CN113150152A - 一种人源t细胞表面抑制性分子的特异性纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人源T细胞表面抑制性分子的特异性纳米抗体及其应用，通过深入研究肿瘤内T细胞表面的T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域蛋白3(TIM‑3)，采用噬菌体展示技术对TIM‑3纳米抗体进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体；得到了具有针对TIM‑3的抗人源纳米抗体，也称为R2G3。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的TIM‑3纳米抗体蛋白，开辟了靶向TIM‑3的纳米抗体的肿瘤T细胞激活剂的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。

Description

一种人源T细胞表面抑制性分子的特异性纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种抗人源T细胞表面抑制性分子(T cellimmunoglobulin domain and mucin domain-3，以下简称TIM-3)的特异性纳米抗体，该抗体与Tim3的氨基酸结合位点以及该抗体在制备靶向结合TIM-3阳性T细胞和重新激活T细胞的用途。
背景技术
以阻断免疫检查点受体为核心的肿瘤免疫治疗以其安全性和有效性的优势被认为是癌症治疗的新支柱。肿瘤免疫治疗的核心在于开发有效的抗体药物以阻断免疫检查点受体分子，恢复免疫系统对肿瘤的杀伤作用。继Ipilimumab和nivolumab(分别针对检查点细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和程序性死亡受体1(PD-1))临床验证有效后。陆续发现和鉴定了新的免疫检查点分子，其中包括T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)。TIM-3作为在细胞表面表达的免疫调节受体，属于TIM超家族。这些蛋白质具有一个共同的结构，由一个氨基末端免疫球蛋白可变结构域、一个粘蛋白柄、一个跨膜结构域和一个细胞质尾。TIM3由人类5q33.2染色体带上的HAVCR2基因编码，最初被鉴定为Th1细胞上的膜蛋白，能够调节巨噬细胞的活化。另外，研究表明许多其他细胞类型也表达TIM-3，包括CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞，髓细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞等。TIM-3靶点为肿瘤免疫治疗的有效靶点，其表达与肿瘤的不良预后有关，且与PD-1的耐药有关。抗TIM-3单抗可与CTLA-4、PD-1和PD-L1抗体共同使用发挥协同的作用，并且能够治疗PD-1和PD-L1耐药的患者。
其中TIM-3的配体包括Galectin-9，磷脂酰丝氨酸，高迁移率族蛋白1(HMBG1)，以及新发现的癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)。在多种疾病模型中已经证明TIM3-galectin9的相互作用能够抑制免疫反应。CEACAM-1被认为不仅和TIM-3的胞外可变结构域结合，而且与TIM3的胞内部分结合。如同PD1的配体PD-L1，CEACAM-1在一些实体肿瘤细胞表面高表达，这使得TIM3-CEACAM1作为免疫治疗的潜在阻断靶点。大量研究表明，TIM-3的表达与肿瘤免疫逃逸现象呈正相关，而在慢性感染和肿瘤模型中免疫衰竭的CD8+T细胞可通过抗TIM-3抗体重新激活。此外，阻断TIM-3还可以增加CD4+T细胞的数量和IFN-γ分泌。TIM-3主要在肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中表达，因此当它被用作免疫治疗靶点时可以减少对正常组织的损伤。
到目前为止，针对TIM3的一些抗体制剂已进入临床试验I/II阶段，包括单药治疗和与PD-1或淋巴细胞激活基因3(LAG-3)的联合阻断。纳米抗体源于骆驼属动物体内重链抗体，其结构只含有重链抗体的可变域(heavy-chain-only antibody,VHH)，是分子工程技术构建的临床诊断和治疗的新兴工具。纳米抗体具有各种优势特性，包括低免疫原性、高溶解度和稳定性、能够与隐藏的表位结合以及在大肠杆菌或酵母中高效表达，因此多种靶向检查点受体的纳米体已经被陆续开发和报道。
大量报道表明，TIM-3的表达与肿瘤免疫逃逸现象呈正相关，通过给予外源性抗TIM-3抗体，衰竭的CD8+T细胞可重新激活，CD4+T细胞的数量和IFN-γ分泌也显著上升，取得了良好的抗肿瘤效果。目前针对TIM-3的纳米抗体由Vida Homayouni等人和马琳琳等人分别在2016和2018年报道。然而他们公布的研究成果都缺乏对TIM-3特异性纳米体亲和力的详细评价和生物学效应的探究。因此，开发具有临床应用潜力的TIM-3纳米抗体有极大的现实意义和应用价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人源T细胞表面抑制性分子的特异性纳米抗体及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体，该特异性纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
该特异性纳米抗体的VHH链，包括四个框架区域(framework region，FR)和三个抗原互补决定区域(complementarity-determining region，CDR)。
其中，所述框架区FR1-FR4的氨基酸序列分别选自下组的SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。三个抗原互补决定区域(CDR1-CDR3)的氨基酸序列分别选自下组的SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7。
本发明公开了编码上述特异性纳米抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO:9所示。
本发明提供一种原核表达载体，它含有所示TIM-3纳米抗体VHH，SEQ ID NO：9的核苷酸序列。本发明提供了一种原核宿主细胞，它含有所述Tim3纳米抗体VHH的表达载体。
本发明还公开了上述抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体在结合前列腺癌中的作用，具体为抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体能够在体内检测结合前列腺癌样本中T细胞表面的TIM-3受体。
本发明还公开了上述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体在制备用于TIM-3受体拮抗剂中的用途。
本发明还公开了抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体在非疾病诊断治疗目的的免疫学检查分析中的应用，可以通过将抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体在制备吸附TIM-3蛋白的试剂中的使用。
进一步地，将本发明抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体制作成TIM-3免疫亲和柱，吸取或者富集TIM-3并或进而富集能与TIM-3结合的受体或者细胞。
更进一步地，还可以将本发明上述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体可以作为前体，进行随机、点突变或者双特异性抗体改造，获得亲和力，特异性或者靶向性更高的突变体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过深入研究肿瘤内T细胞表面的T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)，采用噬菌体展示技术对TIM-3纳米抗体进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体；得到了具有针对TIM-3的抗人源纳米抗体，也称为R2G3。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的TIM-3纳米抗体蛋白，开辟了靶向TIM-3的纳米抗体的肿瘤T细胞激活剂的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。
附图说明
图1为用ELISA方法评价免疫效果图；
图2为用PCR方法随机挑取20个菌落计算插入率；
图3为阳性克隆的PE-ELISA结果；
图4为验证纳米抗体大小和完整性实验结果；其中，A为SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果；B为Western Blotting鉴定纳米抗体完整性结果；
图5为纳米抗体亲和力鉴定；其中，A为全部5株纳米抗体结果；B为NbR2G3亲和力初步鉴定结果；
图6为纳米抗体亲和力初步鉴定；
图7为NbR2G3与前列腺癌组织中TILs结合结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明利用噬菌体展示技术，从羊驼免疫的单域重链抗体中筛选能与靶重组蛋白TIM-3特异性结合的纳米抗体克隆，以作为肿瘤T细胞激活剂。
通用TIM-3重组蛋白对羊驼进行免疫，分离血液中的白细胞，利用噬菌体展示技术，构建噬菌体展示文库，经过3次连续生物淘筛法获得与TIM-3蛋白结合的噬菌体，经测序后和生物比对后，用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)法筛选出抗TIM-3的高亲和力纳米抗体。
1.以人源TIM-3为抗原的纳米抗体文库的构建
1)羊驼免疫血清的抗体检测
向一只4岁的健康雌性羊驼每周皮下注射100μg纯化的人TIM-3蛋白和免疫佐剂共7次。在第一次注射前和最后一次注射后第7天从颈静脉采集外周血，分离获得血清，用ELISA方法比较抗体滴度。向96孔板包被100μg/mL的TIM-3蛋白，以PBS作为阴性对照。经洗板和封闭后，加入梯度稀释的免疫前和免疫后血清。以偶联HRP的山羊抗Llama抗体作为二抗，加入ABTS试剂进行反应。用酶标仪在405nm处测量吸光度值。结果参见图1，从图1中可以看出免疫后羊驼血清中靶向TIM-3的抗体水平显著高于免疫前，证明以TIM-3重组蛋白混合免疫佐剂皮下注射的方法能够成功诱导羊驼的体液免疫反应，对实验动物的免疫达到了预期目的，可以进行后续构建文库等工作。
2)噬菌体文库的构建
于最后一次免疫后7天，从羊驼颈静脉收集100mL外周血，用Sepmate管和Lymphoprep分离外周血单个核细胞。用Trizol试剂从PBMCs中提取总RNA，用Random引物和逆转录酶合成cDNA。
用下述引物进行巢式PCR扩增VHH基因：
CALL001(5‘-GTCCTGGCTGTTCTCTCTCTCCAAGG-3’)CALL002(5’-
GGTACTGCTGTTTGAACTGTCC-3’)
以1％琼脂糖凝胶电泳，用快速凝胶提取编码重链抗体的基因片段(700bp)。
然后用下述引物作为第二次PCR模板：
VHH-for(5’-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3’)
VHH-Back(5‘-GATGTGCA GCAGGA GTCT GGRGGAG-3’)
这对引物是为VHH的框架1和框架4区域设计的，包含PstI和Eco91I酶切位点。第二轮PCR产物经电泳回收，用PstI、XbaI和Eco91I限制性内切酶酶切噬菌体载体pMES4，用PstI和Eco91I酶切第二轮PCR产物。用T4 DNA连接酶连接经酶切的pMES4和PCR产物。将重组载体转染大肠杆菌TG1感受态细胞，并在含氨苄西林的LB琼脂平板上进行培养。
随机挑取20个菌落，用下述载体引物进行菌落PCR，计算插入率：
GIII(5‘-CCACAGACCCCTCATAG-3’)MP57(5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’)。
经转化的TG1由M13K07辅助噬菌体感染在噬菌体上展示VHH片段。感染的细菌在含氨苄西林和卡那霉素的培养基中培养过夜。培养基下离心后，将上清液与PEG6000/NaCl混合分离噬菌体，之后将噬菌体颗粒重悬在1mL冰冷PBS中。VHH库的规模达到3.7×108/mL。对20个随机挑选的菌落进行PCR筛选，结果表明，大多数克隆插入了VHH基因，计算插入率(90％)，结果参见图2，图2为琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物大小共1-20个菌落，左图为菌落1-10，右图为菌落11-20，条带分子量大小为700bp认定为插入了VHH片段的克隆，分子量大小400bp左右的条带认为转入了空质粒。M：DL2000核酸Marker。1-20为随机挑取的20个菌落。
2.纳米抗体筛选
1)生物淘筛
在包被100μL TIM-3蛋白的96孔板上进行三轮生物淘筛以富集特异性结合TIM-3的噬菌体。封闭后洗涤5次。将噬菌体文库加入抗原孔和阴性孔，室温孵育2h后用洗涤10-15次，用蛋白酶洗脱。分别取10μL从抗原孔和阴性孔中洗脱的噬菌体，梯度稀释并感染对数期大肠杆菌TG1，在含有氨苄西林的LB琼脂平板上划线。通过比较抗原孔和阴性孔噬菌体的效价，评价包含TIM-3特异性结合VHHs的噬菌体的富集情况。其余的噬菌体用于感染TG1并过夜培养，取菌液加入M13K07辅助噬菌体，重复上一节沉淀过程，将噬菌体亚文库扩增至后用于下一轮生物淘筛。经过三轮淘选，富集率达到3.8×103，如下表1所示：第三轮后抗原孔的滴度高于阴性孔1000倍以上，表明噬菌体文库中特异性结合TIM-3的部分已充分富集，满足筛选阳性克隆的条件。
表1：TIM-3抗原生物标记后噬菌体的富集
Figure BDA0003018903490000081
c.f.u:菌落形成单位。
2)细菌胞质提取物ELISA
在含有氨苄西林的LB琼脂平板上分别培养第二轮和第三轮噬菌体子文库感染的大肠杆菌TG1细胞。随机挑取第二轮亚文库66个菌落和第三轮亚文库132个菌落，在含氨苄西林的TB培养基中培养。以1M IPTG在28℃过夜诱导。通过TES溶液提取胞质蛋白，以鼠源抗HIS抗体作为一抗，偶联HRP的羊抗鼠抗体作为二抗，以TMB试剂显色。用抗TIM3抗体和偶联HRP的羊抗兔抗体作为阳性对照。以酶标仪检测吸光度值。将OD450的值比阴性孔的值高出三倍的克隆判定为阳性。将阳性克隆提取质粒进行测序，并按CDR3区进行分类。结果参见图3，结果表明，R2G3纳米抗体表现出比商业TIM-3抗体更高的信号。
3.纳米生物的表达、纯化以及鉴定
1)表达纯化
将TIM-3特异性纳米抗体序列插入pHEN6c质粒，转染大肠杆菌WK6细胞。以1L TB培养基中，1mM IPTG诱导并提取HIS标记的重组纳米抗体，然后用Ni-NTA柱和固定化金属亲和层析纯化，将纳米抗体由咪唑透析至PBS。
2)SDS-PAGE和Western-blot分析
将40μL纯化后的TIM-3纳米抗体加入10μL 5×loading buffer，100℃5min水浴。上样量为5uL至4％-15％的SDS-PAGE凝胶并电泳，用考马斯亮蓝染液染色2h。另将样本通过电转至硝化纤维素膜，封闭后以抗HIS抗体孵育过夜，以TBST洗涤10min 3次后以偶联HRP的抗鼠抗体孵育2h，洗涤后以ECL显色液显色，结果参见图4，图4中可清晰地表明只有一个15kDa大小的条带。具体地，可见5株纳米抗体条带均位于15kD附近，符合测序结果。WesternBlot使用Anti-HIS一抗，可见15kD附近清晰条带，表明5株抗体结构完整，纯化效果良好，标签未丢失。A.SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果，M为蛋白预染Marker；B.Western Blotting鉴定纳米抗体完整性，一抗使用兔源的Anti-HIS抗体，二抗使用偶联HRP的羊抗兔抗体。
3)亲和力测定
首先用ELISA方法测定TIM-3特异性纳米体的亲和力。以TIM-3重组蛋白或PBS包被96孔板，封闭后加入梯度稀释的纳米抗体，室温孵育1h。依次加入抗his抗体和偶联HRP的抗鼠抗体孵育1h，中间洗板5次。以TMB试剂显色后测量OD450，用Graphpad软件绘制组合曲线。结果如图5所示，以梯度稀释ELISA方法对5株抗体的亲和力进行初步鉴定，为选择高亲和力的纳米抗体，初筛时使用较小的浓度梯度，图5中A为全部5株纳米抗体结果，可见5株纳米抗体中R2G3和R3E2具有较高的亲和力，又以R2G3最为突出；B为NbR2G3亲和力初步鉴定结果，以GraphPad软件最小二乘法拟合计算纳米抗体R2G3的EC50＝76.02nM，EC50＝76.02nM。
4)NbR2G3结合特异性鉴定
包被96孔板并常规封闭，包被液为以PBS稀释的TIM-3、ACE2、PSMA、HER2、FBS蛋白以及PBS；以NbR2G3作为一抗，偶联HRP的Anti-HIS抗体作为二抗，以TMB显色液显色并以终止液终止；酶标仪读数并记录后，以GraphPad分析并绘图，鉴定NbR2G3结合TIM-3的特异性；结果如图6所示，按前述方法以ELISA检测NbR2G3与TIM-3的结合是否具有特异性，以ACE2、HER2、FBS和PSMA其它无关重组蛋白为例，可见NbR2G3对TIM-3结合具有高特异性，对其它人源化重组蛋白无显著结合。
5)免疫组化分析及H&E染色
按第一部分2.6所述的免疫组化方法进行切片准备，一抗使用NbR2G3,二抗使用兔源Anti-HIS抗体，三抗使用偶联Alexa Fluor 488羊抗兔抗体；封片前滴加含DAPI的抗荧光淬灭剂，在荧光显微镜下观察并拍照；以ImageJ软件进行荧光图像合成。结果参见图7，免疫荧光检验NbR2G3特异性结合前列腺癌和癌旁组织中肿瘤浸润淋巴细胞的能力，以纳米抗体通行对照NbBCII10作为阴性对照，在荧光显微镜下观察并拍照，以ImageJ进行荧光通道合成，结果显示NbR2G3与前列腺癌组织中的TIM-3能够特异性结合(图7中上部分绿色荧光)，前列腺癌组织不同结构的视野下，NbR2G3与阴性对照抗体BCII10的荧光照片(图7中下部分蓝色荧光)。
综上所述，本发明从实验动物羊驼的免疫开始，构建了大容量纳米抗体的噬菌体展示文库。以生物淘筛(bio-panning)方法经过3轮筛选后，获得5株产量良好且完整的抗TIM-3纳米抗体。经ELISA初步鉴定抗体结合活性，结果显示纳米抗体NbR2G3具有最高的结合活性。经大量表达及纯化、透析，我们得到了高亲和力的TIM-3纳米抗体NbR2G3，并通过免疫组化检测了其靶向前列腺癌组织中TILs的能力。结果表明NbR2G3的亲和力(KD)为76.02nM，且表现出了和商品化TIM-3抗体相近的靶向细胞表面TIM-3的能力，后续构建多种抗肿瘤靶向的双特异性纳米抗体打下了坚实基础，并为靶向TIM-3的肿瘤免疫治疗提供了候选抗体，对于揭示TIM-3的免疫激活机制同样有所帮助，具有较大的科学意义和临床应用价值。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 西安交通大学
<120> 一种人源T细胞表面抑制性分子的特异性纳米抗体及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Ala
35 40 45
Ala Ile Thr Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ala Ile Pro Glu Gly Leu Val Gly Arg Asn Leu Gly Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
115 120 125
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Arg Thr Ile Ser Asn Tyr Asn
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Ala Ala
1 5 10 15
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Thr Arg Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ala Ile Pro Glu Gly Leu Val Gly Arg Asn Leu Gly Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccatcagt aattataaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccaggaaagg aacgtgagtt tgtagcagct attacgagga gtggtggtag cacatactat 180
gcagactccg cgaagggccg attcaccatc tctagagaca acgccaagaa cacggtatat 240
ctacaaatga acagcctgaa acctgacgac acggccgttt attactgtaa tgctatcccc 300
gaaggattag taggtcgcaa cctgggctac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363

Claims (10)

1.一种抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体，其特征在于，该特异性纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体，其特征在于，该特异性纳米抗体的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：
4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；
3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQID NO：7所示。
3.如权利要求1所述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体，其特征在于，编码所述特异性纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
4.一种原核表达载体，其特征在于，含有权利要求3所述的编码所述特异性纳米抗体的核苷酸序列。
5.一种原核宿主细胞，其特征在于，含有权利要求4所述的原核表达载体。
6.一种突变体，其特征在于，是由权利要求1所述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体作为前体，经随机、点突变或者双特异性抗体改造获得的特异性或靶向性增强的突变体。
7.权利要求1～3中任意一项所述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体在制备人源T细胞表面抑制性分子TIM-3蛋白吸附剂中的应用。
8.权利要求1～3中任意一项所述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体在制备人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的受体拮抗剂的应用。
9.权利要求1～3中任意一项所述的抗人源T细胞表面抑制性分子TIM-3的特异性纳米抗体作为靶向TIM-3的纳米抗体肿瘤T细胞激活剂的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为前列腺癌。
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