CN106248933A - 基于pgm和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法 - Google Patents

基于pgm和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于PGM和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，包括以下步骤：用化学共沉淀法合成磁性二氧化硅纳米微球；完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化；然后与戊二醛反应，离心分离得到醛基化的磁性二氧化硅微球；再与阪崎克罗诺杆菌多克隆抗体结合，制得表面修饰有阪崎克罗诺杆菌抗体的免疫磁珠；取免疫磁珠与检测样本菌悬液混合，37℃下孵育45 min后，用磁铁吸附2 min，分离上清和磁珠，加入葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7 h后，用电流型便携式葡萄糖传感器检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC=C1－C2，最后根据线性方程为ΔC(mmol/L)=5.36lg[CFU·ml‑1]‑5.74，计算被检测样本中阪崎克罗诺杆菌的数量，实现定量检测。

Description

基于PGM和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种基于电流型便携式葡萄糖传感器(PGM)和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法。
背景技术
阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii,简称C.sakazakii)，是一种革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科，来源广泛，对成年人而言是一种条件致病菌，危害不大，但对婴幼儿危害却非常严重，特别是对于早产和免疫功能低下婴儿的危害特别严重，其感染婴儿的死亡率高达40-80％。目前对C.sakazakiisyn检测方法主要有传统检测方法和各种PCR法，我国对于C.sakazakiisyn的国标传统的检测方法完成整个检测程序需要6～7d，耗时且过程复杂。PCR法虽然具有敏感、快速等优点，但是成本高、操作复杂以及对工作人员要求高等缺陷，而使其难以在基层检测单位普及和推广。因此，研制出更好的快速检测方法对该菌的检测具有重要的现实意义。
现有技术中S.aureus的定性和定量检测方法不足之处在于如果样品中目的菌的含量较少时，对6h培养物进行检测时，结果不确实，需要对待测样品进行培养24h再进行检测，才能获得准确结果，虽然已经是比较快且具有准确稳定简便经济等突出优点，但怎样使低污染样品也能在6h培养物检测时获得准确稳定的结果，就需要进一步有效改善检测方法的敏感性。
电流型便携式葡萄糖传感器(简称便携式血糖仪，Personal glucose meters，PGM)具有体积微小、便携、经济、操作简便、快速准确等突出优点，己被广泛应用于糖尿病患者血糖的医院随时检测和自我监测。将具有如此突出优点和成熟的检测技术引入到繁琐的食品致病菌和抗生素残留的快速检测领域，具有很好的创新性、研究价值和应用前景。目前仅有的基于PGM构建的对非糖类物质检测的方法所必须用到的蔗糖转化酶标记抗体或核酸类物质等生物制剂的制备较繁琐，活性等易受贮存时间和贮存环境等条件作用而降低，不但影响检测结果的准确性，同时，在简便、快捷和经济方面的优势也受到了很大影响。
免疫磁性分离技术是(Immunomagnetic separation,IMS)以其高特异性、快速高效、操作简便和不需要昂贵的仪器设备等优点，目前已广泛应用在微生物学检测、生物分离、医学治疗及环境检测等。免疫磁珠(Immunemagnetic beads，简称IMB)，目前应用最广的为核壳免疫磁珠，其核心部分为稳定的高磁性材料(Fe3O4，Fe2O3)，核外包裹一层高分子材料(如聚氯乙稀，二氧化硅)，最外层是功能基层(如羟基，氨基，醛基)。IMBS具有特异性强，操作简便，耗时短，效率高和不需要昂贵的外用仪器等优点，将其应用于食源性致病菌的前处理中，可以直接从样品中或前增菌物中分离靶细菌，可以取代传统的增菌过程，能高效地富集样品中的少量目标菌，可使采样和检测的时间减少1d，提高对食源性致病菌检测的效率，同时也提高了检测的准确性和灵敏性。
食品中组分复杂，含有多种杂菌，严重干扰了目标菌的检测，检测前通常需要对样品进增菌、分离培养和纯培养，达到富集目标菌的目的。免疫磁性分离技术是具有高特异性和快速、简便和易分离的一种分离技术，通过IMNS对目标菌进行富集分离，目标菌与IMNS发生特应性反应从而被捕获到微球表面。应用免疫磁性技术能从病原菌很少的用品中快速富集目标菌，用集菌来取代増菌步骤，提高检出率，缩短检出时间，以提供更快捷的快速检测方法。
发明内容
为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种基于PGM和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法。
基于PGM和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用化学共沉淀法合成磁性二氧化硅纳米微球；
(2)将磁性二氧化硅纳米微球选混于乙醇中，完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化；然后将氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球与戊二醛反应，离心分离得到醛基化的磁性二氧化硅微球；将醛基化的磁性二氧化硅微球颗粒与阪崎克罗诺杆菌多克隆抗体结合，制得表面修饰有阪崎克罗诺杆菌抗体的免疫磁珠；
(3)取步骤(2)所得免疫磁珠60μL，加入到1mL检测样本菌悬液中，37℃下孵育45min后，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃去上清，加入PBS洗涤，混合均匀，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃去上清，重复洗涤3次，每个离心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7h后，用电流型便携式葡萄糖传感器检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化ΔC，ΔC＝C1－C2，C1为0h培养物中葡萄糖浓度，C2为7h培养物中葡萄糖浓度；
(4)根据线性方程为ΔC(mmol/L)＝5.36lg[CFU·ml-1]-5.74，计算检测样本中阪崎克罗诺杆菌的数量。
进一步地，步骤(1)用化学共沉淀法合成磁性二氧化硅纳米微球的具体步骤包括：取1.35mM FeCl2·4H2O溶解于盛有70mL蒸馏水的三颈烧瓶中，在N2保护下剧烈搅拌，再将2.7mM FeCl3·6H2O和5mL氨水迅速加入到体系中，迅速升温至80℃持续反应80min；反应结束后，将得到的黑色沉淀物用磁铁磁性分离，用蒸馏水洗涤数次，定容于60mL蒸馏水中，得Fe3O4溶液；取Fe3O4溶液30mL置于250mL的烧瓶中，在烧杯中再加入60mL乙醇和9mL氨水，混合后搅拌，然后再加入50μL TEOS和200μL APTMS，在35℃下搅拌反应1h，取出搅拌子静置过夜；将其依次用乙醇和蒸馏水洗涤，分离得到沉淀物即为磁性二氧化硅微球。
步骤(2)的具体步骤是：取250μL磁性二氧化硅微球悬混于20mL乙醇中，加入100μLAPTMS，于室温下搅拌反应12h，离心分离；然后依次采用乙醇和pH7.3的PBS溶液进行洗涤，再离心分离，即完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化；取20mL氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球悬浊液，再加入10mL2.5％戊二醛，于室温下搅拌反应3h，再离心分离，即完成微球的醛基化；将醛基化的磁性二氧化硅微球颗粒悬混于10mL PBS溶液，加入40μL阪崎克罗诺杆菌多克隆抗体，于37℃下温育3h，离心分离，即制得表面修饰有阪崎克罗诺杆菌抗体的免疫磁性微球；将免疫磁性微球混合于10mL PBS溶液中，加入1mL浓度为1％的BSA，在室温下搅拌2h，以封闭免疫磁性微球表面非特异性结合醛基位点，离心分离，最后以PBS溶液洗涤，并悬混于10mL PBS溶液，4℃下保存。
用IMB和PGM检测C.sakazakiisyn的各检测步骤及其原理如图1所示，C.sakazakiisyn在生长代谢时往往可以利用葡萄糖作为碳源，在葡萄糖-肉汤培养液中，C.sakazakiisyn以葡萄糖作为第一碳源，在生长代谢过程中不断消耗葡萄糖，引起培养液中葡萄糖浓度发生变化(ΔC)。用免疫磁珠将样品中的C.sakazakiisyn富集下来，洗涤数次，再加200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液中，37℃培养7h后，随着时间的增长，C.sakazakiisyn利用培养液中的葡萄糖不断生长繁殖，导致培养液中葡萄糖被消耗而浓度逐渐减小，葡萄糖浓度可由PGM测得，并且葡萄糖的消耗量与菌浓度有关。结果表明，该方法可通过用PGM测定培养物中葡萄糖浓度变化量(ΔC)来检测C.sakazakiisyn。
基于免疫磁性纳米微球(Immunomagnetic nanospheres，IMNs)的特异性和富集作用，结合PGM及其配套电极，以婴幼儿配方奶粉中对婴幼儿威胁最严重的致病菌--阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakiisyn，C.sakazakiisyn)为检测对象，以创建一种快速、准确和灵敏的食品致病菌检测新技术。通过化学共沉淀法合成磁性纳米粒子，通过硅烷化和醛基化进行活化，在活化后的磁球表面偶联上抗C.sakazakiisyn的多克隆抗体，将制成的IMNs的用于捕获和富集样品中的C.sakazakiisyn，形成IMNs-C.sakazakiisyn复合物。经磁分离，将IMNs-C.sakazakiisyn复合物加入到设计研究好的专用培养基中。通过对IMNs的工作浓度、孵育时间、磁分离时间等参数的优化和选择，并对其它几种细菌进行特异性检测。结果表明，在最佳检测条件下，当C.sakazakiisyn浓度在101～105cfu/mL变化时，葡萄糖浓度变化量(ΔC)随菌浓度对数值的增加而呈相应的线性增长，检出限为5.2×101cfu/mL(S/N＝3)。此方法无需耗时的増菌和分离纯化培养过程和复杂的检测过程，简便、经济和快速，并且显著增加了检测的灵敏度、特异性和准确性，是一种应用前景很好的奶粉和牛奶中C.sakazakiisyn的快速检测方法。
附图说明
图1是PGM检测阪崎克罗诺杆菌的原理图。
图2是Fe3O4@SiO2磁球透射电子显微镜(TEM)照片。
图3是是Fe3O4,Fe3O4@SiO2,Fe3O4@SiO2-NH2和Fe3O4@SiO2@抗体的红外光谱图。
图4在不同体积免疫磁珠下的葡萄糖浓度变化曲线图。
图5是不同孵育时间下的葡萄糖浓度变化曲线图。
图6是不同磁分离时间下的葡萄糖浓度变化曲线图。
图7是特异性试验示意图。
图8是葡萄糖浓度变化(ΔC)与阪崎克罗诺杆菌浓度对数的关系图。
具体实施方式
实施例1：
(一)磁性二氧化硅纳米微球的合成
利用化学共沉淀法合成磁性Fe3O4，取FeCl2·4H2O(1.35mM)溶解于盛有70mL蒸馏水的三颈烧瓶中，在N2保护下剧烈搅拌，再将FeCl3·6H2O(2.7mM)和5mL氨水迅速加入到体系中，迅速升温至80℃持续反应80min。反应结束后，将得到的黑色沉淀物用磁铁磁性分离，用蒸馏水洗涤数次，定容于60mL蒸馏水中。
取上述Fe3O4溶液30mL置于250mL的烧瓶中，在烧杯中再加入60mL乙醇和9mL氨水，混合后搅拌，然后再加入50μL TEOS和200μL APTMS，在35℃下搅拌反应1h，取出搅拌子静置过夜。将其依次用乙醇和蒸馏水洗涤。在每次清洗过程中，都应利用外加磁场使磁性微球从分散的溶液中沉淀下来，分离最终得到的沉淀物即为磁性二氧化硅微球。
(二)磁性二氧化硅颗粒的氨基硅烷化及抗体标记
利用戊二醛作为偶联剂合成磁性免疫微球。①取一定量(250μL)磁性二氧化硅微球悬混于20mL乙醇中，加入100μL APTMS，于室温下搅拌反应12h，离心分离；然后依次采用乙醇和PBS溶液(pH7.3)进行洗涤，再离心分离，即完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化。②取20mL氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球悬浊液，再加入10mL 2.5％戊二醛，于室温下搅拌反应3h，再离心分离，即完成微球的醛基化。③将醛基化的磁性二氧化硅微球颗粒悬混于10mL PBS溶液，加入40μL C.sakazakiisyn多克隆抗体，于37℃下温育3h，离心分离，即制得表面修饰有C.sakazakiisyn抗体的免疫磁性微球。然后，将颗粒混合于10mL PBS溶液中，加入1mL浓度为1％的BSA，在室温下搅拌2h，以封闭免疫磁性微球表面非特异性结合(醛基)位点，离心分离，最后以PBS溶液洗涤，并悬混于10mL PBS溶液，直接用于分析或于4℃下保存。
利用透射电子显微镜(TEM)观察磁性纳米粒子的颗粒形态和分散状态，并测定其粒径大小。将合成好的磁性纳米粒子用超纯水稀释到合适的浓度，取一到两滴滴在铜网的碳支持膜上，在室温下晾干，并放置一段时间(约15-20min)，在透射电子显微镜下观察磁性纳米粒子的大小及状态。如图2所示，TEM照片可以看出磁性Fe3O4纳米颗粒已经被二氧化硅包裹，可以明显看到核壳结构，中间深色部分为磁性Fe3O4纳米颗粒，外面一层灰色的为二氧化硅。从图中也可看出，所制得的Fe3O4@SiO2磁球具有外观成球性较好，球体表面均匀，无杂质粘连，很好的分散性，且粒径均匀，粒径在160-200nm之间，平均约为180nm,球与球之间无粘连，分散性好。
取少量所测样品干燥过夜，与KBr粉末混研、压片，在Thermo Nicolet 380傅立叶变换红外光谱仪上，4000-400cm-1，测定红外光谱。分辨率为0.4cm-1，，扫描次数为32次，测定吸收信号。图3是Fe3O4,Fe3O4@SiO2,Fe3O4@SiO2-NH2和Fe3O4@SiO2@抗体的红外光谱图。(a)是Fe3O4纳米粒子的红外图谱，582cm-1是Fe3O4纳米粒子的Fe-O键的特征吸收峰。(b)是Fe3O4@SiO2纳米粒子的红外图谱，可看到在1050cm-1处有较大并且较宽的吸收峰，而SiO2的标准图谱中1103cm-1处较大并且较宽的吸收峰，为Si-O的伸缩振动峰，因此与纯SiO2的标准图谱相比，1103cm-1处较大且较宽的吸收峰Si-O的伸缩振动峰发生了“红移”，向低波数方向移动，证明了Fe3O4的表面羟基与SiO2层发生了化学反应。(b)是修饰上氨基的Fe3O4@SiO2纳米粒子的红外图谱，观察到的1543和1389cm-1两处的峰为-NH2的特征峰，并且在2925和2850cm-1处对应的为APTMS的C-H伸缩振动峰，表明氨基已经修饰到Fe3O4@SiO2纳米粒子上(b)是修饰上抗体的Fe3O4@SiO2纳米粒子的红外图谱，在1543和1389cm-1两处-NH2的特征峰的消失表明抗体已经成功的修饰到了Fe3O4@SiO2纳米粒子上。(三)菌株制备
取C.sakazakiisyn斜面菌种1支，在无菌操作台下进行操作，用接种环挑取一环，接入营养肉汤培养基中，静置于37℃的培养箱培养18h，制备获得C.sakazakiisyn菌悬液，将菌悬液用生理盐水稀释为101-105cfu/mL。
实施例2：免疫磁珠及血糖仪检测C.sakazakiisyn方法的建立
(一)免疫磁珠最佳工作浓度的确定
分别取免疫磁珠(IMB)20μL，40μL，60μL，80μL，100μL，120μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn菌悬液(105cfu/mL)中，37℃下孵育45min后，用磁铁吸附2min-3min，分离上清和磁珠，弃去上清，加入PBS洗涤悬浮，充分混匀，用磁铁吸附2min-3min，分离上清和磁珠，弃去上清，重复洗涤3次，每管加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7h后，检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2,C1为0h培养物中葡萄糖浓度，C2为7h培养物中葡萄糖浓度。
(二)免疫磁珠与菌液最佳作用时间
取IMB 60μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn菌悬液(105cfu/mL)中，37℃下分别孵育5min、15min、30min、45min、60min后，用磁铁吸附2min-3min，分离上清和磁珠，弃去上清，加入PBS洗涤，混合均匀，用磁铁吸附2min-3min，分离上清和磁珠，弃去上清，重复洗涤3次，每个离心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7h后，检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2,C1为0h培养物中葡萄糖浓度，C2为7h培养物中葡萄糖浓度。
用PGM测定7h后培养物中葡萄糖浓度变化量(ΔC)，若加入的免疫磁珠过多或过少时ΔC都会变小，即细菌的富集量减少，因此选用60μL作为免疫磁珠的最适工作浓度，确定菌液中免疫磁珠的最适工作体积为60μL，结果见图4。
(三)磁孵育和分离的最佳时间
IMB 60μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn菌悬液(105cfu/mL)中，37℃下孵育45min后，分别用磁铁吸附0.5min、1min、1.5min、2min、5min、10min，分离上清和磁珠，弃去上清，加入PBS洗涤，充分混匀，用磁铁吸附0.5min、1min、2min、3min、5min、10min，分离上清和磁珠，弃去上清，重复洗涤3次，每个离线管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7h后，检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2,C1为0h培养物中葡萄糖浓度，C2为7h培养物中葡萄糖浓度。
孵育的时间越长，免疫磁珠越有利于吸附目标菌，磁珠越小会使粒子的布朗运动越激烈，和目标菌结合的速度就越快，但是孵育时间太长不仅会增加非特异性吸附，又延长了检测时间。用PGM测定7h后培养物中葡萄糖浓度变化量(ΔC)，结果如图5所示，当孵育时间达到45min时，ΔC达到最大值，并且之后趋于平缓，因此为使达到最佳捕获效率，在之后的试验中孵育时间均为45min。
免疫磁珠吸附目标菌后，在吸铁石的作用下会被磁铁吸附聚集起来，从而达到分离的效果，其分离速度受磁场的大小、免疫磁珠的大小、目标菌表面结合的免疫磁珠的量、目标菌大小和样品粘稠力等因素的影响。用PGM测定7h后培养物中葡萄糖浓度变化量(ΔC)，结果如图6所示，当磁分离时间为2min时，ΔC达到最大值，并且之后趋于平缓，考虑到磁分离时间可能会受到样品基质的影响，为得到最佳的富集效率，在后面的试验中选定的最适磁分离时间为2min。
(四)特异性试验
取IMB 60μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn,S.aureus,E.coli,V.parahaemolyticus,B.cereus,B.subtillis和S.gallinarum菌悬液(105cfu/mL)中，37℃下孵育45min后，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃去上清，加入PBS洗涤，混合均匀，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃去上清，重复洗涤3次，每个离心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7h后，检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2,C1为0h培养物中葡萄糖浓度，C2为7h培养物中葡萄糖浓度。
用PGM分别测定7h后的C.sakazakiisyn,S.aureus,E.coli,V.parahaemolyticus,B.cereus,B.subtillis和S.gallinarum培养物中葡萄糖浓度变化量(ΔC)，如图7所示，C.sakazakiisyn培养物中的ΔC最大，其他几种菌培养物中的ΔC明显低于C.sakazakiisyn的，结果表明此方法对C.sakazakiisyn的检测有较好的特异性。
实施例3：葡萄糖浓度变化量(ΔC)与菌液浓度的关系
IMB 60μL，加入到1mL的浓度梯度为101-105cfu/mL的C.sakazakiisyn菌悬液中，37℃下孵育45min后，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃去上清，加入PBS洗涤，混合均匀，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃去上清，重复洗涤3次，每个离心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7h后，检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2,C1为0h培养物中葡萄糖浓度，C2为7h培养物中葡萄糖浓度。
在最佳条件下，各浓度梯度C.sakazakiisyn标准菌液在葡萄糖-肉汤培养液中培养7h后，培养物中葡萄糖浓度变化量(ΔC)与C.sakazakiisyn浓度如图8所示。当C.sakazakiisyn浓度在101-105cfu/mL范围内变化时，培养物中葡萄糖浓度变化量(ΔC)与C.sakazakiisyn浓度对数值呈良好的线性关系，线性方程为ΔC(mmol/L)＝5.36lg[CFU·ml-1]-5.74，相关系数R为0.9844，检出限为5.2×101cfu/mL(S/N＝3)。
实施例4：准确性试验
将牛奶三类样品分别随机分成5组，每组3份，分别用PGM进行检测，每份样品测定5次，并将检测结果与国标法进行对比。
在最佳条件下，分别用本发明方法与国标法对各样品进行检测，检测结果如下表所示。由表可知，与国标法相比，该方法具有较高的准确率，结果表明便携式PGM对奶粉中C.sakazakiisyn的检测有良好的准确度和灵敏度。
本发明基于PGM和免疫磁性分离技术，以葡萄糖为信号转换分子，利用合成的免疫磁球富集分离样品中的目标菌，发展了一种新颖的、简便、快速、经济的方法用于C.sakazakiisyn的检测。合成免疫磁性微球，富集分离C.sakazakiisyn，利用附着在免疫磁性微球的C.sakazakiisyn在生长过程中消耗葡萄糖，将C.sakazakiisyn的检测转换成对葡萄糖的检测。本方法具有良好的特异性，并且与GB方法相比，具有较好的准确性。研究证明，PGM结合磁性分离技术可以准确检测出样品中的C.sakazakiisyn，因此为C.sakazakiisyn的快速检测提供了一种新的手段和方法。

Claims (3)

1.基于PGM和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用化学共沉淀法合成磁性二氧化硅纳米微球；
(2)将磁性二氧化硅纳米微球选混于乙醇中，完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化；然后将氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球与戊二醛反应，离心分离得到醛基化的磁性二氧化硅微球；将醛基化的磁性二氧化硅微球颗粒与阪崎克罗诺杆菌多克隆抗体结合，制得表面修饰有阪崎克罗诺杆菌抗体的免疫磁珠；
(3)取步骤(2)所得免疫磁珠60μL，加入到1mL检测样本中，37℃下孵育45min后，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃除上清，加入PBS洗涤，混合均匀，用磁铁吸附2min，分离上清和磁珠，弃除上清，重复洗涤3次，每个离心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的营养肉汤培养液，37℃培养7h后，用电流型便携式葡萄糖传感器检测并计算各培养物中葡萄糖浓度的变化ΔC，ΔC＝C1－C2，C1为0h培养物中葡萄糖浓度，C2为7h培养物中葡萄糖浓度；
(4)根据线性方程为ΔC(mmol/L)＝5.36lg[CFU·ml-1]-5.74，计算检测样本中阪崎克罗诺杆菌的数量。
2.如权利要求1所述的快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)用化学共沉淀法合成磁性二氧化硅纳米微球的具体步骤包括：取1.35mM FeCl2·4H2O溶解于盛有70mL蒸馏水的三颈烧瓶中，在N2保护下剧烈搅拌，再将2.7mM FeCl3·6H2O和5mL氨水迅速加入到体系中，迅速升温至80℃持续反应80min；反应结束后，将得到的黑色沉淀物用磁铁磁性分离，用蒸馏水洗涤数次，定容于60mL蒸馏水中，得Fe3O4溶液；取Fe3O4溶液30mL置于250mL的烧瓶中，在烧杯中再加入60mL乙醇和9mL氨水，混合后搅拌，然后再加入50μL TEOS和200μL APTMS，在35℃下搅拌反应1h，取出搅拌子静置过夜；将其依次用乙醇和蒸馏水洗涤，分离得到沉淀物即为磁性二氧化硅微球。
3.如权利要求1所述的快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤是：取250μL磁性二氧化硅微球悬混于20mL乙醇中，加入100μL APTMS，于室温下搅拌反应12h，离心分离；然后依次采用乙醇和pH7.3的PBS溶液进行洗涤，再离心分离，即完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化；取20mL氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球悬浊液，再加入10mL2.5％戊二醛，于室温下搅拌反应3h，再离心分离，即完成微球的醛基化；将醛基化的磁性二氧化硅微球颗粒悬混于10mL PBS溶液，加入40μL阪崎克罗诺杆菌多克隆抗体，于37℃下温育3h，离心分离，即制得表面修饰有阪崎克罗诺杆菌抗体的免疫磁性微球；将免疫磁性微球混合于10mL PBS溶液中，加入1mL浓度为1％的BSA，在室温下搅拌2h，以封闭免疫磁性微球表面非特异性结合醛基位点，离心分离，最后以PBS溶液洗涤，并悬混于10mL PBS溶液，4℃下保存。
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