CN101553568B - 生长因子神经调节蛋白的下游蛋白纽激酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生长因子神经调节蛋白(Neuregulin)信号通路中的下游分子纽激酶(Neukinase)。本发明首先提供了编码纽激酶的核酸，纽激酶的多肽，与编码纽激酶的核酸杂交的寡核苷酸以及包含纽激酶编码序列的表达载体。本发明还同时提供了与纽激酶相关的宿主细胞，抗体，转基因动物，组合物以及试剂盒。另外，本发明还提供了鉴定易患心功能障碍体质的方法，检测纽激酶、纽激酶编码核酸的方法，筛选影响纽激酶活性的物质的方法以及调节纽激酶活性的方法。

Description

生长因子神经调节蛋白的下游蛋白纽激酶

1.技术领域

本发明涉及生长因子神经调节蛋白(Neuregulin)信号通路中的下游分子纽激酶(Neukinase)。本发明首先提供了编码纽激酶的核酸，纽激酶的多肽，与编码纽激酶的核酸杂交的寡核苷酸以及包含纽激酶编码序列的表达载体。本发明还同时提供了与纽激酶相关的宿主细胞，抗体，转基因动物，组合物以及试剂盒。另外，本发明还提供了鉴定易患心功能障碍体质的方法，检测纽激酶、纽激酶编码核酸的方法，筛选影响纽激酶活性的物质的方法以及调节纽激酶活性的方法。 

2.背景技术

心衰影响了约500万的美国人口，并以每年55万人的速度在增长。目前对心力衰竭的治疗主要是血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，其主要作用是扩张血管，降低血压以减轻心脏负荷。虽然ACE抑制剂对死亡率下降的影响具有统计学差异，但实际的下降比例仅为3％-4％，同时还可能伴有副作用。其它的心衰治疗方法同样也具有限制性，比如心脏移植手术由于价格昂贵、创伤性大以及缺乏供体等原因而受到限制。医疗器械装置的使用，比如双心室起搏器同样受到了创伤性和价格的限制。基于以上原因，有必要开发一种新的治疗心衰的方法。 

对患有心衰或者可能发生心衰的病人给予neuregulin(以下简称NRG)的摄入可能是一种有前途的治疗方法。NRG家族由结构上相似的生长及分化因子NRG1，NRG2，NRG3，NRG4以及它们的亚型组成。比如已有超过15种NRG1的亚型被发现，并且这15种亚型由于其表皮生长因子(EGF)样结构域的序列的差异被分为α和β两种类型。目前发现NRG1的EGF样结构域，包含50到64个氨基酸不等，已经足够行使结合以及激活其受体的功能。已有的研究显示NRG-1β可以高亲和力地结合ErbB3和ErbB4受体。 

近期的一些研究强调了NRG-1β，ErbB2以及ErbB4在心血管系统的发育以及维持成人心脏功能上的作用。NRG-1β被发现可以增强成年心肌细胞肌原纤维节的结构形成。在三种不同的心衰动物模型中均发现，短期给予重组NRG-1βEGF样结构域蛋白治疗可以显著提高心脏功能，防止心衰。更为重要的是，NRG-1β可以显著地延长心衰动物的生存时间。基于上述研究结果，有理由相信NRG-1β可以作为一个广谱的治疗多种疾病导致的心力衰竭的先驱性的药物。 

然而目前仍然需要进一步研究NRG的信号通路以及下游分子，从而可以通过调节NRG的信号传导来预防，治疗或者延缓心力衰竭和/或心脏肥大。 

3.发明概述 

本发明发现了一个参与NRG信号通路的新的蛋白激酶，命名为纽激酶，它与骨骼肌的肌球蛋白轻链激酶(skMLCK)具有结构上的相似性。我们克隆并测序了编码纽激酶的cDNA序列，并因此获得了纽激酶的氨基酸序列。NRG可以增强纽激酶的表达和/或磷酸化，由此进而增强了纽激酶的靶分子肌球蛋白轻链的磷酸化水平。由于纽激酶在心脏组织中高表达，因此本发明从一个新的角度阐明了NRG预防和治疗心力衰竭的机制，同时也为心血管疾病的治疗提供了一个新的靶点。 

因此，本发明的第一个方面是提供了分离的含有与SEQ ID NO：1具有至少70％同源性的氨基酸序列的多肽，其中所指的多肽可以磷酸化肌球蛋白轻链。另一方面，本发明提供了分离的含有与SEQ ID NO：2具有至少70％同源性的氨基酸序列的多肽，其中所指的多肽可以磷酸化肌球蛋白轻链。在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化心肌细胞的肌球蛋白轻链。在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化来自哺乳动物的心肌细胞的肌球蛋白轻链，其中所指的哺乳动物包括但不受限于大鼠，小鼠或人。在某一具体实施方案中，所分离的多肽包含了SEQID NO：1所示的氨基酸序列。在另一个具体实施方案中，所分离的多肽包含了SEQID NO：2所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所分离的多肽包含了SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列。 

本发明的另一个方面是提供了一种核酸，其编码的多肽含有与SEQ ID NO：1具有至少70％同源性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所分离的核酸编码了含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，所分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少70％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，所分离的核酸包含了SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列。在某一具体实施方案中，所分离的核酸包含了SEQID NO：3所示的核酸序列或其互补序列。 

本发明的另一个方面是提供了一种核酸，其编码的多肽含有与SEQ ID NO：2具有至少70％同源性的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所分离的核酸编码了含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，所分离的核酸编码了含有与SEQ ID NO：25具有至少70％同源性的氨基酸序列的多肽。在某些具体实施方案中，所分离的核酸编码了含有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的多肽。在某些具体实施方案中，所分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少70％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，所分离的核酸包含了SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列。在某一具体实施方案中，所分离的核酸包含了SEQ ID NO：4所示的核酸序列或其互补序列。 

本发明的另一个方面是提供了分离的包含SEQ ID NO：3中至少10个连续核苷酸或其互补序列的寡核苷酸片段。另一个方面，本发明还提供了分离的包含SEQ ID NO：4中至少10个连续核苷酸或其互补序列的寡核苷酸片段。在某些实施方案中，所分离的寡核苷酸片段包含了SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。 

本发明的另一个方面是提供了一种载体，含有编码一种多肽的核酸序列，其中所指的多肽可以磷酸化肌球蛋白轻链。在某些实施方案中，该载体包含了SEQ IDNO：3中至少500个核苷酸序列。在某些实施方案中，该载体包含了SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该载体包含了SEQ ID NO：4中至少500个核苷酸序列。在某些实施方案中，该载体包含了SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。在某一具体实施方案中，该载体中的编码纽激酶的核酸序列被人为地与一个转录调控序列连接。在某些实施方案中，该载体选自质粒、粘粒、病毒或者噬菌体。在某些实施方案中，该载体被转入细胞后可以表达包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，该载体被转入细胞后可以表达包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，该载体被转入细胞后可以表达包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽。 

本发明的另一个方面是提供了一种分离的宿主细胞，其包含了编码本发明中所述的纽激酶的核酸。本发明的另一方面是提供了一种分离的宿主细胞，其包含了可以表达纽激酶的载体。在某些实施方案中，所分离的宿主细胞是新生大鼠心室细胞。在某些实施方案中，所分离的宿主细胞是H9c2(2-1)细胞。 

本发明的另一个方面是提供了一种抗体，可以特异性识别包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽。本发明的另一个方面是提供了一种抗体，可以特异性识别包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，该抗体特异性识别包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的纽激酶多肽，该抗体可以是多克隆抗体，单克隆抗体，单链抗体，重组抗体，嵌合抗体，人源化抗体，哺乳动物或者人的抗体。 

本发明的另一个方面是提供了一种非人类的转基因动物，其含有编码纽激酶的核酸。在某些实施方案中，该转基因动物中表达的纽激酶包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。在某些实施方案中，该转基因动物中表达的纽激酶包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列。在某些实施方案中，该转基因动物中表达的纽激酶包含SEQID NO：25所示氨基酸序列。在某一具体实施方案中，该转基因动物高表达或低表达纽激酶。在某一实施方案中，该转基因动物包含与SEQ ID NO：3或其互补序列至少70％同源性的核酸。在另一实施方案中，该转基因动物包含与SEQ ID NO：4或其互补序列至少70％同源性的核酸。在某些实施方案中，该非人类的转基因动物是哺乳动物，包括但不受限于小鼠，大鼠，兔子，仓鼠或羊。 

本发明的另一个方面是提供了一种转基因动物，其生殖细胞中内源性纽激酶的编码核酸中含有一个纯合子的无义突变，其中含有的无义突变是由于插入突变所造成，比如以同纽激酶转录的相反方向插入一个新霉素的基因表达框，并以同 源重组的方式导入胚胎干细胞，从而由于该无义突变导致该转基因动物不表达有功能的纽激酶多肽。在某些实施方案中，该转基因动物是可以繁殖的且可以将该无义突变传递到子代中。在某些特定的实施方案中，该转基因动物是哺乳动物，包括但不受限于小鼠，大鼠，兔子，仓鼠或者羊。 

本发明的另一个方面是提供了一种筛选影响纽激酶活性的物质的方法，该方法包括：a)将该物质与表达纽激酶的细胞接触；和b)评定该细胞中纽激酶的生物活性。在某些实施方案中，该生物活性选自自抑制功能，对心肌细胞肌球蛋白的磷酸化以及纽激酶的表达。 

本发明的另一个方面是提供了一种筛选影响纽激酶活性的物质的方法，该方法包括：a)使本发明所提供的转基因动物摄入该物质；和b)评定该物质是否影响该动物的心脏功能。在某些实施方案中，该心脏功能选自室间隔厚度，左心室舒张末期内径，心脏后壁厚度，左心室收缩末期内径，射血分数，心室短轴缩短率以及心动周期。 

本发明的另一个方面是提供了检测纽激酶编码基因的方法，该方法包括：a)将一段能与纽激酶编码基因杂交的核酸片段与该样品接触；和b)检测该核酸片段能否与该样品中的核酸相结合。 

本发明的另一个方面是提供了鉴定某一个体从遗传学上是否易患心功能障碍的方法，该方法包括检测来自该个体的某个生物样品中的纽激酶编码基因。在某些实施方案中，该心功能障碍是心脏肥大或心衰。 

本发明的另一个方面是提供了一种组合物，该组合物含有本发明所提供的纽激酶多肽以及药学上可接受的载体。另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物含有包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽以及药学上可接受的载体。另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物含有包括SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，该组合物含有如SEQ IDNO：25所示氨基酸序列的多肽以及药学上可接受的载体。 

本发明的另一个方面是提供了一种组合物，该组合物含有本发明所提供的编码纽激酶的核酸以及药学上可接受的载体。另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物含有编码包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽的核酸以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，该核酸包含了SEQ ID NO：3的序列。另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物含有编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的核酸以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，该组合物含有编码包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽的核酸以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，该核酸包含了SEQ ID NO：4的序列。 

本发明的另一个方面是提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：a)一种包含SEQID NO：3中至少10个连续核苷酸或其互补片段的寡核苷酸片段；和b)一种容器。在某些实施方案中，该试剂盒含有的寡核苷酸片段包含SEQ ID NO：3中至少15个 连续核苷酸或其互补片段。 

本发明的另一个方面是提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：a)一种包含SEQID NO：4中至少10个连续核苷酸或其互补片段的寡核苷酸片段；和b)一种容器。在某些实施方案中，该试剂盒含有的寡核苷酸片段包含SEQ ID NO：4中至少15个连续核苷酸或其互补片段。 

本发明的另一个方面是提供了一种调节纽激酶活性的方法，该方法包括用一种复合物来抑制纽激酶多肽中的自抑制结构域。在某些实施方案中，该复合物是Ca²⁺离子/钙调蛋白。 

4.附图说明

图1.Northern blot检测大鼠心脏、大脑、脾脏、肺脏、肝脏、骨骼肌、肾脏以及睾丸组织中纽激酶的mRNA表达水平。β-actin特异性探针作为上样参照。 

图2.Western blot检测人肠组织、肝脏、骨骼肌、肺脏、肾脏、子宫、脾脏以及甲状腺组织中纽激酶的蛋白表达水平。抗GAPDH抗体作为上样参照。 

图3.基于调节性肌球蛋白轻链(Regulatoty myosin light chain，RLC)的磷酸化(RLC-P)的纽激酶的体外测活反应。重组表达的纽激酶多肽和调节性肌球蛋白轻链在存在或不存在Ca²⁺离子，钙调蛋白，加或不加EGTA的情况下共孵育，用抗RLC-P抗体在Western blot反应中检测RLC的磷酸化。 

图4.大鼠纽激酶(r.NK)，人纽激酶(h.NK)和人骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(s.MLCK；NP_149109)氨基酸序列比对。黑色阴影框表示完全保守序列，灰色阴影框表示相同氨基酸，浅色阴影框表示相似氨基酸。下划线表示s.MLCK中具有丝氨酸/苏氨酸蛋白酶催化活性的片段(191-540位氨基酸)。 

5.实施方案的详细说明 

本发明首次公开了一种分离的cDNA，将其转染入细胞后可以产生纽激酶多肽。纽激酶被认为与心功能障碍，心脏肥大以及某些心肌病比如肥厚性心肌病和向心性心室肥大相关。本发明提供了纽激酶分子的cDNA序列以及由其编码的氨基酸序列。 

在公开了编码纽激酶的cDNA序列的前提下，其互补DNA序列，以及可以在严格的反应条件下与该cDNA或其互补片段杂交的DNA分子也被相应地公开了。这些可以与之杂交的DNA分子包括与原序列仅有较小差异的DNA分子，包括有少量核苷酸的替换、缺失或插入。同样被公开的还有包含该cDNA或其互补片段的一部分序列的寡核苷酸片段。该寡核苷酸片段可以用作DNA探针以及PCR反应中的引物。这些探针以及引物可以用于筛选以及鉴定那些由于纽激酶基因突变而引起的遗传学上易患肥厚性心肌病以及其它类型的心功能障碍的人群。 

同样被公开的还有包含该cDNA的重组DNA载体以及转染了该重组载体的 宿主细胞。另外，高表达或低表达纽激酶，高表达或低表达纽激酶片段或者突变体的转基因动物也被公开。 

为了清楚公开发明内容而非限制发明，分以下小节详细说明。所有此处提到的出版物均以参考文献的方式被引用，以说明以及描述其中引用的方法和/或材料。 

5.1释义 

除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。 

除非特别指明，在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。 

在此所用“生长因子神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”的意思是指与ErbB2，ErbB3，ErbB4或它们的组合物结合，可以激活上述受体的蛋白质或多肽。包括但不受限于所有NRG的亚型，EGF样结构域，包含EGF样结构域的多肽，NRG突变体或衍生物，以及其它可以激活上述受体的NRG样分子。在优选的实施方案中，NRG可以识别并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。NRG包括NRG-1，NRG-2，NRG-3和NRG-4蛋白，多肽，片段以及可以模拟NRG激活功能的复合物。本发明所用NRG可以激活上述受体并调控它们的生物学活性，比如刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为Schwann细胞；刺激骨骼肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞的分化、成活以及DNA合成。在这里，NRG也包括保留NRG保守氨基酸序列，且其生物学活性不变的突变体。适当的氨基酸替换不影响其生物学功能，这在本领域的技术人员中是被广泛认可的。一般情况下，对多肽的非功能区域的单个氨基酸的改变对其功能无影响(参见Watson等.Molecular Biology of the Gene，4^th Edition，1987，TheBejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)。NRG蛋白包括NRG的一个蛋白或者多肽。NRG核酸包括编码NRG的核酸或寡核苷酸片段。 

此处所用“EGF样结构域”或“epidermal growth factor-like domain”或“EGF-likedomain”是指与ErbB2，ErbB3，ErbB4或它们的组合物结合，并激活上述受体，具有与EGF受体结合区域相同结构的多肽。关于“EGF样结构域”参见WO 00/64400，Holmes等，Science，256：1205-1210(1992)；美国专利No.5,530,109及5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，13：1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387：509-512(1997)；Carraway等，Nature，387：512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochem.，122：675-680(1997)以及WO 97/09425。在某些实施方案中，EGF样结构域能够结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-1的受体结合序列。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-1的第177-226或177-237或177-240位氨基酸。在某些实施方案中，EGF样结构域包 含了NRG-3的受体结合序列。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-4的受体结合序列。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了美国专利No.5,834,229中所述的氨基酸序列：Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys PheMet Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro。 

此处所用“纽激酶”或“Neukinase”是指具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，以及与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高比例同源性的蛋白或多肽。且上述蛋白或多肽具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：2或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽相似的生物学功能，所述生物学功能包括但不受限于抗原交叉反应性，自抑制功能，磷酸化功能等。可以预见的是，在保持生物学功能不变的情况下，可以对SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：25所示的氨基酸进行单个或多个保守或非保守氨基酸的替换、插入或缺失。“纽激酶”或“Neukinase”还包括纽激酶基因的不同的突变体，差异剪切体以及具有多态性的序列编码的蛋白质或多肽。 

此处所用“纽激酶的功能性片段和突变体”是指保留有纽激酶的一个或多个功能的片段或突变体。可以认为，编码纽激酶的基因或cDNA在一定程度上的突变可以在实质上不引起纽激酶的一个或多个功能的变化。首先，由于遗传密码子的简并性，不同的密码子可能编码了同一个氨基酸。其次，即使由于基因突变导致了氨基酸的替换，这种替换也有可能是保守性的氨基酸替换并不实质性地影响纽激酶的功能。再次，将纽激酶的一部分氨基酸序列缺失也不会使其所有的功能受损或丧失。最后，在纽激酶中插入或增加氨基酸序列抗原表位标签，也可以使其功能不被受损或丧失。其它的一些修饰比如在体内或体外进行化学或生物化学的修饰也可以在实质上不损害其一个或多个功能。举例来说，这种修饰包括乙酰化，羧化，磷酸化，糖基化，泛素化，放射性核素标记以及其它各种在专业领域中可用的酶的修饰。在本专业领域中众所周知，有多种方法可以对蛋白质进行标记，如放射性同位素，荧光素，化学发光物质，酶以及抗体等。功能性的片段或突变体可以有不同的长度，比如含有至少10，25，50，75，100或200个氨基酸。 

此处所用“肌球蛋白轻链”或“myosin light chain”或“MLC”是指与肌球蛋白重链相关的分子量约18kDa的蛋白，其生物学功能是参与调节肌球蛋白的ATP酶活性。肌球蛋白轻链存在两种类型：MLC1，也被成为基本肌球蛋白轻链，简称为ELC；和MLC2，也被成为调节肌球蛋白轻链，简称为RLC。其中RLC是肌球蛋白轻链激酶的底物，当RLC被磷酸化后，其简称为RLC-P。ELC和RLC的亚型已经被发现存在于骨骼肌、平滑肌和心肌细胞中。比如Macera等人(Genomics 13：829-31(1992))报道了人心肌细胞RLC的基因和cDNA序列(GeneBankNo.NM00432)。 

此处所用“肌球蛋白的功能性片段或突变体”是指可以被具有肌球蛋白轻链 激酶功能的蛋白所磷酸化的多肽。它包括所有6个或6个以上氨基酸长度的能被具有肌球蛋白轻链激酶功能的蛋白磷酸化的多肽。 

此处所用“肌球蛋白轻链激酶功能”是指某一蛋白或多肽所具有的能在体内或体外将一个磷酸根离子共价结合到RLC上的功能。它包含了各种亚型的肌球蛋白轻链激酶(比如平滑肌，骨骼肌和心肌中的肌球蛋白轻链激酶亚型)和它们的片段和突变体(比如天然存在的突变体，重组DNA技术介导的突变、插入或缺失以及蛋白水解导致的各种片段)所具有的酶的活性。 

除非明确指明，此处所用“蛋白”是与“多肽”或“肽”同义。 

此处所用“纽激酶基因”是指编码纽激酶蛋白的一段基因。纽激酶基因的突变包括核苷酸序列的替换、插入或缺失，包括大部分或整个纽激酶基因的缺失，或者完整的或足够完整的基因的重复。基因表达的失控可以引起纽激酶的高表达或低表达。“纽激酶基因”应该被理解为包括人群中存在的各种具有多态性或等位基因突变的序列。另外，除了纽激酶的编码序列，还可以包括部分或全部侧翼调控序列和/或内含子序列。从突变的纽激酶基因上转录的RNA被认为是突变的纽激酶信使RNA。 

此处所用“纽激酶cDNA”是指一种cDNA分子，当被转染或导入细胞时可以表达纽激酶蛋白。该cDNA中不含有非编码的内含子序列和转录调控序列。举例来说，纽激酶cDNA可以从纽激酶基因的信使RNA中通过反转录的方式得到。SEQID NO：4显示了人纽激酶的cDNA序列。 

此处所用“载体”是指用于将外源DNA导入细胞进行表达或复制的不连续的原件。选择和使用此种载体在该领域的技术范围内是广为人知的。表达载体包括能表达DNA的载体，其DNA有效地与调控序列，例如启动子区域连接在一起。调控序列能影响该DNA片段的表达。所以，一个表达载体是指重组DNA或RNA构成物，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，它们一旦导入适当的宿主细胞中，可以导致克隆的DNA表达。合适的表达载体对本领域的技术人员而言十分清楚，包括能在真核细胞和/或原核细胞中复制的载体以及保持游离状态或整合到宿主细胞基因组的载体。 

此处所用“转基因动物”是指非人类的动物，优选的是哺乳动物，更为优选的是啮齿类动物比如大鼠或小鼠，其中一个或多个细胞中含有该转基因。其它的转基因动物还包括灵长类动物，绵羊，兔，仓鼠，狗，牛，山羊，鸡以及两栖类动物等等。该“转基因”是整合到宿主动物的一个细胞中的外源DNA，而该转基因动物则由该细胞发展而来，并且在成年动物的基因组中仍然保持该转基因。 

此处所用“同源重组动物”是指非人类的动物，优选的是哺乳动物，更为优选的是啮齿类动物比如大鼠或小鼠。该同源重组动物是由一个细胞比如胚胎干细胞发展而来，而该细胞中内源性的纽激酶基因被外源DNA的同源重组而改变了。其它的同源重组动物还包括兔，仓鼠和羊。外源性的纽激酶基因可以导入到宿主细 胞比如受精卵或胚胎干细胞中，该宿主细胞可以被用来发展非人类的转基因动物或同源重组动物。 

此处所用“生物样品”是指从一个个体内分离得到的组织、细胞和体液，也包括存在于一个个体内的组织、细胞和体液。 

此处所用“药学上可接受的”是指被国家管理部门认证的或者药典或其它被普遍认可的处方汇编中记载的可以用于动物特别是人的(载体或赋形剂等)。 

此处所用“载体”或“carrier”是指将药物摄入人体时所用的稀释剂、佐剂、赋形剂或介质。这些药用的载体可以是灭菌的液体，比如水和油类。其中油类可以来自石油、动物油、植物油以及合成来源的油类，比如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等等。 

此处所用“射血分数”是指每搏输出量占左心室舒张末期最大容积的百分比，可以用以下公式计算：(左心室舒张末期容积-左心室收缩末期容积)/左心室舒张末期容积。 

此处所用“心室短轴缩短率”是指心室舒张末期到心室收缩末期时左心室直径的变化，可以用以下公式计算：(左心室舒张末期直径-左心室收缩末期直径)/左心室舒张末期直径。 

此处所用“心力衰竭”是指心功能异常，表现为心脏不能以组织代谢所需的速度供血。心力衰竭包括范围广泛的疾病状态如充血性心力衰竭、心肌梗死、快速心律不齐、家族性肥大性心肌病、缺血性心脏病、自发扩张型心肌病、心肌炎。许多因素可导致心力衰竭，包括但不受限于缺血性、先天性、风湿性以及自发性。慢性心肌肥大是充血性心力衰竭和心脏停跳前的明显的疾病状态。 

此处所用“心肌梗死”是指由于冠状动脉阻塞或血流中断造成的心肌局部因严重且持续缺血导致的坏死。 

此处所用“心室肌细胞肥大”与心脏肥大同义，是指心室肌细胞体积增大的状态，这种心肌细胞的体积增大是指单个心肌细胞的体积明显增大(比如等于或大于非肥大细胞的2倍体积)或者是指心肌细胞体积增大足够引起临床症状。这种细胞的肥大常常伴随着心肌细胞内收缩蛋白的积聚以及一些胚胎基因的激活。体内或者体外检测心室肌细胞肥大的方法是本领域的技术人员熟知的。体外方法包括此处所描述的方法，比如细胞体积的增大以及心钠肽的表达升高。细胞体积的增大可以用评分的方法来判定细胞肥大的程度。通过在倒置显微镜下观察，细胞体积大小可以评分为7到0的任意分数，其中7分为完全肥大的细胞而3分为未经刺激的细胞。在Simpson等人发表于Circulation Res.51：787-801(1982)的图2A和B中分别可见评分为3分和7分的细胞状态。细胞肥大的评分与细胞表面积呈线性关系(相关系数＝0.99)。在苯肾上腺素诱导的细胞肥大试验中，非诱导细胞评分为3，其细胞表面积为581μm²，评分为7的完全肥大的细胞表面积为1811μm²，或者约比未诱导细胞大200％；评分为4的细胞表面积为771μm²，或者约比未诱 导细胞大30％；得分为5的细胞表面积为1109μm₂，或者约比未诱导细胞大90％；得分为6的细胞表面积为1366μm²，或者约比未诱导细胞大135％。肥大的心室肌细胞包括比正常细胞大15％的细胞(评分3.5)或更大的细胞。各种心肌肥大的诱导剂诱导心肌细胞肥大的能力是不同的，表现为所能诱导的心肌细胞肥大的最高评分不同，比如内皮素所能诱导的心肌细胞肥大的最高评分约为5。 

此处所用“抑制”心室肌细胞肥大是指降低肥大的心肌细胞的某一项肥大相关性的参数，或者是指防止正常心肌细胞的某一项肥大相关参数的升高。举例来说，抑制心室肌细胞肥大可以是降低肥大心肌细胞的细胞体积，其细胞体积降低的比例可以是10％或更高。更为优选的，其细胞体积降低的比例可以是30％或更高。最为优选的，其细胞体积降低的比例可以是50％或更高。参照苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的评分，抑制心肌细胞的肥大可使肥大评分降至6.5或更低，更为优选的及最为优选的，5.5或更低以及5.0或更低。当使用不同的诱导剂时，抑制的程度是根据该诱导剂所能诱导的最大的细胞体积(或者最高评分)来衡量的。 

抑制心室肌细胞肥大也可以是指存在一定浓度的足够引起心肌细胞肥大的诱导剂的情况下，防止正常心肌细胞的细胞体积增大。举例来说，防止细胞体积增大是指细胞体积的增大小于正常细胞的200％。更为优选的是，细胞体积的增大小于正常细胞的135％。最为优选的是，细胞体积的增大小于正常细胞的90％。参照苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的评分，防止心肌细胞的肥大可使肥大评分降至6.5或更低，更为优选的及最为优选的，5.5或更低以及4.5或更低。 

体内测定心肌肥大的方法包括检测心血管的各项参数比如血压、心率、全身血管阻力、收缩力、心搏力量、向心性或扩张性肥大、左心室收缩压、左心室平均压力、左心室舒张压、心输出量、中风指数、组织学参数以及心室大小和心壁厚度等。已有的测定心肌肥大发生发展或者抑制的动物模型包括压力负荷过重小鼠模型，右室失功能小鼠模型，转基因小鼠模型以及心梗大鼠模型。临床上也存在检测心肌肥大的存在、发展以及抑制的方法，比如舒张以及收缩相关参数的测定，心室估重，肺静脉流量等等。 

此处所用药物的“有效剂量”是指足够引起特定疾病的症状缓解或一定程度减轻的活性物质的剂量。这种有效剂量往往是指缓解症状而言，当然也可以引起疾病的治愈。 

此处所用“活性物质”是指任何在人或其它动物中用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防某种疾病的物质，同时也包括用于提高生理以及精神健康状态的物质。 

此处所用“治疗”是指一般意义上的在患有某种疾病的人中获得药理学和(或)生理学的效应。这种效应可以完全或部分地治愈某种疾病以及(或)该疾病的副作用以及缓解疾病的症状。“治疗”一词涵盖了用于哺乳动物尤其是人类的任何治疗疾病的方法，包括对疾病的抑制，比如阻止疾病的发展，或者缓解疾病，又比如引起疾病的消退。举例来说，“治疗”是指治疗患有或者可能患有心脏疾病比 如心衰的病人。更具体地说，“治疗”是指给心脏病患者以有效且有益的效应。 

此处所用“预防”是指一般意义上的针对具有患某种疾病倾向的个体，在疾病发生之前，防止疾病的发生。因此，“预防”可以是指阻止或者推迟心脏肥大的发生。 

5.2多肽 

本发明提供了新近分离得到的多肽，大鼠和人的纽激酶多肽。在某些实施方案中，这些多肽是指原始的大鼠或人的纽激酶多肽。在某些实施方案中，这些多肽包含了原始的大鼠或人的纽激酶多肽的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些多肽是指纽激酶多肽的功能性片段或突变体，它包含有抗原决定簇(比如可以被抗体识别的纽激酶多肽的一部分)或者具有活性功能。纽激酶的活性功能包括已知野生型全长纽激酶多肽的活性功能，比如肌球蛋白轻链激酶活性功能；抗原性(能被由具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的多肽免疫产生的抗体所识别)；免疫原性(免疫后产生的抗体能够识别具有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所述氨基酸序列的多肽)等等。 

在某些实施方案中，这些多肽由于某些在功能上无足轻重的氨基酸的替换，因而其氨基酸序列不同于原始的纽激酶多肽序列。氨基酸的替换可以由纽激酶编码核苷酸的突变所引起，并且在实质上不改变纽激酶的功能，比如编码核苷酸的突变引起了非必须氨基酸的替换。所谓“非必须”氨基酸是指野生型纽激酶多肽中的某个氨基酸改变后不影响其肌球蛋白轻链激酶活性。而“必须”氨基酸则是维持相应功能所必须的氨基酸。比如纽激酶多肽中的保守氨基酸比较不适合于替换。用于保守性替换的氨基酸是本领域技术人员熟知的。 

表1中显示了常用于保守性替换的“首选氨基酸”。保守性替换的涵义即为用于替换的氨基酸与被替换的氨基酸属于同一种类型，前提是满足替换后不实质性地改变物质的生物活性功能。如果这种替换改变了物质的生物活性功能，那么如表2中所显示的同一类氨基酸的引入也很有可能引起该物质的生物活性功能的改变。 

非保守性的氨基酸替换主要通过影响：1)多肽的骨架结构，比如β片层或α螺旋结构的形成；2)电荷；3)疏水性；或4)靶位点侧链体积来改变纽激酶多肽的功能或免疫学特征。根据氨基酸侧链的特征可以将氨基酸分成表2中所列的几种类型。非保守性替换往往是由一种类型的氨基酸替换成另一类型的氨基酸，替换的位点可以是保守性位点，最好是非保守性位点。 

蛋白质或者多肽的突变体可以由本领域中所熟知的方法所制备，比如核苷酸介导的突变(定点突变)，丙氨酸扫描以及PCR突变。定点突变(参照Carter，Biochem.J.237：1-7(1986)；Zoller和Smith，Methods Enzymol.154：329-50(1987))，表达框突变，限制选择突变(Wells等，Gene 34：315-323(1985))或其它现有的方法可以用 于纽激酶编码基因的克隆以及突变(Ausubel等，Current Protocols In MolecularBiology，John Wiley and Sons，New York(current edition)；Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，3rd.ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(2001).) 

在某些实施方案中，所用的纽激酶多肽包括纽激酶的突变体或衍生物，其中某个氨基酸被非经典氨基酸或氨基酸的化学类似物所替换。非经典氨基酸包括但不受限于氨基酸右旋异构体，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，γ-2-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟(基)脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，碘丙氨酸，t-丁基甘氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟代氨基酸，设计氨基酸比如β-甲基氨基酸以及其它氨基酸类似物。 

在某个实施方案中，所涉及的分离的多肽含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列。在某些实施方案中，该多肽含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少75％，80％，85％，90％或95％同源性的氨基酸序列。在某个特定的实施方案中，所涉及的分离的多肽含有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。 

本发明也包括了含有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。在某些实施方案中，该多肽含有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少75％，80％，85％，90％或95％同源性的氨基酸序列。在某个特定的实施方案中，所涉及的分离的多肽含有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。 

本发明也包括了含有与SEQ ID NO：25所示氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。在某些实施方案中，该多肽含有与SEQ ID NO：25所示氨基酸序列至少75％，80％，85％，90％或95％同源性的氨基酸序列。在某个特定的实施方案中，所涉及的分离的多肽含有如SEQ ID NO：25所示氨基酸序列。 

上述表示同源性的百分比是指两个对比氨基酸序列中相同(线性氨基酸序列相同位置的氨基酸残基相同)或相似(线性氨基酸序列相同位置的氨基酸残基属于上文中所述的保守性替换)氨基酸残基的百分率，同时为了达到最大的同源性，可以在需要的情况下引入间隔。在某些实施方案中，纽激酶的类似物主要是以它与野生型纽激酶序列的同源性或相似性为特征的。 

序列同源性，包括相同或相似氨基酸序列的比例，是由本领域中所熟知的序列对比方法来测定的，特别是运用系统默认参数的计算机运算法则或软件包。 

无穷多的例子运用了计算机运算法则或包含有计算机运算法则的软件包来计算序列的同源性，包括下述例子。BLAST家族程序是一个典型的用于序列比较的数学运算法则(比如Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268(在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改良)，Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410(描述NBLAST和XBLAST)，Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(描述Gapped BLAST和 PSIBLAST))。另外一个常用的是Myers和Miller所发明的结合于ALIGN程序(2.0版本)的运算法则，同时也可以作为GCG序列对比软件包的一部分。还有一个常用的是FASTA程序(Pearson W.R.和Lipman D.J.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：2444-2448，1988)，可以作为Wisconsin序列分析软件的一部分。其它还包括Smith和Waterman发明的BESTFIT，运用“局部同源性”的运算法则来寻找两个对比序列中最相似的区域，在两个对比序列的氨基酸长度不同时，该运算法则尤其适用；和GAP，运用Neddleman和Wunsch所发明的运算法则来寻找“最大相似度”，该运算法则在对比序列的氨基酸长度相差无几，且希望进行全长对比的情况下尤其适用。 

同源类似物可以是来自其它物种的直系同源物，包括来自动物、植物、酵母、细菌等等的直系同源物，也可以来自比如野生型蛋白的突变。举例来说，同源类似物可以通过定点突变来诱导结合蛋白质相互作用试验来验证。其它的方法比如蛋白亲和层析，亲和印迹，体外结合试验等等，是本领域技术人员熟练掌握的。 

为了比较两个不同的核苷酸或多肽序列，本发明所采用的描述方式是待测序列对比于参照序列的相似百分比。当待测序列的氨基酸长度小于参照序列的90％时，采用Myers和Miller的运算法则(Bull.Math.Biol，51：5-37(1989))，具体来说是运用ALIGN程序，采用系统设定参数。 

当待测序列的氨基酸长度大于或等于参照序列的90％时，采用Karlin和Altschul的结合于多种BLAST程序的运算法则(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-77(1993))。具体来说，同源百分比可以通过“BLAST 2Sequences”T具来计算(参照Tatusova和Madden，FEMS Microbiol.Lett.，174(2)：247-250(1999))。当比较两个成对的DNA序列的同源性时，可以使用BLASTN 2.1.2程序并且使用系统设定参数(Match：1；Mismatch：-2；Open gap：5penalties；extension gap：2penalties；gap x_dropoff：50；expect：10；and word size：11，with filter)。当比较两个成对的蛋白质序列的同源性时，可以使用BLASTP 2.1.2程序并且使用系统设定参数((Matrix：BLOSUM62；gap open：11；gap extension：1；x_dropoff：15；expect：10.0；and wordsize：3，with filter)。 

在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化肌球蛋白轻链。在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化肌球蛋白的某个功能片段或突变体。在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化哺乳动物的心肌细胞肌球蛋白轻链，或肌球蛋白轻链的功能片段或突变体。在某些实施方案中，该哺乳动物是大鼠，小鼠或人。在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化大鼠心肌细胞肌球蛋白轻链，或肌球蛋白轻链的功能片段或突变体。在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化小鼠心肌细胞肌球蛋白轻链，或肌球蛋白轻链的功能片段或突变体。在某些实施方案中，所分离的多肽可以磷酸化人心肌细胞肌球蛋白轻链，或肌球蛋白轻链的 功能片段或突变体。 

在某些实施方案中，所分离的多肽可以结合Ca²⁺离子/钙调蛋白并被其激活。可以认为肌球蛋白轻链激酶的激活涉及到Ca²⁺离子/钙调蛋白结合至一个保守的钙调蛋白结合区，该保守区域同时还包含自抑制功能区。Ca²⁺离子/钙调蛋白的结合导致了多肽催化活性中心与自抑制区的解离，因而催化活性中心被暴露，具备了结合以及磷酸化底物的功能。因此从某些方面来所，本发明所提供的多肽具有上述特性。 

5.3核酸 

在另一方面，本发明也提供了新近分离鉴定的分别编码人和大鼠纽激酶多肽特别是野生型纽激酶多肽的核酸。 

本发明所提供的纽激酶编码序列或相关序列包括编码与野生型纽激酶完全相同氨基酸序列的核苷酸序列，也包括其它核苷酸序列，其编码的多肽与野生型纽激酶相比具有不影响其功能的无关紧要的氨基酸替换。比如包括一个碱性氨基酸的替换(例如赖氨酸替换为精氨酸)，一个疏水性氨基酸的替换(例如异亮氨酸替换为亮氨酸)或者一个芳香类氨基酸的替换(例如酪氨酸替换为苯丙氨酸)。 

本发明还涉及了纽激酶的片段，因此编码纽激酶片段的核酸也在本发明公开范围内。纽激酶基因和纽激酶编码基因包括了人和其它物种的同源序列。在某些实施方案中，纽激酶基因和纽激酶编码基因来自脊椎动物，尤其是哺乳动物。在某些实施方案中，纽激酶基因和纽激酶编码基因来自大鼠。在一个优选实施方案中，纽激酶基因和纽激酶编码基因来自人。 

本发明的另一个方面，是提供了分离的核酸序列，其编码的多肽含有与SEQID NO：1所示氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列。在某些实施方案中，该核酸序列编码的多肽含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少75％，80％，85％，90％或95％同源性的氨基酸序列。在某个特定的实施方案中，该核酸序列编码的多肽含有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。 

本发明的另一个方面，提供了分离的核酸，包含了与SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少70％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少70％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少75％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少75％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少80％同源性的核酸序列。在某些实施方 案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少80％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少85％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少85％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少90％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少90％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少95％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：3中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少95％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了SEQ ID NO：3中至少500个连续的核苷酸或其互补序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了SEQ IDNO：3中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列。在某个特定的实施方案中，该分离的核酸包含了SEQ ID NO：3的核苷酸或其互补序列。 

本发明的另一个方面，是提供了分离的核酸序列，其编码的多肽含有与SEQID NO：2所示氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列。在某些实施方案中，该核酸序列编码的多肽含有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少75％，80％，85％，90％或95％同源性的氨基酸序列。在某个特定的实施方案中，该核酸序列编码的多肽含有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。 

本发明的另一个方面，是提供了分离的核酸序列，其编码的多肽含有与SEQID NO：25所示氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列。在某些实施方案中，该核酸序列编码的多肽含有与SEQ ID NO：25所示氨基酸序列至少75％，80％，85％，90％或95％同源性的氨基酸序列。在某个特定的实施方案中，该核酸序列编码的多肽含有如SEQ ID NO：25所示氨基酸序列。 

本发明的另一个方面，提供了分离的核酸，包含了与SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少70％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少70％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少75％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500，600，700，800，900，1000， 1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少75％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少80％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少80％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少85％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少85％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少90％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少90％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少95％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了与SEQ ID NO：4中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列具有至少95％同源性的核酸序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了SEQ ID NO：4中至少500个连续的核苷酸或其互补序列。在某些实施方案中，该分离的核酸包含了SEQ IDNO：4中至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1500，2000或2500个连续的核苷酸或其互补序列。在某个特定的实施方案中，该分离的核酸包含了SEQ ID NO：4的核苷酸或其互补序列。 

本发明的另一个方面还包括了能与上述各个序列杂交或互补结合的核酸分子。在特定的实施方案中，该核酸分子包含了能与纽激酶的完整编码序列或其中至少20，30，40，50，100，200个核苷酸或它们的反义序列互补结合的核苷酸序列。在某一特定实施方案中，该核酸分子能与纽激酶编码序列(比如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中部分或全部序列或它们的互补序列)在低严格性的条件下杂交。在某些实施方案中，该核酸分子对应SEQ ID NO：7中的序列。在某些实施方案中，该核酸分子对应SEQ ID NO：8中的序列，或其中的一部分。 

举例说明，但并非是为了对本发明有所限制，上述低严格性杂交的程序如下(参见Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：6789-6792)。含有DNA的滤膜在40℃条件下预处理6小时，预处理溶液包含35％甲酰胺，5×SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA以及500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。在杂交时该溶液作以下调整：0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(w/v)硫酸葡聚糖以及5-20×10⁶cpm³²P标记探针。滤膜在40℃杂交液中孵育18-20小时，之后在55℃条件下洗1.5小时， 洗液的成分包括2×SSC，25mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM EDTA以及0.1％SDS。更换一次洗液之后，在60℃条件下再洗1.5小时。将滤膜用吸水纸吸干后检测同位素的曝光。在需要时，滤膜可以在65-68℃条件下再洗第三次，然后重新曝光。其它用于低严格性杂交的条件是本技术领域的技术人员熟知的(比如用于种属间杂交的条件)。 

在另一个特定的实施方案中，该核酸分子可以与纽激酶编码序列或其互补序列在高严格性条件下杂交。举例说明，但并非是为了对本发明有所限制，上述高严格性杂交的程序如下。含有DNA的滤膜在65℃条件下预杂交8小时或过夜，预杂交液含有6×SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA以及500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交可以在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA和5-20×10⁶cpm ³²P标记探针的预杂交溶液中进行，杂交条件为65℃，48小时。之后将滤膜在37℃洗液中洗1小时，洗液中含有0.1×SSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll以及0.01％BSA。在50℃的0.1×SSC中再洗45分钟后可以进行放射自显影。其它用于高严格性杂交的条件是本技术领域的技术人员熟知的。 

5.3.1纽激酶基因或的克隆 

本发明还提供了与克隆纽激酶基因或cDNA相关的方法和组合物。在本发明的一个实施方案中，表达克隆的方法(本技术领域中广为人知的方法)被用于克隆纽激酶基因或cDNA。表达库的建立是本技术领域的技术人员熟练掌握的。在一个实施方案中，由分离到的mRNA(例如人的)逆转录的cDNA被连接到一个表达载体，该表达载体导入宿主细胞后可以表达该cDNA。表达的纽激酶的产物可以通过多种方法来筛选。在某一实施方案中，抗纽激酶的抗体被用于筛选表达的纽激酶产物。 

本发明的另一个实施方案中，聚合酶链反应(PCR)被用于从基因文库或cDNA文库中扩增所需的核酸片段。根据已知的纽激酶的序列设计的寡核苷酸片段可以作为PCR的引物。在某些实施方案中，该引物包含了SEQ ID NO：3或其互补序列中至少10个连续核苷酸。在某些实施方案中，该引物包含了SEQ ID NO：4或其互补序列中至少10个连续核苷酸。在某些实施方案中，该引物包含了SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该引物包含了SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。优选的，该引物包含了不同种属纽激酶编码基因中高度保守的序列中的一部分。合成的寡核苷酸片段可以作为引物，用于从RNA或DNA，尤其是cDNA文库中扩增所需序列。另外，也可以合成兼并引物用于PCR反应。 

在PCR反应中，用于扩增的核酸模板包括了来自任何真核物种的RNA或DNA，比如mRNA，cDNA或基因组DNA。Perkin-Elmer公司的Cetus thermal cycler 以及Taq聚合酶可以用来实施PCR反应。在PCR反应中，同样可以通过条件控制来决定引物和模板杂交的严格性，以此来扩增已知的纽激酶基因以及其它具有不同序列相似性的同源基因。对于物种间的杂交，低严格性的杂交条件是比较适用的。而同一物种的杂交，中等严格性的条件比较适用。一旦成功扩增了纽激酶同源基因的一个片段，那么该片段经过克隆，测序，可以作为分离完整cDNA或基因的探针。分离得到的完整的cDNA或基因，又可以用来分析该基因的核苷酸序列，基因的表达以及表达蛋白用于功能分析。通过这种方式，可以分离鉴定更多的编码纽激酶或其同源物的基因。 

上述列举的方法并非是对以下所描述的获得纽激酶或其同源编码基因的方法的限制。 

任何真核细胞都可以作为克隆纽激酶基因、cDNA或其同源物的潜在的核酸来源。编码纽激酶的核酸序列可以来自脊椎动物，哺乳动物，人，猪，牛，猫，鸟，马，犬以及其它灵长类的动物。DNA可以通过本技术领域中标准的程序从克隆的DNA(比如DNA文库)中获得，也可以通过化学合成法，cDNA克隆，基因组克隆，从目标细胞中分离以及PCR扩增和克隆获得。比如可以参照Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3d.ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)；Glover，D.M.(ed.)，DNACloning：A Practical Approach，2d.ed.，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.(1995)。从基因组DNA获得的DNA含有除编码序列之外的调控序列以及内含子。从cDNA获得的DNA则只包含外显子。不管来源如何，获得的基因需要克隆到一个合适的载体进行复制。 

当从基因组DNA中克隆基因时，首先是获得一些DNA的片段，其中的一些片段可能含有目的基因。可以通过多种限制性内切酶在特定的位点将DNA切成片段。或者可以使用DNase在锰离子存在的条件下将DNA片段化，或者DNA也可以通过物理的方式比如超声法将DNA片段化。进而，线性的DNA片段可以根据其大小通过标准的方法来分离，这种方法包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳以及色谱层析。 

一旦获得了DNA片段，可以通过一系列的方法来鉴定含有目的基因的DNA片段。比如，如果能够得到纽激酶的基因(任何种属)并能够将其纯化以及标记，那么上述得到的DNA片段可以通过与标记探针杂交的方法来筛选(Benton和Davis，Science 196：180(1977)；Grunstein和Hogness，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961(1975))。那些与杂交探针具有一定同源性的DNA片段可以被杂交。另外，基因组DNA用限制性内切酶酶切后通过与已知的酶切图谱比较，可以鉴定与目的基因大小相同的片段。 

或者还可以通过检测基因产物的物理、化学或免疫特性来鉴定目的基因的存在。比如cDNA克隆或DNA克隆所表达的蛋白具有与某一纽激酶蛋白相似或相同 的电泳迁移特性，等电聚焦特性，蛋白水解图谱，底物结合活性或者抗原特性。假如可以得到某一纽激酶蛋白的抗体，那么可以通过酶联免疫吸附试验来确定与标记的纽激酶抗体反应的克隆。 

纽激酶或其同源基因还可以通过mRNA选择的方法鉴定。在这个方法中，首先获得与这些DNA片段杂交的mRNA，通过体外翻译的方法得到其产物。通过免疫沉淀或者功能试验来筛选具有纽激酶相似或相同特性的产物并因此筛选到相应的mRNA和还有相应序列的DNA片段。同时，特定的mRNA还可以通过从表达细胞中分离的多核糖体与包被的纽激酶抗体结合试验来筛选。从筛选得到的mRNA可以合成放射性核素标记的纽激酶编码cDNA。放射性核素标记的mRNA或cDNA将可以作为探针去检测其它的DNA片段中是否含有纽激酶编码序列。 

其它的可用于分离纽激酶基因的方法包括但不限于从已知序列通过化学合成或从纽激酶的mRNA获得相应的cDNA。比如可以从表达纽激酶的细胞中分离RNA并因此得到纽激酶的cDNA。其它可能的方法也在本发明的范围之内。 

分离得到的纽激酶或纽激酶类似物的编码基因进而可以插入合适的克隆载体。大量的本技术领域中熟知的载体和宿主细胞系统可以使用。可选用的载体包括但不限于质粒或改良的病毒载体，同时该载体系统必须适用于所选的宿主细胞。相应的载体包括但不限于噬菌体比如λ噬菌体或质粒比如pBR322，pUC质粒及其衍生质粒或pBluescript载体(stratagene)。基因的插入可以通过将DNA片段与具有互补粘性末端的载体连接来完成。但是如果DNA片段的粘性末端并不存在于相应的载体上，那么该DNA片段的末端需要进行酶的修饰。或者，所需的位点可以通过结合一个连接序列来导入。这些连接序列可以包含化学合成的含有特定限制性酶切位点的寡核苷酸序列。或者，被酶切的载体以及DNA片段可以经过同聚物加尾的修饰。重组的载体可以通过转化，转染，感染，电穿孔等方法导入宿主细胞内，从而得到大量的该基因的拷贝。 

另外一种分离鉴定目的基因的方法，是被称为“鸟枪法”的测序方法。将基因组DNA片段化后插入合适的载体构建基因文库，随机挑选克隆进行测序并用计算机方法拼接。 

为了得到多个拷贝的纽激酶基因，cDNA或合成的DNA序列，可以将包含该基因序列的重组DNA分子转化合适的宿主细胞比如大肠杆菌的某种合适的菌株，这种过程可以通过本技术领域中所知的任何转化的方法来实现。因此，当宿主细胞生长后，将重组DNA分子从宿主细胞中分离，可以得到大量的目的基因，如果需要的话，可以再将插入的目的基因从重组DNA分子中分离。 

5.3.2表达载体 

本发明的另一个方面，是提供了用于所分离的纽激酶编码cDNA进行表达的表达载体。一般来讲，表达载体是一种重组的多核苷酸分子，其中包含了表达控 制序列并与需要表达的目的基因相连接。根据其包含的启动子、复制原件或选择标记等的不同，导致mRNA的稳定转录和翻译的差异，表达载体可以适用于真核细胞或原核细胞。构建表达载体以及在包含表达载体的细胞中表达目的基因的方法是本技术领域中广为人知的。比如可以参见Sambrook等人，2001，MolecularCloning-A Laboratory Manual，3^rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY，and Ausubel等人，eds.，Current Edition，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY. 

表达载体中所用的启动子包括但不限于一种金属硫蛋白启动子，一种组成性腺病毒主要晚期启动子，一种地塞米松诱导的MMTV(乳腺肿瘤病毒)启动子，一种SV40(猴空泡病毒40)启动子，一种MRPpol III(RNA聚合酶III)启动子，一种组成性MPSV(骨髓及外骨髓增殖性肉瘤病毒)启动子，一种RSV(呼吸道合胞病毒)启动子，一种四环素诱导的CMV(巨细胞病毒)启动子(比如人即刻早期CMV启动子)以及一种组成性CMV启动子。 

表达载体中需要含有与宿主细胞相适应的表达和复制信号。可以用于表达纽激酶基因的载体包括病毒载体比如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，质粒，柯斯载体等等。病毒和质粒载体比较适合转入哺乳动物细胞。比如表达载体pcDNAl(Invitrogen公司)，其表达控制序列中包含CMV启动子，可以在哺乳动物细胞中获得较高的转染和表达效率。 

表达载体可以通过本技术领域中可用的任一方法导入细胞中并表达纽激酶基因。这种方法包括但不限于细胞直接摄取DNA分子；脂质体转染辅助摄取比如脂质体或免疫脂质体；颗粒介导转染等等。可以参见美国专利No.5,272,065；Goeddel等，Methods in Enzymology，vol.185，Academic Press，Inc.，CA(1990)；Krieger，Gene Transfer and Expression-A Laboratory Manual，Stockton Press，NewYork(1990)；Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York(current edition)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3d.ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001). 

表达载体也可以包含一个纯化标签以方便纯化表达的蛋白。比如一个多组氨酸标签如6组氨酸可以结合到目的蛋白的氨基末端。多组氨酸的标签可以使得蛋白纯化十分简便，仅仅使用一步镍鳌合的亲和层析即可。在某些实施方案中，纯化标签可以在纯化后从目的蛋白上切除。在某些实施方案中，由于纯化标签不影响目的蛋白的功能因此没有必要切除。 

5.3.3细胞 

本发明的另一个方面是提供了含有表达载体，用于表达纽激酶或纽激酶的一部分的细胞。为了方便之后的蛋白纯化，表达量高的细胞将优先被选用。在某些实施方案中，这种细胞是原核细胞比如大肠杆菌。在一个优选的实施方案中，大肠杆菌中表达的纽激酶多肽具有正确的折叠和二硫键。 

在其它实施方案中，这种细胞是真核细胞。可用的真核细胞包括酵母和哺乳动物细胞。本技术领域中技术人员所知的任何可以用于表达重组蛋白的哺乳动物细胞均可以用于表达纽激酶。比如中国仓鼠(CHO)细胞可以用于纽激酶的表达。在某些实施方案中，纽激酶蛋白表达于新生大鼠心室肌细胞中。在某些实施方案中，纽激酶蛋白表达于H9c2(2-1)细胞。 

5.4抗体 

根据本发明，纽激酶多肽或其片段可以作为一个免疫原用于产生特异性结合纽激酶多肽的抗体。这种抗体包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，单链抗体，重组抗体，嵌合抗体，人源化抗体，哺乳动物或人的抗体。 

在某些实施方案中，制备了识别非人源纽激酶多肽的抗体。在某些实施方案中，制备了识别大鼠纽激酶多肽的抗体。在其它实施方案中，制备了识别人纽激酶多肽的抗体。在另一个实施方案中，制备了特异性识别具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白的抗体。在另一个实施方案中，制备了特异性识别具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的蛋白的抗体。在另一个实施方案中，制备了特异性识别具有SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的蛋白的抗体。在另一个实施方案中，制备了识别非人源纽激酶多肽的一个片段的抗体。在另一个实施方案中，制备了识别大鼠纽激酶多肽的一个片段的抗体。在另一个实施方案中，制备了识别人纽激酶多肽的一个片段的抗体。在一个特定的实施方案中，含有亲水性结构域的人源或非人源的纽激酶多肽片段被用来作为产生抗体的免疫原。在一个特定的实施方案中，亲水性分析可以用于分析鉴定纽激酶多肽中的亲水性结构域，并将其作为具有潜在表位的免疫原。 

多种宿主动物可以用来产生抗体，用于免疫的抗原可以是野生型的纽激酶，或者合成的纽激酶或纽激酶的片段。在某些实施方案中，该宿主动物是哺乳动物。在某些实施方案中，该哺乳动物是兔子，小鼠，大鼠，羊，牛或马。 

本技术领域中有多种方案可以用于制备抗纽激酶的多克隆抗体。在特定的实施方案中，制备了兔抗纽激酶的多抗，该多抗针对的纽激酶多肽是由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其片段编码的。鉴于宿主动物的不同，多种佐剂可以用于增强免疫应答。在本发明中可以使用的佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全或不完全)，矿物胶比如氢氧化铝，表面活性剂比如溶血卵磷脂，复合多元醇，聚阴离子，肽，油乳胶，血蓝蛋白，二硝基酚，富含CpG的核酸以及潜在的用于人的佐剂比如BCG(卡介苗)和小棒杆菌。 

任何用细胞连续培养的方法产生抗体的技术都可以用来制备抗纽激酶的单克隆抗体。比如可以用Kohler和Milstein所发明的杂交瘤技术(Nature 256：495-497(1975))，以及三源杂交瘤技术，人淋巴细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today4：72(1983))或者EBV-杂交瘤技术(Cole等，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))来制备单克隆抗体。 

美国专利NO.4,946,778中所描述的制备单链抗体的方法也可以用于制备抗纽激酶的单链抗体。为了快速简便地鉴定特异性识别纽激酶的单克隆抗体的Fab片段(抗原结合片段)，本发明的另一个实施方案采用了构建Fab表达库的技术(Huse et al.，Science 246：1275-1281(1988))。制备含有抗体分子独特型的抗体片段的技术在本技术领域内是已知的。这种片段包括但不限于：将抗体分子用胃蛋白酶消化得到的F(ab’)₂片段；还原F(ab’)₂片段中的二硫键而得到的Fab’片段；将抗体分子用木瓜蛋白酶消化得到的Fab片段以及Fv片段。 

用于制备嵌合型抗体的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855(1984)；Neuberger等，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等，Nature314：452-454(1985))也可以用于本发明。比如小鼠抗纽激酶单克隆抗体的编码序列与编码人抗体的核酸序列拼接而编码的抗体。 

另外，本发明中还包括了应用已有的制备人源化抗体的技术而制备的人源化的纽激酶抗体。人源化抗体的技术可以参见Queen，美国专利No.5,585,089和Winter，美国专利No.5,225,539。免疫球蛋白的轻链和重链的可变区分别包含了框架区(FR)以及其中插入的3个高变区，也称为互补决定区(CDRs)。框架区和互补决定区的位置已经被明确界定。参见Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Kabat，E.等，U.S.Department of Health and Human Services(1983)。简单地说，人源化抗体就是含有一个或多个来自非人源抗体的CDR区以及来自人源抗体的FR区的抗体。 

通过人的杂交瘤细胞技术(Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：2026-2030(1983))或体外用EBV转化人B细胞的技术(Cole等，in Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，pp.77-96(1985))制备的人的抗体同样可以使用。 

在抗体制备过程中，可以通过本技术领域中已知的技术来筛选所需要的抗体，比如ELISA(酶联免疫吸附试验)，RIA(放射性免疫测定)或RIBA(重组免疫印迹试验)。比如为了获得特异性识别纽激酶的某一特定区域的抗体，可以将所产生的杂交瘤用包含该特定区域的纽激酶片段来筛选。为了获得特异性识别纽激酶的某个同源物而不识别其它同源物的抗体，杂交瘤细胞的筛选原则是与该同源物阳性结合且与其它同源物不结合。 

本发明同样提供了针对纽激酶或其同源物的某个结构域的抗体。这些抗体可以用于与纽激酶的定位以及功能相关的试验，比如纽激酶的定位显示，在合适的生理样品中检测纽激酶的表达水平以及用于诊断方法等等。 

5.5纽激酶转基因动物 

利用转基因动物对于研究纽激酶的功能和活性很重要，同时它有助于鉴别和评价纽激酶的活性。在转基因动物中，转入基因可在一种或多种细胞或组织中表 达相应的基因产物。另有一些转基因可以阻止动物自身天然基因产物的表达(基因敲除动物)。还有一些转基因则体现为染色体整合、转位或重组的标志(如cre/loxP鼠) 

转基因动物通过将体外的核苷酸导入受精卵的雄性原核中，并置入假孕雌性动物(PFFA)体内发育。纽激酶基因可以被导入非人动物基因组。在某些实施方案中可用大鼠纽激酶基因序列(SEQ ID NO：3)。在某些实施方案中用人纽激酶序列(SEQ ID NO：4)。在某些实施方案中可用纽激酶同源的基因座位转基因。内含子和多聚腺苷酸可被加入转基因以增加表达量。组织特异性调节序列可加入转基因，以使其在特定细胞中表达。通过对动物胚胎(尤其是小鼠)微注射的方式得到转基因动物的技术已经成为常规的操作，如Evens等人，美国专利No.4,870,009(1994)；.Leder和Stewart，美国专利No.4,736,866，1998；Wagner和Hoppe，美国专利No.4,873,191(1989)。其它非小鼠转基因动物可以用同样的方法获得。用来传代产生新转基因动物的转基因始祖动物可以通过检测基因组中的转基因或相关组织/细胞中转基因mRNA来鉴别。纽激酶转基因动物可以同其它转基因动物杂合繁衍。 

同源重组动物需要将一个含有部分纽激酶基因，其余部分缺失、增加其它序列或被其它序列替代的载体导入动物，从而破坏纽激酶的表达。在某些实施方案中，该载体包含了新霉素表达框并以与纽激酶转录的相反方向插入从而破坏功能性的纽激酶基因表达。纽激酶可以是人基因(SEQ ID NO：10)，或其它纽激酶同源基因。基因敲除质粒可以通过同源重组破坏内源性纽激酶基因表达导致无纽激酶功能性蛋白表达。 

或者载体被设计成通过同源重组使内源纽激酶突变或改变，但编码功能蛋白(如改变上游调节区以改变内源纽激酶表达)。这类同源重组载体纽激酶序列在原基因5′-和3′两侧添加了核苷酸序列以便使胚胎干细胞的内源纽激酶得以与外源的纽激酶发生同源重组。增加的序列对于同源重组是必须的。如Thomas和Capecchi，Cell 51：503-512(1987)中提及的质粒两侧含有几千个碱基的DNA。 

将质粒导入胚胎干细胞(如通过电转的方式)，选择发生了外源纽激酶基因与内源纽激酶基因发生同源重组的细胞(Li et al.，Cell 69：915-926(1992))。 

将选好的细胞注入动物囊胚(如小鼠)以形成嵌合体(见Bradley，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，Oxford UniversityPress，Inc.，Oxford(1987))，该嵌合体可被植入合适的PFFA，在那里可以发育至分娩。生殖细胞中含有重组DNA的子代可以用来繁衍下代，这些通过转基因品系转移而得到的下代可以表现为所有细胞内均有同源重组的DNA。同源重组质粒和动物的构建已经被报道(Berns等，WO 93/04169，1993；Kucherlapati等，WO 91/01140，1991；Le Mouellic和Brullet，WO 90/11354，1990) 

转基因动物转基因表达调控体系已经建立。如噬菌体P2的cre/loxP重组酶系统(Lakso等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236(1992))，酿酒酵母FLP重 组酶系统(O′Gorman等，Science 251：1351-1355(1991))。在cre/loxP重组系统中调控基因的表达有赖于转基因动物同时表达有Cre重组酶和目标蛋白。这类动物可以通过两次转基因获得，或通过目标蛋白转基因动物和重组酶转基因动物杂交获得。 

转基因动物克隆获取(Wilmut等，Nature 385：810-813(1997))。从转基因动物中分离细胞并使其生长阻滞于G0期。此静止期的细胞可以与同种系动物无核卵母细胞融合。重构的卵母细胞发育成桑椹胚或胚囊并被置入PFFA。诞生的雌性子代动物就是转基因动物中的一个母代克隆。 

5.6筛选纽激酶活性调节因子 

本专利发明提供了从细胞或组织中鉴别可调节纽激酶活性的复合物的方法。化合物可以通过以下方式调节纽激酶活性，如(1)影响纽激酶基因的拷贝数(扩大因子或缩小因子)；(2)增加或减少纽激酶的转录(转录上调因子或下调因子)；(3)增加或减少纽激酶mRNA翻译为蛋白(翻译上调因子或下调因子)；(4)增加或减少纽激酶蛋白活性(激动剂或拮抗剂)。为了鉴别可以在DNA、RNA或蛋白水平调节纽激酶的复合物，将细胞或组织与候选复合物接触，并检测纽激酶DNA、RNA和蛋白的表达改变。DNA放大或缩小可以检测纽激酶DNA量。纽激酶mRNA检测可用于筛查充当转录上调因子或转录下调因子的复合物。筛查翻译上调因子和翻译下调因子可检测纽激酶蛋白。纽激酶生物活性改变可以用以下谈及的技术检测，该技术非直接地显示了复合物调控纽激酶翻译的能力。 

这里所指的纽激酶活性是指纽激酶生物活性，包括磷酸化心肌肌球蛋白轻链/其功能片段或其变体，钙调蛋白结合，自抑制等。细胞水平的磷酸化检测已被熟知，可以用于检测被选调节因子对纽激酶活性的影响。 

这里所述的方法可用于内源性表达纽激酶的细胞或组织，或瞬时转染/稳定转染纽激酶基因的细胞或组织。任何用于表达重组蛋白的现有技术可被没有限制的运用于表达纽激酶蛋白并运用于发明中所述检测方法。 

纽激酶活性调节复合物鉴定方法包括第一水平选择表达有纽激酶蛋白的细胞或组织并检测纽激酶活性，第二水平使细胞或组织与待测得复合物接触，然后检测纽激酶活性。两者的差异可以提示复合物对于纽激酶活性的调控。一种情况如果第二水平的纽激酶活性高于第一水平，复合物为激动活性。在某些情况下，激动活性包括第二水平比第一水平由2、4、6、8、10或更多倍数纽激酶活性的增高。另一种情况为第二水平的纽激酶活性低于第一水平，复合物为拮抗活性。在某些情况下，激动活性包括第二水平比第一水平由2、4、6、8、10或更多倍数纽激酶活性的下降。 

在另一实施方案中，发明提供了可以在表达有纽激酶蛋白的细胞或组织中鉴别调控纽激酶活性复合物的方法，包括将待测复合物与上述细胞或组织性接触并判断该细胞或组织纽激酶的活性。此水平的纽激酶活性与对应的基础水平(如未 与复合物接触的细胞或组织)，并作为评价复合物调节纽激酶活性的依据。在一个实施方案中，如果接触复合物后纽激酶活性比对照的更高，该复合物可能是激活剂。在某些情况下，激动活性至少是接触复合物后比对照组高2、4、6、8、10或更多倍。在另一实施方案中，如果接触复合物后纽激酶活性比对照的更低，该复合物可能是抑制剂。在某些情况下，抑制活性至少是接触复合物后比对照组低2、4、6、8、10或更多倍。 

本发明同样提供了鉴别可调控表达纽激酶的非人类的转基因动物中纽激酶蛋白活性的复合物的方法，此方法包括使所述动物摄入该复合物及评价复合物对动物心功能改变的影响。心功能可以通过测量室间隔尺寸、左室舒张末期容积(LVEDD)、后壁厚度、左室收缩末期容积(LVESD)、射血分数(EF)、缩短分数(FS)、心动周期来评价。在一个实施方案中，如果舒张末期容积在用药后LVEDD下降至少2％，5％，10％，15％，20％或更多，那么该复合物具有激动活性。在另一实施方案中，如果舒张末期容积在用药后EF上升至少2％，5％，10％，15％，20％或更多，那么该复合物具有激动活性。在另一实施方案中，如果舒张末期容积在用药后FS上升至少2％，5％，10％，15％，20％或更多，那么该复合物具有激动活性。 

本发明同样提供了鉴别可以特异性结合纽激酶核酸或蛋白的复合物的方法，这些复合物可能可以作为纽激酶的激活剂或抑制剂。在某些实施方案中，这些复合物可能影响心脏肥大、心室肌细胞肥大等。在一个优选的实施方案中，分析试验用来筛查具有潜在心衰治疗效应或可以用于药物开发的复合物。因此本发明提供了检测可以特异性结合纽激酶核酸或蛋白的复合物的方法。比如，表达有纽激酶核酸的重组细胞表达重组纽激酶蛋白后用于分析，筛查可以结合纽激酶多肽的复合物。复合物(如推测为纽激酶结合伙伴)在可结合条件下与纽激酶多肽或片段结合，并加以鉴别该复合物。类似的方法可用于鉴别与纽激酶核酸结合的复合物。上述试验涉及的技术是本技术领域中普遍知晓的。 

在一些实施方案中，无细胞情况下的纯化纽激酶蛋白也可以用来鉴别可以参与调控以下的复合物(1)磷酸化心肌肌球蛋白轻链和/或功能性片段或变异体等。(2)在无钙和钙调蛋白情况下调控纽激酶自抑制活性。肌球蛋白轻链检测的方法是已被熟知的，如Polak等，J.Neurosci.，11：534-54(1991)，Ausubel等，CurrentProtocols In Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York(current edition)，和美国专利No.5,906,810所述的，其整体内容均含有参考文献。潜在的纽激酶生物活性调节因子可以检测不同浓度的复合物作用下底物磷酸化水平的变化来鉴别。在一些实施方案中可以将肌球蛋白轻链作为底物。在一些实施方案中，底物可以是肌球蛋白轻链的片断。在一些实施方案中，底物可以是肌球蛋白轻链变异体。 

在某些实施方案中，纽激酶活性调节可通过检测钙调蛋白活性来测定如美国专利No.5,840,697，Sharma等，Adv.Cyclic Nucleotide Res.，10：187-89(1979)，和Wallace等，Methods Enzymol.，102：39-47(1983)所述，所有都在全文中包含了参考文 献。可以结合并抑制钙调蛋白活性的复合物同样可以抑制钙/钙调蛋白依赖的纽激酶活性。举例说明，在纽激酶活性潜在的调节因子存在或不存在的情况下检测钙调蛋白依赖的磷酸化。钙调蛋白活性通过其刺激磷酸化活性反映，可以用两步的检测方法，如下。 

第一步，3′5′-磷酸环磷腺苷(cAMP)与钙激活磷酸二酯酶(Cal-PDE)共孵育，水解3′的结合产生5′-单磷酸腺苷(5′-AMP)。第二步，5′-AMP在5-核苷酸酶作用下被大量转化为腺苷酸和无机磷(Pi)。接下来与钼酸胺作用并在660nm处测量Pi的吸光度。Pi的数量与磷酸二酯酶直接相关，而后者由钙调蛋白激活。 

在一些实施方案中，纽激酶调节复合物是蛋白，如抗体；核酸；或小分子。在此“小分子”是指有机或无机复合物(包括不同有机的和有机金属的复合物)分子量小于10000克每摩尔，有机或非有机复合物的分子量小于5000克每摩尔，有机或非有机复合物的分子量小于1000克每摩尔，有机或非有机复合物的分子量小于500克每摩尔，有机或非有机复合物的分子量小于100克每摩尔，盐、酯等其他药用可接受形式的复合物同样包括在内。 

举例来说，多种库如随机组合的蛋白库或非蛋白库可以用来筛选特异性结合纽激酶的分子。目前已有许多可用的库，如化学合成库、重组库(如噬菌体表达库)和体外翻译库。 

化学合成库在Fodor等，Science 251：767-773(1991)；Houghten等，Nature354：84-86(1991)；Lam等，Nature 354：82-84(1991)；Medynski，Bio/Technology12：709-710(1994)；Gallop等，J.Medicinal Chemistry 37(9)：1233-1251(1994)；Ohlmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：10922-10926(1993)；Erb等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：11422-11426(1994)；Houghten等，Biotechniques 13：412(1992)；Jayawickreme等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：1614-1618(1994)；Salmon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：11708-11712(1993)；PCT申请No.WO 93/20242；以及Brenner和Lerner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：5381-5383(1992)中有描述。 

噬菌体表达库在Science 249：386-390(1990)；Devlin等，Science，249：404-406(1990)；Christian，R.B.等，J.Mol.Biol.227：711-718(1992))；Lenstra，J.Immunol.Meth.152：149-157(1992)；Kay等，Gene 128：59-65(1993)；以及PCT申请No.WO94/18318，published August 18，1994中有描述。基于体外翻译的库包括但不限于那些在PCT申请No.WO 91/05058，published April 18，1991以及Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：9022-9026(1994)中描述的库。 

非蛋白库、苯二氮卓类库(见Bunin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：4708-4712(1994))、类胨库(Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：9367-9371 (1992))均可以利用。另一个可以利用的库，其特点是将蛋白中氨基化功能全甲基化以产生化学转变的组合库，该库在Ostresh等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：11138-11142(1994)中描述。 

库的筛查方法可以是众多不同的已知方法。见下述参考文献，展示了蛋白库的筛选：Parmley和Smith，Adv.Exp.Med.Biol.251：215-218(1989)；Scott和Smith，Science 249：386-390(1990)；Fowlkes等，Bio/Techniques 13：422-427(1992)；Oldenburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：5393-5397(1992)；Yu等，Cell76：933-945(1994)；Staudt等，Science 241：577-580(1988)；Bock等，Nature355：564-566(1992)；Tuerk等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：6988-6992(1992)；Ellington等，Nature 355：850-852(1992)；美国专利No.5,096,815，美国专利No.5,223,409，和美国专利No.5,198,346.；Rebar和Pabo，Science 263：671-673(1993)；以及PCT申请No.WO 94/18318，published August 8，1994. 

在某些实施方案中，可以将固定在固体界面上的纽激酶蛋白(或核酸)与库成员接触，通过收集结合在蛋白(核酸)上的库成员来筛查。如此筛查的方法叫做“淘选”技术，在Parmley和Smith，Gene 73：305-318(1988)；Fowlkes等，Bio/Techniques 13：422-427(1992)；PCT申请No.WO 94/18318和本文所引的参考文献中有描述。 

其他例子，如在酵母中利用双杂交系统筛选(Fields和Song，Nature340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：9578-9582(1991))，可以用来鉴定特异性结合纽激酶蛋白或其类似物的分子。 

在一些实施方案中，筛选可以在建立有肽库的原核或真核细胞中进行，此时库蛋白被表达在细胞的表面，与纽激酶接触后判断是否发生了结合。或者，在细胞中转染纽激酶编码基因，使纽激酶在细胞表面表达。再将细胞与潜在的激动剂或抑制及接触，看是否结合。在前面提到的实施方案中，潜在的激动剂或抑制剂被表达在相同的细胞或不同的细胞的表面。 

本专业领域中的普通技术人员可以清楚明白这里所述的鉴定可以调控纽激酶活性制剂、药物或复合物的实施方案，包括合理的药物设计以便形成更多的药物以筛选和检测，所有这些都在本发明中被预期。 

5.7诊断方法 

本发明也适合于预测性药物领域，即诊断和预后评估用于预测以达预防性治疗的目的。本发明涉及的诊断分析中包括测定生物样品中(如全血、血清、细胞、组织)纽激酶核酸表达及其活性，从而判断个体是否受疾病或异常所累，或发生某异常高危。此类的疾病或异常与纽激酶表达或活性异常相关，可能涉及到心功能异常等。在某些实施方案中，心功能异常为肥厚性心肌病。在某些实施方案中心功能异常为心衰。本发明同时提供了预后检验分析，用以判断个体是否为发生 与纽激酶核酸或表达异常相关疾病的高危人群。比如可以检测生物样品是否存在纽激酶突变。此类分析可用于预测并在纽激酶核酸表达或生物活性异常相关的紊乱出现前进行预防性治疗。 

5.7.1诊断分析 

一种方法是检测受试者生物样品或利用一种可以探测到纽激酶核酸(如mRNA、基因组DNA)的复合物或试剂与生物样品接触以检测纽激酶是否存在于样品。用于探测纽激酶mRNA、基因组DNA的试剂为标记的核苷酸探针，可以同纽激酶的mRNA、基因组DNA杂交。核苷酸序列可以是全长的纽激酶序列如SEQID NO：3或4，或它的部分。在一些实施方案中，该核苷酸为至少15、30、50、100、250、500个碱基长度的寡核苷酸，可以有效且特异与纽激酶mRNA、基因组DNA杂交。 

检测纽激酶多肽的试剂可以是结合纽激酶的抗体，尤其是带有检测标签的抗体。抗体可以是单抗或是多抗。完整的抗体或是抗体片断，如Fab片断。标记探针与抗体耦联(如物理连接)使之可测，或通过间接方法，利用与标记的第二个试剂相作用。非直接标记的例子包括利用荧光标记的二抗检测一抗，生物素末端标记的DNA探针用荧光标记的抗生物素蛋白检测。 

本发明中的检测方法可以用来检测体内或体外生物样品的纽激酶mRNA、基因组DNA和蛋白。如体外技术检测纽激酶mRNA的方法包括Northern杂交和原位杂交。体外技术检测纽激酶蛋白包括酶联免疫标记法(ELISA)，Western杂交，免疫共沉淀，免疫荧光。体外技术检测纽激酶DNA包括Southern杂交，荧光原位杂交(FISH)。另外，体内检测纽激酶的技术包括将标记的纽激酶抗体导入受试者体内。如用放射性标记抗体可以通过显影技术显示其在体内的存在位置。 

从受试者处获取的生物样品带有蛋白分子、mRNA分子和/或DNA分子。如血液。 

检测方法包含了从受试者处获得生物样品作为对照，并与复合物或试剂接触以检测纽激酶mRNA、基因组DNA，并与代测样品进行比较。 

5.7.2预后检测 

该诊断方法可被用于鉴定那些纽激酶表达或活性异常相关疾病患者，或高危人群。这类疾病或异常包括心功能异常，尤其是肥厚性心肌病和心衰等。本发明提供了一种通过检测受试者样本中纽激酶的核酸(mRNA、基因组DNA)鉴别纽激酶表达或活性异常相关疾病的方法。检测样品为从受试者身上获取的生物样品。比如，检测样品可以是生物液体(如血清)、细胞、组织。 

预后检测可被用来判断病人是否可用某种形式(如激动剂、抑制剂、蛋白模仿剂、蛋白、多肽、核酸、小分子、食物等)治疗与纽激酶表达或活性异常相关 的疾病和异常。该方法用来判断受否某受试者可被某试剂有效的治疗。本发明提供了用于判断某病人能否被某试剂治疗纽激酶表达或活性异常的疾病有效治疗的方法(如纽激酶核酸的表达可以作为病人是否可用纽激酶表达或活性异常的相关治疗试剂治疗)。 

本发明方法同样可用于检测纽激酶基因损伤，从而判断受试者是否是肥厚性心肌病或心衰等的高危人群。方法包括检测受试者样品中是否存基因受损，表现为纽激酶蛋白编码基因的完整性改变或表达错误。此类基因受损可以是：(1)纽激酶基因的单个或多个核酸缺失；(2)纽激酶多个或单个核酸增加；(3)纽激酶基因单个或多个核苷酸替换；(4)纽激酶基因染色体重组；(5)纽激酶mRNA转录异常；(6)纽激酶基因修饰异常，如基因组DNA甲基化异常；(7)纽激酶mRNA转录剪切形式的异常；(8)野生型纽激酶蛋白水平异常；(9)纽激酶等位基因缺失；和/或(10)纽激酶蛋白非正常的翻译后修饰。用于检测纽激酶损伤的技术方法有很多，可用于任何有核的生物样品。 

用于检测纽激酶基因异常的方法可以为任何已有的技术。例如可用核酸探针或引物于聚合酶联反应(PCR)如锚定PCR或cDNA末端快速放大(RACE)PCR。方法中涉及从病人获取样品并提取核酸，使纽激酶核酸与核酸引物特异杂交并放大该序列，然后检测放大后产物是否存在或是片断的大小并与对照样品比较。PCR预期用于初步放大并与检测突变技术联合应用。 

纽激酶基因突变可以通过检测限制性酶切图谱来分析鉴定。如分离样品和对照DNA，放大(可选)，用一种或多种限制性内切酶消化，用电泳的方式比对和判断片段的长度。样品片断与对照DNA的差异提示了样品DNA的突变。序列特异性核酶可以用来判断特异位点的突变或核酶剪切位点的缺失。 

样品或对照核酸的杂交，如DNA、RNA与带有成百上千可鉴定纽激酶基因突变的寡核苷酸探针杂交(可见Cronin等，Hum.Mutat.7：244-255(1996)；Kozal等，Nat.Med.2：753-759(1996))。如纽激酶基因突变可用上述Cronin等所述的二维DNA探针分析。简单说，第一步探针杂交分析可通过线性分析重叠探针序列来鉴定碱基变化。此步可用于点突变的检测。第二步杂交用特异的针对所有变异体和突变的探针来分析特异的突变点。每个突变分析都包含平行探针设置，一个与野生型基因配对另一个于突变型配对。 

目前多种已知测序方法可用于直接测定纽激酶基因并通过比对野生型基因来发现突变。测序反应包括基于那些经典技术的(见Maxam和Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci USA 74：560-564(1977)；Sanger等，Natl.Acad.Sci USA 74：5463-5367(1977))。任何自动测序程序可以用于现有发明的诊断分析(见Naeve等，Biotechniques 19：448-453(1995))，包括质谱测序(Cohen等，Adv.Chromatogr.36：127-162(1996)；Griffin和Griffin，Appl.Biochem.Biotechnol.38：147-159(1993)). 

其他用于点突变的检测方法还包括选择性寡核苷酸杂交，选择性放大，选择 性引物延伸等。如设计针对已知突变的引物并与目标DNA在只允许完全匹配才可杂交的条件下反应(见Saiki等，Nature 324：163-166(1986)；Saiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230-6234(1989))。此等位基因特异的寡核苷酸可以与PCR放大的目标DNA或不同突变体杂交。 

5.8组合物 

本发明提供了给受试者使用有效治疗药物治疗(和预防)的方法。通常来说，本治疗物为充分纯化的。对象为动物，包括牛、猪、马、鸡、猫、狗等，和其他哺乳动物，最常见的为人。在特殊情况下，非人的哺乳动物也可以是受试者。可用的使用方法可从以下所列中选择。 

许多已知导入系统可用于该发明的治疗运用。如用脂质体包裹，微粒，微胶囊，重组细胞以便适于表达治疗、受体介导的内吞效应(见Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))，构建作为腺病毒或其他载体一部分的治疗用核酸序列。导入方法包括皮内、肌肉内、腹腔内、皮下、鼻内、硬膜外和口服给药。化合物可通过简便的方法给药，如滴注或一次性注射，通过上皮和粘膜层吸收(如口腔粘膜，直肠和肠粘膜等)，同时可以与其他的生物活性制剂一起给药。给药可以是全身的也可以是局部的。另外，可以将本发明的治疗物通过合适的方法导入中枢神经系统，包括室内和鞘内给药。室内给药可以通过室内导管，如通过内池例如Ommaya囊脑室。肺部给药同样可以运用，如利用吸入器或者喷雾器，同时药物为可雾状散开的制剂。 

在一个特定的实施方案中，需要将本发明的治疗物用于需要治疗的部位。此种方式可以通过例如在手术时局部给药，局部运用如联合手术后的辅料，注射，或通过导管和栓剂，以及灌输。灌输可以是多孔的、无孔的或胶状材料，包括膜，如硅橡胶膜或纤维。 

在另外一个实施方案中，该治疗物用囊泡来传递，尤其是脂质体(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，in Liposomes in the Therapy of InfectiousDisease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.317-372，353-365(1989)). 

在另外一个实施方案中，该治疗物在一个可控制释放的体系中被传递。一种情况是利用泵(见Langer和Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))，另一种是利用聚合材料(见Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；对照药物生物利用度：药物设计和性能，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Pewas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；另见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。一种 可以是将控制释放系统放置在治疗靶标附近，如胸腺，这样只要系统剂量的部分即可(见Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。其他的可控释放系统在Langer的综述中有讨论(Science249：1527-1533(1990))。 

在一个特定的实施方案中，治疗物为编码蛋白(如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2)的核酸，核酸可通过构建在表达质粒中并导入细胞中来促进其编码蛋白的表达，如利用腺病毒载体(见美国专利No.4,980,286)或通过直接注射，或微孔轰击(如基因枪，Biolistic，DuPont)，或用脂质包被或细胞表面受体或转染试剂，或使其与可进入细胞核的蛋白连同运用(见Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：1864-1868(1991))。另外可选择用同源重组的方式将核酸导入细胞内与宿主细胞DNA相作用从而表达蛋白。 

本发明同样提供了治疗性的组合物。该组合物由有效的治疗剂组成，具有药用可接受的载体。水是常用的静脉用药载体。盐溶液、葡萄糖溶液、丙三醇溶液同样可以用作液态载体，尤其是可注射的溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸盐、甘油硬脂酸盐、云母、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其他。该组合物还可以添加少量的加湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些复合物可以形成溶液、悬液、乳剂、片剂、药丸、胶囊、粉剂、缓释剂等。该组合物可以是运用常见的载体如甘油三酸酯制成的栓剂。口服制剂可用标准的载体如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖盐、纤维素、碳酸镁等。合适的药用载体例子在Remington’sPharmaceutical Sciences by E.W.Martin中有描述。此类组合物含有纯化的具有治疗作用的药剂，同时含有合适的载体以提供用药时合适的形式。制剂的形式需适合于用药方式。 

在通常情况下，该组合物为适合于人类静脉给药的形式。尤其是消毒的等张性水溶缓冲液。需要的话，水溶液还可含有增溶剂、局部麻醉剂如利诺卡因等以缓解注射局部疼痛。通常情况下，在一个剂量中，各组分单独或混合，如冻干粉或置于防潮密封容器中如一次用量的针剂或小包装袋保证活性制剂的质量。当复合物作为滴注剂使用，它可以被溶解在贮有无菌级的水或盐溶液的瓶中。当复合物为注射使用，在注射前将溶剂在一次用量的注射水或盐溶液充分混合。 

治疗制剂可以为中性盐形式。药用可接受的盐包括无氨基的盐类，如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等；无羧基类如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、二乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。 

用于治疗某种异常的有效药物剂量取决于疾病本身，可以通过临床标准来判断。另外，体外实验结果可以被用来参考制定最佳剂量范围。精确的剂量取决于给药方式，并根据疾病的严重程度由医生判断病人的情况。静脉用药合适的剂量范围大约是20-500微克活性复合物每公斤体重。鼻腔给药的合适剂量通常为0.01 pg到1mg每公斤体重。有效剂量可根据体外实验或动物实验的剂量反应曲线来推测。 

栓剂通常含有0.5％到10％净重的活性成分；口服制剂则含有10％到95％活性成分。 

5.9试剂盒 

上述药用组合物可以包含于附有使用说明书的试剂盒或容器中。作为试剂盒应用，组合物的不同组分可能分别被包装在单独的容器中，在使用前才被混合。这种组分的单独包装可以长期保存而不损害组合物的活性。 

试剂盒包含了独立包装的不同试剂从而简化了检测步骤，如诊断检测和组织分型。例如纽激酶DNA模板和合适的引物可被作为内参。 

5.9.1容器或导管 

试剂盒中的试剂被保存在不同的容器中，从而保持不同组分的活性，并保证不被容器的材料所吸收或改变。如密封的玻璃小瓶可以保存在中性无反应气体如氮气条件下包装冻干的荧光素酶或缓冲液。小瓶可以是任何合适的材料，如玻璃、有机聚合物：聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶器、金属或其他材料。其他适合于做容器的包括由类似上述材料制成的简单的瓶、有箔片入铝或其他合金内衬的信封。其他容器还包括试管、小瓶、烧瓶、大瓶、鸣管等。容器需含有一个无菌通道，如可被皮下注射针头刺穿的瓶盖。其他容器可以含有由易于移除膜分隔的隔间，以便不同成分的混合，可移除膜可以是玻璃、塑料、橡皮等。 

5.9.2指导材料 

试剂盒备有指导材料。指导可被印刷在纸上或者其它材料上，和/或以可电子阅读的介质提供如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩盘、录音磁带等。具体的用法说明可以不置于试剂盒内，使用者可以通过访问生产厂家或供应商的互联网站参查，或通过电子邮件提供。 

5.10治疗方法 

本发明提出了预防和治疗与纽激酶表达或活性异常相关高危人群和疾病的方法。最明确的异常为心功能异常，包括充血性心衰、心肌梗死、心动过速、家族性心肌肥大、缺血性心脏病、先天性扩张性心肌病、心肌炎等。 

5.10.1疾病和异常 

与纽激酶量增多或生物活性加强相关的疾病或异常可以用拮抗剂(如降低或抑制)治疗。拮抗剂可用于治疗或预防。治疗包括：(1)纽激酶蛋白、同形物、衍生物，片段或同族物等；(2)纽激酶蛋白抗体；(3)纽激酶核酸；(4)使用反 义核酸和“无功能”核酸(同源插入至编码序列)，通过同源重组降低内源性纽激酶活性(Capecchi，Science 244：1288-1292(1989))；(5)调节子(抑制剂、激动剂、拮抗剂，包括仿制蛋白或纽激酶特异性抗体)从而影响纽激酶与受体结合。 

与纽激酶量减少或生物活性降低相关的疾病或异常可以通过增加(激动剂)其活性治疗。上调活性的药物可以用于治疗或预防。治疗物包括蛋白、类似物、衍生物，片段或同族物等；或是可增加生物活性的激动剂，如可以通过抑制自抑制区而增加纽激酶活性的激动剂。 

表达量的增加或减少可以容易地通过体外定量检测病人组织样品(如活检组织)的蛋白和RNA表达水平、结构或活性。检测方法包括免疫测定(如Western blot、免疫沉淀和SDS聚乙烯胶电泳、免疫组化等)或杂交实验检测mRNA表达(如Northern、电杂交、原位杂交等)。 

5.10.2疾病预防的方法 

本发明提供了通过使用可以调控纽激酶表达或改变其活性的制剂而预防与纽激酶表达或活性异常相关的疾病的方法。因纽激酶表达或活性异常而使患某种疾病高危的病人可以通过如综合诊断和预后分析来鉴别。预防用药可以在出现纽激酶异常相关疾病症状之前用药。在某实施方案中，预防性使用该制剂可以防止或延缓心室肌肥厚。根据纽激酶异常的种类，可以应用纽激酶激活剂或拮抗剂。合适的试剂可以通过筛查来决定。 

5.10.3治疗方法 

本发明的另一方面提供了通过调控纽激酶表达和活性以达到治疗目的的方法。发明中的调控方法包括将制剂与细胞接触，并调节纽激酶活性。可用来调控纽激酶活性的制剂可以使核酸或是蛋白、纽激酶天然的同源受体、多肽、纽激酶多肽类似物、适体或其他小分子。制剂可以刺激纽激酶活性。此类的刺激因子包括活性纽激酶和导入细胞的纽激酶核酸分子。刺激纽激酶的活性在纽激酶被下调的异常中被应用，在此类情况下增加纽激酶活性有有益的效果。 

在其他的实施方案中，纽激酶调控因子抑制纽激酶活性。抑制因子包括纽激酶抗体、抑制性核酸分子。如核酸分子可以是反义核苷酸、适体、抑制性或干扰RNA(如小抑制/干扰RNA)鉴定和制备此类核酸调节因子的方法是已知的。 

在一些实施方案中，RNA干扰(RNAi)(见Chuang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：4985(2000))可以用来抑制纽激酶编码基因的表达。RNA干扰(RNAi)片段，尤其是双链(ds)RNAi，可以用来使纽激酶功能丧失。用RNAi的相关方法使基因表达沉默已经在有机物，包括哺乳动物、线虫、果蝇、植物和人类中被熟知(见Fire等，Nature 391：806-811(1998)；Fire，Trends Genet.15：358-363(1999)；Sharp，Genes Dev.15：485-490(2001)；Hammond，等，Nature Rev.Genet.2：1110-1119 (2001)；Tuschl，Chem.Biochem.2：239-245(2001)；Hamilton et al.，Science286：950-952(1999)；Hammond等，Nature 404：293-296(2000)；Zamore等，Cell101：25-33(2000)；Bernstein等，Nature 409：363-366(2001)；Elbashir等，Genes Dev.15：188 200(2001)；Elbashir等，Nature 411：494-498(2001)；PCT申请No.WO01/29058以及PCT申请No.WO 99/32619)。双链RNA(dsRNA)表达构建在一个可复制载体中被导入宿主，可以为附加载体或是整合入基因组。通过选择合适的序列，表达dsDNA可以干扰内源性纽激酶mRNA累积。 

调控方法可以是体外的(如将细胞与制剂共培养)或是体内的(如受试者使用制剂)。因此，本发明提供了治疗纽激酶蛋白或基因表达或活性异常相关疾病的方法。在实施方案中此方法包括使用制剂(通过筛查鉴定的制剂)，或组合使用纽激酶活性或表达的制剂(上调或下调)。在另一实施方案中，此方法包括了使用纽激酶活核酸分子作为治疗纽激酶活性或表达异常疾病的方法。 

5.10.4治疗物生物活性的检测 

合适的体内外实验可以用来检测特定治疗物的效果以及用药是否适合于治疗受影响的组织。 

在许多特定的实施方案中，体外分析可采用与病人异常相关的细胞，以判断是否该治疗物对细胞有效。治疗过程中该治疗物的使用形式在人体实验前可在合适的动物模型中进行，包括大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。 

同样的，对于体内检测方法而言，在人体应用之前也需要用已知动物模型进行试验。在一个实施方案中，候选治疗物可在心肌肥大模型中检测体内有效性。体内判断肥大包括测量心血管参数如血压、心率、系统血管阻力、收缩性、心搏力、向心性或扩张性肥大，左室收缩压，左室平均压、左室舒张末压、心输出量、中风指数、组织学参数、心室大小壁厚度。动物模型可用于判断体内心肌细胞肥大的发展或抑制，包括压力负荷动物模型、右室功能异常鼠模型、转基因鼠模型、大鼠心梗后模型。评价人类心室肌细胞肥大是否存在、发展或抑制的医学方法是已知的，包括如测量收缩或舒张参数、估计心室重量和肺静脉血流。 

5.10.5发明之组合物的预防和治疗用途 

纽激酶核酸和蛋白对于治疗和预防众多不同的疾病上具有潜在的功效，这些疾病包括充血性心力衰竭、心肌梗死、不规则心动过速、家族性心肌肥大、缺血性心脏病、特发性扩张性心肌病、心肌炎等。 

举例来说，纽激酶编码cDNA可以用在基因治疗，蛋白也可能用于人体发挥作用。以上的举例并非是为了限制的目的，本发明所提供的组合物将可以作为治疗心衰病人的有效的药物。 

在需要检测纽激酶核酸或蛋白的存在或表达量的情况时，纽激酶核酸或片断 同样可以用于诊断用途。其它用途也可以是抗菌分子(一些蛋白被发现具有抗菌作用)。这些材料也可以用于制备特异性结合本发明中所提供的用于治疗和诊断的物质的抗体。 

6.实施例 

通过以下实施例对本发明举例说明，然而这些实施例并非是为了对本发明加以限制。 

6.1实施例1：心梗大鼠模型应用NRG治疗后左心室纽激酶的基因表达水平上调 

为了鉴定可能被NRG调控的基因，我们将NRG通过渗透泵持续给予心梗大鼠，并比较给药后大鼠和正常大鼠左心室基因表达情况。 

为了使透析泵携带NRG，我们将1mL灭菌蒸馏水和1mL0.9％的灭菌生理盐水连续注射到一小瓶NRG中(993.1单位，62.5微克)，用注射器吸取纽兰格林溶液，给注射器换一个钝的针头，将注射器中的气泡小心挤出。将泵竖直放置，再将针头径直插入到泵的顶部的小开口中，轻轻推动活塞将纽兰格林溶液加入到泵中，直到有液体从泵中过量流出。随后拿去针头，并将泵擦拭干净。将流速调制器的白色帽子取下，露出一段短的不锈的铁管，将铁管插入到一个5厘米长的PE60管子的一端，注射器针头插入到另一端，推动活塞将纽兰格林液体加入到流速控制器中直到它满了为止。接下来将流速控制器的长管插入到插入到泵中，直到它白色的边缘结合到泵上。将针从流速控制器上取出，将泵放入灭菌的0.9％的生理盐水中37℃过夜。 

为了安装渗透泵，将体重在200±20克范围内的Wistar雄大鼠(来自中国科学院上海动物中心)按照100mg/kg(药物/体重)的比例腹腔注射克他命麻醉剂麻醉。将大鼠颈部和肩部之间的区域褪毛并消毒，小心的在肩胛骨间的皮肤上切开一个切口，定位并分开外面的颈动脉，将从心脏的动脉远端结扎，用眼科剪刀在外面的颈动脉表皮上扎一个洞，并用微镊子扩大，通过这个洞，将连接着透析泵的PE60管向血管中插入2cm。心脏方向的血管近端被附着在PE60管子上以固定，再将环绕在PE60管的血管远端绑得更紧以进一步固定管子。用止血法，生硬的将切口和肩胛骨之间弄出一条管道，最终通过扩展皮肤在大鼠背上肩胛骨之间区域做成一个口袋。将流速调制器和渗透泵通过之前的管道塞入到口袋中，从而远离切口，最后将切口缝合。大鼠苏醒过来后放回动物房中饲养如初。 

在心梗大鼠通过渗透泵用NRG处理7天后，解剖大鼠取其左心室送给Affymetrix公司做表达谱分析。将大鼠左心室匀浆，从匀浆中抽提总的mRNA。mRNA样本用Affymetrix大鼠表达芯片2302.0分析，基因的mRNA水平检测通过芯片完成。计算得出的与肌球蛋白轻链激酶有关的蛋白的mRNA水平陈列在表 1中，每一个数据点代表3只大鼠的平均表达水平。 

表1编码肌球蛋白轻链激酶有关的蛋白的mRNA相对表达水平，来自NRG处理的大鼠左心室 

探针系列编号	正常大鼠对照   组	MI大鼠对照   组	NRG处理的   MI大鼠组	基因
					1371541	0.921±0.085	0.951±0.125	1.147±0.165	MLCK(预测)
1376789	0.997±0.066	0.679±0.098	1.696±0.189	与MLCK2相  似，骨骼/心肌  (预测)
					1382239	0.886±0.218	0.591±0.246	1.721±0.339	与MLCK2相  似，骨骼/心肌  (预测)
1384818	0.908±0.296	0.598±0.227	0.335±0.162	MLCK(预测)
					1386200	0.969±0.274	0.717±0.104	0.946±0.098	与MLCK2相  似，骨骼/心肌  (预测)
1398820	0.942±0.185	1.115±0.101	0.592±0.195	MLCK2，骨骼肌
					1398821	0.700±0.254	1.287±0.375	0.738±0.217	MLCK，骨骼肌

对于能和探针组1376789和1382239杂合的mRNA序列，在纽兰格林处理的心梗大鼠中，与对照组相比它们的表达至少增加了2倍，这些结果表明，在心梗大鼠左心室中，NRG能显著增强与探针组1376789和1382239结合的mRNA表达水平。此外，与探针组1376789和1382239结合的mRNA很可能编码NRG下游调控的蛋白。 

6.2实施例2：从大鼠左心室RNA中克隆纽激酶cDNA 

我们从正常大鼠左心室中抽提总RNA，将RNA引物序列GACTCGAGTCGACGATTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：5)和AMV逆转录酶(Promega)加入到Promega逆转录系统中(目录号#A3500)，根据使用说明书完成逆转录操作。反应后将整个反应混合物，反向引物 GACTCGAGTCGACGATTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：5)和正向引物(ATGTCAGGAGTTTCAGAGGA(SEQ ID NO：6))(基于肌球蛋白轻链激酶2所预测的相似性)加入到PCR反应体系混合物中(Sinobio)，通过PCR反应扩大cDNA产物。PCR完成后，将反应产物电泳纯化，随后连接到pUCm-T质粒上(Promega)。质粒用以上的两个引物序列(SEQ ID NO：5和6)测序。我们把cDNA序列显示为SEQ ID NO：3，而将相应的蛋白质氨基酸序列显示为SEQ ID NO：1，这个蛋白被命名为纽激酶(neukinase)。同时，纽激酶的cDNA序列还可以通过与探针组1382239(SEQ ID NO：9)和1376789(SEQ ID NO：10)结合的序列比对加以验证(实施例1中有述)。这三个序列同大鼠基因组的比对显示，SEQ ID NO：9的5’端的325bp序列与纽激酶基因的3’端重合，而SEQ ID NO：10的5’端序列与SEQID NO：9的3’端序列重合。 

6.3实施例3：纽激酶基因在大鼠心脏中的特异表达 

使用纽激酶cDNA作为模版，我们用PCR方法合成了纽激酶基因片段(SEQID NO：8)，正向引物序列为(ATGTCAGGAGTTTCAGAGGA(SEQ ID NO：6))，反向引物序列为(CTTGAATTCTCACAGTGACGTATCGATGAT(SEQ ID NO：7))。这一片段(SEQ ID NO：8)随后纯化并用作模版合成放射性标记的纽激酶cDNA探针。我们把纽激酶cDNA探针和[α-³²P]dCTP加入到Promega’s Prime-a 标记系统(含有DNA聚合酶I大的片段和随机的六聚脱氧核苷酸)以合成标记的探针。我们将反应产物加入到 S-400离心柱(Promega)中，离心后收集长度大于270bp的探针。这些探针被用于Clontech大鼠MTN^TM的Northern Blot分析，包括从各种大鼠器官(心、脑、脾脏、肺、肝脏、骨骼肌、肾和睾丸)中抽取的多聚腺嘌呤RNA。图1显示纽激酶特异性探针只与来自心脏组织的长度约为4.4kb的一段mRNA杂交，这表明纽激酶基因是一个只在心脏特异表达的基因。样品使用了β-actin特异性探针(Clontech)作为上样对照。 

6.4实施例4：从人左心室RNA中克隆人纽激酶cDNA 

首先从人的左心室组织中抽提总的RNA，随后将RNA和寡聚脱氧胸腺嘧啶引物(TTTTTTTTTTTTTTT))及AMV逆转录酶(Promega)加入到Promega逆转录系统中进行逆转录反应。反应完成后，将一定量的反应产物、正向引物(GACACCACCGCCTGAGTGAGAAC SEQ ID NO：11))和反向引物(CCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA(SEQ ID NO：12))加入到PCR反应体系中(Sinobio)，通过PCR反应放大目标cDNA。反应完成后将产物电泳纯化并连接到pUCm-T质粒上(Promega)并测序。人的纽激酶cDNA序列显示在SEQ ID NO：4中，推测的翻译起始位点位于SEQ ID NO：4的第139或211位，这两个cDNA转录后分别得到长为795个(SEQ ID NO：2)和819个(SEQ ID NO：25)的多肽 

6.5实施例5：人纽激酶抗体的制备 

我们首先获得了来源于兔的针对人的纽激酶-GST融合蛋白的多克隆抗体。我们把人纽激酶cDNA，正向引物(CGCGGATCCATGGACACAAAGCTGAACATG(SEQ ID NO：13))和反向序列(CCTTAAGTCACGTGGCCCCCACCAAAGCGAT(SEQ ID NO：14))加入到PCR反应体系(Sinobio)中，反应完成后通过电泳纯化混合物。将纯化的DNA和pGEX-2T质粒(GE healthcare)用BamH I和EcoR I酶分别酶切，然后进行连接。人纽激酶片断的cDNA序列为SEQ ID NO：15，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：16。 

我们将含有纽激酶片段cDNA的连接体转化到BL21细胞中，随后在培养基中加入IPTG诱导细胞高表达纽激酶片段。离心收集细胞，然后超声破碎。将超声破碎的细胞悬浮物进一步离心，使包涵体沉淀。除去上清，加入浓度为8M的尿素以分解包涵体。将纽激酶片段溶液透析以除去尿素，同时使片段复性。接下来将纽激酶片段通过GST亲和柱纯化，皮下注射到兔子体内产生抗体。两周后吸取兔血清，纯化抗体。 

6.6实施例6：纽激酶在人心脏组织中的特异表达 

将人的大肠、肝脏、心脏、骨骼肌、肺、肾、子宫、脾和甲状腺组织匀浆后，用裂解缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，5mM EDTA，50mM NaF，2mM Sodium Vanadate，2mM PMSF，cocktail protease inhibitor(Roche，1piece for 25ml))裂解。将裂解后的蛋白样品进行SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上用于western blot分析。纽激酶蛋白在人体不同组织中的表达用实施例5中得到的抗体进行检测。PVDF膜用GAPDH特异性抗体检测作为上样对照。如图2中所示，纽激酶只在人体心脏组织中表达。这一结果是对实施例3中纽激酶mRNA在大鼠心脏组织中的特异性表达的一个补充，也更进一步证明纽激酶的表达具有心脏组织特异性。 

6.7实施例7：人纽激酶活性具有钙离子和钙调蛋白依赖性 

人调节性肌蛋白轻链的表达和纯化

我们从人左心室组织中抽提总RNA，将RNA和正向引物(GGGAATTCCATATGGCACCTAAGAAAGCAAAGAA(SEQ ID NO：17))，和反向引物(CCGCTCGAGGTCCTTCTCTTCTCCGTGGGTG(SEQ ID NO：18))，以及AMV逆转录酶加入到Promega逆转录体系中进行逆转录。反应后，双链cDNA连接到pet22b质粒上，将连接得到的结构体转化到BL21细胞，加入IPTG以诱导加有组蛋白标签的调节性肌蛋白轻链。得到的细胞超声破碎后离心沉淀，得到包涵体， 接下来将包涵体用8M尿素分解，进一步离心分离收集得到。变性的组蛋白标签调节性肌蛋白轻链用镍柱纯化，然后通过透析除去尿素复性。调节性肌蛋白轻链相应的蛋白质序列为SEQ ID NO：19。 

纽激酶的重组表达与纯化 

将纽激酶cDNA，正向引物(CATCATCTGGTTCCGCGTGGATCTATGTCAGGAA CCTCCAAGGAGAGT(SEQID NO：20))，反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGC AGAGTTGAAG(SEQ IDNO：21))和Pfu 

DNA聚合酶(Stratagene)加入到PCR反应体系中进行PCR反应，经过一定次数的循环扩大后，将一定量的反应混合物，新的正向引物(CGGGATCCATGCATCATCATCATCATCATCTGGTTCCGCGT(SEQ ID NO：22))，反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAG(SEQ ID NO：21)以及 

DNA聚合酶(Stratagene)加入到PCR反应体系中进行更多的循环扩增。混合体系中的DNA通过电泳分离，纯化得到编码纽激酶的目标DNA后将其与pcDNA3质粒连接，连接产物转化到DH5α细胞中扩增和测序。将含有正确结构的克隆通过大规模培养放大，使用Qiagen质粒抽提试剂盒抽提含有纽激酶cDNA的质粒。将纯化得到的质粒用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)转染试剂盒转染到COS7细胞。转染完成后几小时内换新的培养基，细胞在37℃.温度下继续培养48小时。将细胞收集后用裂解液(50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，5mM EDTA，50mM NaF，2mM Sodium Vanadate，2mM PMSF，cocktail proteaseinhibitor(Roche，1tablet for 25ml lysis buffer))裂解。12000g离心20分钟后收集上清，并将沉淀重悬，然后用0.45μm滤膜(Millipore)过滤。将得到的蛋白与组蛋白标签抗体(Beyotime)和50％Protein A Sepharose 4Fast Flow在裂解液中混合，冰上轻摇孵育3小时，然后将混合物在12000g离心20秒，除去上清，然后将沉淀用裂解液洗涤三次。最后一次洗涤后，将珠子重悬到1mL反应缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，60mM KCl)中，混合后冰上孵育5分钟。离心除去上清后，再加入300μl反应缓冲液。 

纽激酶引起调节性肌蛋白轻链蛋白发生钙离子和钙调蛋白依赖型磷酸化反应

我们用纯化的纽激酶蛋白、调节性肌蛋白轻链蛋白和钙调蛋白(Calbiochem)进行体外磷酸化实验，以检测纽激酶引起的调节性肌蛋白轻链蛋白的磷酸化反应是否具有钙离子和钙调蛋白依赖性。纽激酶活性检测是在体外完成，两组样品中分别加入和不加钙离子和钙调蛋白，通过western blot检测到的磷酸化RLC含量来反映RLC磷酸化程度。三组实验同时进行。在实验1中，反应混合物包括纽激酶，ATP，RLC，Ca²⁺，CaM。在实验2中，反应混合物包括纽激酶，ATP，RLC，CaM，但不含有Ca²⁺，同时在反应缓冲液中加入EGTA以鳌合Ca²⁺；实验3中，反应混 合物包括纽激酶，ATP，RLC，Ca²⁺，但不含有CaM。在反应体系中所加各物质浓度为2mMATP，2.5μM RLC，0.3μM Ca²⁺，1μM CaM，加入或不加2mM EGTA.。磷酸化反应在室温下轻摇振荡进行2小时。反应完成后，各取20μl反应物，加入到聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上进行western blot分析。我们用RLC-P抗体来检测RLC磷酸化情况，结果如图3所示。 

在钙离子和钙调蛋白存在的情况下，纽激酶与RLC结合，引起RLC的高度磷酸化(泳道1)。与之对比，在钙离子被加入的EGTA鳌合而几乎没有的时候，RLC磷酸化几乎检测不到(泳道2)，类似的是，在没有加入钙调蛋白时，RLC磷酸化也检测不到(泳道3)。综合起来，这些结果说明，纽激酶诱导的RLC磷酸化高度依赖钙离子和钙调蛋白，因此，我们可以认为纽激酶诱导的RLC磷酸化是以以下方式进行的： 

在上述公式中，CaM代表钙调蛋白，RLC代表调节性肌蛋白轻链蛋白，而RLC-P代表磷酸化的调节性肌蛋白轻链蛋白。 

6.8实施例8：昆虫细胞中表达的人纽激酶蛋白的活性 

含有人纽激酶cDNA的病毒质粒的准备

我们把在实施例7中获得的pcDNA3/纽激酶质粒DNA用BamH I和EcoR I酶切。消化产物用电泳分离，通过电泳纯化得到人纽激酶cDNA片段，随后连接到用BamH I和EcoR I酶切过的pFastBac质粒上。我们将连接产物转化到DH5α活细胞，铺板，培养过夜，将过夜培养的克隆中提取得到的少量的DNA送Invitrogen测序，以确定纽激酶的阳性克隆。pFast/纽激酶质粒中含有正确的纽激酶cDNA序列，将含有该质粒的克隆进一步放大，使用Qiagen的质粒抽提试剂盒纯化质粒DNA。随后将pFast/纽激酶质粒转化到DH10Bac细胞中，然后将细胞接种到含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，200μg/ml X-gal和40μg/mlIPTG的琼脂糖胶上，37℃培育48小时。我们从中挑选了一个白色克隆，将其再次接种到一块新的含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，200μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG的琼脂糖胶上，37℃过夜。从中挑出一个白色克隆，将其再次接种到含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，200μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG的液体培养基中，37℃轻摇过夜。取6mL液体培养物，14000g离心1分钟。除去上清，加入1.2mL溶液1(15mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，100μg/ml RNase A)重悬，之后加入1.2mL溶液2(0.2N NaOH，1％SDS)，室温轻摇混匀5分钟，在摇动时缓慢加入1.2mL 3M，pH5.5的醋酸钾，冰上孵育6分钟，然后14000g离心15分钟。小心除去上清而不吸到沉淀，加入 2mL70％乙醇然后上下翻动管子几次，14000g离心5分钟。将管子打开，在室温下放置5到10分钟，以除去残留的上清，最后加入40μl pH8.0的TE缓冲液，以溶解纯化得到的Bacmid DNA 

将纯化的Bacmid DNA，正向引物(GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO：23))和反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA(SEQ ID NO：24))加入到PCR反应体系中(Sinobio)进行PCR扩增，然后将产物电泳分析以检测阳性克隆。 

人纽激酶的表达和纯化 

将5.4×10⁶个sf9昆虫细胞接种到10cm培养皿中，用Grace’s昆虫细胞培养基(Invitrogen)培养，室温放置1小时。在这段时间内，将24μg含有纽激酶cDNA的病毒质粒(Bacmid/纽激酶)加入到1.5mL Grace’s培养基(不含抗生素和胎牛血清)中混合。同时，取60μl lipofectamine^TM 2000，在室温下孵育20分钟，然后加入2mL Grace’s培养基(不含抗生素和胎牛血清)，再将混合物加入到sf9昆虫细胞中。孵育5小时后，在27℃时除去培养基，然后加入10mL新的Grace’s培养基(含有100U链霉素、100U氨苄青霉素及10％胎牛血清)。27℃培养72小时后，收集培养液，500g转速离心5分钟，将含有病毒的上清短期保存在4度冰箱暗格中，或者在-80℃长期保存。 

将含有病毒的溶液加入到可以贴壁生长的sf9细胞培养基中孵育1小时，然后在27℃培养72小时，收集培养液，将其中少量加入到一个100mL装有悬浮状态的Sf9细胞的培养瓶中(2×10⁶cells/ml)，将悬浮物在27℃、以130rpm的速度振摇培养84小时。孵育后，收集细胞悬浮物，以1000rpm的速度离心10分钟。除去上清，加入裂解缓冲液(成分为50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，5mM EDTA，50mM NaF，2mM Sodium Vanadate，2mM PMSF，cocktail蛋白酶抑制剂(Roche，1piece for 25ml))，超声处理后，以12000rpm的速度离心20分钟。然后将上清过滤，加入到镍柱(Ni琼脂糖高性能柱，GE)，以纯化人纽激酶。将蛋白溶液加入到凝胶层析柱(HiTrap脱盐柱)中进一步纯化蛋白，用含有50mMTris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.5mM EDTA，0.02％Triton X-100，2mM DTT，20％glycerol的溶液从柱上洗脱蛋白，将人纽激酶蛋白溶液定量后保存到-80℃。 

人纽激酶活性检测 

下面提供了一种可重复的体外检测纽激酶蛋白活性的方法。纽激酶介导的RLC磷酸化过程包括以下反应和反应产物： 

在上述公式中，PEP代表磷酸烯醇式丙酮酸；PK代表丙酮酸激酶；β-NADH代表β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原态)；LDH代表L-乳酸脱氢酶；β-NAD代表β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化态) 

因此，我们可以通过检测NADH在340nm处的光吸收值的减少量来检测纽激酶活性，NADH在340nm处的光吸收值与纽激酶引起的稳定状态的ATP水解比率成正比。这一反应亦可用来检测对纽激酶活性有加强或抑制效果的物质。在这一反应中，一个800μl的反应体系包括：20mM Tris，pH 7.5，60mM KCl，1mM DTT，3.75mM MgCl2，1mM ATP，0.3μM CaCl2，1.5mM PEP，20U/ml PK，20U/ml LDH，90μM RLC，250μM β-NADH，1μM CaM and 100nM纽激酶，ΔOD/min/nmolneukinase＝0.0152/min/nmol neukinase。 

所有在这份说明书中提及的出版物、专利和专利申请都以参考文献的形式被引入。为了更清楚地描述和理解本发明，我们通过图示和举例的方式详细描述了本发明，但显而易见的是，本技术领域中普通技术人员可以在不背离权利要求的精神和范围的前提下，对本发明做出适当的改变或修改。 

Claims (35)

1.编码多肽的核酸，该多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。

2.权利要求1中的核酸，其中核酸是SEQ ID NO：3所示核酸序列或其互补序列。

3.SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽，其中多肽可磷酸化肌球蛋白轻链。

4.权利要求3中的多肽，其中多肽可磷酸化心脏肌球蛋白的轻链。

5.权利要求3中的多肽，其中多肽可磷酸化哺乳动物心脏肌球蛋白的轻链。

6.权利要求3中的多肽，其中多肽可磷酸化大鼠心脏肌球蛋白的轻链。

7.权利要求3中的多肽，其中多肽可磷酸化小鼠心脏肌球蛋白的轻链。

8.权利要求3中的多肽，其中多肽可磷酸化人心脏肌球蛋白的轻链。

9.包含权利要求1中核酸的载体，其中核酸编码的多肽可磷酸化肌球蛋白轻链。

10.权利要求9中的载体，其中载体包含SEQ ID NO：3所示的核酸序列。

11.权利要求9中的载体，其中核酸与转录调控序列连接。

12.权利要求9中的载体，其中所述载体选自质粒，粘粒，病毒和噬菌体。

13.权利要求9中的载体，其中所述载体转染入细胞表达包含SEQ ID NO：1的多肽。

14.包含了权利要求1中的核酸的宿主细胞。

15.包含了权利要求9中的载体的宿主细胞。

16.权利要求14中的宿主细胞，其中宿主细胞是H9C2(2-1)。

17.权利要求14中的宿主细胞，其中宿主细胞是新生大鼠心室肌细胞。

18.权利要求15中的宿主细胞，其中宿主细胞是H9C2(2-1)。

19.权利要求15中的宿主细胞，其中宿主细胞是新生大鼠心室肌细胞。

20.与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽专一性结合的抗体。

21.权利要求20中的抗体，其中抗体是多克隆的。

22.权利要求20中的抗体，其中抗体是单克隆的。

23.权利要求20中的抗体，其中抗体是单链单克隆的。

24.权利要求20中的抗体，其中抗体是重组的。

25.权利要求20中的抗体，其中抗体是嵌合的。

26.权利要求20中的抗体，其中抗体是人源化的。

27.权利要求20中的抗体，其中抗体是哺乳动物的。

28.权利要求20中的抗体，其中抗体是人的。

29.筛选影响纽激酶活性的物质的方法，包括：a)用所述物质接触表达纽激酶多肽的细胞；b)检测细胞中纽激酶的生物学活性，其中生物学活性选自自抑制，心脏肌球蛋白轻链的磷酸化和纽激酶的表达；其中所述纽激酶是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。

30.筛选影响纽激酶活性的物质的方法，包含：a)给表达编码纽激酶多肽的核酸的非人转基因动物施用所述物质；b)检测由所述物质引起的动物心功能改变；其中所述纽激酶是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。

31.权利要求30中的方法，其中心功能选自室间隔大小，左室舒张末期直径，室后壁厚度，左室收缩末期直径，射血分数，缩短分数和心动周期。

32.包含氨基酸序列为SEQ ID NO：1的多肽和药学中可接受的载体的组合物。

33.包含编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸和药学中可接受的载体的组合物。

34.权利要求33中的组合物，其中多核苷酸是SEQ IDNO：3的核苷序列。

35.在宿主细胞中产生纽激酶多肽的方法，包括：i)用编码纽激酶多肽的核酸序列转染宿主细胞；和ii)表达该核酸序列也就使宿主细胞产生纽激酶多肽；其中所述纽激酶是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。

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