CN107074953A - 人源化抗ox40抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露提供人源化抗OX40抗体。还提供制备此类抗体的方法，以及例如治疗癌症的使用方法。

Description

人源化抗OX40抗体及其用途
背景
OX40(CD134；TNFRSF4)是主要存在于活化的CD4+和CD8+T细胞、调控性T(Treg)细胞和自然杀伤(NK)细胞上的肿瘤坏死因子受体(克罗夫特(Croft)等人，2009，免疫学评论(Immunol Rev)，229：173-91)。OX40具有一种已知的内源性配体，OX40配体(OX40L；CD152；TNFSF4)，其以三聚体形式存在并且可聚集OX40，从而产生T细胞内的有效细胞信号传导事件。同前。在活化的CD4+和CD8+T细胞上通过OX40信号传导导致增强的细胞因子产生、颗粒酶和穿孔素释放、以及效应和记忆T细胞池的扩增(延森(Jensen)等人，2010，肿瘤学研讨会(Semin Oncol)，37：524-32)。此外，Treg细胞上的OX40信号传导抑制Treg的扩增，停止Treg的诱导并且阻断Treg抑制功能(邬(Voo)等人，2013，免疫学杂志(J Immunol.)191:3641-50；乌(Vu)等人，2007，血液(Blood.)110:2501-10)。
免疫组织化学研究和早期流式细胞术分析显示，OX40在浸润广泛人癌症的T细胞上表达(巴鲁(Baruah)等人，2011，免疫生物学(Immunobiology)217:668-675；科蒂(Curti)等人，2013，癌症研究(Cancer Res.)73:7189-98；拉达尔(Ladanyi)等人，2004，临床癌症研究(Clin Cancer Res.)10:521-30；佩蒂(Petty)等人，2002，美国外科学杂志(Am J Surg.)183:512-8；拉姆斯塔德(Ramstad)等人，2000，美国外科学杂志179:400-6；萨夫(Sarff)等人，2008，美国外科学杂志195:621-5；讨论625；韦托(Vetto)等人，1997，美国外科学杂志174:258-65)。虽然不希望受理论束缚，肿瘤浸润淋巴细胞上的OX40表达与几种人癌症中更长的存活相关，从而表明OX40信号可在建立抗肿瘤免疫应答中发挥作用(拉达尔等人，2004，临床癌症研究10:521-30；佩蒂等人，2002，美国外科学杂志183:512-8)。
在各种非临床小鼠肿瘤模型中，OX40的激动剂(包括抗体和OX40配体融合蛋白)已成功使用，具有有希望的结果(卡吉尔加德(Kjaergaard)等人，2000，癌症研究60:5514-21；德洛夫(Ndhlovu)等人，2001，免疫学杂志(J Immunol.)167:2991-9；温伯格(Weinberg)等人，2000，免疫学杂志164:2160-9)。共刺激T细胞通过OX40促进抗肿瘤活性在一些情况下是持久的，从而针对随后的肿瘤激发提供持久的保护(温伯格等人，2000，免疫学杂志164:2160-9)。Treg细胞抑制和效应T细胞的共刺激被证明对于OX40激动剂的肿瘤生长抑制是必要的(皮克内塞(Piconese)等人，2008，实验医学杂志(J Exp Med)205:825-39)。已经探索了许多策略和技术，以通过与疫苗、化学疗法、放射疗法和免疫疗法组合来增强OX40激动剂治疗的抗肿瘤作用(延森等人，2010，肿瘤学研讨会37:524-32；梅来罗(Melero)等人，2013，临床癌症研究19:997-1008)。
概述
本披露提供结合OX40(例如，人OX40)的抗体。在某些方面中，所提供的抗体是人源化抗体。例如，本披露提供一种包含人源化重链可变区(VH)和人源化轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含具有下式的氨基酸序列：
HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，
其中HFW1是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，HCDR1是SEQ ID NO:8，HFW2是SEQ ID NO:9(WIRX39HPGKGLEX47X48G；其中X39是Q或K，X47是W或Y，并且X48是I或M)，HCDR2是SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，HFW3是SEQ ID NO:17(RITINX71DTSKNQX78SLQLNSVTPEDTAVYX91CAR；其中X71是P或R，X78是F或Y，并且X91是Y或F，HCDR3是SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27)，并且HFW4是SEQ ID NO:28，其中该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32；并且其中该抗体或其片段可特异性地结合人OX40。在某些方面中，HFW2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:1，并且在某些方面HFW3的氨基酸序列是SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段的VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:67。在某些方面中，所提供的抗体或其片段的VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，并且该VH包含氨基酸序列SEQ IDNO:59。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段还包含与VL的C末端融合的一个轻链恒定区或其片段，例如人κ恒定区或人λ恒定区。在某些方面中，所提供的抗体或其片段还包含与VH的C末端融合的一个重链恒定区或其片段，例如人IgG1恒定区、人IgG4P恒定区、人IgG1TM恒定区或鼠IgG1恒定区。在某些方面中，该重链恒定区是人IgG1恒定区。在某些方面中，所提供的抗体或其片段包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:71和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:30。如本披露提供的抗体的抗原结合片段可以是，例如Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段或sc(Fv)2片段或其任何组合。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段可特异性地结合人、食蟹猴或恒河猴OX40，例如，可特异性地结合如在Jurkat细胞、来自人、食蟹猴、恒河猴或其任何组合的初级活化的CD4+或CD8+T细胞上表达的OX40。在某些方面中，所提供的抗体或其片段不结合鼠或大鼠OX40。在某些方面中，所提供的抗体或其片段不与相关TNFRSF蛋白交叉反应。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段可对在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40具有约250pM至约370pM，例如约312pM的结合亲和力，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，所提供的抗体或其片段可以在约63至约93pM处实现在初级活化的人CD4+T细胞上20％受体占有率(EC20)，在约250至约370pM处实现在初级活化的人CD4+T细胞上50％受体占有率(EC50)，并且在约2290至约3330pM处实现在初级活化的人CD4+T细胞上90％受体占有率(EC90)，如通过流式细胞术所测量。例如，在某些方面中，EC20是约78pM，EC50是约312pM，并且EC90是约2810pM。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段可以对在过度表达OX40的Jurkat细胞上表达的人OX40具有约250pM至约600pM，例如约424pM的结合亲和力，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，所提供的抗体或其片段在过度表达OX40的Jurkat细胞上可在约60至约150pM处实现EC20，在过度表达OX40的Jurkat细胞上在约250至约600pM处实现EC50，并且在过度表达OX40的Jurkat细胞上在约2260至约4380pM处实现EC90，如通过流式细胞术所测量。例如，在某些方面中，EC20是约106pM，EC50是约424pM，并且EC90是约3820pM。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段可对在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的食蟹猴OX40具有约340pM至约820pM，例如约580pM的结合亲和力，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，所提供的抗体或其片段可对在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40具有约130pM至约600pM，例如约370pM的结合亲和力，如通过流式细胞术所测量。
在某些方面中，在基于平板的测定中，所提供的抗体或其片段可诱导活化的CD4+T细胞的剂量依赖性增殖和初级活化的CD4+T细胞中的剂量依赖性细胞因子释放。例如，在某些方面中，可在初级活化的人CD4+T细胞中在约14pM至约28pM的抗体浓度处实现20％最大增殖应答(EC20)，可在初级活化的人CD4+T细胞中在约0.3pM至约130pM的抗体浓度处实现50％最大增殖应答(EC50)，并且可在初级活化的人CD4+T细胞中在约50pM至约90pM的抗体浓度处实现90％最大增殖应答(EC90)，所有如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，EC20是约21pM，EC50是约28pM，并且EC90是约72pM。初级活化的人CD4+T细胞中释放的细胞因子可以是但不限于IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β或其任何组合中的一种、两种、三种或更多种，例如IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-13或其任何组合。在某些方面中，所提供的抗体或其片段可在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞中和在初级活化的恒河猴CD4+T细胞中实现CD4+T细胞增殖和细胞因子释放。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段可在表达FcγR的细胞存在下活化表达OX40的T细胞中的NFκB途径。例如，表达OX40的T细胞可以是过度表达OX40的Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞，该Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞响应于NFκB信号传导途径的刺激产生荧光素酶。在某些方面中，所提供的抗体或其片段可触发针对表达OX40的细胞的补体依赖性或抗体依赖性细胞毒性。在某些方面中，所提供的抗体或其片段可结合人C1q并触发针对表达OX40的细胞的NK介导的抗体依赖性细胞毒性。
在某些方面中，向需要癌症治疗的受试者给予有效剂量的所提供的抗体或其片段可抑制该受试者的肿瘤生长。例如，可在T细胞存在下实现肿瘤生长抑制。在某些方面中，与给予同种型匹配的对照抗体或其片段相比，肿瘤生长被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％和至少50％、至少60％、或至少70％。
本披露进一步提供一种包含如上所述的抗体或其片段和一种载体的组合物。
本披露进一步提供一种包含核酸的多核苷酸，该核酸编码所提供的抗体或其片段或编码所提供的抗体或其片段的多肽亚基。在某些方面，所提供的多核苷酸包含SEQ IDNO:60的核酸、SEQ ID NO:31的核酸、SEQ ID NO:72的核酸或其任何组合。本披露进一步提供一种包含所提供的多核苷酸的载体，和一种包含所提供的多核苷酸或所提供的载体的宿主细胞。在另一方面中，本披露提供一种产生抗体或其片段的方法，其中该方法包括在表达由多核苷酸编码的抗体或其片段的条件下培养所提供的宿主细胞，并且回收该抗体或其片段。
在另外的方面中，本披露提供一种促进活化的T细胞存活或增殖的方法，其中该方法包括使活化的T细胞与所提供的抗体或其片段相接触，并且其中该抗体或其片段可特异性地结合这些T细胞表面上的OX40。
在另外的方面中，本披露提供一种诱导从活化的T细胞释放细胞因子的方法，其中该方法包括使活化的T细胞与所提供的抗体或其片段相接触，并且其中该抗体或其片段可特异性地结合这些T细胞表面上的OX40。在某些方面中，释放的细胞因子可以是但不限于IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β或其任何组合中的一种、两种、三种或更多种，例如IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-13、或其任何组合。在某些方面中，活化的T细胞是活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、或其组合。在某些方面中，活化的CD4+T细胞是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、恒河猴CD4+T细胞、或其组合。
在另外的方面中，本披露提供一种促进T细胞活化的方法，其中该方法包括使T细胞与所提供的抗体或其片段相接触，其中该抗体或其片段可特异性结合这些T细胞表面上的OX40。在某些方面中，T细胞活化可通过NFκB信号转导途径的刺激进行测量。在某些方面中，T细胞是活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、或其组合。在某些方面中，活化的CD4+T细胞是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、恒河猴CD4+T细胞、或其组合。在某些方面中，接触包括向受试者给予有效量的抗体或其片段。
在另外的方面中，本披露提供一种治疗受试者的癌症的方法，其中该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的所提供的抗体或其片段或所提供的组合物。在某些方面中，该癌症是实体瘤。在某些方面中，给予该抗体或其片段或组合物可抑制肿瘤生长、可促进肿瘤缩小、或两者。在某些方面中，在T细胞存在下实现肿瘤生长抑制。
在另外的方面中，本披露提供一种增强受试者的免疫应答的方法，其中该方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的所提供的抗体或其片段或所提供的组合物。
在本披露提供的治疗方法中，待治疗的受试者可以是人受试者。
在某些方面中，所提供的抗体或其片段可结合位于SEQ ID NO:91的氨基酸108至146内的人OX40的表位。在某些方面中，该表位至少包含SEQ ID NO:91的氨基酸亮氨酸116(L116)和丙氨酸126(A126)。在某些方面中，所提供的抗体或其片段可与具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的小鼠OX40变体结合，除了Q113L突变和V124A突变。
本披露进一步提供一种由100个或更少氨基酸组成的分离的肽，其中该肽可由所提供的抗体或其片段特异性地结合。在某些方面中，该肽包含SEQ ID NO:91的氨基酸116至126。在某些方面中，该肽包含SEQ ID NO:91的氨基酸108至146，除了在除L116和A126之外的任何位置处的一个、两个、三个、四个、五个或六个单个氨基酸取代、缺失或插入。
附图/图简要说明
图1.人源化9B12VH区域中的突变：根据Kabat编号，克隆别名中的数字表示VH中氨基酸的位置。Mab 1、2、5和8是与人源化VL配对的VH嵌合变体。Mab 10-17是具有小鼠回复突变的人源化VH变体。Mab 18-27是被工程化以用于除去潜在序列负荷的变体。将Mab24和mAb27的可变区接枝到不同的重链恒定区上，以获得分别称为mAb28-30和mAb31-32、mAb37的所得同种型变体。
图2A-图2D.OX40mAb24和9B12与在初级活化的人CD4+T细胞表面上表达的OX40的结合。MFI＝与OX40mAb24(2A-2B)结合的647标记的第二抗人抗体或与原代人CD4+T细胞上的9B12(2C-2D)结合的488标记的抗小鼠第二抗体的平均荧光强度。
图3A-图3F.OX40mAb24和9B12与Jurkat T细胞上表达的人OX40的结合。MFI＝与OX40mAb24(3A-3C)结合的647标记的第二抗人抗体或与Jurkat T细胞上的9B12(3D-3F)结合的488标记的抗小鼠第二抗体的平均荧光强度。
图4A-图4B.OX40mAb24与表达TNFRSF的HEK293细胞和表达OX40的Jurkat T细胞的结合。(4A)在HEK293细胞中TNFRSF成员的瞬时表达(如直方图的左侧所指示)，以及与TNFRSF-特异性mAb或与OX40mAb24结合(如直方图上方所指示)。灰度直方图，TNFRSF特异性mAb的荧光染料轭合的同种型对照抗体结合，或OX40mAb24的山羊抗人647第二抗体结合对照；开放直方图，TNFRSF特异性mAb或OX40mAb24结合。(4B)：OX40mAb24与作为阳性对照的表达OX40的Jurkat的结合。灰度直方图，山羊抗人647第二抗体结合对照；开放直方图，OX40mAb24结合。
图5A-图5B.通过ELISA，OX40mAb24(OX40mAb29)(互补决定区)CDR和9B12与重组人TNFRSF成员的结合。通过OX40mAb29(5A)和9B12(5B)展示OX40的特异性结合的ELISA测定的结果。OX40mAb29包含OX40mAb24的CDR。将OX40的抗体结合与其他人TNFRSF蛋白的结合进行比较。
图6.OX40mAb24平板结合生物活性测定的示意图。￥＝抗人CD3抗体克隆OKT3。
图7A-图7C.响应于OX40mAb24和9B12的人CD4+T细胞增殖。(7A)由平板固定的OX40mAb24与亚有丝分裂TCR刺激(抗CD3)的组合介导的四个独立供体的CD4 T细胞增殖。将数据点标准化至原始数据曲线的下限渐近值，之后图形化以增强每个响应的动态范围的可视化。(7B)来自供体651的代表性原始数据，其证明由OX40mAb24加上亚有丝分裂TCR刺激(抗CD3)驱动的增殖以及由R347人IgG1对照mAb、在伴随TCR信号传导存在或不存在下的可溶性OX40mAb24、无OX40mAb24的单独抗CD3单克隆抗体、以及在抗CD3mAb不存在下平板固定的OX40mAb24介导的增殖的相对缺乏。(7C)由平板固定的9B12与亚有丝分裂TCR刺激的组合介导的四个独立供体的CD4 T细胞增殖。符号，平均值；误差条，平均值的标准偏差；n＝全部与抗CD3组合的OX40mAb24、R347人IgG1对照mAb和9B12的3次技术重复；n＝可溶性OX40mAb24和在OX40mAb24不存在下的CD3、无抗CD3的平板结合的OX40mAb24以及无抗CD3的可溶性OX40mAb24的2次技术重复。
图8A-图8E.响应于OX40mAb24的人CD4+T细胞细胞因子释放。代表性OX40mAb24诱导供体651的人CD4 T细胞细胞因子释放，包括(8A)IFNγ，(8B)TNFα，(8C)IL-10，(8D)IL-13，以及(8E)IL-5。符号，平均值；误差条，平均值的标准偏差；n＝OX40mAb24和R347人IgG1对照mAb(两者均与抗CD3组合)的3次技术重复；n＝可溶性OX40mAb24、无抗CD3的可溶性OX40mAb24和在OX40mAb24不存在下抗CD3的2次技术重复。
图9A-图9E.响应于9B12的人CD4+T细胞细胞因子释放。代表性9B12诱导供体651的人CD4 T细胞细胞因子释放，包括(9A)IFNγ，(9B)TNFα，(9C)IL-10，(9D)IL-13，以及(9E)IL-5。符号，平均值；误差条，平均值的标准偏差；n＝9B12和小鼠IgG1对照mAb(两者均与抗CD3组合)的3次技术重复；n＝可溶性9B12、无抗CD3的可溶性9B12和在9B12不存在下抗CD3的2次技术重复。
图10是说明用于测量OX40mAb24和9B12生物活性的细胞系统的示意图。通过表达FcγR的细胞进行的OX40mAb24交联介导表达OX40的Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞系的细胞表面上OX40的聚集和活化，从而导致NFκB介导的荧光素酶的产生，其可被测量为OX40活化的替代物。FcγR＝片段可结晶γ受体；NFκB＝核因子κB。
图11A-图11D.在有或无通过FcγR交联的情况下OX40mAb24在表达OX40的JurkatNFκB报告细胞中的生物活性。在2-细胞生物测定中通过在Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞系的细胞表面上表达的人OX40，OX40mAb24诱导的信号传导的浓度依赖性活性(RLU)。在通过(11A)表达CD32A的HEK293细胞和HEK293亲本细胞(HEK)交联之后或在(11B)表达CD32B的HEK293细胞、(11C)Raji B细胞或(11D)从原发性肺肿瘤分离的的CD45+细胞存在下OX40mAb24的报告活性。数据代表在表5-2中发现的其他结果。mAb＝单克隆抗体，RLU＝相对光单位。
图12A-图12D.在2-细胞生物活性测定中，使用通过不同细胞类型的FcγR交联，9B12在表达OX40的Jurkat NFκB报告细胞中的生物活性。在2-细胞生物测定中通过在Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞系的细胞表面上表达的人OX40，9B12诱导的信号传导的浓度依赖性活性(RLU)。在通过(12A)表达CD32A的HEK293细胞、(12B)表达CD32B的HEK293细胞、(12C)Raji B细胞或(12D)从原发性肺肿瘤分离的CD45+细胞交联9B12后的报告活性。数据代表在表5-3中发现的其他结果。mAb＝单克隆抗体；RLU＝相对光单位。
图13A-图13B.OX40mAb24，实验1的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞毒性。(13A)使用10μ/mL的9B12、OX40mAb24、或OX40mAb24的IgG1三重突变体(mAb29)型式或人IgG4P(mAb28)型式，通过来自同种异体(左)或自体(右)NK和CD4+T细胞供体对的人NK细胞特异性杀伤表达OX40的活化CD4+T细胞。(13B)在利妥昔单抗而不是R347人IgG1同种型对照抗体存在下，通过来自供体350和351的NK细胞溶解Toledo B细胞。技术重复重复进行三次。误差条代表平均值的标准误差。ADCC＝抗体-药物依赖性细胞毒性；mAb＝单克隆抗体；NK＝自然杀伤。
图14A-图14B.OX40mAb24，实验2的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞毒性。(14A)使用10μ/mL的对照R347人IgG1、9B12、OX40mAb24、或OX40mAb24的人IgG4P(mAb28)型式或IgG1三重突变体(mAb29)型式，通过来自同种异体(左)或自体(右)NK和CD4 T细胞供体对的人NK细胞特异性杀伤表达OX40的活化CD4 T细胞。(14B)在利妥昔单抗而不是R347人IgG1同种型对照抗体存在下，通过来自供体558和589的NK细胞溶解Toledo B细胞。技术重复重复进行三次。误差条代表平均值的标准误差。ADCC＝抗体-药物依赖性细胞毒性；mAb＝单克隆抗体；NK＝自然杀伤。
图15A-图15D.OX40mAb24和9B12，实验3的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞毒性的评估。(15A-15B)使用来自如所指示的两个单独供体的原代人NK细胞，由OX40mAb24而不是9B12介导的表达OX40的人CD4 T细胞的特异性杀伤。(15C-15D)在利妥昔单抗而不是R347人IgG1同种型对照抗体存在下，通过来自供体363和504的NK细胞溶解Toledo B细胞。技术重复重复进行两次。误差条代表平均值的标准误差。ADCC＝抗体-药物依赖性细胞毒性；mAb＝单克隆抗体；NK＝自然杀伤。
图16A-图16D.OX40mAb24，实验4的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞毒性的评估。(16A-16B)使用来自如所指示的两个单独供体的原代人NK细胞，由OX40mAb24介导的表达OX40的人CD4 T细胞的特异性杀伤。(16C-16D)在利妥昔单抗而不是R347人IgG1同种型对照抗体存在下，通过来自供体464和532的NK细胞溶解Toledo B细胞。技术重复重复进行两次。误差条代表平均值的标准误差。ADCC＝抗体-药物依赖性细胞毒性；mAb＝单克隆抗体；NK＝自然杀伤。
图17A-图17B.OX40mAb24，实验5的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞毒性的评估。使用来自如所指示的供体601(图A)和602(图B)的原代人NK细胞，由OX40mAb24介导的表达OX40的人CD4+T细胞的特异性杀伤。误差条代表平均值的标准误差。ADCC＝抗体-药物依赖性细胞毒性；mAb＝单克隆抗体；NK＝自然杀伤。
图18A-图18B.OX40mAb24和9B12与纯化的人C1q蛋白的结合的评估。将指定浓度的纯化的人C1q蛋白注射到生物传感器芯片上。空白代表注射单独的PBS/0.005％吐温20媒介物。图A：OX40mAb24与纯化的人C1q的结合。图B：9B12与纯化的人C1q的结合。
图19A-图19B.表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB荧光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B细胞生物活性测定中的OX40mAb24活性。在与恒河猴B细胞系LCL8664组合的表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞系中，通过OX40mAb24进行的NFκB活性(RLU)的浓度依赖性诱导。示出2个独立测定的数据，对于每个数据点具有4次重复。误差条表示平均值的标准误差由于比例而不可见。RLU＝相对光单位。
图20A-图20B.表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB荧光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B细胞生物活性测定中的9B12活性。在与恒河猴B细胞系LCL8664组合的表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞系中，通过9B12进行的NFκB活性(RLU)的浓度依赖性诱导。示出2个独立测定的数据，对于每个数据点具有4次重复。误差条代表平均值的标准误差。RLU＝相对光单位。
图21A-图21B.表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB荧光素酶克隆B2和表达Fcγ受体的恒河猴免疫细胞生物活性测定中的OX40mAb24和9B12活性。在与表达Fcγ受体的恒河猴免疫细胞组合的表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞系中，通过OX40mAb24(图A)和9B12(图B)进行的NFκB活性(RLU)的浓度依赖性诱导。每个数据点两个重复。RLU＝相对光单位。
图22A-图22D.OX40mAb24和9B12引起原代恒河猴CD4 T细胞的增殖。OX40mAb24(22A-22B)和9B12(22C-22D)在初级活化的恒河猴CD4+T细胞中诱导细胞分裂。示出2个独立测定的数据，这2个独立测定具有一式三份的孔。误差条代表平均值的标准误差。
图23A-图23B.OX40mAb24和9B12对小鼠异种移植模型中的A375细胞生长的作用-实验1。每个组中六只NOD/SCID小鼠在第1天经皮下(SC)植入A375细胞，这些A375细胞以1:6的E:T比率与同种异体反应性人CD4+和CD8+T细胞系混合。在第3、第5、第7、第10和第12天腹膜内给予OX40mAb24(23A)和9B12(23B)和同种型对照(23A-23B)。示出肿瘤体积的平均值。分别在第25天和第18天进行OX40mAb24处理的动物(23A)或9B12处理的动物(23B)与同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和检验针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。*：与同种型对照组相比，TGI>68％,P≤0.05。E:T＝效应物:靶标比率；IP腹膜内；NOD/SCID＝非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷；SC＝皮下；TGI＝肿瘤生长抑制。
图24A-图24B.OX40mAb24和9B12对小鼠异种移植模型中的A375细胞生长的作用-实验2。每个组中六只NOD/SCID小鼠在第1天经皮下植入A375细胞，这些A375细胞以1:6的E:T比率与同种异体反应性人CD4+和CD8+T细胞系混合。在第3、第5、第7、第10和第12天腹膜内给予OX40mAb24(24A)和9B12(24B)和同种型对照(24A-24B)。示出肿瘤体积的平均值。在第18天进行OX40mAb24处理的动物(12A)或9B12处理的动物(12B)与同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过曼-惠特尼秩和检验针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。#：与同种型对照组相比，TGI≥75％，P≤0.0004。*：与同种型对照组相比，TGI＝53％，P≤0.05。E:T＝效应物:靶标比率；IP＝腹膜内；NOD/SCID＝非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷；SC＝皮下；TGI＝肿瘤生长抑制。
图25.OX40mAb24对小鼠异种移植模型中的A375细胞生长的作用-实验3。每个组中六只NOD/SCID小鼠在第1天经皮下植入A375细胞，这些A375细胞以1:6的E:T比率与同种异体反应性人CD4+和CD8+T细胞系混合。在第3天、第6天、第8天、第10天和第13天腹膜内给予OX40mAb24。示出肿瘤体积的平均值。在第28天进行OX40mAb24处理的动物与同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过曼-惠特尼秩和检验针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。*：与同种型对照组相比，TGI＝75％,P≤0.05；E:T＝效应物:靶标比率；IP＝腹膜内；NOD/SCID＝非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷；SC＝皮下；TGI＝肿瘤生长抑制。
图26A-图26B.OX86 mIgG2a对小鼠同源模型中的CT26细胞系生长的作用。每个组中10只BALB/c小鼠在第1天经皮下接种CT26细胞。在第9天和第12天((26A)中的箭头)腹膜内给予对照(阴性对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。示出肿瘤体积的平均值(26A)和单个值(26B)。进行OX86 mIgG2a处理的动物与阴性对照处理的动物之间的比较，并且通过单向方差分析(one-way ANOVA)使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。*：在第21天与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.0001。IP＝腹膜内；SC＝皮下；TGI＝肿瘤生长抑制。
图27A-图27B.OX86 mIgG2a对小鼠同源模型中的CT26细胞系生长的作用。每个组中12只BALB/c小鼠在第1天经皮下接种CT26细胞。在第13天和第16天((27A)中的箭头)腹膜内给予测试物品(OX86 mIgG2a)。示出肿瘤体积的平均值(27A)和单个值(27B)。进行OX86mIgG2a处理的动物与未处理的对照动物之间的比较，并且通过单向方差分析使用GraphPadPrism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。*：在第24天与未处理的对照组相比，TGI>50％，P≤0.0001。IP＝腹膜内；SC＝皮下；TGI＝肿瘤生长抑制。
图28A-图28B.OX86 mIgG2a对小鼠同源模型中的MCA205细胞系生长的作用。每个组中14只C57BL/6小鼠在第1天经皮下接种MCA205细胞。在第11天和第14天腹膜内给予对照物品(同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。示出肿瘤体积的平均值(28A)和单个值(28B)。进行OX86 mIgG2a处理的动物与同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条代表平均值的标准误差。*：在第27天与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.0001。IP＝腹膜内；SC＝皮下；TGI＝肿瘤生长抑制。
图29A-图29B.OX86 mIgG2a对小鼠同源模型中的4T1细胞系生长的作用。每个组中12只BALB/c小鼠在第1天经皮下接种4T1细胞。在第13天、第16天、第20天和第23天腹膜内给予对照物品(同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。示出肿瘤体积的平均值(29A)和单个值(29B)。进行OX86 mIgG2a处理的动物与同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。IP＝腹膜内；SC＝皮下；TGI＝肿瘤生长抑制。
图30.人和小鼠OX40分子的细胞外结构域的氨基酸比对。人OX40(NCBI参考序列NP_003318.1)与小鼠OX40(NCBI参考序列NP_035789.1)共享60％序列同一性。使用ClustalW的方法进行比对。详细描述了OX40的细胞外结构域。用箭头示出在CRD3结构域中在人与小鼠之间不同的氨基酸。两个关键的表位残基L116和A126加框。CRD＝富含半胱氨酸的结构域。
图31.嵌合人/小鼠OX40变体的命名法和示意性图示。通过将小鼠OX40(空心)的各种结构域或残基移入或移出人(实心)(KO)中或将人OX40氨基酸的各自结构域或残基移入或移出小鼠OX40(KI)中来构建嵌合人/小鼠OX40变体。单个氨基酸或组合的突变以红色(KO)和绿色(KI)箭头示出。CRD＝富含半胱氨酸的结构域；KI＝敲入；KO＝敲除；TM＝跨膜结构域。
图32A-图32C.OX40mAb24与嵌合人/小鼠OX40变体的结合的FACS分析。使用OX40mAb24及其亲本小鼠mAb(9B12)，使用293F细胞瞬时表达所有变体以用于使用FACS分析的结合表征。使用抗人和小鼠OX40多克隆抗体监测表达水平。(A)使用结构域交换的嵌合变体，CRD3结构域被鉴别为含表位的结构域。OX40mAb24和9B12不结合编码小鼠CRD3结构域的KO变体(KO_CRD3和KO_CRD3+4)，并且识别编码人CRD3结构域的KI变体(KI_CRD3)。(B)另外，通过突变在CRD3结构域中在人与小鼠之间不同的单个氨基酸或氨基酸组合将关键表位残基确定为CRD3结构域中的L116和A126(图11-1)。当用小鼠对应物(KO_L116+A126)置换人残基L116和A126时，OX40mAb24和9B12的结合被消除。(C)KI/功能获得性变体证实这两个关键残基的重要性。将L116、A126或组合接枝至小鼠OX40导致OX40mAb24和9B12的结合。
图33A-图33D.在将OX86 mIgG2a给予至初次接受实验的小鼠后，外周血和脾CD4+T细胞上Ki67和ICOS的表达水平。在第1天用对照物品(盐水和NIP228 IgG2a同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)以指定剂量水平腹膜内接种每组中7只初次接受实验的BALB/c小鼠。在指定天数收集血液(图A和图C)，并且在第10天分离来自5个组的脾。通过流式细胞术测量CD4+T细胞上Ki67(图A和图B)和ICOS(图C和图D)的表达水平。对于每组，示出表达Ki67(图A)和ICOS(图C)的血液中CD4细胞百分比的平均值。对各组的每只动物绘制表达Ki67(图B)和ICOS(图D)的脾中CD4细胞的百分比。误差条表示平均值的标准误差。*：P≤0.05在图A和图C中标记；对于在图B和图D中具有显著性的每个组，列出P值。
图34A-图34B.在将OX86 mIgG2a给予至初次接受实验的小鼠后，外周血和脾CD4+T细胞上Ki67和ICOS表达的相关性。在用对照物品(盐水和NIP228 IgG2a同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)以指定剂量水平处理后10天，进行在图12-1中示出从单个动物的外周血(图A)和脾(图B)分离的Ki67和ICOS阳性CD4 T细胞的百分比之间的比较。绘制单个小鼠的测量值。使用GraphPad Prism 6.0软件对所得到的数据集组进行线性回归分析，以确定该数据的最佳拟合线。为每个图提供斜率为非零(P值)的确定系数(r2)和显著性。
图35A-图35D.在将OX86 mIgG2a给予至初次接受实验的小鼠后，外周血和脾CD8+T细胞上Ki67和ICOS的表达水平。在第1天用对照物品(盐水和NIP228 IgG2a同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)以指定剂量水平腹膜内接种每组中7只初次接受实验的BALB/c小鼠。在指定天数收集血液(图A和图C)，并且在第10天分离来自5个组的脾。通过流式细胞术测量CD8+T细胞上Ki67(图A和图B)和ICOS(图C和图D)的表达水平。对于每组，示出表达Ki67(图A)和ICOS(图C)的血液中CD8细胞百分比的平均值。对各组的每只动物绘制表达Ki67(图B)和ICOS(图D)的脾中CD8细胞的百分比。误差条表示平均值的标准误差。*：P≤0.05在图A和图C中标记；对于在图B和图D中具有显著性的每个组，列出P值。
图36A-图36B.在将OX86 mIgG2a给予至初次接受实验的小鼠后，外周血和脾CD8+T细胞上Ki67和ICOS表达的相关性。在用对照物品(盐水和NIP228 IgG2a同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)以指定剂量水平处理后10天，进行在图12-1中示出从单个动物的外周血(图A)和脾(图B)分离的Ki67和ICOS阳性CD8+T细胞的百分比之间的比较。绘制单个小鼠的测量值。使用GraphPad Prism 6.0软件对所得到的数据集组进行线性回归分析，以确定该数据的最佳拟合线。为每个图提供斜率为非零(P值)的确定系数(r2)和显著性。
图37A-图37D.小鼠OX86 IgG2a对缺乏抑制性(Fcgr2b-/-)或活化(Fcer1g-/-)Fcγ受体的同源小鼠模型中CT26细胞系生长的作用。在第1天用CT26细胞皮下接种遗传工程化为缺乏抑制性Fcγ受体IIb(Fcgr2b-/-；图A和图B)或活化Fcγ受体(Fcer1g-/-；图C和图D)的8只Balb/c小鼠的组。在第4天和第7天腹膜内给予对照物品(盐水/未处理的和OX86mIgG1D265A突变体/同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。示出平均(图A和图C)和单个(图B和图D)肿瘤体积。进行OX86 mIgG2a处理的动物与未处理的动物和同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。SC＝皮下；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制
图38A-图38D.小鼠OX86 IgG2a对缺乏抑制性(Fcgr2b-/-)或活化(Fcer1g-/-)Fcγ受体的同源小鼠模型中MCA205细胞系生长的作用。在第1天用MCA205细胞皮下接种遗传突变为缺乏抑制性Fcγ受体IIb(Fcgr2b-/-；图A和图B)或活化Fcγ受体(Fcer1g-/-；图C和图D)的8只C57BL/6小鼠的组。在第4天和第7天腹膜内给予对照物品(盐水/未处理的和OX86mIgG1 D265A突变体/同种型对照)和测试物品(mOX40L FP)。示出平均(图A和图C)和单个(图B和图D)肿瘤体积。进行mOX40L FP处理的动物与未处理的动物和同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条表示平均值的标准误差。*：在研究第20天与未处理组合同种型对照组相比，TGI≥95％，P≤0.023。SC＝皮下；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制
图39A-图39B.在将OX86小鼠IgG2a给予至缺乏抑制性(Fcgr2b-/-)或活化(Fcer1g-/-)Fcγ受体后，从外周血、脾和CT26肿瘤分离的CD4+T细胞中Ki67的表达水平。在第1天用CT26细胞皮下接种遗传工程化为缺乏抑制性Fcγ受体IIb(Fcgr2b-/-；图A)或活化Fcγ受体(Fcer1g-/-；图B)的4只Balb/c小鼠的组；这项研究独立于图12-5中呈现的研究，但是与图12-5中呈现的研究类似地进行。在第4天和第7天腹膜内给予对照物品(盐水/未处理的和OX86 mIgG1D265A突变体/同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。对于图A，在第14天分离血液、脾和肿瘤，并且对于图B，在第13天分离血液、脾和肿瘤。通过流式细胞术测量CD4+T细胞中Ki67的表达水平。符号表示来自单个小鼠的每种组织的Ki67阳性CD4+T细胞的百分比；水平条表示每组的平均值。通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异，并且用水平条指示计算的P值。SC＝皮下；IP＝腹膜内
图40A-图40B.在将OX86小鼠IgG2a给予至缺乏抑制性(Fcgr2b-/-)或活化(Fcer1g-/-)Fcγ受体后，从外周血、脾和CT26肿瘤分离的CD8+T细胞中Ki67的表达水平。在第1天用CT26细胞皮下接种遗传工程化为缺乏抑制性Fcγ受体IIb(Fcgr2b-/-；图A)或活化Fcγ受体(Fcer1g-/-；图B)的4只Balb/c小鼠的组；这项研究独立于图12-5中呈现的研究，但是与图12-5中呈现的研究类似地进行。在第4天和第7天腹膜内给予对照物品(盐水/未处理的和OX86 mIgG1D265A突变体/同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。对于图A，在第14天分离血液、脾和肿瘤，并且对于图B，在第13天分离血液、脾和肿瘤。通过流式细胞术测量CD8+T细胞中Ki67的表达水平。符号表示来自单个小鼠的每种组织的Ki67阳性CD8+T细胞的百分比；水平条表示平均值。通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异，并且用水平条指示计算的P值。SC＝皮下；IP＝腹膜内
图41A-图41B.在将OX86小鼠IgG2a给予至缺乏抑制性(Fcgr2b-/-)或活化(Fcer1g-/-)Fcγ受体后，从引流淋巴结、脾和MCA205肿瘤分离的CD4 T细胞中Ki67的表达水平。在第1天用MCA205细胞皮下接种遗传工程化为缺乏抑制性Fcγ受体IIb(Fcgr2b-/-；图A)或活化Fcγ受体(Fcer1g-/-；图B)的4只C57BL/6小鼠的组；研究独立于图12-6中呈现的研究，但是与图12-6中呈现的研究类似地进行。在第4天和第7天腹膜内给予对照物品(盐水/未处理的和OX86 mIgG1 D265A突变体/同种型对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。对于图B,在第20天分离引流淋巴结、脾和肿瘤。通过流式细胞术测量CD4+T细胞中Ki67的表达水平。符号表示来自单个小鼠的每种组织的Ki67阳性CD4+T细胞的百分比；水平条表示平均值。通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异，并且用水平条指示计算的P值。SC＝皮下；IP＝腹膜内
图42A-图42B.在将OX86小鼠IgG2a给予至缺乏抑制性(Fcgr2b-/-)或活化(Fcer1g-/-)Fcγ受体后，从引流淋巴结、脾和MCA205肿瘤分离的CD8T细胞中Ki67的表达水平。在第1天用MCA205细胞皮下接种遗传工程化为缺乏抑制性Fcγ受体IIb(Fcgr2b-/-；图A)或活化Fcγ受体(Fcer1g-/-；图B)的4只C57BL/6小鼠的组；这项研究独立于图12-6中呈现的研究，但是与图12-6中呈现的研究类似地进行。在第4天和第7天腹膜内给予对照物品(盐水和mOX40L FP D265A突变体对照)和测试物品(OX86 mIgG2a)。在第20天分离引流淋巴结、脾和肿瘤。通过流式细胞术测量CD8+T细胞中Ki67的表达水平。符号表示来自单个小鼠的每种组织的Ki67阳性CD8+T细胞的百分比；水平条表示平均值。通过单向方差分析使用GraphPad Prism 6.0软件针对统计显著性分析了组间差异，并且用水平条指示计算的P值。SC＝皮下；IP＝腹膜内
图43A-图43B.通过OX40mAb24减少调控性T细胞。图A：就在KLH免疫和用NIP228huIgG1对照(huIgG1)或OX40mAb24处理之前，在植入人免疫细胞的小鼠的外周血中测量的人CD4+Foxp3+Treg细胞的百分比。无mAb指示无免疫并且无mAb处理。图B：在用免疫且用mAb处理后相同组中的小鼠外周血中人CD4+FoxP3+Treg细胞的百分比。统计p值来自单向方差分析。Hu＝人；mAb＝单克隆抗体；Treg＝调控性T细胞
图44A-图44D.在OX40mAb24处理后，相对于调控性T细胞，效应和记忆CD4 T细胞的扩增。对于总CD4+T细胞(图A)；CD4+效应T细胞(Teff)(图B)；CD4+效应记忆T细胞(Tem)(图C)；和CD4+中心记忆T细胞(Tcm)(图D)，如所指示用KLH免疫、接着NIP228 huIgG1mAb(huIgG1)或OX40mAb24免疫，处理前(左)或处理后(右)植入人免疫细胞的小鼠的外周血中人CD4+T细胞与人Treg细胞的比率。无mAb指示无免疫以及无mAb处理。统计p值来自单向方差分析。Hu＝人；mAb＝单克隆抗体；Tcm＝中心记忆T细胞；Teff＝效应T细胞；Tem＝效应记忆T细胞
图45A-图45B.用OX40mAb24处理的小鼠中增加的CD8+效应T细胞与调控性T细胞比率。如所指示，用KLH免疫、接着NIP228 huIgG1 mAb(huIgG1)或OX40mAb24免疫，处理前(左)或处理后(右)植入人免疫细胞的小鼠的外周血中人CD8+效应T细胞与人Treg细胞的比率。无mAb指示无免疫以及无mAb处理。指示比较所有组的来自单向方差分析的统计p值。Hu＝人；mAb＝单克隆抗体；Teff＝效应T细胞；Treg＝调控性T细胞
图46A-图46C.用OX40mAb24处理的小鼠中CD8+T细胞上的CD25(IL-2受体)水平增加。对于(A)总CD8+T细胞，(B)CD8+效应T细胞(Teff)，(C)CD8+效应记忆(Tem)T细胞，如所指示，用无处理(无mAb)或KLH免疫、接着NIP228 huIgG1 mAb(huIgG1)或OX40MAB24免疫处理后(左)或处理前(右)，植入人免疫细胞的小鼠的外周血中人CD8+T细胞之中人CD25(IL-2受体)阳性细胞的百分比。无mAb指示无免疫以及无mAb处理。统计p值来自单向方差分析。Hu＝人；mAb＝单克隆抗体；Teff＝效应T细胞；Tem＝效应记忆T细胞。
发明详细说明
在由抗原引发的过程中或之后不久，OX40受体接合在T细胞(例如，CD4+T细胞)上导致T细胞(例如，CD4+T细胞)对抗原的应答增加。在本披露的上下文中，术语“接合”是指结合并刺激由OX40受体介导的至少一种活性。例如，OX40受体在抗原特异性T细胞(例如，CD4+T细胞)上的接合导致与响应于单独的抗原相比增加的T细胞增殖，以及增加的细胞因子的产生。对抗原的增加的应答可以比在没有OX40受体接合下维持实质上更长的一段时间。因此，经由OX40受体的刺激通过提高抗原(例如，肿瘤抗原)的T细胞识别来增强抗原特异性免疫应答。
当在由抗原引发T细胞的过程中或之后不久向受试者给予时，OX40激动剂可在受试者(如人受试者)中增强抗原特异性免疫应答。OX40激动剂包括OX40配体(“OX40L”)，如可溶性OX40L融合蛋白和抗OX40抗体或其片段。一个具体实例是特异性地结合OX40、从而触发信号传导的人源化抗体。人源化抗OX40单克隆抗体的集合由本披露提供。还描述了包含编码此类抗体的多核苷酸序列的核酸。本披露还提供用于在受试者中使用人源化抗OX40单克隆抗体增强抗原特异性免疫应答的方法。
定义
应注意，术语“一(个/种)”实体是指一个或多个(种)该实体；例如，“一个结合分子”应理解为表示一个或多个结合分子。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个(一种或多种)”、以及“至少一个(至少一种)”在此可以互换地使用。
此外，在此使用“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，术语“和/或”如在此在词组如“A和/或B”中使用时，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”的词组中所使用的术语“和/或”意图涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
除非另外定义，在此所使用的技术和科学术语具有与本披露涉及的领域所属的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，生物医学和分子生物学简明词典(ConciseDictionary ofBiomedicine and Molecular Biology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；细胞和分子生物学词典(Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；以及牛津生物化学和分子生物学词典(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的小标题不是本披露的不同方面或各方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
如在此所使用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合或其任何语法变化形式是明确排除但仅排除由法官或行政或司法机构确定或解释为或可能在任何时候确定或解释为“天然存在”的物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合的那些形式的条件术语。
如在此使用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”和复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化以及通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然发生的氨基酸来进行的修饰。多肽可来自生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从一个指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。
如在此披露的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有一种限定的三维结构，但是它们不是必然具有这种结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有限定的三维结构而可采用很多不同构象的多肽被称为未折叠的。如在此使用，术语糖蛋白是指偶联至至少一个碳水化合物部分的蛋白质，该碳水化合物部分经由氨基酸(例如丝氨酸或天冬酰胺)的含氧或含氮侧链来附接至该蛋白质。
一种“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不存在于其天然环境中的一种多肽。不要求特定水平的纯化。例如，一种分离的多肽可以从其天然或自然环境中去除。如同已经通过任何合适的技术来分离、份化或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽一样，如在此披露的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被视为是分离的。
如在此所使用，术语“非天然存在的”多肽或其任何语法变化形式是明确排除但仅排除由法官或行政或司法机构确定或解释为或可能在任何时候确定或解释为“天然存在”的多肽的那些形式的条件术语。
在此披露的其他多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，以及其任何组合。如在此披露的术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应天然抗体或多肽的至少一些性质(例如特异性地结合抗原)的任何多肽。除了在此其他处所讨论的具体抗体片段以外，多肽片段包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。例如多肽变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些方面中，变体可以是非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包括保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已被改变使得展现出在原始多肽上找不到的附加特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在此还可以称为“多肽类似物”。如在此所使用的，多肽的“衍生物”还可指具有通过官能侧基的反应来化学衍生的一个或多个氨基酸的主题多肽。含有二十种标准氨基酸的一种或多种衍生物的那些肽也作为“衍生物”包括在内。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
“保守的氨基酸取代”是一个氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸置换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸对于酪氨酸的取代是保守取代。在某些实施例中，本披露的多肽和抗体的序列中的保守性取代不会消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与抗原(结合分子所结合的抗原)的结合。鉴别不会消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本领域熟知的(参见，例如，布鲁梅尔(Brummell)等人,生物化学(Biochem.)32:1180-1 187(1993)；小林(Kobayashi)等人，蛋白质工程化(Protein Eng.)12(10):879-884(1999)；以及伯克斯(Burks)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94:.412-417(1997))。
术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指一种分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中所发现)。术语“核酸”或“核酸序列”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸节段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸或多核苷酸旨在是与其天然环境分离的核酸或多核苷酸的任何形式。例如，凝胶纯化的多核苷酸或编码载体中所含的多肽的重组多核苷酸将被认为是“分离的”。此外，已被工程化为具有克隆限制性位点的多核苷酸节段(例如PCR产物)被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的另外实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或非天然溶液如缓冲液或盐水中的纯化(部分地或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物，其中转录物不是将在自然中存在的转录物。分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如在此所使用，“非天然存在的”多核苷酸或其任何语法变化形式是明确排除但仅排除由法官或行政或司法机构确定或解释为或可能在任何时候确定或解释为“天然存在”的多核苷酸的那些形式的条件定义。
如在此使用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，它可被认为是编码区的一部分，但是任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、以及类似序列)并非编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如在单独(不同)载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或可以包括两个或更多个编码区，例如单一载体可以单独地编码一个免疫球蛋白重链可变区和一个免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可包括与另一个编码区融合或未融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于编码特化的元件或基序的那些，如分泌信号肽或异源功能结构域。
在一些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相关联的其他转录或翻译控制元件。可操作相关联是针对基因产物(例如多肽)的编码区按以下这种方式与一个或多个调控序列相关联，该方式使得该基因产物的表达处于这种或这些调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所希望的基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列引导基因产物的表达的能力或不干扰有待转录的DNA模板的能力，那么两个DNA片段(如多肽编码区和与其关联的启动子)“可操作地关联”。因此，启动子区将可操作地与编码多肽的核酸相关联，只要启动子能够实现该核酸的转录。启动子可以是在预定细胞中引导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子以及转录终止信号可以可操作地与多核苷酸相关联以便引导细胞特异性转录。
多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，它与内含子A相结合)、猿病毒40(早期启动子)以及逆转录病毒(如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其他转录控制区包括得自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素以及兔β球蛋白的那些转录控制区域，连同能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。另外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，连同淋巴因子可诱导的启动子(例如可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及得自小核糖核酸病毒的元件(特别是内核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。
在其他实施例中，多核苷酸可以是例如处于信使RNA(mRNA)、转运RNA或核糖体RNA形式的RNA。
多核苷酸和核酸编码区可以缔合有另外的编码区，这些另外的编码区编码分泌或信号肽，这些分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经开始将生长的蛋白质链输出横穿粗面内质网，该信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白质上裂解。本领域普通技术人员意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽可具有融合至多肽的N末端的信号肽，这种信号肽从完整或“全长”多肽上裂解以便产生分泌或“成熟”形式的多肽。在一些实施例中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或保持引导与其可操作关联的多肽的分泌的能力的所述序列的功能衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽，或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列来取代。
在此披露某些结合分子，或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非具体提及全大小抗体，否则术语“结合分子”涵盖全大小抗体以及此类抗体的抗原结合亚基、片段、变体、类似物或衍生物，例如以类似于抗体分子的方式结合抗原、但使用不同支架的工程化的抗体分子或片段。
如在此使用，术语“结合分子”在其最广泛含义上是指特异性地结合受体(例如表位或抗原决定簇)的分子。如在此进一步描述的，结合分子可包含一个或多个在此描述的“抗原结合结构域”。结合分子的非限制性实例是保留抗原特异性结合的抗体或其片段。
如在此所用，术语“结合结构域”、“受体结合结构域”或“抗原结合结构域”是指必需且足以特异性地结合表位的结合分子的区域。例如，作为两个单独的多肽亚基或作为单链的“Fv”(例如抗体的可变重链和可变轻链)被认为是“结合结构域”。其他结合结构域包括但不限于，源自骆驼科动物物种的抗体的可变重链(VHH)，或在异源框架(例如不同种系或物种)中或在不同支架(例如，纤连蛋白支架)中表达的6个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。如在此所述的“结合分子”可以包含一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个“抗原结合结构域”。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换地使用。抗体(或如在此披露的其片段、变体或衍生物)包含至少重链的可变结构域(对于骆驼科动物物种)或至少重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构已得到相对充分地认识。参见例如哈洛(Harlow)等人，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)。除非另外说明，术语“抗体”涵盖从抗体的小抗原结合片段到全大小抗体范围内的任何事物，例如包含两个完整重链和两个完整轻链的IgG抗体、包含四个完整重链和四个完整轻链且任选地包含J链和/或分泌组分的IgA抗体、或包含十个或十二个完整重链和十个或十二个完整轻链且任选地包含J链的IgM抗体。
如以下更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包括可在生物化学上区分的不同广泛类别的多肽。本领域技术人员将了解，重链被分类为、、、或ε(γ、μ、α、δ、ε)，它们之中有一些子类(例如，γ1-γ4或α1-α2))。这种链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等被充分表征，并且已知可赋予功能特化。这些类别和同种型中的每一个的修饰形式在考虑本披露的情况下对于本领域技术人员来说是可容易地辨别的，并且因此在本披露的范围内。
轻链被分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链缔合。总体上，轻链和重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传工程化的宿主细胞来产生时，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键来彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉端的N末端延伸至每个链底部的C末端。某些抗体(例如，IgG抗体)的基本结构包含经由二硫键共价连接以形成“Y”结构(在此也称为“H2L2”结构)的两个重链亚基和两个轻链亚基。
轻链与重链两者均划分到具有结构和功能同源性的区域之中。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在此方面，应了解可变轻链(VL)与可变重链(VH)部分的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予生物特性如分泌、经胎盘移动性(transplacental mobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N-末端部分是可变区并且在C-末端部分处是恒定区；CH3(或在IgM的情况下CH4)结构域和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基-末端。
如上所指示，结合结构域(例如，抗体可变区)允许结合分子选择性地识别并且特异性地结合受体或抗原上的表位。即结合分子(例如抗体)的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集组合以便形成限定三维抗原结合位点的可变区。更确切来说，通过每条VH和VL链上的三个CDR来限定抗原结合位点。某些抗体形成较大的结构。例如，IgA可以形成包含两个H2L2单元、一个J链和一种分泌组分(全部经由二硫键共价连接)的分子，并且IgM可以形成包含五个或六个H2L2单元和任选地经由二硫键共价连接的一个J链的五聚体或六聚体分子。
存在于抗体抗原结合结构域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的、非连续氨基酸序列，这些氨基酸被特别地定位以便当抗体在水性环境中呈现其三维构型时形成结合结构域。被称为“框架”区或“FW”区的结合结构域中的其余氨基酸展示较小分子间变化性。框架区大部分采用β片层构象，并且CDR形成多个环，这些环连接并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。因此，框架区起作用以便形成支架，该支架提供通过链间、非共价相互作用将CDR以正确取向来进行定位。由所定位的CDR形成的结合结构域限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。相应地构成CDR和框架区的氨基酸可由本领域普通技术人员针对任何给定的重链或轻链可变区来容易地加以鉴别，因为它们已经以各种不同的方式定义(参见“免疫学上关注的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”卡巴特(Kabat)，E等人，美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983)；以及柯西亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，196:901-917(1987)，这些文献通过引用以其全部内部结合在此)。
在本领域内使用和/或接受的术语存在两个或更多个定义的情况下，如在此使用的术语的定义旨在包括所有这类含义，除非明确地说明相反情形。具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链与轻链多肽两者的可变区中所发现的非连续抗原组合位点。这些特定区域已经例如由卡巴特等人，美国卫生和公众服务部，“免疫学上关注的蛋白质序列”(1983)和柯西亚等人，分子生物学杂志196:901-917(1987)，其通过引用结合在此。卡巴特和柯西亚的定义包括相对于彼此比较的氨基酸的重叠或子集。然而，除非另外指明，应用任一定义(或本领域的普通技术人员已知的其他定义)来指抗体或其变体的CDR旨在处于如在此所定义并且使用的术语的范围内。涵盖如由以上所引用的每一参考文献所定义的CDR的适当氨基酸在下表1中予以阐明以便进行比较。涵盖具体CDR的精确氨基酸编号将取决于CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域的技术人员可常规地确定哪些氨基酸构成了具体CDR。
表1CDR定义1
卡巴特 柯西亚
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表1中的所有CDR定义的编号根据由卡巴特等人列举的编号惯例(参见下文)。
卡巴特等人还定义了抗体重链和轻链(例如，抗体可变结构域序列)的可适用于任何抗体的编号系统。本领域的普通技术人员可明确地将此“卡巴特编号”系统指派给任何可变域序列，而不需依赖超出序列本身的任何实验数据。如在此所使用，“卡巴特编号”是指由卡巴特等人、美国卫生和公众服务部、“免疫学上关注的蛋白序列”(1983)所阐明的编号系统。然而，除非明确地注明使用卡巴特编号系统，否则连续编号用于本披露中的所有氨基酸序列。
结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利5,892,019之中。本披露涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)或子类。
“特异性地结合”一般是指结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物经由其抗原结合域来结合至表位，并且这种结合需要抗原结合域与表位之间有某种互补性。根据此定义，当与结合分子将结合至随机、不相关的表位相比，该结合分子更容易经由其抗原结合域来结合至一个表位时，该结合分子被认为是“特异性地结合至”该表位。术语“特异性”在此用于对某种结合分子结合至某种表位的相对亲和力进行定性。例如，与结合分子“B”相比，结合分子“A”可被视为针对给定的表位具有较高特异性，或与结合分子“A”针对相关表位“D”所具有的特异性相比，结合分子“A”可被认为以较高特异性结合至表位“C”。
在此披露的结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物可被认为以小于或等于例如5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1、10-3sec-1、5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、或10-5sec-15×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(k(off))结合靶抗原。
在此披露的结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可被认为以大于或等于例如103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1、5×104M-1sec-1、105M-1sec-1、5×105M- 1sec-1、106M-1sec-1、或5×106M-1sec-1、或107M-1sec-1的缔合速率(k(on))结合靶抗原。
结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)被认为竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合，如果它优先结合至该表位至它在某种程度上阻断参考抗体或抗原结合片段与该表位的结合的程度的话。竞争性地抑制可以通过在本领域中已知的任何方法、例如竞争ELISA测定来确定。结合分子可被认为竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合达至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％。
如在此使用，术语“亲和力”是指单独表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个结合结构域的结合强度的度量。参见例如哈洛(Harlow)等人，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，第2版，1988)，第27-28页。如在此所用，术语“亲合力”是指结合结构域的群体与抗原之间的复合物的总体稳定性。参见例如哈洛，第29-34页。亲合力与群体中的单独结合结构域与特定表位的亲和力相关，并且还与免疫球蛋白和抗原的效价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。二价单克隆抗体与细胞表面上以高密度存在的受体之间的相互作用也将具有高亲合力。
如在此披露的结合分子或其抗原结合片段、变体或衍生物还可在它们的交叉反应性方面来描述或规定。如在此使用，术语“交叉反应性”是指对于一种抗原具有特异性的结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)与第二种抗原反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间的关联性的度量。因此，如果结合分子结合至除了诱导其形成的表位以外的表位，那么它具有交叉反应性。交叉反应性表位一般含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，可实际上比原始表位更合宜。
结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)还可以在它们与抗原的结合亲和力方面来描述或规定。例如，结合分子可以不大于例如5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M的解离常数或KD结合抗原。
包含单链抗体或其他结合结构域的抗体片段可以单独存在或与以下中的一种或多种组合存在：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分。还包括抗原结合片段，这些抗原结合片段可以包括可变区与以下中的一种或多种的任何组合：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分。结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可以是人类、鼠类、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一个实施例中，可变区可以是软骨类动物(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。如在此使用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并且包括从人免疫球蛋白文库或从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物分离的抗体，并且可在一些实例中表达内源性免疫球蛋白并且在一些实例中不表达内源性免疫球蛋白，如下文和例如库彻拉帕提(Kucherlapati)等人的美国专利号5,939,598中所描述。
如在此所用，术语“重链亚基”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列，结合分子，例如包含重链亚基的抗体包含以下中的至少一种：VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其变体或片段。例如，结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物除了VH结构域之外还可包含CH1结构域；CH1结构域；铰链和CH2结构域；CH1结构域和CH3结构域；CH1结构域；铰链和CH3结构域；或CH1结构域；铰链结构域；CH2结构域和CH3结构域。在某些方面，结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物除了VH结构域之外还可包含CH3结构域和CH4结构域；或CH3结构域、CH4结构域和J链。此外，用于在本披露中使用的结合分子可以缺乏某些恒定区部分，例如CH2结构域的全部或一部分。本领域的普通技术人员应了解，这些结构域(例如，重链亚基)可被修饰成使得它们在氨基酸序列上不同于原始免疫球蛋白分子。
结合分子(例如，抗体或其片段)的重链亚基可包含源自不同免疫球蛋白分子的结构域。例如，多肽的重链亚基可包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链亚基可以包含部分地源自IgG1分子并且部分地原子IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链亚基可以包含部分地源自IgG1分子并且部分地原子IgG4分子的嵌合铰链。
如在此使用，术语“轻链亚基”包含源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基包含VL或CL(例如，Cκ或Cλ)结构域中的至少一个。
结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以在抗原的一个或多个表位或一个或多个部分(例如它们识别或特异性地结合的抗原)方面来描述或规定。特异性地与抗体的抗原结合结构域相互作用的靶抗原的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可以包含单个表位或至少两个表位，并且可以取决于抗原的大小、构象和类型包含任何数目的表位。
如先前所指示，不同免疫球蛋白类别的恒定区的亚单位结构和三维构型是熟知的。如在此使用，术语“VH域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变域并且术语“CH1域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端的)恒定区域。CH1结构域与VH结构域相邻并且在典型免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如在此使用，术语“CH2结构域”包括重链分子的、例如使用常规编号方案从IgG抗体的约氨基酸244延伸至氨基酸360的那部分(氨基酸244至360，卡巴特编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统；参见卡巴特EA等人的前述文献(op.cit.)。CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C末端并且包含大约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别，例如IgM进一步包含CH4区。
如在此使用，术语“铰链区”包括重链分子的将CH1域接合至CH2域的那部分。这个铰链区包括近似25个氨基酸并且是柔性的，由此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。
如在此使用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在某些IgG分子中，CH1区和CL区通过二硫键来连接并且两个重链通过使用卡巴特编号系统在对应于239和242的位置(EU编号系统的位置226或229)处的两个二硫键来连接。在在此提供的某些方面中，人IgG4Fc结构域可以在铰链区进行突变以确保两个铰链区之间二硫键形成，具体地，在位置228处丝氨酸至脯氨酸(根据EU编号)的突变。包含S228P突变的人IgG4Fc结构域在此被称为“IgG4P Fc结构域”。
如在此所用，“Fc-TM区”是包含如由在卡巴特中阐述的EU索引编号的L234F、L235E和P331S的氨基酸取代并且表现出减少或消除的效应子(ADCC和/或CDC)功能、减少或消除的与Fc受体的结合、和/或减少或消除的毒性的人IgG Fc区。参见例如美国专利申请公开号2011/0059078，其通过引用以其全文结合在此。
如在此使用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫反应区或位点从第一物种获得或得到并且恒定区(其可为完整的、部分的或修饰的)从第二物种获得的抗体。在一些实施例中，靶结合区或位点将来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)并且恒定区是来自人。
术语“多特异性抗体”或“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有两个或更多个不同表位的结合结构域的抗体。除了标准抗体结构以外，其他结合分子也可被构建成具有两种结合特异性。通过双特异性或多特异性抗体结合的表位可以是同时或连续的。三体细胞瘤和杂交杂交瘤是可以分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。双特异性抗体也可以通过重组方法构建。(施特勒莱因和海斯(Heiss)，未来肿瘤学(Future Oncol.)6:1387-94(2010)；马布里(Mabry)和斯内夫利(Snavely)，IDrugs.13:543-9(2010))。双特异性抗体也可以是双抗体。
如在此所用，术语“工程化抗体”是指其中重链和轻链中任一者或两者中的可变结构域通过至少部分置换CDR区或框架区中任一者中的一个或多个氨基酸而改变的抗体。在某些方面，来自具有已知特异性的抗体的全部CDR可以移植到异源抗体的构架区中。虽然替代CDR可源自与框架区所源自的抗体相同的类别或甚至子类别的抗体，但是CDR还可源自不同类别的抗体，例如源自来自不同物种的抗体。其中来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植至人重链或轻链框架区中的工程化的抗体在此称为“人源化抗体”。在某些方面，并非所有的CDR都被来自供体可变区的完整CDR置换，并且供者的抗原结合能力仍然可以被转移至受体可变结构域。考虑到例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762、以及6,180,370中所阐明的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验或通过逐次逼近试验(trial and errortesting)来获得功能工程化或人源化的抗体。
如在此使用，术语“工程化”包括通过合成手段(例如重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶合、或这些技术的某种组合)来操纵核酸或多肽分子。
如在此使用，术语“连接”、“融合(fused)”或“融合(fusion)”或其他语法等效物可互换地使用。这些术语是指通过包括化学轭合或重组手段的任何手段将两个更多个元件或组分连接在一起。“框内融合”是指连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框架(ORF)以便以维持原始ORF的翻译阅读框架的方式来形成连续更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或更多个节段的单一蛋白质(这些节段在天然地通常并不这样连接。)虽然阅读框架由此在整个融合节段上被致使连续，但是这些节段可以被例如框内接头序列在物理上或空间上分离。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可框内融合，但是被编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分离，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分来共翻译即可。
在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”是多肽中的在氨基至羧基末端方向上的氨基酸顺序，其中在多肽的一级结构中，在序列上彼此邻接的氨基酸是连续的。多肽的在多肽的另一部分的“氨基末端”或“N-末端”的多肽的一部分是顺序多肽链中较早出现的那部分。类似地，多肽的在多肽的另一部分的“羧基末端”或“C-末端”的多肽的一部分是在顺序多肽链中较晚出现的那部分。例如，在一种典型的抗体中，可变结构域在恒定区的“N末端”，并且恒定区在可变结构域的“C末端”。
如在此使用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如多肽的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除和瞬态表达与稳定表达两者。它包括而不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，和将这种mRNA翻译成多肽。如果最终所希望的产物是生物化学物质，那么表达包括该生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如在此使用，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录来产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。在此描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白裂解等)的多肽。
术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“缓和(alleviating)”或“缓和(to alleviate)”是指治愈、减缓、减轻现有诊断的病理病状或病症的症状和/或阻止或减慢其进展的治疗措施。诸如“预防(prevent)”、“预防(prevention)”、“避免”、“阻止”等的术语是指预防未诊断的靶向病理病状或病症的发展的防治性或预防性措施。因此，“需要治疗的那些”可包括已经患有该病症的那些；易患该病症的那些；以及其中待预防该病症的那些。
OX40，或“OX40受体”是在活化的T细胞(例如CD4+和CD8+T-细胞)的表面上以及在Foxp3+CD4+调节性T细胞(Treg)上表达的一种蛋白(也不同地称为CD134、肿瘤坏死因子受体超家族成员4、和ACT-35)。初始的CD4+和CD8+T-细胞不表达OX40(克罗夫特·M.(Croft,M.)，(2010)免疫学年鉴(Ann RevImmunol)28：57-78)。
“OX40配体”(“OX40L”)(也不同地称为肿瘤坏死因子配体超家族成员4、gp34、TAX转录活化糖蛋白1、和CD252)在很大程度上被发现于抗原呈递细胞(APC)，并且可以在活化的B细胞、树突细胞(DC)、朗格汉斯细胞、浆细胞DC、和巨噬细胞上被诱导(同前)。其他细胞，包括活化的T细胞、NK细胞、肥大细胞、内皮细胞和平滑肌细胞可以在响应于炎性细胞因子(同前)中表达OX40L。OX40L特异性结合OX40受体。人蛋白质被描述于PCT公开号WO 95/21915中。小鼠OX40L被描述于美国专利号5,457,035中。OX40L表达于细胞的表面上，并包括细胞内、跨膜和细胞外受体结合域。OX40L的功能活性可溶形式可以通过缺失细胞内结构域和跨膜结构域来产生，如例如在美国专利号5,457,035和6,312,700、以及WO 95/21915中所描述，其披露内容出于所有目的结合在此。OX40L的功能性活性形式是保留特异性结合OX40的能力的形式，即具有OX40“受体结合域”的形式。确定OX40L分子或衍生物特异性结合OX40的能力的方法在下面讨论。制造和使用OX40L及其衍生物(例如，包括OX40结合域的衍生物)的方法描述于WO 95/21915，其还描述了包含连接到其他肽的OX40L的可溶形式的蛋白，例如，人免疫球蛋白(“Ig”)Fc区，该蛋白可以被产生来促进OX40配体从培养的细胞中纯化，或被产生来提高该分子在体内给予至哺乳动物后的稳定性(也参见，美国专利号5,457,035和PCT披露号WP 2006/121810，这两个专利都通过引用以其全文结合在此)。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物,”是指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或宠物动物如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。
如在此所用，诸如“将受益于治疗的受试者”和“需要治疗的动物”的短语包括将受益于给予人源化抗OX40抗体的受试者，诸如哺乳动物受试者。此类抗体可用于例如诊断程序和/或用于治疗或预防疾病，例如癌症。
人源化抗OX40抗体及其抗原结合片段
本披露涉及特异性地结合OX40的抗体，例如人源化抗体。在某些方面中，可以分离如在此提供的一种抗体或其片段。在某些方面中，如在此提供的一种抗体或其片段可以是基本上纯的。在某些方面中，如在此提供的一种抗体或其片段可以是非天然存在的。
在某些方面中，本披露提供一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含OX40mAb5、OX40mAb8、OX40mAb10、OX40mAb11、OX40mAb12、OX40mAb13、OX40mAb14、OX40mAb15、OX40mAb16、OX40mAb17、OX40mAb18、OX40mAb19、OX40mAb20、OX40mAb21、OX40mAb22、OX40mAb23、OX40mAb24、OX40mAb25、OX40mAb25a、OX40mAb26、OX40mAb27、OX40mAb28、OX40mAb29、OX40mAb30、OX40mAb31、OX40mAb32、或OX40mAb37的VH和VL。在某些方面中，本披露提供一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含OX40mAb5、OX40mAb8、OX40mAb10、OX40mAb11、OX40mAb12、OX40mAb13、OX40mAb14、OX40mAb15、OX40mAb16、OX40mAb17、OX40mAb18、OX40mAb19、OX40mAb20、OX40mAb21、OX40mAb22、OX40mAb23、OX40mAb24、OX40mAb25、OX40mAb25a、OX40mAb26、OX40mAb27、OX40mAb28、OX40mAb29、OX40mAb30、OX40mAb31、或OX40mAb32的重链和轻链。
在某些方面中，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的氨基酸序列。
在某些方面中，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32。
本披露进一步提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与以下各项一致或除了在这些VH-CDR中的一个或多个中的八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个单个氨基酸取代、缺失或插入外与以下各项一致的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO:8，VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，以及VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQID NO:26或SEQ ID NO:27。
本披露进一步提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含具有下式的氨基酸序列：
HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，
其中HFW1是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，HCDR1是SEQ ID NO:8，HFW2是SEQ ID NO:9，HCDR2是SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，HFW3是SEQ ID NO:17、HCDR3是SEQID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27，并且HFW4是SEQ ID NO:28。在某些方面中，HFW2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13。在某些方面中，HFW3的氨基酸序列是SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:24。
此外，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、或SEQ ID NO:67至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致的氨基酸序列。
在一个方面中，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，并且该VH包含氨基酸序列SEQ IDNO:59。
如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段除了一个VH和一个VL之外还可以包含一个重链恒定区或其片段。在某些方面中，该重链恒定区是一个人重链恒定区，例如人IgG恒定区，例如人IgG1恒定区或人IgG4恒定区。如在此别处所描述，在某些方面中，一个重链恒定区或其片段(例如人IgG恒定区或其片段)可以包含相对于一个野生型IgG恒定区的一个或多个氨基酸取代，其中修饰的IgG相对于一个野生型IgG恒定区具有一种或多种令人希望的性质。例如，如在此别处所描述，该人IgG恒定区可以是一个IgG4P恒定区或一个IgG1-TM恒定区。
如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段除了一个VH和一个VL以及任选地一个重链恒定区或其片段外，还可以包含一个轻链恒定区或其片段。在某些方面中，该轻链恒定区是一个κ或λ轻链恒定区，例如人κ恒定区或人λ恒定区。在一个具体方面中，该轻链恒定区是一个人κ恒定区。
在某些方面中，本披露提供一种包含抗体重链或其片段和抗体轻链或其片段的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71，并且该轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。
如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以是例如单克隆的、多克隆的、重组的、多特异性的或其任何组合。一种人源化抗OX40抗体或抗原结合片段可以是例如Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段、sc(Fv)2片段、Fd片段、二硫键连接的Fv片段、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3片段、四抗体、三抗体、双抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab片段、mAb2片段、(scFv)2片段或scFv-Fc片段。
在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合人、食蟹猴或恒河猴OX40。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合至原代人、食蟹猴或恒河猴CD4 T细胞或Jurkat细胞的表面。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合如在来自人、食蟹猴、恒河猴或其任何组合的活化的CD4+或CD8+T细胞上表达的OX40。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合如在来自人、食蟹猴、恒河猴或其任何组合的初级活化的CD4+T细胞上表达的OX40。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段不结合鼠或大鼠OX40。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段不与相关的TNFRSF蛋白(例如，以下实例3中的表3-1中列出的TNFRSF蛋白)交叉反应。
如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以包含一个或多个保守氨基酸变化，例如，多达十个保守性变化(例如，两个取代的氨基酸、三个取代的氨基酸、四个取代的氨基酸、或五个取代的氨基酸等)，只要可以在该多肽中进行这些变化而不改变该人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的生化功能，例如，特异性地结合OX40、从而触发信号传导。例如，可以在如在此提供的一种抗体的一个受体结合结构域中进行一个或多个保守性变化而不阻断其结合OX40的能力。
另外，一个多肽结构域的一部分可以被缺失而不损害或消除它的全部功能。同样地，如下所述，可以在多肽链中进行插入或添加，例如，添加表位标签，而不损害或消除其功能。可以进行的、不实质性损害多肽的一个或多个功能的其他修饰包括，例如，在体内或体外结合了不常见氨基酸的化学和生化修饰。这样的修饰包括，例如，乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、标记(例如，使用放射性核素)、以及各种酶修饰，如本领域的普通技术人员将很容易理解的。各种用于标记多肽的方法和对于这样的目的有用的标记在本领域中是公知的，并且包括放射性同位素如32P、荧光团、化学发光剂、酶和抗配体。
如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以进一步包含一种异源剂，例如稳定剂、免疫应答调节剂或可检测的试剂。在某些方面中，异源剂包括经由肽键融合到多肽亚基的一个或多个另外的多肽序列，例如信号序列(例如，分泌信号序列)、接头序列、氨基酸标签或标记、或有助于纯化的肽或多肽序列。在某些方面中，异源多肽可以与重链或轻链抗体亚基或其片段的N末端或C末端融合，只要维持这些结构域的功能特征即可。
在某些方面中，异源剂可以与如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段化学轭合。可以化学轭合至多肽亚基的示例性异源剂包括但不限于，连接子、药物、毒素、显像剂、放射性化合物、有机和无机聚合物、以及能够提供不为多肽亚基本身所提供的希望的活性的任何其他组合物。具体的试剂包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒性剂、放射性核素、显像剂、生物素。
在某些方面中，本披露提供了待用作对照或研究工具的某些抗OX40抗体。例如，本披露提供一种如上所述的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH和VL分别与鼠IgG1重链和鼠κ轻链融合。这种“反向嵌合体”适用于恒河猴中的体内表征。在另一个实例中，如在此提供的人源化抗OX40抗体上的VH区可以连接至具有改变的效应子功能的各种重链恒定区，例如在此别处描述的人IgG4P或人IgG1TM。
如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合如在来自人、食蟹猴、恒河猴或其任何组合初级活化的T细胞(例如初级火化的CD4+T细胞、初级活化的CD8+T细胞和/或调控性T细胞)上表达的OX40。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段(例如，OX40mAb24)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约0.01pM至约1nM，例如，约1pM至约500pM，例如，约100pM至约400pM，例如，约250pM至约370pM，所有均如通过流式细胞术所测量。例如，一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约0.1pM、约0.5pM、约1pM、约10pM、约50pM、约100pM、约150pM、约200pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约370pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、约500pM、约550pM、约600pM、约650pM、约700pM、约750pM、或约1nM，所有均如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约312pM。结合亲和力可通过许多不同的方法和/或仪器进行测量，相对结合亲和力可以依赖于方法或仪器而变化，如本领域的技术人员或普通技术人员将很好地理解的。
如在此提供一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以占据和交联在细胞(例如，初级活化的人CD4+T细胞)表面上的一些或全部OX40分子。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，并且能够在约0.01pM至约1nM，例如，约0.1pM至约500pM，例如，约1pM至约200pM，例如，约10pM至约100pM，例如，约50pM至约100pM，例如，约63pM至约93pM，例如，约1pM、约10pM、约20pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约78pM、约80pM、约90pM、约100pM、或约150pM的浓度下实现在初级活化的人CD4+T细胞上的20％受体占有率(EC20)，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以在约78pM的浓度下实现在初级活化的人CD4+T细胞上的20％受体占有率(EC20)，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，并且能够在约0.01pM至约1nM，例如，约1pM至约500pM，例如，约100pM至约400pM，例如约250pM至约370pM，例如，约100pM、约150pM、约200pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约370pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、或约500pM的浓度下实现在初级活化的人CD4+T细胞上的50％受体占有率(EC50)，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以在约312pM的浓度下实现在初级活化的人CD4+T细胞上的50％受体占有率(EC50)，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，并且能够在约100pM至约100nM，例如，约500pM至约10nM，例如，约1nM至约500nM，例如，约2nM至约4nM，例如，约1nM、约2nM、约3nM、约4nM、或约5nM的浓度下实现在初级活化的人CD4+T细胞上的90％受体占有率(EC90)，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以在约2290pM至约3330pM，例如，约2810pM的浓度下实现在初级活化的人CD4+T细胞上的90％受体占有率(EC90)，如通过流式细胞术所测量。
在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在过度表达OX40的Jurkat细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约250pM至约600pM，例如，约424pM，如通过流式细胞术所测量。
在某些方面中，一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在过度表达OX40的Jurkat细胞上表达的人OX40，并且可以在约60pM至约150pM的浓度下实现EC20，在约250pM至约600pM的浓度下实现EC50，以及在约2260至约4390pM的浓度下实现EC90，如通过流式细胞术所测量。在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在过度表达OX40的Jurkat细胞上表达的人OX40，并且可以在约106pM的浓度下实现EC20，在约424pM的浓度下实现EC50，以及在约3820pM的浓度下实现EC90，如通过流式细胞术所测量。
在另一个实例中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的食蟹猴OX40，结合亲和力为约340pM至约820pM，例如，约580pM，如通过流式细胞术所测量。在另一个实例中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以结合至在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40，结合亲和力为约130pM至约600pM，例如，约370pM，如通过流式细胞术所测量。
在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以在基于平板的测定中诱导活化的CD4+T细胞的剂量依赖性增殖。例如，在体外测定中，使用如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段(例如，OX40mAb24)，在初级活化的人CD4+T细胞中在约14pM至约28pM(例如，约21pM)的抗体浓度下能够实现20％最大增殖应答(EC20)，在初级活化的人CD4+T细胞中在约0.3pM至约130pM(例如，约28pM)的抗体浓度下能够实现50％最大增殖应答(EC50)，并且在初级活化的人CD4+T细胞中在约50pM至约90pM(例如，约72pM)的抗体浓度下能够实现90％最大增殖应答(EC90)，所有如通过流式细胞术所测量。
在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以诱导来自活化的CD4+T细胞，例如人初级活化的CD4+T细胞的剂量依赖性细胞因子释放。在某些方面中，释放的细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或其任何组合。在某些方面中，该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-13、或其任何组合。类似地，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段能够在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞中和在初级活化的恒河猴CD4+T细胞中实现CD4+T细胞增殖和细胞因子释放。
在另外的方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以在表达FcγR的细胞存在下活化表达OX40的T细胞中的NFκB途径。例如，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以在表达OX40的Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞中活化NFκB途径，这些Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞在响应于NFκB信号传导途径的刺激中产生荧光素酶。可替代地，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以在表达人OX40、食蟹猴OX40或恒河猴OX40的细胞中活化NFκB途径。
在又另一个方面中，当作为有效剂量向需要癌症治疗的受试者给予时，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以促进癌症治疗，例如通过减缓肿瘤生长、停止肿瘤生长、或减小现有肿瘤的大小。在某些方面中，可以在T细胞的存在下实现癌症治疗的促进。在某些方面中，当作为有效剂量向需要治疗的受试者给予时，与给予同种型匹配的对照抗体相比，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以使肿瘤生长减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％。
在又另外的方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以通过结合OX40来诱导活化的表达OX40的T细胞的增殖，并且同时触发针对表达OX40的T细胞，例如活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞和/或调控性T细胞的补体依赖性或抗体依赖性细胞毒性。此外，在某些方面中，如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以通过结合OX40来诱导表达OX40的T细胞(例如，活化的表达OX40的CD4+、CD8+T细胞和/或调控性T细胞)的增殖，并且同时结合C1q或触发表达OX40的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞和/或调控性T细胞)的NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性。
在某些方面中，本披露提供一种抗OX40抗体或其片段，其包含连接至鼠重链恒定区的人源化VH和连接至鼠轻链恒定区的人源化VL，其中该重链包含SEQ ID NO:81，并且该轻链包含SEQ ID NO:83。在某些方面中，该重链恒定区可以是例如，鼠IgG1恒定区。在某些方面中，该轻链恒定区可以是例如，鼠κ恒定区。
在某些方面中，本披露提供一种包含大鼠VH和大鼠VL的大鼠抗小鼠OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，并且该VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:88。在某些方面中，该抗体或其片段进一步包含与VL的C末端融合的轻链恒定区或其片段。该轻链恒定区可以是例如，鼠κ恒定区。在某些方面中，该抗体或其片段进一步包含与VH的C末端融合的重链恒定区或其片段。该重链恒定区可以是例如，鼠IgG2a恒定区。在某些方面中，该大鼠抗小鼠OX40抗体包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:86和轻链氨基酸序列SEQ IDNO:89。在某些方面中，如在此提供的大鼠抗小鼠OX40抗体或其片段可以特异性地结合小鼠OX40。在某些方面中，向小鼠给予有效剂量的如在此提供的一种大鼠抗小鼠OX40抗体或其片段可以抑制小鼠中的小鼠癌细胞系生长。
在某些方面中，如在此提供的大鼠抗小鼠OX40抗体片段可以是例如，Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段或sc(Fv)2片段或其任何组合。
编码人源化抗OX40抗体、片段或亚基的多核苷酸
本披露提供包含编码人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的核酸序列的多核苷酸。例如，本披露提供一种多核苷酸、或两种或更多种多核苷酸，该多核苷酸或这些多核苷酸包含编码人源化抗OX40抗体或人源化抗OX40抗体的亚基或编码这种抗体的抗原结合片段的核酸序列。本披露的多核苷酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA(例如，修饰的基因组DNA)、以及合成DNA；并且如果单链可以是编码链或非编码(反义)链，那么DNA可以是双链或单链的。
在某些方面中，多核苷酸可以是分离的。在某些方面中，多核苷酸可以是基本上纯的。在某些方面中，多核苷酸可以是非天然存在的。在某些方面中，多核苷酸可以是cDNA或源自cDNA。在某些方面中，多核苷酸可以是重组产生的。在某些实施例中，多核苷酸可以包含在相同阅读框中与有助于例如多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸(例如，充当用于控制多肽从细胞转运的分泌序列的前导序列)融合的成熟多肽的编码序列。具有前导序列的多肽是前蛋白质并且可以使得前导序列被宿主细胞裂解以形成成熟形式的多肽。
在某些方面中，本披露提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段、或如在此提供的一种人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的多肽亚基的核酸。
还提供包含含有一个或少数个缺失、添加和/或取代的核酸序列的多核苷酸。这样的改变可以是连续的，或者可以分布在该核酸的不同位置。基本上相同的核酸序列可以，例如，具有1个、或2个、或3个、或4个、或甚至更多的核苷酸缺失、添加和/或取代。在某些方面中，一个或更多个缺失、添加和/或取代不改变由多核苷酸序列编码的阅读框，使得修饰的(“突变体”)但基本上相同的多肽经核酸的表达而产生。
在某些方面中，本披露提供一种包含编码抗体VL的核酸的分离的多核苷酸，其中该VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的氨基酸序列。在某些方面中，该多核苷酸编码抗体轻链并且包含与参考核酸序列SEQ ID NO:31至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致的核苷酸序列。
在某些方面中，本披露提供一种包含编码抗体VL的核酸的分离的多核苷酸，其中该VL包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32。
本披露进一步提供一种包含编码抗体VH的核酸的分离的多核苷酸，其中该VH包含与以下各项一致或除了在这些VH-CDR中的一个或多个中的八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个单个氨基酸取代、缺失或插入外与以下各项一致的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO:8，VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQID NO:15或SEQ ID NO:16，以及VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27。
本披露进一步提供一种包含编码抗体VH的核酸的分离的多核苷酸，其中该VH包含具有下式的氨基酸序列：
HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，
其中HFW1是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，HCDR1是SEQ ID NO:8，HFW2是SEQ ID NO:9，HCDR2是SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，HFW3是SEQ ID NO:17、HCDR3是SEQID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27，并且HFW4是SEQ ID NO:28。在某些方面中，HFW2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13。在某些方面中，HFW3的氨基酸序列是SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:24。
此外，本披露提供一种包含编码抗体VH的核酸的分离的多核苷酸，其中该VH包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:65、或SEQ ID NO:67至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致的氨基酸序列。在某些方面中，该多核苷酸包含与参考核酸序列SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、或SEQ ID NO:68至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致的核苷酸序列。
在某些方面中，本披露提供一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:60的核酸、SEQ IDNO:31的核酸、SEQ ID NO:72的核酸或其任何组合。
进一步提供一种包含如上所述的多核苷酸的载体。适合的载体在此其他地方描述，并且是本领域的普通技术人员已知的。
在某些方面中，本披露提供一种包含如上所述的多核苷酸或载体、任选地进一步包含一种或多种载体、稀释剂、赋形剂或其他添加剂的组合物，例如药物组合物。
在某些方面中，本披露提供一种多核苷酸组合物，其包含：包含编码VH的核酸的多核苷酸、以及包含编码VL的核酸的多核苷酸。根据该方面，该VL和VH一起可以包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致的VL氨基酸序列，以及VH，该VH包含：(a)与以下各项一致或除了在这些VH-CDR中的一个或多个中的八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个单个氨基酸取代、缺失或插入外与以下各项一致的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO:8，VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，以及VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27；(b)具有下式的氨基酸序列：
HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，
其中HFW1是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，HCDR1是SEQ ID NO:8，HFW2是SEQ ID NO:9，HCDR2是SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，HFW3是SEQ ID NO:17、HCDR3是SEQID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27，并且HFW4是SEQ ID NO:28；或(c)与参考氨基酸序列SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、或SEQID NO:67至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致的氨基酸序列。对于VH(b)，HFW2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13；和/或HFW3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:24。
在如上所述的多核苷酸组合物中，包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸可以存在于单个载体中，或可以在单独的非相同载体上。因此，本披露提供一种或多种包含上述多核苷酸组合物的载体。
在一些情况下，如上所述的编码VH和VL的多核苷酸组合物可以编码能够特异性地结合OX40(例如人OX40、食蟹猴OX40、和/或恒河猴OX40)的人源化抗体或其抗原结合片段。
在某些方面中，本披露提供一种包含编码抗OX40抗体或其片段的核酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸包含连接至鼠重链恒定区的人源化VH和连接至鼠轻链恒定区的人源化VL，其中该重链包含SEQ ID NO:81，并且该轻链包含SEQ ID NO:83。在某些方面中，该重链恒定区可以是例如，鼠IgG1恒定区。在某些方面中，该轻链恒定区可以是例如，鼠κ恒定区。
在某些方面中，本披露提供一种包含编码大鼠抗小鼠OX40抗体或其抗原结合片段的核酸的分离的多核苷酸，其中该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:88。在某些方面中，该抗体或其片段进一步包含与VL的C末端融合的轻链恒定区或其片段。该轻链恒定区可以是例如，鼠κ恒定区。在某些方面中，该抗体或其片段进一步包含与VH的C末端融合的重链恒定区或其片段。该重链恒定区可以是例如，鼠IgG2a恒定区。在某些方面中，该大鼠抗小鼠OX40抗体包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:86和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:89。在某些方面中，如在此提供的大鼠抗小鼠OX40抗体或其片段可以特异性地结合小鼠OX40。在某些方面中，向小鼠给予有效剂量的如在此提供的一种大鼠抗小鼠OX40抗体或其片段可以抑制小鼠中的小鼠癌细胞系生长。
本披露进一步提供一种包含如上所述的多核苷酸、多核苷酸组合物或载体的宿主细胞，其中该宿主细胞在一些情况下可以表达特异性地结合OX40(例如，人OX40、食蟹猴OX40、或恒河猴OX40)的抗体或其抗原结合片段。这种宿主细胞可以用于制备如在此提供的抗体或其抗原结合片段的方法中，该方法包括(a)培养该宿主细胞，以及(b)从该宿主细胞分离所表达的抗体或其抗原结合片段。
还提供多核苷酸变体。多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些方面中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失而不改变编码的多肽的特性或活性的改变。在一些方面中，多核苷酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。多核苷酸变体可以出于多种原因产生，例如，用于优化具体宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主(如大肠杆菌)的那些)。还提供包含在此描述的多核苷酸的载体和细胞。
在一些方面中，编码人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的DNA序列可以通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成来构建。此类寡核苷酸可以是基于所希望的多肽的氨基酸序列并且选择在宿主细胞(其中将产生感兴趣的重组多肽)中偏爱的那些密码子来设计。标准方法可以用于合成编码感兴趣的分离多肽的分离多核苷酸序列。例如，完整氨基酸序列可以用于构建反-翻译基因。此外，可以合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成并且然后连接几个编码所希望多肽部分的小寡核苷酸。单个寡核苷酸可以含有用于互补组装的5'或3'突出端。
一旦组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码特定的感兴趣的分离多肽的多核苷酸序列可以被插入至表达载体中并且可操作地连接至适于蛋白质在所需宿主中的表达的表达控制序列。可以通过例如核苷酸测序、限制酶切作图和/或在适合的宿主中表达生物活性多肽来确认适当的组装。为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，该基因可以可操作地连接至在所选择的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列或与这些转录和翻译表达控制序列缔合。
在某些方面中，重组表达载体用于扩增和表达编码人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，这些构建体具有编码人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的多肽链的合成或cDNA来源的DNA片段，可操作地连接至源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调控元件。在一个实例中，转录单位可以包含以下组件：(1)基因表达中具有调控作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译启动和终止序列，如以下详细描述的。此类调控元件可以包括用于控制转录的操纵子序列。可以另外并入例如由复制起点赋予的在宿主中复制的能力和有助于转化体的识别的选择基因。当DNA区域在功能上彼此相关时，将它们可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA表达为参与多肽的分泌的前体，那么该DNA可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子控制编码序列的转录，那么该启动子可操作地连接至该编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以允许翻译，那么该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。旨在用于在酵母表达系统中使用的结构元件包括前导序列，它使得宿主细胞可以将翻译的蛋白质分泌到胞外。可替代地，在无需前导或转运序列表达重组蛋白质的情况下，该蛋白质可以包括N-末端甲硫氨酸。该甲硫氨酸可以任选地随后从所表达的重组蛋白质裂解以提供终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以采用多种多样的表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9以及其衍生物，更广泛的宿主范围质粒，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。
用于表达人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的适合的宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核细胞、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下所述哺乳动物起源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。关于蛋白质产生(包括抗体产生)方法的其他信息可以在例如美国专利公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501、以及国际专利公开号WO 04009823中找到，这些专利各自通过引用以其全文结合在此。
还可以使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段。可以在哺乳动物细胞中进行重组蛋白质的表达，因为此类蛋白质总体上被正确地折叠，适当地修饰并且完全起作用。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、由格卢兹曼(Gluzman)(细胞23:175,1981)描述的猴肾细胞的COS-7系、以及包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞系的其他细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制原点、连接有待表达的基因的适合的启动子和增强子、以及其他5'或3'侧接非转录序列、以及5'或3'非翻译序列(诸如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点)，以及转录终止序列。用于产生昆虫细胞中的异源蛋白质的杆状病毒系统通过卢科和萨莫斯(Luckow和Summers)，生物技术(BioTechnology)6:47(1988)评价。
通过转化的宿主产生的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以根据任何适合的方法纯化。此类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感外壳序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可以附接至蛋白质，以便允许蛋白质通过合适的亲和柱后较容易地得到纯化。还可以使用诸如蛋白质水解、核磁共振和x射线结晶的此类技术来物理性表征分离的蛋白质。
例如，可以首先使用商业上可获得的蛋白浓缩过滤器例如艾美康恩(Amicon)或密理博皮里康恩(Millipore Pellicon)超滤单元浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液。浓缩步骤之后，浓缩物可以施加到适合的纯化基质。可替代地，可以采用阴离子交换树脂，例如具有侧接的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素或在蛋白质纯化中常用的其他类型。可替代地，可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不可溶基质。最终，可以使用采用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有侧接甲基或其他脂族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，以便进一步纯化人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段。还可以采用不同组合的一些或所有上述纯化步骤以便提供均质的重组蛋白。
在细菌培养物中产生的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以例如通过以下方法分离：最初从细胞沉淀提取，然后进行一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。可以采用高效液相层析(HPLC)进行最终纯化步骤。用于重组蛋白表达的微生物细胞可以通过任何常规方法来破坏，这些方法包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。
本领域已知的用于纯化抗体和其他蛋白质的方法还包括，例如，美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048、以及2009/0187005中所描述的那些，这些专利各自通过引用以其全部内容结合在此。
药物组合物和给药方法
制备和给予如在此提供的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段至有需要的受试者，例如，以便增强在癌症患者中的免疫应答的方法，例如，以便抑制或减少肿瘤生长的方法，是本领域的技术人员熟知的或可以容易地确定的。人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的给予途径可以是例如口服、胃肠外、吸入或局部给药。如在此所用的术语胃肠外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给药。虽然所有这些给药形式可清楚地考虑为适合的形式，但对于给予形式的另一个实例是用于注射、特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适合的药物组合物可以包含但不限于缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(如聚山梨酯)、稳定剂试剂(例如人白蛋白)等。在与在此的传授内容相容的其他方法中，如在此提供的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以直接递送至有害细胞群的位点，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。
在此提供的某些药物组合物可以按一种可接受的剂型(包括例如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液)来口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入来给予。使用苄醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规增溶剂或分散剂，这样的组合物可以作为盐水中的溶液来制备。
可以与载体材料组合以产生单一剂型人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的量将取决于所治疗的受试者以及特定的给药模式而变化。组合物可以作为单剂量，多剂量或经在输注中的确定时间段给予。还可以调节剂量方案以提供最佳的希望的响应(例如治疗的或预防的响应)。
“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段当被给予时引起对患有待治疗疾病或病状的治疗的积极治疗应答的量。
试剂盒
本披露进一步提供包括如在此描述的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段且可以用于执行在此描述的方法的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒包括在一个或多个容器中的至少一种纯化的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段。本领域的技术人员将易于认识到，所披露的人源化抗OX40抗体可以易于并入本领域中熟知的已建立的试剂盒形式之一。
免疫测定
可以通过本领域中已知的任何方法测定人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段的特异性和/或选择性结合。可以使用的免疫测定包括但不限于使用如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统，例如：蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、荧光集落测定(FFA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、仅举几个例子。此类测定是常规的并且在本领域是熟知的(参见，例如奥苏贝尔(Ausubel)等人编著，(1994)分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰威利父子公司，纽约(John Wiley&Sons,Inc.,NY))第1卷，其通过引用以其全文结合在此)。
适合于确定如在此提供的人源化抗OX40抗体的结合特性的方法和试剂是本领域中已知的和/或可商购的。设计用于此类动力学分析的设备和软件是可商购的(例如，软件，GE医疗集团；软件，Sapidyne仪器)。
免疫增强和治疗的方法
在抗原活化过程中或之后通过在活化的T细胞(例如活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)上接合OX40在受试者(例如，哺乳动物受试者，如人受试者)内增强抗原特异性免疫应答可以利用各种各样的方法来实现。选择的方法将主要取决于期望增强免疫应答的抗原的类型，并且可用的各种方法将在下面讨论。无论选择何种方法，可以向受试者(例如人受试者)给予人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，以使得T细胞被抗原引发过程中或之后不久它被呈递至受试者的T细胞。
在某些方面中，本披露提供一种促进活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)的存活或增殖的方法，该方法包括使这些活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)与人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段在人源化抗OX40抗体能够特异性地结合T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)表面上的OX40的条件下接触。在某些方面中，该接触是体外的。在某些方面中，该接触是体内的，例如，经由向需要治疗的受试者给予有效剂量的人源化抗OX40抗体。在某些方面中，该接触与T细胞活化(例如，抗原活化)同时发生，在某些方面中，该接触在T细胞活化后发生。
在其他方面中，本披露提供一种诱导从活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)释放细胞因子的方法，该方法包括使这些活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)与如在此提供的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段接触，其中该人源化抗OX40抗体能够特异性地结合这些活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)表面上的OX40。在某些方面中，该接触是体外的。在某些方面中，该接触是体内的，例如，经由向需要治疗的受试者给予有效剂量的人源化抗OX40抗体。在某些方面中，该接触与T细胞激活(例如，抗原激活)同时发生，在某些方面中，该接触在T细胞激活后发生。在某些方面中，该细胞因子可以是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它们的任意组合。在某些方面中，该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-13、或其任何组合。
在某些方面中，活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)是人T细胞、食蟹猴T细胞、恒河猴T细胞、或其组合。
本披露进一步提供一种促进T细胞活化的方法，该方法包括使T细胞与如在此提供的人源化抗OX40抗体接触，其中该人源化抗OX40抗体能够特异性地结合T细胞表面上的OX40。在某些方面中，接触在抗原(例如，肿瘤抗原)的存在下发生。在某些方面中，该方法进一步包括使人源化抗OX40抗体的Fc结构域与表达FcγR的细胞相互作用，该表达FcγR的细胞是例如：B细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞或浆细胞树突状细胞、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞、NK细胞、活化的T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、肥大细胞、来自原发人肿瘤或肿瘤引流或非引流淋巴结的CD45+细胞、来自其他二级或三级淋巴结构的CD45+细胞，或其组合。在某些方面中，T细胞活化可以通过NFκB信号传导途径的刺激进行测量。在某些方面中，该接触是体外的。在某些方面中，该接触是体内的，例如，经由向需要治疗的受试者给予有效剂量的人源化抗OX40抗体。
本披露进一步提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段、或包含该人源化抗OX40抗体的组合物或配制品。在某些方面中，该癌症是实体瘤。根据这种方法，给予人源化抗OX40抗体或组合物可以抑制肿瘤生长；可以促进肿瘤缩小、或两者。在某些方面中，在T细胞存在下实现肿瘤生长抑制。
术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性”和“恶性”是指或描述在哺乳动物中典型地是特征为不受控制的细胞生长的生理病状。癌症的实例包括但不限于上皮癌，包括腺癌，淋巴瘤，胚细胞瘤，黑素瘤，肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(诸如肝癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介导的乳腺癌，参见例如，英尼斯(Innes)等人(2006)英国癌症杂志(Br.J.Cancer)94:1057-1065)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、各种类型的头颈癌(包括但不限于鳞状细胞癌)、以及粘液性起源的癌症(诸如粘液性卵巢癌)、胆管癌(肝)以及肾乳头状癌。
本披露进一步提供一种预防或治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段、包含该人源化抗OX40抗体的组合物或配制品、或如在此所述的多核苷酸、载体或宿主细胞。
用于治疗癌症的组合物的有效剂量取决于许多不同因素而变化，这些因素包括给予方式、靶标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所给予的其他药剂，以及治疗是预防性还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定，以最优化安全性和功效。
本披露的组合物可以通过任何合适方法来给予，例如肠胃外、心室内、口服、通过吸入喷雾剂、局部、直肠、经鼻、口腔、经阴道或经由植入的储槽。如在此使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病变内以及颅内注射或输注技术。
本披露进一步提供一种增强受试者的免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段、或包含该人源化抗OX40抗体的组合物或配制品。
待治疗的受试者可以是需要治疗的任何动物，例如，哺乳动物，在某些方面中，受试者是人受试者。
在其最简单的形式中，待给予至受试者的制剂是以常规剂型给予的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其可以与如在此别处描述的药用赋形剂、载体或稀释剂组合。
人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段可以通过在此别处描述的任何适合的方法给予，例如经由IV输注。在某些方面中，可以将人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段引入到肿瘤中或引入肿瘤细胞附近。
所有类型的肿瘤都潜在适合于通过这个方法来治疗，这些肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌和膀胱癌、以及黑色素瘤、肉瘤和淋巴瘤。
在由抗原引发的过程中或之后不久，OX40受体接合在活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)上导致活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)对抗原的应答增加。在本披露的上下文中，术语“接合”是指结合并刺激由OX40受体介导的至少一种活性。例如，OX40受体在抗原特异性活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞)上的接合导致与响应于单独的抗原相比增加的T细胞增殖，以及增加的细胞因子产生。对抗原的增加的应答可以比在没有OX40受体接合下维持实质上更长的一段时间。因此，经由OX40受体的刺激通过提高抗原(例如，肿瘤抗原)的T细胞识别来增强抗原特异性免疫应答。
当在由抗原引发T细胞的过程中或之后不久向受试者给予时，OX40激动剂可在受试者(如人受试者)中增强抗原特异性免疫应答。OX40激动剂包括OX40配体(“OX40L”)，如可溶性OX40L融合蛋白和抗OX40抗体或其片段。一个具体实例是特异性地结合OX40、从而触发信号传导的人源化抗体。人源化抗OX40单克隆抗体的集合由本披露提供。还描述了包含编码此类抗体的多核苷酸序列的核酸。本披露还提供用于在受试者中使用人源化抗OX40单克隆抗体增强抗原特异性免疫应答的方法。
OX40表位
与抗体的抗原结合结构域特异性地相互作用的靶分子(例如，OX40多肽)的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶分子(例如，多肽)可以是单一表位，但是典型地包含至少两个表位，并且取决于抗原的大小、构象以及类型，可以包含任何数目的表位。
可以被靶多肽上的抗体结合的表位的最小大小被认为是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位可以含有至少七个、至少九个、至少十个、或至少约15个或更多个氨基酸。由于抗体可以识别呈其三级形式的多肽抗原，所以包含表位的氨基酸不必是连续的。如在此提供的OX40(例如，人OX40)的表位可以包含OX40(例如，人OX40)的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约10至约30个连续或不连续的氨基酸。在某些方面中，如在此提供的OX40(例如，人OX40)的表位由100个或更少个氨基酸、75个或更少个氨基酸、50个或更少个氨基酸、40个或更少个氨基酸、35个或更少个氨基酸、30个或更少个氨基酸、25个或更少个氨基酸、20个或更少个氨基酸或15个或更少个氨基酸的肽组成，并且可以包含OX40(例如，人OX40)的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约10至约30个连续或不连续的氨基酸。另一方面，OX40(例如，如在此提供的人OX40)的表位可以包含OX40(例如，人OX40)的不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过15个、不超过20个、不超过25个连续或非连续的氨基酸，或者可以由OX40(例如，人OX40)的约10至约30个之间的连续或非连续的氨基酸组成。
在某些方面中，如在此提供的抗OX40抗体或其片段结合OX40(例如，人OX40、恒河猴OX40、或食蟹猴OX40)的位于OX40的第三富含半胱氨酸的结构域(CRD3)内，例如在人OX40(SEQ ID NO:91)的氨基酸108至146内，或与SEQ ID NO:91的氨基酸108至146至少17％、至少75％、至少80％、至少85％、和至少90％、至少95％、或至少100％一致的多肽内的表位。“位于OX40的CRD3”内意指表位可以包含OX40的由CRD3区组成的区域的4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多、15个或更多个、或30个或更多个连续或非连续的氨基酸，例如SEQ ID NO:91的氨基酸108至146，或与SEQ ID NO:91的氨基酸108至146至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、和至少90％、至少95％、或至少100％一致的多肽。
在某些方面中，结合在此提供的抗体的OX40CRD3肽保留在对应于SEQ ID NOL 91的氨基酸116的位置处的亮氨酸和在对应于SEQ ID NO:91的氨基酸126的位置处的丙氨酸。例如，如在此提供的某些抗OX40抗体或其片段结合人OX40，但不结合小鼠或大鼠OX40。小鼠OX40的CRD3区从SEQ ID NO:92的约氨基酸104延伸至约氨基酸144。小鼠OX40(SEQ ID NO:92)的氨基酸Q113对应于人OX40(SEQ ID NO:91)的氨基酸L116，并且小鼠OX40(SEQ ID NO:92)的氨基酸V124对应于人OX40(SEQ ID NO:91)的氨基酸A126。如实例10中所示，如在此提供的OX40抗体(例如，OX40mAb24)可以与小鼠OX40的包含SEQ ID NO:92(除了Q113L突变和V124A之外)的变体结合。
在某些方面中，提供一种分离的肽，该肽由特异性地结合如在此提供的OX40抗体(例如，OX40mAb24)的表位组成或包含该表位。在某些方面中，该肽由100个或更少个氨基酸、75个或更少个氨基酸、50个或更少个氨基酸、40个或更少个氨基酸、35个或更少个氨基酸、30个或更少个氨基酸、25个或更少个氨基酸、20个或更少个氨基酸、或15个或更少个氨基酸组成，并且包含OX40的CRD3的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约10至约30个之间的连续或非连续的氨基酸，例如与SEQ ID NO:91的氨基酸108至146至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、和至少90％、至少95％、或至少100％一致的OX40区域。在某些方面中，该肽保留在对应于SEQ IDNO:91的氨基酸116的位置处的亮氨酸和在对应于SEQ ID NO:91的氨基酸126的位置处的丙氨酸。
可以使用这种分离的肽，例如用于筛选特异性地结合OX40的结合分子的文库，或用作免疫原以在受试者动物中产生抗OX40抗体。
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除非另外指示，否则本披露采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，萨布鲁克(Sambrook)等人，编著(1989)分子克隆：实验手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)(第2版；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press))；萨布鲁克等人，编著(1992)分子克隆：实验手册，(冷泉港实验室，纽约)；D·N·格洛夫(Glover)编著，(1985)DNA克隆(DNA Cloning)，第I卷和第II卷；盖特(Gait)，编著(1984)寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)；穆利斯(Mullis)等人，美国专利号4,683,195；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)，编著(1984)核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)；黑姆斯和希金斯，编著(1984)转录与翻译(Transcription And Translation)；弗莱士尼(Freshney)(1987)动物细胞的培养(Culture Of Animal Cells)(艾伦·艾·利斯公司(Alan R.Liss,Inc.))；固定化细胞与酶(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社)(1986)；帕柏尔(Perbal)(1984)分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)；专题论文，酶学方法(MethodsIn Enzymology)(学术出版社公司，纽约)；米勒(Miller)和卡洛斯(Calos)编著(1987)哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)，(冷泉港实验室)；Wu(吴)等人，编著，酶学方法(Methods In Enzymology)，第154卷和第155卷；迈耶(Mayer)和沃克(Walker)，编著(1987)细胞与分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)(学术出版社，伦敦)；韦尔(Weir)和布莱克韦尔(Blackwell)，编著(1986)实验免疫学手册(Handbook OfExperimental Immunology)，第I-IV卷；操纵小鼠胚胎(Manipulating the MouseEmbryo)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1986)；以及奥苏贝尔(Ausubel)等人(1989)当代分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰&威利父子公司，巴尔的摩(Baltimore)，马里兰州(Md.))。
在博雷贝克(Borrebaeck)编辑(1995)抗体工程(Antibody Engineering)(第二版；牛津大学出版社)中，提出了抗体工程的普遍原理。蛋白质工程化的一般原理列举在里克伍德(wood)等人，编著(1995)蛋白质工程化，实用方法(Protein Engineering,APractical Approach)(牛津大学出版社的IRL出版社(IRL Press at Oxford UnivPress)，牛津，英国)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理列举在以下中：尼索诺夫(Nisonoff)(1984)分子免疫学(Molecular Immunology)(第2版；Sinauer出版社，桑德兰(Sunderland)，马萨诸塞州(Mass.))；和斯图尔德(Steward)(1984)抗体，其结构和功能(Antibodies,Their Structure and Function)(查普曼&霍尔出版社(Chapman andHall)，纽约，纽约州)。另外，本领域中已知并且没有确切描述的免疫学方面的标准方法通常根据如下参考文献中：当代免疫学实验技术(Current Protocols in Immunology)，约翰威利父子公司，纽约；斯蒂茨(Stites)等人，编著(1994)基础和临床免疫学(Basic andClinical Immunology)(第8版；阿普尔顿&朗格出版社(Appleton&Lange)，诺沃克(Norwalk)，康涅狄格州(Conn.))；以及米雪尔(Mishell)和施吉(Shiigi)(编著)(1980)细胞免疫学中的所选方法(Selected Methods in Cellular Immunology)(W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman and Co.)，纽约)。
列举免疫学的一般原理的标准参考工作包括当代免疫学实验技术，约翰威利父子公司，纽约；克莱因(Klein)(1982)J.，免疫学：自我-非自身辨别的科学(J.,Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination)(约翰威利父子公司，纽约)；肯尼特(Kennett)等人，编著(1980)单克隆抗体，杂交瘤：生物分析的一个新维度(MonoclonalAntibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses)(普莱南出版社(Plenum Press)，纽约)；坎贝尔(Campbell)(1984)“单克隆抗体技术(MonoclonalAntibody Technology)”，生物化学和分子生物学实验室技术(Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)，伯登(Burden)等人编著，(爱思唯尔(Elsevier)，阿姆斯特丹(Amsterdam))；戈尔兹比(Goldsby)等人，编著(2000)Kuby免疫性(第4版；H.弗里曼出版社(H.Freemand&Co.))；罗伊特(Roitt)等人(2001)免疫学(Immunology)(第6版；伦敦：莫斯比出版社(Mosby))；阿巴斯(Abbas)等人(2005)细胞与分子免疫学(Cellularand Molecular Immunology)(第5版；爱思唯尔健康科学部(Elsevier Health SciencesDivision))；科特曼(Kontermann)和迪贝尔(Dubel)(2001)抗体工程化(AntibodyEngineering)(施普林格维拉格出版社(Springer Verlag))；萨布鲁克和拉塞尔(Russell)(2001)分子克隆：实验室手册(冷泉港出版社)；勒温(Lewin)(2003)基因VIII(普伦蒂斯·霍尔出版社(Prentice Hall)2003)；哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)(1988)抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港出版社)；迪芬巴赫(Dieffenbach)和德维克斯勒(Dveksler)(2003)PCR引物(冷泉港出版社)。
以上引用的所有参考文献，连同在此引用的所有参考文献通过引用以其全文结合在此。
通过说明而不是通过限制的方式提供以下实例。
实例
术语的缩写和定义如表2中所列举。
表2缩略词列表与术语定义
实例1：抗人OX40鼠MAb 9B12的人源化
通过将鼠mAb 9B12的CDR接枝到选定的人种系框架上来人源化鼠mAb 9B12。将鼠mAb 9B12的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列与公开NCBI数据库中可获得的人抗体种系序列进行比较。基于最高序列同源性鉴别人受体框架(FR)。当选择最佳受体框架时，考虑了几个标准，如可能影响结合的匹配残基(游标区中的残基、规范类残基、和VH/VL界面残基)以及免疫原性潜力(低种系频率)。通过为每个单独的框架区选择最同源的人免疫球蛋白种系节段，独立地针对VH和VL设计了最佳杂合人受体FR序列。将三种不同的种系受体序列组合形成人源化VH框架主链，同时为VL选择两种不同的种系受体序列。为VH链(9B12VH-hu)选择的完全人种系受体模板是IGVH4-34*09(FR 1)、VH4-39(FR 2)、VH6-1(FR3)、以及JH4(FR 4)的组合。VL(9B12VL-hu1)是O18(FR 1)、O18(FR 2)、L23(FR 3)、以及JK1(FR 4)的组合。鼠序列与人模板受体序列之间的框架同源性对于VH是大约72％，并且对于VL是大约77％。
鉴别可以影响或维持亲本CDR的功能构象并且与人种系序列不匹配的鼠框架残基，并且将这些鼠框架残基选择性地再次引入人受体FR以便最佳地保留9B12结合亲和力和功能性。在这种情况下，VH链中的小鼠FR残基27D、39K、47Y、48M、71R、78Y和91F以及VL链中的44V和68R在人模板中回复突变。将由卡巴特定义的CDR残基融合到VH和VL两者的设计的受体框架中以用于产生人源化抗体。通过GeneART(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(MA))合成两种人源化VH基因(9B12VH-hu和9B12VH-hu39K71R)和两种VL基因(9B12VL-hu1和9B12VL-hu2)，然后克隆到内部pOE IgG1表达载体中。
已经在基于T细胞的结合和增殖测定中产生并表征了一组人源化变体。含有几个框架氨基酸的人源化变体回复为重链可变区中的小鼠FR残基，与活化的CD4+T细胞上的OX40结合，与9B12具有可比较的亲和力和类似的效力(T细胞增殖)。与所有人源化VH变体配对的可变轻链编码完全人源化框架。为了降低免疫原性的风险，通过用相应的人残基置换非影响性小鼠残基，将VH人FR中的小鼠残基的数量进一步减少至3或4。为了除去潜在的序列负荷，将VH-CDR2中的NG脱酰胺位点、VH-CDR3中的RYD整联蛋白结合位点和DG异构化位点主动地独立地或组合地除去。为了避免由人IgG1 Fc效应子功能介导的ADCC，针对人源化前导mAb制备IgG4P和IgG1TM Fc变体。所得的IgG4P和IgG1TM变体表现出对OX40的与IgG1变体相同的结合活性，但显著降低的ADCC活性，这与鼠mAb 9B12最相似。总之，人源化变体表现出与亲本小鼠mAb 9B12可比较的细胞结合亲和力和体外效力。人源化VH变体(其全部与人源化VL配对)之间的氨基酸差异总结在图1中。
反向嵌合体被工程化用于在恒河猴中体内表征。简言之，将人源化mAb24的VH和VL接枝到鼠9B12的恒定重链和恒定轻链上。体外表征证明了与mAb24可比较的与人OX40结合的反向嵌合体的Fab部分。
实例2：OX40mAb24对在活化的人、非人灵长类动物、大鼠和小鼠T细胞表面上表达的天然OX40的结合亲和力和受体占有率
2.1 材料
在此实例中使用的材料在表2-1中列出。
表2-1 材料
在此实例中，进行了基于细胞的平衡结合测定来测量OX40mAb24与人、非人类灵长类动物、大鼠和小鼠T细胞的细胞表面上表达的OX40的结合的表观亲和力。另外，使用平衡结合测定来确定在活化的人CD4+T细胞上实现20％、50％、或90％人OX40受体占有率的OX40mAb24浓度。
还针对9B12(OX40mAb24所源自的鼠抗人OX40单克隆抗体)与在CD4+T细胞表面上表达的人和非人灵长类动物OX40的结合确定实现20％、50％或90％受体占有率所需的OX40mAb24浓度以用于比较OX40mAb24和9B12结合。
2.2 测定
2.2.1 OX40mAb24与原代人CD4+T细胞和表达OX40的Jurkat T细胞的结合
OX40mAb24与人OX40结合的表观平衡结合常数(Kd)和在平衡时结合20％、50％、或90％的细胞表面人OX40受体所需的浓度是从OX40mAb24与表达OX40的初级活化的人CD4+T细胞或过度表达OX40的人Jurkat T细胞的结合曲线计算的。同时进行类似的实验以评估9B12与这些细胞的结合，以用于与OX40mAb24值进行比较。
首先通过米迪缪尼供血者程序，使用RosetteSep CD4+T细胞富集试剂盒(干细胞技术公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省)和改进的制造商方案从自健康供体获得的肝素钠抗凝全血中分离原代人CD4+T细胞。
将原代人CD4+T细胞用2μg/mL PHA-L和20IU/mL rhIL-2培养48小时以活化T细胞并上调OX40。随后在OX40mAb24结合实验中使用>95％存活的活化的T细胞。所有供体代表独特个体；即不用来自同一供体的CD4+T细胞进行重复结合实验。
在结合实验之前，过度表达OX40的人Jurkat NFκB-荧光素酶克隆64细胞在完全RPMI+10％FBS中进行培养，但无需活化。
将OX40mAb24(10μg/mL)或9B12(10μg/mL)在17点2倍稀释系列内稀释。将OX40mAb24添加至100,000个细胞(活化的原代CD4+T细胞或过度表达OX40的人JurkatNFkB-荧光素酶克隆64细胞)/孔，并且在4℃下孵育1小时。对于背景结合减法，将细胞仅在第二抗体存在下孵育。对照R347人IgG1单克隆抗体和小鼠IgG1同种型克隆MOPC-21用于使用过度表达OX40的Jurkat T细胞的实验中以便分别证明OX40mAb24或9B12的OX40结合的特异性。在孵育后，将细胞用200μL冷(4℃)FACS缓冲液洗涤三次，并且与含有10μg/mL647标记的山羊抗人IgG第二抗体(用于结合OX40mAb24)或10μg/mL488标记的山羊抗小鼠IgG第二抗体(用于结合9B12)和5μg/mL碘化丙啶(PI)的100μL的FACS缓冲液(PBS+2％热灭活的新生小牛血清)一起孵育。在第二抗体孵育后，将细胞用洗涤，并且悬浮于100μL FACS缓冲液中用于如下文所描述在BD LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。
2.2.2 OX40mAb24与小鼠CD4+T细胞的结合
针对与在活化的原代CD4+T细胞上表达的小鼠OX40的结合研究了OX40mAb24。同时进行类似的实验以评估9B12与这些细胞的结合，以与OX40mAb24进行比较。根据以下方案，从收获的正常Balb/C小鼠脾脏中分离小鼠CD4+T细胞：
抵靠70μM尼龙过滤器将脾脏捣碎以释放脾细胞，并且用1mL完全培养基(RPMI-1640加10％FBS、1％抗生素/抗真菌溶液和55μMβ巯基乙醇[BME])冲洗过滤器。将脾细胞沉淀并且丢弃上清液。将沉淀物用5mL的IX红血细胞(RBC)裂解缓冲液处理，并且孵育以裂解RBC。在孵育时间结束时通过添加完全培养基来恢复渗透压。
将细胞沉淀，在美天旎MACS缓冲液(PBS pH 7.2+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+2mM乙二胺四乙酸[EDTA])中洗涤，并且丢弃上清液。将沉淀物悬浮在冷MACS缓冲液中，并且用Vi细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
根据制造商的说明书，使用美天旎加工试剂盒(圣地亚哥，加利福尼亚州)进行小鼠CD4+T细胞分离，并且将分离的细胞悬浮于完全培养基中。
将小鼠CD4+T细胞(在100μL完全培养基中150,000/孔)在各自涂有2μg/mL仓鼠抗小鼠CD3抗体和仓鼠抗小鼠CD28抗体的96孔平板中培养以活化T细胞并诱导OX40表达。将活化的CD4+T细胞从孵育平板中除去，并且将100,000个细胞转移至非组织培养处理的96孔圆底平板的每个孔以用于结合测定，并且用FACS缓冲液洗涤一次。用10μg/mL的OX40mAb24、9B12和大鼠抗小鼠OX40、克隆OX86(阳性对照)抗体进行结合，这些抗体各自在FACS缓冲液中3倍连续稀释以用于10点数据曲线。对于阴性对照，将10μg/mL R347人IgG1、MOPC-21小鼠IgG1或RTK2071大鼠IgG1稀释6倍以用于3点数据曲线。将含有OX40mAb24或抗体的FACS缓冲液(50μL)一式两份添加至CD4+T细胞并且孵育。在初次孵育后，将细胞用200μL的4℃FACS缓冲液洗涤，并且与50μL的含有10μg/mL488标记的山羊抗人第二抗体、10μg/mL488标记的山羊抗小鼠第二抗体或488标记的山羊抗大鼠第二抗体和5μg/mL PI的FACS缓冲液一起孵育。在第二抗体孵育后，将细胞用4℃FACS缓冲液(每次洗涤200μL)洗涤，并且悬浮于100μL FACS缓冲液中以用于如章节2.3中所描述在BDLSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。
2.2.3 OX40mAb24与大鼠CD4+T细胞的结合
针对与在活化的原代CD4+T细胞上表达的大鼠OX40的结合研究了OX40mAb24。同时用9B12进行类似的实验以允许与OX40mAb24进行比较。根据上述用于分离小鼠脾细胞的方案从新鲜收获的正常斯普瑞格-道利大鼠脾脏中分离大鼠CD4+细胞，除了根据制造商的说明书用R&D系统Magcellect试剂盒(明尼阿波利斯，明尼苏达州)进行大鼠CD4+T细胞分离。
将大鼠CD4+T细胞(1×106/mL完全培养基)在具有1μg/mL伴刀豆球蛋白A(Con A)和500IU/mL IL-2的T75细胞培养烧瓶中培养过夜以活化T细胞并且诱导OX40表达，并在孵育过夜。将活化的CD4+T细胞从烧瓶中除去，并且将100,000个细胞转移至非组织培养处理的96孔圆底平板的各孔用于结合测定，并且用FACS缓冲液洗涤。用在FACS缓冲液中连续稀释3倍以用于10点数据曲线的10μg/mL OX40mAb24、9B12或小鼠抗大鼠CD134、克隆OX40(阳性对照)抗体进行结合。对于阴性对照，将10μg/mL R347人IgG1或小鼠IgG1克隆MOPC-21连续稀释6倍以用于3点数据曲线。将100μL的OX40mAb24对照蛋白、9B12或克隆OX40抗体一式两份添加至CD4+T细胞并且孵育。在初次孵育后，将细胞用每次洗涤200μL的4℃FACS缓冲液洗涤，并且与100μL的含有10μg/mL488标记的山羊抗人、或488标记的山羊抗小鼠第二抗体和5μg/mL PI的FACS缓冲液一起孵育。在第二抗体孵育后，如章节2.3中所描述，将细胞处理以进行流式细胞术。
2.2.4 OX40mAb24与食蟹猴CD4+T细胞的结合
针对与在活化的原代CD4+T细胞上表达的食蟹猴(cyno)OX40的结合研究了OX40mAb24。同时用9B12进行类似的实验以允许与OX40mAb24值进行比较。根据以下方案，从来自全球灵长类(World Wide Primates)(迈阿密，佛罗里达州)的健康食蟹猴供体(N＝2)获得的肝素钠抗凝全血中分离食蟹猴CD4+T细胞：
将全血铺层于50mL锥形离心管中的30mL的60％Percoll上。将血液离心，并且外周血单核细胞(PBMC)在界面收集并用冷(4℃)美天旎MACS缓冲液洗涤，在1200RPM下进行10分钟。丢弃上清液，且将沉淀物用5mL的1X RBC裂解缓冲液处理，并且孵育。将完全培养基(RPMI，具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌剂)添加至沉淀物以在孵育时间结束时停止裂解过程。
将细胞沉淀并且用20mL的冷(4℃)美天旎MACS缓冲液洗涤。丢弃上清液，且将细胞沉淀物悬浮在冷(4℃)MACS缓冲液中，并用Vi细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
根据制造商的说明书，用美天旎非人灵长类试剂盒进行食蟹猴CD4+T细胞分离，然后如上所述将CD4+T细胞在Vi细胞计数器上计数并以1×106/mL悬浮在完全培养基中。
将食蟹猴CD4+T细胞(在完全培养基中1×106/ml)在具有2μg/mL PHA-L和20IU/mLIL-2的T75细胞培养烧瓶中孵育48小时以活化T细胞并诱导OX40表达。将活化的CD4+T细胞从烧瓶中除去，并且将100,000个细胞转移至非组织培养处理的96孔圆底平板的各孔用于结合测定，并且用200μL FACS缓冲液洗涤。用在FACS缓冲液中连续稀释4倍以用于11点数据曲线的10μg/mL OX40mAb24或9B12，或连续稀释6倍以用于3点数据曲线的R347人IgG1或小鼠IgG1克隆MOPC-21(阴性对照)两者进行结合。将OX40mAb24、9B12或对照蛋白质添加至CD4+T细胞并且孵育。在初次孵育后，将细胞用每次洗涤200μL的冷(4℃)FACS缓冲液洗涤，并且与100μL的含有10μg/mL488标记的山羊抗人第二抗体、或10μg/mL488标记的山羊抗小鼠第二抗体和5μg/mL PI的FACS缓冲液一起孵育。在第二抗体孵育后，如章节2.3中所描述，将细胞处理以进行流式细胞术。
2.2.5 OX40mAb24与恒河猴CD4+T细胞的结合
针对与在活化的原代CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40的结合研究了OX40mAb24。同时用9B12进行类似的实验以允许与OX40mAb24值进行比较。根据以下方案，从来自全球灵长类(迈阿密，佛罗里达州)的健康恒河猴供体(N＝2)获得的肝素钠抗凝全血中分离恒河猴CD4+T细胞：
将肝素化恒河猴血液(20mL)用PBS以1:1稀释，并且铺层于50ml锥形离心管中的15ml 95％LSM上。将血液离心，PBMC在界面收集并用冷的美天旎MACS缓冲液洗涤两次，在400xg下进行30分钟。丢弃上清液，且将沉淀物用5mL的IX RBC裂解缓冲液处理，并且孵育。将完全培养基(RPMI，具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌剂)添加至沉淀物以在孵育时间结束时停止裂解过程。将细胞沉淀并且用20mL的冷美天旎MACS缓冲液洗涤。丢弃上清液，且将沉淀物悬浮在冷的MACS缓冲液中，并用Vi细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。根据制造商的说明书，用美天旎非人灵长类试剂盒(圣地亚哥，加利福尼亚州)进行恒河猴CD4+T细胞分离。
将恒河猴CD4+T细胞(在完全培养基中1×106/mL)在具有5μg/mL Con-A和1000IU/mL IL-2的T75细胞培养烧瓶中培养48小时以活化T细胞并诱导OX40表达。用在FACS缓冲液中连续稀释3倍以用于10点(实验1)或12点数据曲线(实验2)的10μg/mL OX40mAb24和9B12、以及稀释6倍以用于2个数据点(实验1)或4个数据点(实验2)的10μg/mL人和小鼠同种型对照进行与100,000个活化的恒河猴CD4+T细胞的结合。如上文针对食蟹猴CD4+T细胞所描述进行488标记的山羊抗人第二抗体和488标记的山羊抗小鼠第二抗体结合，并且如章节2.3中所描述进行流式细胞术。
2.3 流式细胞术
使用LSRII流式细胞仪(BD公司(Becton-Dickinson)，圣何塞，加利福尼亚州)进行在章节2.1中描述的测定中的流式细胞术。流式乔细胞术分析软件(树星(TreeStar)，阿什兰，俄勒冈州)用于确定与细胞结合的OX40mAb24、9B12和对照蛋白质。制备含有表达OX40的细胞(未染色的，无PI或第二抗体)、仅结合于488或647标记的第二抗体试剂的细胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mL PI处理的细胞的孔，以用于单染色补偿对照。在荧光补偿之后，对活的(PI阴性)细胞进行门控并确定第二抗体的平均荧光强度(MFI)。
2.4 计算
2.4.1 表观平衡解离常数的确定(Kd)
用于Windows的GraphPad Prism 5.01版(GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥，www.graphpad.com)用于绘制OX40mAb24结合对蛋白质浓度(M)的MFI，以便产生从其中确定表观Kd的结合曲线。为了确定OX40mAb24和9B12与人、小鼠、大鼠、食蟹猴或恒河猴OX40的表观Kd，采用一个位点(特异性)结合的非线性回归(曲线拟合)方程。
2.4.2 20％、50％、和90％受体占有值的确定
与其受体结合的单克隆抗体(mAb)的量可以从以下结合关系估计：
等式1：
对应抗体的结合解离常数(Kd)由以下表示：
等式2：
其中[A]和[B]分别表示游离受体和抗体的浓度。
最后，与抗体结合的所有受体分子的分数占有率分数(F)可以通过以下计算：
等式3：
方程2的形成和替换成等式3产生：
等式4：
简化等式4产生：
等式5：
因此，在平衡条件下，如果对应抗体的游离mAb浓度和解离常数Kd是已知的，则可以计算与该抗体结合的所有受体分子的分数。
用于计算表示为F的分数受体占有率所需的抗体浓度的此公式的推导产生以下公式：
等式6：
[B]＝F*Kd/(1-F)
其中[B]等于mAb(在这种情况下OX40mAb24)的浓度。该公式(等式6)用于计算来自细胞结合实验的20％、50％和90％受体占有率(F＝0.20、0.50或0.90)所需的OX40mAb24浓度，使用上述一个位点(特异性)结合的非线性回归(曲线拟合)等式从其计算Kd值。
2.5 统计方法
在Graphpad Prism软件中使用双侧未配对的学生t检验与95％置信水平和韦尔奇氏校正(Welch’s correction)以将具有不同标准偏差的数据集考虑在内，以确定针对OX40mAb24与活化的原代人CD4 T细胞对比表达OX40的Jurkat T细胞上的OX40的结合确定的表观Kd值或表观受体占有值之间的统计学显著性差异。描述性统计(即，平均值和平均值的标准误差)在总结图和表中给出。
2.6 结果
2.6.1 OX40mAb24与原代人CD4+T细胞的结合
OX40mAb24结合于活化的人CD4+T细胞，平均表观Kd为312pM，并且20％、50％和90％受体占有值分别为78.1、312和2810pM；n＝6次结合测定，使用六个独立的T细胞供体(图2A和图2B，以及表2-2)。
相比之下，9B12结合于活化的人CD4+T细胞，平均Kd为669pM，并且20％、50％和90％受体占有值分别为167、669和6020pM(图2C和图2D，以及表2-2)。因此，9B12与OX40mAb24表观Kd值之间的比值是2.1至1，并且反映了与人OX40对鼠和人源化单克隆抗体的类似结合亲和力。
表2-2 OX40mAb24或9B12与表达OX40的活化的原代人CD4+T细胞的结合的表观亲和力(Kd)和受体占有值
EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；Kd＝平衡结合解离常数；StdErr＝平均值的标准误差。
2.6.2 OX40mAb24与工程化为过度表达人OX40的Jurkat T细胞系的结合
OX40mAb24结合于表达OX40的Jurkat T细胞，平均Kd为424pM，并且20％、50％和90％受体占有值分别为106、424和3820pM。图3A-3C和表2-3。在OX40mAb24与由活化的原代人CD4+T细胞和过度表达OX40的Jurkat T细胞表达的OX40的表观结合亲和力或受体占有率方面不存在统计上显著的差异(p＝0.59)。
相比之下，9B12结合这些细胞，平均Kd为726pM，并且20％、50％和90％受体占有值分别为182、726和6540pM(图3D-3F和表2-3)。因此，9B12和OX40mAb24的表观Kd值之间的比值为1.7至1，类似于针对与活化的人CD4+T细胞上的OX40结合计算的比值。
表2-3 OX40mAb24或9B12与过度表达OX40的人Jurkat NFkB-荧光素酶克隆64细胞的结合的表观亲和力(Kd)和受体占有值
EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；Kd＝平衡结合解离常数；StdErr＝平均值的标准误差。
2.6.3 OX40mAb24与小鼠或大鼠CD4+T细胞的结合
OX40mAb24和9B12两者都不与活化的小鼠或大鼠CD4+T细胞结合(数据未示出)。用商业抗小鼠和抗大鼠OX40抗体(分别克隆OX86和OX40)观察到活化的小鼠和大鼠CD4+T细胞的阳性染色。9B12既不结合活化的小鼠CD4+T细胞，也不结合活化的大鼠CD4+T细胞(数据未示出)。
2.6.4 OX40mAb24与食蟹猴和恒河猴CD4+T细胞的结合
OX40mAb24结合于活化的食蟹猴细胞，平均Kd为581pM。食蟹猴Kd比人类Kd高1.9倍(表2-4)。
9B12结合活化的食蟹猴CD4+T细胞，平均Kd为1088pM(表2-4)，其产生9B12与OX40mAb24表观Kd值之间1.9至1的比值。
OX40mAb24结合于活化的恒河猴CD4+T细胞，平均Kd为369pM(表2-4)。恒河猴Kd比人Kd高1.2倍。
9B12结合活化的恒河猴CD4+T细胞，平均Kd为713pM(表2-4)，其产生9B12与OX40mAb24表观Kd值之间2.8至1的比值。
表2-4 OX40mAb24或9B12与表达食蟹猴和恒河猴OX40的活化的原代CD4+T细胞的结合的表观亲和力(Kd)
Kd＝平衡结合解离常数；StdErr＝平均值的标准误差。
实例3：OX40mAb24对人OX40的结合特异性
在此实例中，相对于具有相关氨基酸序列的其他人TNFRSF成员，进行基于流式细胞术的细胞结合测定以确定OX40mAb24对人OX40的特异性，这些TNFRSF成员包括：NGFR(TNFRSF16)、LTβR(TNFRSF3)、TNFR2(TNFRSF1β)、GITR(TNFRSF18)、CD137(TNFRSF9)、以及HVEM(TNFRSF14)。此外，OX40mAb24对重组人TNFRSF成员的结合特异性以ELISA形式进行了测试，这些TNFRSF成员包括以上提及的那些以及DR6(TNFRSF21)、骨保护素(OPG；TNFRSF11B)、RANK(TNFRSF11A)、FAS(TNFRSF6)、以及CD40(TNFRSF5)。
3.1 材料
在此研究中使用的材料在表3-1中列出。
表3-1 材料
3.2 方法
3.2.1 搜索与人OX40具有亲近序列同源性的蛋白
为了鉴别与人OX40具有氨基酸序列一致性的人蛋白质，使用OX40(CCDS 11/UniProt P43489)的蛋白质序列进行蛋白质序列同源性基本局部比对搜索工具(BLASTP)搜索。鉴别了19种TNFRSF家族成员/同种型。使用CCDS和UniProt数据库(www.uniprot.org)验证了这些蛋白质的全长序列。克隆Manager版本9软件用于使用blosum62评分矩阵针对人OX40参考进行组装比对，以确定人OX40与BLASTP搜索中鉴别的蛋白质之间的氨基酸一致性百分比(表3-2)。
3.2.2 相对于在HEK293细胞中表达的其他TNFRSF成员，OX40mAb24对OX40的结合特异性
在转染到哺乳动物细胞中时能够指导个体TNFRSF成员的表达的cDNA构建体从傲锐基因技术公司(罗克维尔市，马里兰州)获得。这些cDNA构建体由在米迪缪尼公司(MedImmune)(盖瑟斯堡，马里兰州)的蛋白质科学组扩增并纯化以用于在瞬时转染中使用。对于每个TNFRSF成员的单独表达，根据制造商对于脂质体2000建议的方案，使用脂质体2000(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)与0.5μg DNA的编码TNFRSF成员之一的表达载体组合地转染HEK293细胞。转染后48小时，通过胰蛋白酶消化从组织培养板中除去细胞。通过添加含血清的完全培养基(RPMI-1640加10％FBS)中和胰蛋白酶，随后细胞沉淀并在完全培养基中洗涤。然后将细胞悬浮在冷FACS缓冲液(PBS+2％FBS)中，并且接种到96孔非组织培养处理板中，以用于使用TNFRSF成员特异性mAb(表3-3)和OX40mAb24的结合研究。
对于抗体或OX40mAb24的结合，将HEK细胞沉淀，除去FACS缓冲液，并且将细胞悬浮于FACS缓冲液中，该FACS缓冲液含有2μg/mL碘化丙啶(PI)以及由制造商推荐浓度的特异于转染的TNFRSF成员的荧光染料标记的mAb或具有1μg/mL浓度的OX40mAb24。对于结合对照，将细胞单独与荧光染料标记的同种型对照抗体一起孵育。在黑暗中4℃下将细胞与抗体孵育1小时。此后，将与荧光染料标记的单克隆抗体一起孵育的细胞在冷的FACS缓冲液中洗涤，且然后通过流式细胞术使用LSRII流式细胞仪(BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)和FlowJo软件收集并分析结合事件，如章节3.2.3中所描述。将与OX40mAb24一起孵育的细胞在冰冷的FACS缓冲液中洗涤，且然后悬浮于25μg/mL的Alexa647山羊抗人IgG(H+L)第二抗体中并在黑暗中4℃下孵育另外30分钟。对于第二抗体结合对照，将细胞在OX40mAb24不存在但单独的荧光染料标记的第二抗体存在下孵育。此后，将细胞洗涤并悬浮在冷的FACS缓冲液中用于在LSRII流式细胞仪上分析。
3.2.3 流式细胞术分析
使用FlowJo软件(阿什兰(Ashland)，俄勒冈州(OR))检查流式细胞术标准(FCS)数据。为了分析mAb结合，首先将细胞门控为活的(PI阴性)细胞，且然后将事件的平均荧光强度(MFI)对事件的总数绘图以产生结合直方图。对于每个样品确定了所有活细胞的几何MFI，以使得可以确定相对于背景(同种型对照或单独的第二抗体)的MFI倍数。
3.2.4OX40mAb24结合特异性ELISA
在PBS中将储备蛋白质稀释至5μg/mL后，制备每种重组人TNFRSF蛋白的八点、两倍稀释系列。随后，将50μL每种抗原稀释液一式两份转移到Nunc 96孔MaxiSorp平底板的孔中，并在4℃下孵育过夜以将蛋白质吸附到板上。之后，将板在洗板器中用PBS洗涤三次以除去未结合的蛋白质。将抗OX40mAb29、9B12和对照抗体在PBS中稀释至10μg/mL的最终浓度，并且将50μL的mAb添加至每个孔中，并在室温下孵育1小时以将mAb与平板结合的蛋白质结合。此后，使用洗板器，用PBS/吐温-200.1％(体积/体积)洗涤孔。将10μg/mL的HRP轭合的山羊抗人或山羊抗小鼠第二抗体添加至每个孔，并在室温下孵育1小时。在PBS/吐温-200.1％中洗涤三次后，向各孔添加50μL的TMB底物，并在室温下孵育5分钟以显色比色产物。通过向孔中添加50μL的0.5摩尔H2SO4终止反应，并使用Envision平板读数器在450nm下立即读取板用于检测比色产物。在用于Windows的GraphPad Prism软件(5.01版)中对结果绘图，并且使用单一位点结合的非线性回归分析生成结合曲线。
3.3 结果
对人OX40的蛋白质序列同源性BLASTP搜索鉴别了与全长OX40序列共享15％-27％氨基酸序列一致性的19种人TNFRSF蛋白或同种型。这些蛋白质及其序列一致性百分比在表3-2中列出。
表3-2 与人OX40具有最高同源性的12个TNFRSF成员的氨基酸序列一致性。
CCDS＝共有编码序列；ID＝标识符；NA＝不适用；TNFRSF＝肿瘤坏死因子受体超家族；UniProt-全球蛋白质资源
通过如上文章节3.1.3中所描述的流式细胞术评估OX40mAb24与表达人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137或HVEM的瞬时转染的HEK293细胞的结合。使用对每种人TNFRSF蛋白具有特异性的可商购抗体证实了人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137和HVEM的细胞表面表达；表3-3中示出与每种TNFRSF蛋白的同种型对照抗体相比，MFI的倍数增加。OX40mAb24与表达人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137或HVEM的HEK293细胞的结合不是基本上如以上所看见的单独的第二抗体与这些相同的细胞的结合(表3-3，图4A)。相比之下，OX40mAb24与组成型地过度表达OX40的Jurkat细胞系的结合与单独荧光染料标记的第二抗体的结合相比高48倍(就平均MFI而言)(表3-3和图4B)。
表3-3:荧光染料标记的TNFRSF特异性单克隆抗体和OX40mAb24与过度表达TNFRSF的HEK293细胞或OX40mAb24与过度表达OX40的Jurkat细胞的倍数结合。
mAb＝单克隆抗体；MFI＝平均荧光强度；ND＝未确定；TNFRSF＝肿瘤坏死因子受体超家族
在ELISA形式中，含有OX40mAb24的Fab臂但具有含有三个氨基酸修饰的IgG1Fc结构域的抗体(mAb29)的结合对OX40具有特异性(图5A)，从而显示与重组人NGFR(TNFRSF16)、LTβR(TNFRSF3)、TNFR2(TNFRSF1β)、GITR(TNFRSF18)、CD137(TNFRSF9)、HVEM(TNFRSF14)、DR6(TNFRSF21)、骨保护素(OPG；TNFRSF11B)、RANK(TNFRSF11A)、FAS(TNFRSF6)、以及CD40(TNFRSF5)没有高于背景的特异性结合。9B12(“人源化”以产生OX40mAb24的小鼠抗人OX40IgG1单克隆抗体)展示与这些TNFRSF蛋白的结合的类似缺乏(图5B)。
3.4：结论
OX40mAb24和9B12与人OX40的结合是特异性的，并且不与高度相关的TNFRSF蛋白交叉反应。
实例4：OX40mAb24通过OX40体外共刺激原代人CD4+T细胞的能力
在此实例中，使用基于平板的人CD4+T细胞增殖和细胞因子释放测定来评估与通过CD3/T细胞受体(TCR)复合物活化组合，OX40mAb24增强T细胞活化的能力。还检查了可溶性OX40mAb24活性，以及在CD3/TCR信号传导不存在下可溶性和平板结合的OX40mAb24的活性。
4.1 材料
在此研究中使用的材料在表4-1中列出。
表4-1 材料
4.2 测定
4.2.1 OX40mAb24的平板固定的生物活性
通过在基于平板的药物捕获测定中测量人CD4+T细胞增殖和细胞因子产生来确定OX40mAb24的生物活性(图6)。
根据制造商的方案，使用RosetteSep CD4+T细胞富集试剂盒从健康供体全血中分离富集的人CD4+T细胞。用来自四个独立供体的细胞进行测定。
将CD4+T细胞悬浮在完全RPMI培养基中，并将细胞浓度调节至1.0×106/mL。添加最终浓度2μg/mL的植物凝集素-白细胞凝集素(PHA-L)和20IU/mL重组人IL-2，并且将细胞在37℃和5％CO2下在湿润组织培养孵育箱中培养2天以活化T细胞并上调OX40。
将非组织培养处理的圆底96孔测定平板涂覆100μL的在PBS中2μg/mL的山羊抗小鼠Fcγ特异性IgG和2μg/mL的山羊抗人Fcγ特异性IgG。山羊抗人IgG捕获抗体未添加至旨在用于测定可溶性OX40mAb24活性的孔中。将板在4℃下孵育过夜，用200μL的PBS洗涤，并在37℃下用PBS中的1％BSA(1％BSA/PBS)封闭90分钟。用PBS洗涤平板，并在37℃下将2ng/mL的在1％BSA/PBS中重构的小鼠抗人CD3克隆OKT3添加至平板持续90分钟。用PBS洗涤板以除去未结合的OKT3，将OLS40mAb24、R347人IgG1对照mAb、9B12、以及小鼠IgG1对照mAb克隆MOPC-21各自以0.918μg/mL(3.0nM)开始在1％BSA/PBS中重构，并且在3倍稀释系列内连续稀释，且然后添加至测定板，并在37℃下孵育90分钟。
收集活化的原代人CD4+T细胞，在完全RPMI培养基中洗涤，并将浓度调节至1.0×106个活细胞/mL。根据制造商的说明书，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞(除了使用1.25μM CFSE而不是推荐的5μM)，在37℃下孵育10分钟。标记后，将细胞悬浮于完全RPMI培养基中，且将浓度调节至0.5×106/mL。用PBS洗涤板，并向每个孔中添加200μL的CD4+T细胞(100,000个/孔)。对于含有可溶性OX40mAb24的孔，将OX40mAb24在完全RPMI培养基中稀释至用于平板结合的OX40mAb24的最高最终浓度。将板中的细胞通过380xg下的离心沉淀，并在37℃下孵育3天。在72小时孵育时间后，除去40μL细胞培养上清液用于细胞因子释放测量。将CD4+T细胞沉淀，并用含有2％FBS(FACS缓冲液)的PBS洗涤一次。将细胞悬浮在含有用于鉴别CD4+T细胞的抗人CD4标记的抗体以及用于活/非存活细胞区别的碘化丙啶(PI)的结合混合物中，并孵育30分钟。孵育后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤，重新悬浮在FACS缓冲液中，并使用LSRII流式细胞仪和FlowJo软件通过流式细胞术进行分析，以用于流式细胞术标准(FCS)格式数据的分析。
对于分析T细胞增殖，使用FlowJo软件对活的(PI阴性)事件进行门控，并且显示CFSE稀释的CD4-门控细胞的百分比被确定为经历增殖的细胞的百分比的测量。
为了分析细胞因子释放，使用来自中尺度发现公司(盖瑟斯堡，马里兰州)的10-丛人Th1/Th2细胞因子分析试剂盒，根据制造商的方案测量培养72小时后获得的细胞培养上清液的细胞因子含量。该试剂盒采用电化学检测方法来定量测量以下人细胞因子：IFNγ、IL-2、IL4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、以及IL-1β。
用于Windows的GraphPad Prism 5.01版(GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥，www.graphpad.com)用于绘制mAb浓度对增殖或细胞因子释放值的对数。使用ECAnything函数从S形剂量-反应生物活性曲线计算导致OX40mAb24生物活性的20％、50％和90％最大效应(EC20、EC50和EC90)值的有效浓度。
4.3 结果
来自四个供体中的每一个的增殖数据和来自一个供体的细胞因子释放数据示于图7A-7C和图8A-8E中。人原代CD4+T细胞增殖的EC20、EC50和EC90效价值示于表4-2中；人原代CD4+T细胞因子释放测定的效价值示于表4-3至表4-7中；OX40mAb24和9B12的平均增殖和细胞因子释放值分别示于表4-8和表4-9中。
OX40mAb24以浓度依赖性方式共刺激原代人CD4+T细胞(n＝4)的增殖，EC20、EC50和EC90值分别为21、28和72pM。9B12共刺激CD4+T细胞的增殖，EC20、EC50和EC90值分别为106、218和622pM。因此，诱导50％最大增殖反应所需的9B12与OX40mAb24浓度之比为8:1(表4-2)。
OX40mAb24和9B12共刺激原代人CD4+T细胞释放细胞因子(n＝4)。平均EC20、EC50和EC90值不如增殖的值强，并且总结于表4-8和表4-9中。由于不良形成或不存在S形剂量-反应曲线，不能进行两种mAb的IL-2、IL-4、IL-8、IL-12p70、以及IL-1β测定结果的非线性回归分析。
表4-2 在原代人CD4+T细胞增殖测定中OX40mAb24和9B12的平均EC20、EC50和EC90值
CI＝置信区间；EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；TCR＝T细胞受体
表4-3：在原代人CD4+T细胞生物活性测定中由OX40mAb24或9B12诱导的IFNγ的平均EC20、EC50和EC90值
CI＝置信区间；EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；TCR＝T细胞受体
表4-4：在原代人CD4+T细胞生物活性测定中由OX40mAb24或9B12诱导的TNFα的平均EC20、EC50和EC90值
CI＝置信区间；EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；ND＝由于曲线拟合较差(EC20，EC50，EC90)或缺乏足够的值来确定平均值和平均值的标准误差而未确定；TCR＝T细胞受体。
表4-5：在原代人CD4+T细胞生物活性测定中由OX40mAb24或9B12诱导的IL10的平均EC20、EC50和EC90值
CI＝置信区间；EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；ND＝由于曲线拟合较差(EC20，EC50，EC90)或缺乏足够的值来确定平均值和平均值的标准误差而未确定；TCR＝T细胞受体。
表4-6：在原代人CD4+T细胞生物活性测定中由OX40mAb24或9B12诱导的IL13的平均EC20、EC50和EC90值
CI＝置信区间；EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；ND＝由于曲线拟合较差(EC20，EC50，EC90)或缺乏足够的值来确定平均值和平均值的标准误差而未确定；TCR＝T细胞受体。
表4-7：在原代人CD4+T细胞生物活性测定中由OX40mAb24或9B12诱导的IL5的平均EC20、EC50和EC90值
CI＝置信区间；EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；ND＝由于曲线拟合较差(EC20，EC50，EC90)或缺乏足够的值来确定平均值和平均值的标准误差而未确定；TCR＝T细胞受体。
表4-8:OX40mAb24的增殖和细胞因子释放的平均EC20、EC50和EC90值的总结
EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；ND＝由于用于计算平均值和平均值的标准误差的n值不足而未确定；StdErr＝平均值的标准误差。
表4-9:9B12的增殖和细胞因子释放的平均EC20、EC50和EC90值的总结
EC20＝导致最大效应的20％的有效浓度；EC50＝半最大有效浓度；EC90＝导致最大效应的90％的有效浓度；ND＝由于用于计算平均值和平均值的标准误差的n值不足而未确定；StdErr＝平均值的标准误差。
测定非板结合的可溶性OX40mAb24的活性。可溶性OX40mAb24未诱导针对单独抗CD3抗体或在R347人IgG1对照mAb存在下观察到的水平以上的原代人CD4+T细胞增殖(图7A-7C)或细胞因子释放(图8A-8E)。平板结合的抗CD3抗体单独产生最小至中等水平的增殖和细胞因子释放。在此通过可溶性OX40mAb24证明的活性的缺乏与在测量OX40介导的NFκB信号传导的2-细胞生物活性测定中在没有基于细胞的交联的情况下针对可溶性OX40mAb24观察到的活性的不存在相一致(参见下文的实例5)。
同样地，在亚有丝分裂抗CD3抗体信号不存在下，固定在平板表面上或作为可溶性未结合蛋白质添加的OX40mAb24诱导很少至没有CD4+T细胞增殖(图7A-7C)或细胞因子释放(图8A-8E)。这些结果证明，在此研究中，在同时CD3/TCR连接不存在下，OX40mAb24在原代人CD4+T细胞中不具有活性。
4.4 结论
OX40mAb24以与9B12自其人源化的抗体相似的浓度依赖性方式诱导原代人CD4+T细胞的增殖和细胞因子释放(图8A-8E和图9A-9E)。OX40mAb24展示作为平板结合的而不是作为可溶性蛋白质的活性。此外，OX40mAb24活性与CD3/TCR信号传导同时发生。
实例5：使用Jurkat NFκB-荧光素酶报告T细胞测定OX40mAb24在基于2-细胞的生物活性测定中的体外活性
在此实例中，使用一组2-细胞报告基因生物活性测定评估OX40mAb24和9B12通过人OX40信号传导的能力。通过使用响应于NFκB信号传导途径的刺激产生荧光素酶的过度表达OX40的Jurkat NFκB-荧光素酶T细胞报告系实现了通过OX40共刺激T细胞活化的测量(图10)。据报道，NFκB信号传导发生在OX40接合的下游，并且可以与T细胞活化的其他测量(如增殖和细胞因子释放)相关(克罗夫特M(Croft M)等人，免疫学评论(Immunol Rev.)229:173-91(2009))。通过向细胞裂解液添加荧光素酶底物和使用光度计测量由反应产物所发出的光来测量荧光素酶、且因此T细胞活化的量。测量了使用被工程化为表达不同Fcγ受体补体的细胞交联的OX40mAb24以及可溶性非FcγR交联的OX40mAb24的生物活性。
5.1 材料
在此研究中使用的材料在表5-1中列出。
表5-1：材料
5.2 2-细胞生物活性测定
5.2.1 原代人CD45+细胞的分离
从人肿瘤中分离原代人CD45+细胞。将肿瘤样品从转运介质中除去并置于无菌培养皿中。添加汉克氏缓冲盐溶液并解剖可见坏死组织或来自肿瘤样本的任何正常组织。将组织切成小块(约1mm)并置于50mL锥形管中，且添加胶原酶III酶混合物(250IU/mL胶原酶III、3mM CaCl2、315μg/mL DNA酶1)，混合并孵育。将消化的样品通过70微米过滤器过滤并用MACS缓冲液洗涤。将解离的细胞沉淀，并使用Vi细胞计数器测定细胞数量和活力。将细胞悬浮在具有CD45微珠的MACS缓冲液中，并在冰上孵育。将细胞洗涤并重新悬浮在MACS缓冲液中，以用于使用LS柱阳性选择CD45+细胞。通过从磁铁移除柱且向柱添加MACS缓冲液来洗脱珠粒结合的CD45+细胞。将细胞沉淀并重新悬浮在完全RPMI培养基中并用于如上所述的生物活性测定。
5.2.2 测定方案
使用2-细胞生物活性测定来测试OX40mAb24和9B12的生物活性。使用过度表达OX40的人Jurkat NFκB-荧光素酶报告克隆64(OX40 Jurkat报告基因)来测量OX40激动(NFκB活性)。第二表达FcγR的细胞系用于介导OX40mAb24交联，其聚集并活化OX40 Jurkat报告细胞上的OX40(图10)。b用于交联的FcγR-表达细胞系包括Raji人B细胞淋巴瘤系、表达CD32A的HEK293、表达CD32B的HEK293、或从原发人肿瘤分离的CD45+免疫细胞。
为了确定OX40mAb24的可溶性活性，还使用亲本HEK293细胞(这些亲本HEK293细胞是FcγR无效的且因此不能交联OX40mAb24)、或在完全交联细胞不存在下进行了生物活性测定。
在使用前，将OX40 Jurkat报告细胞在组织培养孵育箱中以0.5-1.5×106/mL的密度在完全RPMI培养基中培养。将细胞在生物测定前一天以106个细胞/mL的最终密度传代。
收集并沉淀OX40 Jurkat报告细胞、FcγR-表达细胞系、或HEK亲本细胞。为了从原发人肿瘤和正常邻近组织中分离CD45+细胞，将组织解离，且将CD45+细胞分离并重新悬浮在完全RPMI培养基中用于在生物活性测定中使用，如下所述。
将OX40mAb24、9B12和各种对照抗体在完全RPMI培养基中连续稀释3倍。
将OX40 Jurkat报告细胞加上FcγR-表达细胞、或HEK亲本细胞以100,000个细胞/孔添加至96孔板。将OX40mAb24、9B12或对照抗体以具有10μg/mL起始浓度的稀释系列添加至细胞，并且在37℃下在组织培养孵育箱中孵育。
在16-24小时孵育时间后，将100μL重构的Steady-Glo荧光素酶测定溶液(普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康辛州)添加至每个孔并混合以裂解细胞，且然后孵育以平衡荧光素酶信号。将Steady-Glo/样品裂解物(150μL)从各孔转移至96孔白壁测定板，以使用珀金埃尔默Envision发光读取器进行检测和发光读取。
用于Windows的GraphPad Prism 5.01版(GraphPad软件公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)用于绘制OX40mAb24、9B12、R347人IgG1、小鼠IgG1克隆MOPC-21的浓度(x轴是蛋白质浓度的log 10)对发光RLU(y轴)。使用ECAnything(ECf)(f＝20、f＝50和f＝90)从S形剂量-反应(可变斜率)生物活性曲线确定生物活性的EEC20、EC50和EC90值。
5.3 2-细胞生物活性测定的结果
OX40mAb24和对照抗体的生物活性的结果示于图11A-11D、图12A-12D和表5-2中。
在FcγR-表达细胞系(例如，表达CD32A的HEK293、表达CD32B的HEK293、Raji B细胞、或从原发人肿瘤分离的CD45+细胞)的存在下，OX40mAb24展示对过度表达OX40的JurkatNFκB报告细胞的有效刺激，如通过NFκB途径活化所测量。在第二细胞类型不存在或在缺乏外源表达的FcγR的HEK293细胞存在下，OX40mAb24表现出最小的报告活性(图11A-11D)。
2-细胞生物测定的效价值(EC20、EC50、和EC90)总结于表5-2中。跨所有测定的平均EC20、EC50和EC90值分别是228、751和5630pM。
9B12和对照抗体的生物活性的结果示于图12A-12D中，并且效价值总结于表5-3中。所有测定的平均EC20、EC50和EC90值分别是519、2530和41100pM。因此，9B12的2-细胞生物活性(EC50)相对于OX40mAb24的2-细胞生物活性的比率计算为3.4:1。
表5-2：OX40mAb24的2-细胞生物活性
NSCLC＝非小细胞肺癌；RCC＝肾细胞癌
*如所指示，测定使用了Raji细胞、表达CD32A的HEK293细胞、表达CD32B的HEK293细胞、或从具有表达OX40的Jurkat NFκB-荧光素酶克隆64报告细胞的原发人肿瘤中分离的CD45+细胞。
表5-3：9B12的2-细胞生物活性
ND＝未确定；NSCLC＝非小细胞肺癌；RCC＝肾细胞癌
*如所指示，测定使用了Raji细胞、表达CD32A的HEK293细胞、表达CD32B的HEK293细胞、或从具有表达OX40的Jurkat NFκB-荧光素酶克隆64报告细胞的原发人肿瘤中分离的CD45+细胞。
5-4：结论
OX40mAb24和9B12介导人T细胞的活化，如通过在过度表达OX40的Jurkat NFκB-荧光素酶报告细胞系中刺激NFκB途径所测量。在不存在表达能够经由OX40mAb24的Fc结构域交联的FcγR的细胞的情况下，测量了最小报告细胞系活性。然而，在包含表达能够交联mAb的FcγR的细胞的2-细胞系统、以及用于读出T细胞活化的过度表达Jurkat的NFκB-荧光素酶报告系中，OX40mAb24和9B12介导有效的OX40活化，平均EC50值分别为751pM和2530pM。因此，OX40mAb24在2-细胞测定系统中的生物活性与9B12相似。
实例6：OX40mAb24触发效应子功能的能力
在此实例中，关于OX40mAb24触发Fc效应子功能的能力，即OX40mAb24触发针对表达高水平的OX40的原代人CD4+T细胞的人天然杀伤(NK)细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或结合C1q(通过经典补体途径的补体依赖性细胞毒性(CDC)的先决条件)的能力评估了OX40mAb24。使用含有人IgG4P Fc结构域(mAb28)或IgG1 Fc结构域中的减少FcγRIIIa结合的三重突变(mAb29)的OX40mAb24型式来评估OX40mAb24 IgG1 Fc结构域介导ADCC活性的贡献。此外，将OX40mAb24的效应子功能与9B12(进行人源化以产生OX40mAb24的一种小鼠抗人OX40 IgG1单克隆抗体)的效应子功能进行比较。抗CD20抗体利妥昔单抗结合至表达CD20的B细胞，并被用作用于ADCC实验的阳性对照。因为初级活化的人CD4+T细胞不表达CD20，所以进行了使用不表达CD20的Toledo B细胞系的单独测定以验证在该ADCC测定系统中使用的NK细胞的活性。
6.1 材料
在此研究中使用的材料在表7-1中列出。
表6-1：材料
6.2 测定
6.2.1 抗体依赖性细胞毒性
使用富集的原代人NK细胞作为效应子和表达OX40的原代人CD4+T细胞作为靶标，测试了相对于9B12和含有OX40mAb24的具有IgG4P Fc结构域或三重突变体(TM)人IgG1 Fc结构域的Fab臂的单克隆抗体的ADCC活性，OX40mAb24的ADCC活性。作为一种阳性对照，使用Toledo B细胞系的利妥昔单抗定向杀死测试了每种NK细胞制剂的活性。
对于原代人CD4+T细胞的分离，将通过米迪缪尼供血者程序从健康供体获得的肝素抗凝的全血根据以下方案进行处理：每20mL全血添加干细胞技术RosetteSep CD4 T细胞分离试剂盒抗体混合物(1mL，干细胞技术公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大)，混合并在室温(RT)下孵育20分钟(mm)。用无菌室温FACS缓冲液(PBS，pH 7.2加2％热灭活的新生小牛血清)将血液1:1稀释并铺层到DM-L培养基上，然后离心20分钟。在离心后，除去含有人CD4+T细胞的血沉棕黄层，并且用RT FACS缓冲液洗涤细胞一次，并用RT完成RPMI培养基洗涤一次。将细胞在Vi细胞计数器上计数以确定细胞数量和活力，并且将CD4+T细胞以1.0×106/mL的浓度悬浮于完全RPMI培养基中。
将原代人CD4+T细胞(在完全RPMI培养基中1.0×106/mL)在湿润的组织培养孵育箱中在37℃和5％CO2下与2μg/mL PHA-L和20IU/mL rhIL-2一起培养48小时以活化T细胞并上调OX40，并且随后用于OX40mAb24 ADCC测定中。下文提及的图中的所有供体都代表独特的个体；即未从同一供体分离CD4+T细胞用于重复ADCC实验。
为了在细胞毒性测定中区分靶T细胞或培养的Toledo B细胞与纯化的人NK细胞，使用Vybrant DiO细胞标记溶液将荧光染料DiO并入靶细胞的细胞膜中(根据制造商的用于悬浮细胞标记的方案)。在原代人CD4+T细胞活化和DiO标记后，从来自米迪缪尼供血者程序的肝素钠抗凝血液中分离效应NK细胞，使用与如上针对人CD4+T细胞相同的方案，除了使用了1mL的RosetteSep Nk细胞分离试剂盒抗体混合物代替1mL的RosetteSep CD4+T细胞分离试剂盒抗体混合物之外。将分离的原代人NK细胞用温热的完全RPMI培养基(RPMI-1640加10％FBS)洗涤两次，且然后以2.67×106/mL的浓度悬浮于完全RPMI中。同样，活化的原代人CD4+T细胞也在温热的完全RPMI中洗涤两次，并以2.67×105/mL的浓度悬浮。此后，将75μL的原代人NK细胞(200,000)和75μL的活化的原代人CD4+T细胞(20,000)添加至无菌非组织培养处理的圆底96孔板的孔中，以获得10:1的效应物:靶标比率。在一些实验中，添加含有OX40mAb24或对照mAb的完全RPMI培养基(50μL)以得到10μg/mL的最终浓度。另外，将含有OX40mAb24或对照mAb的3倍稀释系列(从而产生67nM的最终浓度)或9B12或R347人IgG1的从67nM开始的27倍稀释系列的完全RPMI(50μL)添加至接种的细胞。利妥昔单抗(10μg/mL，对照抗体)用作含有DiO标记的表达CD20的Toledo B细胞(代替表达OX40的活化的原代人CD4+T细胞)的孔中的阳性对照，因为活化的CD4+T细胞不表达CD20。通过在室温下离心将ADCC测定中的细胞轻轻地沉淀，且随后培养24小时。
在孵育期结束时，将细胞通过离心沉淀，且然后悬浮于含有10μg/mL碘化丙啶(PT)的FACS缓冲液中，以用于在BD LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。在荧光补偿后，使用FlowJo软件区分DiO阳性靶CD4+T细胞或Toledo B细胞中的非存活(PT阳性)细胞。
NK细胞ADCC测定的数据的图解表示(包括平均值和该平均值的标准误差的确定)使用用于Windows的GraphPadPrism 5.01版来产生。
6.2.2 OX40mAb24与C1q的结合
使用ProteOn XPR36仪器来确定OX40mAb24或9B12与通过表面等离振子共振从与OX40mAb24或9B12的合并人血清纯化的人补体蛋白C1q的结合。标准胺偶联用于使OX40mAb24或9B12固定至GLC生物传感器芯片的表面上。将在从26nM至1.6nM范围内的5个浓度的人C1q悬浮在PBS/0.005％吐温20，pH 7.4中。将样品以30μL/分钟注射200秒，并且接下来是解离相持续600秒。使用ProteOn Manager 2.1软件(伯乐公司)使用1:1拟合来对传感图数据进行处理。
6.3 结果
使用NK细胞和表达OX40的靶细胞的同种异体和自体混合物，在OX40结合的饱和水平(10μg/mL[67nM])下测试OX40mAb24、9B12、以及OX40mAb24的人IgG4P(mAb28)和IgG1-TM(mAb29)型式介导ADCC的能力(参见实例2)(图13A和图14A)。OX40mAb24显示针对活化的人CD4+T细胞的可测量的ADCC活性。相比之下，9B12、mAb28和mAb29未显示高于阴性对照的ADCC活性的ADCC活性。使用相同的NK细胞，针对人CD20(利妥昔单抗)的阳性对照抗体展示ADCC活性，从而证明NK细胞都具有稳健的ADCC活性(图13B和图14B)。
在剂量-反应实验中，OX40mAb24展示针对活化的人CD4+T细胞的浓度依赖性ADCC活性(图15A-15D、图16A-16D、图17A-17B、以及表6-2)。相比之下，9B12没有显示任何可检测的ADCC活性。此外，R347人IgG1对照mAb未显示任何可检测的ADCC活性，这证实了由OX40mAb24介导的ADCC活性依赖于与靶细胞上的OX40接合。针对人CD20的阳性对照抗体也展示了针对表达CD20的B细胞淋巴瘤细胞系的ADCC(图13B和图14B)；这支持检测的有效性。总体而言，这些实验结果证实，OX40mAb24具有针对已在先前显示刺激细胞表面OX40表达的条件下培养的靶细胞的ADCC。
表6-2 OX40mAb24介导NK细胞ADCC效力的总结
使用表面等离子体共振测定，评估了OX40mAb24结合于人补体组分C1q的潜能。在此测定中，与Clq的结合用作补体依赖性细胞毒性测定中的活性的替代物(戴尔’阿夸 (Dall'Acqua)等人，免疫学杂志(J.Immunol)177:1129-1138(2006))。9B12用作阴性对照抗体。OX40mAb24展示与纯化的人Clq蛋白结合的浓度依赖性能力(图18A)。相比之下，9B12未展示任何可检测的与C1q蛋白的结合(图18B)。
6.4 结论
OX40mAb24结合于C1q并触发针对活化的CD4+T细胞的NK介导的ADCC。
实例7：使用OX40mAb24以及食蟹猴和恒河猴T细胞的体外可比性研究
在此实例中，用表达食蟹猴(cyno)/恒河猴OX40的Jurkat NFκB-荧光素酶T细胞报告系使用2-细胞报告基因生物活性测定来确定OX40mAb24增强T细胞活化的能力。Fcγ受体介导的药物交联由恒河猴B细胞系或由在红血细胞裂解后全血样品中的恒河猴Fcγ受体表达细胞介导。OX40活化被测量为响应于原代人T细胞活化下游的NFκB信号传导途径的刺激的增加的荧光素酶活性。NFκB信号传导是OX40信号传导中的充分研究的下游事件，并且可以与T细胞活化的其他测量(如增殖和细胞因子释放)相关(克罗夫特M等人，免疫学评论 229:173-91(2009))。此外，使用基于平板的生物活性测定来测试OX40mAb24增强恒河猴T细胞的T细胞受体介导的活化(共刺激)的能力，其中评估CD4+T细胞增殖。使用同种型对照(NIP228 IgG1)来证明特异性OX40接合。
并行地，测量了9B12(OX40mAb24所源自的鼠抗OX40单克隆抗体)的生物活性，以提供关于非人灵长类动物OX40的OX40mAb24和9B12活性的比较。
7.1 材料
在此研究中使用的材料在表7.1中列出
表7-1 材料
7.2 测定
7.2.1 食蟹猴/恒河猴2-细胞生物活性测定
使用2-细胞报告基因测定来测试OX40mAb24的生物活性。因为食蟹猴和恒河猴共享相同的OX40氨基酸序列，所以表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB-荧光素酶报告细胞系(克隆B2)用于读出OX40激动(NFκB活性)。为了介导OX40mAb24交联且因此Jurkat报告细胞上的OX40聚集，使用了表达Fcγ受体的恒河猴B细胞系、LCL8664、或来自正常恒河猴全血的含有FcγR表达细胞的白细胞。在不添加OX40mAb24的情况下以及还在不存在FcγR表达细胞的情况下评估了背景生物活性。为了证明OX40接合对报告细胞的作用，使用同种型对照代替OX40mAb24。
根据以下方案进行了使用LCL8664的OX40mAb242-细胞生物活性测定：
在使用前一天，在完全RPMI培养基(具有10％胎牛血清[FBS]和1％抗生素/抗真菌剂的RPMI)中培养表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat NFκB-荧光素酶报告基因克隆B2和LCL8664，以便分别达到大约5×106个细胞/mL和4×105个细胞/mL的细胞密度。第二天，将OX40 Jurkat报告细胞和LCL8664沉淀，悬浮在完全培养基中并使用Vi细胞计数器计数，之后将两种细胞系的细胞浓度在完全培养基中调节至2.5×106。
将克隆B2和LCL8664细胞各自以100,000个细胞/孔添加至96孔圆底非组织培养处理的平板中。将OX40mAb24添加至完全RPMI培养基中的细胞，至以30μg/mL开始并以3倍增量稀释的最终浓度。类似地，使用终浓度为10μg/mL并以6倍增量稀释的R347 IgG1(同种型对照)。9B12和MOPC-21(同种型对照)以相同的方式稀释。将平板转移至具有湿润5％CO2气氛的37℃孵育箱中。
在16小时孵育时间后，将100μL重构的Steady-Glo荧光素酶测定溶液添加至每个孔并混合以裂解细胞，且然后孵育以平衡荧光素酶信号。将Steady-Glo/样品裂解物(150μL)从各孔转移至96孔白壁测定板，以使用珀金埃尔默Envision发光读取器进行检测和发光读取。
使用以下方案来从由健康印度来源的恒河猴获得的肝素钠抗凝全血获得RBC裂解的恒河猴细胞：
将新鲜全血(5mL)添加至50mL锥形管，且添加45mL氯化铵溶液。将细胞混合物在冰上孵育10分钟，然后沉淀，并用完全RPMI培养基洗涤，之后将细胞准备用于2-细胞生物活性测定中。
如用LCL8664恒河猴B细胞系所描述进行使用恒河猴RBC裂解的全血细胞的2-细胞生物活性测定，但是使用10μg/mL NIP228IgG1作为阴性对照抗体。
7.2.2 恒河猴CD4 T细胞增殖测定
根据以下方案在使用活化的原代恒河猴CD4+T细胞和板捕获的药物的CD4+T细胞增殖测定中测定OX40mAb24生物活性。从来自全球灵长类的健康恒河猴供体(N＝2)获得的肝素钠抗凝全血中分离的恒河猴CD4+T细胞用作反应性细胞的来源。
将新鲜肝素化恒河猴血液在室温(RT)下用PBS 1:1稀释。然后将20mL稀释的全血覆盖到50mL锥形离心管中的15mL 95％淋巴细胞分离培养基(LSM)上。在无制动的情况下将血液在室温下以400 x g离心30分钟。外周血单核细胞在界面收集并用美天旎MACS缓冲液洗涤两次且沉淀。将细胞沉淀物用红细胞裂解缓冲液处理5分钟，并且通过添加完全RPMI培养基去活化裂解缓冲液。将细胞洗涤且悬浮在MACS缓冲液中，并且用Vi细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
根据制造商的说明书，用美天旎非人灵长类试剂盒分离恒河猴CD4+T细胞。然后，在Vi细胞计数器上计数CD4+T细胞，在具有51μg/mL伴刀豆球蛋白A和1000IU/mL IL-2的完全RPMI培养基中以1×106个细胞/mL悬浮，并且在37℃和5％CO2下在湿润孵育箱中培养2天以活化T细胞并诱导OX40表达。将非组织培养处理的圆底96孔测定平板涂覆100μL的在PBS中2μg/mL的山羊抗小鼠Fcγ特异性IgG和2μg/mL的山羊抗人Fcγ特异性IgG。山羊抗人IgG捕获抗体未添加至旨在用于测定可溶性OX40mAb24活性的孔中。将平板在4℃下孵育过夜，用200μL的PBS洗涤，并且在37℃下用PBS中的1％BSA(1％BSA/PBS)封闭90分钟。用PBS洗涤平板，并且在37℃下将2ng/mL的在1％BSA/PBS中重构的抗CD3(克隆SP34-2)添加至平板持续90分钟。用PBS洗涤平板以除去未结合的OX40mAb24，将R347人IgG1对照mAb、9B12、以及小鼠IgG1对照mAb(克隆MOPC-21)各自以1.01μg/mL(6.67nM；实验1)或1.5μg/mL(10.0nM；实验2)开始在1％BSA/PBS中重构，并且在3倍稀释系列内连续稀释，且然后添加至测定板，并在37℃下孵育90分钟。
收集活化的原代恒河猴CD4+T细胞，在完全RPMI培养基中洗涤，并将浓度调节至1.0×106个活细胞/mL。根据制造商的说明书，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞(除了使用1.25μM CFSE代替推荐的5μM)，在37℃下孵育10分钟。标记后，将细胞悬浮于完全RPMI中，且将浓度调节至1.0×106/mL。用PBS洗涤板，并向每个孔中添加200μL的CD4+T细胞(200,000个/孔)。然后，将板在37℃下孵育3天。
在72小时孵育时间后，将CD4+T细胞沉淀，并用含有2％FBS(FACS缓冲液)的PBS洗涤一次。将细胞悬浮在含有用于鉴别CD4+T细胞的抗CD4标记的抗体以及用于活/非存活细胞区别的碘化丙啶(PI)的结合混合物中，并孵育30分钟。孵育后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤，重新悬浮在FACS缓冲液中，并使用LSRII流式细胞仪和FlowJo软件通过流式细胞术进行分析，以用于流式细胞术标准(FCS)格式数据的分析。
使用原代恒河猴CD4+T细胞在两个独立的试验中重复该测定。
为了评估细胞增殖，使用FlowJo软件门控活(碘化丙啶阴性)事件，并测定显示CFSE稀释的CD4+门控细胞的百分比。通过从响应于抗CD3抗体加OX40mAb24的CDFE稀释的CD4+门控细胞的百分比中减去显示响应于单独抗CD3的CFSE稀释的CD4+门控细胞的百分比来计算OX40mAb24的特异性活性。
在GraphPad Prism，5.01版(圣地亚哥，加利福利亚州)中使用非线性回归分析(对数剂量-反应，4-参数拟合曲线)测定在Jurkat NFκB报告基因测定和原代恒河猴CD4+T细胞测定中实现半最大(EC50)响应的OX40mAb24的浓度。
7.3 结果
7.3.1 食蟹猴/恒河猴2-细胞生物活性测定
在表7-2、图19A-19B、图20A-20B和图21A-21B中示出食蟹猴/恒河猴2-细胞生物活性测定的结果。OX40mAb24在恒河猴B细胞系LCL8664存在下，在表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat T细胞中活化OX40信号传导途径，如通过NFκB信号传导所测量，平均EC50为1450pM(N＝2个实验)。如表7-2中所示，食蟹猴/恒河猴2-细胞测定中OX40mAb24活性的EC50比使用Raji B细胞系的人2-细胞测定中高1.3倍，而9B12在食蟹猴/恒河猴2-细胞测定中具有有限活性，且不能确定EC50值。
此外，如表7-2中所示，OX40mAb24在恒河猴RBC裂解的全血存在下活化Jurkat T细胞中的OX40信号传导途径，其预期含有表达Fcγ受体的细胞，EC50为550pM(N＝1个实验)。还如表7-2所示，同一测定中9B12的EC50值是6052pM，并且在使用Raji B细胞系的人2-细胞测定中是4680pM。
表7-2 在2-细胞生物活性测定中OX40mAb24和9B12的平均半最大有效浓度
Std Err＝平均值的标准误差。n＝实验数目。NT＝未测试。ND＝未确定。
a来自实例5的数据。
7.3.2 恒河猴原代C-细胞增殖测定
恒河猴原代T细胞增殖测定的结果示于表7-3、表7-4和图22A-22D中。OX40mAb24诱导原代恒河猴CD4+T细胞的增殖，平均EC50为436pM(表7-3；N＝2次实验)。如表7-5中所示，9B12的EC50值是110pM(表7-4；N＝2次实验)。OX40mAb24以类似的测定形式诱导活化的原代人CD4+T细胞的增殖，平均EC50是28pM(表7-5；来自实例4的数据)。
表7-3 在原代恒河猴CD4 T细胞增殖测定中OX40mAb24的平均半最大有效浓度
测试或对照抗体 实验数目 平均EC50(StdErr)
OX40mAb24 2 436(309)
NIP228 IgG1 2 无活性
Std Err＝平均值的标准误差。
表7-4 在原代恒河猴CD4 T细胞增殖测定中9B12的平均半最大有效浓度
Std Err＝平均值的标准误差。
表7-5 在恒河猴和人CD4 T细胞增殖测定中OX40mAb24和9B12的平均半最大有效浓度
测试或对照抗体 恒河猴平均值(Std Err) 人平均值(Std Err)
OX40mAb24 436(309) 28(98)
9B12 110(13) 218(35)
Std Err＝平均值的标准误差。
7.4 结论
在RBC裂解的恒河猴全血内包含的恒河猴B细胞或Fcγ受体表达细胞存在下，OX40mAb24活化表达食蟹猴/恒河猴OX40的Jurkat T细胞NFκB报告细胞系中的OX40信号传导途径。此外，OX40mAb24诱导原代恒河猴CD4+T细胞的增殖。
实例8：OX40mAb24在人癌症的小鼠模型中的活性
此实例旨在确定OX40mAb24是否作为用于癌症治疗的单一药剂治疗是有效的。此研究在免疫受损的非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中与同种异体反应性人T细胞混合的人癌症的异种移植模型中进行。
8.1 材料
在此研究中使用的材料和它们的来源在表8-1中列出。
表8-1 材料
8.2 实验方案
8.2.1 测试动物
5至9周龄的雌性NOD/SCID小鼠从哈兰实验室公司(Harlan Laboratories,Inc)获得。按照米迪缪尼公司的实验动物资源设施的机构动物护理和使用委员会(实验动物护理的动物认证和美国农业部特许机构)批准的协议，这些动物被人道处理和圈养。将动物保持在无菌微型隔离单元中，提供有无菌草垫和食物、以及自由采食的酸化饮用水。将环境条件标准化(室温：20℃+/-1℃；相对湿度：50％±10％；12小时光照-黑暗循环)。将动物针对不良的临床症状每天监测且针对体重每周监测。
8.2.2 异种移植物的建立
从ATCC获得源自人黑色素瘤细胞系的人癌性A375细胞。将细胞在具有10％FCS的DMEM中，在37℃、5％CO2下在湿润孵育箱中生长。然后收获它们，用PBS洗涤一次，然后重新悬浮于PBS中。
从细胞培养物中收获人癌性A375细胞。将它们重新悬浮于PBS中。随后，A375细胞在移植到动物中之前与A375肿瘤细胞系同种异体反应性的CD4+和CD8+T细胞系混合。
为了产生CD4+和CD8+T细胞系，来自健康供体的人外周血单核细胞(PBMC)通过向每20mL全血加入1mL RosetteSep T细胞富集产品来富集CD4+或CD8+T细胞。接下来是20分钟孵育和随后使用RosetteSep DM-L致密培养基通过密度梯度离心来分离。离心后，将细胞用补充有2％胎牛血清(FBS)的PBS洗涤3次，并再悬浮于补充有10％FBS的RPMI1640培养基中。将富集的CD4+和CD8+T细胞在补充有重组人白介素-2(rhIL-2)的培养基中单独培养7至10天，且各自与丝裂霉素C处理的A375细胞相组合。将T细胞收集并也在补充有rhIL-2的培养基中单独培养7至10天，且与丝裂霉素C处理的A375细胞相组合。将CD4+和CD8+T细胞收集并以2:1的比例组合。
将富含CD4+和CD8+T细胞的A375细胞和PBMC在移植前即刻以6A375细胞比1T细胞的比例混合。
通过将3.5×106个细胞(人T细胞与A375细胞以1:6的效应物:靶标(E:T)比率混合，并悬浮于200μL PBS中)皮下(SC)注射到动物的右侧腹中来建立异种移植物。
8.2.3 随机化、组名称和剂量水平
在SC注射细胞前，六只动物被随机分配给每个实验组。目前还没有动物替换。每个实验的组名称和剂量水平在表8-2、表8-3和表8-4中列出。将测试抗体和对照抗体在PBS中稀释至适当浓度并且以200μL的总体积经腹膜内(IP)给予。测试抗体和对照抗体的第一剂量在癌症/效应T细胞移植后第3天或第4天给予。动物接受达3个额外剂量的测试抗体和对照抗体，如图中所示并在相应的图描述中所描述。在每只动物中观察肿瘤的形成，每周1或2次。在此研究中的主要终点是2000mm3的肿瘤体积抑或总肿瘤坏死。
8.2.4 肿瘤测量
通过卡尺在每个实验的图和表中指示的间隔处测量肿瘤，并且使用以下公式计算肿瘤体积(V)：
V(mm3)＝(长度[mm]×宽带[mm]×宽度[mm])/2。
对于每个组，结果报告为算术平均值。抗肿瘤作用被表示为肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，其如下计算：
％TGI＝(1-[处理组的平均肿瘤V]÷[对照组的平均肿瘤V])×100
8.3 统计方法
进行OX40mAb24处理的或9B12处理的动物与同种型对照处理的动物之间的比较，并且通过曼-惠特尼秩和检验针对统计显著性分析了组间差异。
从曼-惠特尼秩和检验获得的显著p值呈现于邻近算术平均值和该平均值的标准偏差的总结表和图中。
8.4 结果
在此研究中，研究了OX40mAb24对在人癌症的小鼠模型中的肿瘤生长的活性。免疫缺陷的NOD/SCID雌性动物用混合有同种异体反应性人CD4+和CD8+T细胞系的人癌症细胞系来移植。CD4+和CD8+T细胞起源于从健康人供体中分离的PBMC。动物在异种移植物移植后3或4天接受测试抗体和对照抗体的首次剂量，并如所指示给予测试抗体和对照抗体的额外剂量。
在三个独立的实验中，如与同种型对照组相比，OX40mAb24加同种异体反应性人T细胞显著地抑制A375细胞生长达85％(表8-2、表8-3和表8-4；图23A、如24A和图25)。如与同种型对照组相比，对照9B12加同种异体反应性人T细胞显著地抑制A375细胞生长达77％(表8-2至8-4，图23B和图24B)。
表8-2 处理组与在第18天在A375异种移植模型中的TGI百分比(实验2)
IP＝腹膜内；NA＝不适用；TGI＝肿瘤生长抑制；V＝体积
a每组动物的数目：6。
b所有动物在第4、7、9和12天接受200μl的测试抗体(IP)
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(同种型对照组的平均肿瘤V)]×100
表8-3 处理组与在第25天在A375异种移植模型中的TGI百分比(实验1)
IP＝腹膜内；NA＝不适用；TGI＝肿瘤生长抑制；V＝体积
a每组动物的数目：6。
b所有动物在第4、7、9、12天接受200μl的测试抗体(IP)
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(同种型对照组的平均肿瘤V)]×100
表8-4 处理组与在第28天在A375异种移植模型中的TGI百分比(实验3)
IP＝腹膜内；NA＝不适用；TGI＝肿瘤生长抑制；V＝体积
an＝6。
b所有动物在第3、6、8、10天接受200μl的测试抗体(IP)
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(同种型对照组的平均肿瘤V)]×100
8.5 结论
OX40mAb24在与同种异体反应性人T细胞混合的人癌症的小鼠模型中展示有效的抗肿瘤活性。OX40mAb24的抗肿瘤活性与9B12的抗肿瘤活性相似。这些结果提供了证据表明，OX40mAb24作为治疗患有T细胞浸润癌症的患者的单一药剂治疗可以是有效的。
实例9：大鼠/小鼠抗小鼠OX40 IgG2a嵌合体抗体克隆OX86抑制同源模型中的小鼠癌细胞系生长
OX40mAb24不与小鼠(m)OX40交叉反应(参见实例2)；因此，不可能在免疫活性的小鼠模型中测试其活性。OX86是特异性地结合并触发mOX40的信号传导的大鼠抗mOX40 IgG1抗体(阿尔-沙姆哈尼(al-Shamkhani)等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)26:1695-1699(1996))，并且在癌症的免疫活性小鼠模型中具有抗肿瘤活性(温伯格AD等人，免疫学杂志164:2160-2169(2000))。为了使用具有与OX40mAb24类似的功能特性的小鼠替代抗体更全面地研究OX40激动的作用，从OX86产生了大鼠/小鼠抗mOX40 IgG2a嵌合抗体(OX86mIgG2a；大鼠抗OX40轻链和重链可变区与小鼠IgG2a恒定区)。此实例评估了三种小鼠癌症模型中OX86 mIgG2a的单剂抗肿瘤活性。
9.1 材料
在此研究中使用的材料和它们的来源在表9-1中列出。
表9-1 材料
项目 来源
磷酸盐缓冲盐水，pH7.2 生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州
胎牛血清，热灭活的 生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州
洛斯维公园纪念研究所1640培养基 生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州
0.25％胰蛋白酶-EDTA(1X) 生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州
EDTA＝乙二胺四乙酸。
9.2 实验方案
9.2.1 测试动物
在米迪缪尼公司接受来自哈兰实验室公司(印第安纳波利斯，印第安纳州)的6-8周龄的BALB/c和C57BL/6小鼠，并且在研究开始之前允许适应3天。此后，将小鼠在肿瘤植入部位剃毛，并植入用于鉴定的微芯片转发器。
根据米迪缪尼公司的实验动物资源设施的机构动物护理和使用委员会(实验动物护理的动物认证和美国农业部特许机构)批准的方案，将这些动物圈养。将动物保持在无菌微型隔离单元中，提供有无菌草垫和食物、以及自由采食的酸化饮用水。将环境条件标准化(室温：20℃±1℃；相对湿度：50％±10％；12小时光照-黑暗循环)。将动物针对不良的临床症状每天监测且针对体重每两周监测。如果注意到后肢麻痹、呼吸窘迫、20％体重损失、或肿瘤体积大于2000mm3，立即通过用CO2窒息人道地将动物处死。
9.2.2 同源肿瘤的建立和植入
从马纳萨斯，弗吉尼亚州的ATCC获得CT26和4T1。从俄勒冈州波特兰的普罗维登斯癌症中心获得MCA205细胞。将所有细胞在补充有10％FBS的RPMI 1640细胞培养基中培养，并在37℃、5％CO2下在湿润组织培养室中生长，然后收获，在FBS中洗涤一次，且然后重新悬浮于PBS中。
通过将悬浮于0.1mL PBS中的5.0×105CT26细胞或1.0×1054T1细胞皮下(SC)注射到7至9周龄的BALB/c小鼠的右侧腹中来建立同种异体移植物；而将悬浮于0.1mL磷酸盐缓冲盐水中的2.5×105MCA205细胞注射到7至9周龄的C57BL/6小鼠的右侧腹中。
9.2.3 随机化、组名称和剂量水平
BALB/c(总共216只)和C57BL/6(总共70只)雌性小鼠用于此研究中。在移植后9天肿瘤生长至每组120mm3的平均体积或移植后13天生长至每组200mm3的平均体积后，随机分配植入CT26肿瘤细胞的BALB/c小鼠。在移植后13天，在肿瘤生长至每组120mm3的平均体积之后，随机分配植入4T1肿瘤细胞的BALB/c小鼠。在移植后11天，在肿瘤生长至每组95mm3的平均体积之后，随机分配C57BL/6小鼠。组名称、动物数目、剂量水平和剂量时间表呈现于表9-2、表9-3、表9-4和表9-5中。通过腹膜内(IP)注射给予所有测试抗体和对照抗体。目前还没有动物替换。
当肿瘤体积达到大约2000mm3或当肿瘤变得溃烂或坏死时，将来自每个组的动物杀死。
表9-2 研究设计：CT26同源模型
F＝雌性；IgG1＝免疫球蛋白G1；IP＝腹膜内；mAb＝单克隆抗体；OX86 mIgG2a＝具有小鼠IgG2a恒定区的克隆OX86的大鼠抗OX40轻链和重链可变区；OX86 mIgG1 D265A＝在Fc结构域中具有降低其结合Fcγ受体能力的点突变的小鼠抗小鼠OX40 mIgG1；NA＝因为动物未进行处理而不适用；ROA＝给药途径。a剂量体积：0.2mL。
表9-3 研究设计：CT26同源模型
F＝雌性；IP＝腹膜内；OX86 mIgG2a＝具有小鼠IgG2a恒定区的克隆OX86的大鼠抗OX40轻链和重链可变区；NA＝因为动物未进行处理而不适用；ROA＝给药途径。a剂量体积：0.2mL。
表9-4 研究设计：MCA205同源模型
F＝雌性；IP＝腹膜内；OX86 mIgG2a＝具有小鼠IgG2a恒定区的克隆OX86的大鼠抗OX40轻链和重链可变区；NA＝因为动物未进行处理而不适用；ROA＝给药途径。a剂量体积：0.2mL。b混合物含有具有mIgG2a(10mg/kg)和mIgG2b(10mg/kg)的Fc结构域的同种型对照抗体。
表9-5 研究设计：4T1同源模型
F＝雌性；IP＝腹膜内；OX86 mIgG2a＝具有小鼠IgG2a恒定区的克隆OX86的大鼠抗OX40轻链和重链可变区；NA＝因为动物未进行处理而不适用；ROA＝给药途径。a剂量体积：0.2mL。b混合物含有具有mIgG2a(10mg/kg)、mIgG2b(20mg/kg)、大鼠IgG2a(20mg/kg)和大鼠IgG2b(20mg/kg)的Fc结构域的同种型对照抗体。
9.2.4 肿瘤测量
通过卡尺每周两次测量肿瘤且使用以下公式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(V)＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2
其中，长被定义为较大边且宽被定义为垂直于长的较小边。
每个组的抗肿瘤作用被表示为肿瘤生长抑制(TGI)，其如下计算：
％TGI＝(1-[处理组的平均V]÷[对照组的平均V]×100
如果没有可测量的肿瘤，则肿瘤生长应答被归类为完全应答(CR)。
9.3 统计方法
单向方差分析(One-way ANOVA)被用于确定平均肿瘤体积差异。在显著的F测试的情况下，使用邓尼特的(Dunnett’s)或Sidak’s多重比较试验(适用时)。适用时，对肿瘤体积应用log10转化来解释异方差性。p值<0.05被认为是显著的。
9.4 结果
与未处理的或阴性、或同种型对照抗体处理的小鼠对照相比，用OX86 mIgG2a处理小鼠导致CT26和MCA205肿瘤细胞的生长显著降低(表9-6、表9-7和表9-8；图26A、图27A和图28A)。与未处理或同种型对照抗体相比，用OX86 mIgG2a处理小鼠导致4T1肿瘤细胞的生长延迟和降低(表9-9和图29A)。
混合应答通常在同源模型中显示；然而，从单个动物肿瘤生长图用OX86 mIgG2a处理的显著应答更清楚(图26B、图27B、图28B和图29B)。基于TGI(表9-6、表9-7、表9-8和表9-9；图26A、图27A、图28A和图29A)或相对于增加展示完全应答的动物的数目(表9-6、表9-7、表9-8和表9-9)，在用OX86 mIgG2a处理的小鼠中未观察到剂量反应。
表9-6 处理组、在第22天的肿瘤生长抑制百分比、以及在CT26同源模型中完全应答的数目
IP＝腹膜内；NA＝不适用；TGI＝肿瘤生长抑制；V体积。
an＝12。
b所有动物在第13和16天接受200μL测试抗体(IP)。
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100。
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
表9-7 处理组、在第26天的肿瘤生长抑制百分比、以及在CT26同源模型中完全应答的数目
IP＝腹膜内；NA＝不适用；TGI＝肿瘤生长抑制；V体积。
an＝10。
b所有动物在第9和12天接受200μL测试抗体(IP)。
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100。
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
表9-8 处理组、在第22天的肿瘤生长抑制百分比、以及在MCA205同源模型中完全应答的数目
表9-9 处理组、在第25天的肿瘤生长抑制百分比、以及在4T1同源模型中完全应答的数目
IP＝腹膜内；NA＝不适用；TGI＝肿瘤生长抑制；V体积；ND＝未确定。
an＝12。
b所有动物在第13、16、20和23天接受200μL测试抗体(IP)。
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100。
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
9-5 结论
与未处理的、阴性对照、和/或同种型对照处理的组相比，用OX86 mIgG2a单一药剂处理荷瘤小鼠导致显著降低多个肿瘤的生长的抗肿瘤活性。实例10：OX40mAb24的表位的表征
此实例使用一系列人/小鼠OX40嵌合变体检查OX40mAb24的表位。
10.1 在此研究中使用的材料和它们的来源在表10-1中列出。
表10-1 材料
项目 来源
抗人IgG-Alexa480 英杰公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)
抗绵羊IgG-Alexa-480 英杰公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)
抗山羊IgG-Alexa480 英杰公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)
FreeStyle293F细胞(HEK293F细胞) 英杰公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)
山羊抗小鼠OX40多克隆抗体 R&D系统公司(明尼阿波利斯，明尼苏达州)
LSRII流式细胞仪 BD生物科学公司(圣何塞，加利福尼亚州)
磷酸盐缓冲盐水 英杰公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)
绵羊抗人OX40多克隆抗体 R&D系统公司(明尼阿波利斯，明尼苏达州)
293fectin转染试剂 英杰公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)
10.2 人/小鼠嵌合变体的产生
OX40mAb24特异性地结合人OX40(SEQ ID NO:91)且不识别小鼠OX40(SEQ ID NO:92)，尽管在它们的氨基酸(aa)序列中共享60％一致性(图30)。通过交换人与小鼠OX40之间的细胞外结构域的部分来工程化人/小鼠嵌合OX40变体。将人和小鼠OX40的cDNA构建体用作重叠延伸PCR中的模板，以构建具有跨膜结构域的嵌合变体用于重组蛋白的细胞表面表达。OX40是具有三个完整富含半胱氨酸的结构域(CRD)和一个截短的富含半胱氨酸的结构域的大约45kDa蛋白质。该结构是TNFR超家族的特征。
通过用相应的小鼠OX40aa或丙氨酸置换人OX40的细胞外结构域的以下残基来构建十三种嵌合敲除(KO/功能丧失)变体(图31)：
··CRD1(人OX40aa 29至65用小鼠对应物置换)；
··CRD2(人OX40aa 66至107用小鼠对应物置换)；
··CRD3(人OX40aa 108至146用小鼠对应物置换)；
··CRD4+连接子(人OX40aa 147至214用小鼠对应物置换)；
··CRD3+4(人OX40aa 108至167用其小鼠对应物置换)；
··A111(人OX40aa丙氨酸111用其小鼠对应物脯氨酸置换)；
··L116(人OX40aa亮氨酸116用其小鼠对应物谷氨酰胺置换)；
··P121(人OX40aa脯氨酸121用其小鼠对应物亮氨酸置换)；
··A126(人OX40aa丙氨酸126用其小鼠对应物缬氨酸置换)；
··D137(人OX40aa天冬氨酸137用其小鼠对应物天冬酰胺置换)；
··A111P121D137(人OX40aa Ala111、Pro121和Asp137用小鼠对应物置换)；
··L116A126(人OX40aa Leu116和Ala126用小鼠对应物置换)；以及
··D117S118(人OX40aa Asp117和Ser118用Ala突变置换)。
另外，使用与如上文针对KO构建体所描述的相同方法将人OX40的以下残基接枝到小鼠OX40中构建了五种敲入(KI/功能获得性)变体(图31)：
·CRD3(人OX40aa 108至146接枝到相应小鼠区域中)；
·A111(人OX40aa丙氨酸111接枝到相应小鼠位置中)；
·L116(人OX40aa亮氨酸116接枝到相应小鼠位置中)；
·A126(人OX40aa丙氨酸126接枝到相应小鼠位置中)；
·L116A126(人OX40aa亮氨酸116和丙氨酸126接枝到相应小鼠位置中)。
将所得嵌合DNA克隆到用于瞬时哺乳动物表达的哺乳动物表达载体pEBNA中。在转染前一天将293F细胞以0.7×106个细胞/mL的密度接种。按照制造商的说明书，使用5μL的293fectin转染试剂将3.5微克的每种表达载体转染到5mL的HEK293F细胞中。
10.3 OX40mAb24与嵌合OX40变体的结合的表征
在转染后48小时，将HEK293F细胞与1μg/mL的OX40mAb24在PBS中在冰上孵育1小时。为了通过流式细胞术检测结合的OX40mAb24，将细胞用冷PBS洗涤3次，与1μg/mL的Alexa480轭合的抗人IgG抗体在冰上孵育1小时，且然后使用LSRII流式细胞仪分析。
还通过流式细胞术监测所有嵌合OX40变体的表达水平；将细胞与绵羊抗人OX40和山羊抗小鼠OX40多克隆抗体的混合物在PBS中以μg/mL在冰上孵育1小时。将细胞用冷PBS洗涤3次，且然后与Alexa480轭合的抗山羊和抗绵羊IgG多克隆抗体的混合物一起孵育。用冷PBS洗涤3次后，用LSRII流式细胞仪分析细胞。
10.4 结果
使用嵌合人/小鼠变体表征OX40mAb24的表位。人OX40和小鼠OX40在aa序列中共享60％一致性(图30)；但是，OX40mAb24特异性地结合人OX40并且不识别小鼠OX40。这种特异性用于鉴别OX40mAb24的表位。通过将小鼠OX40的细胞外结构域的各个结构域移入或移出人OX40中(KO/功能丧失变体)或将人OX40的细胞外结构域的各个结构域移入或移出小鼠OX40中(KI/功能获得性变体)来构建十八种嵌合变体(图31)。所有变体编码用于嵌合蛋白质的细胞表面表达的跨膜结构域。通过流式细胞术分析OX40mAb24与这些变体的结合特征。
通过交换人与小鼠OX40之间的单个结构域来将OX40mAb24的表位映射至人OX40的CRD3结构域。当用小鼠对应物置换人CRD3结构域时(KO_CRD3和KO_CRD3-4)，OX40mAb24与人OX40的结合被消除(图32A-32C)。用小鼠区域置换其他人CRD结构域不影响OX40mAb24的结合(KO_CRD1、KO_CRD2、以及KO_CRD4+连接子)。此外，将人CRD3结构域接枝到小鼠OX40中导致OX40mAb24的结合(KI_CRD3)。如所监测所有变体均通过抗人和小鼠OX40多克隆抗体表达(图32A-32C)。OX40mAb24、9B12的亲本mAb也在结合研究中进行了表征。9B12显示与这些变体的与OX40mAb24相同的结合谱，从而表明两种IgG均识别CRD3结构域的相同表位。
此外，通过突变在人与小鼠OX40之间不同的氨基酸，在CRD3结构域中鉴别了关键表位残基Leu116和Ala126。将人CRD3结构域中的5种氨基酸(包括Ala111、Leu116、Pro121、Ala126、以及Asp137)(图30)突变为相应的小鼠残基或Ala作为单独的氨基酸或不同的组合(图31)。当用小鼠对应物置换人残基Leu116和Ala126时(KO_L116+A126)，OX40mAb24的结合被消除。此外，KI/功能获得性变体证实了这两种关键残基的重要性。将Leu116、Ala126或组合接枝到小鼠OX40中导致OX40mAb24的结合。
10.5结论
使用具有关键残基Leu116和Ala126的人/小鼠嵌合变体将表位OX40mAb24映射至人OX40的CRD3结构域。OX40mAb24与其亲本9B12之间的所有变体的结合谱是一致的，从而表明它们识别人OX40上的相同表位。
实例11：大鼠/小鼠抗小鼠OX40 IgG2a嵌合体抗体克隆OX86在初次接受实验的小鼠和携带同源肿瘤的小鼠中的药效动力学活性
OX86是特异性地结合mOX40并触发mOX40的信号传导的大鼠抗mOX40 IgG1抗体(阿尔-沙姆哈等人，1996)，并且在癌症的免疫活性小鼠模型中具有抗肿瘤活性(温伯格等人，2000)。为了使用具有类似于OX40mAb24的功能特性的小鼠替代抗体更全面地研究OX40激动的作用，此实例使用实例9中所述的大鼠/小鼠抗mOX40 IgG2a嵌合体抗体OX86。然而，有可能在这些物种之间绘出一些相似之处，例如mIgG2a和人IgG1通常被认为是在功能上等效的，因为两种同种型均能够结合多个Fcγ受体，能够具有高亲和性Fcγ受体结合并且能够触发ADCC并结合人C1q(经典补体途径的补体依赖性细胞毒性(CDC)的一个先决条件)(斯图尔特等人，2014；戴尔’阿夸等人，2006)。OX86 mIGg2a结合小鼠OX40(参见实例9)并用作OX40mAb24的替代小鼠OX40激动剂抗体。
在此实例中，对OX86 mIgG2a在初次接受实验的小鼠和携带肿瘤的小鼠中诱导T细胞并进入细胞周期且增殖的能力进行了研究。此外，K167和ICOS被评价为OX40激动剂活性的潜在生物标志物。在癌症的两个同源小鼠模型中测定了T细胞增殖和抗肿瘤活性。此外，最后确定了活化(Fcγ受体I、III和IV)和/或抑制性(Cfγ受体IIb)Fcγ受体在OX86mIgG2a的体内活性中的作用。
11.1 材料和方法
11.1.1 动物接收和鉴定
在米迪缪尼公司接受来自哈兰实验室公司(印第安纳波利斯，印第安纳州或查尔斯河实验室(英国))的6-8周龄的野生型Fcgr2b-/-或Fcer1g-/-BALB/c以及Fcgr2b-/-或Fcer1g-/-C57BL/6小鼠，并且在研究开始之前允许适应<15天。此后，将小鼠植入微芯片转发器以鉴别个体小鼠。
11.1.2 圈养
根据米迪缪尼公司的实验动物资源设施(美国)和生物科学单元(英国)的机构动物护理和使用委员会(美国)和内政部(英国)(实验动物护理的动物认证和美国农业部特许机构)批准的方案，这些动物被人道处理和圈养。将动物保持在无菌微型隔离单元中，提供有无菌草垫和食物、以及自由采食的酸化饮用水(美国)或自来水(英国)。将环境条件标准化(室温：20℃±1℃(美国)或21℃±1℃(英国)；相对湿度：50％±10％(美国)或55％±10％(英国)；12小时光照-黑暗循环)。将动物针对不良的临床症状每天监测且针对体重每两周监测。如果注意到后肢麻痹、呼吸窘迫、20％体重损失、或肿瘤体积大于2000mm3，立即通过颈脱位法或用CO2窒息人道地将动物杀死。
11.1.3 同源肿瘤的建立
CT26细胞系(小鼠结肠癌)获自弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC，并且细胞系MCA 205(化学诱导的小鼠软组织肉瘤)获自俄勒冈州波特兰的普罗维登斯癌症中心。将两种细胞系在37℃、5％CO2下维持在RPMI 1640培养基+10％FBS中。
通过将重新悬浮于0.1mL PBS中的5.0×105个CT26细胞皮下(SC)注射到7至9周龄野生型、Fcgr2b-/-或Fcer1g-/-BALB/c小鼠的右侧腹中来建立同种异体移植物。还通过将重新悬浮于0.1mL PBS中的2.5×105个MCA205细胞皮下(SC)注射到7至9周龄野生型、Fcgr2b-/-或Fcer1g-/-C57BL/6小鼠的右侧腹中来建立同种异体移植物。
11.1.4 随机化、组名称和剂量水平
野生型(n＝70)、Fcgr2b-/-(n＝36)或Fcer1g-/-(n＝36)BALB/c和Fcgr2b-/-(n＝36)或Fcer1g-/-C57BL/6雌性小鼠(n＝36)用于此研究中。将所有小鼠随机分配到处理组中。组名称、动物数目、剂量水平和剂量时间表呈现于表11-1、表11-2和表11-3中。腹膜内(IP)给予所有测试物品和对照物品。目前还没有动物替换。
当肿瘤体积达到大约2000mm3或当肿瘤变得溃烂或坏死时，将来自每个组的动物杀死。
表11-1 初次接受实验的Balb/c小鼠的组名称和剂量水平
F＝雌性；M＝雄性；NA＝不适用；IP＝腹膜内；ROA＝给药途径；OX86 mIgG2a＝OX86的小鼠抗小鼠OX40 IgG2a单克隆抗体变体
a剂量体积：对于盐水0.2mL或根据体重调整体积；对于所有其他组10mL/kg。
表11-2 CT26同源模型中的组名称和剂量水平
F＝雌性；M＝雄性；NA＝因为动物未进行处理而不适用；IP＝腹膜内；ROA＝给药途径；OX86 mIgG2a＝具有小鼠IgG2a恒定区的克隆OX86的大鼠抗OX40轻链和重链可变区。
a剂量体积：0.2mL。
表11-3 MCA205同源模型中的组名称和剂量水平
F＝雌性；M＝雄性；NA＝因为动物未进行处理而不适用；IP＝腹膜内；ROA＝给药途径；OX86 mIgG2a＝具有小鼠IgG2a恒定区的克隆OX86的大鼠抗OX40轻链和重链可变区。
a剂量体积：0.2mL。
11.1.5 肿瘤测量
通过卡尺每周两次测量肿瘤且使用以下公式计算肿瘤体积：
肿瘤体积＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2
其中，长度被定义为较大边且宽度被定义为垂直于长度的较小边。
每个组的抗肿瘤作用被表示为肿瘤生长抑制(TGI)，其如下计算：
％TGI＝(1-[处理组的平均肿瘤V]÷[对照组的平均肿瘤V])×100
11.1.6 组织收集和单一细胞分离
11.1.6.1 用于流式细胞术分析的小鼠血细胞的制备
向血液(50μL)中添加红血细胞裂解(RBCL)缓冲液(2mL)并孵育5分钟。从活体出血获得的体积范围为20μL至50μL。终点出血是50μL。将RPMI+10％胎牛血清(FBS)(8mL)添加至每种样品。将每种样品中的细胞沉淀(300×g，5分钟)，且然后重新悬浮于0.3mL流动缓冲液中。将细胞悬浮液(200μL)添加至96孔圆底板的每个孔以用于用荧光抗体染色。合并组样品用于未染色的、单一抗体染色、同种型染色和荧光减一(FMO)抗体染色对照。
11.1.6.2 小鼠引流淋巴结和脾脏分离以及用于流式细胞术分析的单细胞悬浮液的产生
将脾脏置于10mL的RPMI+1X Pen/Strep溶液中，并穿过40μm细胞过滤器。将样品沉淀(300×g，5分钟)，且然后重新悬浮于1mL RBCL缓冲液中3分钟。将RPMI+FBS 10％(9mL)添加至每种样品中。将细胞悬浮液沉淀(300 x g，5分钟)，并且重新悬浮于1mL流动缓冲液中。将细胞悬浮液(100μL)添加至96孔圆底板的每个孔以用于用荧光抗体染色。合并组样品用于未染色的、单一抗体染色、同种型染色和FMO抗体染色对照。
11.1.6.3 用于流式细胞术分析的小鼠肿瘤的单细胞悬液的制备
从安乐死的小鼠无菌切除肿瘤，小心以避免收集结缔组织或皮肤，并置于用汉克氏平衡盐溶液稀释在6孔培养皿中的胶原酶中。为了提高酶消化过程的效率，将每个肿瘤用手术刀或小的锋利剪刀切成较小的块。将切碎的肿瘤转移到15mL锥形管中并置于振荡平台上以在37℃下孵育20-30分钟。将5mL的RPMI+10％FBS添加至每种样品中以使胶原酶失活并保持免疫细胞的活力。将样品穿过70μM细胞过滤器并置于50mL锥形管中。移除每种样品的等分试样以用于计数。将剩余量的样品在离心机中在330 x g下沉淀，并以1×107个细胞/mL的浓度重新悬浮于FACS缓冲液(PBS+2％FBS)中。
'
11.1.7 流式细胞术分析
11.1.7.1 来自非荷瘤小鼠的组织的分析
将血液或脾细胞的单细胞悬浮液沉淀(300 x g，5分钟)，重新悬浮于50μL的Fc阻断溶液(1:50)中，在eBiosciences流动缓冲液中稀释，并在冰上孵育10分钟。向每种样品添加50微升荧光标记的抗体(2X储备溶液)(最终体积100μL)。以1μL/孔添加单一抗体染色溶液(细胞外)，且将细胞/抗体混合物在冰上孵育30分钟。将细胞沉淀(300 x g，5分钟)，洗涤两次(200μL流动缓冲液/孔，300 x g，5分钟)，重新悬浮于50μL Fix/Penn缓冲液(一份浓缩液至三份稀释剂)中，且然后在4℃下在黑暗中孵育过夜。
将处理的细胞在1X透化缓冲液(在水中稀释)洗涤两次。将细胞内标记抗体稀释到透化缓冲液(100μL/孔)中，并且添加至细胞，然后将其在室温下在黑暗中孵育30分钟。将用于单标记物染色(细胞内)的抗体添加至以1μL/孔到100μL透化缓冲液中的细胞，并在黑暗中在冰上孵育30分钟。将细胞在透化缓冲液中洗涤一次，并重新悬浮在3.7％甲醛溶液(100μL)中，然后在Canto II流式细胞仪(BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)上进行分析。
11.1.7.2 来自荷瘤小鼠的组织的分析
11.1.7.2.1 细胞表面染色
将沉淀细胞的每种样品重新悬浮于FACS缓冲液中。将FACS缓冲液中的荧光抗体混合物添加至适当的孔中，并在4℃下在黑暗中孵育20-30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重新悬浮于FACS缓冲液中，并在LSRII流式细胞仪(BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)上进行分析。
11.1.7.2.2 细胞内染色(固定和透化细胞)
将沉淀细胞的每种样品重新悬浮在50μL的用于活/非存活细胞区别的荧光可固定蓝色染料的1:500稀释液中，并在4℃下在黑暗中孵育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤一次，重新悬浮于含有Fc阻断的30μL PBS+4％正常小鼠血清中，并在室温下孵育15分钟。将FACS缓冲液中的荧光抗体混合物添加至适当的孔中，并在4℃下在黑暗中孵育20-30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重新悬浮于150μL新鲜制备的FoxP3Fix/Penn工作溶液中，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。将细胞用1X透化缓冲液洗涤两次，重新悬浮于含有抗体的100μL 1X透化缓冲液中以染色细胞内抗原，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。将细胞用1x透化缓冲液洗涤一次，重新悬浮于FACS缓冲液中，并在LSRII流式细胞仪上进行分析。
11.1.8 统计方法
用单向方差分析来确定平均肿瘤体积差异和Ki67+或ICOS+细胞的平均百分比。在显著性F检验的情况下，使用邓尼特氏(Dunnett’s)或Sidak氏多重比较检验(适用时)。适用时，对平均体积应用log10转化来解释异方差性。p值<0.05被认为是显著的。GraphPadPrism 6.0用于线性回归分析，其生成从X最佳预测Y的最佳拟合线、该线的统计显著性水平和所确定的最佳拟合线的拟合优度(r2)。
11.1.9 材料
在此研究中使用的材料和它们的来源在表11-4和表11-5中列出。
表11-4 材料
表11-5 用于流式细胞术研究的荧光抗体
项目 来源
APC轭合的大鼠IgG2a抗CD4 eBiosciences公司，英国
FITC轭合的mIgG2a抗MHC2 eBiosciences公司，美国
APC-H7轭合的大鼠IgG2a抗CD8 BD生物科学公司，英国
EFluor480轭合的大鼠IgG2a抗Ki67 eBioscience公司，英国
APC轭合的同种型对照大鼠IgG2a eBioscience公司，英国
APC-H7轭合的同种型对照大鼠IgGa BD生物科学公司，英国
eFluor轭合的同种型对照大鼠IgG2a eBioscience公司，英国
PE轭合的同种型对照大鼠IgG2b eBioscience公司，英国
PECy7轭合的rlgG2aKi67 eBioscience公司，美国
BV605轭合的rlgG2a抗CD4 生物传奇公司，美国
BV711轭合的rlgG2a抗CD8 生物传奇公司，美国
可固定的蓝色 生命技术公司，美国
PeCy7轭合的同种型对照rlgG2a 生物传奇公司，美国
11.2 结果
与用对照制品处理的小鼠相比，用抗OX40抗体OX86小鼠IgG2a(OX86 mIgG2a)腹膜内处理初次接受实验的小鼠导致随时间推移血液中Ki67+CD4+和ICOS+CD4+T细胞的百分比的显著剂量依赖性和瞬时增加(图33A和33C)。在第10天检测到Ki67+CD4+和ICOS+CD4+T细胞的最高百分比。与用对照制品处理的小鼠相比，在给予OX86 mIgG2a后第10天，在小鼠的脾脏中测量到Ki67+CD4+和ICOS+CD4+T细胞百分比的显著增加(图33B和33D)。鉴别了第10天血液和脾脏中Ki67+CD4+T细胞和ICOS+CD4+T细胞的百分比之间的统计上显著和较强的相关性(图34A和图34B)。
与用对照制品处理的小鼠相比，用OX86 mIgG2a处理初次接受实验的小鼠还导致随时间推移血液中Ki67+CD8+T细胞的百分比的显著瞬时增加(图35A)。在用OX86 mIgG2a处理后，检测到随时间推移血液中ICOS+CD8+T细胞的百分比增加(图35C)，以及在第10天脾脏中Ki67+CD8+T细胞的百分比增加(图35B)，但当与用对照制品处理相比都不是统计上显著的。与用对照制品处理的小鼠相比，用OX86 mIgG2a处理处理接受实验的小鼠未诱导第10天脾脏中ICOS+CD8+T细胞的百分比的显著剂量依赖性增加(图35D)。确定了血液和脾脏中Ki67+CD8+T细胞和ICOS+CD8+T细胞的百分比之间的中等但显著的相关性(图36A和图36B)。
与未处理的和同种型对照处理的组相比，用OX86 mIgG2a单药剂处理荷瘤野生型小鼠导致两种组织学上不同的肿瘤的生长降低的抗肿瘤活性(参见实例9)。当在遗传工程化为缺乏抑制性Fcγ受体IIB表达的C57BL/6小鼠(Fcgr2b-/-小鼠)中与对照制品处理相比时，用OX86 mIGg2a处理导致在第20天MCA205肿瘤的生长显著降低(图38A，表11-7)。当在Fcgr2b-/-BALB/c小鼠中用对照制品处理相比时，用CT26肿瘤相同处理小鼠导致在第18天未达到统计显著性的肿瘤生长减少(图37A，表11-6)。在遗传工程化为缺乏活化Fcγ受体表达的荷瘤Balb/c和C57BL/6小鼠中，未观察到通过任何药剂的生长抑制(Fcer1g-/-小鼠；图37C；图38C)。在同源模型中通常观察到混合应答。然而，在Fcγ受体敲除小鼠的两种不同品系中用OX86 mIgG2a处理后的抗肿瘤应答也可以从单独动物肿瘤生长图中看出(图37B和37D；图38B和38D)；用OX86 mIgG2a处理导致CT26和MCA205肿瘤生长的抑制，并且在一些情况下在Fcgr2b-/-小鼠中诱导完全应答(图37B；图38B)。
表11-6 处理组和TGI百分比以及在CT26同源小鼠模型中完全应答的数目
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹膜内；V＝体积
a每组动物的数目：8。
b所有动物在第4和7天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100；对于Fcgr2b-/-小鼠，在第18天计算，并且对于Fcer1g-/-小鼠在第16天计算
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
表11-7 处理组和在第20天的TGI百分比以及在MCA205同源小鼠模型中完全应答的数目
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹膜内；V＝体积
a每组动物的数目：8。
b所有动物在第4和7天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(处理组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
在并行药效动力学研究中，与对照制品相比，用OX86 mIgG2a处理导致脾脏中Ki67+CD4+T细胞(图39A)以及外周血和脾脏中Ki67+CD8+T细胞百分比的显著增加，但在携带CT26肿瘤的Fcgr2b-/-Balb/c小鼠的肿瘤中未不如此(图40A)。与对照制品相比，在用OX86mIgG2a处理后，携带CT26肿瘤的Fcer1g-/-Balb/c小鼠的血液、脾脏或肿瘤中未检测到Ki67+CD4+或CD8+T细胞的增加(图39B；图40B)。
另外，在并行研究中，与对照制品相比，用OX86 mIgG2a处理导致携带MCA205肿瘤的Fcgr2b-/-C57BL/6小鼠的引流淋巴结、脾脏和肿瘤中Ki67+CD4+T细胞(图41A)以及引流淋巴结和脾脏中Ki67+CD8+T细胞(图42A)百分比的显著增加。携带MCA205肿瘤的Fcgr2b-/-C57BL/6小鼠的肿瘤中Ki67+CD8+T细胞的百分比的增加不是统计上显著的(图42A)。与对照制品相比，用OX86 mIgG2a处理也诱导携带MCA205肿瘤的Fcer1g-/-C57BL/6小鼠的引流淋巴结和脾脏中Ki67+CD4+T细胞的百分比的显著增加(图41B)。还观察到这些小鼠的脾脏中Ki67+CD8+T细胞百分比的显著增加(图42B)。未检测到携带MCA205肿瘤的Fcgr2b-/-C57BL/6小鼠的肿瘤中Ki67+CD4+T细胞(图42B)或引流淋巴结或肿瘤中Ki67+CD8+T细胞百分比的显著增加(图42B)。
11.3 结论
初次接受实验的小鼠中单剂量的OX86 mIgG2a诱导T细胞活化和增殖的瞬时增加，如分别通过ICOS和Ki67的表达增加所测量。发现ICOS和Ki67对CD4+和CD8+T细胞百分比的显著线性相关。作为CT26和MCA205肿瘤生长的抑制测量的OX86 mIgG2a的抗肿瘤活性依赖于活化Fcγ受体I、III和IV的表达，但不依赖于抑制性Fcγ受体IIB。在表达活化Fcγ受体的荷瘤小鼠中，在并行药效动力学实验中观察到外周血、引流淋巴结和/或脾脏T细胞增殖(Ki67)的增加；在仅表达抑制性Fcγ受体的小鼠中观察到一些T细胞增殖。连同来自初次接受实验的小鼠的药效动力学结果且虽然不希望受理论束缚，但OX86 mIgG2a抗肿瘤活性的潜在机制是增加的外周和肿瘤内T细胞增殖(Ki67)。此外，OX86 mIgG2a体内抗肿瘤活性在活化Fcγ受体表达时发生。
实例12：植入人造血干细胞的免疫受损小鼠中对OX40mAb24处理的应答的T细胞药效动力学变化
此实例研究OX40mAb24是否能够用重构的人免疫系统活化和扩增人CD4+和CD8+记忆T细胞或减少免疫受损小鼠中的人Treg。在用人免疫细胞重构的体内小鼠模型系统中对OX40mAb24进行了测试，以确定该药物是否对人T细胞具有免疫调节作用。
12.1 材料和方法
12.1.1 测试动物
Nod.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wy/SzJ(NSG)小鼠(n＝14，23-26周龄)获自杰克逊实验室。按照米迪缪尼公司的实验动物资源设施的机构动物护理和使用委员会(实验动物护理的动物认证和美国农业部特许机构)批准的协议，这些动物被人道处理和圈养。将动物保持在无菌微型隔离单元中，提供有无菌草垫和食物、以及自由采食的酸化饮用水。将环境条件标准化(室温：20℃±1℃；相对湿度：50％±10％；12小时光照-黑暗循环)。在研究过程期间将动物针对不良的临床症状每天监测。
12.1.2 OX40mAb24在HSC植入(人源化)小鼠中的药效动力学
12.1.2.1 人HSC植入小鼠的建立
人CD34+HSC植入小鼠购自杰克逊实验室。如下小鼠产生：分离来自多个脐带血供体的合并的人CD34+细胞，并静脉注射到Nod.Cg-Prkdcscid112rgtm1Wy/SzJ(NSG)小鼠的尾静脉中。在植入后12周，对小鼠外周血取样，并用Pharm Lyse红血细胞裂解缓冲液裂解，且然后通过流式细胞术分析人CD45、CD19和CD3阳性细胞，以确定小鼠中人免疫细胞移植的程度。随后将成功植入总体存活血细胞的25％或更多的CD45+人免疫细胞的小鼠运输至米迪缪尼公司。
12.1.2.2 人HSC植入小鼠的抗原激发和OX40mAb24处理
在注射人CD34细胞后22周，通过流式细胞术证实人免疫细胞持续移植到NSG小鼠中，并且在23周时，将小鼠置于3组中，这些组不被接触或接受处理(表12-1)。在实验开始之前第22周，最终处理组之间的人CD45+细胞移植的平均百分比没有统计学显著性差异。组1由4只小鼠组成且未接受皮下(SC)钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)免疫或抗体给予。组2由5只小鼠组成且在两个独立的注射SC部位接受300μg/50μL的KLH和50μL的完全弗氏佐剂(CFA)。该组小鼠也在KLH免疫后1天接受腹膜内(IP)给予的2mg/kg的hIgG1同种型对照抗体。组3由5只小鼠组成，并且如上所述接受KLH/CFA SC免疫。此外，一天后还给予小鼠单次IP剂量的2mg/kg OX40mAb24。在KLH/CFA SC免疫当天，在免疫(预处理)之前和7天后(处理后)，通过后眼眶出血获得全血，并通过流式细胞术对细胞进行免疫分型和计数。
表12-1 实验组、人CD45+细胞移植和处理
Hu＝人；KLH＝钥孔虫戚血蓝蛋白；HSC＝造血干细胞。
a通过流式细胞术测定的人CD45+细胞；bKLH免疫、钥孔虫戚血蓝蛋白加完全弗氏佐剂。
12.1.2.3 通过流式细胞术进行的免疫细胞分析
使用全血抗体结合方案通过流式细胞术对细胞进行免疫分型。简言之，将恒定体积的EDTA抗凝全血添加至深孔板的孔中，并将T细胞染色主混合物添加至细胞以结合细胞表面抗原。在FACS缓冲液(PBS，pH 7.2加2％热灭活的新生小牛血清)中洗涤后，使用1X RBC裂解缓冲液裂解红血细胞(RBC)，并且使用EBiosciences固定和透化试剂盒根据制造商的方案固定和透化细胞。随后，将抗FoxP3和抗Ki67mAb结合至细胞。使用1X固定和透化缓冲液洗涤细胞，重新悬浮于FACS缓冲液中，并使用LSRII流式细胞仪分析事件。使用FlowJo软件分析原始流式细胞术标准(FCS)数据，并在活/死细胞鉴别和除去双重细胞和细胞碎片后鉴定细胞群体。在CD4+和CD8+T细胞群体门控后，通过CD45RA和CCR7表达谱确定记忆T细胞，将初始T细胞定义为CD45RA+/CCR7+，效应T细胞(Teff)定义为CD45RA+/CCR7-，效应记忆T细胞(Tem)定义为CD4SRA-/CCR7-，以及中心记忆T细胞(Tcm)定义为CD45RA-/CCR7+。Treg被定义为CD4+/FoxP3+细胞。
12.1.2.4 统计方法
用于Windows的GraphPad Prism软件(6.03版)用于数据的图形化和统计分析。
单向方差分析多重比较检验与杜凯氏后检验分析用于比较实验组平均值之间的差异。在显著性F检验的情况下，使用Sidak氏多重比较检验。小于0.05的p值被认为是显著的。
12.1.3 材料
在此研究中使用的材料和它们的来源在表12-2中列出。
表12-2 材料
12.2 结果
在用KLH免疫后一天给予OX40mAb24或huIgG1对照抗体。相对于给予huIgG1同种型对照抗体的组，OX40mAb24导致在六天后外周血中Treg百分比的统计上显著的降低(P＝0.019，单向方差分析；图43A和图43B)。在免疫和抗体给予之前，未观察到处理组之间Treg的百分比差异。
除了外周血Treg百分比的显著降低之外，相对于huIgG1同种型匹配对照，在用OX40mAb24处理后，CD4+Tem:Treg比率存在统计上显著的增加(p＝0.042)，并且趋势朝向总CD4+:Treg(p＝0.051)、CD4+Teff:Treg(p＝0.10)、以及CD4+Tem:Treg(p＝0.069)比率的显著增加(图44A-44D)。同样地，相对于用huIgG1同种型对照处理的小鼠，观察到在用OX40mAb24处理的小鼠的外周血中CD8+Teff:Treg比率增加的朝向显著性的趋势(p＝0.064)(图45A-45B)。
CD25(IL-2受体)在活化后在T细胞上上调，并且被认为是最近活化的T细胞的标志物。相对于总CD8+(p＝0.038)、效应CD8+(p＝0.076)和效应记忆CD8+(p＝0.040)T细胞的huIgG1处理组，对于OX40mAb24处理组相观察到CD25阳性CD8+T细胞百分比的增加(图46A-46C)。因此，相对于对照抗体，OX40mAb24对OX40的激动作用活化CD8+T细胞。
12.3 结论
在植入人免疫细胞的小鼠中，在抗原免疫后用OX40mAb24处理导致相对于接受人IgG1对照抗体的小鼠，外周Treg细胞减少。同样，与接受huIgG1对照抗体的那些小鼠相比，在接受OX40mAb24的小鼠的外周血中，相对于Treg细胞，总、效应和记忆CD4+T细胞以及效应CD8+T细胞的比例也增加。最后，在OX40mAb24处理后，细胞表面上表达CD25的CD8+T细胞的百分比增加，从而表明OX40诱导外周CD8+T细胞活化。
序列表
<110> 米迪缪尼有限公司（MEDIMMUNE, LLC）
<120> 人源化抗OX40抗体及其用途
<130> OX40H-100WO1
<140>
<141>
<150> 62/062,431
<151> 2014-10-10
<160> 98
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asp Leu Asp Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 2
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 3
Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 4
Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 8
Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gln或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Ile或Met
<400> 9
Trp Ile Arg Xaa His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Xaa Xaa Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 10
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 11
Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 12
Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 13
Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 14
Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 15
Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 16
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Pro或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Tyr或Phe
<400> 17
Arg Ile Thr Ile Asn Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Xaa Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 18
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 18
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 19
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 20
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 20
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 21
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 22
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 22
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 23
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 24
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 25
Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 26
Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Ala Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 27
Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 31
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcaagc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctccgccc tgccctggac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 34
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggcagcac 120
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cccgacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 36
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 37
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 38
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catgggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 39
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 40
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 42
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 43
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 44
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 45
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 46
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 47
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 48
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cccgacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 49
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 50
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 52
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 53
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 54
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cccgacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 55
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Ala Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 56
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg ccggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 57
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 58
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 59
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 60
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 61
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 62
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca gcggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 63
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 64
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca gcggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 65
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 65
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 66
gaggtgcagc tgcaggaaag cggccccagc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgcagcg tgaccggcga cagcttcacc agcggctact ggaactggat ccggaagttc 120
cccggcaacc ggctcgagta catgggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat cagcatcacc cgggacacca gcaagaacca ctactacctg 240
cagctgaaca gcgtgaccac cgaggacacc gccacctact tttgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 67
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 68
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 69
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 70
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa 990
<210> 71
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 72
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 72
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tctgcgtcga ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcctggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcttaagcct gtctccgggt aaa 1353
<210> 73
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 74
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 74
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
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tcctggaaca gcggcgctct gaccagcggc gtgcatacct tccccgccgt gctccagagc 540
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acctacacct gcaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660
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gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 780
acctgcgtgg tggtggacgt gtcccaggag gaccccgagg tccagtttaa ttggtacgtg 840
gacggcgtgg aagtgcataa cgccaagacc aagcccagag aggagcagtt caacagcacc 900
tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggaatac 960
aagtgcaagg tctccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaagaccat cagcaaggcc 1020
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gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200
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tccctgagcc tgagcctggg caag 1344
<210> 75
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 75
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
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210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
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435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 76
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 76
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
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acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga attcgagggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
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tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080
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acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 77
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 77
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
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Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
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Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 78
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 78
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
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<210> 79
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
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165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
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275 280 285
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435 440 445
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450
<210> 80
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 80
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
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cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
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acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga attcgagggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cctccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 81
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 81
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35 40 45
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 82
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 82
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tctgcgaaga cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 420
aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480
acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 540
gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 600
gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 660
agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt accgtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 720
ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 780
gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 840
gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 900
gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 960
gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1020
ccgaaggctc cacaggtgta taccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1080
gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1140
tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1200
tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1260
ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1320
cactctcctg gtaaa 1335
<210> 83
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 84
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 84
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcaagc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctccgccc tgccctggac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgggctgat gcggcgccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642
<210> 85
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 85
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Met Arg Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Gly Arg Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 86
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Met Arg Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Gly Arg Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 87
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 87
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggt ctggtgcagc cctcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctgggtt ctcactaacc ggttacaatt tacactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gatgggaaga atgaggtatg atggagacac atattataat 180
tcagttctca aatcccgact gagcatcagc agggacacct ccaagaacca agttttcttg 240
aaaatgaaca gtctgcaaac ggatgacaca gccatttact attgtaccag agacgggcgt 300
ggtgactcct ttgattactg gggccaagga gtcatggtca cagtctcctc cgcgtcgacg 360
acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 420
accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 480
ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 540
ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 600
gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 660
tgtaagcctt gcatatgtac cgtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 720
cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 780
agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 840
gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 900
cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 960
gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1020
caggtgtata ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1080
tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1140
ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1200
tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1260
gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1320
aaa 1323
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 88
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Thr Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Arg Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val
85 90 95
Arg Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 89
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Thr Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Arg Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val
85 90 95
Arg Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 90
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 90
gatattgtga tgacccaggg tgcactcccc aatcctgtcc cttctggaga gtcagcttcc 60
atcacctgca ggtctagtca gagtctggta tacaaagacg gccagacata cttgaattgg 120
tttctgcaga ggccaggaca gtctcctcag cttctgacct attggatgtc tacccgtgca 180
tcaggagtct cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa catatttcac actgaaaatc 240
agtagagtga gggctgagga tgcgggtgtg tattactgtc agcaagttcg agagtatcct 300
ttcactttcg gctcagggac gaagttggaa ataaaacggg ctgatgcggc gccaactgta 360
tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420
ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 480
caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 540
agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 600
gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgt 657
<210> 91
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 92
<211> 272
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 92
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 93
Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly
1 5
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 94
Lys Tyr Asp Tyr Asp Ala
1 5
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 95
Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly
1 5
<210> 96
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln
<210> 97
<211> 175
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 97
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp
165 170 175
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
6xHis标签
<400> 98
His His His His His His
1 5

Claims (70)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含一个人源化重链可变区(VH)和一个人源化轻链可变区(VL)；
其中该VH包含具有下式的氨基酸序列：
HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，
其中HFW1是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，HCDR1是SEQ ID NO:8，HFW2是SEQ ID NO:9，HCDR2是SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，HFW3是SEQ ID NO:17、HCDR3是SEQID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27，并且HFW4是SEQ ID NO:28；
其中该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32；并且
其中该抗体或其片段可以特异性地结合人OX40。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中HFW2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体或其片段，其中HFW3的氨基酸序列是SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQID NO:24。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段，其中该VH包含氨基酸序列SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:67。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其中该VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:29，并且该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:59。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段，进一步包含与该VL的C末端融合的轻链恒定区或其片段。
7.如权利要求6所述的抗体或其片段，其中该轻链恒定区是人κ恒定区。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体或其片段，进一步包含与该VH的C末端融合的重链恒定区或其片段。
9.如权利要求8所述的抗体或其片段，其中该重链恒定区是人IgG1恒定区、人IgG4P恒定区、人IgG1TM恒定区或鼠IgG1恒定区。
10.如权利要求9所述的抗体或其片段，其中该重链恒定区是人IgG1恒定区。
11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体或其片段，包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:71和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:30。
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗体或片段，其中该抗原结合片段是Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段或sc(Fv)2片段、或其任何组合。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体或其片段，其可以特异性地结合食蟹猴或恒河猴OX40。
14.如权利要求13所述的抗体或其片段，其可以特异性地结合在Jurkat细胞，来自人、食蟹猴、恒河猴或其任何组合的初级活化的CD4+或CD8+T细胞上表达的OX40。
15.如权利要求1至14中任一项所述的抗体或其片段，其不结合鼠或大鼠OX40。
16.如权利要求1至15中任一项所述的抗体或其片段，其不与相关肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)蛋白交叉反应。
17.如权利要求14所述的抗体或其片段，其中对于在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40的结合亲和力是约250pM至约370pM，如通过流式细胞术所测量。
18.如权利要求17所述的抗体或其片段，其中该结合亲和力是约312pM。
19.如权利要求17或权利要求18所述的抗体或其片段，其可以在约63至约93pM处实现在初级活化的人CD4+T细胞上20％受体占有率(EC20)，在约250至约370pM处实现在初级活化的人CD4+T细胞上50％受体占有率(EC50)，并且在约2290至约3330pM处实现在初级活化的人CD4+T细胞上90％受体占有率(EC90)，如通过流式细胞术所测量。
20.如权利要求19所述的抗体或其片段，其中EC20是约78pM，EC50是约312pM，并且EC90是约2810pM。
21.如权利要求14所述的抗体或其片段，其中对于在过度表达OX40的Jurkat细胞上表达的人OX40的结合亲和力是约250pM至约600pM，如通过流式细胞术所测量。
22.如权利要求21所述的抗体或其片段，其中该结合亲和力是约424pM。
23.如权利要求21或权利要求22所述的抗体或其片段，其在过度表达OX40的Jurkat细胞上在约60至150pM处可以实现EC20，在过度表达OX40的Jurkat细胞上在约250至600pM处可以实现EC50，并且在过度表达OX40的Jurkat细胞上在约2260至4380pM处可以实现EC90，如通过流式细胞术所测量。
24.如权利要求23所述的抗体或其片段，其中EC20是约106pM，EC50是约424pM，并且EC90是约3820pM。
25.如权利要求14所述的抗体或其片段，其中对于在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的食蟹猴OX40的结合亲和力是约340pM至约820pM，如通过流式细胞术所测量。
26.如权利要求25所述的抗体或其片段，其中该结合亲和力是约580pM。
27.如权利要求14所述的抗体或其片段，其中对于在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40的结合亲和力是约130pM至约600pM，如通过流式细胞术所测量。
28.如权利要求27所述的抗体或其片段，其中该结合亲和力是约370pM。
29.如权利要求1至28中任一项所述的抗体或其片段，其可以在基于平板的测定中诱导活化的CD4+T细胞的剂量依赖性增殖和初级活化的人CD4+T细胞中的剂量依赖性细胞因子释放。
30.如权利要求29所述的抗体或其片段，其中可以在初级活化的人CD4+T细胞中在约14pM至约28pM的抗体浓度处实现20％最大增殖应答(EC20)，可以在初级活化的人CD4+T细胞中在约0.3pM至约130pM的抗体浓度处实现50％最大增殖应答(EC50)，并且可以在初级活化的人CD4+T细胞中在约50pM至约90pM的抗体浓度处实现90％最大增殖应答(EC90)，所有如通过流式细胞术所测量。
31.如权利要求30所述的抗体或其片段，其中EC20是约21pM，EC50是约28pM，并且EC90是约72pM。
32.如权利要求29至31中任一项所述的抗体或其片段，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或其任何组合。
33.如权利要求32所述的抗体或其片段，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-13、或其任何组合。
34.如权利要求1至28中任一项所述的抗体或其片段，其可以在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞中和初级活化的恒河猴CD4+T细胞中实现CD4+T细胞增殖和细胞因子释放。
35.如权利要求1至34中任一项所述的抗体或其片段，其可以在FcγR表达细胞的存在下活化在表达OX40的T细胞中的NFκB途径。
36.如权利要求35所述的抗体或其片段，其中该表达OX40的T细胞是表达OX40的JurkatNFκB-荧光素酶报告细胞，这些Jurkat NFκB-荧光素酶报告细胞响应于NFκB信号传导途径的刺激产生荧光素酶。
37.如权利要求1至36中任一项所述的抗体或其片段，其可以触发针对表达OX40的细胞的补体依赖性或抗体依赖性细胞毒性。
38.如权利要求37所述的抗体或其片段，其可以结合人C1q并且触发针对这些表达OX40的细胞的NK介导的抗体依赖性细胞毒性。
39.如权利要求1至38中任一项所述的抗体或其片段，其中向需要癌症治疗的受试者给予有效剂量可以抑制该受试者中的肿瘤生长。
40.如权利要求39所述的抗体或其片段，其中该肿瘤生长抑制是在T细胞的存在下实现的。
41.如权利要求39或权利要求40所述的抗体或其片段，其中与给予同种型匹配的对照抗体或其片段相比，肿瘤生长被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％。
42.一种组合物，包含如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段以及一种载体。
43.一种多核苷酸，包含编码如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段、或如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段的多肽亚基的核酸。
44.如权利要求43所述的多核苷酸，包含SEQ ID NO:60的核酸、SEQ ID NO:31的核酸、SEQ ID NO:72的核酸、或其任何组合。
45.一种载体，包含如权利要求43或权利要求44所述的多核苷酸。
46.一种宿主细胞，包含如权利要求43或权利要求44所述的多核苷酸或如权利要求45所述的载体。
47.一种产生抗体或其片段的方法，该方法包括在表达由多核苷酸编码的抗体或其片段的条件下培养如权利要求46所述的宿主细胞，并且回收该抗体或其片段。
48.一种促进活化的T细胞存活或增殖的方法，该方法包括使活化的T细胞与如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段接触，其中该抗体或其片段可以特异性地结合这些T细胞表面上的OX40。
49.一种诱导从活化的T细胞释放细胞因子的方法，该方法包括使活化的T细胞与如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段接触，其中该抗体或其片段可以特异性地结合这些T细胞表面上的OX40。
50.如权利要求49所述的方法，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或其任何组合。
51.如权利要求50所述的方法，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-13、或其任何组合。
52.如权利要求48至51中任一项所述的方法，其中这些活化的T细胞是活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、或其组合。
53.如权利要求52所述的方法，其中这些活化的CD4+T细胞是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、恒河猴CD4+T细胞、或其组合。
54.一种促进T细胞活化的方法，该方法包括使T细胞与如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段接触，其中该抗体或其片段可以特异性地结合这些T细胞表面上的OX40。
55.如权利要求54所述的方法，其中T细胞活化可以通过NFκB信号转导途径的刺激来测量。
56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中这些T细胞是活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、或其组合。
57.如权利要求56所述的方法，其中这些活化的CD4+T细胞是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、恒河猴CD4+T细胞、或其组合。
58.如权利要求54至57中任一项所述的方法，其中该接触包括向受试者给予有效量的该抗体或其片段。
59.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段、或如权利要求42所述的组合物。
60.如权利要求59所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
61.如权利要求59或权利要求60所述的方法，其中该抗体或其片段或组合物的给予可以抑制肿瘤生长，可以促进肿瘤减小，或两者。
62.如权利要求61所述的方法，其中肿瘤生长抑制是在T细胞的存在下实现的。
63.一种增强受试者的免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段、或如权利要求42所述的组合物。
64.如权利要求59至63中任一项所述的方法，其中该受试者是人受试者。
65.如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段，其结合位于SEQ ID NO:91的氨基酸108至146内的人OX40的表位。
66.如权利要求65所述的抗体或其片段，其中该表位至少包含SEQ ID NO:91的氨基酸亮氨酸116和丙氨酸126。
67.如权利要求1至41中任一项所述的抗体，其结合小鼠OX40变体，该变体包含SEQ IDNO:92，除了一个Q113L突变和一个V124A突变之外。
68.一种由100个或更少个氨基酸组成的分离的肽，其中该肽可以被如权利要求1至41中任一项所述的抗体或其片段特异性地结合。
69.如权利要求68所述的肽，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸116至126。
70.如权利要求68或权利要求69所述的肽，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸108至146，除了在除L116和A126之外的任何位置处的一个、两个、三个、四个、五个或六个单个氨基酸取代、缺失或插入外。
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