ES2625316T3

ES2625316T3 - Neuquinasa, una proteína corriente abajo de neuregulina

Info

Publication number: ES2625316T3
Application number: ES13184566.1T
Authority: ES
Inventors: Mingdong Zhou
Original assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Current assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2017-07-19
Anticipated expiration: 2027-08-21
Also published as: JP2019213550A; EP2484763A2; EP2059594A1; CN102618562A; CA2661308A1; CA2661308C; US10227418B2; EP2730654A2; JP6339415B2; US20200207870A1; US9580515B2; EP2730654B1; CN101553568B; CN102618562B; EP2730654A3; EP3202904A1; EP2059594A4; US20080260713A1; US20170313784A1; CN101553568A

Abstract

Un método de cribado de un agente que afecta a la actividad de neuquinasa, que comprende: (a) poner en contacto in vitro dicho agente con una célula que expresa un polipéptido de neuquinasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y (b) evaluar la actividad biológica de dicha neuquinasa en la célula, en donde la actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en autoinhibición, fosforilación de la cadena ligera de la miosina cardiaca y expresión de dicha neuquinasa.

Description

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5.2. Polipéptidos de la invención

La presente solicitud describe polipéptidos recién identificados y aislados a los que se refiere la presente solicitud como neuquinasa de rata y neuquinasa humana, respectivamente. Los polipéptidos pueden ser polipéptidos de neuquinasa de rata de secuencia natural y humana de secuencia natural. En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden comprender sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que las encontradas en las secuencias de neuquinasa naturales. La solicitud describe secuencias de aminoácidos de fragmentos funcionales y variantes de neuquinasa que comprenden un determinante antigénico (es decir, una parte de un polipéptido que puede ser reconocida por un anticuerpo) o que son funcionalmente activos de otra forma, así como ácidos nucleicos que codifican los anteriores. La actividad funcional de la neuquinasa abarca una o más actividades funcionales asociadas con un polipéptido de neuquinasa de longitud completa (de tipo natural), actividad biológica de la quinasa de la cadena ligera de miosina; antigenicidad (la capacidad para ser unido por un anticuerpo a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2); inmunogenicidad (la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo que se une a las SEQ ID NO: 1 o 2), etc.

Los polipéptidos pueden comprender las secuencias de aminoácidos que tienen sustituciones de aminoácidos funcionalmente inconsecuentes, y por lo tanto tienen secuencias de aminoácidos que difieren de la de la secuencia de neuquinasa natural. Las sustituciones se pueden introducir por mutación en secuencias de ácidos nucleicos que codifican la neuquinasa, que producen alteraciones en las secuencias de aminoácidos de la neuquinasa codificada, pero no alteran la función de neuquinasa. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos “no esenciales”, en secuencias que codifican la neuquinasa. Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que se puede alterar de la secuencia de tipo natural de neuquinasa sin alterar la actividad biológica de quinasa de la cadena ligera de miosina, mientras que un resto de aminoácido “esencial” es necesario para dicha actividad biológica. Por ejemplo, los restos de aminoácidos que son conservados entre los polipéptidos de neuquinasa de la invención se predice que en particular no son adecuados para la alteración. Los aminoácidos para los que se pueden hacer sustituciones conservativas son bien conocidos en la técnica.

Las sustituciones conservativas útiles se muestran en la tabla 1, “Sustituciones preferidas”. Sustituciones conservativas por las que un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido del mismo tipo, están dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. Si dichas sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, indicados en la tabla 2 como ejemplo, y se criban los productos con actividad biológica del polipéptido de neuquinasa.

Tabla 1 Sustituciones preferidas

Ala (A): Val, Leu, Ile Val

Arg (R): Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N): Gln, His, Lys, Arg Gln

Asp (D): Glu Glu

Cys (C): Ser Ser

Gln (Q): Asn Asn

Glu (E): Asp Asp

Gly (G): Pro, Ala Ala

His (H): Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile (I): Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu (L): Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K): Arg, Gln, Asn Arg

Met (M): Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F): Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu

Pro (P): Ala Ala

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la autorradiografía. Si es necesario, los filtros se pueden lavar una tercera vez a 65-68ºC y volver a exponer a película. Otras condiciones de baja restricción que se pueden usar son bien conocidas en la técnica (p. ej., como se usan para las hibridaciones de especies cruzadas).

Además, se describe un ácido nucleico que hibrida con un ácido nucleico que codifica la neuquinasa, o su complemento inverso, en condiciones de alta restricción. A modo de ejemplo y no de limitación, procedimientos que usan dichas condiciones de alta restricción son las siguientes. La prehibridación de filtros que contienen ADN se puede llevar a cabo durante 8 h durante la noche a 65ºC, en tampón compuesto de 6xSSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02%, y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 500 μg/ml. Los filtros se pueden hibridar durante 48 h a 65ºC, en mezcla de prehibridación que contiene ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 μg/ml y sonda marcada con 32P 5-20x106 cpm. El lavado de los filtros se puede hacer a 37ºC durante 1 h, en una solución que contiene 2xSSC, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01%, y BSA al 0,01%. A esto le puede seguir un lavado en 0,1xSSC a 50ºC, durante 45 minutos antes de la autorradiografía. Otras condiciones de alta restricción que se pueden usar son bien conocidas en la técnica.

5.3.1. Clonación del gen o ADNc de la neuquinasa

La presente solicitud describe métodos y composiciones relacionadas con la clonación de un gen o ADNc que codifica la neuquinasa. En un aspecto, se puede usar la clonación de expresión (una técnica usada normalmente en la materia) para aislar un gen o ADNc que codifica la neuquinasa. Se puede construir una biblioteca de expresión por cualquier método conocido en la técnica. En una realización, el ARNm (p. ej., humano) se aísla, y el ADNc se hace y se liga en un vector de expresión, de modo que el ADNc sea capaz de ser expresado por la célula hospedante en la que se ha introducido. Se pueden usar varios ensayos de cribado para seleccionar el producto de neuquinasa expresado. En un ejemplo, se pueden usar anticuerpos anti-neuquinasa para la selección.

En otro aspecto, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede usar para amplificar las secuencias de ácido nucleico de la presente invención deseadas a partir de una biblioteca genómica o de ADNc. Los cebadores oligonucleótidos aislados que representan secuencias que codifican neuquinasa conocidas se pueden usar como cebadores en la PCR. El cebador oligonucleótido aislado puede comprender al menos 10 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 3 o su cadena complementaria. Alternativamente, el cebador oligonucleótido aislado comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 4 o su cadena complementaria. En algunos casos, el cebador oligonucleótido aislado comprende el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5. En algunos casos, el cebador oligonucleótido aislado comprende el ácido nucleico de SEQ ID NO: 6. Preferiblemente, los cebadores oligonucleótidos representan al menos parte de los segmentos conservados de fuerte homología entre genes que codifican neuquinasa de diferentes especies. Los oligonucleótidos sintéticos se pueden usar como cebadores para amplificar por PCR secuencias de ARN o ADN, preferiblemente una biblioteca de ADNc, de potencial interés. Alternativamente, se pueden sintetizar cebadores degenerados para usar en reacciones de la PCR.

En las reacciones de la PCR, el ácido nucleico que se va a amplificar puede incluir ARN o ADN, por ejemplo, ARNm, ADNc o ADN genómico de cualquier especie eucariota. La PCR se puede llevar a cabo, p. ej., usando un ciclador térmico Cetus de Perkin-Elmer y la polimerasa Taq. También se puede variar la restricción de las condiciones de hibridación usadas en el cebado de las reacciones de PCR, para permitir mayor o menor grado de similitud de secuencias de nucleótidos entre una secuencia de nucleótidos de neuquinasa conocida y un homólogo de ácido nucleico que se está aislando. Para la hibridación de especies cruzadas, se prefieren las condiciones de restricción bajas. Para la hibridación en la misma especie, se prefieren condiciones moderadamente restrictivas. Después de la amplificación con éxito de un segmento de un homólogo de neuquinasa, ese segmento se puede clonar, secuenciar y usar como una sonda para aislar un ADNc completo o clon genómico. Esto, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótidos completa del gen, el análisis de su expresión y la producción de su producto proteína para el análisis funcional. De esta forma, se pueden identificar secuencias de nucleótidos adicionales que codifican la neuquinasa u homólogos de neuquinasa.

Los métodos antes citados no se pretende que limitan la siguiente descripción general de métodos por los cuales se pueden obtener clones de genes que codifican la neuquinasa u homólogos de los mismos.

Cualquier célula eucariota puede servir potencialmente como la fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen de neuquinasa, ADNc de neuquinasa o un homólogo de los mismos. Las secuencias de ácido nucleico que codifican la neuquinasa se pueden aislar de fuente de vertebrado, mamífero, humana, porcina, bovina, felina, aviar, equina, canina, así como primates adicionales. El ADN se puede obtener por procedimientos convencionales conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (p. ej., una “biblioteca” de ADN), por síntesis química, por clonación de ADNc o por clonación de ADN genómico o fragmentos del mismo, purificado de la célula deseada o por amplificación por PCR y clonación. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Glover, D.M. (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, 2ª ed., MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1995). Los clones derivados de ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras y de intrones además de las regiones codificantes; los clones derivados de ADNc contendrán solo secuencias de exones. Cualquiera que sea la fuente, el gen se puede clonar en un vector adecuado para la propagación del gen.

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En la clonación del gen a partir del ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codifican el gen deseado. El ADN se puede escindir en sitios específicos usando diferentes enzimas de restricción. Alternativamente, se puede usar DNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN o el ADN se puede cizallar físicamente, por ejemplo, mediante ultrasonidos. Los fragmentos de ADN lineales después se pueden separar de acuerdo con el tamaño por técnicas convencionales, incluyendo, pero no limitado a electroforesis en agarosa y gel de poliacrilamida y cromatografía en columna.

Una vez se han generado los fragmentos de ADN, se puede llevar a cabo la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen deseado, de una serie de formas. Por ejemplo, si está disponible un gen de neuquinasa (de cualquier especie) o su ARN específico, y se puede purificar y marcar, los fragmentos de ADN generados se pueden cribar por hibridación de ácido nucleico con la sonda marcada (Benton y Davis, Science

196:180 (1977); Grunstein y Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961 (1975). Los fragmentos de ADN con homología sustancial con la sonda hibridarán. También se puede identificar el fragmento adecuado mediante digestión o digestiones con enzimas de restricción y comparación de los tamaños de fragmentos con los esperados de acuerdo con un mapa de restricción conocido, si este está disponible. Se puede llevar a cabo selección adicional basándose en las propiedades del gen.

Alternativamente, la presencia del gen se puede detectar mediante ensayos basados en propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, los clones de ADNc o clones de ADN que hibridan-seleccionan los ARNm adecuados, se pueden seleccionar para producir una proteína que tenga, p. ej., migración electroforética, comportamiento de isoelectroenfoque, mapas de digestión proteolítica, actividad de unión de sustrato o propiedades antígenas similares o idénticas, como se conocen para una neuquinasa específica. Si está disponible un anticuerpo contra una neuquinasa particular, la neuquinasa se puede identificar por unión del anticuerpo marcado al clon o clones que producen putativamente la neuquinasa en un procedimiento de tipo ELISA (inmunoensayo de absorción ligado a enzimas).

Una neuquinasa u homólogo de la misma también se puede identificar por selección de ARNm por hibridación de ácido nucleico seguido de traducción in vitro. En este procedimiento, se usan fragmentos para aislar los ARNm complementarios por hibridación. Dichos fragmentos de ADN pueden representar ADN purificado disponible de otras especies que contienen un gen que codifica la neuquinasa. El análisis por inmunoprecipitación o ensayos funcionales de los productos de traducción in vitro de los ARNm aislados identifica el ARNm y, por lo tanto, los fragmentos de ADN complementarios que contienen las secuencias deseadas. Además, se pueden seleccionar los ARNm específicos por adsorción de polisomas aislados de células para inmovilizar anticuerpos específicamente dirigidos contra una neuquinasa específica. Se puede sintetizar un ADNc que codifica la neuquinasa radiomarcada usando el ARNm seleccionado (de los polisomas adsorbidos) como molde. El ARNm o ADNc radiomarcado después se pueden usar como una sonda para identificar los fragmentos de ADN que codifican la neuquinasa de entre otros fragmentos de ADN genómicos.

Las alternativas para aislar el ADN genómico de neuquinasa incluyen, pero no se limitan a la síntesis química de la propia secuencia génica a partir de una secuencia conocida, o hacer el ADNc al ARNm que codifica la neuquinasa. Por ejemplo, el ARN para la clonación del ADNc de neuquinasa se puede aislar de células que expresan un gen de neuquinasa. Son posibles otros métodos y están dentro del alcance de la invención.

El gen que codifica la neuquinasa o análogo de neuquinasa identificado y aislado, después se puede insertar en un vector de clonación adecuado. Se puede usar un gran número de sistemas de vector-hospedante conocidos en la técnica. Los vectores de clonación posibles incluyen, pero no se limitan a plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedante usada. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a bacteriófagos tales como derivados lambda o plásmidos tales como pBR322, derivados de plásmidos pUC o el vector pBluescript (Stratagene). La inserción en un vector de clonación se puede llevar a cabo, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que puede tener extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (conectores) en los extremos de ADN. Estos conectores ligados pueden comprender oligonucleótidos químicamente sintetizados específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen o secuencia de ácido nucleico que codifica la neuquinasa se puede modificar mediante formación de cola homopolímera. Se pueden introducir moléculas recombinantes en células hospedantes por transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de modo que se generan muchas copias del gen.

En un método alternativo, el gen deseado se puede identificar y aislar después de inserción en un vector de clonación adecuado en un procedimiento de “perdigonada”. El enriquecimiento del gen deseado, por ejemplo, por fraccionamiento por tamaños, se puede hacer antes de inserción en el vector de clonación.

Para generar múltiples copias del gen, ADNc o secuencia de ADN sintetizada que codifica la neuquinasa aislado, se pueden transformar células hospedantes, por ejemplo cepas competentes de E. coli, con moléculas de ADN recombinantes que incorporan dichas secuencias de acuerdo con cualquier técnica conocida en la materia. Por lo tanto, el gen se puede obtener en grandes cantidades desarrollando transformantes, aislando las moléculas de ADN

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células germinales se puede usar para reproducir animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de forma homóloga por transmisión de la línea germinal del transgén. Hay métodos descritos para la construcción de vectores recombinantes homólogos y animales recombinantes homólogos (Berns et al., documento WO 93/04169, 1993; Kucherlapati et al., documento WO 91/01140, 1991; Le Mouellic y Brullet, documento WO 90/11354, 1990).

Alternativamente, se pueden producir animales transgénicos que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del transgén. Un ejemplo de dicho sistema es el sistema de recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1 (Lakso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 (1992)). Otro sistema de recombinasa es el sistema de recombinasa FLP de Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al., Science 251:1351-1355 (1991)). Si se usa un sistema de recombinasa cre/loxP para regular la expresión del transgén, se requieren animales que contengan transgenes que codifican tanto la recombinada Cre como una proteína seleccionada. Dichos animales se pueden producir como animales transgénicos “dobles”, por apareamiento de un animal que contiene un transgén que codifica una proteína seleccionada con otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa.

También se pueden producir clones de animales transgénicos (Wilmut et al., Nature 385:810-813 (1997)). En resumen, se puede aislar una célula de un animal transgénico e inducir que salga del ciclo de crecimiento y entre en la fase G0. La célula quiescente después se puede fusionar con un ovocito enucleado de un animal de la misma especie del que se ha aislado la célula quiescente. Después, el ovocito reconstruido se cultiva para el desarrollo hasta una mórula o blastocito y después se transfiere a una PFFA. La descendencia nacida de esta animal madre adoptiva será un clon del animal transgénico “parental”.

5.6. Métodos de cribado para moduladores de la actividad de neuquinasa

La presente invención también proporciona métodos para identificar un compuesto que modula la actividad de

neuquinasa en una célula o tejido de interés. Un compuesto puede modular la actividad de neuquinasa afectando, por ejemplo: (1) al número de copias del gen de neuquinasa en la célula (amplificadores y desamplificadores); (2) aumentando o disminuyendo la transcripción del gen de neuquinasa (reguladores por aumento y reguladores por disminución de la transcripción); (3) aumentando o disminuyendo la traducción del ARNm de neuquinasa en proteína (reguladores que aumentan y reguladores que disminuyen la traducción); o (4) aumentando o disminuyendo la actividad de la proteína neuquinasa (agonistas y antagonistas). Para identificar compuestos que afectan a la neuquinasa a nivel del ADN, ARN y proteína, se ponen en contacto células u organismos con un compuesto candidato y se puede evaluar el correspondiente cambio en el ADN, ARN o proteína neuquinasa. Para los amplificadores o desamplificadores de ADN, se puede medir la cantidad de ADN de neuquinasa. Para aquellos compuestos que son reguladores por aumento y reguladores por disminución de la transcripción, se puede medir la cantidad de ARNm de neuquinasa. Alternativamente, la secuencia promotora de neuquinasa se puede unir operativamente a un gen indicador, y se pueden ensayar potenciales moduladores de la transcripción de neuquinasa midiendo la actividad del gen indicador en presencia y ausencia del compuesto. Para reguladores que aumentan y disminuyen la traducción, se puede medir la cantidad de polipéptido de neuquinasa. Alternativamente, los cambios en la actividad biológica de la neuquinasa, medidos por la técnica descrita a continuación, pueden ser un indicador indirecto de la capacidad de un compuesto para modular la traducción de neuquinasa.

La actividad de neuquinasa de los métodos descritos en la presente memoria abarca la actividad biológica de la neuquinasa que incluye, pero no se limita a la fosforilación de la cadena ligera de la miosina cardiaca y/o fragmentos funcionales o variantes de la cadena ligera de miosina, unión de calmodulina, y autoihibición. Los métodos para examinar los sucesos de fosforilación basados en célula son conocidos normalmente en la técnica, y se pueden usar para examinar cambios en la fosforilación de la cadena ligera de miosina después de contacto con un modulador putativo de la actividad biológica de neuquinasa.

En una realización, la célula o tejido útil para los métodos descritos en la presente memoria, expresa un polipéptido de neuquinasa a partir de una copia endógena del gen de neuquinasa. En otra realización, la célula o tejido expresa un polipéptido de neuquinasa después de transformación transitoria o estable con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de neuquinasa de la presente invención. Se puede usar cualquier célula de mamífero conocida por el experto en la técnica como útil para expresar un polipéptido recombinante, sin limitación, para expresar un polipéptido de neuquinasa útil para los métodos descritos en la presente memoria.

En una realización, el método de identificación de un compuesto que modula la actividad de neuquinasa comprende determinar un primer nivel de actividad de neuquinasa en una célula o tejido que expresa un polipéptido de neuquinasa, poner en contacto dicha célula o tejido con un compuesto de ensayo, después determinar un segundo nivel de actividad de neuquinasa en dicha célula o tejido. Una diferencia en el primer nivel y el segundo nivel de actividad de neuquinasa es indicativa de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de la neuquinasa. En una realización, un compuesto puede tener actividad agonista si el segundo nivel de actividad de neuquinasa es mayor que el primer nivel de actividad de neuquinasa. En algunas realizaciones, la actividad agonista comprende al menos aproximadamente un aumento de al menos aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10 o más veces en el segundo nivel de actividad de neuquinasa comparado con el primer nivel de actividad de neuquinasa. En otra realización, un compuesto puede tener actividad antagonista si el segundo nivel de actividad de neuquinasa es menor que el primer nivel de actividad de neuquinasa. En algunas realizaciones, la actividad antagonista comprende

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miembros de la biblioteca que se unen a la proteína (o ácido nucleico). Los ejemplos dichos métodos de cribado, denominados técnicas de “batea” se describen a modo de ejemplo en Parmley y Smith, Gene 73:305-318 (1988); Fowlkes et al., Bio/Techniques 13:422-427 (1992); publicación PCT nº WO 94/18318; y en referencias citadas en los documentos anteriores.

En otra realización, se puede usar el sistema de dos híbridos para seleccionar proteínas que interaccionan en levaduras (Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9578-9582 (1991)) para identificar moléculas que se unen específicamente a la proteína neuquinasa o un análogo de la misma.

En otra realización, el cribado se puede llevar a cabo creando una biblioteca de péptidos en una célula procariota o eucariota, de modo que las proteínas de la biblioteca son expresadas en la superficie de la célula, seguido de contacto de la superficie de la célula con neuquinasa y determinación de si se ha producido la unión. Alternativamente, las células se transforman con un ácido nucleico que codifica neuquinasa, de modo que la neuquinasa es expresada en la superficie de la célula. Después, las células se ponen en contacto con un agonista o antagonista potencial, y se determina la unión o falta de ella. En una realización específica de lo anterior, el potencial agonista o antagonista se puede expresar en la misma o diferente célula, de modo que el potencial agonista o antagonista sea expresado en la superficie de la célula.

Como entenderá claramente el experto en la técnica, cualquiera y/o todas las realizaciones descritas en la presente memoria para identificar un agente, fármaco o compuesto que pueda modular la actividad de neuquinasa, incluyendo los procedimientos que incorporan el diseño racional de fármacos, como se describe en la presente memoria, se pueden combinar para formar cribados y ensayos de fármacos adicionales, todos los cuales están contemplados por la presente invención.

5.7. Métodos de diagnóstico

La presente invención también se refiere al campo de la medicina predictiva en la que se usan ensayos de diagnóstico y pronóstico para fines de pronóstico (predictivos) para el tratamiento profiláctico de un individuo. Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la expresión del ácido nucleico de neuquinasa así como la actividad de neuquinasa en el contexto de una muestra biológica (p. ej., sangre, suero, células, tejido) para determinar si un individuo está afectado por una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno. Dicho trastorno o enfermedad puede estar asociada con la expresión o actividad aberrante de la neuquinasa, y pueden incluir, pero no se limita a disfunción cardiaca. En realizaciones particulares, la disfunción cardiaca es la miocardiopatía hipertrófica. En otras realizaciones, la disfunción cardiaca es la insuficiencia cardiaca. La invención también proporciona ensayos de pronóstico para determinar si un individuo tiene riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión o actividad del ácido nucleico de neuquinasa. Por ejemplo, se pueden ensayar mutaciones en la neuquinasa en una muestra biológica. Dichos ensayos se pueden usar para propósitos de pronóstico o predictivos para el tratamiento profiláctico de un individuo antes del inicio de un trastorno caracterizado por o asociado con la expresión del ácido nucleico o actividad biológica de la neuquinasa aberrantes.

5.7.1. Ensayos de diagnóstico

Un método de ejemplo para detectar la presencia o ausencia de neuquinasa en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el ácido nucleico de neuquinasa (p. ej., ARNm, ADN genómico) de modo que se confirme la presencia de neuquinasa en la muestra. Un agente para detectar el ARNm o ADN genómico de neuquinasa es una sonda de ácido nucleico marcada que puede hibridar con el ARNm o ADN genómico de neuquinasa. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de neuquinasa de longitud completa, tal como el ácido nucleico de las SEQ ID NO: 3 o 4, o una parte de las mismas. En algunas realizaciones, la sonda de ácido nucleico es un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y es suficiente para hibridar específicamente en condiciones restrictivas con el ARNm o ADN genómico de neuquinasa.

Un agente para detectar el polipéptido de neuquinasa puede ser un anticuerpo capaz de unirse a la neuquinasa, preferiblemente un anticuerpo con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Se puede usar un anticuerpo intacto o un fragmento de anticuerpo, p. ej., un fragmento Fab. Una sonda marcada o anticuerpo se puede acoplar (es decir, unir físicamente) con una sustancia detectable, o se puede usar un método de detección indirecto en donde la sonda o el anticuerpo se detecta por la reactividad con un reactivo secundario directamente marcado. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario con marcaje fluorescente, o marcaje en el extremo de una sonda de ADN con biotina, de modo que se pueda detectar con estreptavidina con marcaje fluorescente.

El método de detección de la invención se puede usar para detectar el ARNm, proteína o ADN genómico de neuquinasa en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para detectar ARNm de neuquinasa incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de polipéptido de neuquinasa incluyen inmunoensayos absorbentes ligados a enzima (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección del ADN genómico de

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una muestra de tejido del paciente (p. ej., de tejido de biopsia) y ensayando in vitro los niveles de ARN o péptido, estructura y/o actividad de los péptidos expresados (o los ARNm de neuquinasa). Los métodos incluyen, pero no se limitan a inmunoensayos (p. ej., por análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS), inmunocitoquímica, etc.) y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión de ARNm (p. ej., ensayos Northern, transferencias en manchas, hibridación in situ, y similares).

5.10.2. Métodos profilácticos

La invención proporciona un método para prevenir en un sujeto una enfermedad o afección asociada con una expresión o actividad aberrante de la neuquinasa, administrando un agente que modula la expresión de la neuquinasa o al menos una actividad de neuquinasa. De acuerdo con la invención, dicho agente es el polipéptido aislado o ácido nucleico asilado de la invención. Los sujetos que tienen riesgo de una enfermedad que es causada por la expresión o actividad aberrante de la neuquinasa se pueden identificar, por ejemplo, por cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico. La administración de un agente profiláctico se puede producir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de la neuquinasa, de modo que se previene una enfermedad o trastorno, o alternativamente, se retrasa su avance. En una realización específica de la invención, la hipertrofia de células musculares ventriculares se previene o retrasa por la administración de dicho agente profiláctico. Dependiendo del tipo de aberración de la neuquinasa, se puede usar, por ejemplo, un agonista de neuquinasa o antagonista de neuquinasa para tratar el sujeto. El agente adecuado se puede determinar basándose en ensayos de cribado.

5.10.3. Métodos terapéuticos

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos de modulación de la expresión o actividad de la neuquinasa con propósitos terapéuticos. El método modulador de la invención implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de neuquinasa asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de neuquinasa puede ser un ácido nucleico o una proteína, un ligando cognado de neuquinasa que se encuentra de forma natural, un péptido, un peptidomimético de neuquinasa, un aptámero, u otras moléculas pequeñas. El agente puede estimular la actividad de neuquinasa. Los ejemplos de dichos agentes estimuladores incluyen neuquinasa activa y una molécula de ácido nucleico de neuquinasa que se ha introducido en la célula. De acuerdo con la invención, dicho agente es el polipéptido aislado o ácido nucleico asilado de la invención. La estimulación de la actividad de neuquinasa es deseable en situaciones en las que la neuquinasa es anormalmente regulada por disminución y/o en las que es probable que la actividad aumentada de neuquinasa tenga un efecto beneficioso.

Alternativamente, el agente modulador de neuquinasa puede inhibir la actividad de neuquinasa. Los ejemplos de agentes inhibidores incluyen anticuerpos anti-neuquinasa, o una molécula de ácido nucleico inhibidora. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede comprender un oligonucleótido de sentido contrario, un aptámero, o un ARN inhibidor/interferente (p. ej., un ARN inhibidor/interferente pequeño). Los métodos para cribar para identificar y hacer estos moduladores de ácidos nucleicos son conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, puede usar ARN interferente (ARNi) (véase, p. ej., Chuang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 97:4985 (2000)) para inhibir la expresión de un gen que codifica la neuquinasa. Los fragmentos de ARN interferente, en particular los ARNi bicatenarios (bc), se pueden usar para generar la pérdida de función de neuquinasa. Se conocen métodos relacionados con el uso de ARNi para silenciar genes en organismos, incluyendo mamíferos, C. elegans, Drosophila, plantas, y seres humanos (véase, p. ej., Fire et al., Nature 391:806-811 (1998); Fire, Trends Genet. 15:358-363 (1999); Sharp, Genes Dev. 15:485-490 (2001); Hammond, et al., Nature Rev. Genet. 2:1110-1119 (2001); Tuschl, Chem, Biochem. 2:239-245 (2001); Hamilton et al., Science 286:950-952(1999); Hammond et al., Nature 404:293-296 (2000); Zamore et al., Cell 101:25-33 (2000); Bernstein et al., Nature 409: 363366 (2001); Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 200 (2001); Elbashir et al. Nature 411:494-498 (2001); solicitud internacional PCT nº WO 01/29058; y solicitud internacional PCT nº WO 99/32619), cuyos contenidos se incorporan por referencia. Las construcciones que expresan ARN bicatenario (ARNbc) se introducen en un hospedante usando un vector replicable que permanece episomal o se integra en el genoma. Seleccionando secuencias adecuadas, se puede interferir en la expresión de ARNbc con acumulación de ARNm endógeno que codifica neuquinasa.

Se pueden llevar a cabo métodos moduladores in vitro (p. ej., cultivando la célula con el agente), o alternativamente in vivo (p. ej., administrando el agente a un sujeto). Como tal, la invención proporciona el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión o actividad aberrante de una neuquinasa o molécula de ácido nucleico. En una realización, el método implica administrar un agente (p. ej., un agente identificado por un ensayo de cribado), o combinación de agentes que modulan (p. ej., regulan por aumento o regulan por disminución) la expresión o actividad de neuquinasa. En otra realización, el método implica administrar una neuquinasa o molécula de ácido nucleico como tratamiento para compensar la expresión o actividad de neuquinasa aberrante o reducida.

5.10.4. Determinación del efecto biológico del producto terapéutico

Se pueden llevar a cabo ensayos in vitro o in vivo adecuados para determinar el efecto de un producto terapéutico específico y si su administración está indicada para el tratamiento del tejido afectado.

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extremo 5' de la SEQ ID NO: 10 solapaban con el 3' de la SEQ ID NO: 9.

6.3. Ejemplo 3: Expresión específica del gen de neuquinasa en corazón de rata

Usando el ADNc de neuquinasa como molde, se sintetizó una subsecuencia de neuquinasa (SEQ ID NO: 8) por PCR usando un cebador directo (ATGTCAGGAGTTTCAGAGGA (SEQ ID NO: 6)) y un cebador inverso (CTTGAATTCTCACAGTGACGTATCGATGAT (SEQ ID NO: 7)). Este fragmento (SEQ ID NO: 8) después se purificó y se usó como un molde para sintetizar la sonda de ADNc de neuquinasa radiomarcada. El fragmento de ADNc de neuquinasa y [α-32P]dCTP se añadieron al sistema de marcaje Prime-a Gene® de Promega (que contiene el fragmento largo de la ADN polimerasa I y hexadesoxirribonucleótidos aleatorios) para sintetizar sondas marcadas. Los productos de reacción se cargaron en columnas de centrifugado Sephacryl® S-400 (Promega), y las columnas se centrifugaron para recoger sondas mayores de 270 bp. Las sondas después se usaron para el análisis de transferencia Northern de Rat MTN™ Blot de Clontech, que incluye poli A+ ARN extraído de diferentes órganos de rata (corazón, cerebro, baso, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y testículos). La figura 1 muestra que la sonda específica de neuquinasa hibrida solo con un ARNm de aproximadamente 4,4 kb del tejido cardiaco, sugiriendo que el gen de neuquinasa es un gen cardiaco específico. La transferencia también se hibridó con sonda específica de β-actina (Clontech) como control de carga.

6.4. Ejemplo 4: Clonación de ADNc de neuquinasa humana a partir de ARN de ventrículo izquierdo humano

Se extrajo el ARN total del ventrículo izquierdo humano. Se añadieron ARN, cebador Oligo-dT ((TTTTTTTTTTTTTTT)) (SEQ ID NO: 29) y transcriptasa inversa de AMV (Promega) al sistema de transcripción inversa de Promega para la transcripción inversa. Después de la reacción, se añadieron una parte alícuota de la mezcla de reacción, cebador directo (GACACCACCGCCTGAGTGAGAAC (SEQ ID NO: 11)) y cebador inverso (CCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA (SEQ ID NO: 12)) a una mezcla madre de PCR (Sinobio), y se llevó a cabo la PCR para amplificar el ADNc diana. Después de la reacción, las mezclas resultantes se purificaron por electroforesis y se ligaron al plásmido pUCm-T (Promega) y se secuenciaron. La secuencia de ADNc de neuquinasa humana se cita como SEQ ID NO: 4. Se identificaron sitios de inicio de traducción alternativa putativa en las posiciones 139 y 211 de la SEQ ID NO: 4, cuya traducción dio como resultado polipéptidos de 795 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) y 819 aminoácidos (SEQ ID NO: 25), respectivamente.

6.5. Ejemplo 5: Producción de anticuerpos para neuquinasa humana

Se generaron anticuerpos policlonales de conejo contra una proteína de fusión de neuquinasa humana-GST. Brevemente, se añadieron, ADNc de neuquinasa humana, cebador directo (CGCGGATCCATGGACACAAAGCTGAACATG (SEQ ID NO: 13)) y cebador inverso (CCTTAAGTCACGTGGCCCCCACCAAAGCGAT (SEQ ID NO: 14)) a una mezcla primaria de PCR (Sinobio), y se llevó a cabo la PCR. Después de la PCR, las mezclas resultantes se purificaron por electroforesis. Tanto el ADN purificado como el plásmido pGEX-2T (GE healthcare) se digirieron con BamHI y EcoRI respectivamente antes del ligado. La secuencia de ADNc del fragmento de neuquinasa humana se cita como SEQ ID NO: 15, y la secuencia de aminoácidos del fragmento se muestra como SEQ ID NO: 16.

La construcción ligada que contenía el fragmento de ADNc de neuquinasa humana se transformó en células BL21 antes de añadir IPTG al cultivo para inducir la expresión alta del fragmento de neuquinasa. Después, se recogieron las células por centrifugación del cultivo antes de tratamiento con ultrasonidos. La suspensión de células tratada con ultrasonidos después se centrifugó además para sedimentar los cuerpos de inclusión. Después de separar el líquido sobrenadante, se añadió urea 8 M para disolver los cuerpos de inclusión. Después la solución del fragmento de neuquinasa se dializó para separar la urea y simultáneamente volver a plegar el fragmento. Después, el fragmento se purificó por columna de afinidad de GST y se inyectó hipodérmicamente a conejos para producir anticuerpos. Después de 2 semanas, se extrajo el suero de los conejos para la purificación del anticuerpo.

6.6. Ejemplo 6: Expresión específica de neuquinasa en tejido cardiaco humano

Se homogeneizaron tejidos humanos de intestino, hígado, corazón, músculo esquelético, pulmón, riñón, útero, bazo y tiroides por separado y se dializaron con tampón de diálisis (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150mM, Triton X-100 al 1%, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, vanadato sódico 2 mM, PMSF 2 mM, cóctel de inhibidor de proteasa (Roche, 1 trozo para 25 ml)). Las muestras de proteína de tejidos lisados se sometieron a SDS-PAGE, después se transfirieron a una membrana de PVDF para la transferencia Western. La expresión de la proteína neuquinasa en diferentes tejidos humanos se detectó mediante el anticuerpo producido en el ejemplo 5. La membrana se hibridó con un anticuerpo específico para GAPDH como un control de carga. Como se muestra en la figura 2, la neuquinasa solo se expresó en corazón humano. Este resultado complementa la expresión de ARNm de neuquinasa en tejido de corazón de rata, como se presenta en el ejemplo 3, y demuestra además que la expresión de neuquinasa es específica cardiaca.

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6.7. Ejemplo 7: La actividad de neuquinasa humana depende de calcio y calmodulina

Expresión y purificación de la cadena ligera de miosina reguladora (RLC) humana

Se extrajo el ARN total de tejido del ventrículo izquierdo humano. Se añadieron ARN, cebador directo (GGGAATTCCATATGGCACCTAAGAAAGCAAAGAA (SEQ ID NO: 17)), cebador inverso (CCGCTCGAGGTCCTTCTCTTCTCCGTGGGTG (SEQ ID NO: 18)) y transcriptasa inversa de AMV al sistema de transcripción inversa de Promega para la transcripción inversa. Después de la reacción, se ligó ADNc bicatenario al plásmido pet22b. Después, la construcción ligada se transformó en células BL21 antes de añadir IPTG para inducir la expresión alta de esta RLC marcada con his. Las células se sedimentaron por centrifugación antes del tratamiento con ultrasonidos para liberar los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación adicional antes de disolverlos con urea 8 M. La RLC marcada con his desnaturalizada se purificó por columna de níquel y se replegó por diálisis para separar la urea. La secuencia de aminoácidos de la RLC se corresponde con la SEQ ID NO: 19.

Expresión recombinante y purificación de neuquinasa

Se añadieron ADNc de neuquinasa, cebador directo (CATCATCTGGTTCCGCGTGGATCTATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGT (SEQ ID NO: 20)), cebador inverso (CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAG (SEQ ID NO: 21)) y ADN polimerasa Pfu Turbo® (Stratagene) al sistema de reacción de PCR para la PCR. Después de varios ciclos de amplificación, se añadieron una parte alícuota de la mezcla de reacción, nuevo cebador directo (CGGGATCCATGCATCATCATCATCATCATCTGGTTCCGCGT (SEQ ID NO: 22)), cebador inverso (CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA (SEQ ID NO: 24) y ADN polimerasa PfuTurbo® (Stratagene) al sistema de reacción de PCR para ciclos adicionales de PCR. Se separó el ADN en la mezcla de reacción por electroforesis, y el ADN diana que codifica la neuquinasa se purificó y se ligó al plásmido pcDNA3. Los productos de la reacción de ligado se transformaron en células DH5α para la amplificación y secuenciación. Los clones que contenían la construcción correcta se amplificaron en cultivos de aumento gradual, y se extrajo el ADN plasmídico que contenía el ADNc de neuquinasa usando el kit Qiagen Plasmid Maxi Kit. El plásmido pcDNA3/neuquinasa purificado se transfectó en células COS7 usando Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). Después de un cambio inicial de medio varias horas después de transfección, las células se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Después las células se lisaron y se recogieron usando tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, vanadato sódico 2 mM, PMSF 2 mM, cóctel de inhibidor de proteasa (Roche, 1 comprimido para 25 ml de tampón de lisis)). La suspensión celular se centrifugó a 12000g durante 20 minutos, y los sedimentos vueltos a suspender se filtraron a través de una membrana de 0,45 µm (Millipore). Después la muestra se mezcló con anticuerpo con marcador His (Beyotime) y Protein A Sepharose 4 Fast Flow al 50% en tampón de lisis y se incubó sobre hielo durante 3 horas con agitación suave. La mezcla se centrifugó a 12000g durante 20 segundos antes de separar el líquido sobrenadante. Después el sedimento se lavó tres veces con tampón de lisis. Después del último lavado, el sedimento se volvió a suspender en 1 ml de tampón de reacción (Tris 20 mM, pH 7,5, KCl 60 mM), se mezcló y se incubó sobre hielo durante 5 min. La mezcla después se centrifugó, se separó el líquido sobrenadante y se añadieron otros 300 µl de tampón de reacción.

Fosforilación de RLC por neuquinasa dependiente de calcio y calmodulina

Se llevaron a cabo ensayos de fosforilación in vitro usando neuquinasa purificada, RLC, y calmodulina (Calbiochem) para determinar si la fosforilación por neuquinasa de la RLC es dependiente tanto de calcio como de calmodulina. La actividad de neuquinasa se evaluó in vitro, tanto en presencia como en ausencia de Ca2+ y calmodulina, vigilando la cantidad de fosforilación de RLC, determinada por transferencia Western para RLC fosforilada (RLC-P). Se llevaron a cabo tres experimentos simultáneos. En el experimento I, los componentes de la reacción incluían neuquinasa, ATP, RLC, Ca2+, CaM. En el experimento II, los componentes de la reacción incluían neuquinasa, ATP, RLC, CaM, pero no calcio, y se añadió EGTA para quelar el calcio en el tampón de reacción. En el experimento III, los componentes de la reacción incluían neuquinasa, ATP, RLC y Ca2+, pero no calmodulina. La concentración de los reaccionantes, cuando se incluían en la reacción, era la siguiente: ATP 2 mM, RLC 2,5 µM, Ca2+ 0,3 µM, CaM 1 µM, con o sin EGTA 2 mM. Las reacciones de fosforilación se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave. Se separó una parte alícuota de 20 µl de cada reacción, se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida, y se transfirió a una membrana de PVDF para el análisis de transferencia Western. Se usó anticuerpo contra RLC-P (Cell Singnaling) para detectar la RLC-P; los resultados se presentan en la figura 3.

La RLC es altamente fosforilada cuando la neuquinasa se combina con RLC en presencia tanto de Ca2+ como de calmodulina (banda 1). En cambio, la fosforilación de la RLC apenas es detectable en ausencia de Ca2+ combinado con la adición de EGTA a la solución de reacción (banda 2). Igualmente, la fosforilación de la RLC es indetectable en ausencia de calmodulina (banda 3). Considerados juntos, estos resultados indican que la fosforilación por la neuquinasa de la RLC es altamente dependiente de la presencia de Ca2+ y calmodulina. Por lo tanto, se cree que la fosforilación por la neuquinasa de la RLC se produce de la siguiente forma:

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