CN103604920A - 一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法及检测方法 - Google Patents
一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法，步骤如下：（1）磁性纳米粒子的制备与表征；（2）磁性纳米粒子的硅烷化及氨基化修饰与表征；（3）采用氨基硅烷化的磁性纳米粒子，经戊二醛活化后，与CA125单抗交联制备卵巢癌磁性纳米探针。同时，本发明还公开了一种诊断卵巢癌的检测方法。本发明制备的磁性纳米探针，磁性粒子体积小可吸附更多抗原或抗体，因磁性微粒子核心为铁，在磁场中下沉速度快，易进行洗涤和固相载体分离；可特异性的捕获早期卵巢癌患者外周血中的CA125，采用酶联免疫吸附法（ELISA）对富集后的样品进行检测，构建一种基于纳米探针在卵巢癌预警及早期诊断的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性纳米探针的制备和生物医学应用领域，尤其涉及一种肿瘤预防学以肿瘤标志物CA125磁性纳米探针的制备方法，用于卵巢癌的早期诊断。
背景技术
卵巢癌病死率居妇科恶性肿瘤首位，早期几乎没有症状。由于缺乏有效的早期诊断和筛查方法，80％的卵巢癌确诊时已属晚期，5年生存率仅30％左右，而早期卵巢癌（I期，Ⅱ期）患者5年生存率达90％，提高卵巢癌整体生存率的根本在于早期发现。因此，寻找有效的早期诊断和预警方法，是改善卵巢癌总体预后、降低治疗成本、提高生活质量的根本途径。
肿瘤标志物在癌症临床诊疗中具有重要作用，但目前肿瘤标志物因对早期诊断的敏感性低而难以广泛应用，癌症的早期诊断一直是困扰医学界的难题。纳米技术进行恶性肿瘤早期诊断和治疗是目前生物技术领域中最前沿的研究课题之一。由于肿瘤所特有的病理生理变化，在肿瘤的诊断治疗中，纳米技术能更好地检测疾病所导致的分子和细胞改变。利用纳米微粒进行细胞分离技术很可能在肿瘤患者早期的血液中检查出癌细胞，实现癌症的早期诊断和治疗。磁性纳米粒子（10-100 nm）具有良好的磁导向性、生物相容性和磁场响应性等特点，因而纳米生物学领域取得的进展将为卵巢癌预警与早期诊断研究提供新的方法。
CA125是卵巢上皮性癌首选标志物，在胚胎发育中存在于体腔上皮化生组织，出生后消失。成人及胎儿卵巢上皮不含CA125，卵巢癌细胞CA125阳性。80%晚期卵巢癌患者CA-125 值升高，对晚期卵巢癌的敏感度可达 90%，但对早期卵巢癌诊断的敏感度较低，仅有50-60%，且在子宫内膜异位症及炎症中均有升高。CA125被用于作为一种癌抗原，通过分析患者外周血肿瘤相关基因的表达以明确早期卵巢癌的诊断。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法。本发明制备的磁性纳米探针，磁性粒子体积小可吸附更多抗原或抗体，因磁性微粒子核心为铁，在磁场中下沉速度快，易进行洗涤和固相载体分离；可特异性的捕获早期卵巢癌患者外周血中的CA125，采用酶联免疫吸附法（ELISA）对富集后的样品进行检测。
同时，本发明还提供了一种诊断卵巢癌的检测方法，该方法构建一种基于纳米探针在卵巢癌预警及早期诊断的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1）在碱性条件下，采用共沉淀法制备了磁性纳米粒子，并利用柠檬酸钠对其进行修饰，将修饰后的磁性纳米粒子与硅烷偶联剂TEOS反应，制备得到硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）将硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子与氨基硅烷化试剂APTES反应，制备得到氨基硅烷化修饰的磁性纳米粒子，使硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子表面带有活性较强的氨基功能基团；
（3）氨基硅烷化修饰的磁性纳米粒子经戊二醛活化后，与CA125单抗交联制备磁性纳米探针。
相应地，本发明提供的一种诊断卵巢癌的检测方法，建立一种基于磁性纳米探针为标记双抗体夹心酶联免疫吸附法对CA125的检测方法。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、制备的卵巢癌纳米探针功能性磁性纳米颗粒在外加磁场的作用下方便、快速地进行定位、导向及分离。
2、建立一种基于磁性纳米探针为标记双抗体夹心酶联免疫吸附法对CA125的检测方法；以磁性纳米粒子作为固相载体，将磁性纳米粒子上的氨基与CA125抗体链接，制备成CA125磁性纳米探针，将未结合的抗体及杂质通过磁性分离除去；制备好的CA125磁性纳米探针可以特异性捕获样品中的抗原，形成磁性纳米微球固相抗原复合物，通过磁性分离除去未结合的物质；再加上酶标的CA125抗体进行定量检测。
3、生物相容性问题以及如何避免包覆的高分子层在使用及储藏过程中的分解是功能性磁性纳米颗粒在应用过程中需首要解决的问题。功能性磁性纳米颗粒表面修饰有一定量的OH、NH2、COOH、CHO等功能基团，从而可以使特定的生物活性物质通过化学作用力偶联到磁性纳米颗粒表面，多数生物高分子如多糖，蛋白质类因其安全无毒，可降解，同时具有良好的生物相容性而受到了广泛关注，可应用于磁性载体的表面修饰反应中。
附图说明
图1为Fe3O4纳米的XRD图谱；
图2为硅烷化四氧化三铁的XRD图；
图3为磁性纳米粒子的IR表征图（图上方为Fe3O4红外图谱，图下方为硅烷化Fe3O4图谱）；
图4为Fe3O4SiO2磁性纳米粒子透射电子显微镜（TEM）表征图；
图5为卵巢癌肿瘤标志物CA125与磁性纳米粒子形成的纳米探针。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1）在碱性条件下，采用共沉淀法制备了磁性纳米粒子，并利用柠檬酸钠对其进行修饰，将修饰后的磁性纳米粒子与硅烷偶联剂TEOS反应，制备得到硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子，即Fe3O4SiO2。
（1.1）Fe3O4磁性纳米粒子的合成及表征
采用经典的化学共沉淀法合成超顺磁流体，其制备原理简单，主要是在沉淀剂NH3.H2O的作用下，二价与三价铁离子在碱性条件下生成沉淀，或利用氧化-还原反应生成Fe3O4。
共沉淀反应原理方程式如下：Fe2++2Fe3++8OH-—Fe3O4+4H2O
在合成过程中，条件的选择至关重要，物料比、碱用量、温度、晶化温度、搅拌速度、反应时间等因素均会影响最终产物纳米级Fe3O4的生成和性质。
具体制备过程如下：配置Fe2+（0.011 M）与Fe3+（0.020 M）混合母液30ml，在磁力搅拌条件下，逐滴加入沉淀剂氨水1ml（氨水适当过量），溶液颜色由浅黄色逐渐变成黑色，搅拌1 h，接着再在90 ℃条件下反应1 h，待反应完成后利用磁铁将Fe3O4纳米粒子进行吸附，并用去离子水进行清洗3次；将制得的Fe3O4纳米粒子复溶至60 ml、0.3 M的柠檬酸钠溶液中，加热至80 ℃，搅拌反应1 h后，利用磁铁对产物进行吸附，并用丙酮清洗，以除去吸附在纳米粒子表面的柠檬酸根离子，再次用磁铁将产物吸附后，对产物分别进行水洗及乙醇洗各三次；将得到的四氧化三铁保存在10 ml的无水乙醇中。
共沉淀法得到的磁性微粒通常粒径较小(10 nm-100 nm)的Fe3O4，具有较大比表面积和固载量。在外加磁场作用下，分离得到纳米级别的Fe3O4。利用柠檬酸钠对Fe3O4进行修饰，粒径较小但不均匀，但是制备过程简单易操作。
图1与图2分别为Fe3O4以及硅烷化四氧化三铁纳米颗粒的X射线衍射（XRD）图谱，可以看到图2比图1在20-30的位置有一个隆起的峰。但由于Fe3O4与硅烷化四氧化三铁结构很相似，它们的XRD峰型没有很大区别，因此，在图3中采用红外光谱对它们的结构进一步鉴定。
（1.2）硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子的合成及表征
采用经典Stober法，在碱性条件下，利用TEOS对磁性Fe3O4纳米粒子表面进行包覆，得到核-壳结构的硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子。具体方法如下：一定量的磁性Fe3O4纳米粒子（2 ml Fe3O4的乙醇溶液）加入至50 ml乙醇-水混合溶剂中（乙醇:水=4:1），加入1 ml氨水，超声20 min使其充分分散。接着200 ulTEOS缓缓加入至反应溶液中，在磁力搅拌下反应6 h，600 r/min。最后，将制备的硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子用无水乙醇清洗3次。利用透射电子显微镜（TEM）以及傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)等对其结构进行表征。结果如图3所示，在波段在1100附近，有一个很明显的的峰，即Si-O-Si的反对称伸缩振动引起特征峰。
硅烷化四氧化三铁磁性纳米微粒的透射电子显微镜如图4所示，结果表明单个粒径大小平均为100 nm左右。由TEM图可知，Fe3O4磁性纳米粒子被二氧化硅很好的包覆在里面。
（2）将硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子与氨基硅烷化试剂APTES反应，制备得到氨基硅烷化修饰的磁性纳米粒子，使硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子表面带有活性较强的氨基功能基团，该功能基团可以连接具有生物活性的物质，如生物酶、抗体、抗原等，进而制备成具有生物活性的纳米探针。
硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子的氨基化：采用非水体系进行硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子的氨基化反应，制备无水甲苯待用。具体制备方法如下：将制备的氨基硅烷化四氧化三铁纳米粒子用无水甲苯清洗3次，加入30 ml无水甲苯、1 ml APTES，超声20 min后，在磁力搅拌器上进行反应，条件为在105 ℃下回流反应8 h。最后，利用外加磁场，将氨基硅烷化的磁性四氧化三铁纳米粒子从甲苯溶液中分离出来，并用乙醇溶液对其清洗5次。
（3）氨基硅烷化修饰的磁性纳米粒子经戊二醛活化后，与CA125单抗交联制备磁性纳米探针。
磁性颗粒的醛基化修饰及卵巢癌纳米探针的制备：
采用戊二醛对氨基化的磁性纳米粒子进行活化，利用戊二醛在磁性纳米微球与生物活性物质之间搭桥形成shiff建，使带有氨基官能团的载体磁珠与生物活性物质中的氨基基团直接进行缩合形成复合物。把制备的磁性纳米粒子与卵巢癌标志物CA125抗体相结合，制备成卵巢癌磁性纳米探针。
在修饰完APTES之后，将2 ml（10 mM）氨基化的磁性纳米粒子用PBS（pH=7.4）溶液充分清洗3次，分散在质量分数为10 %戊二醛的磷酸缓冲溶液（PBS）中，并在室温下充分震荡并保持在分散状态，反应3 h，然后磁性纳米粒子采用外加磁场进行磁分离，再用PBS 洗3 次。将氨基化磁性粒子悬浮在0.5 ml PBS溶液中，加入不同浓度CA125抗体，4℃反应42 h，最后采用外加磁场进行磁性分离，最终获得CA125抗体复合磁性纳米探针（MNPs-HRP-CA125Ab），合成示意图如图5。制备好的卵巢癌磁性纳米探针采用ELISA进行评价。
一种诊断卵巢癌的检测方法，建立一种基于磁性纳米探针为标记双抗体夹心酶联免疫吸附法对CA125的检测方法。
基于磁性纳米探针为标记双抗体夹心酶联免疫吸附法对CA125的检测：在ELISA测定过程中，固相载体作为吸附剂和容器，在反应过程中不参与化学反应，不影响抗原与抗体的结合及检测。最常用的是聚苯乙烯，其具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。为了考察所制备的磁性纳米粒子能否提高ELISA的检测灵敏度，把磁性纳米粒子与CA125抗原特异性结合，制备成卵巢癌磁性纳米粒子，在试验中，卵巢癌磁性纳米粒子作为固相载体，不需要把抗原或者抗体再洗脱下来。通过包被、加样、温育、洗涤、显色和比色，对比了加入磁性纳米粒子与未加入磁性纳米粒子时，所测得的CA125抗体的浓度。
空白对照实验：
空白对照实验，以传统的酶标板为固相载体的酶联免疫检测。包被板制备：取 CA125 McAb，采用0.05 M PH 9.6 包被液稀释至浓度为5 ug/ml，取110 ul 稀释好的CA125抗体，于37 ℃ 孵育2.5 h，然后拍干，取150 ul 1% BSA 0.01M PH7.4作为封闭液于室温下孵育4.5 h，拍干，37 ℃干燥过夜。
标准品制备：抗原逐级稀释，制备成6点不同浓度的抗原，根据所测得的OD值，制作标准曲线。
酶结合物的制备：取标记HRP的CA125抗体，按优化的浓度用酶标稀释液稀释。
取包被好的酶标板，加入25 ul标准品和75 ul的酶结合物，37℃温育1 h，用洗液洗板3-5次，拍干加入50 ul 底物A和50 ul 底物B，37 ℃温育10 min用终止液终止，酶标仪读数，拟合计算。
以磁性纳米颗粒为固相载体的酶联免疫检测：
取醛基化的氨基磁性纳米粒子，与不同浓度的CA125 抗体偶联与封闭，利用戊二醛在磁性纳米微球与生物活性物质之间搭桥形成shiff建，使带有氨基官能团的载体磁珠与生物活性物质中的氨基基团直接进行缩合形成复合物。
纳米磁性颗粒与CA125 McAb,coating偶联与封闭，优化磁性纳米颗粒与抗体的比例、抗体与酶标抗体浓度。首先，以空白酶标板为载体，取偶联有抗体的纳米磁性颗粒用抗体稀释液按优化的浓度稀释，每孔加入25 ul，然后加入25 ul标准品和75 ul的酶结合物，37 ℃温育1 h，用洗液洗板3-5次，吸干。加入50 ul 底物A和50 ul 底物B，37 ℃温育10 min用终止液终止，酶标仪读数，结果发现，CA125与磁性纳米粒子制备成 CA125磁性纳米粒子探针后，所制备的磁性纳米探针体积小可吸附更多抗原或抗体，其检测的灵敏度比空白对照组实验较高，可有效的提高ELISA检测灵敏度。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）在碱性条件下，采用共沉淀法制备了磁性纳米粒子，并利用柠檬酸钠对其进行修饰，将修饰后的磁性纳米粒子与硅烷偶联剂TEOS反应，制备得到硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）将硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子与氨基硅烷化试剂APTES反应，制备得到氨基硅烷化修饰的磁性纳米粒子，使硅烷化Fe3O4磁性纳米粒子表面带有活性较强的氨基功能基团；
（3）氨基硅烷化修饰的磁性纳米粒子经戊二醛活化后，与CA125单抗交联制备磁性纳米探针。
2.一种诊断卵巢癌的检测方法，其特征在于，建立一种基于磁性纳米探针为标记双抗体夹心酶联免疫吸附法对CA125的检测方法。
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