CN110628624A - 一种磁性微生物捕获材料及微生物捕获方法 - Google Patents

一种磁性微生物捕获材料及微生物捕获方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种广谱性高效性的微生物捕获材料及生物捕获方法，该微生物捕获材料同时连接具有广谱性微生物捕获能力的甘露糖凝集素和具有高效特异性微生物捕获能力的免疫球蛋白G，通过甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G的联用的复合协同效应，极大地增强磁珠的捕获效率。

Description

一种磁性微生物捕获材料及微生物捕获方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及磁性微生物捕获材料及微生物捕获方法。
背景技术
微生物与人类的生活息息相关，从食品生产到医药卫生，人们都在时刻关注着微生物。但在微生物的快速检测中常常面临着尴尬的处境，有研究者将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，傅里叶变换红外光谱，拉曼光谱等谱学手段用于微生物的检测，但由于样本中微生物含量低或者是样本基底过于复杂，往往无法实现直接检测或者是检测不到微生物信号。这就需要一种具有广谱性高效性的微生物捕获材料，在微生物鉴定前进行微生物的富集以及去除复杂的基底，再与上述的谱学手段联合使用，从而实现微生物的快速检测。
微生物的另一大功能则是在微生物免疫领域的以发挥。脓毒症是一种高危疾病，当机体受到感染时，由于自身的免疫反应使得自身组织和器官受到伤害。脓毒症每年导致全球数百万人死亡，并且是住院患者死亡的最常见原因。全世界败血症的发病率估计为每年1800万例。脓毒症通常用静脉输液和抗生素进行治疗，但对于不同的病人，微生物的感染情况不同，通常需要进行血培养，获得微生物感染的情况之后再使用相应的抗生素，但是情况危急的病人常常在血培养细菌鉴定过程中病情就进一步恶化，导致死亡。当然，有时为了挽救病人的生命，医护人员会同时使用多种广谱性的抗生素进行治疗，长此以往，微生物就会产生耐药性，当病人再一次感染时就没有可用的抗生素了。此时，如果有广谱性高效性的微生物捕获材料，能将微生物从病人的体液中分离出来，实现疾病治疗的目的。通过材料将微生物从病人体内分离，不需要进行前期的微生物鉴定，也不需要使用大量的抗生素使微生物产生耐药性，同时可以大幅的减小脓血症治疗的费用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种广谱性高效性的微生物捕获材料。通过甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G的联用的复合效应，极大地增强磁珠的捕获效率。
本发明采用以下技术方案：
一种磁性微生物捕获材料，为甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G同时连接在磁珠表面。
进一步，所述甘露糖结合凝集素为重组蛋白。
进一步，所述磁珠为羧基修饰的磁珠。
进一步，将羧基修饰的磁珠进行活化，其具体步骤为：取羧基修饰的磁珠溶液，去除磁珠自身所带的溶剂，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应后，通过磁性分离得到活化的羧基修饰的磁珠。
进一步，将甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G与活化后的磁珠相连接，用甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G的混合溶液将活化好的磁珠重悬，进行偶联反应，将偶联反应后的磁珠从溶液中分离出来，得到具有微生物捕获能力的磁性微生物捕获材料。
本发明还提供一种微生物捕获方法，将上述的磁性微生物捕获材料置于体系中，捕获微生物。
进一步，所述体系为水体，食物或各种体液中的一种或多种，体系中具有钙离子。
进一步，将磁性微生物捕获材料用后续实验所用的缓冲液清洗后直接加入含微生物的溶液中进行捕获。
进一步，将磁性微生物捕获材料用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液清洗三次后，直接加入含微生物的溶液中。
进一步，完成微生物捕获后通过外加磁场将磁珠从体系中分离。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种广谱性高效性的微生物捕获材料及生物捕获方法，该微生物捕获材料同时连接具有广谱性微生物捕获能力的甘露糖凝集素和具有高效特异性微生物捕获能力的免疫球蛋白G，通过甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G 的联用的复合协同效应，极大地增强磁珠的捕获效率。
进一步的，本发明将羧基修饰的磁珠溶液通过磁性分离去除上清液后，加入-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)反应，将表面的羧基活化，更有利于甘露糖凝集素与人体免疫球蛋白和磁珠的连接。
本发明通过磁性材料的引入，使得微生物从复杂体系中分离变得简单，经济。只需要普通的磁铁，提供一个外加磁场，就可以将磁性材料连同捕获到的微生物同时从复杂体系中分离出来。
由于本发明中所用到的甘露糖凝集素在微生物捕获时是钙离子依赖型的，所以对于复杂体系，进行微生物捕获前都需要外加适量的钙离子，以保证捕获过程的顺利进行。
附图说明
图1是实施例1中肺炎克雷伯氏菌捕获实验的结果图(总数10个菌)。
图2是实施例1中肺炎克雷伯氏菌捕获实验的结果图(总数100个菌)。
图3是实施例1中肺炎克雷伯氏菌捕获实验的结果图(总数1000个菌)。
图4是实施例2中金黄色葡萄球菌捕获实验的结果图(总数10个菌)。
图5是实施例2中金黄色葡萄球菌捕获实验的结果图(总数100个菌)。
图6是实施例2中金黄色葡萄球菌捕获实验的结果图(总数100个菌)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
实施例1肺炎克雷伯氏菌捕获实验
具体实验步骤
1.取适量的商品化羧基磁珠溶液，去除磁珠自身所带的溶剂，加入适量的浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液和适量的浓度为10mg/mL 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，25℃反应30分钟，期间保持磁珠的悬浮状态。最后，通过磁性分离得到活化的羧基修饰的磁珠(活化后的磁珠不建议长时间保存)。
2.取适量的MBL和IgG溶于无菌水中,用该溶液将活化好的磁珠重悬，进行偶联反应。25℃偶联2小时，期间保证磁珠处于悬浮状态。
3.将上述反应液置于外加磁场中，去除上清液得到具有微生物捕获能力的磁珠，磁珠经过磷酸盐缓冲液清洗三次后，(可重悬保存在带有0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液中)。
4.配制梯度菌液，其含菌量分别为1000个、100个、10个菌(实验所用的到菌为实验室培养的肺炎克雷伯氏菌，菌量为估计值)。将清洗好的磁珠加入菌液中，25℃反应30分钟，完成细菌捕获。
5.将上述溶液置于外加磁场中，分别收集上清液和磁珠进行平板涂布(所用的培养基为胰蛋白胨大豆琼脂培养基)。在恒温培养箱中37℃，培养16 小时。
6.结果见图1(总数10个菌)、图2(总数100个菌)和图3(总数1000个菌)。图1(总数10个肺炎克雷伯氏菌)：IgG-MBL复合在一起时磁珠(Beads) 上富集的细菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列)及MBL单独使用时(第二列)更多。图2(总数100个肺炎克雷伯氏菌)：IgG-MBL复合在一起时磁珠 (Beads)上富集的细菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列)及MBL单独使用时(第二列)更多。图3(总数1000个肺炎克雷伯氏菌)：IgG-MBL复合在一起时磁珠(Beads)上富集的细菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列) 及MBL单独使用时(第二列)更多。
结果表明IgG-MBL复合在一起时磁珠(Beads)上富集的肺炎克雷伯氏菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列)及MBL单独使用时(第二列)更多。
实施例2金黄色葡萄球菌捕获实验
具体实验步骤
1.取适量的商品化羧基磁珠溶液，去除磁珠自身所带的溶剂，加入适量的浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液和适量的浓度为10mg/mL的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，25℃反应30分钟，期间保持磁珠的悬浮状态。最后，通过磁性分离得到活化的羧基修饰的磁珠(活化后的磁珠不建议长时间保存)。
2.取适量的MBL和IgG溶于无菌水中,用该溶液将活化好的磁珠重悬，进行偶联反应。25℃偶联2小时，期间保证磁珠处于悬浮状态。
3.将上述反应液置于外加磁场中，去除上清液得到具有微生物捕获能力的磁珠，磁珠经过磷酸盐缓冲液清洗三次后，(可重悬保存在带有0.05％的吐温20 的磷酸盐缓冲液中)。
4.配制梯度菌液，其含菌量分别为1000个、100个、10个菌(实验所用的到菌为实验室培养的金黄色葡萄球菌，菌量为估计值)。将清洗好的磁珠加入菌液中，25℃反应30分钟，完成细菌捕获。
5.将上述溶液置于外加磁场中，分别收集上清液和磁珠进行平板涂布(所用的培养基为胰蛋白胨大豆琼脂培养基)。在恒温培养箱中37℃，培养16小时。
6.结果见图4(总数10个菌)、图5(总数100个菌)和图6(总数1000个菌)。
(总数10个金黄色葡萄球菌)：IgG-MBL复合在一起时磁珠(Beads)上富集的细菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列)及MBL单独使用时(第二列)更多。(总数100个金黄色葡萄球菌)：IgG-MBL复合在一起时磁珠(Beads)上富集的细菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列)及MBL单独使用时(第二列)更多。(总数1000个金黄色葡萄球菌)：IgG-MBL复合在一起时磁珠(Beads)上富集的细菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列)及MBL单独使用时(第二列)更多。结果表明IgG-MBL复合在一起时磁珠(Beads)上富集的金黄色葡萄球菌数(第三列)比IgG单独使用(第一列)及MBL单独使用时(第二列)更多。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种磁性微生物捕获材料，其特征在于：所述捕获材料为甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G同时连接在磁珠表面。
2.根据权利要求1所述的磁性微生物捕获材料，其特征在于：所述甘露糖结合凝集素为重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的磁性微生物捕获材料，其特征在于：所述磁珠为羧基修饰的磁珠。
4.根据权利要求3所述的磁性微生物捕获材料，其特征在于：将羧基修饰的磁珠进行活化，其具体步骤为：取羧基修饰的磁珠溶液，去除磁珠自身所带的溶剂，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应后，通过磁性分离得到活化的羧基修饰的磁珠。
5.根据权利要求3所述的磁性微生物捕获材料，其特征在于：将甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G与活化后的磁珠相连接，用甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G的混合溶液将活化好的磁珠重悬，进行偶联反应，将偶联反应后的磁珠从溶液中分离出来，得到具有微生物捕获能力的磁性微生物捕获材料。
6.一种微生物捕获方法，其特征在于，将权利要求1-5任意一项所述的磁性微生物捕获材料置于体系中，捕获微生物。
7.根据权利要求6所述的微生物捕获方法，其特征在于：所述体系为水体，食物或各种体液中的一种或多种，体系中具有钙离子。
8.根据权利要求6所述的微生物捕获方法，其特征在于：将磁性微生物捕获材料用后续实验所用的缓冲液清洗后直接加入含微生物的溶液中进行捕获。
9.根据权利要求8所述的磁性微生物捕获材料，其特征在于：将磁性微生物捕获材料用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液清洗三次后，直接加入含微生物的溶液中。
10.根据权利要求9所述的磁性微生物捕获材料，其特征在于：完成微生物捕获后通过外加磁场将磁珠从体系中分离。
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