CN105777792A - 一种季铵盐化荧光硅点及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种季铵盐化荧光硅点，它包括一个含硅元素的纳米颗粒和共价接枝在纳米颗粒表面的烷基甜菜碱。本发明还公开了前述季铵盐化荧光硅点的制备方法及其在抗菌和细菌成像方面的应用。与现有技术相比，本发明利用烷基甜菜碱，一步反应就对表面带有氨基的硅点季铵盐化，在保持硅点良好水溶性的同时，又赋予硅点优良的选择性抗菌和细菌成像效果。除此之外，季铵盐化的硅点还具有纯净度高、无需外加荧光标记、稳定性好、制备成本低等优点。

Description

一种季铵盐化荧光硅点及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及一种季铵盐化荧光硅点及其制备方法与应用。

背景技术

在20世纪初，细菌感染性疾病是全世界导致死亡最主要原因。由于抗微生物剂的出现，在过去的一个世纪中感染性疾病的发病率和死亡率大幅下降。然而，细菌耐药性的出现对已有抗生素的使用造成重大威胁。人们努力通过发现新的抗生素和对既有抗微生物药物进行化学修饰来解决抗微生物药物的耐药性问题。不幸的是，新的抗微生物药物开发速度赶不上病原微生物耐药菌出现的频率。研究表明，抗微生物纳米材料不会引起病原菌产生耐受性，是解决这一难题的一种有效策略之一。与传统抗生素相比，抗微生物纳米制剂在降低急性毒性、克服耐药性和降低成本等方面具有许多独特的优势。纳米材料的抗菌活性主要归因于其高表面积体积比和独特的化学-物理特性。文献中报道应用于抗生素领域的纳米颗粒有：(1)基于贵金属的纳米颗粒：包括金纳米颗粒，银纳米颗粒，铜纳米颗粒，合金纳米颗粒等；(2)基于氧化石墨烯的颗粒；(3)基于脂质体、高分子等的纳米颗粒；(4)其他纳米颗粒：如二氧化硅、多肽纳米颗粒等。

另一方面，要使抗生素发挥最大药效，临床要求必须准确且快速区分细菌。目前按照革兰氏染色法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。这两类细菌的细胞壁结构显著不同，导致这两类细菌在染色性、抗原性、毒性、对某些药物的敏感性等方面的很大差异。所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。目前，革兰氏染色法仍然是最常见的区分和检测这两类细菌的方法，但是其需要用肉眼通过显微镜观察，所以会出现视觉误差，而且操作过于复杂。为了解决这些问题，1938年，日本科学家Ryu报道了一种基于氢氧化钾快速鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的方法(J.Jpn.Soc.Vet.Sci.,1938,17,31)，但不能用于同时存在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌样品的检测。1990年，美国科学家Sizemore报道了一种基于麦胚凝集素(wheatgermagglitinin，WGA)的荧光染料，可以选择性地对革兰氏阳性菌成像(Appl.Environ.Microbiol.,1990,56,2245)，但有时也可以对革兰氏阳性菌有成像效果(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2014,111,7807)。近些年，也有一些研究将对革兰氏阳性菌有特效的抗生素(如万古霉素、达托霉素)修饰到不同材料上，从而实现对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的区分(ACSNano,2011,5,8834；ACSAppl.Mater.Interfaces2013,5,10874)，但引入抗生素进行细菌检测，可能会引起耐药细菌的产生。另外，这些抗生素对两类细菌的区分程度并不高。因此，亟需发明一种快速有效且方便的区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的方法。

本发明引入季铵盐化的硅点来实现细菌检测和抗菌。季铵盐类的抗菌试剂可以破坏细胞膜，被认为不易产生细菌耐药性。硅是地壳中含量仅次于氧、第二丰富的元素，也是人体中必需的元素。因为良好的生物相容性、特殊的光学性质、低生物毒性和容易表面修饰等优势，硅基纳米材料受到人们广泛关注。这其中包括硅纳米线，硅纳米管，硅纳米颗粒以及硅点等。而硅点作为一种零维硅纳米材料，不但继承了硅良好的生物相容性，同时量子尺寸又赋予它良好的荧光性质。硅点可以用于光催化、光学器件、显示材料、生化检测、细胞成像、新型抗癌药物载体等研究领域。由于硅点对细胞、细菌的毒性普遍很低，目前还没有关于硅点抗菌应用的报道。利用硅点制备方便、材料便宜等优点，迫切需要开发基于硅点的新型抗菌试剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种季铵盐化荧光硅点，以解决现有技术在细菌成像方面存在的区分程度较低和产生耐药性等问题和在抗菌应用方面存在的生物相容性较低和产生耐药性等问题。

本发明还要解决的技术问题是提供上述季铵盐化荧光硅点的制备方法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述季铵盐化荧光硅点的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种由下述通式Ⅰ表示的季铵盐化荧光硅点，它包括一个含硅元素的纳米颗粒和共价接枝在纳米颗粒表面的烷基甜菜碱；

SiNPs-(R_x)_nⅠ；

其中，

R_x为十二烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱或十八烷基二甲基甜菜碱；

n为共价接枝在纳米颗粒表面的烷基甜菜碱的个数，n为1～10。

上述季铵盐化荧光硅点的制备方法，它包括如下步骤：

(1)向还原剂的水溶液中通入氮气，以除去溶液中的氧气；在去除氧气后的还原剂的水溶液中加入有机硅烷，密闭状态搅拌5～15min后充分混合，然后在微波反应器或水热反应器中以140～180℃反应5min～24h，形成硅点溶液；将硅点溶液降至室温并进行透析，得到表面为氨基的水溶性荧光硅点；

(2)将烷基甜菜碱的乙醇溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于缓冲液中，0.5～4h后调节pH至7～8并加入步骤(1)中制备得到的水溶性荧光硅点反应4～15h；反应反应完成后将所得混合体系进行透析，即得。

步骤(1)中，所述的还原剂为柠檬酸钠、柠檬酸、抗坏血酸钠或抗坏血酸。

步骤(1)中，所述的有机硅烷为3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷。

步骤(1)中，有机硅烷和还原剂的质量比为1：3～20；优选为1：8。

步骤(1)中，透析所用透析液为水。

步骤(2)中，所述的烷基甜菜碱为十二烷基二甲基甜菜碱(BS-12)、十四烷基二甲基甜菜碱(BS-14)、十六烷基二甲基甜菜碱(BS-16)或十八烷基二甲基甜菜碱(BS-18)；其中，所述的烷基甜菜碱可替换为烷基甜菜碱和甜菜碱的混合物。

其中，所述的烷基甜菜碱购自市场，或采用常规技术手段制备得到，或采用如下方法制备得到(以十六烷基二甲基甜菜碱和十八烷基二甲基甜菜碱为例)：

将叔胺水溶液和氯乙酸钠水溶液在70～100℃下反应5～10h后。所得产物用乙醚进行重结晶提纯，提纯后产物经冻干后即可使用；其中，所述的叔胺为十六烷基二甲基叔胺或十八烷基二甲基叔胺。

步骤(2)中，烷基甜菜碱、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和水溶性荧光硅点的摩尔比为1：3～40：3～40：0.1～1.0，优选1：10：25：0.5。

步骤(2)中，所述的缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，pH为6～7，浓度为20～500mM。

步骤(2)中，所述的透析操作为：采用分子量为1000的透析袋进行透析，透析液为体积比1：4的乙醇和水的混合物，透析3天，每天换透析液3次，最后一天的透析液为超纯水。

其中，采用十二烷基二甲基甜菜碱(BS-12)、十四烷基二甲基甜菜碱(BS-14)、十六烷基二甲基甜菜碱(BS-16)和十八烷基二甲基甜菜碱(BS-18)制备得到的季铵盐化荧光硅点分别被命名为SiNPs-C₁₂、SiNPs-C₁₄、SiNPs-C₁₆和SiNPs-C₁₈。制备得到的季铵盐化荧光硅点直接保存在常温(25℃)的环境中或冻干保存在-20℃冰箱中。

上述季铵盐化荧光硅点在抗菌试剂和制备抗菌药物方面的应用也在本发明的保护范围之内。

上述季铵盐化荧光硅点在细菌成像方面的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的季铵盐化荧光硅点在细菌成像方面的应用是指季铵盐化荧光硅点可以选择性地杀死革兰氏阳性菌，并实现革兰氏阳性菌的荧光成像，从而达到区分革兰氏阴性菌和阳性菌的目的。

有益效果：

本发明利用烷基甜菜碱，一步反应就对表面带有氨基的硅点季铵盐化，在保持硅点良好水溶性的同时，又赋予硅点优良的选择性抗菌和细菌成像效果。除此之外，季铵盐化的硅点还具有纯净度高、无需外加荧光标记、稳定性好、制备成本低等优点。具体而言，本发明利用微波方法采用带氨基的硅烷试剂制备得到了氨基化的水溶性硅点，通过共价接枝烷基甜菜碱，即得季铵盐化硅点。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)仅通过一步反应就将硅点表面季铵盐化，同时赋予硅点对革兰氏阳性菌优良的抗菌效果。具体而言，对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和藤黄微球菌(M.luteus)的最小抑菌浓度为1.0μg/mL，对枯草芽孢杆菌(B.subtili)的最小抑菌浓度分别为2.0μg/mL。

(2)该季铵盐化硅点的细胞毒性低，再加上其较小的尺寸(粒径在3nm左右)使之容易透过肾小球血管壁进入尿液而被排出体外，因此可以保证硅点在体内应用的安全性。

(3)该季铵盐化硅点不但能够有效杀死革兰氏阳性菌，还能实现对其荧光成像，而对革兰氏阴性菌没有抗菌或者染色效果，因此可用于区分革兰氏阳性菌和阴性菌。

附图说明

图1为实施例7中季铵盐化硅点的制备示意图；

图2为实施例7中SiNPs-C₁₈的透射电子显微镜图；

图3为实施例10中不同浓度的SiNPs-C₁₈对大肠杆菌2h抗菌效果图；

图4为实施例11中不同浓度的SiNPs-C₁₈对金黄色葡萄球菌2h抗菌效果图；

图5为实施例12中大肠杆菌与SiNPs-C₁₈共同孵育1h后的共聚焦显微镜图；

图6为实施例13中金黄色葡萄球菌与SiNPs-C₁₈共同孵育1h后的共聚焦显微镜图；

图7为实施例14中SiNPs-C₁₈对正常肺部细胞ATII和正常肝细胞L02的细胞毒性图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做出进一步说明。

实施例1

表面带有氨基的水溶性硅点的制备，包括以下步骤：

(1)向质量分数为4.65％柠檬酸钠水溶液中通入氮气5min，除去溶液中的氧气；

(2)向去除氧气后的柠檬酸钠水溶液中边搅拌边加入3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)，并在密闭状态下继续搅拌10min，形成硅点前体溶液；APTMS与柠檬酸钠水溶液中溶质柠檬酸钠的质量比为1：4；

(3)将步骤(2)中所得的混合体系在微波反应器中以180℃反应5min，形成硅点溶液；

(4)用分子量为1000的透析袋(透析液为水)透析硅点溶液，即得纯净的APTMS硅点溶液。

实施例2

制备方法与实施例1相同，所不同的是，步骤(3)中，反应温度为140℃，反应时间为15min。

实施例3

制备方法与实施例1相同，所不同的是，步骤(2)中，分别用3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)和3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(AEEA)分别替换实施例1中的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)，制备得到三种不同的带氨基的水溶性硅点；有机硅烷和还原剂的质量比为1：8。

实施例4

制备方法与实施例1相同，所不同的是，步骤(1)中，分别用抗坏血酸钠水溶液和抗坏血酸水溶液代替实施利1种的柠檬酸钠水溶液，制备得到两种不同的带有氨基的水溶性硅点；

其中，抗坏血酸钠水溶液的浓度为0.1M，APTMS与抗坏血酸钠溶液的体积比为1：2；抗坏血酸水溶液的浓度为0.1M，APTMS与抗坏血酸溶液的体积比为1：2。

实施例5

十八烷基二甲基甜菜碱的制备方法如下：：

(1)十八烷基二甲基叔胺与氯乙酸钠按照1：1.2的物质的量比溶于水后，在90℃下反应8h；

(2)用乙醚对步骤(1)中所得混合体系进行重结晶提纯；

(3)将步骤(2)中提纯后的产物冻干之后备用。

实施例6

十六烷基二甲基甜菜碱的制备，其制备方法与实施例5相同；所不同的是，步骤(1)中，将十八烷基二甲基叔胺替换为等摩尔的十六烷基二甲基叔胺。

实施例7

季铵盐化硅点(SiNPs-C₁₈)的制备，包括以下步骤：

(1)十八烷基二甲基甜菜碱溶于乙醇，与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照1:10:25的物质的量比在pH＝6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(浓度为100mM)中室温活化4h。

(2)将上述溶液的pH值用1M的磷酸缓冲液调至7.4，将经活化后的十八烷基二甲基甜菜碱与步骤(1)中制备得到的APTMS硅点按照2:1的物质的量室温反应12h。

(3)用分子量为1000的透析袋在乙醇和水的混合物中透析3天，每天换水3次，最后一天的透析液为超纯水。该反应的示意图见图1。由图2的透射电子显微镜结果可知，所得季铵盐化硅点的粒径为3nm左右。

实施例8

制备方法与实施例1相同，所不同的是，步骤(1)中，将十八烷基二甲基甜菜碱分别替换为等摩尔的十六烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二甲基甜菜碱，制备得到三种不同的季铵盐化硅点。

实施例9

制备方法与实施例1相同，所不同的是，步骤(3)中，将APTMS硅点分别替换为等摩尔的APTES硅点、DAMO硅点和AEEA硅点，制备得到三种不同的季铵盐化硅点。

实施例10

测试实施例7的季铵盐化硅点对大肠杆菌的毒性，方法如下：

将培养过夜的大肠杆菌，用细菌培养基以1:100的比例稀释，在37℃的摇床中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5。大肠杆菌在与含不同浓度硅点(0,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱2h后，利用酶标仪采用CCK8试剂盒，测定450nm的吸光度，实验结果见图3。实验结果表明，在细菌个数为1×10⁵～1×10⁶个/mL情况下，硅点对大肠杆菌抑制效果不明显，最小抑菌浓度(MIC)大于5μg/mL。

实施例11

测试实施例7的季铵盐化硅点对金黄色葡萄球菌的毒性，方法如下：

将培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5。金黄色葡萄球菌在与含不同浓度硅点(0,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱2h后，利用酶标仪采用CCK8试剂盒，测定450nm的吸光度，实验结果见图4。实验结果表明，在细菌个数为1×10⁵～1×10⁶个mL情况下，硅点浓度为1.0μg/mL时，即可抑制金黄色葡萄球菌的生长(即最小抑菌浓度MIC为1.0μg/mL)。

实施例12

测试实施例7的季铵盐化硅点对大肠杆菌的成像效果，方法如下：

将培养过夜的大肠杆菌，加入实施例7中季铵盐化的硅点(5mg/mL)至硅点最终浓度为0.5mg/mL。在37℃中的摇床中培养2h后，用7000rpm的速度离心，去掉上清液，加入500μL生理盐水重悬，滴至盖玻片上在共聚焦显微镜用405nm的激光激发观察。结果见图5，表明该季铵盐化硅点能对大肠杆菌成像效果较差。

实施例13

测试实施例7的季铵盐化硅点对金黄色葡萄球菌的成像效果，方法如下：

将培养过夜的金黄色葡萄球菌，加入实施例7中季铵盐化的硅点(5mg/mL)至硅点最终浓度为0.5mg/mL。在37℃中的摇床中培养2h后，用7000rpm的速度离心，去掉上清液，加入500μL生理盐水重悬，滴至盖玻片上在共聚焦显微镜用405nm的激光激发观察。结果见图6，表明该季铵盐化硅点能对金黄色葡萄球菌成像，同时能够进入金黄色葡萄球菌内部。

实施例14

测试实施例7中的季铵盐化硅点的细胞毒性，方法如下：

选择正常肺细胞ATII和正常肝细胞L02，利用酶标仪采用MTT检测法分别测定浓度为0,0.1,0.5,1,2,5,10,20和50μg/mL的季铵盐化硅点对ATII和L02毒性(硅点加入细胞24h之后测定)，结果见图7。实验结果表明季铵盐化硅点浓度在远远大于最小抑菌浓度的浓度下，对细胞毒性低，满足了硅点在体内抗菌的应用条件。

Claims (10)

1.一种由下述通式Ⅰ表示的季铵盐化荧光硅点，它包括一个含硅元素的纳米颗粒和共价接枝在纳米颗粒表面的烷基甜菜碱；

SiNPs-(R_x)_nⅠ；

其中，

R_x为十二烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱或十八烷基二甲基甜菜碱；

n为共价接枝在纳米颗粒表面的烷基甜菜碱的个数，n为1～10。

2.权利要求1所述的季铵盐化荧光硅点的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)向还原剂的水溶液中加入有机硅烷，充分混合后在140～180℃下反应5min～24h，反应完成后将所得混合体系降至室温并进行透析，得到水溶性荧光硅点；

(2)将烷基甜菜碱的乙醇溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于缓冲液中，0.5～4h后调节pH至7～8并加入步骤(1)中制备得到的水溶性荧光硅点反应4～15h；反应反应完成后将所得混合体系进行透析，即得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的还原剂为柠檬酸钠、柠檬酸、抗坏血酸钠或抗坏血酸。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的有机硅烷为3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，有机硅烷和还原剂的质量比为1：3～20。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的烷基甜菜碱为十二烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱或十八烷基二甲基甜菜碱；其中，所述的烷基甜菜碱可替换为烷基甜菜碱和甜菜碱的混合物。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，烷基甜菜碱、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和水溶性荧光硅点的摩尔比为1：3～40：3～40：0.1～1.0。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，且pH为6～7，浓度为20～500mM。

9.权利要求1所述的季铵盐化荧光硅点在抗菌试剂和制备抗菌药物方面的应用。

10.权利要求1所述的季铵盐化荧光硅点在细菌成像方面的应用。