JP6707660B2 - 抗ポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ2モノクローナル抗体とその生成方法及び使用 - Google Patents
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Description
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Ausubel 他,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates
the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego
Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998
METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGYと、Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999
4種類の等しい比率で混合した4株の胃癌細胞(BGC−823、MKN−28、MKN−45及びSGC−7901。いずれも中国科学院上海細胞生物学研究所製)を用い、10%FBSを含有するDMEM培地及び5%CO2、37℃環境で培養した後、収集した生細胞をPBS緩衝液内で混合して免疫原とした。続いて、これをA/J−JAXマウス(南京大学実験動物モデルセンターより購入。マウスは米国ジャクソン研究所由来)の背部皮下及び尾静脈に注射して免疫した。なお、毎回マウス1匹につき各部位3〜5百万の細胞(0.1ml)を注射した。免疫は隔週で実施された。3回目の免疫から1週間後にマウスの血清を抽出し、フローサイトメトリーハイスループットシステム(FACS−HTS)によって、血清と4種類の混合胃癌細胞株との反応状況を検出した(具体的には実施例3を参照)。また、健常人ボランティアのPBMCを対照細胞とした(健常人ボランティアの末梢血からフィコール液で末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)を分離し、蛍光フローサイトメトリーハイスループットスクリーニング(FACS−HTS)における健常人の細胞抗原として対照スクリーニングした)。そして、血清の力価が高く、且つ対照細胞PBMCとの交叉反応レベルが低いマウス(同じ希釈比率で、血清と胃癌細胞及び対照細胞との平均蛍光強度値の差>500)を選択し、融合前に免疫を強化した。
(1)4株の胃癌細胞の表面抗原との間に結合反応がある(即ち、アイソタイプ対照の信号ピークと比較して、サンプルの信号ピークのずれ幅が対数値1つ分よりも大きい)。
(2)PBMC細胞との間に結合反応がない(即ち、アイソタイプ対照の信号ピークと比較して、サンプルの信号ピークのずれ幅が5〜10%未満)。
このようにして選択及び採取された独特な結合を示すハイブリドーマのハイスループットスクリーニング細胞は、選択培地や一般的な10%FBSのDMEM培地、ハイブリドーマのサブクローニング及び複数回に渡る抗体ハイブリドーマの培養上清検出を経たものである。MS17−38モノクローナル抗体に対応するハイブリドーマの上清は、親和及び精製を経て0.2μm膜で濾過し、4℃で無菌保存した。或いは、50%グリセリンを添加して−20℃で長期保存した。
QIAGEN社(米国カリフォルニア州バレンシア)のRNeasy試薬キットを用いてMS17−38モノクローナル抗体のハイブリドーマ株からトータルRNAを抽出し、インビトロジェン社(米国ニューヨーク州グランドアイランド)のSuperScript III First−Strand試薬キットを用いてmRNAをMS17−38モノクローナル抗体のcDNAライブラリに逆転写した。次に、ドイツProgen Biotechnik社の「Mouse IgG Library Primer Set」(F2010)試薬キットに含まれる23個のプライマー及び実験方法を用い、21個の特定のプライマー対によるPCR反応を実施した(λL鎖の反応は含まない)。そして、発生した特異的なL鎖・H鎖の産物について、DNAシークエンシング、アミノ酸ポリペプチド配列の翻訳、及びCDRs(抗原決定基領域)とFW(足場領域)の識別を実施した。具体的な結果を以下に示す。
MS17−38モノクローナル抗体全長における真核発現ベクターの構築及びその発現細胞株の作製:
96ウェル「U」型プレート上で、1%BSA/PBSを用いて各ウェルにつき平均約20万個の異なる胃癌細胞(胃癌のSGC7901及びBGC823細胞株と、対照として健常人PBMC)/100μLとなるよう配合し、U型プレートに加えた。そして、胃癌生細胞で免疫した血清(実施例1で取得した免疫後のマウス血清)をそれぞれ5倍力価で段階希釈した後、各ウェルに100マイクロリットル(μL)ずつ加えて均一に混合し、氷上又は4℃下で20分間反応させた。そして、2回洗浄してから1:333で希釈したヤギ抗マウスIgGFc−FITCを100μL/ウェル加え、4℃で反応及び洗浄した後、BD社のLSR−II蛍光フローサイトメーター・HTS機で各ウェルの平均蛍光強度値(MFI)を読み取った。
親和及び精製したMS17−38モノクローナル抗体に対し実施例4の説明で述べたU型ウェルプレートによる細胞染色方法を適用し、4種類の免疫用胃癌細胞株を結合染色反応させてLSR−II FACSメーターでMFIを読み取った。なお、その他の実験手順については実施例4と同様とした。
親和及び精製したMS17−38モノクローナル抗体に対し実施例4の説明で述べたU型ウェルプレートによる細胞染色方法を適用し、健常人PBMC、胃癌細胞株MKN−28、GES−1、AGS−Nを結合染色反応させてLSR−II FACSメーターでFITC蛍光のMFI値を読み取った。
親和及び精製したMS17−38モノクローナル抗体を、それぞれ胃癌細胞株BGC823及び胃癌細胞株MKN−45の細胞膜抽出タンパク質(事前に米国Fisher Scientific社製のImmunlon−II 96−ウェルELISA反応プレートに充填)と酵素結合反応をさせ(例えばELISA等)、ELISAプレートリーダーにおいて450−nmの光学密度でOD値を読み取って作図した。
胃粘膜形質転換細胞GES−1及び胃癌細胞BGC823、MKN45をサイトスピン(Cytospin)してからMS17−38モノクローナル抗体と結合し、カタラーゼ染色反応させた結果、標的タンパク質がいずれも細胞膜表面に分布していることがわかった(拡大倍率は各40x)(免疫組織化学法)。また、胃粘膜形質転換細胞GES−1についてはサイトスピン(Cytospin)後に、培養上清液を親和及び精製して取得したMS17−38モノクローナル抗体と結合した。これをカタラーゼ染色反応させた結果、モノクローナル抗体が細胞膜表面の標的タンパク質に結合可能なことがわかった。
胃癌細胞株BGC823及びMKN45の細胞膜抽出タンパク質をMS17−38モノクローナル抗体との親和カラム(特に、結合するMS17−38モノクローナル抗体との親和精製カラム)で精製及び共免疫沈降(IP)した後、産物を分子量の異なる分子マーカーサンプルとともにそれぞれサンプル投入して電気泳動(SDS−PAGE)を実施した。電気泳動後にSDS−PAGEゲルをブロモフェノールブルー染色した結果、MS17−38モノクローナル抗体により精製された胃癌MKN45及びBGC823の細胞膜抽出タンパク質は抗原純度がたいへん高いことがわかった。また、抗原ストリップゲルをそれぞれ切り出すことで、更に抗原の質量分析を実施したいとの要求にも対応可能であった(図8は、MS17−38モノクローナル抗体によって胃癌BGC82及びMKN45の細胞膜抽出標的タンパク質に対し実施したSDS−PAGEゲルの精製ストリップを示す)。
実施例9で述べたように、間接免疫沈降法では、MS17−38モノクローナル抗体との親和カラムによって、結合する抗原を胃癌細胞(MKN45及びBGC823)の膜抽出タンパク質から精製し、抗体のFc末端がProtein−Aの磁気ビーズに特異的に結合して非特異的吸着タンパクが洗い流された後、SDS−PAGEにサンプルを投入し、緩衝液を加えて加熱解離した。一方、直接免疫沈降法では、MS17−38モノクローナル抗体を、米国インビトロジェン社(米国ニューヨーク州グランドアイランド)製の活性化したDynabeads磁気ビーズに直接連結し、それ以降の反応手順は間接免疫沈降法と同様とした。実践より、MS17−38モノクローナル抗体の免疫沈降法としては、直接法でなければ特異的且つ明瞭な標的ストリップを得られないことが証明された(図8参照)。その後、複数回の高感度質量分析によって、MS17−38モノクローナル抗体に対応する標的がPODXL−v2タンパク質であることが特定された(図9は、MS17−38モノクローナル抗体によって胃癌BGC82及びMKN45の細胞膜抽出標的タンパク質に対し実施した3度の質量分析の結果を示す)。
NCBIの大規模データベースのデータより、PODXLのいくつかのサブタイプのうち最長のアミノ酸配列における8−merのアミノ酸と6−merのアミノ酸を重複させ、マイクロマトリックスチップに積層した。次に、MS17−38モノクローナル抗体に蛍光標識したヤギ抗体を加えて間接的なハイブリダイゼーションを実施したところ、アミノ酸配列のうち221〜224と473〜477の2つセグメントにおいて強い蛍光結合強度が認められた。即ち、MS17−38モノクローナル抗体は、異性体PODXL−v2と結合することが示された(図10は、マイクロマトリックスチップに積載した6−mer及び8−merのアミノ酸をMS17−38モノクローナル抗体により分析したものである)。MS17−38モノクローナル抗体が異性体PODXL−v2と特異的に結合したのは、PODXL−v2のみが2つの空間立体構造の結合座位間に配列の欠損を有していたからである。このような2つの立体構造の座位が形成されるにはフォールディングが必要であり、PODXLとPODXL−v1にはMS17−38モノクローナル抗体とPODXL−v2との結合のような立体構造座位は形成され得ない(図11は、PODXL、PODXL−v1、PODXL−v2のアミノ酸配列における比較及びこれらの違いと、PODXL−v2における空間立体構造の座位のうちMS17−38モノクローナル抗体が具体的に結合する2つの座位を示している)。
MKN−45細胞の培養では、Ambion Lifetech社(現サーモフィッシャー・サイエンティフィック社)から購入した各25nM(ナノモル)の最終濃度のPODXL−v2(品番s10769)、FAM120B、Sec16A、SMARCC1及びブランク対照siRNAをそれぞれ添加した。そして、細胞に対しsiRNAをトランスフェクションすることで、最終的に各siRNAの標的タンパク質の発現が抑制された。次に、処理済みの細胞タンパク質を抽出し、それぞれSDS−PAGEにおいて各タンパク質ストリップを分離した。そして、MS17−38モノクローナル抗体とβ−Actin抗体(ウェスタンブロットの対照)を用いて特異的に反応させたところ、PODXL−v2とsiRNAで処理したMKN−45の細胞抽出タンパク質のみにおいて、MS17−38モノクローナル抗体と結合可能なPODXL−v2ストリップベルトが消失した。即ち、別の観点からもMS17−38モノクローナル抗体がPODXL−v2と特異的に反応することが証明された(図12は、MKN45細胞膜上でのPODXL−v2の発現をPODXL−v2とsiRNAが干渉することをウェスタンブロット試験により示したものである)。
Claims (14)
- 胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ2に対するモノクローナル抗体であって、
当該抗体のL鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2であり、当該抗体のH鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、SEQ ID NO:4であるモノクローナル抗体。 - 前記L鎖可変領域におけるコード配列は、SEQ ID NO:1であり、前記H鎖可変領域におけるコード配列は、SEQ ID NO:3であることを特徴とする請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体は、マウス由来であることを特徴とする請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体は、IgG1H鎖及びκL鎖のサブタイプの免疫グロブリンであることを特徴とする請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体におけるH鎖及びL鎖の可変領域をコードするDNA分子。
- 請求項5に記載のDNA分子を含む構造体。
- 請求項6に記載の構造体が宿主細胞にトランスフェクションされて構成されるモノクローナル抗体の発現系。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体の生成方法であって、
前記抗体の発現に適した条件で、請求項7に記載されたモノクローナル抗体の発現系を培養することで前記モノクローナル抗体を発現し、前記モノクローナル抗体を精製及び分離するステップを含む方法。 - 請求項1〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体の、腫瘍治療薬の生成又はスクリーニングにおける使用、或いは、腫瘍診断薬の生成における使用。
- 前記腫瘍が、胃癌であることを特徴とする請求項9に記載の使用。
- 前記胃癌が、胃扁平上皮癌、胃腺癌、胃小細胞癌、胃腺扁平上皮癌、胃カルチノイド、或いは、胃及び十二指腸癌であることを特徴とする請求項10に記載の使用。
- 治療有効投与量の、請求項1〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
- 1以上の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含むことを特徴とする請求項12に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む診断用試薬キット。
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