CN204656552U - 可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体 - Google Patents

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黄志刚
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Abstract

本实用新型公开了一种可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体，包括微型粒子1，所述微型粒子1的表面上包覆有人MBL涂层2，所述人MBL为甘露糖结合凝集素。本实用新型的有益效果是，制造成本低，不改变血液成分，治疗效果好。

Description

可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体
技术领域
本实用新型涉及一种用于血液清洗的结构体，特别是一种可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体。
背景技术
当血液中存在的病原微生物，可以引起的全身炎症反应，进而导致脓毒症。这病症往往能够克服的抗生素治疗，最终造成多器官系统衰竭，感染性休克和死亡。全世界每年都有近1800万人忍受着脓毒症的折磨，即使在最先进的医院重症监护病房中，其死亡率依然高达30-50％。导致脓毒症发病率增长的主要原因是抗生素耐药微生物的出现。现阶段脓毒症的治疗方法通常为广谱抗生素治疗。广谱抗生素治疗需要数日才能识别感染源，不利于血培养；不能针对特定的病原微生物，同时存在副作用。由于广谱抗生素治疗这些缺陷。即使接受正确的抗生素治疗，脓毒症的死亡率每小时高达9％。由于缺乏有效的药物和抗真菌药物的高毒性，使抗生素耐药微生物患者、免疫抑制患者和新生儿真菌感染者的这种情况更为严重。而除了广谱抗生素治疗外的其他脓毒症治疗方法(例如，输液治疗，抗血栓治疗，血透析和体外器官支持)不解决问题的根源，因为无论活的或者死的病原体依然持续的将毒素释放到血液中。自从2011年重组形式的活化蛋白CEli Lilly drugXigris(drotrecogin alpha)的退出，目前尚无专门的药物被批准用于治疗脓毒症。
对于脓毒症病人的发病率和死亡率主要原因是血液中负载了大量的病原微生物。而大多数治疗有效的病人，都是使用针对性的抗生素治来降低活的病原体数量而达到的。然而这种治疗方式治疗成本高，见效慢，治疗过程复杂。
发明内容
本实用新型的目的是为了解决上述问题，设计了一种可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体。
实现上述目的本实用新型的技术方案为，一种可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体，包括微型粒子1，所述微型粒子1的表面上包覆有人MBL涂层2，所述人MBL为甘露糖结合凝集素。
所述微型粒子1是直径为8-25μm的圆珠形结构。
所述微型粒子1为带有磁性的粒子。
所述人MBL是基因工程编码带有Hi s标签的调理素蛋白rhFMBL，其编码基因序列为：
GCAAAGACGCATCACCATCACCATCACGGTGGCGGACCGGATGGTGATAGTAGCCTGGCTGCCTCAGAAAGAAAAGCTCTGCAAACAGAAATGGCACGTATCAAAAAGTGGCTGACCTTCTCTCTGGGCAAACAAGTTGGGAACAAGTTCTTCCTGACCAATGGTGAAATAATGACCTTTGAAAAAGTGAAGGCCTTGTGTGTCAAGTTCCAGGCCTCTGTGGCCACCCCCAGGAATGCTGCAGAGAATGGAGCCATTCAGAATCTCATCAAGGAGGAAGCCTTCCTGGGCATCACTGATGAGAAGACAGAAGGGCAGTTTGTGGATCTGACAGGAAATAGACTGACCTACACAAACTGGAACGAGGGTGAACCCAACAAT
该基因编码的氨基酸序列为：
AKTHHHHHHHHGGGPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
利用本实用新型的技术方案制作的可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体，制作成本低，有利于临床广泛应用，并且可以在不需要首先确定的感染源，不改变血液成分的基础上，将微生物和内毒素从血液迅速去除。
附图说明
图1是本实用新型所述可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体的结构示意图；
图中，1、微型粒子；2、人MBL涂层。
具体实施方式
下面结合附图对本实用新型进行具体描述，如图1是本实用新型所述可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体的结构示意图，如图所示，一种可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体，包括微型粒子1，所述微型粒子1的表面上包覆有人MBL涂层2。其中，所述微型粒子1是直径为8-25μm的圆珠形结构；所述微型粒子1为带有磁性的粒子；所述人MBL是基因工程编码带有Hi s标签的调理素蛋白rhFMBL，其编码基因序列为：
GCAAAGACGCATCACCATCACCATCACGGTGGCGGACCGGATGGTGATAGTAGCCTGGCTGCCTCAGAAAGAAAAGCTCTGCAAACAGAAATGGCACGTATCAAAAAGTGGCTGACCTTCTCTCTGGGCAAACAAGTTGGGAACAAGTTCTTCCTGACCAATGGTGAAATAATGACCTTTGAAAAAGTGAAGGCCTTGTGTGTCAAGTTCCAGGCCTCTGTGGCCACCCCCAGGAATGCTGCAGAGAATGGAGCCATTCAGAATCTCATCAAGGAGGAAGCCTTCCTGGGCATCACTGATGAGAAGACAGAAGGGCAGTTTGTGGATCTGACAGGAAATAGACTGACCTACACAAACTGGAACGAGGGTGAACCCAACAAT
该基因编码的氨基酸序列为：
AKTHHHHHHHHGGGPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
本技术方案的特点是在体外血液疗法中将纳米磁流体技术和能过捕获病原体的广谱蛋白质结合，在不需要首先确定的感染源，不改变血液成分的基础上，将微生物和内毒素从血液迅速去除。
在本技术方案中，本可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体用于从脓毒症患者的血液中净化病原体。本结构体是由包覆基因工程转录的人MBL(甘露糖结合凝集素)涂层的磁性粒子构成。其中人MBL能够结合多种病原体，制备简单，但是单独用于治疗时，无法从体内移除，因此必须报复在磁性粒子上使用。
在本技术方案中，人MBL为基因工程编码带有His标签的调理素蛋白rhFMBL。所述rhFMBL是由三肽alanine-lysine-threonine(AKT)、八个histine、一个三甘氨酸连接器熔合而成的颈部以及人MBL2(成熟蛋白的81-228残基)的糖类识别区(CRD)两部分组成的。在HTLV驱动表达质粒转染HEK293F游离细胞(Invitrogen)中，将构建的cDNA((GenBank登录代码：kj710775))克隆为下游的Igk轻链的前导链，并形成新HTLV表达质粒。在IRES的控制下，HTLV质粒和DHFR稳定转染到CHO-DG44细胞(Invitrogen)中。使用镍柱纯化培养基中的rhFMBL。通过CHO细胞株表达rhFMBL和His标签一步纯化技术，我们获得了大量的单一条带的rhFMBL(＞0.5g/l)。
关于rHFMBL的修饰：
通过将融合三肽AKT到N端形成生物素化特异性结合位点，从而确定rhFMBL、MBL偶联到超顺磁株的方向，使将N端片段吸附到磁珠表面，CRD裸露在外面。使用磷酸吡哆醛一水化合物将rhFMBL蛋白N端的氨基修饰成醛基，然后将AKT三肽结合到N端。
关于rhFMBL与磁珠的偶联：
将rhFMBL蛋白溶于含有7.5mM PLP的PBS(pH 6.4)中，蛋白浓度为4mg/ml，室温过夜放置。将PLP处理后的蛋白，用PBS(pH 6.450mM)透析3次，向1mg rhFMBL蛋白溶液中添加25μg氨氧基生物素，再次室温过夜处理，得到生物素化的rhFMBL。将生物素化的rhFMBL偶联到128nm的链霉素包被磁珠上。1mg磁珠与25μg偶联到链霉素的生物素化的rhFMBL室温反应30min，再用聚乙二醇生物素封闭磁珠表面未结合的链霉素，洗涤得到磁性调理素。PEG已经被证明能够有效地防止体外或体内的非特异性结合，因此选择其作为封闭液来减少磁珠对白蛋白以及其他血液成分的吸附。将磁性调理素悬浮在1％BSA中，是其浓度为5mg beads/ml，4℃保存备用。
当我们使用相同生物设备模拟rhFMBL磁珠处理人血液治疗方案进行大鼠实验，然后使用com-mercial CBC机器进行完整的血细胞计数，发现rhFMBL磁珠不会非特异性消耗血细胞。除此之外，通过测量MBL的凝血酶的活性和补体结合活性的方法来检测rhFMB。发现rhFMBL磁珠在血液治疗过程中不会引起大量凝集和补体反应。
rhFMBL包被的磁性粒子与从鲑鱼精子中提取的DNA混合，检测发现rhFMBL磁珠不与DNA结合，这与天然的MBL结合DNA形成了鲜明对比。
与病原结合的通用配体已经有报道。例如，合成有机分子的锌(II)-吡啶甲基胺结合到阴离子磷脂细菌细胞壁的形成配合物。然而，他们的结合能力是有限的：他们不能绑定广泛的病原体、毒素和病毒，对微生物细胞表面结合力，它们比MBL的弱得多。rhFMBL磁珠调理素的主要优势成本低，有利于临床应用。。
上述技术方案仅体现了本实用新型技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本实用新型的原理，属于本实用新型的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体，包括微型粒子(1)，其特征在于，所述微型粒子(1)的表面上包覆有人MBL涂层(2)。
2.根据权利要求1所述的可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体，其特征在于，所述微型粒子(1)是直径为8-25μm的圆珠形结构。
3.根据权利要求1所述的可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体，其特征在于，所述微型粒子(1)为带有磁性的粒子。
CN201420792654.8U 2014-12-12 2014-12-12 可用于脓毒症病人血液清洗的广谱磁珠结构体 Active CN204656552U (zh)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628624A (zh) * 2019-02-01 2019-12-31 浙江和谱生物科技有限公司 一种磁性微生物捕获材料及微生物捕获方法

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Patentee before: TIANJIN DEXIANG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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