CN110092832A - 抗ox40抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗OX40的抗体。此外，本发明提供编码所述抗体的核酸序列，包含所述核酸序列的载体以及用所述载体转化或转染的宿主细胞。更进一步地，本发明提供所述抗体的制药用途。

Description

抗OX40抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及一种抗OX40抗体及其用途。
背景技术
OX40是1型跨膜糖蛋白，近30年前作为一个激活的T细胞表达的细胞表面抗原得到报道。自发现以来，它被证实是T细胞和肿瘤坏死因子受体家族成员的共刺激分子，也称为“肿瘤坏死因子受体超家族成员4”或CD134，基因的名称为TNFRSF4。
OX40的分子量为50kD，具有胞质尾、跨膜结构域和胞外区。目前OX40只有一个已知配体，即OX40L(CD252)，其表达在活化的APC细胞上，OX40与其配体的结合会共刺激T细胞增殖和细胞因子的产生。OX40对T细胞的刺激是通过胞浆内细胞信号传导实现的，如NF-κB以及T细胞活化核因子(NFAT)的激活，后者可以提高如survivin、细胞周期蛋白依赖性激酶、Bcl-2抗凋亡分子、细胞因子和细胞因子受体的表达。
OX40是长期T细胞免疫的共刺激分子，同时在CD4+T细胞应答和T细胞依赖B细胞增殖分化中起着积极的促进作用。发现OX40在小鼠T细胞表面的表达通常发生在同源抗原识别后的24小时和96小时之间。使用激活性的OX40抗体，直接促进了不同的效应T细胞亚群增加生存。
此外，OX40在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的表达已经有了不同深入的研究，如在乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、头颈部肿瘤中。另外发现OX40在结肠癌肿瘤组织中高表达，在肠系膜淋巴结或在浸润性边缘淋巴的OX40的表达与整体生存率相关。
正是因为OX40对T细胞具有激活作用，其涉及多种疾病，并可应用于肿瘤免疫治疗及器官移植的抗排异等多个领域。因此，共刺激分子OX40属于下一代目前在肿瘤学早期临床试验中检测的免疫治疗靶点。
目前国内外已有一些公司或者机构针对OX40开始了一些研究，包括开发针对该靶点的激动剂，例如小分子及生物大分子抗体的药物开发。几种OX40单克隆抗体目前正在进行早期癌症临床试验。但是，目前的数据显示，此类激动剂大都和OX40L有对OX40结合的竞争关系，因此在此类激动剂激活OX40的同时也失去了天然配体对OX40的激活作用。例如，国际上现有的OX40抗体大都与OX40L竞争性结合OX40，即抗体与OX40的结合位点和OX40L与OX40的结合位点有部分重合，所以当抗体作为激动剂激活了OX40及其下游信号通路时，却失去了OX40L作为天然配体也同时激活OX40的功能。
因此，本领域仍然存在对新型抗OX40抗体的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种新型抗OX40抗体，所述抗体对OX40具有高亲和力，能有效激活OX40蛋白及其下游的信号通路，同时所述抗体与OX40配体OX40L为非竞争结合关系，因此与OX40L具有协同激活作用，从而克服现有抗OX40抗体的不足。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种新型抗OX40抗体或其功能性片段，并基于该新型OX40抗体或片段，提供其用途。
本发明的技术方案如下：
本发明的发明人以OX40蛋白的胞外区与小鼠IgG2a FC标签构建的融合蛋白作为免疫原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术，筛选在分子水平和细胞水平上与OX40亲和力最好的杂交瘤细胞株，利用HT1080-OX40稳转细胞在亲和力高的细胞株里采用ELISA方法筛选激活功能最好的杂交瘤细胞株并测定抗体序列。
一方面，本发明提供一种能够特异性结合OX40的抗体，所述抗体与OX40的天然配体结合OX40的不同表位。换言之，本发明提供的抗体与OX40的天然配体OX40L没有与OX40结合的竞争关系，在结合、进而激活OX40时仍不影响天然配体对OX40的结合、激活作用。
检测本发明的抗体与OX40的结合，发现本发明的抗体以2-15nM、优选4-6nM的亲和力与OX40结合。所述亲和力通过本申请实施例9中所述的BIACORE实验测得。
所述抗体包含重(H)链和/或轻(L)链，其中：
所述重链在其重链可变区(VH)中包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，H-CDR1具有如SEQID NO：1、4、7或10所示的氨基酸序列，H-CDR2具有如SEQ ID NO：2、5、8或11所示的氨基酸序列，H-CDR3具有如SEQ ID NO：3、6、9或12所示的氨基酸序列；
和/或，
所述轻链在其轻链可变区(VL)中包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中L-CDR1具有如SEQ ID NO：13、16、19或22所示的氨基酸序列，L-CDR2具有如SEQ ID NO：14、17、20或23所示的氨基酸序列，L-CDR3具有如SEQ ID NO：15、18、21或24所示的氨基酸序列。
优选地，关于本发明的抗体：
所述重链在其重链可变区中包含选自以下的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的组合：
(1)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的H-CDR3；
(2)具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的H-CDR3；
(3)具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的H-CDR3；和
(4)具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的H-CDR3；
和/或
所述轻链在其轻链可变区中包含选自以下的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的组合：
(1)具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的L-CDR3；
(2)具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的L-CDR3；
(3)具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的L-CDR3；和
(4)具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的L-CDR3。
优选地，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：25、26、27或28所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：25、26、27或28所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
和/或
所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：29、30、31或32所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：29、30、31或32所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
更优选地，所述抗体包含选自以下的重链可变区和轻链可变区的组合：
(1)包含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
(2)包含如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
(3)包含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；以及
(4)包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
除了可变区之外，本发明的抗体在其重链中还包含小鼠源重链恒定区；和/或，在其轻链中还包含小鼠源轻链恒定区；
更优选地，所述抗体包含选自以下的重链和轻链的组合：
(1)包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；
(2)包含如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；
(3)包含如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；以及
(4)包含如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明的抗体是单克隆抗体、单链抗体、单域抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体；
更优选地，所述抗体是免疫球蛋白，优选为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更优选为IgG1；
具体地，所述抗体选自抗体I3E3、H1E6、161B3和H1K1。
另一方面，本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和/或轻链；
优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46、47或48所示的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，进而转化或转染宿主细胞。因此又一方面，本发明还提供一种载体，所述载体包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞，用于保存或抗体表达等目的。因此，还一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
本发明提供的抗体可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，可以先由本发明提供的核酸分子获得所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者获得所述抗体的重链和/或轻链，然后与所述抗体的任选其他结构域组装成抗体；或者，在允许本发明提供的宿主细胞表达所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区或者所述抗体的重链和/或轻链以组装成所述抗体的情况下，培养所述宿主细胞。任选地，所述方法还包括回收产生的抗体的步骤。
本发明提供的抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在药物组合物中，更特别地被包含在药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，在又一方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
再一方面，本发明还提供所述抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤。
另一方面，本发明还提供一种预防或治疗疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
并且，本发明还提供一种增强T细胞免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
其中，所述增强T细胞免疫应答包括增强T细胞的细胞因子产生；优选地，细胞因子包括IL-8和/或IFN-γ。
在本发明的上述方法中，还可以联合施用其他药物，例如所述方法还包括给受试者施用至少一种选自下述的药物：TLR9拮抗剂例如CpG、IDO1抑制剂、PD1、PDL1、CTLA4等抑制剂类药物，以及肿瘤疫苗类药物。
再一方面，本发明还提供所述抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于诊断疾病的试剂中的用途，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤。
另一方面，本发明还提供一种诊断疾病的方法，所述方法包括使本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物与来自受试者的样品相接触，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物。所述试剂盒可以用于治疗或诊断用途。
与现有技术相比，本发明提供了一种新型的能够特异性结合OX40的抗体。本发明的抗体如下进行筛选和制备：以OX40蛋白的胞外区与小鼠IgG2a FC标签构建的融合蛋白作为免疫原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术，筛选在分子水平和细胞水平上与OX40亲和力最好的杂交瘤细胞株，利用HT1080-OX40稳转细胞在亲和力高的细胞株里采用ELISA方法筛选激活功能最好的杂交瘤细胞株并测定抗体序列。最终，本发明筛选出具有出乎意料的高OX40亲和力和T细胞活化能力的抗体，例如抗体I3E3、H1E6、161B3和H1K1。
与现有抗OX40抗体相比，本发明的抗体具有以下特点：
本发明的抗OX40抗体对人源OX40蛋白具有高亲和力，能有效激活OX40蛋白及其下游的信号通路，同时本发明的抗OX40抗体与OX40L非竞争地结合，因此并不影响OX40与其配体OX40L的结合。因此，本发明的抗OX40抗体能够与OX40L协同激活OX40蛋白及其下游的信号通路，从而与下游蛋白TRAF2和TRAF5的相互作用而激活NF-K B，同时促进凋亡抑制剂BCL2和BCL21L1/BCL2-XL的表达，从而抑制T细胞凋亡，达到长期刺激T细胞免疫的功能。因此该OX40抗体能够运用于治疗肿瘤疾病药物的制备中。另外，本发明的抗OX40抗体还可作为诊断试剂，用于诊断涉及OX40蛋白表达的疾病。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了本发明的抗体与抗原OX40结合的ELISA检测结果。
图2显示了本发明的抗体与抗原OX40结合的FACS检测结果。
图3显示了本发明的抗体刺激OX40稳转细胞产生IL-8的ELISA检测结果。
图4显示了本发明的抗体与OX40L非竞争地结合OX40的FACS检测结果。
图5显示了本发明的抗体与抗原OX40结合的Biacore检测结果。
图6显示了本发明的抗体增强OKT3激活原代T细胞释放IFN-γ的检测结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1本发明杂交瘤细胞的制备
用包含OX40蛋白(来自Genbank登记号NM_003327.3)的胞外区(SEQ ID NO：49)与小鼠IgG2a-FC(来自Genbank登记号AAH31470.1)的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠，5只小鼠皮下免疫，5只小鼠肌肉免疫，佐剂采用quick antibody 5W水溶性佐剂，加强免疫以后2周测效价，选取效价高的两只小鼠进行免疫冲击，3天之后进行下文所述的细胞融合。
取准备融合的两只小鼠，取血清，然后解剖后，取脾脏，分离脾细胞，与培养的骨髓瘤细胞进行融合，铺96孔板，同时加入选择性培养基进行筛选，7天后换液，10天后进行ELISA检测，选择OD值大于阴性对照10倍以上的再进行流式细胞仪检测。
挑选双阳的细胞，通过细胞有限稀释法进行亚克隆铺板，挑选单克隆细胞。将挑选出的单克隆细胞，取培养上清，进行ELISA检测及流式细胞仪检测，挑选双阳的细胞扩大培养。
实施例2本发明杂交瘤细胞的培养上清与OX40结合的ELISA检测
用包含OX40蛋白(来自Genbank登记号NM_003327.3)的胞外区(SEQ ID NO：49)与人的IgG1-FC(来自Genbank登记号CAC20454.1)用包被液稀释至1-2μg/ml，然后以50-100μl/孔加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。每孔加入200μl封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时。用洗涤液洗3次，此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
向每孔中加入50-100μl待检杂交瘤细胞的培养上清，同时设立阳性对照(加入融合小鼠的血清)、阴性对照(加入正常小鼠的血清)和空白对照(加入培养基)。在37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。然后向每孔中加入酶标二抗，为1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(SIGMA，货号A9044-2ml)，每孔50-100μl，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。向每孔中加入新鲜配制的底物显色液TMB 50-100μl，37℃孵育10-30分钟。
加入2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
结果判定：以P/N＞2∶1(P代表阳性数值，N代表正常小鼠血清数值)为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
实施例3本发明杂交瘤细胞的培养上清与OX40结合的FACS检测
将OX40蛋白(来自Genbank登记号NM_003327.3)的胞外区(SEQ ID NO：49)构建到PLVX病毒包装载体(clontech，virus package mix，货号631275)，转染293T细胞包装病毒，用该病毒感染HEK293细胞，加药嘌呤霉素(puromycin)筛选得到耐药细胞株即稳定转染OX40的HEK293。然后将HEK293-OX40细胞在含2％FBS的PBS中制备成细胞浓度为107个细胞/ml的细胞悬液。
向每个流式管(样品管)中放入50μl细胞悬液，然后加入50μl待检杂交瘤细胞的培养上清，4℃孵育60分钟。向每个流式管中加入1ml的流式缓冲液，1200rpm下离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。同时设置对照管1(不加入培养上清和下文的二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入培养上清，仅加入细胞悬液和下文的二抗)。
然后向每个流式管中加入100μl流式缓冲液进行重悬，根据实验要求加入5μl PE标记的抗人Fc标签的二抗(Biolegend，货号409304)，4℃避光孵育30分钟，然后加入1ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。
再次向每个流式管中加入250μl流式缓冲液，重悬混匀，上机检测。
实施例4本发明杂交瘤细胞的培养上清刺激OX40稳转细胞产生IL-8的检测
用OX40蛋白(来自Genbank登记号NM_003327.3)的胞外区(SEQ ID NO：49)构建到PLVX病毒包装载体(clontech，virus package mix，货号631275)，转染293T细胞包装病毒，用该病毒感染HT1080细胞，加药嘌呤霉素(puromycin)筛选得到耐药细胞株即稳定转染OX40的HT1080。然后收集处于对数生长期的HT1080-OX40细胞，在补充10％FBS的1640培养基中制备成细胞浓度为1x106个细胞/ml的细胞悬液。
将100μl细胞悬液加入96孔板中，细胞培养箱中孵育过夜。然后弃去96孔板中的培养基，用PBS洗涤一次。加入50μl～100μl待检杂交瘤细胞的培养上清，培养箱中孵育6小时后收集上清。
用EILSA试剂盒检测上清中IL-8含量。基于检测到的IL-8含量，选择相应的单克隆细胞，提RNA，再反转录cDNA，连入测序载体中进行测序分析。示例性抗体示于下表1。
表1
对于测序得到的针对OX40靶点的抗体DNA序列，重新设计引物，合成基因，连入真核表达载体中，转化DH5a感受态细胞，37℃恒温培养箱培养过夜，挑单克隆菌株送公司测序鉴定。挑选序列正确的菌株，摇菌，大提质粒，转染哺乳动物表达细胞293F，置于37℃、5％CO2的培养箱中，表达培养7天。
收取表达上清，离心，过滤，选择protein G亲和层析柱，进行纯化，纯化的抗体通过SDS-PAGE电泳检测纯度，用BCA蛋白检测试剂盒检测抗体浓度，分装，保存于-80℃冰箱中备用。
实施例5本发明的抗体与OX40结合的ELISA检测
实验过程参照实施例2，不同之处在于，向包被板的每孔中加入待检抗体、阳性参考抗体(Ref；Genetech，1A7抗体，参见US2015/307617A1)，和阴性参考抗体(hIgG1)，浓度参见图1。
实验结果见图1。
实施例6本发明的抗体与OX40结合的FACS检测
实验过程参照实施例3，不同之处在于，向每个流式管中放入50μl细胞悬液之后，加入待检抗体、阳性参考抗体(Ref；Genetech，1A7抗体，参见US2015/307617A1)，和阴性参考抗体(hIgG1)，浓度参见图2。同时设置对照管1(不加入抗体和下文的二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体，仅加入细胞悬液和下文的二抗)。
实验结果见图2。
实施例7本发明的抗体刺激OX40稳转细胞产生IL-8的检测
实验过程参照实施例4，不同之处在于，向96孔板的每孔中加入待检抗体、阳性参考抗体(Ref；Genetech，1A7抗体，参见US2015/307617A1)，和阴性参考抗体(hIgG1)，浓度参见图3。
实验结果见图3。
实施例8本发明的抗体与OX40L非竞争关系的FACS检测
将HEK293-OX40细胞在含2％FBS的PBS中制备成细胞浓度为107个细胞/ml的细胞悬液。
向每个流式管(样品管)中放入50μl细胞悬液，然后加入OX40L-hFC融合蛋白(SinoBiological Inc，货号13127-H01H-50)和不同的20μg/ml本发明的抗体或阳性参考抗体(Ref；Genetech，1A7抗体，参见US2015/307617A1)，4℃孵育60分钟。向每个流式管中加入1ml的流式缓冲液，1200rpm下离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。同时设置对照管1(不加入抗体、融合蛋白和下文的二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体和融合蛋白，仅加入细胞悬液和下文的二抗)。
然后向每个流式管中加入100μl流式缓冲液进行重悬，根据实验要求加入5μl PE标记的抗人Fc二抗(Biolegend，货号：409304)，4℃避光孵育30分钟，然后加入1ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。
再次向每个流式管中加入250μl流式缓冲液，重悬混匀，上机检测。
实验结果见图4。结果表明，抗体I3E3、H1E6、161B3和H1K1在5μg/ml的浓度下均与OX40L同时结合OX40，由此证明抗体I3E3、H1E6、161B3和H1K1与OX40L均非竞争地结合OX40。
实施例9本发明表达纯化后的抗体与OX40结合的亲和力检测
将实施例1中的融合蛋白在PBS缓冲溶液中制备成最高浓度为30nM的溶液，并3倍稀释为6个浓度并设0浓度对照。将本发明的抗体在PBS中制备为20nM的溶液。
用Biacore T200测定抗体抗原的亲和力。使用CM5芯片捕获本发明的抗体之后，将抗原OX40小鼠IgG2a Fc标签蛋白流过芯片，具体条件为：流速30μl/min；抗原抗体结合时间200秒，解离时间500秒。测得的结果用仪器专用配套软件拟合，以分析抗体与抗原的亲和力。
实验结果见图5。结果表明，I3E3的KD值为4.4nM，H1K1的KD值为11nM，H1E6的KD值为5.1nM。
实施例10本发明的抗体增强OKT3激活原代T细胞释放IFN-γ的检测
采用常规方法制备PMBC，然后在RPMI-1640培养基中制备成细胞浓度为5x107个细胞/mL的细胞悬液，取2ml置于5ml流式管中。然后向每ml细胞悬液中加入50μl CD4+T细胞富集混合物(Cell Enrichment Cocktail)，混匀置于室温孵育10分钟。
每ml细胞悬液中加入100μl EasySepTM D磁珠，混匀，置于室温孵育5分钟。然后补加RPMI-1640培养基至总体积2.5ml，混匀，然后将流式管置于磁铁中5分钟。颠倒磁铁和流式管，将混合物导入新的5ml流式管中。对于待分离的CD4+T细胞，按照2X106个细胞/ml的浓度加入5μg/ml PHA及20U/ml IL2，激活48小时。
用1μg/ml抗小鼠FC抗体(SIGMA，货号M3534)包被96孔板12小时。然后每孔加入105个/40μl上文激活的CD4+T细胞，再加入10μl 10μg/ml OKT3抗体。
之后，以20μg/ml起始以10X梯度在PBS中稀释待检抗体、阳性参考抗体(Ref；Genetech，1A7抗体，参见US2015/307617A1)和阴性参考抗体(hIgG1)，加入50μl抗体稀释液，混匀，继续培养72小时。收集上清，用INF-gamma ELISA试剂盒检测抗体对T细胞的激活作用。
实验结果见图6。结果表明，抗体I3E3、H1E6、161B3和H1K1在不同浓度下均可刺激产生IFN-γ，在2μg/ml浓度左右达到最大刺激。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (15)

1.一种能够特异性结合OX40的抗体，所述抗体与OX40的天然配体结合OX40的不同表位。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体以2-15nM、优选4-6nM的亲和力与OX40结合。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含重链和/或轻链，其中：
所述重链在其重链可变区中包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，H-CDR1具有如SEQ ID NO：1、4、7或10所示的氨基酸序列，H-CDR2具有如SEQ ID NO：2、5、8或11所示的氨基酸序列，H-CDR3具有如SEQ ID NO：3、6、9或12所示的氨基酸序列；
和/或，
所述轻链在其轻链可变区中包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中L-CDR1具有如SEQ IDNO：13、16、19或22所示的氨基酸序列，L-CDR2具有如SEQ ID NO：14、17、20或23所示的氨基酸序列，L-CDR3具有如SEQ ID NO：15、18、21或24所示的氨基酸序列；
优选地，
所述重链在其重链可变区中包含选自以下的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的组合：
(1)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的H-CDR3；
(2)具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的H-CDR3；
(3)具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的H-CDR3；和
(4)具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的H-CDR1、具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的H-CDR2和具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的H-CDR3；
和/或
所述轻链在其轻链可变区中包含选自以下的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的组合：
(1)具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的L-CDR3；
(2)具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的L-CDR3；
(3)具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的L-CDR3；和
(4)具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的L-CDR3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区包含如SEQID NO：25、26、27或28所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：25、26、27或28所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
和/或
所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：29、30、31或32所示的氨基酸序列或者包含与如SEQID NO：29、30、31或32所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述抗体包含选自以下的重链可变区和轻链可变区的组合：
(1)包含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有75％、优选80％、更优选85％、进一步优选至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
(2)包含如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
(3)包含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；以及
(4)包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
更优选地，所述抗体在其重链中还包含小鼠源重链恒定区；和/或，在其轻链中还包含小鼠源轻链恒定区；
进一步优选地，所述抗体包含选自以下的重链和轻链的组合：
(1)包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；
(2)包含如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；
(3)包含如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；以及
(4)包含如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体、单链抗体、单域抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体；
优选地，所述抗体是嵌合抗体；更优选地，所述抗体是免疫球蛋白，优选为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更优选为IgG1；
进一步优选地，所述抗体选自抗体I3E3、H1E6、161B3和H1K1。
6.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1至5中任一项所述抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和/或轻链；
优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46、47或48所示的核苷酸序列。
7.一种载体，所述载体包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体，或者所述宿主细胞被权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体转化或转染。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体和/或权利要求8所述的宿主细胞，以及任选的药学上可接受的载体。
10.权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤。
11.一种预防或治疗疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的药物组合物，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
12.一种增强T细胞免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的药物组合物；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人；
优选地，所述增强T细胞免疫应答包括增强T细胞的细胞因子产生；更优选地，细胞因子包括IL-8和/或IFN-γ。
13.权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的药物组合物在制备用于诊断疾病的试剂中的用途，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤。
14.一种诊断疾病的方法，所述方法包括使权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的药物组合物与来自受试者的样品相接触，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
15.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的药物组合物。
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