CN113333024B - 一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用，属于病毒检测技术领域。一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料，由ZnFe2O4@COF和金纳米粒子原料制成。本发明还提供了一种特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶，是由特异性诺如病毒识别生物材料结合在所述磁性纳米酶材料的金纳米粒子上形成的，不仅能特异性识别和结合诺如病毒而且具有高效的辣根过氧化物酶催化活性，能够完全替换传统ELISA检测中辣根过氧化物酶标记的二抗，实现非生理条件下诺如病毒的检测。本发明提供的检测试剂盒具有检测操作方便、成本低，检测高通量高，具有较高的使用价值。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用。
背景技术
诺如病毒(norovirus，NoV)是一种线性单链正向RNA病毒，属于杯状病毒科，是继轮状病毒后可引起人急性胃肠炎流行和暴发的主要病原体。目前，诺如病毒还没有可以使用的疫苗，因此，准确快速检测NoV，对于临床医生的快速诊断以及患者获得更佳治疗具有重要意义。
目前，酶联免疫吸附测定法(ELISA)仍然是最常使用的诺如病毒检测方法，具有快速、高通量和低成本等优点。国内外已报道的体内诺如病毒浓度的ELISA检测方法，主要是以抗原抗体反应为依据，利用二抗上偶联的辣根过氧化物酶(HRP)的底物显色作用，实现检测。但由于天然酶HRP在非生理条件下不稳定，容易变性失活，这给传统的ELISA检测的推广应用带来了不便。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料，具有优异的辣根过氧化物酶活性，增加检测灵敏度。
本发明提供了一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF，由以下原料制成：ZnFe2O4@COF和金纳米粒子；
所述ZnFe2O4@COF的质量和金纳米粒子的摩尔比为0.1～5mg：2～10μmol。
优选的，所述ZnFe2O4@COF的质量和金纳米粒子的摩尔比为0.5～3mg：4～8μmol。
优选的，所述ZnFe2O4@COF的制备方法，包括以下步骤：
1)将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛和ZnFe2O4溶解于二甲基亚砜中，得到预混合溶液；
2)在无水乙酸的作用下，将所述预混合溶液进行复合反应，得到的反应物为ZnFe2O4@COF。
优选的，所述1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛和ZnFe2O4的质量比为0.1～0.8：0.01～0.2：0.1～1.0。
本发明提供了一种特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶，由以下原料制成：特异性诺如病毒识别生物材料和所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF；
所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的质量和特异性诺如病毒识别生物材料的摩尔比为0.005～2.5mg：0.00005～0.0003μmol。
优选的，所述特异性诺如病毒识别生物材料包括特异性诺如病毒识别肽、抗诺如病毒的抗体或诺如病毒的适配体。
本发明提供了所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶在制备免疫检测诺如病毒的试剂盒或试剂中的应用。
本发明提供了一种特异性检测诺如病毒的ELISA试剂盒，包括所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶。
优选的，还包括包被有诺如病毒抗体的酶标板、样品稀释液、洗涤液、终止反应液、3,3',5,5',-四甲基联苯胺溶液和过氧化氢溶液。
本发明提供了一种非诊断目的的诺如病毒ELISA检测方法，包括以下步骤：
A.将诺如病毒液样本添加至包被有诺如病毒抗体的酶标板中，孵育，洗涤，得到捕获有诺如病毒的酶标板；
B.向所述捕获有诺如病毒的酶标板加入含所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶的水溶液，孵育，洗涤，得到含酶-病毒-抗体复合物的酶标板；
C.终止所述含酶-病毒-抗体复合物的酶标板中的反应，添加辣根过氧化物酶的显色底物，孵育，检测吸光值；
D.将所述吸光值代入标准曲线回归方程中，计算诺如病毒液样本中诺如病毒的浓度。
本发明提供的具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF，由以下原料制成：ZnFe2O4@COF和金纳米粒子；所述ZnFe2O4@COF的质量和金纳米粒子的摩尔比为0.1～5mg：2～10μmol。所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF具有较高的过氧化物酶催化活性，能催化TMB快速显色。实验表明，AuNPs@ZnFe2O4@COF材料的酶活力为Kcat＝3.4x1010s-1。
同时，AuNPs@ZnFe2O4@COF作为新一代磁性纳米酶材料，具有良好的吸附性，能溶于水，且具有能结合抗体、适配体、多肽等病毒识别材料的特点。
本发明提供了一种特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶，由以下原料制成：特异性诺如病毒识别生物材料和所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF；所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的质量和特异性诺如病毒识别生物材料的摩尔比为0.005～2.5mg：0.00005～0.0003μmol。本发明将特异性诺如病毒识别生物材料通过配位键与磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF表面的金纳米粒子进行连接，实现磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF表面耦合特异性诺如病毒识别生物材料的目的。本发明提供的磁性纳米复合酶不仅具有较高的过氧化物酶催化活性，而且还具有特异性识别诺如病毒的作用，为后续制备检测诺如病毒的产品提供了材料。
进一步的，本发明提供的磁性纳米复合酶还具体限定了特异性诺如病毒识别生物材料包括特异性诺如病毒识别肽、抗诺如病毒的抗体或诺如病毒的适配体。本发明利用识别肽、抗体以及适配体可以特异性识别结合诺如病毒的特点，与磁性纳米酶材料结合，构建了一个用于检测诺如病毒的磁性纳米复合酶，具有检测方便、成本低、高灵敏性以及高通量等优点。
本发明提供了一种非诊断目的的诺如病毒ELISA检测方法，通过将诺如病毒抗体包被于酶标板上，有效地捕获诺如病毒，添加AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料后，利用所述纳米复合酶中的特异性诺如病毒识别生物材料特异性识别结合诺如病毒的性能，实现将纳米复合酶固定在酶标板上，同时利用AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料具有优异的辣根过氧化物酶催化活性，能催化底物TMB快速显色，最终实现诺如病毒的ELISA法检测。本发明提供的检测试剂盒适用于检测范围为1～2×104拷贝数/mL的诺如病毒样本的检测，同时本发明提供的检测试剂盒具有较高的检测灵敏度，试验表明，本发明所述试剂盒的最低检出限(LOD)为1copy/mL。可见，利用本发明提供的检测试剂盒检测诺如病毒，具有较高的特异性。
本发明提供的诺如病毒ELISA检测方法，具有较好的选择性和抗干扰性，能用于成分复杂的实际样品中诺如病毒的检测。同时该诺如病毒检测方法无需核酸提取和扩增，检测操作方便、成本低，检测高通量高，具有较高的使用价值。
附图说明
图1为本发明技术方案的实验流程图；
图2为本发明涉及的磁性纳米材料ZnFe2O4@COF的合成示意图；
图3为ZnFe2O4纳米粒子的表征结果，其中图3A为ZnFe2O4纳米粒子TEM结果，图3B为ZnFe2O4纳米粒子的SEM结果；
图4为ZnFe2O4@COF纳米粒子的表征结果，其中图4A为ZnFe2O4@COF纳米粒子TEM结果，图4B为ZnFe2O4@COF纳米粒子的SEM结果；
图5为AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米粒子的表征结果，其中图5A为AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米粒子TEM结果，图5B为AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米粒子的SEM结果；图5C为AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米粒子的Zeta结果；
图6为不同材料优化的吸光度图示，(a)无催化剂，(b)ZnFe2O4，(c)COF，(d)ZnFe2O4@COF，(e～m)AuNPs@ZnFe2O4@COF中ZnFe2O4@COF与AuNPs反应原料投入的质量比例：(e)20:1，(f)15:1，(g)10:1，(h)5:1，(h)2:1，(h)1:1，(h)1:2，(h)1:3，(h)1:4；
图7为检测实验条件优化结果，图7A为在不同温度下检测结果，图7B为采用不同pH值的醋酸缓冲液的检测结果，图7C为不同H2O2条件下检测结果；
图8为本发明提供的检测方法绘制的标准曲线，图8A为不同浓度诺如病毒溶液进行检测在652nm处的吸光情况，图8B为绘制的标准曲线；
图9为本发明提供的检测原理图。
具体实施方式
本发明提供了一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF，由以下原料制成：ZnFe2O4@COF和金纳米粒子；所述ZnFe2O4@COF的质量和金纳米粒子的摩尔比为0.1～5mg：2～10μmol。
本发明提供的磁性纳米酶材料的原料包括ZnFe2O4@COF和金纳米粒子。所述ZnFe2O4@COF的质量和金纳米粒子的摩尔比优选为0.5～3mg：4～8μmol，更优选为1～2.5mg：5～7μmol，进一步优选的1.5～2.0mg：5.5～6.5μmol，最优选为1.8mg：6.0μmol。ZnFe2O4@COF材料为以ZnFe2O4为核层，在核层的外层包裹COF(共价有机骨架材料)。
在本发明中所述ZnFe2O4@COF的制备方法，优选包括以下步骤：
1)将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛和ZnFe2O4溶解于二甲基亚砜中，得到预混合溶液；
2)在无水乙酸的作用下，将所述预混合溶液进行复合反应，得到的反应物为ZnFe2O4@COF。
在本发明中，所述1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛和ZnFe2O4的质量比优选为0.1～0.8：0.01～0.2：0.1～1.0，更优选为0.2～0.6：0.05～0.15：0.4～0.8，最优选为0.4：0.1：0.6。用二甲基亚砜溶解后，1,3,5-三(4-氨基苯基)苯的浓度优选为0.002～0.016g/ml，更优选为0.004～0.012g/ml，最优选为0.008g/ml。本发明对所述1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛和二甲基亚砜的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的上述药品来源即可。所述溶解优选采用超声处理提高溶解速度和分散情况。本发明对所述ZnFe2O4的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的ZnFe2O4或其公知的制备方法即可。
在本发明中，所述预混合溶液和无水乙酸的体积比为4～6，更优选为5:1。所述复合反应的温度优选为20～28℃，更优选为25℃。所述复合反应的时间优选为50～70min，更优选为60min。所述复合反应结束后，本发明优选利用磁场力吸附反应产物，将所述反应产物分别依次用四氢呋喃和甲醇清洗三次，得到棕色固体进行真空干燥，得到ZnFe2O4@COF棕色粉末。
本发明对金纳米粒子的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的金纳米粒子的制备方法即可。
在本发明中，磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的制备方法，优选包括以下步骤：
将ZnFe2O4@COF溶解于去离子水中，形成ZnFe2O4@COF水溶液；将所述ZnFe2O4@COF水溶液滴加金纳米粒子水溶液中，2～7℃搅拌12h，离心洗涤，得到AuNPs@ZnFe2O4@COF磁性纳米酶材料。
在本发明中，所述ZnFe2O4@COF水溶液的浓度优选为0.1～5mg/mL，更优选为0.5～4.5mg/mL，进一步优选为1～4mg/mL，最优选为2mg/mL。所述金纳米粒子水溶液的浓度优选为0.2～1.0mmol/L，更优选为0.5～0.8mmol/L，最优选为0.6mmol/L。所述ZnFe2O4@COF水溶液和金纳米粒子水溶液的体积比优选为1:9～11，更优选为1:10。所述离心的转速优选为5000～8000rpm，更优选为6000rpm。所述离心的时间优选为3～10min，更优选为5min。所述洗涤用溶液优选为去离子水。
本发明提供了一种特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶，由以下原料制成：特异性诺如病毒识别生物材料和所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF；所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的质量和特异性诺如病毒识别生物材料的摩尔比为0.005～2.5mg：0.00005～0.0003μmol。
在本发明中，所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的质量和特异性诺如病毒识别生物材料的摩尔比优选为0.01～2.0mg：0.00008～0.0001μmol，更优选为0.1～1mg：0.0001～0.00009μmol。所述特异性诺如病毒识别生物材料优选包括特异性诺如病毒识别肽、抗诺如病毒的抗体或诺如病毒的适配体。所述特异性诺如病毒识别肽NoroBP的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(QHKMHKPHKNTKGGGGSC)所示。在本发明中，所述特异性诺如病毒识别肽委托上海吉玛有限公司合成。所述抗诺如病毒的抗体优选购自Abcom公司。所述诺如病毒的适配体为AGTATACCGTATTACCTGCAGCCATGTTTTGTAGGTGTAATAGGTCATGTTAGGGTTTCTGCGATATCTCGGAGATCTTGC(SEQ ID NO:2，委托南京擎科生物科技有限公司合成)。所述特异性诺如病毒识别生物材料通过配位键与磁性纳米酶材料中金纳米粒子结合。所述磁性纳米酶材料发挥辣根过氧化物酶的催化作用，特异性诺如病毒识别生物材料发挥特异性识别和结合诺如病毒的作用，因此，磁性纳米复合酶能够代替传统的ELISA检测方法中二抗和辣根过氧化物酶，实现ELISA检测诺如病毒。
在本发明中，所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶的制备方法，优选包括以下步骤：
将含特异性诺如病毒识别生物材料的水溶液和含所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的水溶液混合，室温震荡，离心，收集沉淀洗涤，得到磁性纳米复合酶。
在本发明中，含特异性诺如病毒识别生物材料的水溶液的浓度有选为10μmol/L。所述含所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的水溶液的浓度优选为0.1-5mg/mL，更优选为0.5～4mg/mL，进一步优选为1～3mg/mL，最优选为2mg/mL。含特异性诺如病毒识别生物材料的水溶液和含所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的水溶液的体积比优选为5-30μL：500，更优选为10～20:500，最优选为15:500。
基于所述磁性纳米复合酶既具有辣根过氧化物酶催化活性又具有特异性识别和结合诺如病毒的作用，本发明提供了所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶在制备免疫检测诺如病毒的试剂盒或试剂中的应用。
在本发明中，所述免疫检测诺如病毒的试剂盒或试剂优选包括ELISA检测试剂盒。
本发明提供了一种特异性检测诺如病毒的ELISA试剂盒，包括所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶。所述ELISA试剂盒还优选包括包被诱诺如病毒抗体的酶标板、样品稀释液、洗涤液、终止反应液、3,3',5,5',-四甲基联苯胺溶液和过氧化氢溶液。本发明对所述ELISA试剂盒的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的ELISA试剂盒制备方法即可。
本发明提供了一种非诊断目的的诺如病毒ELISA检测方法，包括以下步骤：
A.将诺如病毒液样本添加至包被有诺如病毒抗体的酶标板中，孵育，洗涤，得到捕获有诺如病毒的酶标板；
B.向所述捕获有诺如病毒的酶标板加入含所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶的水溶液，孵育，洗涤，得到含酶-病毒-抗体复合物的酶标板；
C.终止所述含酶-病毒-抗体复合物的酶标板中的反应，添加辣根过氧化物酶的显色底物，孵育，检测吸光值；
D.将所述吸光值代入标准曲线回归方程中，计算诺如病毒液样本中诺如病毒的浓度。
本发明提供的非诊断目的的诺如病毒ELISA检测方法的检测原理见图9。将诺如病毒抗体包被至酶标板后，经过封闭，得到包被抗体的酶标板，添加含诺如病毒的样本后，包被抗体捕获诺如病毒，洗涤除去未包被的病毒，添加磁性纳米复合酶，利用特异性诺如病毒识别材料与诺如病毒特异性结合，实现酶标板上固定的抗体-病毒-复合酶三元复合物，在体系中添加辣根过氧化酶底物后，利用磁性纳米复合酶的催化作用，实现底物显色，得到吸光值，从而达到定性和/或定量检测诺如病毒的目的。
本发明将诺如病毒液样本添加至包被有诺如病毒抗体的酶标板中，孵育，洗涤，得到捕获有诺如病毒的酶标板。
在本发明中，包被有诺如病毒抗体的酶标板中，诺如病毒抗体的包被浓度优选为1μg/mL。所述诺如病毒抗体的包被溶液优选为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的pH值优选为7.2。所述包被诺如病毒抗体的时间优选为10～14h，更优选为12h。所述包被的温度优选为2～7℃，更优选为4℃。所述包被后，优选还包括酶标板的封闭。本发明对所述封闭的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的封闭方法即可。
在本发明中，所述孵育的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述孵育的时间优选为1～3h，更优选为2h。所述洗涤用溶液优选为PBST洗涤液。所述洗涤的次数优选为3～4次。
本发明捕获有诺如病毒的酶标板后，本发明向所述捕获有诺如病毒的酶标板加入含所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶的水溶液，孵育，洗涤，得到含酶-病毒-抗体复合物的酶标板。
在本发明中，含所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶的水溶液的浓度优选为1mg/mL。所述孵育和洗涤的方法没有特殊限制，采用上述记载的孵育和洗涤方法即可。
得到含酶-病毒-抗体复合物的酶标板后，本发明终止所述含酶-病毒-抗体复合物的酶标板中的反应，添加辣根过氧化物酶的显色底物，孵育，检测吸光值。
在本发明中，终止反应用溶液优选为TMB显色终止液(购自碧云天生物技术有限公司)，该终止液加入后反应终止，并保持原来的蓝色。所述辣根过氧化物酶的显色底物的浓度优选为10mmol/LTMB水溶液和100mmol/LH2O2水溶液。所述吸光值在652nm下进行测定。
得到吸光值后，本发明将所述吸光值代入标准曲线回归方程中，计算诺如病毒液样本中诺如病毒的浓度。
在本发明中，所述标准曲线回归方程为Abs＝0.196logCNoV(拷贝数·mL-1)+0.238(R2＝0.994)，其中CNoV表示诺如病毒的浓度，Abs表示吸光度。
在本发明中，所述检测方法适合检测诺如病毒的检测范围为1～2×104copies/mL。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明涉及的专业术语对照表如下：
实施例1
ZnFe2O4@COF的制备方法如下：
(1)ZnFe2O4纳米粒的制备：称取1.0g六水合氯化铁和0.5g无水氯化锌，溶解于60mL乙二醇中形成透明溶液，随后加入5.0g醋酸钠和0.1g聚乙二醇20000。混合液剧烈搅拌2h后，转移到不锈钢高压釜(容量100mL)中，在200℃条件下反应12h，反应终止后自然冷却至室温得到含有黑色沉淀的悬浊液。将沉淀用乙醇和水清洗数次，黑色产物在60℃真空环境下干燥6h。获得粉末状ZnFe2O4纳米粒。
(2)合成ZnFe2O4@COF：取0.1g1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB)、0.06g对苯二甲醛(TPA)和2.0g ZnFe2O4，用50mL二甲基亚砜溶解。超声分散处理60min，在超声下加入10mL无水乙酸，室温反应60min。磁铁收集ZnFe2O4@COF，分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次，得到棕色固体，60℃真空干燥，得到ZnFe2O4@COF棕色粉末。
实施例2
制备和表征ZnFe2O4@COF
(1)ZnFe2O4纳米粒的制备：称取3.0g六水合氯化铁和1.0g无水氯化锌，溶解于80mL乙二醇中形成透明溶液，随后加入2.0g醋酸钠和聚乙二醇20000(0.1g)。混合液剧烈搅拌0.5h后，转移到不锈钢高压釜(容量100mL)中，在200℃条件下反应24h，反应终止后自然冷却至室温得到含有黑色沉淀的悬浊液。将沉淀用乙醇和水清洗数次，黑色产物在60℃真空环境下干燥6h。获得粉末状ZnFe2O4纳米粒。将制备的ZnFe2O4纳米粒分别进行TEM检测和SEM检测，检测结果见图3A和图3B。
(2)合成ZnFe2O4@COF：取0.3g 1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB)、0.03g对苯二甲醛(TPA)和1.0g ZnFe2O4，用50mL二甲基亚砜溶解。超声分散30min，超声下加入1.5mL无水乙酸，室温反应15min。磁铁收集ZnFe2O4@COF，分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次，得到棕色固体，60℃真空干燥得到ZnFe2O4@COF棕色粉末。将制备的ZnFe2O4@COF棕色粉末分别进行TEM检测和SEM检测。检测结果见图4A和图4B。与图3A比较，可知ZnFe2O4@COF棕色粉末在颗粒的表层还包裹一层；比较图4B结果和图3B结果可知，ZnFe2O4@COF比ZnFe2O4纳米粒的粒径有明显增加。
实施例3
AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料的制备和表征：
(1)AuNPs的制备：在搅拌条件下，将50mL浓度为20mmol/L的HAuCl4溶液加入200mL沸腾的去离子水中，在110℃下加热搅拌30min，缓慢滴加50mL浓度为20mmol/L的柠檬酸钠溶液，冷凝回流60min，直至溶液变为酒红色，溶液在室温条件下搅拌60min，于4℃下储存。
(2)将上一步得到ZnFe2O4@COF的加水配制成浓度为5mg/mL的ZnFe2O4@COF溶液，取2mLZnFe2O4@COF溶液滴加在浓度为0.2mmol/L 50mL金纳米粒子溶液中，4℃搅拌24h，磁铁收集，弃上清液，继续用去离子水离心洗涤3次，得到AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料。AuNPs@ZnFe2O4@COF的TEM结果见图5A，与图4A比较可知，AuNPs@ZnFe2O4@COF的最外层结合有点状颗粒，为金纳米粒子。EDS检测结果见图5B。元素分析结果表明，所述纳米复合材料有金原子存在，证明金纳米成功负载到ZnFe2O4@COF上。
Zeta检测结果见图5C。电位检测结果表明，由于合成的金纳米带负电荷，而所述纳米复合材料电荷增大，说明金纳米粒子成功负载在ZnFe2O4@COF材料。
实施例4
为探究合成AuNPs@ZnFe2O4@COF时ZnFe2O4@COF与AuNPs反应原料投入比例是否对探针材料的性能有明显影响，进行如下实验：
首先，按照实施例3的方法，分别以ZnFe2O4@COF:AuNPs＝20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4(质量比)的比例合成ZnFe2O4@COF@AuNPs，磁铁收集产物，去离子水清洗三次，冷冻干燥，得到ZnFe2O4@COF@AuNPs棕色粉末。
将上述制备的不同质量比的ZnFe2O4@COF@AuNPs配制成1mg/mL的ZnFe2O4@COF@AuNPs溶液，取10μL加入相同的反应体系中(200μL含有TMB和H2O2的醋酸缓冲液)，15min后紫外分光光度计检测吸光值。检测结果表明，按照ZnFe2O4@COF:AuNPs＝1:2的质量比合成的ZnFe2O4@COF@AuNPs对TMB的催化显色能力最优良(见图6)。
实施例5
在AuNPs@ZnFe2O4@COF上修饰NoroBP的方法
将公司合成的NoroBP按照说明书的稀释方法用去离子水稀释为10μmol/L，然后将30μL 10μmol/L的NoroBP加入到500μL 1mg/mL的AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料溶液中，室温震荡12h，磁铁富集后去除上清液并用去离子水洗涤，得到磁性纳米复合酶。
实施例6
ELISA检测诺如病毒的实验参数优化，包括以下几项实验：
1)用PBS缓冲液稀释诺如病毒一抗(Ab1)至1μg/mL，每孔100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜；用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μL 1％BSA，37℃封闭45min；
用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μL浓度为2×104copies·mL-1的不同浓度的NoV溶液，37℃孵育2h；
用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μLNoroBP@AuNPs@ZnFe2O4@COF，孵育2h；用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入适量醋酸缓冲液(pH值为4.0)终止反应，再加入TMB，H2O2(100mM)，反应体系总体积为200μL，37℃孵育15min，紫外分光光度计检测652nm处的吸光值。
其中催化TMB显色检测过程温度分别设置25℃，30℃，35℃，40℃，50℃和60℃六个温度梯度来评估温度对TMB催化的影响。
结果表明，40℃为最佳反应温度(见图7A)。
(2)为验证醋酸缓冲液的pH值也对反应体系的成功构建有着较大的影响，按照实验(1)的方法检测诺如病毒，其中催化TMB显色温度在40℃下进行，H2O2浓度为100mM。但醋酸缓冲液分别选择了3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0的pH来进行筛选。
结果表明，终止反应的醋酸缓冲液最佳为pH值为4.0(见图7B)。
(3)为验证H2O2的浓度对检测结果的影响，进行了筛选，按照实验(1)的方法检测诺如病毒，其中催化TMB显色温度在40℃下进行，醋酸缓冲液的pH值为4.0，同时分别设置10mM，50mM，100mM，150mM，200mM五个H2O2的浓度梯度。
实验结果表明H2O2的最适浓度为100mM(图7C)。
实施例7
一种诺如病毒的检测方法，包括步骤如下：
(1)用PBS缓冲液稀释诺如病毒一抗(Ab1)至1μg/mL，每孔100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜；
(2)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μL 1％BSA，37℃封闭45min；
(3)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μL浓度为10copies·mL-1、100copies·mL-1、1000copies·mL-1和1×104copies·mL-1的不同浓度的诺如病毒溶液，37℃孵育2h；
(4)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μLNoroPep@AuNPs@ZnFe2O4@COF磁性纳米复合酶，37℃孵育2h。
(5)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入适量醋酸缓冲液，分别加入100μl TMB和100mM的H2O2溶液，反应体系总体积为200μL，37℃孵育15min，紫外分光光度计检测652nm处的吸光值，绘制标准曲线见图8B。
(6)按照步骤(1)～(5)的检测方法检测浓度分别为0、1copy·mL-1、100.5copies·mL-1、10copies·mL-1、101.5copies·mL-1、200copies·mL-1、500copies·mL-1、1000copies·mL-1、2000copies·mL-1、50000copies·mL-1、10000copies·mL-1、20000copies·mL-1的诺如病毒溶液。紫外分光光度计检测652nm处的吸光值，结果见图8A和图8B，最低检出限(LOD)为1copy/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln His Lys Met His Lys Pro His Lys Asn Thr Lys Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Cys
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtataccgt attacctgca gccatgtttt gtaggtgtaa taggtcatgt tagggtttct 60
gcgatatctc ggagatcttg c 81
Claims (6)
1.一种特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶在制备免疫检测诺如病毒的试剂盒或试剂中的应用，所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶，由以下原料制成：特异性诺如病毒识别生物材料和磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF；
所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF的质量和特异性诺如病毒识别生物材料的摩尔比为0.005~2.5 mg：0.00005~0.0003 μmol;
所述磁性纳米酶材料AuNPs@ZnFe2O4@COF由以下原料制成：ZnFe2O4@COF和金纳米粒子；
所述ZnFe2O4@COF的质量和金纳米粒子的摩尔比为0.1~5 mg：2~10 μmol；
所述ZnFe2O4@COF的制备方法，包括以下步骤：
1）将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛和ZnFe2O4溶解于二甲基亚砜中，得到预混合溶液；
2）在无水乙酸的作用下，将所述预混合溶液进行复合反应，得到的反应物为ZnFe2O4@COF；
所述1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛和ZnFe2O4的质量比为0.1~0.8：0.01~0.2：0.1~1.0。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述特异性诺如病毒识别生物材料包括特异性诺如病毒识别肽、抗诺如病毒的抗体或诺如病毒的适配体。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述ZnFe2O4@COF的质量和金纳米粒子的摩尔比为0.5~3 mg：4~8 μmol。
4.一种特异性检测诺如病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任意一项所述应用中的特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶。
5.根据权利要求4所述特异性检测诺如病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，还包括包被有诺如病毒抗体的酶标板、样品稀释液、洗涤液、终止反应液、3,3',5,5',-四甲基联苯胺溶液和过氧化氢溶液。
6.一种非诊断目的的诺如病毒ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将诺如病毒液样本添加至包被有诺如病毒抗体的酶标板中，孵育，洗涤，得到捕获有诺如病毒的酶标板；
B.向所述捕获有诺如病毒的酶标板加入含权利要求1~3任意一项所述应用中所述特异性检测诺如病毒的磁性纳米复合酶的水溶液，孵育，洗涤，得到含酶-病毒-抗体复合物的酶标板；
C.终止所述含酶-病毒-抗体复合物的酶标板中的反应，添加辣根过氧化物酶的显色底物，孵育，检测吸光值；
D.将所述吸光值代入标准曲线回归方程中，计算诺如病毒液样本中诺如病毒的浓度。
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