CN101717812A - 一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法及应用 - Google Patents
一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，提供了Fe3O4磁性纳米粒子制备及溶胶凝胶功能化条件，步骤如下：制备超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子；Fe3O4磁性纳米粒子的硅烷功能化；制备Nisin功能化磁性磁性纳米粒子。本发明的优点：Nisin功能化磁性磁性纳米粒子应用于微生物测定时，化学稳定性高、生物相容性好，其粒径可使表面容纳多个配体存在，与细菌进行多化合价作用，使得生物纳米粒子具有很好的动力学；特别是Nisin和细菌的特异性作用及静电吸附作用都促进对细菌的捕捉。本方法工艺合理、易于实施且能够快速、灵敏地检测出致病菌，对于食品安全、临床诊断、治疗及反生物恐怖等方面具有重要的意义。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种乳酸链球菌素(Nisin)修饰的Fe3O4磁性纳米粒子的制备方法，并将乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子用于农产品中致病菌的检测，属于纳米材料及分析检测技术领域。
【背景技术】
果蔬和鲜肉类等食品在流通过程中，不可避免地受到微生物等不良因素的影响，使食品感观、卫生指标恶化，食用安全性受到威胁。近年由于食用了大肠杆菌污染的农产品以及炭疽杆菌感染的肉类食品所导致的食源性疾病的不断爆发，食品因致病微生物污染引发的食源性中毒事件逐渐上升，中毒和死亡人数增加，迫切地需要有效的方法能够快速、灵敏地检出微生物的污染。传统检测方法一般需要对样品进行富集培养，使被检测微生物的数量在样品中达到检测的水平，测定步骤较多，时间较长，发展更为快速的检测手段具有重要的意义。PCR技术虽较传统的手段大有进步，但仍然有不足之处，如步骤较多，需要引物，速度还不够快等。
已经证实纳米粒子和生物分子巧妙的结合能够应用于设计新型纳米传感器，而且在生物医学应用方面也取得了巨大的进步。采用磁性纳米粒子实现对食源性致病菌的检测具有检测速度快和对人为因素不敏感等优点，检测过程不需要富集培养或复杂的PCR反应，其检测效率与传统方法相比具有明显的优势。
Nisin(乳酸链球菌素)是一种抗菌肽，常用作食品中的防腐剂，它是由34个氨基酸残基组成，其N末端为异亮氨酸，C端为赖氨酸，在生理条件下带正电荷。而且，抗菌肽Nisin与革兰氏阳性菌细胞壁的前体物质Lipid II上的焦磷酸酯之间具有特异性相互作用。
本发明将Nisin通过共价键结合在Fe3O4磁性纳米粒子上，研究Nisin修饰的磁性纳米粒子对食源性致病菌的吸附作用，并提供了一种快速、有效地检测致病菌的方法。
【发明内容】
本发明的目的是克服通常情况下检测致病菌需要较长的富集培养时间、操作繁琐、对人为因素敏感和检测效率低等缺点，提供一种Nisin修饰的磁性纳米粒子的制备方法，并将其应用于农产品中的致病菌快速检测。
本发明的技术方案：
一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，提供了Fe3O4磁性纳米粒子制备条件及溶胶凝胶功能化条件，包括如下步骤：
(1)超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子的制备
采用共沉淀方法合成Fe3O4磁性纳米粒子：将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别溶于HCl溶液中，浓度均为1M，将两种溶液进行机械搅拌混合，通入氮气保护，加入氨水，使溶液pH达到11，在室温下剧烈搅拌30min，以钕铁硼磁铁进行磁分离，分别用高纯水、无水乙醇依次清洗各3次，60℃真空干燥12h；
(2)Fe3O4磁性纳米粒子的硅烷功能化
1)Fe3O4磁性纳米粒子包覆四乙氧基硅烷(TEOS)
将真空干燥后的Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇和水的体积比为1～50∶1的乙醇水溶液中，超声混合，调节溶液的pH值为9，加入四乙氧基硅烷(TEOS)，机械搅拌并氮气保护，室温反应(4～24)h，然后以钕铁硼磁铁进行磁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
2)硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子的氨基功能化
将真空干燥后的硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子分散混合有机溶液中，超声混合，加入γ-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)混合均匀，在容器中机械搅拌并氮气保护，室温24h，最后以钕铁硼磁铁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
3)氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子的羧基功能化
将真空干燥后的氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子分散于无水甲苯中，加入戊二酸酐，机械搅拌并氮气保护，室温反应(2～8)h，最后以钕铁硼磁铁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
(3)乳酸链球菌素(Nisin)功能化磁性磁性纳米粒子的制备
将羧基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子分散于pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液中，加入EDC·HCl和NHS，室温反应30min，以以钕铁硼磁铁分离，高纯水清洗磁球3次，在这过程中以钕铁硼磁铁富集，最后将其重新分散于pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液中，加入乳酸链球菌素(Nisin)，室温反应(1～4h)，以钕铁硼磁铁分离后富集，用磷酸缓冲溶液清洗3次即可得到Nisin修饰的Fe3O4磁性纳米粒子。
所述步骤(1)中HCl溶液的浓度为2M，FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O的摩尔比为2∶1，氨水的重量百分比浓度为28％。
所述步骤(2)1)中Fe3O4磁性纳米粒子在乙醇水溶液中的浓度为0.05～2％，四乙氧基硅烷(TEOS)占上述溶液重量百分比浓度为0.1～2％。
所述步骤(2)2)中混合有机溶液中为N，N，-二甲基甲酰胺和甲苯，其体积比为1～10∶2；硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子在混合有机溶液中的重量百分比浓度为0.05～2％；γ-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)占上述溶液重量百分比浓度为0.5～5％。
所述步骤(2)3)中氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子在无水甲苯中的重量百分比浓度为0.1～2％；戊二酸酐占上述溶液重量百分比浓度为0.5～10％。
所述步骤(3)中羧基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子为5～50mg，pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液为50mL；EDC·HCl和NHS的摩尔比为1∶1，加入量为10～100mg；乳酸链球菌素(Nisin)的加入量为(10～100)mg。
一种所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子，用于农产品中致病微生物的检测，具体步骤如下：农产品经匀浆处理并以pH5.8～7.4缓冲液稀释或是直接以pH5.8～7.4缓冲液淋洗并收集，取匀浆稀释液或淋洗液与Nisin修饰的磁性纳米粒子振荡吸附，将Nisin修饰的磁性纳米粒子和细菌的结合物以无菌生理盐水清洗3次，在此过程中以外部磁铁进行富集，将其进行荧光染色，以荧光显微镜进行检测。
所述pH5.8～7.4缓冲液中含有重量百分比浓度为0.9％的NaCl。
本发明的优点：本发明提供的乳酸链球菌素(Nisin)修饰的磁性纳米粒子的制备方法，工艺合理、易于实施；本法制备的乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子应用于微生物测定时除了具有化学稳定性、生物相容性外，Fe3O4磁性纳米粒子的粒径比细菌等微生物小两个数量级，这样既可以使其表面容纳多个配体存在，进行多化合价作用；且能够保证生物纳米粒子在水溶液中具有较好的动力学性质，利于快速检测；更为重要的是Nisin和细菌的特异性作用及静电吸附作用都促进了Nisin修饰的磁性纳米粒子对细菌的捕捉。本法提供的方法能够快速、灵敏地检测出致病菌，对于食品安全、临床诊断、治疗以及反生物恐怖等方面具有十分重要的意义。
【附图说明】：
图1是Nisin修饰的Fe3O4磁性纳米粒子的合成路线示意图。
图2是应用该产物对农产品中致病微生物的检测过程示意图。
【具体实施方式】：
实施例：
一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，提供了Fe3O4磁性纳米粒子制备条件及溶胶凝胶功能化条件，包括如下步骤：
(1)超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子的制备
采用共沉淀方法合成Fe3O4磁性纳米粒子：将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别配制在2M HCl溶液中，使两者的浓度都为1M。将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O以2∶1的摩尔比进行机械搅拌混合，并通氮气保护，加入氨水使pH达到11，在室温剧烈搅拌30min。以钕铁硼磁铁进行磁分离，并用高纯水、无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥过夜。
(2)Fe3O4磁性纳米粒子的硅烷功能化
1)Fe3O4磁性纳米粒子包覆四乙氧基硅烷(TEOS)
取真空干燥后的Fe3O4磁性纳米粒子0.1g分散于50mL乙醇水溶液中(乙醇和水的体积比为4∶1)超声混合，调节溶液的pH值为9，加入0.1mL的四乙氧基硅烷(TEOS)，在三颈瓶中机械搅拌并氮气保护，室温反应12h，然后以钕铁硼磁铁进行磁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
2)硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子的氨基功能化
取真空干燥后的硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子0.1g分散于50mL混合有机溶液中(N，N，-二甲基甲酰胺和甲苯的体积比为5∶2)超声混合，加入1mL γ-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)混合均匀，在三颈瓶中机械搅拌并氮气保护，加热60℃反应12h，最后以钕铁硼磁铁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
3)氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子进一步羧基功能化
取真空干燥后的氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子0.1g，超声分散于100mL无水甲苯中，加入0.5g的戊二酸酐，在三颈瓶中机械搅拌并氮气保护，室温反应4h，最后以钕铁硼磁铁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
(3)Nisin功能化磁性磁性纳米粒子的制备
取羧基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子20mg分散于50mL的磷酸缓冲溶液中(pH为7.0)加入33mg的EDC·HCl和20mg NHS，室温反应30min；高纯水清洗磁球3次，在这过程中以钕铁硼磁铁富集，然后将其重新分散于50mL的磷酸缓冲溶液中加入40mg的Nisin，室温反应3h，以钕铁硼磁铁分离富集，用磷酸缓冲溶液清洗3次即可得到Nisin修饰的Fe3O4磁性纳米粒子。
以金黄葡萄球菌为模板菌株，采用实施例制得的乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子对金黄葡萄球菌进行捕捉试验：
取金黄葡萄球菌培养液(～1.0x106cfu/mL，4mL)，离心富集，以pH为7.0的磷酸缓冲溶液(其中含有0.9％NaCl)清洗2次，然后分散于4mL上述缓冲溶液中，加入Nisin功能化磁性磁性纳米粒子5mg，摇床振荡5min，以外部磁铁分离，分别取上清液和吸附前的菌悬液在600nm处用紫外分光光度计下测定其吸光度值，检测结果表明：在Nisin功能化磁性磁性纳米粒子吸附后，上清液在600nm的吸光度值较吸附前菌悬液的吸光度值大大减小，不到吸附前菌悬液的吸光度值的三分之一，Nisin功能化磁性磁性纳米粒子对金黄葡萄球菌的捕获效率可达到71％
应用于葡萄表面携带细菌量的检测：
方法是取50mL pH7.0缓冲液(其中含0.9％NaCl)淋洗0.1kg葡萄，并将其收集在灭菌的三角瓶中，取上述样品10mL加入Nisin修饰的磁性纳米粒子10mg振荡吸附20min，将磁性纳米粒和细菌的结合物用pH7.0缓冲液(其中含0.9％NaCl)清洗3次，在此过程中以外部磁铁进行富集，进行荧光染色，以荧光显微镜对其进行检测，同时将Nisin功能化磁性磁性纳米粒子和细菌的结合物以平板菌落计数法进行验证。检测结果表明：荧光显微镜计数法的结果与平板菌落计数法的结果很吻合。
Claims (8)
1.一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，提供了Fe3O4磁性纳米粒子制备条件及溶胶凝胶功能化条件，其特征在于包括如下步骤：
(1)超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子的制备
采用共沉淀方法合成Fe3O4磁性纳米粒子：将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别溶于HCl溶液中，浓度均为1M，将两种溶液进行机械搅拌混合，通入氮气保护，加入氨水，使溶液pH达到11，在室温下剧烈搅拌30min，以钕铁硼磁铁进行磁分离，分别用高纯水、无水乙醇依次清洗各3次，60℃真空干燥12h；
(2)Fe3O4磁性纳米粒子的硅烷功能化
1)Fe3O4磁性纳米粒子包覆四乙氧基硅烷(TEOS)
将真空干燥后的Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇和水的体积比为1～50∶1的乙醇水溶液中，超声混合，调节溶液的pH值为9，加入四乙氧基硅烷(TEOS)，机械搅拌并氮气保护，室温反应(4～24)h，然后以钕铁硼磁铁进行磁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
2)硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子的氨基功能化
将真空干燥后的硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子分散混合有机溶液中，超声混合，加入γ-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)混合均匀，在容器中机械搅拌并氮气保护，室温24h，最后以钕铁硼磁铁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
3)氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子的羧基功能化
将真空干燥后的氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子分散于无水甲苯中，加入戊二酸酐，机械搅拌并氮气保护，室温反应(2～8)h，最后以钕铁硼磁铁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；
(3)乳酸链球菌素(Nisin)功能化磁性磁性纳米粒子的制备
将羧基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子分散于pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液中，加入EDC.HCl和NHS，室温反应30min，以以钕铁硼磁铁分离，高纯水清洗磁球3次，在这过程中以钕铁硼磁铁富集，最后将其重新分散于pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液中，加入乳酸链球菌素(Nisin)，室温反应(1～4h)，以钕铁硼磁铁分离后富集，用磷酸缓冲溶液清洗3次即可得到Nisin修饰的Fe304磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中HCl溶液的浓度为2M，FeCl3·6H20和FeS04·7H20的摩尔比为2∶1，氨水的重量百分比浓度为28％。
3.根据权利要求1所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)1)中Fe3O4磁性纳米粒子在乙醇水溶液中的浓度为0.05～2％，四乙氧基硅烷(TEOS)占上述溶液重量百分比浓度为0.1～2％。
4.根据权利要求1所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)2)中混合有机溶液中为N，N，-二甲基甲酰胺和甲苯，其体积比为1～10∶2；硅包覆的Fe3O4磁性纳米粒子在混合有机溶液中的重量百分比浓度为0.05～2％；γ-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)占上述溶液重量百分比浓度为0.5～5％。
5.根据权利要求1所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)3)中氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子在无水甲苯中的重量百分比浓度为0.1～2％；戊二酸酐占上述溶液重量百分比浓度为0.5～10％。
6.根据权利要求1所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中羧基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子为5～50mg，pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液为50mL；EDC·HCl和NHS的摩尔比为1∶1，加入量为10～100mg；乳酸链球菌素(Nisin)的加入量为(10～100)mg。
7.一种所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的应用，用于农产品中致病微生物的检测，其特征在于具体步骤如下：农产品经匀浆处理并以pH5.8～7.4缓冲液稀释或是直接以pH5.8～7.4缓冲液淋洗并收集，取匀浆稀释液或淋洗液与Nisin修饰的磁性纳米粒子振荡吸附，将Nisin修饰的磁性纳米粒子和细菌的结合物以无菌生理盐水清洗3次，在此过程中以外部磁铁进行富集，将其进行荧光染色，以荧光显微镜进行检测。
8.根据权利要求7所述乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的应用，其特征在于：所述pH5.8～7.4缓冲液中含有重量百分比浓度为0.9％的NaCl。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111109 Termination date: 20121113 |