CN111066792A

CN111066792A - 一种抗菌剂组合物及应用

Info

Publication number: CN111066792A
Application number: CN201911297980.5A
Authority: CN
Inventors: 陈子昭; 高哲; 杨亚玲
Original assignee: Yunnan Lunyang Technology Co ltd
Current assignee: Yunnan Lunyang Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2020-04-28

Abstract

本发明以碘克沙醇、乙二胺为原料，一步水热法合成同时含氮、碘掺杂的碳点，基于合成碳点模拟酶特性，将氮、碘掺杂碳点固定到具有高度生物匹配性的壳聚糖分子表面，形成的复合物与双氧水混合作为新型抗菌剂，利用碳点纳米酶与双氧水共存，纳米酶的氧化活性促进细菌细胞氧化过程及抗氧化生物分子的消耗，导致包括H₂O₂在内的氧产物与来自活性氧（ROS）的积累的其它抗菌活性降低，同时壳聚糖也具有较好的抗菌性，产生协同抗菌效果。与油墨混合，用于烟用接装纸抗菌，其抗菌性能满足烟草行业要求，为一种安全、环境、有效新型抗菌剂。

Description

一种抗菌剂组合物及应用

技术领域

本发明属于抗菌剂制备技术领域，具体是涉及一种抗菌剂组合物及应用。

背景技术

烟用接装纸是生产卷烟的重要材料之一，它是以烟用接装原纸为基材，通过印前设计、印刷加工及印后处理等工序，将滤嘴与卷烟烟支卷接起来的一种专用纸。由于烟用接装纸与吸烟者嘴唇直接接触，因此抗菌性能也受到卷烟厂和消费者的重视。抗菌剂在纸张上的使用已有较长历史，主要分为天然抗菌剂、有机抗菌剂和无机抗菌剂等 3 大类，不同抗菌剂的抗菌机理也不尽相同。目前主要通过在油墨中加入抗菌剂达到抗菌效果，各种抗菌油墨运营而生。发明专利（CN 105542561 A）公开了表面功能化的纳米氧化铜、纳米氧化亚铜、纳米铜、纳米金及银系列抗菌剂；发明专利（CN 1066221369 A）公开了负载银/二氧化钛石墨烯量子点抗菌复合材料；发明专利（CN 103981782 A）公开了苍术硬脂及无机银抗菌复合材料。尽管这些抗菌剂有较好抗菌效果，但环保、安全、有效的抗菌剂仍有较大需求。

纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米酶作为一类新型的模拟酶，它具有许多其他传统模拟酶所无法企及的优点，人们可以根据纳米材料模拟酶的特性进行研究并加以利用，让纳米酶具有更大的应用前景。碳点（carbon dots,CDs）是一种尺寸小于10 nm的新型碳纳米材料，由sp²/sp³杂化的碳原子组成，表面具有不同的官能团，具有依赖于其成分的荧光性质，由于良好的光诱导电子转移、电子储能特性及优异的上转换光致发光行为和双光子吸收的特性引起研究者极大的兴趣。碳点具有的低毒性，生物介质的相容性，稳定性及合成便捷性等特性为其作为抗菌剂提供了好的条件，相关研究已有报道，本研究小组也进行了该方向研究，得到有益结果，但也存在抗菌效果有限、抗菌范围窄等缺陷。以碳点为纳米酶的应用目前主要用于检测领域，如葡萄糖、双氧水、尿酸、胆固醇等，用于微生物抗菌的报道几乎没有。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗菌剂组合物，利用负载氮、碘掺杂的碳点的壳聚糖对微生物菌种纳米酶氧化及壳聚糖协同抑菌杀菌作用，将其应用于抗菌油墨及烟用接装纸生产。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

本发明的技术方案主要基于以下认识：

一种抗菌剂组合物及应用，其特征在于，包括：负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖及双氧水，其中所述负载氮、碘掺杂的碳点的壳聚糖制备方法包括：

壳聚糖纳米粒子制备：称取1-5份壳聚糖溶解于100-500份1%乙酸溶液，加入(v/v) 0.4-0.8%的吐温-20水溶液，在不断搅拌下，将(w/v) 0.04-0.08%三聚磷酸钠水溶液逐滴加入到上述溶液中，pH被调至5.0，搅拌10-20min，即为壳聚糖纳米粒子；

碘氮掺杂碳点制备：称取1-3份碘克沙醇，加入100-150份超纯水，混合溶解，加入0.3-1份乙二胺，超声10-20min，并转移至聚四氟乙烯反应釜，于180℃加热8-12h，自然冷却后，先用孔径为0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000D 的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性碘氮掺杂碳点；

负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备：将上述制备的等体积壳聚糖纳米粒子与碘氮掺杂碳点混合，加入1.5-2倍pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌30-40min，摇床振摇15-20 h，即得负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖。

所述负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖及双氧水重量比为1:150-550。

所述微生物菌种包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌之一种。

所述抗菌剂组合物与油墨按照1:240-480重量比进行混合，得到抗菌油墨，再应用于烟用接装纸生产。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1、本发明首次将含负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖技术引入微生物抑菌杀菌领域。尤其利用氮、碘掺杂的碳点的纳米酶特性，与双氧水共存，其催化氧化产生的活性氧（ROS）的抑菌杀菌效果明显，较单一双氧水杀菌效果增加90%以上。

2、将壳聚糖制备成纳米壳聚糖粒子后，利用纳米材料独特的尺寸效应在保留壳聚糖优良性质的同时，能明显提升其力学性质及抗菌性。

3、负载氮、碘掺杂的碳点的壳聚糖中氮、碘掺杂碳点模拟酶特性与纳米壳聚糖产生的协同抗菌作用，使其成为一种全新抗菌剂，其抗菌效果与现有商品化的抗生素及抗菌素药物相比，抗菌效果更加优异。

4、该抗菌剂制备工艺操作简单，不需添加有机试剂，具有安全，环保及生物相容性好等特点。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明所作出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例1：抗菌剂对大肠杆菌抑菌杀菌效果

1、负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备方法包括以下步骤：

壳聚糖纳米粒子制备：称取1份壳聚糖溶解于100份1%乙酸溶液，加入(v/v) 0.4%的吐温-20水溶液，在不断搅拌下，将(w/v) 0.04%三聚磷酸钠水溶液逐滴加入到上述溶液中，pH被调至5.0，搅拌10min，即为壳聚糖纳米粒子；

碘氮掺杂碳点制备：称取1份碘克沙醇，加入100份超纯水，混合溶解，加入0.3份乙二胺，超声10min，并转移至聚四氟乙烯反应釜，于180℃加热8 h，自然冷却后，先用孔径为0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000D 的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性碘氮掺杂碳点；

负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备：将上述制备的等体积壳聚糖纳米粒子与碘氮掺杂碳点混合，加入1.5倍pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌30 min，摇床振摇15 h，即得负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖。

2、抗菌剂制备：将负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖与双氧水按重量比1:150混合均匀即可。

3、负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖大肠杆菌的抑菌杀菌作用：

（1）菌种的培养：大肠杆菌（Ｅ.coli ATCC 25922）购自云南大学微生物研究所。将菌株植入营养肉汤培养，在 37 ℃ 摇床约 18h ，营养肉汤琼脂培养基平皿画线培养，置于 37℃隔水恒温培养箱中约 24 h ，挑去单个菌落于营养肉汤琼脂斜面培养基中培养，置于37 ℃ 隔水恒温培养箱中约 24 h ，用接种环挑取少许菌体于装有无菌生理盐水的试管中，振荡均匀，制成菌悬液，用血球计数板计数，用无菌生理盐水稀释至 10⁶cfu/mL，备用。

（2）负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖的抑菌圈试验。将负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖稀释成3个浓度梯度，即C₁=56.5 µg/mL、C₂=37.0µg/mL、C₃=19.5 µg/mL，双氧水浓度为300μM，以无菌水为空白对照，共4个处理。将负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖与双氧水混合，使用混匀器充分混匀，取菌液100μL，加入含琼脂粉的固体培养基上，用涂布器涂布均匀，用滤纸片扩散法进行抑菌试验，一共涂布4个平板(平板直径9 cm)，1号平板贴3片浸有C₃的无菌滤片，2号平板贴3片浸有C₂的无菌滤纸片，3号平板贴3片浸有C₁无菌滤纸片，4号平板贴3片浸有无菌水的无菌滤纸片作对照（滤纸片直径均为6 mm）。将涂布好并贴有滤纸片的细菌平板在37℃条件下倒置培养24 h，将涂布好并贴有滤纸片的大肠杆菌平板在37℃条件下倒置培养48 h。测抑菌圈大小，计算抑菌率。以壳聚糖纳米粒子、碘氮掺杂碳点、双氧水在相同条件下做对比试验。结果见表1。

抑菌率=(试验抑菌圈直径-对照抑菌圈直径)／试验抑菌圈直径×100％。

（3）负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖的最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MBC)试验。称取一定量的抗菌剂溶解于无菌水中，超声分散后，用无菌移液管移取 50µ L 的抗菌剂悬浮液，用无菌液体培养基稀释至 5 mL ，配制成稀释的抗菌剂悬浮液。采用二倍稀释法将抗菌剂悬浮液依次稀释得到 296、148、74、37、18.5、9.25 mg·L ^-1 不同浓度梯度的抗菌剂测试液，与300μM双氧水混合，使用混匀器充分混匀。移取 100μL涂布到琼脂平板，37 ℃培养18 h后计数，观察琼脂平板菌落生长状况，以含抗菌剂的无菌液体培养液作为参比液体。用紫外可见分光度计 (OD=600 nm) 测试样品的吸光度值，以处理液和参比液的吸光度相同的最小抗菌剂浓度为该抗菌剂的最小抑菌浓度 (MIC) ，使活菌生长减少99% 以上的最小抗菌剂浓度为该抗菌剂的最小杀菌浓度 (MBC) 。结果见表3。

表1 负载N/I-CDs的壳聚糖模拟氧化酶体系对大肠杆菌的抑菌圈直径/mm

抑菌剂	56.5	37.0	19.5	0
					仅有N/I-CDs (µg/mL)	8.5	7.5	7.0	6
仅有H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(300μM)	7.5	-	-	6
					壳聚糖纳米粒子(μg/mL)	12.5	9.5	8	6
负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖(µg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(300μM)	24.5	22.5	20	6

实施例2：抗菌剂对金黄色葡萄球菌抑菌杀菌效果

1、负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备方法包括以下步骤：

壳聚糖纳米粒子制备：称取3份壳聚糖溶解于300份1%乙酸溶液，加入(v/v) 0.6%的吐温-20水溶液，在不断搅拌下，将(w/v) 0.06%三聚磷酸钠水溶液逐滴加入到上述溶液中，pH被调至5.0，搅拌15 min，即为壳聚糖纳米粒子；

碘氮掺杂碳点制备：称取2份碘克沙醇，加入120份超纯水，混合溶解，加入0.5份乙二胺，超声15 min，并转移至聚四氟乙烯反应釜，于180℃加热10 h，自然冷却后，先用孔径为0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000D 的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性碘氮掺杂碳点；

负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备：将上述制备的等体积壳聚糖纳米粒子与碘氮掺杂碳点混合，加入 2倍pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌40min，摇床振摇20 h，即得负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖。

2、抗菌剂制备：将负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖与双氧水按重量比1:300混合均匀即可。

3、负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖金黄色葡萄球菌的抑菌杀菌作用：

（1）菌种的培养：金黄色葡萄球菌 (S. aureus ATCC6538) 购自云南大学微生物研究所。其他同实施例1。

（2）负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖的抑菌圈试验。同实施例1。结果见表2。

（3）负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖的最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MBC)试验。同实施例1。结果见表3。

表2 负载N/I-CDs的壳聚糖模拟氧化酶体系对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径/mm

抑菌剂	56.5	37.0	19.5	0
					仅有N/I-CDs (µg/mL)	8.5	7.5	7.0	6
仅有H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(300μM)	7.5	-	-	6
					壳聚糖纳米粒子(30μg/mL)	16	14.5	11.5	6
负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖(µg/mL)+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(300μM)	23	20	17	6

表3 负载N/I-CDs的壳聚糖模拟氧化酶体系对致病菌的MIC 与MBC

实施例3：抗菌剂用于烟用接装纸

1、负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备方法包括以下步骤：

壳聚糖纳米粒子制备：称取5份壳聚糖溶解于500份1%乙酸溶液，加入(v/v) 0.8%的吐温-20水溶液，在不断搅拌下，将(w/v) 0.08%三聚磷酸钠水溶液逐滴加入到上述溶液中，pH被调至5.0，搅拌20min，即为壳聚糖纳米粒子；

碘氮掺杂碳点制备：称取3份碘克沙醇，加入150份超纯水，混合溶解，加入1份乙二胺，超声20min，并转移至聚四氟乙烯反应釜，于180℃加热12h，自然冷却后，先用孔径为0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000D 的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性碘氮掺杂碳点；

负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备：将上述制备的等体积壳聚糖纳米粒子与碘氮掺杂碳点混合，加入2倍pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌35 min，摇床振摇20 h，即得负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖。

2、抗菌剂制备：将负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖与双氧水按重量比1:550混合均匀即可。

3、抗菌油墨制备：将抗菌剂与油墨按照1: 480重量比进行混合，得到抗菌油墨。

4、烟用接装纸抗菌试验：将抗菌油墨用于烟用接装纸生产，生产出的烟用接装纸，按照Q/YNZY.J04.103-2018标准进行试验。将抗菌接装纸制成 2.0cm×3.0cm 纸片，以4 片为 1 组，同时用不加抗菌剂的相同纸张作阴性对照和阳性对照。抑菌试验用大肠杆菌（Ｅ.coli ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC6538）制成菌悬液，在试验纸片上滴染菌悬液5µL （阴性对照不染菌），使用灭菌接种环涂布均匀，开始计时，分别作用不同时间后，用无菌镊子分别将样品投入含5mL 磷酸盐缓冲液试管内，使用混匀器充分混匀，接着，吸取管内菌液0.5mL，移至含4.5mL 磷酸盐缓冲液试管内（稀释10倍），充分混匀；接着，按照上述方法再将菌液稀释10倍，最后，取上述两个稀释度，分别吸取菌液0.5mL，置于两个灭菌平板内，用凉至40-45℃的营养琼脂培养基15mL作倾注，待琼脂凝固后，翻转平皿，使其充分均匀，待琼脂凝固后，翻转平板，35±2℃培养48h，作活菌菌落计数。试验重复3次，计算抑菌率。结果见表4。

抑菌率（%）=（空白-样品）/空白×100%

表4 烟用接装纸抑菌试验结果

由表1-表3 可知，本发明制备负载N/I-CDs的壳聚糖模拟氧化酶体系对致病菌抑菌、杀菌作用效果明显。N/I-CDs与H₂O₂组成的模拟酶体系，在可见光照射下，纳米酶的氧化活性促进细菌细胞氧化过程及抗氧化生物分子的消耗，导致包括H₂O₂在内的氧产物与来自活性氧（ROS）的积累的其它抗菌活性降低，产生好的抗菌效果，壳聚糖本身就是一种抗菌物质，负载于N/I-CDs上形成的模拟酶体系的协同氧化，效果更为明显。

由表4可见，本发明制备的负载N/I-CDs的壳聚糖模拟氧化酶体系用于抗菌油墨用于烟用接装纸生产，烟用接装纸具有很好抑菌效果，由于抗菌剂安全、有效，可以作为一种新型抗菌剂。

Claims

1.一种抗菌剂组合物及应用，其特征在于，包括：负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖及双氧水，其中所述负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖制备方法包括：

2.根据权利要求1所述一种抗菌剂组合物及应用，其特征在于，所述负载氮、碘掺杂碳点的壳聚糖及双氧水重量比为1: 150-550。

3.根据权利要求1所述一种抗菌剂组合物及应用，其特征在于，所述微生物菌种包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌之一种。

4.根据权利要求1所述一种抗菌剂组合物及应用，其特征在于，所述抗菌剂组合物与油墨按照1:240-480重量比进行混合，得到抗菌油墨，再应用于烟用接装纸生产。