CN106220732A - 抗CTLA‑4的纳米抗体Nb16及其制备方法与应用 - Google Patents

抗CTLA‑4的纳米抗体Nb16及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗CTLA‑4的纳米抗体Nb16及其制备方法与应用。本发明所提供的纳米抗体，包含决定簇互补区和框架区；所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第26‑35位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第51‑59位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第97‑106位氨基酸。本发明的纳米抗体Nb16可以与T细胞及CTLA‑4结合，可应用于CTLA‑4分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CTLA‑4活性和促进T细胞增殖的药物。

Description

抗CTLA-4的纳米抗体Nb16及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中抗CTLA-4的纳米抗体Nb16及其制备方法与应用。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocytic associatedantigen,CTLA-4/CTLA4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是活化T细胞表面表达的一种跨膜糖蛋白分子，属免疫球蛋白超家族成员，对T细胞增殖起负性调节作用，在免疫应答中起重要调节作用。CTLA-4Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应、肿瘤及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。
抗体药物应用存在很多问题，比如研发周期长，生产成本过高；难以大规模生产；稳定性差易降解，贮存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在临床上的应用范围。
纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子。1993年Hamers等报道，骆驼体内存在着天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(variable domain of heavychain of heavy-chain antibody)，现已被重新命名为“纳米抗体”(nanobody，Nb)。纳米抗体具有完整功能的最小的抗原结合片段，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm。Nb具有许多独特的性质，很适合进行基因改造，在疾病的精确诊断和靶向治疗等方面展现了广阔的应用前景。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成。纳米抗体对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低。纳米抗体的独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了纳米抗体。
本发明所提供的纳米抗体，其名称为Nb16，包含决定簇互补区；
所述Nb16的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第26-35位氨基酸；
所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第51-59位氨基酸；
所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第97-106位氨基酸。
上述纳米抗体中，所述Nb16由所述决定簇互补区和框架区组成。
上述纳米抗体中，所述Nb16为下述a)或b)：
a)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-117位氨基酸的纳米抗体；
b)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的纳米抗体。
为了使所述Nb16便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.1的第1-117位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA
所述Nb16可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述Nb16的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.2的第1-351位核苷酸或SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
其中，SEQ ID No.2的第1-351位核苷酸编码SEQ ID No.1的第1-117位氨基酸的纳米抗体，SEQ ID No.2的第352-408位核苷酸编码SEQ ID No.1的第118-136位氨基酸的纳米抗体，SEQ ID No.2所示的DNA编码SEQ ID No.1所示的纳米抗体。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述Nb16相关的生物材料。
本发明所提供的与所述Nb16相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：
B1)编码所述Nb16的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码所述Nb16的核酸分子的表达盒(Nb16基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Nb16的DNA，该DNA不但可包括启动Nb16基因转录的启动子，还可包括终止Nb16基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述Nb16基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pComb3中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述Nb16的编码基因(核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2的第1-351位核苷酸)导入pComb3中得到的重组载体pComb3-Nb16，重组载体pComb3-Nb16表达SEQ ID No.1所示的纳米抗体Nb16。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述生物材料中，所述转基因动物细胞系不包括繁殖材料；所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入到大肠杆菌WK6中得到的重组微生物。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的B1)所述Nb16的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的B1)所述Nb16的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述Nb16且具有Nb16活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1-117位氨基酸所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述Nb16的CDR1的编码序列为序列表中SEQ ID No.2的第76-105位核苷酸；
所述Nb16的CDR2的编码序列如序列表中SEQ ID No.2的第151-177位核苷酸；
所述Nb16的CDR3的编码序列为序列表中SEQ ID No.2的第289-318位核苷酸。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)或4)：
1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第1-351位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Nb16的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Nb16的cDNA分子或基因组DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述Nb16的衍生抗体。
本发明所提供的所述Nb16的衍生抗体，为下述a)或b)或c)或d)或e)：
a)含有所述Nb16的单链抗体；
b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；
c)含有所述Nb16的融合抗体；
d)含有所述Nb16的Fab；
e)含有所述Nb16的完整抗体。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述Nb16的制备方法。
本发明所提供的所述Nb16的制备方法，包括将编码所述Nb16的核酸分子导入受体细胞得到表达所述Nb16的转基因细胞，培养所述转基因细胞，得到所述Nb16。
上述Nb16的制备方法中，所述编码所述Nb16的核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1-351位核苷酸或SEQ ID No.2所示。
上述Nb16的制备方法中，所述受体细胞可为微生物细胞，如大肠杆菌，具体可为大肠杆菌WK6。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述A1-A12中的任一种用途：
A1、所述Nb16在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A2、所述生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A3、所述纳米抗体的衍生抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A4、所述Nb16的制备方法在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A5、所述Nb16在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A6、所述生物材料在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A7、所述衍生抗体在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A8、所述Nb16的制备方法在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A9、所述Nb16在制备与CTLA-4结合产品中的应用；
A10、所述生物材料在制备与CTLA-4结合产品中的应用；
A11、所述衍生抗体在制备与CTLA-4结合产品中的应用；
A12、所述Nb16的制备方法在制备与CTLA-4结合产品中的应用。
上述产品可为药物。
扩增编码序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或其任一片段氨基酸序列的核酸分子的引物对，也属于本发明的保护范围。
本发明公开了针对于CTLA-4多肽分子抗原表位的一种纳米抗体(Nb16)，同时还公布了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体(Nb16)能够在大肠杆菌内高效表达，可以与T细胞及CTLA-4结合，可应用于CTLA-4分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CTLA-4活性和促进T细胞增殖的药物。
附图说明
图1为纳米抗体Nb16的SDA-PAGE电泳图。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。
图2为纳米抗体Nb30的SDA-PAGE电泳图。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。
图3为纳米抗体Nb36的SDA-PAGE电泳图。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。
图4为纳米抗体Nb91的SDA-PAGE电泳图。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。
图5为纳米抗体Nb16与抗原的结合实验结果。
图6为纳米抗体Nb30与抗原的结合实验结果。
图7为纳米抗体Nb36与抗原的结合实验结果。
图8为纳米抗体Nb91与抗原的结合实验结果。
图5-图8中，CTLA-4mAb表示PE mouse anti-human CD152。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌WK6(Yan et al.,Characterization and applications of Nanobodies against human procalcitonin selected from a novelNanobody phage display l ibrary，Journal of Nanobiotechnology(2015)13:33)经东南大学生命科学研究院万亚坤实验室同意后，公众可从广西医科大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、纳米抗体的制备
本发明提供了来源于骆驼的四种纳米抗体，其名称分别为Nb16、Nb30、Nb36和Nb91。其中，Nb16的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，由SEQ ID No.2的核苷酸序列编码；Nb30的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，由SEQ ID No.4的核苷酸序列编码；Nb36的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，由SEQ ID No.6的核苷酸序列编码；Nb91的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，由SEQ ID No.8的核苷酸序列编码。
将载体pComb3(Biovector产品)的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQID No.2所示的DNA分子，其他序列均不变，得到重组载体pComb3-Nb16，pComb3-Nb16与pComb3的差别仅在于将pComb3的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.2所示的DNA分子。重组载体pComb3-Nb16表达SEQ ID No.1所示的纳米抗体Nb16。将pComb3-Nb16导入大肠杆菌WK6中，得到重组菌WK6-pComb3-Nb16。
将载体pComb3(Biovector产品)的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQID No.4所示的DNA分子，其他序列均不变，得到重组载体pComb3-Nb30，pComb3-Nb30与pComb3的差别仅在于将pComb3的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.4所示的DNA分子。重组载体pComb3-Nb16表达SEQ ID No.3所示的纳米抗体Nb30。将pComb3-Nb30导入大肠杆菌WK6中，得到重组菌WK6-pComb3-Nb30。
将载体pComb3(Biovector产品)的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQID No.6所示的DNA分子，其他序列均不变，得到重组载体pComb3-Nb36，pComb3-Nb36与pComb3的差别仅在于将pComb3的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.6所示的DNA分子。重组载体pComb3-Nb36表达SEQ ID No.5所示的纳米抗体Nb36。将pComb3-Nb36导入大肠杆菌WK6中，得到重组菌WK6-pComb3-Nb36。
将载体pComb3(Biovector产品)的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQID No.8所示的DNA分子，其他序列均不变，得到重组载体pComb3-Nb91，pComb3-Nb91与pComb3的差别仅在于将pComb3的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.8所示的DNA分子。重组载体pComb3-Nb91表达SEQ ID No.7所示的纳米抗体Nb91。将pComb3-Nb91导入大肠杆菌WK6中，得到重组菌WK6-pComb3-Nb91。
纳米抗体的具体制备步骤如下：
(1)将WK6-pComb3-Nb16涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB平板(LB平板中，氨苄青霉素和葡萄糖的浓度分别为100μg/mL和20mg/mL)上，37℃培养过夜(12小时)；
(2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液(LB培养液中，氨苄青霉素的浓度为100μg/mL)中，37℃摇床培养过夜(12小时)；
(3)取1mL步骤(2)培养过夜的培养液接种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养至OD值达到0.6-1时，加入IPTG，得到WK6-pComb3-Nb16培养液，使WK6-pComb3-Nb16培养液中IPTG的浓度为1mM，将WK6-pComb3-Nb16培养液在28℃下于摇床(摇床的转速为220rpm)上培养过夜(12小时)，得到WK6-pComb3-Nb16诱导液；
(4)将步骤(3)的WK6-pComb3-Nb16诱导液于4℃下离心，收集菌体；
(5)利用文献(Zhu M,Hu Y,Li G,Ou W,Mao P,Xin S,Wan Y:Combining magneticnanoparticle with biotinylated nanobodies for rapid and sensitive detectionof influenza H3N2.Nanoscale Res Lett 2014,9:528.)中的渗透法，获得抗体粗提液；
(6)利用文献(Zhu M,Hu Y,Li G,Ou W,Mao P,Xin S,Wan Y:Combining magneticnanoparticle with biotinylated nanobodies for rapid and sensitive detectionof influenza H3N2.Nanoscale Res Lett 2014,9:528.)中的镍柱离子亲和层析法制备纳米抗体Nb16。
按照上述步骤(1)-(6)的方法，分别将WK6-pComb3-Nb16替换为WK6-pComb3-Nb30、WK6-pComb3-Nb36和WK6-pComb3-Nb91，其他步骤均不变，分别得到纳米抗体Nb30、Nb36和Nb91。
纳米抗体Nb16、Nb30、Nb36和Nb91的SDA-PAGE电泳图分别如图1、图2、图3和图4所示。结果显示，上述方法得到的纳米抗体Nb16、Nb30、Nb36和Nb91的纯度均达到90％以上。
实施例2、纳米抗体与CTLA-4结合率的测定
一、纳米抗体与CTLA-4结合率测定(直接法)
从健康志愿者人外周血细胞中分离T细胞，培养于96孔板中，将10μg/ml PHA(sigma，L9017)加入T细胞中共培养72h后，将实施例1的Nb16(1μg)加入1×106个上述T细胞中4℃避光孵育30min，PBS洗涤三次后，加入1μg PE anti-HA tag antibody(abcam，Clone:16B12)4℃孵育30min，PBS洗涤三次后，将样品上BACKMAN流式细胞仪，结果如图5中A所示。
按照上述方法，将Nb16分别替换为Nb30、Nb36和Nb91，其他步骤均不变，得到Nb30、Nb36和Nb91与CTLA-4的结合结果，分别如图6中A、图7中A、图8中A所示。
二、纳米抗体与CTLA-4结合率测定(竞争法)
1、从健康志愿者人外周血细胞中分离T细胞，培养于96孔板中，将10μg/ml PHA(sigma，L9017)加入T细胞中共培养72h，得到PHA刺激的T细胞。
2、将PE mouse anti-human CD152(BD Clone:BNI3)(20μl)与1×106个上述T细胞4℃避光孵育30min，PBS洗涤三次后，将样品上BACKMAN流式细胞仪。
3、将实施例1的Nb16(1μg)与PE mouse anti-human CD152(BD Clone:BNI3)(20μl)4℃避光孵育30min，然后将该混合物与步骤1的1×106个PHA刺激的T细胞4℃避光孵育30min，PBS洗涤三次后，将样品上BACKMAN流式细胞仪。结果如图5中B所示。
按照上述方法，将Nb16分别替换为Nb30、Nb36和Nb91，其他步骤均不变，得到Nb30、Nb36和Nb91与CTLA-4的结合结果，分别如图6中B、图7中B、图8中B所示。
结果表明，纳米抗体Nb16、Nb30、Nb36和Nb91均可以与T细胞及CTLA-4结合。

Claims (10)

1.纳米抗体，包含决定簇互补区；
所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第26-35位氨基酸；
所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第51-59位氨基酸；
所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第97-106位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体由所述决定簇互补区和框架区组成。
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体为下述a)或b)：
a)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-117位氨基酸的纳米抗体；
b)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的纳米抗体。
4.与权利要求1或2或3所述纳米抗体相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：
B1)编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：
所述纳米抗体的CDR1的编码序列为序列表中SEQ ID No.2的第76-105位核苷酸；
所述纳米抗体的CDR2的编码序列为序列表中SEQ ID No.2的第151-177位核苷酸；
所述纳米抗体的CDR3的编码序列为序列表中SEQ ID No.2的第289-318位核苷酸。
6.根据权利要求4或5所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)或4)：
1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第1-351位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的cDNA分子或基因组DNA分子。
7.权利要求1或2或3所述纳米抗体的衍生抗体，为下述a)或b)或c)或d)或e)：
a)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的单链抗体；
b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；
c)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的融合抗体；
d)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的Fab；
e)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的完整抗体。
8.权利要求1或2或3所述纳米抗体的制备方法，包括将编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体的转基因细胞，培养所述转基因细胞，得到所述纳米抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1-351位核苷酸或SEQ ID No.2所示；
和/或，
所述受体细胞为微生物细胞。
10.下述A1-A12中的任一种用途：
A1、权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A2、权利要求4-6中任一所述生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A3、权利要求7所述衍生抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A4、权利要求8或9所述方法在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A5、权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A6、权利要求4-6中任一所述生物材料在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A7、权利要求7所述衍生抗体在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A8、权利要求8或9所述方法在制备抑制CTLA-4活性或促进T细胞增殖产品中的应用；
A9、权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备与CTLA-4结合产品中的应用；
A10、权利要求4-6中任一所述生物材料在制备与CTLA-4结合产品中的应用；
A11、权利要求7所述衍生抗体在制备与CTLA-4结合产品中的应用；
A12、权利要求8或9所述方法在制备与CTLA-4结合产品中的应用。
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