CN114349859B - 抗EGFRvⅢ的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗EGFRvⅢ的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1‑11及其制备方法与应用。本发明所提供的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1‑11，包含抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR；所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1‑11的抗原决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；通过本发明所公布的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1‑11核苷酸序列及宿主细胞，该纳米抗体EGFRvIII/Nb1‑11能够在大肠杆菌内高效表达，可以应用于EGFRvⅢ分子检测试剂的研发，及制备靶向表达EGFRvⅢ的肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂。

Description

抗EGFRvⅢ的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域中抗EGFRvⅢ的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11及其制备方法与应用。

背景技术

表皮生长因子受体III型突变体(epidermal growthfactor receper variantIII，EGFRvIII)是表皮生长因子受体最常见的突变体，由外显子2到7的框内缺失和外显子1和8的连接处产生新的甘氨酸残基引起的。这种新的氨基酸在EGFR胞外区产生了肿瘤特异性、致癌性和免疫原性的表位。EGFRvIII是一种肿瘤特异性受体，仅在胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)和其他肿瘤细胞表面表达，但在正常组织中不存在。在新诊断的GBM病例中EGFRvIII表达率约为30％，是治疗胶质母细胞瘤(GBM)的理想靶点。EGFRvⅢ在肿瘤中的表达往往与不良预后相关，靶向EGFRvⅢ的抗体药物对于抑制GBM和其他肿瘤细胞的进展和侵袭具有很大的治疗价值。

但是，抗体药物应用存在很多问题，比如研发周期长，生产成本过高；难以大规模生产；稳定性差且易降解，贮存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在临床上的应用范围。

纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子。

1993年Hamers等报道，骆驼体内存在着天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(variable domainof heavy chain of heavy-chain antibody)，现已被重新命名为“纳米抗体”(nanobody，Nb)。纳米抗体具有完整功能的最小的抗原结合片段，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm。Nb具有许多独特的性质，很适合进行基因改造，在疾病的精确诊断和靶向治疗等方面展现了广阔的应用前景。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成。纳米抗体对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低。纳米抗体的独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，如何制备有效治疗肿瘤的药物。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11。

本发明在第一方面提供了一种纳米抗体，称为EGFRvⅢ/Nb1-11，该纳米抗体包含抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR；所述纳米抗体的抗原决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第26-35位氨基酸(参见SEQID NO.2)；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第51-60位氨基酸(参见SEQID NO.4)；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第101-110位氨基酸(参见SEQID NO.6)。

优选地，该纳米抗体的骨架区FR由FR1、FR2、FR3和FR4组成；其中所述FR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第1-25位氨基酸(参见SEQ ID NO.1)；所述FR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第36-50位氨基酸(参见SEQ ID NO.3)；所述FR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第61-100位氨基酸(参见SEQ ID NO.5)；所述FR4的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第111-121位氨基酸(参见SEQ ID NO.7)。

优选地，所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示。

为了使所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.9的第1-121位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	例如RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	例如HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

本发明另外一方面，所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的编码基因可通过将序列表中EGFRvⅢ/Nb1-11所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11相关的生物材料。

本发明所提供的与所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：

B1)编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核酸分子的表达盒，又称为EGFRvⅢ/Nb1-11基因表达盒，是能够在宿主细胞中表达纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的DNA，该DNA不但可包括启动纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11基因转录的启动子，还可包括终止纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pMECS中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的编码基因(核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第1-363位核苷酸)导入pMECS中得到的重组载体pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11，重组载体pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11表达SEQ ID No.9所示的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述生物材料中，所述转基因动物细胞系不包括繁殖材料；所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入到大肠杆菌WK6中得到的重组微生物。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的B1)所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的B1)所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11且具有纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11活性，或者只要只要编码所述纳米抗体与EGFRvⅢ/Nb1-11类似的蛋白且具有与纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11相似的活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.9所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)：

1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.8的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的cDNA分子或基因组DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的衍生抗体。

本发明所提供的所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的衍生抗体，为下述a)或b)或c)或d)或e)：

a)含有所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的单链抗体；

b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；

c)含有所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的融合抗体；

d)含有所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的Fab；

e)含有所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的完整抗体。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的制备方法。

本发明所提供的所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核酸分子导入受体细胞，得到表达所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的转基因细胞；

(2)培养所述转基因细胞，得到所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11。

上述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的制备方法中，所述编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核酸分子包含如序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；优选的是，所述编码所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示。

上述纳米抗体EGFRVⅢ/Nb1-11的制备方法中，所述受体细胞可为微生物细胞，如大肠杆菌，具体可为大肠杆菌WK6。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述C1-C8中的任一种用途：

C1、所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

C2、所述生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

C3、所述纳米抗体的衍生抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

C4、所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的制备方法在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

C5、所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11在制备抑制EGFRVⅢ活性或促进T细胞增殖产品中的应用；

C6、所述生物材料在制备抑制EGFRvⅢ活性或促进T细胞增殖产品中的应用；

C7、所述衍生抗体在制备抑制EGFRvⅢ活性或促进T细胞增殖产品中的应用；

C8、所述纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的制备方法在制备抑制EGFRvⅢ活性或促进T细胞增殖产品中的应用。

上述产品可为药物。

扩增编码序列表中SEQ ID No.9所示的氨基酸序列或其任一片段氨基酸序列的核酸分子的引物对，也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种抗EGFRvⅢ的纳米抗体、编码该纳米抗体的核苷酸序列及宿主细胞，以及其制备方法和应用。该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于EGFRvⅢ分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制EGFRvⅢ活性和促进T细胞增殖的药物。

附图说明

图1是纳米抗体的DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为2000bp的分子标记，第二道为PCR产物，PCR产物带约为400bp；

图2是EGFRvⅢ纳米抗体EGFRVⅢ/Nb1-11经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；泳道M表示蛋白分子量Marker，单位为KDa；

图3A为纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11与未转染EGFRvⅢ的U251细胞的结合实验结果；图3B为纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11与转染EGFRvⅢ的u251细胞的结合实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大肠杆菌WK6来自广西医科大学。

实施例1、纳米抗体的制备

本发明提供了来源于骆驼的1种纳米抗体，其名称为EGFRvⅢ/Nb1-11，该纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示，由SEQ ID No.8的核苷酸序列编码。

纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的核苷酸电泳图如图1所示，其中第一道为2000bp的分子标记，第二孔道为PCR产物，PCR产物带约为400bp。

将载体pMECS的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.8所示的DNA分子，其他序列均不变，得到重组载体pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11，pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11与pMECS的差别仅在于将pMECS的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.8所示的DNA分子。重组载体pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11表达SEQ ID No.9所示的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11。将pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11导入大肠杆菌WK6中，得到重组菌WK6-pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11。

纳米抗体的具体制备步骤如下：

(1)将WK6-pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB平板(LB平板中，氨苄青霉素和葡萄糖的浓度分别为100μg/mL和20mg/mL)上，25-37℃培养过夜(10-14小时)；

(2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液(LB培养液中，氨苄青霉素的浓度为100μg/mL)中，25-37℃摇床培养过夜(10-14小时)；

(3)步骤(2)培养过夜的培养液按照1﹕300-1﹕350接种至新鲜TB培养液中，25-37℃摇床培养至OD值达到0.6-1.0时，加入IPTG，得到WK6-pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11培养液，使WK6-pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11培养液中IPTG的浓度为1mM，将WK6-pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11培养液在20-30℃下于摇床(摇床的转速为220-250rpm)上培养过夜(10-14小时)，得到WK6-pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11诱导液；

(4)将步骤(3)的WK6-pMECS-EGFRvⅢ/Nb1-11诱导液于4℃下离心，收集菌体；

(5)利用文献(Zhu M,Hu Y,Li G,Ou W,Mao P,Xin S,Wan Y:Combining magneticnanoparticle with biotinylated nanobodies for rapid and sensitive detectionof influenza H3N2.Nanoscale Res Lett 2014,9:528.)中的渗透法，获得抗体粗提液；

(6)利用文献(Zhu M,Hu Y,Li G,Ou W,Mao P,Xin S,Wan Y:Combining magneticnanoparticle with biotinylated nanobodies for rapid and sensitive detectionof influenza H3N2.Nanoscale Res Lett 2014,9:528.)中的镍柱离子亲和层析法制备纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11。纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的SDA-PAGE电泳图分别如图2，纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的大小约为15KDa。结果显示，上述方法得到的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11的纯度可以达到90％以上。

实施例2、纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11与EGFRvⅢ结合率的测定纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11与EGFRvⅢ结合率测定(直接法)

用稳转EGFRvⅢ的U251细胞检测纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11与EGFRvⅢ结合率，将实施例1的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11(1μg)加入1-6×10⁶个上述U251细胞中4℃避光孵育20-40min，PBS洗涤2次后，加入5μl Alexa Fluor 647anti-HA tag antibody(Cellsignaling)4℃孵育20-40min，PBS洗涤2次后，将样品上BACKMAN流式细胞仪，结果如图3B所示，未转染EGFRvⅢ的U251细胞作为对照如图3A所示。图3A是空白对照和EGFRvⅢ纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11分别与未转染EGFRvⅢ的U251细胞的结合百分率；图3B是空白对照和EGFRvⅢ纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11分别稳转EGFRvⅢ的U251细胞的结合百分率；图3A和3B中横轴为荧光强度(Alexa Fluor 647)，纵轴为数量百分比(％of Max)，S2代表空白对照，S1代表EGFRvⅢ纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11。图示结果可以看出EGFRvⅢ纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11能够很好的与稳转EGFRvⅢ的U251细胞结合。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西医科大学

<120> 抗EGFRvⅢ的纳米抗体EGFRvⅢ/Nb1-11及其制备方法与应用

<130> GY21100985

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser

20 25

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Gly Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Cys Thr Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Ile His Thr Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Gln Asp Asn Ala Lys

1 5 10 15

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly

20 25 30

Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asn Pro

35 40

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Ser Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggaggatc tctgagactc 60

tcctgtgcag tctctggatt aacctacagt agcaggtgta cgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct attcatactg gtggtggtat cacatactat 180

accgactccg tgaagggccg attcaccctc tcccaagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acaatctgaa acctgaagac actggcatgt actactgtgc ggcaaatccc 300

agtggttact gctcctcaaa ttttgcttac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Thr Tyr Ser Ser Arg

20 25 30

Cys Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile His Thr Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Ser Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims (14)

1.一种纳米抗体，包含抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR；其特征在于：

所述纳米抗体的抗原决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第26-35位氨基酸；

所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第51-60位氨基酸；

所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第101-110位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于：

所述骨架区FR由FR1、FR2、FR3和FR4组成；

其中所述FR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第1-25位氨基酸；所述FR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第36-50位氨基酸；所述FR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第61-100位氨基酸；所述FR4的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第111-121位氨基酸。

3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于：

所述纳米抗体包含如序列表中SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体，其特征在于：

所述纳米抗体在氨基末端或羧基末端连接上用于方便纯化的标签氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的纳米抗体，其特征在于：

所述标签氨基酸序列选自由Poly-Arg序列、Poly-His序列、FLAG序列、Strep-tag

序列、c-myc序列和HA序列中的一种标签氨基酸序列，其中Poly-Arg序列为(R)_n，n为5或6；Poly-His序列为(H)_m，m为2-10；FLAG序列为DYKDDDDK；Strep-tag />

序列为WSHPQFEK；c-myc序列为EQKLISEEDL；HA序列为YPYDVPDYA。

7.根据权利要求6所述的纳米抗体，其特征在于，n为6。

8.根据权利要求6所述的纳米抗体，其特征在于，m为6。

9.与权利要求1至8中任一项所述的纳米抗体相关的生物材料，其中，所述生物材料为B1）至B12）中的任一种：

B1）编码权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B9）含有B1）所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10）含有B2）所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11）含有B3）所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12）含有B4）所述重组载体的转基因动物细胞系；

所述核酸分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.8的cDNA分子或DNA分子。

10.一种权利要求1至8中任一项所述纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将编码权利要求1至8中任一项所述的纳米抗体的核酸分子导入受体细胞，得到表达所述纳米抗体的转基因细胞；

（2）培养所述转基因细胞，得到所述纳米抗体。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，编码权利要求1至8中任一项所述的纳米抗体的核酸分子包含序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，编码权利要求1至8中任一项所述的纳米抗体的核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述受体细胞为微生物细胞。

14.下述A1-A3中的任一种应用：

A1、权利要求1至8中任一项所述的纳米抗体在制备用于结合表达EGFRvⅢ的T细胞的药物中的应用；

A2、权利要求9所述的生物材料在制备用于结合表达EGFRvⅢ的T细胞的药物中的应用；

A3、权利要求10至12中任一项所述的制备方法在制备用于结合表达EGFRvⅢ的T细胞的药物中的应用。

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