ES2605380T3 - Proteina de fusión OX40-inmunoglobulina trimérica y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de fusión que comprende en una dirección N-terminal a C-terminal: un dominio de inmunoglobulina, donde el dominio de inmunoglobulina comprende un dominio Fc; un dominio de trimerización; y un dominio de unión al receptor; donde el dominio de unión al receptor es: (a) un dominio de unión al receptor OX-40L, que es capaz de unirse al receptor OX-40 y estimular al menos una actividad mediada por OX-40; y opcionalmente comprende una secuencia de polipéptidos al menos un 95% idéntica a la SEC. ID. N.º: 2 u opcionalmente comprende un dominio extracelular del ligando OX-40 (OX-40L); o (b) un anticuerpo anti-receptor OX-40, o un fragmento del mismo de unión a antígeno, que es capaz de estimular al menos una actividad mediada por OX-40, donde la actividad mediada por OX-40 es opcionalmente la proliferación de linfocitos T CD4+; y donde el polipéptido de fusión se autoconjuga con una proteína de fusión trimérica o hexamérica.

Description

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A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos del presente documento tienen el mismo significado que el que entenderán aquellos expertos en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Las definiciones de los términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd, 1994 (lSBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.) Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los términos en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen los relativos al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De forma similar, se entenderá que el término "o" incluye "y", a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entenderá también que los tamaños de todas las bases o los tamaños de los aminoácidos, así como todos los valores de peso molecular o masa molecular indicados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan con fines descriptivos. Aunque en la práctica o ensayos de la presente divulgación se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente, se describen métodos y materiales adecuados más adelante. El término "comprende" significa "incluye". La abreviatura "p. ej." se utiliza en el presente para indicar un ejemplo de carácter no limitador. Por tanto, la abreviatura "p. ej." es sinónimo del término "por ejemplo".

A fin de facilitar la revisión de las diversas realizaciones de esta divulgación, se facilitan las siguientes explicaciones de términos específicos:

El "receptor OX-40" es una proteína (también denominada según los casos ACT-4 y ACT-35) expresada en la superficie de linfocitos T CD4+ de mamífero activados por antígeno (Weinberg et al. (1994) J. Immunol. 152:47124721; Weinberg et al. (1996) Nature Medicine 2:183-189; WO 95/12673; Latza et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:677683). Se han clonado y secuenciado secuencias de ADN que codifican homólogos del receptor OX-40 humano, de rata y de ratón (Mallet et al. (1990) EMBO J. 9:1063-1068; Calderhead et al. (1993) J. Immunol. 151:5261-5271; Latza et al. (1994) Eur. J.Immunol. 24:677-683; WO 95/12673). Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos y nucleótidos para los receptores OX-40 humano y murino se pueden encontrar en GENBANK® con los números de registro NM 003327 y NM 011659, respectivamente.

El “ligando OX-40” (“OX-40L”) (también denominado según los casos gp34 y ACT-4-L) se ha encontrado expresado en la superficie de determinadas células de mamífero, tales como células presentadoras de antígeno (“APCs”). OX40L se une específicamente al receptor OX-40. La proteína humana se describe en la Publicación PCT n.º 95/21915. El ratón OX-40L se describe en la Patente USA n.º 5 457 035. Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de OX-40L humano y murino se encuentran disponibles en GENBANK® con los números de registro NM 003326 y NM 009452, respectivamente. El ligando OX-40 naturalmente presente incluye dominios intracelulares, transmembrana y extracelulares. Se puede producir una forma soluble funcionalmente activa del ligando OX-40 ("ligando OX-40 soluble") por deleción de los dominios intracelulares y transmembrana tal y como se describe, por ejemplo, en las Patentes USA n.º 5 457 035 y 6 312 700, y en WO 95/21915, cuyas divulgaciones quedan incorporadas al presente por referencia. Una forma funcionalmente activa del ligando OX-40 es una forma que conserva la capacidad de unirse específicamente al receptor OX-40, es decir, que posee un "dominio de unión al receptor" OX-40. Los métodos para determinar la capacidad de una molécula de ligando OX-40 o un derivado para unirse específicamente al receptor OX-40 se explican más adelante. Los métodos para producir y utilizar el ligando OX-40 y sus derivados (tales como derivados que incluyen un dominio de unión al receptor OX-40) se describen en WO 95/21915 (supra), que describe también proteínas que comprenden la forma soluble del ligando OX-40 unida a otros péptidos, como regiones Fc de inmunoglobulina ("Ig") humana, que se pueden producir para facilitar la purificación del ligando OX40 de las células cultivadas o para potenciar la estabilidad de la molécula tras la administración in vivo a un mamífero (véase también la Patente USA n.º 5 457 035).

A efectos del presente, el término "OX-40L" incluye el ligando OX-40 completo, el ligando OX-40 soluble, así como porciones funcionalmente activas del ligando OX-40. También se incluyen en la definición de OX-40L las variantes del ligando OX-40 que difieren en la secuencia de aminoácidos de las moléculas del ligando OX-40 naturalmente presentes, pero que conservan la capacidad para unirse específicamente a un receptor de OX-40. Estas variantes se describen en la Patente USA n.º 5 457 035 y en WO 95/21915 (supra).

Un “agente de unión al receptor de OX-40” es un agente que se une sustancialmente solo a un receptor OX-40, por ejemplo un receptor OX-40 presente en la superficie de linfocitos T de mamífero activados por antígeno, como linfocitos T CD4+ activados. A efectos del presente documento, el término "agente de unión al receptor OX-40" incluye anticuerpos anti-OX-40 y OX-40L. Un "dominio de unión al receptor" OX-40 es un dominio que se une específicamente a un receptor OX-40.

Un "dominio de trimerización" es una secuencia de aminoácidos dentro de un polipéptido que estimula que el polipéptido se conjugue con los trímeros. Por ejemplo, una trimerización puede estimular la conjugación con los trímeros a través de asociaciones con otros dominios de trimerización (de otros polipéptidos con la misma secuencia de aminoácidos o con otra diferente). El término se utiliza también para referirse a un polinucleótido que codifica dicho péptido o polipéptido.

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sintetizado en el laboratorio mediante transcripción inversa del ARN mensajero extraído de células.

Una célula "transformada" o una célula "huésped" es una célula en la que se ha introducido una molécula de ácido nucleico por técnicas de biología molecular. Para los fines del presente documento, el término transformación abarca todas las técnicas por las que una molécula de ácido nucleico se puede introducir en esta célula, incluyendo la transfección con vectores virales, la transformación con vectores plásmidos y la introducción de ADN desnudo mediante electroporación, lipofección y aceleración con pistola de partículas. Una célula transformada o una célula huésped puede ser una célula bacteriana o una célula eucariota.

Un componente biológico "aislado" (como un ácido nucleico o proteína) ha sido sustancialmente separado o purificado de otros componentes biológicos de la célula del organismo en la que el componente está naturalmente presente, como otro ARN y ADN cromosómico y extracromosómico, y proteínas. Los ácidos nucleicos y proteínas aislados incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante métodos de purificación estándar. El término abarca también ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente.

El término “purificado” no implica una pureza absoluta; pretende ser más bien un término relativo. Así, por ejemplo, la preparación de un ligando OX-40 purificado es aquella en la que el ligando OX-40 es más puro que el ligando en su entorno natural dentro de la célula. Preferiblemente, se entiende por preparación de un ligando OX-40 purificado cuando la proteína del ligando OX-40 representa al menos el 50% del contenido proteico total de la preparación.

Un ácido nucleico "recombinante" es aquel que tiene una secuencia que no se encuentra naturalmente presente o tiene una secuencia que se produce por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de otro modo estarían separados. Por lo general, esta combinación artificial se realiza por síntesis química o, más frecuentemente, por la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo mediante técnicas de ingeniería genética.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótido de al menos 10 bases de longitud. El término "secuencia" de polinucleótidos se refiere a la serie de nucleótidos integrantes constituyentes de polinucleótido. El término secuencia de polinucleótidos también se utiliza para referirse a la serie de letras (por ejemplo, a, c, g, t) que se utilizan para representar un ácido nucleico. Un ácido nucleico "recombinante" (por ejemplo, un ADN recombinante) incluye un elemento genético (una secuencia de polinucleótidos) que no se encuentra inmediatamente contiguo a los dos elementos genómicos a los que se encuentra inmediatamente contiguo (uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3') en el genoma naturalmente presente del organismo del que se deriva. Así pues, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector; a un virus o plásmido de replicación autónoma; o al ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como molécula separada (por ejemplo, ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucleótidos pueden ser ribonucleóticos, desoxirribonucleótidos o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye las formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico introducida en una célula huésped, que produce así una célula huésped transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en la célula huésped, como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.

Un ácido nucleico que regula la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga a la que está operativamente unido se denomina "secuencia de control de la expresión" o "secuencia reguladora de la transcripción". Una secuencia reguladora de la transcripción está operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico cuando la secuencia reguladora controla y regula la transcripción y, cuando corresponde, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Por tanto, las secuencias reguladoras de la transcripción pueden incluir los correspondientes promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de iniciación (típicamente ATG) delante del gen que codifica una proteína, que une la señal para los intrones y mantiene el marco de lectura correcto de ese gen para permitir la correcta traducción del ARNm, y codones de terminación. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.

Un "promotor" es una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción de un ácido nucleico. También se incluyen aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer que la expresión del gen dependiente de promotor sea controlable de forma específica para un tipo de célula, específica para un tejido o inducible por señales

o agentes externos; dichos elementos pueden estar localizados en las regiones 5' o 3' del gen. Se incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles (véase por ejemplo, Bitter et al. Methods in Enzvmology (1987) 153:516-544). Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. En una realización, cuando se clona en sistemas celulares de mamífero, pueden usarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (tales como el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (tales como un promotor temprano

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OX-40L con una proteína trimérica. Por tanto, un polipéptido de fusión OX-40L con un dominio de trimerización se autoconjuga con una proteína de fusión OX-40L trimérica. En una realización, el dominio de trimerización es un dominio de cremallera de isoleucina. Un ejemplo de dominio de cremallera de isoleucina es la variante de la isoleucina GCN4 de levadura modificada que se describe en Harbury et al. (1993) Science 262:1401-1407, cuya divulgación se incorpora aquí todos los efectos. La secuencia de un dominio de cremallera de isoleucina adecuada está representada por la SEC. ID. N.º: 4, a pesar de que las variantes de esta secuencia que conservan la capacidad para formar un dominio de trimerización superenrollado resultan igualmente adecuadas. Entre los dominios de trimerización superenrollados alternativos se incluyen los siguientes. TRAF2 (GENBANK® Nº de registro Q12933 [gi:23503103]; aminoácidos 299-348); trombospondina 1 (Nº de registro PO7996 [gi: 135717]; aminoácidos 291314); Matrilin-4 (Nº de registro 095460 [gi: 14548117]; aminoácidos 594-618; CMP (matrilina-1) (Nº de registro NP_002370 [gi;4505111]; aminoácidos 463-496; HSF1 (Nº de registro AAX42211 [gi:61362386]; aminoácidos 165191; y cubilina (Nº de registro NPJ301072 [gi:4557503]; aminoácidos 104-138.

Además del dominio de unión al receptor OX-40L y del dominio de trimerización, el polipéptido de fusión incluye un dominio de inmunoglobulina, como una región constante o un dominio "Fc". La secuencia de aminoácidos de un ejemplo de dominio de inmunoglobulina se proporciona en la SEC. ID. N.º: 6, aunque se pueden utilizar muchas otras secuencias del dominio de inmunoglobulina. En determinadas realizaciones, el dominio de inmunoglobulina sirve como dominio de dimerización que promueve el conjugado entre dos polipéptidos de fusión triméricos para formar un hexámero estable (que es un multímero que contiene seis polipéptidos de fusión OX-40L) a través de interacciones entre los dominios de inmunoglobulina desparejados (tal y como muestra esquemáticamente la FIG. 1). Opcionalmente, se pueden utilizar dominios de dimerización alternativos capaces de formar interacciones estables entre los pelipéptidos que permanecen desparejados tras la trimerización de los polipéptidos de fusión OX40L en lugar del dominio de inmunoglobulina.

Los dominios proteicos adicionales de la proteína de fusión OX-40L pueden servir para diversas funciones, entre las que se incluyen mejorar la actividad de OX-40L, facilitar la purificación y/o aumentar la estabilidad de la proteína en el cuerpo de un sujeto. En las proteínas de fusión descritas aquí, OX-40L, por ejemplo, se puede fusionar un dominio extracelular de OX-40L, u otro fragmento activo del mismo, o una variante conservadora o de otro tipo de este dominio o fragmento con un dominio de inmunoglobulina u otro dominio de proteína de fusión seleccionado de forma que se corresponda con el sujeto al que se va a administrar el polipéptido de fusión OX-40L. Por ejemplo, si el sujeto previsto es un sujeto humano, es recomendable seleccionar el dominio de inmunoglobulina de un polipéptido o una proteína de inmunoglobulina humana. El ejemplo específico que se describe más adelante implica la fusión entre el dominio extracelular de OX-40L, un dominio de trimerización y un polipéptido que incluye un dominio constante de IgG humana. Típicamente, el polipéptido de fusión incluye al menos un dominio de región constante de inmunoglobulina. Por ejemplo, el polipéptido de fusión OX-40L puede incluir los dominios CH2 y CH3 de IgG. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión incluye una región bisagra de la secuencia de aminoácidos, que se corresponde con la totalidad o con una parte de una región bisagra de la IgG. Opcionalmente, se pueden mutar uno

o más residuos de cisteína en residuos de aminoácidos no sulfurosos, como alanina o glicina. Por ejemplo, al alterar los nucleótidos "tgt" por "acc" (por ejemplo, en la posición 8 de la SEC. ID. N.º: 5 y SEC. ID. N.º: 7), se puede introducir una sustitución de cisteína por treonina al principio del dominio Fc.

Un ejemplo de polipéptido de fusión OX-40L que se conjuga con una proteína de fusión OX-40L trimérica se describe también en los Ejemplos. La secuencia de aminoácidos de este polipéptido de fusión se proporciona en la SEC. ID. N.º: 8. No obstante, un experto en la técnica reconocerá que otras muchas secuencias también satisfacen los criterios establecidos en el presente documento para los polipéptidos de fusión OX-40L multiméricos. Por tanto, a pesar de que los polipéptidos de fusión OX-40L multiméricos se describen predominantemente con respecto al polipéptido de la SEC. ID.N.º: 8, esta divulgación abarca otras muchas realizaciones.

Además de las proteínas y los polipéptidos de fusión OX-40L triméricos descritos en el presente documento, los fragmentos y variantes funcionales también reflejan esta divulgación. Un fragmento o variante funcional es un fragmento o una variante que mantiene una o más funciones del polipéptido de referencia. Los términos fragmento y variante no son necesaria mutuamente exclusivos. Los fragmentos y variantes funcionales pueden tener una longitud variable. Por ejemplo, algunos fragmentos tienen al menos 10, 25, 50, 75, 100 o 200 residuos de aminoácidos. Por lo general, el término "fragmento" se utiliza para referirse a una subsecuencia de un polipéptido menor que su totalidad. El término "variante" se utiliza para designar un polipéptido con una o más alteraciones o modificaciones con respecto a un polipéptido de referencia, como el polipéptido de fusión OX-40L explícitamente descrito de forma detallada en los ejemplos. Una variante puede tener una longitud idéntica al polipéptido de referencia o puede tener una o más deleciones o adiciones de aminoácidos. La variante puede incluir deleciones o adiciones de uno o varios aminoácidos, siempre que se mantenga la característica funcional deseada (por ejemplo, la unión al receptor OX-40). Por otra parte, una variante puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos. Por lo general, una sustitución de aminoácidos es una sustitución conservadora que sustituye un aminoácido naturalmente presente por características funcionales similares.

Un experto en la técnica reconocerá que un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión OX-40L puede ser alterado o modificado sin alterar materialmente una o más de las funciones de la proteína de fusión. Como materia preliminar, el código genético es degenerado y los diferentes codones pueden codificar el mismo aminoácido. Cabe

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polipéptido incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro que incorporan aminoácidos inusuales. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación, marcado, por ejemplo con radionúclidos, y diversas modificaciones enzimáticas, tal y como apreciarán claramente los expertos en la técnica. Diversos métodos para marcar polipéptidos y marcadores útiles para estos fines son bien conocidos en la técnica e incluyen isótopos radiactivos como 32P, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y antiligandos.

Más generalmente, las proteínas de fusión multiméricas estables que incluyen un dominio seleccionado de un ligando que se une a un receptor biológicamente relevante se pueden producir de forma análoga a la descrita en el presente con respecto al ligando OX-40. Estas proteínas de fusión se conjugan con trímeros (y hexámeros) estables con una actividad biológica mejorada en comparación con otras formas solubles del ligando. Las proteínas de fusión se caracterizan por incluir, en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio de inmunoglobulina (p. ej., Fc); un dominio de trimerización; y un dominio de unión al receptor. A pesar de que estas proteínas se pueden producir básicamente a partir de cualquier ligando, resultan especialmente útiles para producir homólogos solubles para los ligandos que son multiméricos (por ejemplo, triméricos) en su forma activa. Por ejemplo, se pueden producir y usar favorablemente proteínas de fusión triméricas que se corresponden con los ligandos que se unen a receptores para miembros de la familia de proteínas del factor de necrosis tumoral (TNF), tales como: TNF-α, TNF-b, linfotoxina-b, CD40L, Fast, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, ligando RANK, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, ligando GITR, EDA-A1, EDA-A2.

Polinucleótidos que codifican proteínas de fusión OX-40L

Los polipéptidos de fusión OX-40L divulgados en el presente documento (como el polipéptido representado por la SEC. ID. N.º 8) son codificados por nuevas secuencias de polinucleótidos. Las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido de fusión OX-40L capaz de trimerización incluyen al menos una primera subsecuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de inmunoglobulina, al menos una segunda subsecuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de trimerización y al menos una tercera subsecuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de unión al receptor OX-40L. Un ejemplo de secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de fusión OX-40L está representado por la SEC. ID. N.º: 7. Típicamente, los polinucleótidos que codifican el dominio de inmunoglobulina, el dominio de trimerización y los dominios de unión al receptor OX-40L están unidos en una orientación 5' a 3'. En una realización, los polinucleótidos que codifican el dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, Fc), el dominio de trimerización y el dominio OX-40L están enlazados de forma contigua en una orientación 5' a 3'. Opcionalmente, el polinucleótido codifica una secuencia de señal, por ejemplo una secuencia de señal secretora o una secuencia de localización de membrana. En una realización, una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de enlazadores de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia de enlazadores flexibles) está incluida en el polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión OX-40L.

Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión OX-40L incluye favorablemente una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de unión al receptor OX-40 que es un dominio extracelular de un OX-40L humano. Un ejemplo de secuencia de polinucleótidos está representado por la SEC. ID. N.º: 1. El dominio extracelular del OX-40L representado por GENBANK® con el número de registro NM 003326 (SEC. ID. N.º: 9), resulta equivalentemente adecuado en el contexto de un polipéptido de fusión OX-40L. Las SEC. ID. N.º: 1 y SEC. ID. N.º: 9 representan secuencias de polinucleótidos funcionalmente equivalentes al OX-40L humano. La SEC. ID. N.º: 1 tiene dos sustituciones de nucleótidos, siendo cada una de ellas una sustitución de A por T. El polipéptido representado por la SEC. ID. N.º: 2 incluye una sustitución de una fenilalanina por una isoleucina en la posición del aminoácido 9 en comparación con la secuencia de GENBANK®. De forma similar, cualquier secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de OX-40L funcionalmente equivalente se puede emplear en los polipéptidos de fusión descritos en el presente.

Adyacente a la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio de unión al receptor OX-40L hay una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de trimerización. Tal y como se ha indicado anteriormente, un dominio de trimerización favorable es un dominio de cremallera de isoleucina. En una realización favorable, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión OX-40L incluye una secuencia de polinucleótido que codifica un dominio de cremallera de leucina. Un ejemplo de secuencia de polinucleótidos se proporciona en la SEC. ID. N.º: 3. Entre los dominios de trimerización alternativos se incluyen los de TRAF2, trombospondina 1, matrilina-4, CMP, HSF1 y cubilina.

Además de las secuencias de polinucleótidos que codifican un dominio de unión al receptor OX-40L y un dominio de trimerización, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión OX-40L incluye también una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de región constante de inmunoglobulina ("dominio Fc"). Típicamente, el polinucleótido codifica los dominios CH2, CH3 y bisagra de una región Fc de inmunoglobulina humana, aunque se podrían sustituir otros dominios de región constante, como por ejemplo los dominios CH2 y CH1. En un ejemplo de realización, el polinucleótido codifica un dominio Fc de IgGI. Favorablemente, el dominio de inmunoglobulina es capaz de promover la dimerización (por ejemplo, con otro polipéptido que incluye un dominio de inmunoglobulina). Un ejemplo de secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio Fc de IgGI humana se proporciona en la SEC. ID. N.º: 5.

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Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión OX-40L incluyen secuencias de desoxirribonucleótidos (ADN, ADNc) o ribodesoxinucleótidos (ARN), o formas modificadas de cualquier nucleótido, que codifican los polipéptidos de fusión descritos aquí. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias ADN y/o ARN.

Las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento incluyen secuencias de polinucleótidos, como las secuencias representadas por la SEC. ID. N.º: 7, que codifican polipéptidos de fusión OX-40L, además de secuencias de polinucleótidos complementarias. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una secuencia de polipéptidos de fusión OX-40L representada por la SEC. ID. N.º: 8 es una característica de esta divulgación.

Además de las SEC. ID. N.º: 1, 3, 5, 7 y 9, las secuencias de polinucleótidos que son sustancialmente idénticas a estas secuencias de polinucleótidos se pueden utilizar en las composiciones y métodos de la divulgación. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica puede tener una o un pequeño número de deleciones, adiciones y/o sustituciones. Estos cambios de los polinucleótidos pueden ser contiguos o estar distribuidos en diferentes posiciones del ácido nucleico. Una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica puede, por ejemplo, tener 1 o 2 o 3 o 4 o incluso más deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. Típicamente esta una o más deleciones, adiciones y/o sustituciones no alteran el marco de lectura codificado por la secuencia de polinucleótidos, de forma que se produce un polipéptido modificado ("mutante") pero sustancialmente idéntico tras la expresión del ácido nucleico.

La similitud entre las secuencias de aminoácidos (y/o polinucleótidos) se expresa en términos de similitud entre las secuencias, denominada también identidad de secuencia. La identidad de la secuencia se mide normalmente en términos de identidad porcentual (o similitud); cuanto más alto es el porcentaje, más similares son las estructuras primarias de las dos secuencias. Por tanto, un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión OX-40L puede ser al menos un 95% o al menos un 96%, frecuentemente al menos un 97%, 98% o 99% idéntico a la SEC. ID. N.º: 7 (o SEC. ID. N.º: 9) o al menos a una subsecuencia de estas; como la SEC. ID. N.º: 1, SEC. ID. N.º: 3 y/o SEC. ID. N.º:

5. Los métodos para determinar la identidad de la secuencia son bien conocidos en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Higgins y Sharp (1988) Gene 73:237; Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151; Corpet et al. (1998) Nucleic Acids Research 16:10881; y Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:2444. Altschul et al. (1994) Nature Genet. 6:119, presenta un análisis detallado de los métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología.

The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al, J. Mol. Biol. (1990) 215:403) está disponible en diversas fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Una descripción del método para determinar la identidad de la secuencia utilizando este programa está disponible en el sitio web del NCBI en Internet.

Por tanto, una secuencia (es decir, una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos) que es sustancialmente idéntica, o un polinucleótido sustancialmente similar a un polinucleótido de las SEC. ID. N.º: 1, 3, 5, 7 o 9 (o a una secuencia de polipéptidos de SEC. ID. N.º: 2, 4, 6, u 8) está incluida en la presente divulgación. Una secuencia es sustancialmente idéntica a una de las SEC. ID. N.º: 1-9, si la secuencia es idéntica, nucleótido a nucleótido, con al menos una subsecuencia de la secuencia de referencia (p. ej., las SEC. ID. N.º: 1-9). Estos polinucleótidos pueden incluir, por ejemplo, inserciones, deleciones y sustituciones con respecto a cualquiera de las SEC. ID. N.º: 1, 3, 5, 7, y/o 9. Por ejemplo, estos polinucleótidos son típicamente al menos un 70% idénticos a un polinucleótido (o polipéptido) de referencia seleccionado entre las SEC. ID. N.º: 1 y SEC. ID. N.º: 9. Es decir, al menos 7 de cada 10 nucleótidos (o aminoácidos) dentro de una ventana de comparación son idénticos a la secuencia de referencia seleccionada SEC. ID. N.º: 1-9. Con frecuencia, estas secuencias son aproximadamente al menos un 80%, con frecuencia al menos un 90% y a menudo al menos un 95% o más idénticas a una secuencia de referencia seleccionada de las SEC. ID. N.º: 1 a SEC. ID. N.º: 9. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o polinucleótidos puede ser un 96%, 97%, 98% o incluso 99% idéntica a la secuencia de referencia, por ejemplo al menos una de las SEC. ID. N.º: 1 a SEC. ID. N.º: 9.

Otros indicios de la similitud de la secuencia entre dos ácidos nucleicos es la capacidad para hibridarse. Cuanto más similares son las secuencias de los dos ácidos nucleicos, más rigurosas son las condiciones en las que se hibridarán. Los ácidos nucleicos sustancialmente similares o sustancialmente idénticos a la SEC. ID. N.º: 7 (y a subsecuencias de la misma, como la SEC. ID. N.º: 1, la SEC. ID. N.º: 3 y la SEC. ID. N.º: 5) incluyen ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas con cualquiera de estas secuencias de polinucleótidos de referencia. Por tanto, un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de polinucleótidos de referencia seleccionada entre las SEC. ID. N.º: 1, 3, 5 y/o 7 es sustancialmente idéntico o sustancialmente similar a los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión OX-40 descritos en el presente documento.

La rigurosidad de las condiciones de hibridación depende de la secuencia y son diferentes en función de los distintos parámetros ambientales. Por tanto, las condiciones de hibridación que dan como resultado determinados grados de rigurosidad variarán en función de la naturaleza del método de hibridación y de la composición y longitud de las

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secuencias de ácido nucleico que se van a hibridar. Por lo general, la temperatura de la hibridación y la fuerza iónica (especialmente la concentración de Na+ y/o Mg++) del tampón de hibridación determinarán la rigurosidad de la hibridación, aunque los tiempos de lavado tambien influyen en la rigurosidad. Por lo general, las condiciones de rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente de 5°C a 20°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda que se corresponde perfectamente. Las condiciones para la hibridación del ácido nucleico y el cálculo de la rigurosidad se puede encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Tijssen (1993)

Hybridization With Nucleic Add Probes. Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY y Ausubel et al. (1999) Short Protocols in Molecular Biology. 4ª ed.John Wiley & Sons, Inc.

A efectos de la presente divulgación, las "condiciones de rigurosidad" abarcan condiciones en las que la hibridación únicamente se producirá si hay menos de un 25% de coincidencia errónea entre la molécula de hibridación y la secuencia diana. Las "condiciones de rigurosidad" se pueden dividir en niveles de rigurosidad concretos para una definición más precisa. Por tanto, a efectos del presente documento, condiciones de "rigurosidad moderada" son aquellas en las que las moléculas con más de un 25% de coincidencia errónea no se hibridarán; condiciones de "rigurosidad media" son aquellas en las que las moléculas con más de un 15% de coincidencia errónea no se hibridarán; y condiciones de "rigurosidad elevada" son aquellas en las que las secuencias con más de un 10% de coincidencia errónea no se hibridarán. Las condiciones de "rigurosidad muy elevada" son aquellas en las que las secuencias con más de un 6% de coincidencia errónea no se hibridarán. Por el contrario, los ácidos nucleicos que se hibridan en "condiciones de rigurosidad bajas" incluyen aquellos con una identidad de la secuencia mucho menor

o con una identidad de la secuencia únicamente en subsecuencias cortas del ácido nucleico.

Por ejemplo, en reacciones de hibridación de ácido nucleico, las condiciones utilizadas para conseguir un nivel concreto de rigurosidad variarán en función de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se van a hibridar. La longitud, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido GC frente a AT) y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN frente a ADN) de las regiones de hibridación de los ácidos nucleicos influirán en la selección de las condiciones de hibridación apropiadas. Por otra parte, el hecho de si uno de los ácidos nucleicos es inmovilizado, por ejemplo, sobre un filtro puede afectar a las condiciones necesarias para conseguir la rigurosidad deseada.

Un ejemplo específico de condiciones de rigurosidad progresivamente mayores es el siguiente: 2 x SSC/0,1 % SDS aproximadamente a temperatura ambiente (condiciones de hibridación); 0,2 x SSC/0,1 % SDS aproximadamente a temperatura ambiente (condiciones de rigurosidad baja); 0,2 x SSC/0,1% SDS aproximadamente a 42°C (condiciones de rigurosidad moderadas); y 0,1 x SSC aproximadamente a 68°C (condiciones de rigurosidad elevadas). Un experto en la técnica determinará fácilmente variaciones de estas condiciones (por ejemplo, por referencia a Sambrook, Tjissen y/o Ausubel, anteriormente citados). El lavado se puede realizar utilizando solamente una de estas condiciones, por ejemplo condiciones de rigurosidad elevadas, o se puede utilizar cada una de las condiciones, por ejemplo durante 10-15 minutos cada una, en el orden anteriomente indicado, repitiendo cualquiera

o la totalidad de los pasos explicados. Sin embargo, tal y como se ha mencionado anteriormente, las condiciones óptimas variarán dependiendo de la reacción de hibridación concreta implicada y se podrán determinar de forma empírica.

Adicionalmente, el ácido nucleico que codifica los polipéptidos de fusión OX-40L también puede incluir secuencias de polinucleótidos, como secuencias reguladoras de la expresión y/o secuencias vectoriales que facilitan la expresión o replicación de los ácidos nucleicos. De forma similar, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión OX-40L puede incluir otras secuencias de codificación que confieren características funcionales al polipéptido codificado. Estas secuencias incluyen secuencias de señal secretora y señales de localización de membrana.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de fusión OX-40L pueden ser manipulados con procedimientos estándar como la digestión con enzimas de restricción, rellenado con polimerasa de ADN, deleción con exonucleasa, extensión con desoxinucleótido terminal, unión de secuencias de ADN sintéticas o clonadas, alteración de la secuencia dirigida al punto a través de un intermedio bacteriófago de cadena única o con el uso de oligonucleótidos específicos en combinación con PCR u otra amplificación in vitro. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden encontrar ejemplos de protocolos en Sambrook y Ausubel (supra).

Una secuencia de polinucleótidos (o porciones obtenidas de la misma) como un ADNc que codifica un polipéptido de fusión OX-40L puede ser introducida en un vector, como un vector de expresión eucariota, utilizando técnicas convencionales. Un vector de expresión está diseñado para permitir la transcripción de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de fusión OX-40L en células, proporcionando secuencias reguladoras que inician y potencian la transcripción del ADNc y garantizan el adecuado corte y poliadenilación. Son conocidos numerosos vectores de expresión por parte de los expertos en la técnica y están disponibles en el mercado o se pueden producir a partir de componentes individuales utilizando procedimientos de biología molecular

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convencionales, como los que se describen, por ejemplo, en Sambrook y Ausubel, anteriormente citados. El vector pCEP D4-7 descrito en los Ejemplos es uno de estos vectores de expresión adecuados.

Por ejemplo, el promotor temprano intermedio de citomegalovirus ("CMV") se puede utilizar favorablemente para regular la transcripción de un polipéptido de fusión OX-40L tras la introducción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión OX-40L operativamente unido al promotor de CMV. Adicionalmente, los vectores que contienen las regiones promotoras y potenciadoras del SV40 o la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous y la señal de corte y poliadenilación del SV40 se pueden conseguir fácilmente (Mulligan et al, (1981) Pros, Natl, Acad. Sci. USA 78:1078-2076; Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:6777-6781). El nivel de expresión del polinucleótido que codifica un polipéptido se puede manipular con este tipo de vector, utilizando promotores que tienen diferentes actividades (por ejemplo, el baculovirus pAC373 puede expresar ADNc a elevados niveles en células de S.frugiperda (Summers y Smith (1985) en Genetically Altered Viruses and the Environment Fields et al, (Eds.) 22:319-328, CSHL Press, Cold Spring New York) o utilizando vectores que contienen promotores susceptibles de modulación, como por ejemplo el promotor que responde a glucocorticoides del virus tumoral mamario murino (Lee et al. (1982) Nature 294:228).

Además, algunos vectores contienen marcadores seleccionables, como los genes bacterianos gpt (Mullipan y Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072-2076) o neo (Southern y Berg (1982) J. Mol. Appl.Genet, 1:327-341). Estos marcadores seleccionables permiten la selección de células transfectadas que presentan una expresión estable a largo plazo de los vectores (y, por tanto, del ADNc). Los vectores se pueden mantener en las células como entidades episomales de replicación libre, utilizando elementos reguladores de virus como el papiloma (Sarver et al. (1981) Mol. Cell Biol. 1:486) o Epstein-Barr (Sugden et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:410). Alternativamente, se pueden producir líneas de células que tienen integrado el vector en el ADN genómico. Estos dos tipos de líneas de células producen el producto genético de forma continua. También se pueden producir líneas de células que han amplificado el número de copias del vector (y, por tanto, también el ADNc) para crear líneas de células que pueden producir elevados niveles de producto genético (Alt et al. (1978) J. Biol, Chem. 253:1357).

Los sistemas de vectores adecuados para la expresión de polinucleótidos que codifican proteínas de fusión incluyen, además de los vectores específicos descritos en los ejemplos, la serie pUR de vectores (Ruther y Muller-Hill (1983) EMBO J. 2:1791), pEX1-3 (Stanley y Luzio (1984) EMBO J. 3:1429) y pMR100 (Gray et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6598). Los vectores adecuados para la producción de proteínas nativas intactas incluyen pKC30 (Shimatake y Rosenberg (1981) Nature 292:128, 1981), pKK177-3 (Amann y Brosius (1985) Gene 40:183) y pET-3 (Studiar y Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113).

La presente divulgación, por tanto, abarca vectores recombinantes que comprenden la totalidad o parte de los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión OX-40L triméricas o secuencias de ADNc que codifican polipéptidos de fusión OX-40L, para su expresión en un huésped adecuado, solos o en forma de proteína marcada o detectable por otro medio. El ADN está operativamente unido en el vector a una secuencia de control de la expresión en la molécula de ADN recombinante, para que la proteína o el polipéptido de fusión se pueda expresar. La secuencia de control de la expresión se puede seleccionar del grupo compuesto por secuencias que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas y sus virus y combinaciones de los mismos. La secuencia de control de la expresión se puede seleccionar específicamente del grupo compuesto por el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, importantes regiones operadoras y promotoras del fago lambda, la región de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor temprano y tardío de SV40, promotores obtenidos de polioma, adenovirus, retrovirus, baculovirus y virus de simio, el promotor para 3-fosfoflicerato quinasa, los promotores de la fosfatasa ácida de levaduras, el promotor de los factores de acoplamiento alfa de las levaduras y combinaciones de los mismos.

El ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión OX-40L también se puede transferir desde su contexto existente a otros vehículos de clonación, tales como otros plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, virus animales y cromosomas artificiales de levaduras (YAC) (Burke et al. (1987) Science 236:806-812). Estos vectores se pueden introducir a continuación en diversos huéspedes, incluyendo células somáticas y organismos simples o complejos como bacterias, hongos (Timberlake y Marshall (1989) Science 244:1313-1317), invertebrados, plantas (Gasser y Fraley (1989) Science 244:1293), y animales (Pursel et al, (1989) Science 244:1281-1283), cuyas células u organismos se vuelven transgénicos mediante la introducción del ADNc heterólogo.

Para la expresión en células de mamífero, se puede unir una secuencia de ADNc con promotores heterólogos, como el promotor del virus de simio (SV) 40 en el vector pSV2 (Mulligan y Berg (1981) Proc. Natl Acad. Sci. USA 78:20722076), e introducirse en células, como células de mono COS-1 (Gluzman (1981) Cell 23:175-182), para conseguir una expresión transitoria o prolongada. La integración estable de la estructura del gen quimérico se puede mantener en las células de mamífero mediante selección bioquímica, como neomicina (Southern y Berg (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341) y ácido micofenólico (Mulligan y Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072-2076).

Producción de proteínas de fusión OX-40L recombinantes

Las proteínas de fusión OX-40L se pueden producir en cualquier sistema de expresión heterólogo adecuado y,

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cuando procede, el ADN que codifica la proteína de fusión también puede codificar una secuencia de señal secretora conocida adecuada para el sistema de célula huésped empleado, de forma que el ADN se traduzca en una proteína que al principio incluye la señal secretora y la secuencia de clivaje, pero que después es transportada fuera de la célula sin estas secuencias auxiliares.

La expresión y purificación de proteínas, como una proteína de fusión OX-40L trimérica, se puede realizar utilizando técnicas de laboratorio estándar. Algunos ejemplos de estos métodos se debaten y citan en el presente documento. Tras la expresión, las proteínas purificadas tienen múltiples usos, incluyendo, por ejemplo, análisis funcionales, producción de anticuerpos y diagnósticos, así como los usos profilácticos y terapéuticos que se describen a continuación. Las secuencias de ADNc de longitud parcial o total, que codifican las proteínas de fusión, se pueden unir en vectores de expresión bacterianos. Los métodos para expresar grandes cantidades de proteína de una secuencia clonada introducida en células de Escherichia coli (E, coli) o baculovirus/Sf9 se pueden utilizar para la purificación, localización y el análisis funcional de proteínas, así como para la producción de anticuerpos y composiciones de vacunas. Por ejemplo, se pueden utilizar proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de fusión OX-40L en diversos procedimientos, por ejemplo para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales contra estas proteínas. Posteriormente, estos anticuerpos se pueden utilizar para purificar proteínas mediante cromatografía de inmunoafinidad, en ensayos de diagnóstico para cuantificar los niveles de proteína y para localizar las proteínas en tejidos y células individuales por inmunofluorescencia. Más concretamente, las proteínas de fusión y los polinucleótidos que las codifican descritos aquí se pueden utilizar para producir composiciones farmacéuticas, incluyendo composiciones de vacunas adecuadas para la administración profiláctica y/o terapéutica.

Los métodos y vectores plasmídicos para producir los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión y para expresar estos polinucleótidos en células bacterianas y eucariotas son bien conocidos en la técnica, y los métodos específicos se describen en Sambrook (supra). Estas proteínas de fusión se pueden producir en grandes cantidades, son fáciles de purificar y se pueden utilizar para mejorar la respuesta inmunitaria, incluyendo la respuesta del anticuerpo o la respuesta de linfocitos T. Las proteínas nativas pueden producirse en las bacterias introduciendo un potente promotor regulado (como el promotor del CMV) y un punto de unión de ribosoma eficiente cadena arriba del gen clonado. Si se producen bajos niveles de proteína, se pueden aplicar pasos adicionales para aumentar la proteína; si se producen elevados niveles de proteína, la purificación resulta relativamente fácil. Los métodos adecuados se presentan en Sambrook (supra) y son bien conocidos en la técnica. A menudo, las proteínas expresadas a elevados niveles se encuentran en cuerpos de inclusión insolubles. Los métodos para extraer proteínas de estos agregados se describen en Sambrook (supra). Las proteínas, incluyendo proteínas de fusión, pueden ser aisladas de geles proteicos, liofilizar, moler a polvo y usar como antígeno.

La transferencia de ADN en eucariotas, en particular células humanas o de otro mamífero, ya es una técnica convencional conocida por los expertos en la técnica. Los vectores son introducidos en las células receptoras como ADN puro (transfección) mediante, por ejemplo, precipitación con fosfato cálcico (Graham y Vander Eb (1973) Virology 52:466) o fosfato de estroncio (Brash et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7:2013), electroforación (Neumann et al. (1982) EMBO J. 1:841), lipofección (Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413), DEAE-dextrano (McCuthan et al. (1968) J. Natl. Cancer Inst. 41:351), microinyección (Mueller et al. (1978) Cell 15:579), fusión de protoplastos (Schafner, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163-2167), biolística, por ejemplo con pistolas de gránulos (Klein et al. (1987) Nature 327:70) o pistolas génicas. Alternativamente, el ADNc, o fragmentos del mismo, se pueden introducir mediante infección con vectores virales. Se desarrollan sistemas que utilizan, por ejemplo, retrovirus (Bernstein et al. (1985) Gen. Engineering 7:235), adenovirus (Ahmad et al. (1986) J. Virol. 57:267), o Herpes virus (Spaete et al. (1982) Cell 30:295). Los polinucleótidos que codifican proteínas, tales como proteínas de fusión, también se pueden liberar en las células diana in vitro a través de sistemas no infecciosos, como liposomas.

Utilizando las técnicas anteriores, los vectores de expresión que contienen un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión monomérico como el que se describe en el presente o ADNc, o fragmentos o variantes o mutantes de ellos, se pueden introducir en células humanas, células de mamíferos de otras especies o células no pertenecientes a mamíferos, según corresponda. La elección de la célula está determinada por el propósito del tratamiento. Por ejemplo, se pueden utilizar células de mono COS (Gluzman (1981) Cell 23:175-182) que producen elevados niveles del antígeno T de SV40 y permiten la replicación de vectores que contienen el origen de replicación de SV40. Del mismo modo, se pueden utilizar linfoblastos o fibroblastos humanos o fibroblastos NIH 3T3 murinos, o células de ovario de hámster chino (CHO).

Métodos para potenciar una respuesta inmunitaria específica de antígeno

La potenciación de la respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, como un sujeto humano) uniendo el receptor OX-40 a los linfocitos T CD4+ durante o después de la activación del antígeno se puede conseguir utilizando diversos métodos. El método seleccionado dependerá principalmente del tipo de antígeno contra el que se desea potenciar la respuesta inmunitaria, y a continuación se debaten diversos métodos disponibles. Con independencia del método que se seleccione, la proteína de fusión OX-40L trimérica se debería administrar al animal de forma que se presente a los linfocitos T del sujeto durante o poco después de la sensibilización de linfocitos T por el antígeno. En un ejemplo de método, se administra una proteína de fusión OX40L trimérica que comprende el polipéptido representado por la SEC. ID. N.º: 8.

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La formulación de la proteína de fusión trimérica, como la proteína de fusión OX-40L trimérica, con un vehículo farmacéutico puede adoptar múltiples formas físicas, pero es preferiblemente una solución o suspensión líquida estéril adecuada para la inyección directa. Preferiblemente, al sujeto se le administrará la proteína de fusión OX-40L trimérica en una formulación como la anteriormente descrita (por ejemplo, en combinación con un vehículo farmacéutico), donde la formulación incluye una cantidad clínicamente efectiva de la proteína de fusión.

A efectos del presente documento, "una cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad que produce un efecto terapéuticamente significativo. La naturaleza de este efecto variará con el contexto en el que se utilice la proteína de fusión OX-40L trimérica, por ejemplo, si la proteína de fusión se va a administrar para tratar una condición existente (por ejemplo, para tratar una enfermedad infecciosa o un cáncer) o como agente profiláctico (para prevenir o reducir el riesgo de enfermedad o cáncer, por ejemplo la recurrencia de un tumor o la metástasis de un tumor). Si la proteína de fusión OX-40L trimérica se va a administrar a un paciente con cáncer, se apreciará que cualquier mejora en la patología del paciente es terapéuticamente significativa. Por tanto, en esta situación, "una cantidad terapéuticamente efectiva" abarca cantidades de la proteína de fusión OX-40L trimérica que producen al menos una remisión parcial del cáncer, así como cantidades que ralentizan o limitan la progresión del cáncer. De forma similar, en el contexto terapéutico en el que se va a utilizar el agente para potenciar la respuesta inmunitaria de un paciente a un agente infeccioso, como un virus o una bacteria, cuando el paciente ya esté infectado con el agente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede producir un efecto terapéutico, lo que significa un efecto que produce cierto grado de recuperación de la infección o mejoría de los síntomas clínicos.

En el contexto profiláctico, como el de las vacunas, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión OX-40L trimérica puede proporcionar una mejora de la respuesta inmunitaria al antígeno diana, es decir producir una respuesta inmunitaria mayor de la que se produciría en ausencia de la administración de la proteína de fusión OX-40L trimérica. La cuantificación de la respuesta inmunitaria producida por la vacunación se puede conseguir por cualquier método estándar, por ejemplo mediante la medición de los títulos de anticuerpos en suero para determinar el nivel y/o la duración frente a cualquier antígeno de ensayo conveniente y/o la linfoproliferación en respuesta al antígeno de ensayo in vitro.

Se apreciará que una dosis terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión OX-40L trimérica variará en función del contexto clínico (por ejemplo, si el agente se va a utilizar con fines terapéuticos o profilácticos), las características del sujeto (edad, peso, otra medicación concomitante, etc.) y la gravedad de la afección. Por tanto, la valoración de una dosis terapéuticamente efectiva la decidirá en última instancia un médico, veterinario u otro profesional sanitario familiarizado con el tema. Típicamente, la administración de una proteína de fusión OX-40L trimérica a un sujeto según los métodos de la presente divulgación implicará la administración de entre 10 ng y 1 g de proteína de fusión OX-40L trimérica por dosis, con la utilización frecuente de unidades monodosis de entre 10 ng y 100 mg, y dosis específicas de hasta 1 mg o 10 mg también dentro del rango utilizado habitualmente.

La proteína de fusión OX-40L trimérica se puede administrar a un sujeto a través de diversas vías, incluyendo la subcutánea o intravenosa o, cuando el sujeto tenga un tumor, directamente en el punto tumoral. El agente puede ser el único ingrediente activo de la composición o se puede combinar con otros agentes que tengan un efecto beneficioso, como interferón u otras moléculas estimuladoras del sistema inmunitario.

En el contexto profiláctico (vacuna), la proteína de fusión OX-40L trimérica se administra frecuentemente a un sujeto en combinación con una formulación o preparación de vacuna convencional, como una preparación de vacuna que comprende antígeno bacterianos o víricos. La proteína de fusión OX-40L trimérica se puede combinar con la vacuna convencional o se puede administrar como preparación individual junto con la vacuna convencional. Por ejemplo, cuando la proteína de fusión OX-40L trimérica se administra por separado, normalmente se administra en el plazo aproximado de una semana desde la administración de la vacuna. Las preparaciones convencionales de vacunas adecuadas para el uso en la presente divulgación incluyen aquellas elaboradas con antígenos bacterianos purificados, bacterias muertas por calor, vacunas de subunidades y vacunas virales que contienen virus vivos o atenuados. Una preparación de una vacuna puede incluir un adyuvante y/o vehículo farmacéutico.

Cuando la proteína de fusión OX-40L trimérica se administra al sujeto en una única preparación con los antígenos de la vacuna, la preparación se puede formular simplemente mezclando una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión OX-40L trimérica con la preparación del antígeno. Alternativamente, la proteína de fusión OX40L trimérica se puede producir junto con el antígeno. Por ejemplo, cuando el antígeno se va a administrar como vacuna es un antígeno bacteriano o una mezcla de antígenos bacterianos, la bacteria con la que se ha elaborado la preparación del antígeno puede ser una bacteria transgénica que expresa la proteína de fusión OX-40L trimérica. En esta situación, la proteína de fusión OX-40L trimérica se obtiene directamente en combinación con los antígenos bacterianos. De forma similar, las vacunas que comprenden antígenos tumorales y la proteína de fusión OX-40L trimérica se pueden preparar con células tumorales que expresan la proteína de fusión OX-40L trimérica. Los métodos para expresar proteínas como los polipéptidos de fusión OX-40L en células procariotas y eucariotas transgénicas son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en ensayos de laboratorio estándar como los de Sambrook y Ausubel anteriormente citados.

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OX-40L trimérica, se pueden administrar al paciente en lugar de células tumorales intactas. Una preparación de membrana celular se puede realizar fácilmente alterando o sometiendo a lisis las células mediante técnicas estándar, como French Press, congelación/descongelación o ultrasonidos. Tras la alteración de las células, se obtiene una fracción más rica de membrana por centrifugación.

Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión OX-40L que es capaz de conjugarse con una proteína de fusión OX-40L trimérica se pueden administrar directamente a un sujeto en forma de ADN "desnudo", de forma que la expresión del polipéptido de fusión OX-40L se produzca en el cuerpo del paciente. Los métodos para administrar ADN desnudo a animales para que provoquen la expresión de ADN en el cuerpo del animal son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en las Patentes estadoinidenses N.º 5 620 896; 5 643 578 y 5 593 972, y las referencias citadas en las mismas.

La presente divulgación abarca también otros métodos de inmunoterapia para tratar patologías como el cáncer, incluyendo inmunoterapia adoptiva. Tal y como se conoce en la técnica, la inmunoterapia adoptiva consiste en obtener células linfoides expuestas a un antígeno concreto, cultivar estas células ex vivo en condiciones en las que se potencie la actividad celular y, a continuación, administrar las células a un individuo. Las células linfoides son preferiblemente linfocitos T obtenidos de un paciente con cáncer, por ejemplo linfocitos T de un ganglio linfático drenante. Tal y como se ha explicado anteriormente, la unión del receptor OX-40 de estas células a una proteína de fusión OX-40L trimérica estimulará a las células y mejorará la generación de linfocitos T de memoria. Por consiguiente, los métodos proporcionan una forma de inmunoterapia adoptiva en la que la incubación de células linfoides ex vivo se realiza en un medio que contiene un polipéptido de fusión OX-40L trimérico antes de la administración de las células a un paciente. Los datos técnicos de los métodos para obtener células linfoides, del cultivo ex vivo de estas células con estimulantes inmunitarios, y la administración a pacientes son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes USA n.º 4 690 915; 5 229 115; 5 631 006 y 4 902 288, y las referencias citadas en las mismas.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: PRODUCCIÓN DE UN POLIPÉPTIDO DE FUSIÓN OX-40L

Un ejemplo de proteína de fusión OX-40L:Ig humana multimérica (mostrado esquemáticamente en la FIG. 1 ) se preparó como sigue: La producción implicó la conjugación de cuatro dominios; una secuencia de señal, el dominio Fc de la IgGI humana, una cremallera de isoleucina obtenida del factor de transcripción GCN4 de levadura, y por último en el extremo C-terminal el dominio extracelular completo del OX-40L humano.

El punto de partida fue un pCMVFlag. 1-TriZP-BAFF. TriZP es la cremalllera de isoleucina y se denomina LZ. Ell dominio BAFF de este plásmido está flanqueado por los puntos de restricción Eco RI (5 ’) y Xho I (3'). El dominio extracelular completo (C-terminal para el dominio transmembrana) de OX-40L se amplificó a partir de un plásmido que contenía la secuencia de codificación de OX-40L humano en toda su longitud mediante PCR. Para esta reacción, el cebador 5' contenía un sitio Eco RI flanqueante y un cambio de A a T en la secuencia de codificación para eliminar 26 bases de un sitio Eco RI interferente cadena abajo. El cebador 3' contenía un sitio Xho I flanqueante, un codón de parada y un cambio de A a T de 13 bases del sitio de Xho I para eliminar otro sitio Eco RI interferente en esta posición. La primera mutación de A a T provocó la sustitución de isoleucina por fenilalanina (por ejemplo, como se muestra en el 9º animoácido de la SEC. ID. Nº: 2). La segunda mutación de A a T no alteró la secuencia de aminoácidos del dominio OX-40L codificado. El dominio extracelular de OX-40L amplificado se sometió a clivaje con Eco RI y Xho I, se purificó por electroforesis en gel de agarosa (purificado en gel) y se clonó en el sitio Eco RI/Xho I que había dejado libre el dominio BAFF del vector pCMV. Los ahora dominios ILZ:OX-40L contiguos se amplificaron mediante PCR a partir de este nuevo plásmido de pCMV utilizando un cebador 5' que contenía un sitio Sac I flanqueante y el mismo cebador 3' utilizado para amplificar el dominio OX-40L inicialmente. La clonación TOPO TA se utilizó para unir, mediante toposiomerasa, el producto amplificado con el plásmido pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La misma estrategia se utilizó para amplificar y clonar el dominio Fc-γ humano de IgG1 en pCR 2.1. El fragmento Fc-y de IgGl fue previamente modificado convirtiendo el residuo Cys (tgt) de la región bisagra en Thr (acc) correspondiente a la base 799 en BC 041037. El cebador 5' incluía un sitio Nhe flanqueante, una base adicional, A, para mantener el marco de lectura para el próximo paso de la clonación y la secuencia de codificación comenzó con el codón Thr mutado. El cebador 3' contiene un sitio Sac I flanqueante y la secuencia de codificación termina con el Lys (aaa) C-terminal de IgGl. El inserto ILZ-OX-40L se escindió de pCR 2.1 mediante clivaje con Sac I y Xho I, gel purificado, y se clonó en el Fc-γpCR2.1 también cortado con Sac I y Xho I. Esto resulta en el posicionamiento contiguo de Fc-gamma, ILZ y OX-40L y la inserción del dipéptido, Leu-Gln, codificado por el sitio Sac I añadido entre Fc-γ e ILZ. Para la expresión en células de mamífero, la estructura FC-ILZ-OX-40L se clonó en una versión modificada del vector de expresión pCBP4 (Invitrogen). El plásmido, designado pCEP D4-7, fue modificado para incluir la secuencia de señal de proteína de membrana basal BM40 adyacente al sitio de clonación múltiple. pCEP4 controla la transcripción desde el promotor de CMV. La expresión del gen EBNA del virus de Epstein Barr promueve la replicación autosómica del plásmido lo que se traduce en un elevado número de copias. El inserto Fc-ILZ-OX-40L fue clivado de pCR2.1 utilizando Nhe I y Xho I, se purificó en gel y se unión a pCEP D4-7 también cortado con Nhe I y Xho I. La estructura final se analizó por análisis de restricción, tal y como se muestra en la Fig. 2. El inserto fue secuenciado para confirmar la autenticidad de la proteína de fusión codificada.

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EJEMPLO 2; PRODUCCIÓN DE UN POLIPÉPTIDO DE FUSIÓN OX-40L

Con el fin de producir la proteína de fusión OX-40L multimérica recombinante, la estructura de fusión Fc-ILZ-OX-40L se introdujo en células H293 por transfección con lipofectamina. La línea celular HK 293 es una línea de cultivo bien establecida utilizada ampliamente para la expresión proteica en mamíferos. pCEP D4-7 contiene un gen de resistencia a higromicina que permite la selección de colonias de células 293 establemente transfectadas en presencia de higromicina. Dado que pCEP D4-7 se replica autosómicamente, todas las células resistentes a higromicina fueron combinadas y se expandieron en cultivos celulares monitorizando la síntesis Fc-ILZ-OX-40L. Para la producción proteínica las células se cultivaron en un biorreactor de laboratorio (Cell-Max). La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía por afinidad de la proteína G. Un ejemplo de perfil de elución de la proteína G se muestra en las FIG. 3A y B. Tal y como se muestra en la FIG. 3B, la elución máxima se observó en las fracciones 6 y 7. La identidad de la proteína eluída se confirmó por inmunorreactividad usando anticuerpos anti-IgG humana (FIG. 4A y B) y anticuerpos anti-ligando OX-40 humano (FIGS, 4C y D). En condiciones de reducción, se observó que el producto predominante migra a aproximadamente 43 kD, coherente con un polipéptido de fusión monomérica. En condiciones de no reducción, se observaron las especies de peso molecular más elevado. Se observó una sólida banda en 86kD coherente con la formación de dímeros enlazados por enlaces de disulfuro entre los dos dominios Fc. La unión en trímeros implica interacciones no covalentes entre los dominios de OX-40L y de trimerización, y deja un dominio Fc desparejado. La asociación entre los dominios Fc desparejados de las dos proteínas de fusión OX-40L triméricas resulta en la formación de hexámeros bajo condiciones nativas. Sin embargo, en geles SDS PAGE no reductores no se observa nada más grande que los dímeros tras la elución en pH ácido.

Aunque el análisis de F-ILZ-OX-40L tras la elución a pH ácido indicó la correspondiente conjugación covalente de subunidades, el análisis por cromatografía de exclusión por tamaño en condiciones no desnaturalizantes indicó que el pH ácido indujo la agregación no covalente de la proteína a estructuras de orden superior. Para evitar esta agregación, la proteína de fusión fue eluida de la columna de proteína G utilizando ActiSep Elution Medium (Sterogene, Carlsbad, CA), añadiendo una solución tampón con pH entre 4 y 7. Este único paso permitió un elevado grado de purificación (FIG. 5) y generó el material posteriormente analizado para determinar la estructura y actividad biológica.

La contribución del dominio ILZ al plegamiento de la proteína de fusión Fc-OX-40L recombinante se demostró comparando el perfil de elución de la cromatografía de exclusión por tamaño de Fc:ILZ:OX-40L y Fc:QX-40L como se muestra en la FIG. 6. Fc:ILZ:OX-40L se eluye como un pico ampliamente homogéneo y simétrico a unos 20 ml, lo que corresponde a una esfera equivalente con una masa de unos 570 kDa. Esto supone aproximadamente el doble de la masa prevista pero es posible que se deba a la estructura asimétrica impartida por tres dominios de la proteína de fusion. En contraste, en ausencia del dominio ILZ, una cantidad muy pequeña de la proteína purificada se eluye a 20 ml y en lugar de esto se aluye en forma de grandes agregados en el volumen vacío o como componentes de bajo peso molecular que es probable que sean monómeros no ensamblados. Esto indica que para la molécula humana. El dominio de trimerización ILZ está implicado en el plegamiento productivo del dominio de unión al receptor extracelular recombinante OX-40L.

EJEMPLO 3: LA PROTEÍNA DE FUSIÓN OX-40L TRIMÉRICA INDUJO LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS T

La contribución funcional del dominio ILZ se sometió a ensayo comparando la actividad coestimuladora de Fc:ILZOX-40L con Fc:OX-40L en un ensayo de proliferación in vitro (FIG. 7). La FIG. 7 ilustra la actividad biológica de Fc:ILZOX-40L humano recombinante con y sin el dominio ILZ. La proteína recombinante se sometió a ensayo para determinar la actividad biológica in vitro por coestimulación de la proliferación de linfocitos T CD4+ en respuesta anti-CD3. Las placas de cultivo de 96 pocillos se recubrieron con anticuerpos de captura de cabra anti-Ig humana y de cabra anti-Ig de ratón, en ambos casos con 2 μg/ml. Las placas se incubaron con CD3 de ratón anti-humano a 2 ng/ml seguido de diluciones seriadas por dos de la proteína de fusión OX-40L recombinante (1600 para 3 ng/ml). Los linfocitos T CD4 humanos purificados que se habían activado con pHA y cultivado durante cuatro días con IL2 (lOU/ml) fueron lavados y se añadió a cada pocillo 5x104 células. Las células se marcaron con 3H-timidina durante las últimas 16 horas de un cultivo de 62 horas, se recogieron y se sometieron a recuento. Los resultados, mostrados en la FIG. 7, se presentan como CPM medios con la desviación estándar calculada por los pocillos por triplicado. Los resultados indican que la proteína de fusión OX-40L trimérica que contiene el dominio ILZ produjo la estimulación/coestimulación dependiente de dosis (mitogénesis) de los linfocitos T CD4+, mientras que la estructura que carecía del dominio ILZ se mantuvo esencialmente inactiva.

En vista de las numerosas realizaciones posibles a las que se pueden aplicar los principios de nuestra invención, se debe reconocer que las realizaciones ilustradas son solamente ejemplos preferibles de la invención y que no se debería entender que limitan el alcance de la misma. Por lo contrario, el alcance de la invención se define en las siguientes reivindicaciones. Por tanto, los autores de la presente invención reivindican como su invención todo lo que se enmarca en el ámbito de aplicación de estas reivindicaciones.

Claims (1)

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