CN105950471A - 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用，属于食品安全技术领域。本发明所提供的方法为将阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠，然后利用获得的免疫磁珠对置于捕获体系中进行捕获。本发明方法可以快速、高效的捕获并富集阪崎克罗诺杆菌，尤其是在纯培养物和乳制品中，改善了传统前增菌过程的弊端，大大缩短了增菌时间，具有耗时短，操作简便特异性强、灵敏度高、耗时短等优点，为实现快速检测阪崎克罗诺杆菌提供了前提条件，同时为各种病原体的检测提供了新的前处理方法。可以用于克罗诺杆菌的富集、分离和检测。

Description

一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用，属于食品安全技术领域。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)，原阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，属于肠杆菌科，是一种氧化酶阴性、兼性厌氧、革兰氏阴性杆菌，周生鞭毛能运动。阪崎克罗诺杆菌能感染新生儿，尤其是早产儿，死亡率高达33％～80％。食用含有克罗诺杆菌的食品会引发坏死性小肠结肠炎、败血症、脑脊膜炎等疾病，致死率高达80％。大量研究表明，克罗诺杆菌感染是新生儿的最主要风险危害因素之一。根据CDC，FDA和WHO的公开记录显示，克罗诺杆菌的感染有90％以上是来自于婴儿配方粉。因此如何快速灵敏的检出食品中(特别是婴儿配方粉中)的阪崎克罗诺杆菌显得尤为重要。

现阶段现有的检测克罗诺杆菌的方法包括传统微生物培养法、分子生物学检测方法、免疫学检测方法以及一些新型检测技术。对于阪崎克罗诺杆菌的检测，我国食品安全国家标准GB 4789.40和行业标准SN 1632中规定采用平皿培养法，即通过增菌培养、分离、生化鉴定进行定性、定量检验。但该传统检测方法的检测时间高达72个小时，其中前增菌和增菌过程达到了40个小时。新型检测技术虽然具有灵敏度高、特异性强等优点，然而却都需要经过较长的前增菌过程。而这则是现阶段影响食品安全快速检测领域亟待解决的一大问题瓶颈之一。

免疫磁珠由磁性载体微球和免疫配基结合而成。免疫微球通过表面的氨基、羧基等功能集团共价偶联免疫活性物质，从而具有特异性结合目标分子的能力。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法，该方法是将阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠，然后利用获得的免疫磁珠对置于捕获体系中进行捕获。

优选地，所述方法，步骤如下：

1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液混合，获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获。

更优选地，所述方法，步骤如下：

1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液按照质量比为5:2.5-5:7.5进行活化，获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液按照质量比为1:1-5:2混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；所述免疫磁珠，添加量为每400μL捕获体系中添加50μL-100μL免疫磁珠。

更优选地，所述方法，步骤如下：

1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与MES溶液混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于MES溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于MES溶液中，然后再按照羧基磁珠与EDC溶液的质量比为5:2.5-5:7.5加入EDC溶液进行活化，获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的活化的羧基磁珠磁分离后，重悬于MEST溶液中，按照羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液的质量比为1:1-5:2加入阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液进行共价偶联，然后用PBST溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得免疫磁珠；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；所述免疫磁珠，添加量为每400μL捕获体系中添加50μL-100μL免疫磁珠。

优选地，步骤1)所述超声，为200w，10min。

优选地，步骤2)所述MEST溶液为含有0.02％-0.08％v/v Tween-20的MES溶液，pH为5.5-6.5。

优选地，步骤3)所述捕获体系，为阪崎克罗诺杆菌纯培养物、乳或乳制品。

优选地，步骤3)所述捕获，时间为30min-60min。

优选地，所述方法，具体步骤为：

1)将羧基磁珠与MES溶液混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于MES溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于MES溶液中，按照羧基磁珠与EDC溶液质量比为5:6加入EDC溶液，室温下振荡后获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的活化的羧基磁珠磁分离后，重悬于MEST溶液中，按照羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液质量比为5:4加入阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液，室温下振荡过夜，PBST溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得免疫磁珠；MEST溶液为含有0.02％v/v Tween-20的MES溶液，pH为6.5；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；所述免疫磁珠，添加量为每400μL捕获体系中添加75μL免疫磁珠。

以上所述任一方法在克罗诺杆菌的富集、分离和检测中的应用。

本发明将阪崎克罗诺杆菌抗体与Fe₃O₄磁珠偶联，制备特异性免疫磁珠并快速富集乳中的阪崎克罗诺杆菌。

本发明方法是基于免疫磁珠法捕获富集乳中克罗诺杆菌的快速检测前增菌方法，在多个方面具有较高的应用价值。由于磁珠具备的超顺磁性，使其在液体中具备良好的分散性，因而可以在复杂的乳基质中实现较高的灵敏度；磁珠所包被的免疫活性物质决定了此方法良好的特异性；磁性颗粒捕获菌体后，既可以通过量子点发光、化学发光等方法直接观测定性结果，也可以与分子检测技术联用；同时，磁珠的可再生性也降低了检测成本。以上特质特点，决定了此方法可以广泛应用于检测机构、企业。基于此前增菌技术亦可以进一步开发试剂盒，其成本低、高效的特点，也可以满足基层单位的需要。因此，此方法具有良好的应用前景，并有能力带来可观的经济效益。在学术方面，免疫磁珠法捕获食品中的克罗诺杆菌突破了传统检测技术中所必需的纯培养的富集方法，大大缩短了检测时间。同时，还形成了涵盖物理学、化学、生物学和免疫学领域的集成检测体系。

本发明有益效果：

1、本发明将阪崎克罗诺杆菌的特异性抗体与羧基磁珠进行共价偶联，将特异性抗体包被于磁性颗粒表面以及抗原形成复合物，从而制备得到免疫磁珠，本发明方法可以快速、高效的捕获并富集阪崎克罗诺杆菌，尤其是在纯培养物和乳制品中，改善了传统前增菌过程的弊端，大大缩短了增菌时间，具有耗时短，操作简便特异性强、灵敏度高、耗时短等优点，同时在磁场的作用下，可达到分离、富集、用于后续检测的目的，本发明方法为实现快速检测阪崎克罗诺杆菌提供了前提条件，同时为各种病原体的检测提供了新的前处理方法。

2、本发明利用克罗诺杆菌的单克隆抗体制备免疫磁珠，建立了完整的免疫磁捕获体系，对细菌浓度为10⁴～10⁵cfu/mL的菌悬液的捕获量达到6×10⁴cfu/mg，同等浓度乳体系中的捕获量也达到了8×10³cfu/mg，捕获时间仅为1小时，比传统富集方式大大缩短，能够实现短时间内对乳中克罗诺杆菌的快速富集，为致病菌的检测提供了一种全新有效的富集方式。同时，实验的操作步骤简单，也不需要专业技术人员，成为可以替代传统增菌方法的新技术。

3、本发明方法特异性强，且针对纯培养物中阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度达到10²～10³cfu/mL，乳中阪崎克罗诺杆菌的灵敏度达到10³～10⁴cfu/mL。该方法能够大大缩短阪崎克罗诺杆菌的增菌时间，辅以适宜的检测方法即可实现对乳中阪崎克罗诺杆菌的快速富集，并且具有更高的特异性。

附图说明

图1为抗体效价的测定结果。

图2为抗体特异性检测结果。

图3为EDC添加量与抗体偶联效率的关系。

图4为抗体添加量的确定。

图5为偶联缓冲液pH值的优化。

图6为偶联缓冲液中吐温-20添加量的优化。

图7为不同偶联缓冲液的比较。

图8为免疫磁捕获时间的优化。

图9为免疫磁珠添加量的优化。

图10为免疫磁珠对不同浓度细菌的捕获。

图11为免疫磁珠对乳体系中克罗诺杆菌的捕获。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

1材料与方法

1.1主要菌株

本实验所用菌株如下表1所示：

表1菌种信息

阪崎克罗诺杆菌标准菌株ATCC 29544，ATCC 29004，ATCC 12868，产气肠杆菌ATCC13048，阴沟肠杆菌ATCC 3503，大肠杆菌CMCC B4413，单增李斯特菌CMCC 54006，分别购自美国模式培养物集存库ATCC和中国医学微生物菌种保藏中心CMCC。

1.2实验方法

1.2.1菌株的培养

将已纯化的菌液以2％接种量接种于20mL灭菌的NB液体培养基中，200r/min条件下，37℃摇床培养8h，即得到处于对数生长期的阪崎克罗诺杆菌菌液，以用于后续实验。

1.2.2抗体效价测定方法

方法为：1)选择细菌浓度为10⁸～10⁹cfu/ml的克罗诺杆菌培养液，取100ul加至96孔酶标板，37℃包被2小时；2)倒掉细菌培养液，加入100ul 3％BSA溶液，37℃封闭2小时；3)倒掉BSA溶液，将1mg/ml的克罗诺杆菌单抗梯度稀释100、500、1000、2000、4000、8000倍，各加入100ul，37℃孵育1小时；同时，空白对照组加入100ul抗体稀释液；4)洗涤并拍板以去除未结合的一抗，加入100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1小时；5)洗涤并拍板后，加入100ul TMB显色液，37℃孵育20分钟；6)加入50ul 2M硫酸终止反应，放入酶标仪，读取450nm波长下的吸光值。所得数据中，吸光值为空白孔2倍以上的即为阳性，阳性孔中，最大的稀释倍数即为抗体效价。

1.2.3抗体特异性评价方法

选取1.2.2方法中所得抗体效价的75％作为克罗诺杆菌单抗稀释的最佳倍数，即1440倍。将产气肠杆菌ATCC 13048、阴沟肠杆菌ATCC 3503、大肠杆菌CMCC B4413、单增李斯特菌CMCC 54006、克罗诺杆菌ATCC 29544、ATCC 12868、ATCC 29004、ATCC BAA-894包被于96孔板，利用间接ELISA方法，检测抗体的特异性。其中，空白对照组包被细菌培养基100ul，吸光值为空白孔2倍以上即为阳性。

1.2.4免疫磁珠的制备方法

免疫磁珠的制备主要分为两个步骤：羧基的活化和抗体的偶联。羧基磁珠表面生物分子的活化是将含有羧基的分子或基团先与EDC反应生成中间体O-酰基异硫脲，而后中间体与氨基反应生成目标产物和脲。

1)羧基磁珠的活化

取100ul羧基磁珠于离心管中，加入400ul MES溶液；将离心管置于磁分离架上，静置2分钟后，弃上清；重悬于400ul MES溶液中，200w超声10分钟，磁分离后，弃上清；洗涤两次，重悬于400ul MES溶液中，再加入120ul 10mg/ml EDC溶液，室温下轻柔振荡30分钟；而后洗涤三次，30分钟内，与抗体偶联。

2)抗体的偶联

将活化好的磁珠磁分离后，重悬与400ul MEST溶液中，加入80ul抗体溶液，室温下轻柔振荡过夜。PBST洗涤三次后，重悬于PBS溶液中，保存于4℃冰箱内备用。

1.2.5抗体偶联量的测定

取羧基磁珠偶联前后的抗体溶液，用MES缓冲溶液稀释一定倍数，分别测定260nm和280nm波长下的光密度值，再按照如下Lowry-Kalokar公式计算抗体溶液的浓度，样品蛋白浓度＝1.45×OD₂₉₀-0.74×OD₂₆₀并依此计算抗体偶联量，计算偶联效率。

1.2.6免疫磁珠细菌捕获方法

1)免疫磁珠在细菌悬浮液中的捕获

取400ul细菌培养液加至2ml离心管中，再加入50ul制备好的免疫磁珠悬浮液，在37℃的条件下，轻柔混匀；1小时后，取出离心管，置于磁性分离架上，静置1分钟，重悬于400ul PBS中，再次置于磁性分离架上；如此反复洗涤3-5次，以此去除未与免疫磁珠特异性结合的细菌；最后，重悬于100ul PBS缓冲液中，用于后续的检测。

2)免疫磁珠在乳中的细菌捕获

将克罗诺杆菌制备一定浓度的细菌悬浮液，将悬浮液与灭菌水溶解的婴儿配方粉1:9混匀。取400μL与菌溶液混合的配方粉复原乳，用已建立的免疫磁捕获方法，模拟实际样品进行捕获。

2结果与分析

2.1抗体效价

将抗体原液梯度稀释，依1.2.2中所述方法，测定结果如图1所示。吸光值为空白孔数值2倍以上的即为阳性，阳性孔中，最大的稀释倍数，即4000倍为抗体效价，且使用时实际稀释倍数为效价的75％，即3000倍。

2.2抗体特异性测定结果

本实施例在抗体的特异性评价上，主要选取了克罗诺杆菌亲缘关系较近的菌，即产气肠杆菌ATCC 13048、阴沟肠杆菌ATCC 13047、大肠杆菌CMCC B4413、单增李斯特菌CMCC54006，同时选取了三株ATCC保藏的克罗诺杆菌。

由图2中所得到的各株细菌与克罗诺杆菌单克隆抗体的反应结果显示，三株克罗诺杆菌与抗体反应呈阳性，非克罗诺杆菌菌呈阴性。因而可得出结论，此抗体与克罗诺杆菌亲和性较强，对部分非克罗诺杆菌未产生非特异性反应。

2.3EDC添加量的优化

EDC交联剂添加量的优化试验是基于1.2.4中1)所述方法，将试验分为8组进行，每组取5μL羧基磁珠，其余试剂添加量按适当比例缩小，其中抗体添加量为5μL，每组10mg/ml的EDC溶液添加量分别为0、2.5、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、10.0μL，经抗体偶联后，测定偶联前后的抗体浓度并计算磁珠的抗体偶联效率，结果如图3。

结果发现：当EDC添加量小于6μL时，抗体偶联效率与EDC添加量呈正相关；当EDC继续添加时，抗体偶联效率逐渐降低；当添加量到达10μL时，抗体偶联效率仅有19.69％。因而根据试验结果显示，确定制备50μL免疫磁珠所需要的EDC优选添加量为2.5-7.5μL，最优添加量为6μL，最终羧基磁珠与添加EDC的优选质量比为5:2.5-5:7.5，最优质量比为5:6。

2.4抗体添加量的优化

本试验基于1.2.4所陈述的方法，在添加抗体的环节设置了分组，每组分别添加1、2、3、4、5μL的1mg/mL的抗体原液。通过测定磁珠偶联前后的抗体浓度来计算抗体偶联量和偶联效率，试验结果如图4所示。

由图4中偶联量的曲线显示，一定量的羧基磁珠，当抗体添加量小于4μL时，抗体的偶联量逐步升高；大于等于4μL时，抗体的偶联量趋于饱和。因而可以得出结论，每5mg羧基磁珠的抗体最大携带量约为3.664mg。在免疫磁珠的实际制备中，添加4mg的抗体以确保偶联量。

由图4中偶联效率的曲线显示，当抗体添加量小于4μL时，抗体的偶联效率逐步升高，这与偶联缓冲液中抗体的浓度有直接关系，当浓度较高时，抗体与磁珠的接触几率大，因而偶联效率会随着抗体浓度升高而有所增加；而当抗体添加量大于4μL时，磁珠携带的抗体趋于饱和，使抗体产生浪费，导致偶联效率降低。

综上结果可以得出结论，制备每0μL免疫磁珠所需要优选添加量为2-5μL，最优添加的抗体原液4μL，计算可得，羧基磁珠与抗体的优选质量比为1:1-5:2，最优质量比为5:4。

2.5偶联缓冲液pH的优化

本试验基于1.2.4所述的方法，针对其中偶联缓冲液的pH值进行了梯度优化，5组试验的pH值分别为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，再分别测定每组偶联前后的抗体浓度，以计算抗体的偶联量，同时免疫磁珠捕获到的细菌进行平板计数，测定免疫磁珠的捕获量。

结果如图5所示。由抗体偶联量曲线可知，在5组试验中，偶联量随着pH值的增大，呈倒V形分布，偶联量在pH为5.5时达到最高，而在pH为7.0时偶联量最低。由细菌捕获量曲线可看出，当pH为5.0和7.0时，细菌捕获量极低，这与抗体偶联量较低有关。然而在pH 5.5-6.5范围中，细菌捕获量与抗体偶联量没有呈现出正相关，细菌捕获量在pH为6.5时达到最高。这就有可能是由于pH在5.0时虽然有最大的抗体偶联量，但偶联上的抗体没有最大程度的把与目标物质的结合位点暴露在外侧。因而，本试验以细菌捕获量为准，选取pH 6.5作为偶联缓冲液的最适pH值，用于后续试验。

2.6偶联缓冲液中吐温-20浓度优化

在确定缓冲液pH为6.5的基础上，5组分别添加了不同体积浓度吐温-20，即0，0.02％，0.04％，0.06％，0.08％，通过测定偶联前后的抗体浓度以计算抗体偶联量，确定偶联缓冲液中最适的吐温-20添加量。

试验结果如图6所示。由图6可见，添加吐温-20与不添加吐温-20的实验组对应的抗体偶联量由明显的差距，添加组的偶联量远远高于不添加组。当吐温-20添加量为0.02％时，抗体的偶联量最大；随着吐温-20的添加量逐渐升高，偶联量逐渐降低。因而，根据本试验结果所得，在偶联缓冲液中添加吐温-20可以提高抗体偶联量，选取最终抗体偶联量最高的一组，确定优选添加量为0.02-0.08％(v/v)，最适吐温-20添加量为0.02％(v/v)。

而后，依据1.2.6中1)所述方法，针对偶联缓冲液中含有0.02％(组1)和不含吐温-20(组2)所制备的两组免疫磁珠进行对比试验，每组均将50μL的免疫磁珠分别加入梯度稀释至10²～10³、10³～10⁴、10⁴～10⁵、10⁵～10⁶cfu/mL的细菌悬浮液中进行捕获，根据二者的细菌捕获量计数结果进行对比，对比结果见图7。由图7中结果可见，未添加吐温-20所制备的免疫磁珠的细菌捕获量明显低于添加了吐温-20所制备的免疫磁珠，当细菌浓度较低时更为明显。随细菌浓度提高，细菌捕获量有所升高且逐渐趋于平稳，而组1免疫磁珠的捕获量平台也明显高于组2。这说明吐温-20的添加对于细菌的捕获有良好的促进作用。

综上试验结果清晰可见在偶联缓冲液中添加吐温-20的必要性，不仅提高了抗体的偶联量，也进一步促成了细菌捕获量的提高，尤其是在细菌浓度较低的情况下，起到了放大结果的作用。因而，确定在最终的偶联缓冲液成分中添加0.02％体积比的吐温-20。

2.7免疫磁珠细菌捕获时间优化

本文所建立的免疫磁捕获方法是在37℃恒温条件下，利用水平振荡仪低速震荡进行的。有研究表明，提高免疫时间有利于免疫磁珠与目标物质的结合。为确定最适合免疫磁捕获的时间，本试验分为4组，每组捕获时间分别为30、60、75、90分钟，其余反应条件保持一致。试验结果如图8所示。在捕获时间为60分钟时，细菌捕获量达到最大；30分钟时，细菌捕获量非常低，显然是因为免疫磁珠和细菌的接触不足，导致磁捕获不完全；60分钟以后，对两个浓度的细菌培养物的捕获量同样有所降低，这也许是因为有部分抗体与细菌结合不紧密，在持续的振荡过程中，导致部分脱落。最终，本试验确定了此方法中免疫反应的时间为60分钟。

2.8免疫磁珠添加量优化

本试验基于1.2.6中1)所述的方法，对免疫磁珠的添加量设置一定的梯度，分4组试验进行，分别添加了25μL、50μL、75μL和100μL的免疫磁珠，分别与不同浓度的细菌悬浮液进行免疫捕获反应，结果如图9所示。

结果显示，针对试验中选取的任一浓度菌液而言，随着免疫磁珠添加量的提升，细菌捕获量也有所提升，且呈线性正相关。根据作图软件计算结果，细菌浓度为10³～10⁴cfu/mL时的相关性曲线公式为：Y＝7.248x-129,R²＝0.9979；细菌浓度为10⁴～10⁵cfu/mL时的相关性曲线公式为：Y＝＝6.868x-69.5，R²＝0.9941(此公式图中未显示)。其中公式中的斜率即为试验测得的每微升免疫磁珠所能捕获细菌量的理论值，平均每微升磁珠可以捕获的细菌量约为7cfu。在后续的检测试验中，可根据试验所需的细菌量，以此公式适当调整免疫磁珠的添加量，在一定程度上提供指导作用。

同时，由此结果显示，磁珠添加量越大，捕获量就越高。然而本文最终选取了75μL的添加量进行后续试验，部分试验采用50μL作为对比。这是因为，虽然100μL能够捕获的细菌量较高，其捕获效率却低于添加量较低的几组，且在后期的洗涤和涂布时，由于免疫磁珠的添加量较大，其磁分离时间和洗涤次数也要高于其余几组；同时100μL免疫磁珠的制备所需的抗体量也高于其余两组，其成本必然要高；而75μL和50μL的添加量已经能够满足目前实验的需要。综上，本试验的优化结果为75μL为最适免疫磁珠添加量。

2.9免疫磁珠对不同浓度细菌的捕获

本试验对梯度稀释至不同浓度的细菌悬浮液进行免疫磁捕获试验，浓度分别为10²～10³,、10³～10⁴、10⁴～10⁵、10⁵～10⁶、10⁶～10⁷cfu/mL，对每一浓度的细菌悬浮液采用50μL和75μL的免疫磁珠进行对比捕获，反应程序依照1.2.6中1)所述进行。

所得结果见图10。横向比较可以发现，当细菌浓度在10²～10⁵cfu/mL变化时，随着细菌浓度升高，细菌捕获量有显著提高；当细菌浓度达到10⁴cfu/mL时，细菌浓度的升高对细菌捕获量影响不大，且趋于恒定。因而可得出结论，在实际应用的前增菌过程中，借助免疫磁捕获方法，将细菌浓度提升到10⁴～10⁵cfu/mL即可达到富集细菌的作用。纵向比较得出，50μL免疫磁珠添加量的一组细菌捕获量均低于免疫磁珠添加量为75μL的一组，这种差距在细菌浓度较低时尤为明显：细菌浓度为10²～10³cfu/mL时，75μL组的捕获量为50μL组的3倍之多；而10³～10⁴cfu/mL时，差距缩小为1/3；当细菌浓度达到10⁴～10⁷cfu/mL时，50μL组的捕获量为75μL组的75％。可见，当细菌浓度较低时，适当提升免疫磁珠的添加量可以显著提高细菌捕获量。

2.10免疫磁珠对乳体系中克罗诺杆菌的捕获

将克罗诺杆菌制备一定浓度的细菌悬浮液，用灭菌的生理盐水进行10倍梯度稀释，依据2.2.8.2所述的方法将菌悬浮液与灭菌水溶解的婴儿配方粉1:9混匀，使得混匀后细菌浓度的数量级为10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²cfu/mL，用已建立的免疫磁捕获方法，模拟实际样品进行捕获，结果如图11所示。

由图11可知，免疫磁珠的细菌捕获量随着菌浓度的降低而降低，此方法下的免疫磁珠捕获灵敏度为10³～10⁴cfu/mL。对比免疫磁珠在菌悬液中的捕获，对处于不同菌浓度的乳体系中，细菌捕获量均低于菌悬液体系中的捕获量。免疫磁珠有较强的抗干扰能力，常用于分离纯化等高精度生物实验。然而，乳基质中成分较为复杂，尤其含有大量的蛋白质，其浓度远远高于乳中的细菌浓度。同时，乳的粘度要高于菌悬液，因而在洗涤、磁分离的过程中都会造成免疫磁珠的损失。

2.11方法特异性测定

利用已建立的免疫磁捕获方法对3株阪崎克罗诺干菌，以及产气肠杆菌ATCC 13048，阴沟肠杆菌ATCC 3503，大肠杆菌CMCC B4413，单增李斯特菌CMCC 54006进行捕获，并将相应结果与ELISA检测结果进行对比。结果如下表2，此方法对3株阪崎菌的捕获呈阳性，对4株非阪崎菌无特异性捕获，结果于ELISA检测结果相同。表明此方法特异性良好，对试验菌株中的非阪崎菌无交叉反应。

表2不同细菌采用两种方法测定结果对比

3结论

由于阪崎克罗诺杆菌对于婴幼儿较高的致病率及致死率，及其污染源的不确定性，因此对于阪崎克罗诺杆菌的预防和检测应引起重视。传统的检测方法需要经过培养、分离等多步过程，操作繁琐、耗时长。本实验通过利用免疫磁珠的高富集特性，可将传统方法中72个小时的前增菌时间缩短至10个小时以内，再辅以适当的检测方法，即可实现对于阪崎克罗诺杆菌的简单、快速的检测。本实验检测灵敏度可达10⁴～10⁵cfu/mL，并且与产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌无交叉反应。对于人工污染乳中的阪崎克罗诺杆菌的检测，可达到10⁵～10⁶cfu/mL。并且由于免疫磁珠是直接从检样中捕获靶细菌，抗干扰性强。本研究为检测乳中阪崎肠杆菌的检测提供了一种高效、高特异性的方法。

本发明基于免疫磁珠技术，选取针对克罗诺杆菌的特异性单克隆抗体，包被于磁珠表面。对免疫磁珠制备过程中的活化剂添加量、抗体添加量、偶联缓冲液pH值及成分进行了优化，确定每毫克磁珠所需要的活化剂最优添加量为1.2mg，抗体最优添加量为0.8μL，偶联缓冲液pH值为6.5，偶联缓冲液中吐温-20的浓度为0.02％，建立起免疫磁珠制备的方法。基于制备好的免疫磁珠用于克罗诺杆菌的捕获，对捕获过程中的磁珠添加量、免疫反应时间进行了优化，确定每400μL捕获体系中免疫磁珠最优添加量为75μL，免疫磁捕获最佳时间为60分钟。同时，基于本研究建立的免疫磁捕获体系对菌悬液和乳中克罗诺杆菌进行捕获实验，得出在10⁴～10⁵cfu/mL菌悬液中捕获量为438cfu，在同等浓度的乳中的捕获量为137cfu，整个捕获时间不超过90分钟，比传统富集方式大大缩短，能够实现短时间内对乳中克罗诺杆菌的快速富集。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法，其特征在于，将阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠，然后利用获得的免疫磁珠对置于捕获体系中进行捕获。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液混合，获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液按照质量比为5:2.5-5:7.5进行活化，获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液按照质量比为1:1-5:2混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；所述免疫磁珠，添加量为每400μL捕获体系中添加50μL-100μL免疫磁珠。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与MES溶液混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于MES溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于MES溶液中，然后再按照羧基磁珠与EDC溶液的质量比为5:2.5-5:7.5加入EDC溶液进行活化，获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的活化的羧基磁珠磁分离后，重悬于MEST溶液中，按照羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液的质量比为1:1-5:2加入阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液进行共价偶联，然后用PBST溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得免疫磁珠；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；所述免疫磁珠，添加量为每400μL捕获体系中添加50μL-100μL免疫磁珠。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)所述超声，为200w，10min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述MEST溶液为含有0.02％-0.08％v/vTween-20的MES溶液，pH为5.5-6.5。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)所述捕获体系，为阪崎克罗诺杆菌纯培养物、乳或乳制品。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)所述捕获，时间为30min-60min。

9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤为：

1)将羧基磁珠与MES溶液混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于MES溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于MES溶液中，按照羧基磁珠与EDC溶液质量比为5:6加入EDC溶液，室温下振荡后获得活化的羧基磁珠；

2)抗体的偶联：将步骤1)获得的活化的羧基磁珠磁分离后，重悬于MEST溶液中，按照羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液质量比为5:4加入阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液，室温下振荡过夜，PBST溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得免疫磁珠；MEST溶液为含有0.02％v/v Tween-20的MES溶液，pH为6.5；

3)将步骤2)获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；所述免疫磁珠，添加量为每400μL捕获体系中添加75μL免疫磁珠。

10.权利要求1-9所述任一方法在克罗诺杆菌的富集、分离和检测中的应用。