CN109221104A - 一种含银碳点、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米医学技术领域，具体为一种含银碳点、制备方法及其应用。本发明公开了一种含银碳点制备方法，该制备方法以柠檬酸和尿素为主要原料，具有过程简单环保，原料廉价易得，产率高，成本低等优点，由该方法制备的含银碳点，具有抑菌作用良好，水溶性好、细胞毒性低、银离子负载率高等特性，具有在制备抗菌剂中的应用前景。

Description

一种含银碳点、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于纳米医学技术领域，具体涉及一种含银碳点、制备方法及其应用。

背景技术

碳是构成有机生物体最基本的元素之一，对于现有已知的所有生命系统都是不可或缺的，没有它，生命不可能存在。碳纳米材料自从被发现后一直都活跃在纳米材料的前沿，碳纳米材料主要包括富勒烯(fullerenes，C60)、碳纳米管(carbon nanotubes，CNT)和氧化石墨烯(graphene oxide，GO)等，碳纳米材料目前已经广泛应用于电子、机械、化学催化、工程、生物医药等领域。荧光碳纳米颗粒作为一种新型的零维的碳材料，由于其廉价的原料、良好的生物兼容性、良好的光稳定性及易表面修饰等优点而备受关注。

碳纳米材料具有较低的体内和体外毒性，碳点(carbon dots)作为一种重要的零维纳米材料(<5nm)，不但继承了碳元素良好的生物相容性，同时其较大的比表面积又赋予它良好的吸附性能，为金属离子的吸附提供了载体。基于其尺寸小、生物相容性好及易修饰性等优良性质，碳点有作为载体的潜质。

银的各种化学形态都具有优秀的抗菌性能，硝酸盐溶液里的银离子就是典型的抗菌银种类。由于银离子和含银的复合物都具有良好的抗菌活性、耐药性和广谱抗菌性，所以银系无机抗菌剂得到了国内外研究者的关注并顺利投入市场使用。银系无机抗菌剂在服装、电子产品、生物传感器、食品行业、化妆品、医疗器械等行业得到广泛应用。Ag离子是目前已知的最高效的金属离子型抗菌剂，具有抗菌效果好，抗菌浓度低，能杀灭很多种细菌和耐药性强的优点。银系抗菌材料得到了许多国内外专家学者的关注，是目前研究和应用最广的一种抗菌剂。它们具有广谱抗菌活性和和减少引起微生物抗药性的倾向。推测银纳米粒子的抗菌活性主要通过两种方法干扰基本的细菌细胞功能控制机制。第一种机制，释放的银离子(Ag+)与蛋白质和酶相互作用，导致细胞膜的结构发生改变。第二种可能是由于银离子的作用，产生大量的活性氧(ROS)，扰乱细胞的新陈代谢，达到抑制细菌生长的效果。

因此，将银系无机抗菌剂和碳点结合，开发出一种既具有良好抗菌活性又具有良好生物相容性和较低细胞毒性的含银碳点是一项非常重要且非常有意义的工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含银碳点制备方法，该制备方法具有过程简单环保，原料廉价易得，产率高，成本低等优点。

本发明的另一个目的在于提供一种功能化含银碳点，该含银碳点具有抑菌作用良好，水溶性好、细胞毒性低、银离子负载率高等特性。

本发明的再一个目的在于提供上述含银碳点在制备抗菌剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种含银碳点的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

(a).制备碳点：碳点的制备方法为水热法，具体为将柠檬酸、尿素、硝酸钴、和EDTA溶于N,N-二甲基甲酰胺中，然后将混合液转移到反应釜中，控温140-220℃反应3-8h，反应结束后，自然冷却到室温，离心，离心固体用氢氧化钠的乙醇(2mM)溶液洗涤，然后将得到的固体放在烘箱中65℃烘干，得到红褐色粉末；

(b).制备含银碳点：将步骤(a)制备的碳点加入到硝酸银超纯水溶液中，升温至95℃反应20min后倒入培养皿中，放入烘箱中烘干，得到黑色固体即为含银碳点。

作为一种优选方案，所述步骤(a)中，柠檬酸和尿素、硝酸钴、EDTA溶于N,N-二甲基甲酰胺的投料比例为1:2:1:1

作为一种优选方案，所述步骤(a)中，反应温度为160℃，反应时间为6h。

作为一种优选方案，所述步骤(b)中，硝酸银和步骤(a)制备获得的碳点的重量比为1:0.5～1.5。

上述任一方法制备获得的含银碳点也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了上述任一方法制备获得的含银碳点在制备抗菌剂中的应用。

上述任一方法制备获得的含银碳点在制备抑菌剂中的应用优选为在制备大肠杆菌抑制剂或金黄色葡萄球菌抑制剂中的应用。

本发明所达到的有益效果为：

(1)本发明所述的含银碳点的制备方法具有过程简单环保，原料廉价易得，产率高，成本低等优点。

(2)本发明制得的含银碳点吸附银离子多并且分散性能良好，含银碳点粒径随着含银离子的浓度的增加而变大。

(3)本发明制得的含银碳点对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有良好的抑制作用，且抑菌作用随着银离子浓度的增加而增加。

(4)本发明制得的含银碳点具有溶血毒性低，生物相容性好，细胞毒性低等特点，可以成为很好的可全身给药的抗菌剂。

附图说明

图1为碳点的投射电镜(TEM)图；

图2为硝酸银/碳点＝1/1.5时含银碳点的投射电镜(TEM)图；

图3为硝酸银/碳点＝1/0.75时含银碳点的投射电镜(TEM)图；

图4为硝酸银/碳点＝1/0.5时含银碳点的投射电镜(TEM)图；

图5为含银碳点对大肠杆菌抑制作用图；

图6为含银碳点对金黄色葡萄球菌抑制作用图；

图7为含银碳点对A549细胞的MTT实验结果图；

图8为含银碳点溶血作用图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

1.碳点的制备

实施例1

向50ml烧杯中加入3.0g柠檬酸、6.0g尿素、3.0g硝酸钴和3.0gEDTA，加入20ml N,N-二甲基甲酰胺，用玻璃棒搅拌溶解后，将其转移到50ml的反应釜中，拧紧釜盖后放入鼓风干燥箱中，控制温度140℃反应8h，反应结束后将反应体系自然冷却至室温后进行离心分离，弃去上清液，离心固体用1M的氢氧化钠乙醇溶液离心洗涤5次(10000rpm/min,5min),将离心获得的固体控温60℃干燥4h得到固体粉末3.0g，碳点产率为20.0％，碳点水合动力学粒径为10.5±1.7nm。

实施例2

向50ml烧杯中加入3.0g柠檬酸、6.0g尿素、3.0g硝酸钴和3.0gEDTA，加入20mlN,N-二甲基甲酰胺，用玻璃棒搅拌溶解后，将其转移到50ml的反应釜中，拧紧釜盖后放入鼓风干燥箱中，控制温度160℃反应6h，反应结束后将反应体系自然冷却至室温后进行离心分离，弃去上清液，离心固体用1M的氢氧化钠乙醇溶液离心洗涤5次(10000rpm/min,5min),将离心获得的固体控温60℃干燥4h得到固体粉末6.0g，碳点产率为40.0％

实施例3

向50ml烧杯中加入3.0g柠檬酸、6.0g尿素、3.0g硝酸钴和3.0gEDTA，加入20mlN,N-二甲基甲酰胺，用玻璃棒搅拌溶解后，将其转移到50ml的反应釜中，拧紧釜盖后放入鼓风干燥箱中，控制温度220℃反应3h，反应结束后将反应体系自然冷却至室温后进行离心分离，弃去上清液，离心固体用1M的氢氧化钠乙醇溶液离心洗涤5次(10000rpm/min,5min),将离心获得的固体控温60℃干燥4h得到固体粉末4.3g，碳点产率为28.7％。

2.含银碳点的制备

实施例4

称取硝酸银固体，用超纯水配制成2mg/ml的硝酸银超纯化水溶液，取配制好的2mg/ml硝酸银超纯水溶液10ml，上述制备获得的碳点30.4mg分别加入到反应瓶中，控温95℃反应20min后倒入培养皿中，放入烘箱中控温100℃烘干得黑色固体28.5mg，产率56.5％，粒径为18±2.5nm。

实施例5

称取硝酸银固体，用超纯水配制成4mg/ml的硝酸银超纯化水溶液，取配制好的4mg/ml硝酸银超纯水溶液10ml，上述制备获得的碳点30.1mg分别加入到反应瓶中，控温95℃反应20min后倒入培养皿中，放入烘箱中控温100℃烘干得黑色固体29.5g，产率42.1％，粒径为25±1.5nm。

实施例6

称取硝酸银固体，用超纯水配制成6mg/ml的硝酸银超纯化水溶液，取配制好的6mg/ml硝酸银超纯水溶液10ml，上述制备获得的碳点30.2mg分别加入到反应瓶中，控温95℃反应20min后倒入培养皿中，放入烘箱中控温100℃烘干得黑色固体31.3mg，产率34.7％，粒径30±3.1nm。

3.抗菌活性检测

实施例8

取大肠杆菌单菌落在LB培养基37℃震荡培养过夜，稀释菌落浓度为5×10⁵。在96孔板中每孔加200μL上述菌液，取不同浓度的含银碳点分散液(浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5mg/ml)5μL于每孔中，轻微震荡30s后，于37℃培养过夜，在595nm处测试其吸光度。实验结果显示，含银碳点对大肠杆菌具有良好的抑制作用，硝酸银/碳点重量为1:1.5～0.5时，半数细菌抑制浓度均小于0.2mg/ml，且其对大肠杆菌的抑制能力随着银离子浓度的增加而增强，具体实验结果如下表所示：

其中，细菌存活率计算公式如下：

细菌成活率(％)＝(OD_材料–OD_{Broth only})/(OD_H2O+bac–OD_{Broth only})×100％，其中OD_材料为含银碳点分散液和细菌混合液的吸光度，OD_{Broth only}为细菌培养基的吸光度，OD_H2O+bac为水和细菌混合液的吸光度。

实施例9

取金黄色葡萄球菌单菌落在LB培养基37℃震荡培养过夜，稀释菌落浓度为5×10⁵。在96孔板中每孔加200μL上述菌液，取不同浓度的含银碳点分散液(浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5mg/ml)5μL于每孔中，轻微震荡30s后，于37℃培养过夜，在595nm处测试其吸光度。实验结果显示，含银碳点对金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用，硝酸银/碳点重量为1:1.5～0.5时，半数细菌抑制浓度均小于1mg/ml，且其对金黄色葡萄球菌的抑制能力随着银离子浓度的增加而增强，具体实验结果如下表所示：

4.细胞毒性实验

实施例10

将对数生长期的A549细胞制成5.0×10³个/ml的单细胞悬浮液，然后接种于96孔细胞培养板中，每孔加入体积为100μL，再将其置于CO2培养箱中培养至汇合度约为80％时，弃除原培养基，加入含不同浓度的含银碳点(浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.5，1mg/mL)的培养基，继续培养24h后，吸除旧培养基，加入100μL新鲜培养基，每孔加入20μL MTT(5mg/ml)，置于培养箱中继续培养4h后，将上清液吸除弃去，再每孔加入150μL DMSO，在酶标仪中低速振荡三次，直至孔内紫色结晶溶解完全，测定595nm波长处每孔的OD值，记录实验数据结果。计算不同加药浓度条件下A549细胞株的存活率。实验结果显示，含银碳点的细胞毒性较低，硝酸银/碳点重量为1:1.5～0.5时，半数细胞毒性浓度均不小于1mg/ml，且其对细胞毒性强度随着银子浓度的增加而增强，实验结果如下表所示：

5.溶血毒性实验

实施例11

颈脱臼处死大鼠，摘眼球取血液5mL，加入肝素钠溶液0.5mL抗凝,3000r/min离心10min，用生理盐水洗涤、离心,至上清液不显红色,弃上清液后取0.5mL再加入49.5mL生理盐水即得红细胞悬液。配置不同浓度的含银碳点的分散液(浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.5，1mg/mL)待用。在1.5mL离心管里加入400μL红细胞悬液，每个离心管里再加入不同浓度的材料分散液5μL，在37℃孵育1h，5000r/min离心10min。取上清液200μL加入到新的96孔板中。每个浓度平行3组，用纯水作为空白对照，Triton X–100作为完全溶血组。取上述96孔板，在酶标仪上于543nm检测吸光度。实验结果显示，含银碳点的溶血毒性较低，硝酸银/碳点重量为1:1.5～0.5时，半数溶血浓度均大于1mg/ml，且其溶血毒性随着银子浓度的增加而增强，具体实验结果如下表所示：

其中，溶血度计算公式如下：

溶血度(％)＝(A_材料-A_H2O)/(A_{Complete hemolysis}-A_H2O)×100％

其中A_材料为含银碳点分散液加入到红细胞后上清液的吸光度，A_H2O为水加入到红细胞后上清液的吸光度，A_{Complete hemolysis}为1％Triton X-100入到红细胞后上清液的吸光度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种含银碳点的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

(a).制备碳点：碳点的制备方法为水热法，具体为将柠檬酸、尿素、硝酸钴、和EDTA溶于N,N-二甲基甲酰胺中，然后将混合液转移到反应釜中，控温140-220℃反应3-8h，反应结束后，自然冷却到室温，离心，离心固体用氢氧化钠的乙醇溶液洗涤，然后将得到的固体放在烘箱中65℃烘干，得到红褐色粉末；

(b).制备含银碳点：将步骤(a)制备获得的碳点加入到硝酸银超纯水溶液中，升温至95℃反应20min后倒入培养皿中，放入烘箱中烘干，得到黑色固体。

2.如权利要求1所述的含银碳点的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，柠檬酸、尿素、硝酸钴、EDTA的投料重量比为1:2:1:1。

3.如权利要求1所述的含银碳点的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，反应温度为160℃，反应时间为6h。

4.如权利要求1所述的含银碳点的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，硝酸银和步骤(a)制备获得碳点的重量比为1:0.5～1.5。

5.权利要求1至4任意方法制备获得的含银碳点。

6.权利要求5所述的含银碳点在制备抗菌剂中的应用。

7.权利要求5所述的含银碳点在制备大肠杆菌抑剂或金黄色葡萄球菌抑制剂中的应用。