JPH0515367A - 酵素及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ラットコリンキナーゼ（ＣＫ）の各種分野で
の利用を可能とするためのＣＫ遺伝子のクローニング、
該遺伝子を用いた遺伝子組換え技術によるＣＫの大腸菌
等での生産及び生産されたＣＫの各種疾患の診断、治療
ための利用についての技術を提供する。 【構成】 ラット肝臓からｃＤＮＡライブラリーを調製
し、抗ＣＫ抗体を用いた第１のスクリーニング過程及び
活性誘導による第２のスクリーニング過程を通してＣＫ
をコードする遺伝子を単離した。更に、得られたＣＫ遺
伝子をベクターに組み込んで大腸菌で発現させ、各種用
途に用いた。また、数種のＣＫアイソザイムが確認さ
れ、それらの遺伝子もクローニングして大腸菌で発現さ
せた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリンキナーゼ（EC2.
7.1.32、以下ＣＫと略記する）及びＣＫの遺伝子に関す
るものである。より詳しくは、ラット、ヒト等の動物及
び植物のＣＫ、これらＣＫの分離、精製方法、ＣＫに対
する抗体の調製方法、ＣＫ遺伝子、ＣＫ遺伝子のクロー
ニング方法、ＣＫ遺伝子の各種宿主での発現方法、及び
遺伝子工学的に発現されたＣＫの利用方法に関する。更
に、本発明は神経、循環器、消化器、代謝系、癌等の各
種疾患の診断及び治療に有効な方法、及び動物性、植物
性の生体リン脂質類の生産に有用な技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】コリンの生体内で必要な量の一部は、生
体内で作られるが、そのほとんどは食物から必須に摂取
されており、腸管から吸収されたコリンは門脈を経由し
て肝臓に達し、ここで回収される。生体内におけるコリ
ンの代表的な代謝経路は次式に示されるようなホスファ
チジルコリンの合成経路である。

【０００３】

【化１】 ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリンなどはリン脂質とよばれ、生
体膜の主要成分をなす重要な物質である。上述のように
ＣＫは、ホスファチジルコリンの生合成の第１番目の調
節酵素である。このように、肝臓で回収されたコリン
は、分解されるか、肝細胞リン脂質及び血中リポタンパ
ク質中のホスファチジルコリンに変換される。

【０００４】生体中のＣＫの活性は、細胞増殖因子やホ
ルモン（インスリン、エストロジェン等）による刺激に
応じて、あるいは生体の発生から分化、成長における時
期によって増強あるいは変化し、また、栄養失調時（ラ
ットなどの必須脂肪酸欠乏時）、腎臓の代償性肥大時
（２つある腎臓のうち１つを摘出すると、腎臓は生体か
らの負荷をこなすため肥大する）などの種々の状況にお
いても増強あるいは変化することが知られている。神経
系組織では、その細胞が神経系として特別な機能を果す
ために、その生体膜系が非常に発達しており、神経系組
織の増殖、分化に対応してＣＫ活性は増大するなど、Ｃ
Ｋはホスファチジルコリン合成、ひいては神経系細胞の
機能維持のために重要な役割を担っている。また、神経
軸索が損傷するとＣＫ活性が増大することが知られてい
るが、その意味は未だ不明である。更に、神経系細胞に
コリンを加えると、細胞内に取り込まれた後、神経伝達
物質のアセチルコリンの合成には使われず、ホスホリル
コリンになってしまう。このことから、ＣＫが、基質と
してのコリンをコリン：アセチル転移酵素と競合するこ
とによって、アセチルコリン生合成を調節する機能を有
している可能性も考えられる。実際、神経疾患、痴呆等
の治療の目的に脳でのアセチルコリン合成を高めよう
と、血中にコリンを注射するという療法が試みられてい
るが、血中のコリン濃度が一時期高くなるもののすみや
かに代謝されてしまい、所期の効果が得られていないの
が現状である。

【０００５】一方、ニワトリでは卵の黄味に肝臓で生合
成されたホスファチジルコリンが多量に蓄積されてい
る。ニワトリの肝臓でのホスファチジルコリンの合成
は、ホルモンとしてのエストロジェンが肝臓に作用し、
ＣＫ活性を高めることによって行われ、合成されたホス
ファチジルコリンは血中に移行して、リポタンパク質成
分となって卵に取り込まれる。また、植物では、大豆に
おいてＣＫの存在が報告されており、大豆レシチン（ホ
スファチジルコリン）は食用等、広範な用途が開発され
ている。更に、酵母のＣＫについても多くの研究がなさ
れており、そのアミノ酸の一次配列、遺伝子の塩基配列
が分析され、報告されている（参考文献１）。

【０００６】他方、ＣＫは、基質としてコリンのみなら
ず、エタノールアミンもリン酸化する。リン酸化された
ホスホエタノールアミンは、ＣＤＰ−エタノールアミン
を経由してホスファチジルエタノールアミンに代謝され
る。ホスファチジルエタノールアミンもホスファチジル
コリンとともに生体膜リン脂質の主要成分であり、この
点からもＣＫ活性の調節は生体にとって極めて重要であ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところが、上述のよう
にＣＫがコリン及びコリン関連物質の代謝や生体内リン
脂質代謝における鍵として重要な酵素であるにも拘ら
ず、組織湿重量における含有割合が１０万分の１〜１０
０万分の１と生体内含量が非常に少なく、従来の分離、
精製方法では充分な純度のＣＫの必要量を得ることが困
難であり、ＣＫの役割、機能の解明等に関する研究が立
ち遅れていた。

【０００８】本発明者らは、ＣＫの生物学、基礎医学領
域での知見を増やし、研究を発展させ、ＣＫの神経、循
環器、消化器、代謝系、癌等の各種疾患の診断、治療へ
の応用を実現させるために、あるいは、ＣＫの、卵黄、
大豆等のリン脂質の食品への応用やリポソームなどの製
造のような油脂化学産業への応用をはかるために、充分
な量のＣＫを確保するための技術を確立することが急務
であると考えた。そこで、ＣＫの高純度の分離、精製技
術を開発し、ＣＫ遺伝子のクローニングを行い、取得し
た遺伝子を動物細胞、植物細胞、微生物等で発現させる
手段を開発するために、ラット脳のＣＫを精製し、その
特性について報告した（参考文献２）。また、本発明者
らは、ヒトＨｅＬａ細胞において、ＥＧＦ、インスリ
ン、ＩＧＦ−１、ＰＭＡなどの細胞増殖因子がＣＫを特
異的に活性化することを見い出し、ＣＫ活性の調節機構
を明らかとすることは、リン脂質生合成、生体膜合成、
細胞増殖などの生命現象の解明に有用であると考えた。

【０００９】そこで本発明者らは、更に、ラット肝のＣ
Ｋを高度に精製すべく鋭意検討した結果、高純度のラッ
ト肝のＣＫを得ることのできる方法を確立するに至り、
得られた高純度ラット肝ＣＫを用いて調製した抗体を利
用してＣＫ遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完
成した。

【００１０】本発明の目的は、ＣＫの新たな知見を得る
ために必要な高純度のラットＣＫを分画する技術及びＣ
Ｋ遺伝子のクローニングに必要な技術を提供することに
ある。本発明の他の目的は、ラットＣＫのアミノ酸配
列、ラットＣＫ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を明らかとし、
これらと酵母ＣＫ等におけるアミノ酸配列及びＤＮＡ塩
基配列との相同性を比較検討し、例えば、ラット脳、ヒ
ト脳神経や肝臓、腎臓等の各種臓器、またニワトリ、ウ
ズラ等の肝臓、卵黄の、更には大豆等の、レシチン含量
の多い食品として有用な動植物などにおけるＣＫ遺伝子
を検出、取得できる方法を提供することにある。本発明
の他の目的は、ラットＣＫ遺伝子を各種細胞、微生物等
で発現させて、ＣＫを量的に生産する方法、及びＣＫに
対する抗体を調製する方法を提供することにある。本発
明の他の目的は、ラット、ヒト等のＣＫに対する抗体を
用いたＣＫの測定方法、ＣＫの各組織・細胞内の分布の
検出方法、そして神経疾患、肝疾患、癌ほか各種疾患の
診断、治療のため、及びヒトＣＫ、ヒトＣＫ遺伝子、抗
ヒトＣＫ抗体等を用いた神経疾患、肝疾患、癌ほか各種
疾患の診断、治療のために必要な技術を提供することに
ある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明のラットＣＫ遺伝
子は、例えば、ラットから分離精製したラットＣＫに対
する抗体を調製し、得られた抗体を用いて、ラットｍＲ
ＮＡから調製したｃＤＮＡをスクリーニングする方法に
よりラットＣＫ遺伝子をクローニングすることによって
得ることができる。

【００１２】ラットＣＫをラットから分離するには、ラ
ットの肝臓、腎臓、脳神経等の各種臓器や組織をすばや
くカミソリ刃等によって細く切り、庶糖、ＥＤＴＡ、メ
ルカプトエタノール、種々のプロテアーゼ阻害剤等を含
む緩衝液に懸濁し、テフロン−ガラスホモジェナイザー
等で４℃以下でホモジェナイズする。次いで、遠心分離
して得られた上清を更に超遠心分離してＣＫ酵素抽出液
を採取する。この抽出液に食塩等の塩を加え、種々のカ
ラムクロマトグラフィーを行うことにより、ＣＫ活性画
分を採取する。分画された画分のＣＫ活性の測定には、
放射性同位元素標識コリンを用いるアイソトープ法や分
光分析を用いる方法等各種の方法を利用することができ
る。ＣＫ活性画分を分画するためのカラムクロマトグラ
フィーには、Ｑ−セファロースカラムなどを利用するこ
とができる。カラムを通して集められたＣＫ活性を有す
る画分から塩析や透析を用いて粗精製品を得た後、これ
を更にＡＦ−ブルートヨパールカラムをにかけると、カ
ラムに吸着しない画分と、吸着する画分とに分画するこ
とができる。前者をＣＫ−Ｐ、後者をＣＫ−Ｒとする。
ここまでの精製操作によって得られた精製品の比活性
を、超遠心時に得られた上清の比活性に比べて６〜１０
倍高めることができる。

【００１３】さらに、粗ＣＫの精製度を高めるために、
1,6-ジアミノヘキサン−アガロースカラム、モノメチル
アミン（ＭＭＡ）−アガロースカラムなどを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーを行うことが有用であ
る。

【００１４】ラットのＣＫは、クロマトグラフィーでの
挙動及び分子量の違いから、上記のように２種類のアイ
ソザイム（ＣＫ−Ｐ、ＣＫ−Ｒ）に分離され、上述の精
製方法によって、ＣＫ−Ｐ及びＣＫ−Ｒのそれぞれが１
５０００〜５００００倍と高度に精製された均一な標品
として得ることができる。これらＣＫの均質性の確認、
分子量の測定は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動、Superose-12 カラムで
のゲル濾過、庶糖密度勾配超遠心分析などの方法によっ
て行うことができる。なお、分子量の測定にあたって
は、対照としての分子量マーカーを共存させて測定を行
うと良い。また、上記の測定に加えて、ＣＫ−Ｐ及びＣ
Ｋ−Ｒのそれぞれの基質特異性、活性化物質の検討を行
うことにより、これらがアイソザイムであることを確認
できる。

【００１５】精製したＣＫを、フロイントのアジュバン
ドなどとともにウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、ハ
ムスターなどに免疫し、ポリクローナル抗体やモノクロ
ーナル抗体を調製できる。このようにして得たＣＫ−Ｐ
に対する抗体（抗ＣＫ−Ｐ抗体）及びＣＫ−Ｒに対する
抗体（抗ＣＫ−Ｒ抗体）を用いて、Huynh らの方法（参
考文献３）を利用して、ラットｍＲＮＡより調製したｃ
ＤＮＡからＣＫ遺伝子のクローニングが可能となる。例
えば、ラット肝臓からChirgwinらの方法（参考文献４）
にしたがって全ＲＮＡを調製する。なお、poly(A)⁺ＲＮ
Ａは、Avivらの方法（参考文献５）にしたがってオリゴ
(dT)セルロースカラムを２回通して精製することができ
る。

【００１６】次に、オリゴ(dT)をプライマーとしてｃＤ
ＮＡを、Gublerらの方法（参考文献６）に従って合成す
る。このｃＤＮＡの合成には、ファルマシア社、ベセス
ダリサーチ社、ベーリンガー・マンハイム社、アマシャ
ム社等から市販されているｃＤＮＡ合成キットが利用で
きる。得られたｃＤＮＡのうち約５００塩基対以上のも
のを分別してからλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを作
製し、先に挙げたHuynh らの方法を用いて、抗ＣＫ−Ｐ
抗体または抗ＣＫ−Ｒ抗体によってスクリーニングする
ことによって、ラットＣＫ遺伝子全部またはその一部を
含むｃＤＮＡ断片を有するクローンを選別し、必要に応
じて該ｃＤＮＡ断片を他のベクターなどに再度クローニ
ングしてラットＣＫ遺伝子（またはその一部）を単離す
ることができる。

【００１７】なお、この操作におけるクローンの選別に
おいては、抗ＣＫ−Ｐ抗体及び抗ＣＫ−Ｒ抗体の両方に
対してポジティブなクローンを選別することが好まし
い。すなわち、抗体を使用したｃＤＮＡクローンのスク
リーニングにおいては、通常、抗体を含む血清が利用さ
れるが、この血清には自然抗体が混入しているばかりで
なく、抗体調製用として用いた抗原タンパク質中に含ま
れる少量の不純物に対する抗体も混入しているために、
目的のクローン以外のクローンもポジティブなクローン
として検出される場合が多い。そのような場合には、選
別したポジティブクローン中のｃＤＮＡの塩基配列の分
析や融合タンパク質を発現させてその活性を測定する方
法などによって、選別したクローンが目的としたクロー
ンであるかどうかを確認する必要がある。

【００１８】そこで、アイソザイムであるＣＫ−Ｐ及び
ＣＫ−Ｒのそれぞれに対する抗ＣＫ−Ｐ抗体及び抗ＣＫ
−Ｒ抗体の両方に共通な部分に対してポジティブなクロ
ーンを選別することによって、ＣＫ遺伝子に共通な部分
でのダブルチェックを行うことで、少なくともＣＫ活性
に関与する部分をコードする部分を含むｃＤＮＡクロー
ンを、スクリーニングすることが容易になり、より効率
良くクローンを選別することが可能となる。

【００１９】また、上記の操作において選別されたクロ
ーンがＣＫ遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ断片を有する場
合には、該ｃＤＮＡ断片をプローブとして再度クローン
のスクリーニングを行って、完全なラットＣＫ遺伝子を
有するクローンを選別することができる。なお、該プロ
ーブとしては該ｃＤＮＡ断片の有するＤＮＡ塩基配列を
その機能を損なうことなく変換したものも利用できる。

【００２０】選別されたクローン中にラットＣＫ遺伝子
の全てが含まれているかどうかは、得られたｃＤＮＡク
ローンのＤＮＡ塩基配列やそれに対応するアミノ酸配列
を、酵母などのＣＫ遺伝子のＤＮＡ塩基配列やそれに対
応するアミノ酸配列と比較することで確認できる。すな
わち、本発明者らの検討によれば、ＣＫのアミノ酸配列
は、分類学上及び進化の上で非常にかけ離れているラッ
トと酵母のＣＫにおいて、アミノ酸配列が非常に似てお
り良く保存された複数の領域が存在し、これらの領域が
ヒトや他の動植物においても同様に保存されている可能
性が高いとの結論を得た。従って、得られたｃＤＮＡの
塩基配列やそれに対応するアミノ酸配列を他のＣＫのも
のと比較することで得られるクローンがＣＫ遺伝子全体
を含むかどうか推定できる。更に、選別されたクローン
を用いて合成される融合タンパク質が示す酵素活性によ
りコリンリン酸が生産されるかどうかを薄層クロマトグ
ラフィーなどによって測定することで、選別されたクロ
ーンがＣＫ遺伝子のＣＫ活性に関与する部位をコードす
る部分を含むかどうか確認できる。

【００２１】上述のように、ＣＫは、ラットと酵母にお
いてアミノ酸配列が非常に似ており良く保存された複数
の領域を有し、これらの領域がヒトや他の動植物におい
ても同様に保存されている可能性が高いことから、ラッ
トＣＫ遺伝子のＤＮＡ塩基配列から選択した種々のＣＫ
遺伝子に相同性の高いＤＮＡ塩基配列を選択して、それ
をポリメラーゼ チェイン リアクション（ＰＣＲ）用
のプライマーとして、あるいはハイブリダイゼーション
を利用したスクリーニング用のプローブとして用いるこ
とによって、ヒトあるいは各種動植物のＣＫ遺伝子の単
離を行うことができる。特に、未知のＣＫ遺伝子の単離
に有用である。

【００２２】ＰＣＲ用のプライマーとして用いる場合
は、上述のようにして得たラットＣＫ遺伝子のＤＮＡ塩
基配列から選定されたＤＮＡ塩基配列を有する二種のオ
リゴヌクレオチドを調製し、これらのオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして、生体由来のＤＮＡのＰＣＲを行
い、増幅されたＣＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離する
ことによって、単離されたＣＫ遺伝子を得ることができ
る。また、上記の二種のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして、生体由来のＤＮＡのＰＣＲを行い、ＣＫ遺伝
子の一部を有するＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅された
ＤＮＡ断片をプローブとして、生体由来のＤＮＡからＣ
Ｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択し、単離することによ
って、単離されたＣＫ遺伝子を得ることができる。な
お、この方法の場合、ＰＣＲにかけるＤＮＡを供給する
生体と、ＣＫ遺伝子供給用の生体とは同一（同種）であ
っても異なるものであっても良い。更に、上述のように
して得たラットＣＫ遺伝子のＤＮＡ塩基配列から選定さ
れたＤＮＡ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを直接
プローブとして用いて、生体由来のＤＮＡからＣＫ遺伝
子を含むＤＮＡ断片を選択し、単離することによって、
単離されたＣＫ遺伝子を得ることができる。なお、以上
の各方法で用いるプライマーやプローブは、その機能を
損なわない範囲内でその塩基配列を変更したものであっ
ても良い。

【００２３】以上の方法によって、ヒトや他の動植物の
ＣＫ遺伝子のクローニングが可能となる。例えば、後述
の実施例において得られたクローンＬｉ２７９、Ｌｉ３
３６の各ｃＤＮＡの共通部分を位置合わせした際のＬｉ
２７９中のｃＤＮＡの５’末端からＬｉ３３６中のｃＤ
ＮＡの３’末端までのｃＤＮＡの全長は図１〜４に示す
ように２５４０の塩基長（配列番号：１）を有し、ＣＫ
をコードする領域は１３０５ｂｐで、アミノ酸残基４３
５（配列番号：２）のタンパク質に対応するものであ
り、このアミノ酸配列の酵母ＣＫのアミノ酸配列との比
較において、４つの相同性の高い領域（各種のアンダー
ラインを付した領域）が存在することが明かとされた。

【００２４】従って、上述した理由から、図７、８に示
す＊の多く並んだ領域は、ヒト、サル、ニワトリをはじ
め、各種動物、大豆等の各種植物、細菌、酵母等の各種
微生物のＣＫ遺伝子をクローニングする際のＰＣＲ用プ
ライマー、あるいはハイブリダイゼーションを用いたス
クリーニング用のプローブとして有用である。

【００２５】一方、このようにして単離されたＣＫ遺伝
子を適当なベクターに組み込んで得た組換えＤＮＡを適
当な宿主に導入して得た組換え体（組換え菌体、組換え
細胞、トランスジェニック動物等）に、ＣＫを発現させ
ることによって、量的に充分なＣＫの生産が可能とな
る。該ベクターとしては、発現のために必要なプロモー
ター、ＳＤ配列、ターミネーター、発現を制御したり誘
導したりするための配列、あるいは宿主中での複製オリ
ジン、各種マーカー等を必要に応じて有するものが利用
できる。なお、これらのプロモーター等のベクターの構
成要素としては、用いる宿主に応じて公知のものを適宜
選択して用いる。該宿主としては、大腸菌等の細菌、酵
母などの微生物、動物細胞及び植物細胞等が利用でき
る。また、ウイルスゲノム中にＣＫ遺伝子を組み込ん
で、それを宿主に導入してＣＫ遺伝子を発現させること
もでき、例えばバキュロウイルスゲノムを用いること
で、カイコなどの昆虫でのＣＫ遺伝子の発現を行わせ、
ＣＫの大量生産が可能となる。

【００２６】こうして生産されたＣＫは、ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体作製用の抗原として利用で
きる。また、各種担体に結合させて、ＣＫ結合アフィニ
ティクロマトグラフィーを行うことができ、コリン様物
質、ＣＫに対する抗体等の分離、精製に用いることがで
きる。更に、ＣＫを担持したバイオリアクターは大量の
コリン類のリン酸化を可能とし、リン脂質類の大量合成
に必要な技術の開発を促進することができる。

【００２７】

【実施例】以下の各実施例におけるＣＫ活性の検出は以
下のアイソトープ法または分光分学的手法のいずれかに
よって行った。 ａ．アイソトープ法 １００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ溶液（ｐＨ９）中に、１
０ｍＭＡＴＰ、２ｍＭ［Ｍｅ−¹⁴Ｃ］コリンクロリド
（１１００ｄｐｍ／ｎｍｏｌ，New England Nuclear)，
１５０ｍＭＫＣｌ、１２ｍＭＭｇＣｌ₂ 及び試料（酵素
蛋白質量が非常に低い時はウシ血清マルブミンを０．５
ｍｇ／ｍｌの濃度で補った）を含有させて全量を１００
μｌとした反応液を調製し、反応温度３０℃、反応時間
５分で反応を行った。反応は、テトラフェニルボロンの
ブチロニトリル溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）の２５０μｌを
加えることで停止した。反応停止後、反応液を激しく混
合し、下層を取り、この下層に上記と同様の濃度のテト
ラフェニルボロンのブチロニトリル溶液（２５０μｌ）
を添加して混合した後、下層を分取し、この操作をさら
にもう一度繰り返し、下層からブチロニトリル溶液によ
ってコリンを除いた。下層に残った［¹⁴Ｃ］コリンリン
酸を液体シンチレーション計測により測定し、ＣＫ活性
を算出した。

【００２８】ｂ．分光学的手法 ＣＫ反応で生ずるＡＤＰをホスホエノールピルビン酸を
もう一つの基質としたピルビン酸キナーゼ反応に共役さ
せ、更に、このピルビン酸キナーぜ反応で生じたピルビ
ン酸をＮＡＤＨをもう一つの基質とする乳酸脱水素酵素
と共役させる反応におけるＣＫのＡＴＰの消費にともな
うＮＡＤ⁺ の化学量論的な増加を、ＮＡＤＨからＮＡＤ
⁺ への変換を分光学的に測定してＣＫ活性を測定した。
すなわち、１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ溶液（ｐＨ
９．０）に、１０ｍＭＡＴＰ、２ｍＭコリンクロリド、
１２ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭホスホ
エノールピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ，０．５ｍｌ
／ｍｌウシ血清アルブミン、７ユニットビルビン酸キナ
ーゼ、３２ユニット乳酸脱水素酵素及び試料を含有させ
て全量を１ｍｌとした反応液を調製し、３０℃で３４０
ｎｍの吸光度の減少を測定した。

【００２９】実施例１ （１）アフィニティークロマトグラフィーカラムの調製 1,6-ジアミノヘキサンをアガロース（セファロース４
Ｂ、ファルマシア社製）に臭化シアンで結合させてアフ
ィニティークロマトグラフィーカラムを調製した。な
お、このカラムの調製に際して以下の点について特に考
慮した。 イ）臭化シアンのアセトニトリル液を使用する一般的に
使われている固型臭化シアンでゲルを活性化する方法は
不可である。 ロ）臭化シアンの濃度を厳密にする。 まず、よく蒸留水で洗ったセファロース４Ｂを吸引して
ケーキ状にした。その４ｇを５ｍｌの２ＭＮａ₂ ＣＯ₃
に懸濁し、７５〜１００μｌの臭化シアンのアセトニト
リル溶液（１ｇ／ｍｌ）と２０℃２分間反応させた。

【００３０】反応は、ガラスフィルターを使ってゲルと
反応液を分離した後、ゲルを１００ｍｌの蒸留水（０
℃）、つづいて１００ｍｌの０．１ＭのＮａＨＣＯ₃
（ｐＨ９．０、０℃）で洗って停止させた。この活性化
したゲルを１０ｍｌの１Ｍ１，６−ジアミノヘキサン液
（ｐＨ９．０）に懸濁し、２５℃で１２〜１６時間ゆる
やかに反応させた。それから、蒸留水と緩衝液Ａ［２０
ｍＭトリス(pH7.5) 、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭ２−メル
カプトエタノール、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド］でよく洗ってから所定の大きさのカラ
ムに充填して、アフィニティークロマトグラフィーカラ
ムを得た。 （１−Ａ）アフィニティークロマトグラフィー用モノメ
チルアミン（ＭＭＡ）−アガロースの調製 １，４−ブタンジオールジグルシジルエーテルのカップ
リングは、SundbergらのJ. Chromatogr. 90 (1974);87-
98の一部を変更して行なった。５０ｍｌセファロース６
Ｂ（ファルマシア社製）を蒸留水でよく洗い、２５ｍｌ
の１，４−ブタンジオールジグルシジルエーテルと５０
ｍｌの０．６Ｍ ＮａＯＨ（２ｍｇ／ｍｌでＮａＢＨ₄
を含む）からなる溶液に懸濁し、２５℃１６時間反応さ
せた。ゲルを蒸留水でよく洗い、２．５％モノメチルア
ミン溶液に懸濁し、４３℃１６時間反応させ、ＭＭＡ−
アガロースを調製した。これを蒸留水でよく洗い、カラ
ムに詰め、緩衝液で平衡化して、アフィニティーカラム
とした。以下の（２）項で述べるが、ＣＫの精製の過程
でＡＦ−ブルートヨパールカラムを素通りする活性（Ｃ
Ｋ−Ｐ）とカラムに保持される活性（ＣＫ−Ｒ）とに分
離する。１，６−ジアミノヘキサン−アガロースはＣＫ
−ＰとＣＫ−Ｒの両方の精製に使用することができる。
一方、ＭＭＡ−アガロースはＣＫ−Ｒの精製にのみ使用
することができる。 （２）ＣＫの精製 ラット肝あるいは脳１０〜５０ｇを生体から取り出した
らすばやくカミソリ刃で細かくし、テフロン−ガラスホ
モジェナイザーで２４０ｍＭスクロース、２０ｍＭトリ
ス（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、下記のプロテアーゼインヒビターを含
む溶液中でホモジェナイズした。 プロテアーゼインヒビターの組成；フェニルメチルスル
ホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、１ｍＭ）、benzamidin
e ＨＣｌ（１０ｍＭ）、leupeptin （１０μｇ／ｌ）及
びantipain（１０μｇ／ｌ）を含む。

【００３１】これを遠心分離（12,000×ｇ、１５分）
し、得られた上清を更に超遠心分離(100,000×ｇ、１時
間）して、酵素抽出液を採取した。この抽出液にＮａＣ
ｌ（最終濃度７５ｍＭ）を加え、Q-Sepharose カラム(
ファルマシア社製、カラムサイズ１．６×２１．５ｃ
ｍ）にかけた。カラムは平衡化用の緩衝液［２０ｍＭト
リス（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭ２−メル
カプトエタノール、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド、１００ｍＭＮａＣｌ］で平衡化してお
いた。

【００３２】酵素抽出液をかけた後、平衡化用緩衝液１
５０ｍｌでカラムを洗った。ＣＫは緩衝液Ａを用いた１
００〜５００ｍＭＮａＣｌの直線濃度勾配（合計４００
ｍｌ）をかけることで溶出させた。流速は常に１５０ｍ
ｌ／時間とした。ＣＫ活性を示す溶出画分を集めて一緒
にして合計約１００ｍｌの溶出液を得、この硫安分画を
行った。２５〜５０％飽和硫安濃度で沈殿する画分を集
め、緩衝液Ａ対して透析した。透析液を、緩衝液Ａで平
衡化したＡＦ−ブルートヨパール６５０ＭＬカラム（ト
ーソー社製、１×１１．５ｃｍ）にかけた。カラムを緩
衝液Ａ（５０ｍｌ）で洗浄し、カラムから流出した洗液
にＣＫ活性が検出されたので、この洗液に含まれたカラ
ムに吸着しないＣＫをＣＫ−Ｐとした。次に、カラムに
緩衝液Ａを用いた０〜１ＭＮａＣｌの直線濃度勾配（全
量１００ｍｌ、流速６０ｍｌ／時間）をかけたところ、
ＣＫ活性を示す画分を得た。これらのＣＫ活性のある画
分を集め、緩衝液Ａに対して透析し、カラムに吸着して
溶出されたＣＫ（ＣＫ−Ｒ）を含む溶液を得た。

【００３３】以下、ＣＫ−Ｐを含む溶液及びＣＫ−Ｒを
含む溶液のそれぞれを個々に用いて、同様の操作によっ
てアフィニティークロマトグラフィーでこれらを更に精
製した。すなわち、ＣＫ活性を示す画分を、緩衝液Ａで
平衡化した上記（１）項で作製した１，６−ジアミノヘ
キサン−アガロースカラム（１×７．５ｃｍ）にかけ
た。次に、カラムを次の溶液で順次洗った。 ａ．５ｍｌ緩衝液Ａ ｂ．緩衝液Ａを用いた０〜５００ｍＭＮａＣｌ直線濃度
勾配（全量４０ｍｌ） ｃ．２００ｍｌの５００ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ ｄ．２０ｍｌの１００ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ 以上の洗浄が終了したところで、最後に１００ｍＭＮａ
Ｃｌと２００ｍＭコリンクロリドを含む緩衝液Ａでカラ
ムからＣＫを溶出（流速２０ｍｌ／時間）した。なお、
カラムからの溶出した活性は、分光学的方法によって調
べた。

【００３４】（３）分析 上記（２）項のアフィニティークロマトグラフィーによ
って精製されたＣＫ−Ｐ及びＣＫ−Ｒについて以下の分
析を行った。 ａ．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 Laemmli, U.K. 1970 Nature 227, 680-685に従って、上
記（２）項のアフィニティークロマトグラフィーで得ら
れた各ＣＫ活性を示す画分をそれぞれＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけた。なお、１０％分離ゲル
におけるアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミドの比率は３７：１で、０．１％ＳＤＳを含む
ものを使用した。電気泳動で展開されたタンパク質は銀
染色法で染色して検出した。ＳＤＳで変性した精製ＣＫ
の分子量は、分子量マーカーとしてウシ血清アルブミン
（分子量66、000）、ニワトリ卵白アルブミン（分子量4
5、000）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（分子量36,000）、カーボニックアンヒドラーゼ
（分子量29,000）、トリプシノーゲン（分子量24,000）
を用いたカリブレーション直線から求めた。

【００３５】このカリブレーション直線により、ＣＫ−
Ｐ（単一バンド）の変性状態での推定分子量は約４４，
０００と算定された。ＣＫ−Ｒは推定分子量４４，００
０〜５２，０００のところに数本のバンドとして検出さ
れた。なお、別途行った免疫学的研究においてこれら数
本のバンドがすべてＣＫであることが推定された。ま
た、これらの分子量の推定値は、電気泳動法の条件、蛋
白質分子量マーカーの種類等によって異なる値が算定さ
れ得る。

【００３６】ｂ．ゲル濾過カラムによる分析 精製ＣＫ−ＰをＨＰＬＣ分析に付した。分析条件は以下
のとおりである。 カラム：Superose１２ＨＲ１０／３０（ファルマシア社
製） 溶出緩衝液：１００ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ 流速：０．５ｍｌ／分 分子量マーカーとしてブルーデキストラン（分子量 2,0
00,000）、ウマアポフェリチン（分子量 443,000）、サ
ツマイモβ−アミラーゼ（分子量 200,000）、酵母アル
コールデヒドロゲナーゼ（分子量 150,000）、ウシ血清
アルブミン（分子量66、000）、ニワトリ卵白アルブミン
（分子量45、000）、チトクロムＣ（分子量12,400）（い
ずれもシグマ社製）を用いて、カリブレーション直線を
作製し、未変性状態のＣＫ−Ｐの分子量を約９０，００
０、ストークス半径４．２ｎｍと算定した。なお、これ
らの値は、用いるカラム充填剤、タンパク質分子量マー
カーの種類、分析条件等によって異なった値が算定され
得る。 ｃ．超遠心分析 直線的庶糖密度勾配（５−２０％）は１００ｍＭＮａＣ
ｌを含む緩衝液Ａをベースに作製した。精製ＣＫ−Ｐと
タンパク質マーカー、乳酸脱水素酵素、３−ホスホグリ
セリン酸キナーゼ、チトクロムＣを一緒にスクロースグ
ラジェントにのせ、１７２，０００×ｇ、７時間４℃で
日立ＲＰＳ５０−２ローターを用いて分析を行った。そ
の結果、沈降係数ｓ２０、ｗが４．８ｓと算出された。
なおこの値は、用いる分析条件や蛋白質マーカーの種類
等によって異なった値が算定され得る。

【００３７】（４）抗血清の作製 前記（２）項で得たＣＫ画分を集めた溶液の所定量をと
り、これに等容のフロイントの完全アジュバントをよく
混合してエマルジョンにして、ＣＫ−Ｐを含む免疫用溶
液及びＣＫ−Ｒを含む免疫用溶液をそれぞれ調製した。
これらを別個に、日本白色種の家兎一匹当たり５０μｇ
ＣＫとなるように四肢のfootpadに免疫した。４週目か
ら２週間おきに同量のＣＫを皮内に免疫した。なお、２
回目の免疫からはフロイントの不完全アジュバントを用
いた。最終的に、４〜６回の免疫を行い、抗体価の上昇
した時点で全身麻酔下に全採血し、抗血清を調製した。

【００３８】なお、この免疫時における抗体価の測定
は、以下の方法により行った。すなわち、前記（２）項
で得たＣＫ−ＰあるいはＣＫ−Ｒを、９６穴のマイクロ
タイタープレートに吸着させ、その後ウシ血清でプレー
トのＣＫ不吸着部分をブロックした。次に、採血した血
液から調製した抗血清を段階的に希釈し、プレート上の
ＣＫとそれぞれ反応させ、プレートを洗浄した後、これ
にパーオシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体
を反応させた。再びプレートを洗浄した後、基質として
過酸化水素とｏ−フェニレンジアミンを用いて発色反応
を行い、抗体価を測定した。

【００３９】（５）抗体によるＣＫの阻害 ＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒの免疫学的な性質及び抗体の性質を
調べる目的で、抗体によるＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒの阻害を
調べた。なお、抗ＣＫ−Ｐ血清及び抗ＣＫ−Ｒ血清は前
記（４）項で調製したものを、ＣＫ−Ｐ及びＣＫ−Ｒは
前記（２）項で調製したものをそれぞれ用いた。

【００４０】まず、抗ＣＫ−Ｐ血清のＣＫ−Ｐに対する
抗体価と、抗ＣＫ−Ｒ血清のＣＫ−Ｒに対する抗体価と
が等しくなるように調製した抗ＣＫ−Ｐ血清溶液と抗Ｃ
Ｋ−Ｒ血清溶液とを用意し、更にこれらの溶液の段階的
希釈した。得られた希釈液のそれぞれをＣＫ−Ｐ及びＣ
Ｋ−Ｒの溶液（これらの溶液のＣＫ活性は等しくなるよ
うに調整した）のそれぞれと１時間反応させた後、スタ
フィロコッカス アウレウスの菌体懸濁液（和光社製）
と更に１時間反応させた。遠心により菌体を沈殿させ、
ＣＫ−抗体複合体を除き、上清に残ったＣＫ活性を測定
した。

【００４１】図９（Ａ）及び（Ｂ）に示しように、抗Ｃ
Ｋ−Ｐ抗体はＣＫ−Ｒと、抗ＣＫ−Ｒ抗体はＣＫ−Ｐと
も反応した。このことは、ＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒとに共通
な抗原決定基があることを示す。なお、図９に示す活性
は抗体と反応しないで上清に残ったＣＫ活性を示すの
で、活性０は、全ＣＫが抗体と結合して遠心により除去
されたことを示す。つまり、本発明のＣＫｃＤＮＡを使
って大腸菌、酵母、培養細胞に発現させたＣＫｃＤＮＡ
から推定されるＣＫのアミノ酸配列を解析することによ
ってＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒとに共通に反応する抗体を製造
することができることを示す。すなわち、ＣＫのアミノ
酸配列の特定の部分のＮ末端側から第１番目から所定の
残基数（例えば６〜１０残基）の第１のオリゴペプチ
ド、第２番目から第１のオリゴペプチドと同じ残基数の
第２のオリゴペプチド、第３番目から第１のオリゴペプ
チドと同じ残基数のオリゴペプチドと、順次１アミノ酸
ずつずらしたアミノ酸を頭とする所定の残基数のオリゴ
ペプチドをすべて合成し、それぞれをイムノプレートや
ニトロセルロースに固定し、抗体を反応させることによ
って、どのオリゴペプチド部分が抗体と反応したかを調
べることによって、エピトープ部分がどこにあるかを、
また検出されたエピトープ部分でＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒに
共通のアミノ酸配列を有する部分を抗原として用いるこ
とで、ＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒとに共通に反応する抗体を製
造することができる。さらに、エピトープ部分のオリゴ
ぺプチドをアガロースのような担体に結合させ、これに
対する抗体を精製することができる。

【００４２】更に、βガラクトシダーゼ遺伝子、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子、マ
ルトース結合蛋白質遺伝子等に、ＣＫのｃＤＮＡから種
々の部分を切り出して、それぞれを個々に融合し、発現
された各種融合タンパク質の抗体との反応性を上記と同
様の方法によって調べることによって、ｃＤＮＡのどの
部分がエピトープ部分がどこにあるかを、また検出され
たエピトープ部分をコードしているかを検出でき、ま
た、またＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒに共通のＤＮＡ塩基配列を
有するエピトープをコードする部分を発現させて、それ
を抗原として用いることで、ＣＫ−ＰとＣＫ−Ｒとに共
通に反応する抗体を製造することができる。グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質の作製には
ファルマシア社製プラスミドｐＧＥＸ−２ＴやｐＧＥＸ
−３Ｘが利用でき、マルトース結合蛋白質との融合蛋白
質の作製にはＮＥＢ社製プラスミドｐＭＡＬ−ｃが利用
できる。更に、これらのプラスミドを用いて構築したプ
ラスミドを大腸菌に導入し、発現させた融合蛋白質はそ
れらのＮ末端側蛋白質に対するアフィニティークロマト
グラフィーで容易に精製されうる。

【００４３】また、図９（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、
ＣＫ−Ｐは抗ＣＫ−Ｐ抗体と、ＣＫ−Ｒは抗ＣＫ−Ｒ抗
体とより強く反応したことから、ＣＫ−Ｐ、ＣＫ−Ｒそ
れぞれに特異的な抗原決定基が存在することが示され
た。従って、ＣＫｃＤＮＡを解析することによってＣＫ
−Ｐ、ＣＫ−Ｒのそれぞれに特異的に反応する抗体を製
作することができることが判明した。なお、別途行った
試験によれば、これらの抗血清はＨｅＬａ細胞のＣＫと
も反応した。このことは、ラットＣＫがヒトＣＫと似て
いおり、ラットｃＤＮＡを使用してヒトＣＫのｃＤＮＡ
更にはヒトＣＫ遺伝子のクローニングが可能であること
を示す。また、ラットＣＫに対する抗血清、モノクロー
ナル抗体によってヒトＣＫを調べることができること
は、基礎臨床研究にばかりでなく診断等の応用にも用い
ることを示す。

【００４４】ＣＫ−Ｒは数本のバンドに精製されたが、
これをニトロセルロース膜にブロットして抗ＣＫ−Ｐ抗
体と反応させるとすべてのバンドが反応した。このこと
はすべてのバンドにＣＫ−Ｐと共通な抗原が存在し、こ
れらのバンドがすべてＣＫであることを示すものであ
る。

【００４５】（６）基質特異性の測定 上記（２）項で得たＣＫ−Ｒ及びＣＫ−Ｐについての基
質特異性を調べた。その結果、ＡＴＰがリン酸基の供与
体として最も優れていた。また、ＣＫ−ＲのＡＴＰに対
する特定のＡＴＰ濃度でのＫｍは１．０ｍＭであり、コ
リン類似体がＣＫの基質になるか調べた結果、コリンに
対して最も低い（親和性が高い）ことが明らかとなっ
た。また、コリン類似体もリン酸化することが明らかと
なった。また、ＣＫ−Ｐでも同様の結果を得た。このこ
とは、本発明によって得られたラットｃＤＮＡと大腸
菌、酵母、培養細胞に発現させ、精製したＣＫを用いて
コリン類似体を容易にリン酸化することができることを
示している。これらリン酸化コリン性物質（ラジオアイ
ソトープラベルされた物質も含む）は他の分野にも応用
され得る。

【００４６】（７）ＣＫの活性化物質 上記（２）項で得たＣＫ−Ｒ及びＣＫ−ＰＣＫともに種
々のアミンによって活性化された。

【００４７】実施例２ （１）λｇｔ１１発現ベクターライブラリーの調製 全ＲＮＡはメスのラット肝臓からChirgwinらの方法（参
考文献４）に従って、グアニジンイソチオシアナート−
セシウムクロリドを使った方法で調製した。ｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ ＲＮＡはAviv & Lederの方法（参考文献５）に
従ってＯｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロースカラムを２回通し
て精製した。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとしてｃ
ＤＮＡとファルマシア社製のｃＤＮＡ合成キット等を利
用してGubler & Hoffmanらの方法（参考文献６）に従っ
て合成した。約５００塩基対以上のｃＤＮＡを分別して
λｇｔ１１アーム（ベセスダ社製）にライゲージョンし
た。０．１μｇｃＤＮＡと１．２５μｇλｇｔ１１アー
ムからラムダファージパッケージング抽出液（ギガパッ
クゴールドＩＩ−ストラタジーン社製）を使用して２．
４×１０⁶ 個のリコンビナントファージのライブラリー
を作製した。

【００４８】（２）スクリーニング 以下に述べる３段階のスクリーニングを踏んで目的のＣ
ＫｃＤＮＡを得た。（２−１）第一段階：抗体によるス
クリーニング Huynh らの方法に従って作製したλｇｔ１１ライブラリ
ーを抗ＣＫ−Ｐと抗ＣＫ−Ｒ血清の混合液でまずスクリ
ーニングした。抗体と反応したクローンは、二次抗体と
してヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体とパーオキジダーゼ抗パー
オキシダーゼ複合体を反応させ、基質としてＨ₂ Ｏ₂ と
ジアミノベンチジンを用いて検出した。反応したクロー
ンとすべて単−クローンにした後、今度は抗ＣＫ−Ｐ血
清と抗ＣＫ−Ｒ血清を別個に反応させ、両方の抗体に反
応するものだけを選び出した。

【００４９】ここで用いた２種類のアイソザイムに対す
る互いに交叉反応を示す２種類の抗血清を使用する方法
によって、より効率良い抗体によるｃＤＮＡクローニン
グが可能となった。 （２−２）第二段階：活性誘導によるスクリーニング 上記の２種類の抗血清に反応し、タンパク質を発現する
ファージを大腸菌（Ｙ１０９０株）に感染させ、イソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドで融合蛋白質を誘導し
た。大腸菌を超音波処理（５０ｗａｔｔ，３０秒）して
破砕し、ライゼートを調製した。これを１４，０００×
ｇ１時間４℃で遠心し、上清を得た。この上清のＣＫ活
性を反応液中［１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ9.
0 ）、１０ｍＭＡＴＰ，１２ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．１８
ｍＭ［¹⁴Ｃ］コリンクロリド］で３０℃、１時間反応さ
せて調べた。反応は１００μｌの１ｍＭＥＤＴＡを含む
１０ｍＭトリス（pH7.5)、及び２５０μｌのブチロニト
リル（３０ｍｇ／ｍｌでテトラフェニルボロンを含む）
をよく混合して停止させた。水層の［¹⁴Ｃ］コリンリン
酸を液体シンチレーション計測により測定した。

【００５０】上述の第一段階及び第二段階を通して、１
個のクローンλＬｉ３７を得た。このクローンが産生す
る融合タンパク質が示す酵素活性の結果、反応産物がコ
リンリン酸であることは、薄層クロマトグラフィー（シ
リカゲル６０（メルク社製）、展開溶媒９５％エタノー
ル：２％アンモニウム）を行うことによって確認され
た。このクローンに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を調べ
た結果、酵母ＣＫの塩基配列に高いホモロジーを示すこ
とがわかった。

【００５１】（２−３）第三段階：Ｌｉ３７ｃＤＮＡを
使用したクローニング 酵母ＣＫの塩基配列との比較からＬｉ３７ｃＤＮＡはＣ
Ｋの全長のポリペブチドをコードしていないことがわか
った。そこで、Ｌｉ３７ｃＤＮＡ中のlacZ遺伝子側Ｅｃ
ｏ４７ＩＩＩ−ＢａｌＩのフラグメンを［α−³²Ｐ］ｄ
ＣＴＰでラベルして、これとハイブリダイスするクロー
ンをスクリーニングした。その結果、クローンＬｉ２７
９及びＬｉ３３６を得ることができた。

【００５２】（２）ＤＮＡシークエンス 得られたｃＤＮＡ中には２個のＥｃｏＲＩ部位があり、
ＥｃｏＲＩでは一本の連続したｃＤＮＡとして切り出せ
ないので、Ｌｉ３３６についてはＳａｃＩとＫｐｎＩと
でクローンを消化し、ｃＤＮＡの両端にλＤＮＡを有す
る形でｃＤＮＡ断片を得た。これをｐＴＴＱ１９（アマ
シャム社製）のＳａｃＩ−ＫｐｎＩ部位にサブクローニ
ングし、組換えプラスミドｐＴＴＱ１９（Ｌｉ３３６）
を得た。この組換えプラスミドを有する大腸菌ＵＭ−
２、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、ブ
ダペスト条約に基づいて寄託されている（寄託番号：Ｆ
ＥＲＭＢＰ−３０９０、寄託日：平成２年９月７日）。

【００５３】また、Ｌｉ２７９についてはＮｄｅＩとＫ
ｐｎＩとでクローンを消化して、ｃＤＮＡの両端にλＤ
ＮＡを有する形でｃＤＮＡ断片を得た後、これをｐＵＣ
１９（宝酒造社製）のＮｄｅＩ−ＫｐｎＩ部位にサブク
ローニングし、組換えプラスミドｐＵＣ１９（Ｌｉ２７
９）を得た。この組換えプラスミドを有する大腸菌ＵＭ
−１、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、
ブダペスト条約に基づいて寄託されている（寄託番号：
ＦＥＲＭ ＢＰ−３０８９、寄託日：平成２年９月７
日）。

【００５４】得られた各サブクローンを用いて制限酵素
地図を作製し、さらに各ｃＤＮＡフラグメントをＭ１３
ｍｐ１０とＭ１３ｍｐ１１プラスミドにラゲィションし
てジデオキシタクレオチド法によって全ｃＤＮＡ塩基配
列を決定した。その結果、以下のことが判明した。ＣＫ
ｃＤＮＡ−Ｌｉ２７９（１７２５塩基長）はＬｉ３３６
より上流側に３７塩基分だけはみ出した部分を有する
が、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ 鎖を有していない。Ｌｉ３３６
（２５０３塩基長）はｐｏｌｙ（Ａ）⁺ 鎖をもつ。両方
を共通部分で位置合わせすると図１〜４に示す２５４０
塩基長の塩基配列（配列番号１）となる。

【００５５】両方とも同一のタンパク質をコードする領
域をもち、この長さは１３０５塩基対で図１〜４及び図
５、６に示すアミノ酸残基数４３５（配列番号：２）の
タンパク質をコードしている。なお、クローンＬｉ３
７、Ｌｉ２７９、Ｌｉ３３６の関係を図１０に示す。な
お、黒枠はＣＫをコードする領域を示すが、クローンＬ
ｉ３７においてはＣＫをコードする領域はその一部が欠
失している。 （３）ホモロジーについて ラットＣＫと酵母ＣＫならびに他の蛋白質とのホモロジ
ー比較は、酵素の活性部位を推定するうえで重要であ
る。図７、８は、上記（２）項で得たラットＣＫ遺伝子
のＤＮＡ塩基配列に対応するアミノ酸配列と、酵母ＣＫ
（参考文献１）及びと酵母コリントランスポートタンパ
ク質とのアミノ酸配列レベルでホモロジーの高い部分を
示してある。なお、星（＊）印は同一のアミノ酸残基の
ある部分を、点（・）は類似のアミノ酸残基のある部分
を示す。また、図７（Ａ）は図１〜６で直線のアンダー
ラインで示した部分を含む領域の比較図、図７（Ｂ）は
波線のアンダーラインで示した部分を含む領域の比較
図、図８（Ａ）は点線のアンダーラインで示した部分を
含む領域の比較図、図８（Ｂ）及び（Ｃ）は二重線のア
ンダーラインで示した部分を含む領域の比較図であり、
ａの列は酵母ＣＫの、ｂの列はラットＣＫの、ｃの列は
酵母コリントランスポートタンパク質のアミノ酸配列の
比較された部分的な領域を示す。また、左端の数字は、
各列の最初のアミノ酸の各ＣＫのアミノ酸配列のＮ末端
からの位置を示す。

【００５６】また、酵母ＣＫとラットＣＫのアミノ酸配
列レベルでの相同性の分析をドットマトリックス アナ
リシスにより行ったところ、図１１に示す結果を得た。
この図においては対角線上に点が並ぶんだ部分の相同性
が高いことを示すが、ラットＣＫにおいて大きな欠失が
あるためにギャップがみられる。

【００５７】なお、種々のアミノ酸配列との比較から図
５、６に示すアミノ酸残基２７８〜３３３付近はヌクレ
オチド結合領域を示すもので、広くホスホトランスフェ
ラーゼや蛋白質キナーゼに見い出されるものであること
がわかった。

【００５８】図７、８に示すように、分類学上あるいは
進化上非常にかけ離れた酵母とラットのＣＫにおいて、
非常に良く似た配列領域が保存されていることは、これ
らの配列がＣＫ活性に重要な配列であることを示してい
る。従って、これらの部分を変異させることでより強い
活性を有するＣＫを合成できる可能性がある。また、ヒ
トＣＫにおいても、これらの領域あるいはその類似領域
が保存されていることは容易に推定でき、従って、例え
ば＊の多い部分の配列あるいはその誘導配列をＰＣＲ用
のプライマーとして、あるいはプローブとして用いるこ
とで、ヒトＣＫ遺伝子をクローニングすることができ
る。さらに、これらの領域あるいはその類似領域はヒト
の以外の各種動植物においても保存されていることが推
定でき、＊の多い部分の配列あるいはその誘導配列を用
いてヒトと同様にこれら各種動植物からのＣＫ遺伝子の
クローニングを行うことができる。

【００５９】実施例３ ラットＣＫを大腸菌で発現させるために、ベクタープラ
スミドとして、大腸菌での高発現をイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシドでの誘導で可能とするＰｔｒｃ
（ｔｒｐ／ｌａｃ）融合プロモーター、大腸菌リボゾー
ム結合サイト、該大腸菌リボゾーム結合サイトから良好
な位置にあるポリペプチドの最初のＡＴＧ、この部位近
くにあるマルチクローニングサイト及び転写終結配列
（ターミネーター）を有するｐＫＫ２３３−２（ファル
マシア社製）を用いて以下の操作によって組換えプラス
ミドを構築した。なお、この構築過程の概要を図１２に
示す。

【００６０】まず、ｐＫＫ２３３−２をＨｉｎｄIII で
消化して得られたＤＮＡ断片をクレノウフラグメントで
処理して両末端を平滑化した。次に、実施例２の（３）
項で得た組換えプラスミドｐＵＣ１９（Ｌｉ２７９）を
ＡａｔIIで消化し、得られた大小２つのＤＮＡ断片から
電気泳動法によって小ＤＮＡ断片を分離回収した。次
に、この小ＤＮＡ断片をクレノウ酵素で処理して両末端
を平滑化し、これと先に得たｐＫＫ２３３−２からのＤ
ＮＡ断片とをリガーゼで結合させて環状プラスミドを得
た。これを大腸菌ＪＭ１０５にトランスフェクション
し、右方向への矢印で示すコーディング方向の正しいプ
ラスミドｐＡを選択した。なお、この選択は、環状プラ
スミドを導入して形質転換された大腸菌からプラスミド
を分離し、その制限酵素地図を作製してプラスミドの構
造を確認することで行った。

【００６１】次に、このプラスミドｐＡをＮｃｏＩで消
化してから、クレノウフラグメントで処理して両末端を
平滑化し、さらに、ＮｈｅＩで消化して（ＮｃｏＩ）−
ＮｈｅＩＤＮＡベクター側の長い断片を得た。なお、
（ＮｃｏＩ）のように括弧内に制限酵素名を表示した場
合は括弧内の制限酵素で処理した後に他の酵素で平滑化
したことを示す。

【００６２】これとは別に、プラスミドｐＵＣ１９（Ｌ
ｉ２７９）をＡａｔIIで消化して得た断片をＥｃｏＲＩ
で消化し、得られた３つのＤＮＡ断片からコーディング
領域の最初ＡＴＧを含む断片を分取し、これをＮｌａＩ
ＩＩで消化して、さらにクレノウフラグメントで処理し
て両末端を平滑化し、（ＮｌａＩＩＩ）−ＮｈｅＩ断片
を得た。この（ＮｌａＩＩＩ）−ＮｈｅＩ断片とさきに
調整したプラスミドｐＡから調製した（ＮｃｏＩ）−Ｎ
ｈｅＩＤＮＡ断片とをリガーゼで結合させて環状プラス
ミドｐＫＩＹＯを得た。これを大腸菌ＪＭ１０５にトラ
ンスフェクションし、形質転換体を得た。この形質転換
体は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドでの誘
導で大量のＣＫを発現した。

【００６３】実施例４ ａ．大腸菌でのＣＫの発現と精製 プラスミドｐＫＩＹＯで形質転換した大腸菌ＪＭ１０５
を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地１０ｍｌ
で終夜培養した。この培養液を翌朝５００ｍｌの５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、２時間
培養をした時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシ
ド（最終濃度３ｍＭ）を加え、さらに２〜３時間培養を
続けた。この培養液を遠心分離機にかけて大腸菌を集め
た。なお、培養は３７℃で行なった。集めた大腸菌を、
２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ benzamidineＨＣ
ｌ、２０μｇ／ｍｌ antipain、２０μｇ／ｍｌ chym
ostatin 、２０μｇ／ｍｌ Ｅ−６４ 、２０μｇ／ｍ
ｌ leupeptin 、２０μｇ／ｍｌ pepstatin A の組
成の緩衝液で氷冷下超音波破砕した。

【００６４】菌体破砕液を遠心分離（２００００ｒｐ
ｍ、２０分間）し、上清を得た。これを２０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ
ＰＭＳＦ、２ｍＭ benzamidine ＨＣｌ、１μｇ／ｍｌ
antipain、１μｇ／ｍｌ chymostatin 、１μｇ／ｍ
ｌ Ｅ−６４ 、１μｇ／ｍｌ leupeptin 、１μｇ／
ｍｌ pepstatin A の組成の緩衝液Ｂで平衡化してお
いたＤＥ５２（ワットマン社製 、２ｍｌゲル）のカラ
ムを通した。ゲルを１０ｍｌの２００ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む緩衝液Ａで洗浄した。この洗液を素通りした液
と合せた。このカラムを通過させた液の塩化ナトリウム
濃度を１００ｍＭ以下にし、７５ｍＭ塩化ナトリウムを
含む緩衝液Ｂで平衡化しておいたＱ−セファロース Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム（０．９×１２ｃｍ）に流速
６０ｍｌ／ｈでかけた。１００ｍＭ塩化ナトリウムを含
む緩衝液Ｂ２０ｍｌでカラムを洗い、塩化ナトリウム１
００ｍＭから５００ｍＭの濃度勾配（１００ｍｌ）でＣ
Ｋを溶出した。活性は２つに分離した。塩化ナトリウム
濃度がより低いときに溶出される活性を集めた。なお、
塩化ナトリウムより高い時に溶出される活性は、ＣＫが
かなりプロテオリシスを受けたものである。従って、Ｃ
Ｋ活性をより高収率で回収するためには種々のプロテア
ーゼ阻害剤を試みる必要がある。

【００６５】集めたＣＫ活性をＭＭＡ−アフィニティー
カラム（ゲル６ｍｌ）にかける。ＭＭＡ−アフィニティ
ーカラムは１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで
平衡化しておく。流速２０ｍｌ／ｈでカラムを３０ｍｌ
の２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂ、１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで洗った。続いて、１
００ｍＭ塩化ナトリウムと１００ｍＭ ｃｈｏｌｉｎｅ
Ｃｌを含む緩衝液ＢでＣＫを溶出した。活性は前述の
分光学的手法によって検出した。なお、大腸菌に発現し
たＣＫをＡＦ−ブルートヨパールカラムにかけたとこ
ろ、ＣＫはこのカラムに保持されて塩化ナトリウムで溶
出されたことから、このＣＫはＣＫ−Ｒであることが判
明した。 ｂ．ＭＭＡ−アガロースの有効性 表１はＣＫを発現させた大腸菌からのＣＫの精製を示
す。表２にラットの精巣からのＣＫ−Ｒの精製を示し
た。精製方法は肝臓からの精製と同じ方法で行なった。
ただし、緩衝液はＢを使用した。このアフィニティーク
ロマトグラフィー用ゲルを使用することで容易に高度な
精製が達成された。

【００６６】

【表１】 Ｆ：Ｑ−セファロ−スでは活性が２つに分離する。塩
濃度が低いほうで溶出された活性を示す。

【００６７】

【表２】 Ｐ：ＡＦブルートヨパールカラムを素通りする活性ＣＫ
−Ｐ。 Ｒ：ＡＦブルートヨパールカラムに保持される活性ＣＫ
−Ｒ。 （Ｐ）：ＣＫ−Ｐを1,6-ジアミノヘキサンアガロースで
精製した場合の値。 （Ｒ）：ＣＫ−ＲをＭＭＡ−アガロースで精製した場合
の値。 実施例５ （グルタチンオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋
白質の作製）先に述べたようにグルタチンオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）にＣＫの全部あるいは一部
のペプチド鎖が結合した融合蛋白質は、ＣＫの活性部位
の検索、ＣＫのエピトープの検索、融合蛋白質をアガロ
ースのようなゲルに結合したアフィニティークロマトグ
ラフィー担体を作製してのＣＫのエピトープに対する抗
体の精製、融合蛋白質を免疫することによってＣＫ部分
に対する抗体の作製等に利用することができる。

【００６８】本実施例ではＧＳＴとの融合蛋白質を作製
するためにプラスミドとしてｐＧＥＸ−２ＴとｐＧＥＸ
−３Ｘ（ファルマシア社製）を用いた。これらのプラス
ミドを用いてＧＳＴのＣ末端部分にあるマルチクローニ
ング部位にＤＮＡを挿入し、全部あるいは部分的ＣＫを
コードするＧＳＴ−ＣＫ融合遺伝子を作製した。

【００６９】ＧＳＴとＣＫの融合部分は正しい読み枠に
なっていなければならない。プラスミドのマルチクロー
ニング部位のＢａｍＨＩ部位にＤＮＡ断片を挿入する場
合は、プラスミドｐＧＥＸ−２ＴとｐＧＥＸ−３ＸをＢ
ａｍＨＩで消化後、クレノウフラグメント、あるいはＭ
ｕｎｇ Ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅで処理して平滑末
端にすると、種々の読み枠に対応してＤＮＡ断片を正し
い読み枠で接続することができる。 ａ．ＧＳＴとＣＫの融合蛋白質を大腸菌で発現させるた
めのプラスミドの作製ｉ）ｐＧＣＫ１−４３５の作製 ｐＵＣ１９（Ｌｉ２７９）をＥｃｏＲＩ消化し、ＣＫの
開始コドンを含むフラグメントを調製した。これをＴａ
ｑＩで消化、クレノウフラグメント処理、ＮｈｅＩ消化
し、アガロース電気泳動により（ＴａｑＩ）−ＮｈｅＩ
ＤＮＡフラグメントを得た。ｐＵＣ１９（Ｌｉ２７
９）をＡａｔＩＩ消化し、クレノウフラグメント処理し
た。アガロース電気泳動により、小さいほうのフラグメ
ントを精製した。このフラグメントをＥｃｏＲＩ消化し
て、クレノウフラグメント処理しておいたｐＧＥＸ−２
Ｔとライゲーションした。ＧＳＴ側がＣＫのＮ末端にな
っているプラスミドを選択した。このプラスミドはＳｍ
ａＩとＮｈｅＩで消化し、アガロース電気泳動し、ベク
ター側の長いＤＮＡ断片を得た。これと先に調製してお
いた（ＴａｑＩ）−ＮｈｅＩ断片をライゲーションし
て、ｐＧＣＫ１−４３５を得た。 ii）ｐＧＣＫ２６−４３５の作製 ｐＵＣ１９（Ｌｉ２７９）をＥｃｏ４７ＩＩＩ消化し、
アガロース電気泳動し、小さいほうのＤＮＡフラグメン
トを得た。これを、先にＢａｍＨＩ消化及びクレノウフ
ラグメント処理しておいたｐＧＥＸ−３Ｘとライゲーシ
ョンした。ＧＳＴ側がＣＫのＮ末端になっているプラス
ミドｐＧＣＫ２６−４３５を選択した。 iii ）ｐＧＣＫ７４−４３５、ｐＧＣＫ１０３−４３
５、ｐＧＣＫ１４１−４３５、ｐＧＣＫ１９１−４３
５、ｐＧＣＫ２１２−４３５、ｐＧＣＫ２６３−４３
５、ｐＧＣＫ２９８−４３５、ｐＧＣＫ３８８−４３５
の作製 ｐＵＣ１９（Ｌｉ２７９）をＡａｔＩＩ消化、クレノウ
フラグメント処理し、アガロース電気泳動した小さいＤ
ＮＡ断片を精製した。これを先にＸｂａＩ消化し、クレ
ノウフラグメント処理しておいたｐＵＣ１９とライゲー
ションした。ＣＫのＮ末端がＳａｌＩ側部位にあるプラ
スミドを選択した（ｐＵＣ１９（ＸＫ）ＡＡＳＢ）。ｐ
ＧＣＫ７４−４３５、ｐＧＣＫ１０３−４３５、ｐＧＣ
Ｋ１４１−４３５ 、ｐＧＣＫ１９１−４３５、ｐＧＣ
Ｋ２１２−４３５、ｐＧＣＫ２６３−４３５、ｐＧＣＫ
２９８−４３５、ｐＧＣＫ３８８−４３５を作製するた
め、ＮｈｅＩ、ＮｒｕＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、Ｎａｅ
Ｉ、ＢａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩを
それぞれ用いた。前述の制限酵素でｐＵＣ１９（ＸＫ）
ＡＡＳＢを消化し、平滑末端を生じないものはクレノウ
フラグメント処理し、ついでＫｐｎＩ消化した。アガロ
ース電気泳動により目的のＣＫのペプチドをコードする
ＤＮＡ断片を精製した。

【００７０】ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ消化
して得られたＤＮＡ断片を先にＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ
で消化しておいたｐＧＥＸ−２ＴとｐＧＥＸ−３Ｘにラ
イゲーションした。これらをそれぞれｐＧＥＸ−２Ｔ
Ｓ、ｐＧＥＸ−３ＸＳとした。ｐＧＥＸ−２ＴＳ、ｐＧ
ＥＸ−３ＸＳをＢａｍＨＩ消化し、クレノウフラグメン
トあるいはＭｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ処理
し、ついでＫｐｎＩ消化した。先に、調製しておいたＣ
ＫのｃＤＮＡ断片をアミノ酸コドンのフレームが正しく
なるようにベクター側ＤＮＡを選択してライゲーション
し、目的のプラスミドを得た。 iv）ｐＧＣＫ９３−２９８、ｐＧＣＫ９３−２１０、ｐ
ＧＣＫ２１２−２９８の作製 ｐＵＣ１９（Ｌｉ２７９）をＥｃｏＲＩ消化し、ついで
クレノウフラグメント処理し、アガロース電気泳動でｃ
ＤＮＡの真中の部分のＤＮＡ断片を精製した（Ｅ−Ｅ断
片、ｐＧＣＫ９３−２９８用）。このＥ−Ｅ断片をＢａ
ｌＩ消化し、２つの得られたＤＮＡ断片をアガロース電
気泳動して精製した（Ｅ−Ｂ断片、ｐＧＣＫ９３−２１
０用；Ｂ−Ｅ断片、ｐＧＣＫ２１１−２９８用）。これ
らをＢａｍＨＩ消化し、ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ処理しておいたｐＧＥＸ−２Ｔとライゲーショ
ンし、ＧＳＴ側にＣＫの末端がきているプラスミドを選
択した。 ｖ）ｐＧＣＫ１−２５、ｐＧＣＫ１−７４、ｐＧＣＫ１
−１０２、ｐＧＣＫ１−１８９、ｐＧＣＫ１−２６２、
ｐＧＣＫ１−４０８、ｐＧＣＫ１−４３２の作製 先に調製したｐＧＣＫ１−４３５をＥｃｏ４７ＩＩＩ、
ＮｈｅＩ、ＮｒｕＩ、ＮａｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、平滑末端を生じない場合
はクレノウフラグメント処理した。アガロース電気泳動
してベクター側の長いＤＮＡ断片を精製した。これらに
ユニバーサルトランスレーションターミネーター（ファ
ルマシア社製）をライゲーションして終始コドンを導入
したプラスミドを調製した。

【００７１】目的のＣＫのペプチドをコードしているＤ
ＮＡ断片が正しく接続されていることは、制限酵素地図
の作製と塩基配列の決定によった。

【００７２】なお、以上の各クローンからの融合蛋白質
の有するＣＶの部分を模式的に図１４に示した。 ｂ．大腸菌での発現 それぞれのプラスミドで大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換
した。形質転換菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地で終夜培養し、培養液の５０倍量の５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、２時間培
養したところで、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシドを加え、更に２〜３時間培養を続け、遠心に
よって集菌した。培養は、３７℃出行なった。菌体全て
を２−メルカプトエタノールとラウリル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）とで可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動して蛋白質をナイロン膜あるいはニトロセ
ルロース膜に転写して融合蛋白質を抗体によって検出し
た。結果として、プラスミドを導入した菌すべてで融合
蛋白質が検出された。また、プロテオリシスを受けてい
た。一例として、ｐＧＣＫ１−４３５を導入した大腸菌
から、上述のごとく大腸菌に融合蛋白質（ＧＳＴＣＫ１
−４３５）を合成させた。集めた菌を超音波処理し、２
００００ｒｐｍ、２０分間遠心し、細胞上清を集めた。
これをグルタチオン−セファロース４Ｂ（ファルマシア
社製）にかけた。溶出はマニュアルに従った。すなわ
ち、ゲルをＰＳＢで洗い、５ｍＭのグルタチオンを含む
トリス緩衝液で融合蛋白質を溶出した。ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッティン
グを行ない、蛋白質の検出と抗体を用いた融合蛋白質の
検出を行なった。目的の融合蛋白質の分子量に相当する
蛋白質が検出された。しかし、プロテオリシスを受けて
いる蛋白質も検出されたため、融合蛋白質の目的によっ
ては更に高速クロマトグラフィーなどによって精製する
と良い。

【００７３】実施例６ （ＣＫアイソザイムｃＤＮＡのスクリーニング）動物で
は多くの例でアイソザイムあるいはアイソフォームの存
在が知られている。アイソザイム、アイソフォームはそ
れが発現している細胞の機能や生理状態に対応している
と考えられているので、アイソザイムやアイソフォーム
のｃＤＮＡをスクリーニングしてこれを得ることは、そ
れぞれのアイソザイム、アイソフォームについて、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞出の発現系の開発、それ
ぞれのアイソザイム、アイソフォームに対する特異的な
ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの調製、特異的な抗体の
作製などを通して、脳神経、循環器、消化器、生殖器、
代謝系、癌等の各種疾患の診断及び治療に有効な方法を
提供すると考えられる。

【００７４】スクリーニングに用いたＤＮＡ断片は、図
１〜４の配列のなかのヌクレオチド番号５３５付近のＥ
ｃｏＲＩ部位からヌクレオチド番号１１４９付近のＥｃ
ｏＲＩ部位までのものを使用した。ＤＡＮ断片の³²Ｐで
のラベリングとスクリーニング法は、実施例２の（２ー
３）と同様にして行なった。結果として、Ｌｉ２７９、
Ｌｉ３３６とは異なり更に互いに相違するクローンＬｉ
３２７とＬｉ３３２を得た。これらのラムダＤＮＡから
Ｌｉ３３６と同じようにＳａｃＩとＫｐｎＩでランダム
ＤＮＡを含む形でｃＤＮＡを切り出し、ｐＴＴＱ１９の
ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローニングした。この
クローンＬｉ３２７からのサブクローニングによってプ
ラスミドｐＴＬｉ３２７を得た。これで形質転換した大
腸菌をＵＭ３とした。

【００７５】クローンＬｉ３３２の場合も同様にサブク
ローニングしてプラスミドｐＴＬｉ３３２を得た。これ
で形質転換した大腸菌をＵＭ４とした。

【００７６】なお、これらの形質転換体ＵＭ３、ＵＭ４
は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。 ＵＭ３：寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２４９２、寄託
日：平成３年９月９日 ＵＭ４：寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１２４９３、寄託
日：平成３年９月９日 図１５はこれらの制限酵素地図を比較したものである。
３’側はＬｉ３２７、Ｌｉ３３２ともに、Ｌｉ３３６と
同じ制限酵素地図を示すが、５’側は異なっていた。す
なわち、Ｌｉ３２７、 Ｌｉ３３２とも、Ｌｉ２７９、３
３６とは別個のアイソザイムをコードすると考えられ
る。

【００７７】これらクローンを大腸菌で発現するための
プラスミドを構築し、各ＣＫアイソザイムを発現させ
た。この発現させたＣＫ蛋白質を精製し、抗体の作製に
も用いた。作製された抗体を用いて、ＣＫの免疫測定系
を設定できる。また、抗体を用いて免疫組織化学的検討
も行なえる。また、実施例３におけるｐＵＣ１９（Ｌｉ
２７９）を用いた操作と同様にして、ｐＴＬｉ３２７と
ｐＴＬｉ３３２からＣＫｃＤＮＡを大腸菌発現ベクター
ｐＫＫ２３３−２に移してそれぞれ発現プラスミドｐＫ
ＩＹＯII、ｐＫＩＹＯIII を作製した。これらで大腸菌
ＪＭ１０５を形質転換し、実施例３と同様にして、イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドでＣＫを誘導し、
精製した。

【００７８】実施例７ （抗ＣＫ抗体の精製）大腸菌に発現させて精製したＣＫ
をＣＮＢｒで活性化したアガロース（ファルマシア社
製）にマニュアルに従ってカップリングした。このゲル
を使って実施例１及び６で得た抗血清から抗ＣＫ抗体を
４℃で精製した。なお、用いる抗血清としては、実施例
１の（４）のウサギ抗血清のほか、マウス、マムスタ
ー、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシなどにＣＫ
タンパク質を常法により免疫し、それより得られた抗血
清がある。

【００７９】実験例１ 実施例１の（４）、実施例６及び実施例７で得た抗ＣＫ
抗体を用い、ベクタスティンＡＢＣ法（Ｖｅｃｔａｓｔ
ａｉｎ ＡＢＣ ｍｅｔｈｏｄ、アビジン−ビオチン化
ワサビペルオキシダーゼコンプレックス法、フナコシ社
販売）により各種癌組織・細胞および正常組織・細胞の
免疫組織化学的検索を行なった。すると、肺癌、胃癌、
大腸癌、肝細胞癌、子宮頸部癌、膀胱移行上皮癌、腎細
胞癌、絨毛上皮癌、胎児性癌等の上皮性悪性腫瘍および
悪性繊維性組織腫、神経多形膠芽腫等の非上皮性肉腫な
どがよく染色された。リンフォーマおよびある種の肉腫
は染色されなかった。一方、正常組織細胞はうすくしか
染色されず、抗体の希釈度を高めれば、癌特異的な診断
も可能となる。また、本法によりレトロウイルスでトラ
ンスフォームしたリンパ球細胞ではＣＫが極めてよく発
現していること、一方、非トランスフォーム細胞ではＣ
Ｋが発現していないことがわかり、癌化とＣＫの発現量
の増大とは密接な関連があることがわかった。

【００８０】実施例８ （１）転移ベクターｐＶＬＣＫ−１ バキュロウイルスによるラットＣＫの生産のために、転
移ベクターとしてｐＶＬ１３９２を、相同組換え用とし
てSpodoptera frugiperda SF9 細胞と野生株ウイルスＤ
ＮＡ（ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ）を含むインビトロジェン社
のマックスバック−バキュロウイルス発現システムを利
用した。バキュロウイルスへの導入のための転移ベクタ
ーｐＶＬＣＫ１は、図１３に示す過程によって、転移ベ
クターｐＶＬ１３９２内にラットＣＫ遺伝子を導入して
構築した。

【００８１】まず、ｐＶＬ１３９２をＰｓｔＩで消化
し、クレノウフラグメントで処理して両末端を平滑化
し、次にＢａｍＨＩで消化し、ベクター側の（Ｐｓｔ
Ｉ）−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を得た。次に、実施例２の
（３）項で得た組換えプラスミドｐＵＣ１９（Ｌｉ２７
９）をＡａｔIIで消化し、得られた大小２つのＤＮＡ断
片から電気泳動法によって小ＤＮＡ断片を分離、回収し
た。この小ＤＮＡ断片を、クレノウフラグメントで処理
して両末端を平滑化し、これを、ｐＵＣ１９をＸｂａＩ
で消化した後、クレノウフラグメントで処理して両末端
を平滑化して得たＤＮＡ断片とリガーゼを用いて結合し
た。これを大腸菌ＪＭ１０５にトランスフェクション
し、矢印で示すコーディング方向の正しいプラスミドｐ
Ｂを選択した。なお、この選択は、環状プラスミドを導
入して形質転換された大腸菌からプラスミドを分離し、
その制限酵素地図を作製してプラスミドの構造を確認す
ることで行った。更に、プラスミドｐＢをＳａｌＩで消
化した後、クレノウフラグメントで処理して両末端を平
滑化し、次いでＮｈｅＩで消化し、ベクター側の（Ｓａ
ｌＩ）−ＮｈｅＩＤＮＡ断片を得た。

【００８２】一方、プラスミドｐＵＣ１９（Ｌｉ２７
９）のＡａｔIIでの消化物から電気泳動法によって分離
した小ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化して、得られた３
つのＤＮＡ断片からコーディング領域の最初のＡＴＧを
含む断片を電気泳動法によって分離、回収し、これをＴ
ａｑＩで消化してから、クレノウフラグメントで処理し
て両末端を平滑化し、次いでＮｈｅＩで消化して（Ｔａ
ｑＩ）−ＮｈｅＩＤＮＡ断片を得た。この（ＴａｑＩ）
−ＮｈｅＩＤＮＡ断片と先にプラスミドｐＢから調製し
た（ＳａｌＩ）−ＮｈｅＩＤＮＡ断片とをリガーゼを用
いて結合してプラスミドｐＣを得た。これを大腸菌ＪＭ
１０５にトランスフェクションし、矢印で示すコーディ
ング方向の正しいプラスミドｐＣを選択した。なお、こ
の選択は、環状プラスミドを導入して形質転換された大
腸菌からプラスミドを分離し、その制限酵素地図を作製
してプラスミドの構造を確認することで行った。

【００８３】このプラスミドｐＣをＳｐｈＩで消化後、
クレノウフラグメントで処理して両末端を平滑化し、更
にＢａｍＨＩで消化し、得られたＣＫをコードする断片
を先にｐＶＬ１３９２から得た（ＰｓｔＩ）−ＢａｍＨ
ＩＤＮＡ断片とリガーゼを用いて連結し、転移ベクター
ｐＶＬＣＫ１を得た。 （２）組換え体ウイルスの分離 昆虫細胞（Spodoptera frugiperda SF9 細胞）に、上記
（１）項で得た転移ベクターｐＶＬＣＫ１と野生株ウイ
ルスＤＮＡ（ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ）とを導入し、相同組
換えによって組換え体ウイルスを作らせた。導入から４
〜５日後に培養液から組換え体ウイルスをプラーク法に
より分離した。その際、ラットＣＫ遺伝子が組み込まれ
たウイルスの検出は、ウイルスが感染した細胞からＤＮ
Ａを抽出し、ドットブロット法−ハイブリダイゼーショ
ン法によって行った。

【００８４】また、組換え体ウイルスを有する昆虫細胞
がラットＣＫを生産しているかどうかは、細胞抽出液の
ＣＫ活性を測定すること、あるいは細胞抽出液をドット
ブロットし、実施例１の（４）項でえた抗ＣＫ−Ｐ血清
あるいは抗ＣＫ−Ｒ血清との反応性を試験することで確
認できる。

【００８５】この結果、ラットＣＫを生産している昆虫
細胞からラットＣＫ遺伝子が組み込まれた組換え体バキ
ュロウイルスＡｃＮＰＶ１３９２ＰＲＣＫ１を得た。

【００８６】転移ベクターをかえたりラットＣＫ遺伝子
の挿入部位を種々変化させることで、生産性のより高い
組換え体ウイルスを作製することもできる。

【００８７】なお、上述の実施例３及び４における制限
酵素での処理、リガーゼによるＤＮＡ断片の結合、大腸
菌へのプラスミドの導入、各段階における形質転換体の
選択などの各操作は、公知の方法を用いて行うことがで
きる。 参考文献リスト １．Hosaka, K. et al. 1989. J. Biol. Chem., 264,
4, 2053. ２．Uchida, T. et al. 1990. Biochimica Biophysica
Acta, 1043, 281. ３．Huynh, T. V. et al. 1985. In DNA Cloning : A P
ractical Approach vol.1( D. M. Glover, ed. ) pp49-
78. IRL Press, Oxford. ４．Chirgwin, J. J. et al. 1979. Biochemistry, 18,
5294. ５．Aviv, H. et al. 1972. J. Mol. Biol. 134, 743. ６．Gubler, U. et al. 1983. Gene, 25, 263.

【００８８】

【発明の効果】本発明によれば、ＣＫの新たな知見を得
るために必要な高純度のラットＣＫを分画する技術及び
ＣＫ遺伝子のクローニングに必要な技術を提供すること
ができる。また、本発明によれば、例えば、ラット脳、
ヒト脳神経や肝臓等の各種臓器、ニワトリ、ウズラ等の
肝臓、卵黄、さらには大豆等のレシチン含量の多い食品
として有用な動植物などにおけるＣＫ遺伝子を検出、取
得できる方法を提供することができる。

【００８９】さらに、本発明によれば、ラットＣＫ遺伝
子を各種細胞、微生物等で発現させて、ＣＫを量的に生
産する方法、及びＣＫに対する抗体を調製する方法を提
供することができる。また、本発明によれば、ラット、
ヒト等のＣＫに対する抗体を用いたＣＫの測定方法、Ｃ
Ｋの各組織・細胞内の分布の検出方法、そして脳神経疾
患、肝疾患、癌ほか各種疾患の診断、治療のため、及び
ヒトＣＫ、ヒトＣＫ遺伝子、抗ヒトＣＫ抗体等を用いた
脳神経疾患、肝疾患、癌ほか各種疾患の診断、治療のた
めに必要な技術を提供することができる。

【００９０】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２５４０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ＲＮＡ 起源：ラット肝臓 配列の特徴 特徴を表わす記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２５９．．１５６３ 特徴を決定した方法：Ｅ その他の情報：ラットコリンキナーゼをコードする遺伝
子 配列 CCGCGGCCCA CTACAGCAGT CGCCCGCCGT CAGCCTCCCG CGCTCGTCTC TCGTCACTGC 60 TGCTCGGCGT CCATTGCTGC CTCTCCCCGC AGTCGCCGAC GTCGCTTCCC CGCGCGCTCC 120 CACAACCGCC GCCCCGCCGG TCAGTGAAGC CGGTGAGCCA TTCCCCGCGC CGGCCCCCAG 180 AGGCGGGCAT CCAGCCGGAC CCCGAGTGTG GCCCTCTCCT GCTGTGGCCG TCCGCGCCTT 240 CTCGACCGCT TATCCAGC ATG AAA ACC AAG TTC TGC ACC GGG GGC GAG GCC 291 Met Lys Thr Lys Phe Cys Thr Gly Gly Glu Ala GAG CCG TCC CCG CTT GGG CTG CTG CTG AGC TGC GGT GGC AGC GCT GCC 339 Glu Pro Ser Pro Leu Gly Leu Leu Leu Ser Cys Gly Gly Ser Ala Ala CCG ACG CCC GGC GTA GGG CAG CAG CGC GAT GCC GCA GGC GAG CTG GAG 387 Pro Thr Pro Gly Val Gly Gln Gln Arg Asp Ala Ala Gly Glu Leu Glu TCC AAG CAG CTT GGT GGC CGG TCC CAA CCT CTC GCG CTG CCG CCG CCA 435 Ser Lys Gln Leu Gly Gly Arg Ser Gln Pro Leu Ala Leu Pro Pro Pro CCA CCG CCG CCC CTG CCG CTG CCC CCG CCG CCA TCA CCG CCG CTA GCG 483 Pro Pro Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Leu Ala GAC GAA CAA CCC GCG CCC CGG ACG CGG CGC AGG GCC TAC CTG TGG TGC 531 Asp Glu Gln Pro Glu Pro Arg Thr Arg Arg Arg Ala Tyr Leu Trp Cys AAG GAA TTC CTG CCC GGA GCC TGG AGG GGC CTT CGC GAG GAC CAG TTC 579 Lys Glu Phe Leu Pro Gly Ala Trp Arg Gly Leu Arg Glu Asp Gln Phe CAC ATC AGT GTC ATC AGG GGT GGT CTC AGA AAC ATG CTG TTC CAG TGT 627 His Ile Ser Val Ile Arg Gly Gly Leu Ser Asn Met Leu Phe Gln Cys TCC TTG CCA GAC TCC ATA GCC AGT GTT GGT GAT GAA CCT CGG AAA GTG 675 Ser Leu Pro Asp Ser Ile Ala Ser Val Gly Asp Glu Pro Arg Lys Val CTC TTG CGA CTG TAT GGG GCA ATC TTA AAG ATG GGG GCT GAA GCA ATG 723 Leu Leu Arg Leu Tyr Gly Ala Ile Leu Lys Met Gly Ala Glu Ala Met GTT CTG GAG AGT GTT ATG TTT GCC ATT CTT GCA GAG AGG TCA CTT GGG 771 Val Leu Glu Ser Val Met Phe Ala Ile Leu Ala Glu Arg Ser Leu Gly CCA AAA CTC TAT GGC ATC TTT CCG CAA GGC CGA CTG GAG CAG TTT ATC 819 Pro Lys Leu Tyr Gly Ile Phe Pro Gln Gly Arg Leu Glu Gln Phe Ile CCG AGC CGG CGA TTG GAC ACT GAA GAA TTA TGT TTA CCA GAT ATT TCT 867 Pro Ser Arg Arg Leu Asp Thr Glu Glu Leu Cys Leu Pro Asp Ile Ser GCA GAA ATA GCT GAA AAA ATG GCC ACA TTT CAT GGT ATG AAA ATG CCA 915 Ala Glu Ile Ala Glu Lys Met Ala Thr Phe His Gly Met Lys Met Pro TTC AAT AAG GAA CCA AAA TGG CTT TTT GGA ACA ATG GAA AAA TAC CTG 963 Phe Asn Lys Glu Pro Lys Trp Leu Phe Gly Thr Met Glu Lys Tyr Leu AAT CAA GTA CTA AGA CTT AAA TTC AGC AGG GAG GCC AGA GTT CAA CAA 1011 Asn Gln Val Leu Arg Leu Lys Phe Ser Arg Glu Ala Arg Val Gln Gln CTG CAC AAG TTC CTC TCT TAC AAT CTG CCT CTC GAG CTT GAG AAC CTG 1059 Leu His Lys Phe Leu Ser Tyr Asn Leu Pro Leu Glu Leu Glu Asn Leu AGG TCA TTG CTG CAG TAT ACT AGA TCC CCA GTT GTG TTT TGT CAT AAT 1107 Arg Ser Leu Leu Gln Tyr Thr Arg Ser Pro Val Val Phe Cys His Asn GAC TGT CAA GAA GGT AAT ATC TTA TTG TTG GAA GGC CAA GAG AAT TCT 1155 Asp Cys Gln Glu Gly Asn Ile Leu Leu Leu Glu Gly Gln Glu Asn Ser GAA AAG CAG AAG TTG ATG CTC ATT GAC TTT GAA TAC AGC AGT TAC AAT 1203 Glu Lys Gln Lys Leu Met Leu Ile Asp Phe Glu Tyr Ser Ser Tyr Asn TAC AGG GGA TTT GAC ATT GGA AAT CAT TTC TGT GAA TGG ATG TAT GAT 1251 Tyr Arg Gly Phe Asp Ile Gly Asn His Phe Cys Glu Trp Met Tyr Asp TAT ACC TAT GAA AAG TAT CCT TTC TTC AGA GCA AAC ATT CAG AAG TAT 1299 Tyr Thr Tyr Glu Lys Tyr Pro Phe Phe Arg Ala Asn Ile Gln Lys Tyr CCT ACC CGA AAA CAA CAG CTC CAT TTT ATT TCA AGT TAC TTG ACT ACA 1347 Pro Thr Arg Lys Gln Gln Leu His Phe Ile Ser Ser Tyr Leu Thr Thr TTC CAA AAT GAT TTT GAA AGC CTC AGC AGT GAA GAG CAG TCT GCT ACA 1395 Phe Gln Asn Asp Phe Glu Ser Leu Ser Ser Glu Glu Gln Ser Ala Thr AAA GAA GAC ATG TTG CTT GAA GTC AAC AGA TTT GCC CTT GCC TCT CAT 1443 Lys Glu Asp Met Leu Leu Glu Val Asn Arg Phe Ala Leu Ala Ser His TTC CTC TGG GGA CTT TGG TCC ATT GTA CAG GCC AAG ATC TCA TCC ATT 1491 Phe Leu Trp Gly Leu Trp Ser Ile Val Gln Ala Lys Ile Ser Ser Ile GAA TTT GGG TAC ATG GAA TAT GCC CAA GCC AGG TTC GAT GCC TAC TTT 1439 Glu Phe Gly Tyr Met Glu Tyr Ala Gln Ala Arg Phe Asp Ala Tyr Phe GAC CAG AAG AGG AAG CTT GGT GTG TGA ATGGATGGCT CCACTCTTCA 1586 Asp Gln Lys Arg Lys Leu Gly Val * CCACTGGACT GCAGGAGGTG GCTGCACCAG GCCCTCAGTG GAGCGCTGCT GTGACCACTG 1646 CCCTGGGCAG AAGGCCTGGA CGTCTCACTA CTGAGCACCG ATGTGTATGA TACTACAGAC 1706 TATATTAAAG TGGAGTAACA TTTCTTTCAT CTTTGTTTAC ACTCTCACTA GGACTCTGAA 1766 CCATGATTGG AAGCAGAAAT ATAGTGTGAT AGTGCAATAG CTCAGACCCC GCCTAAGCGG 1826 GAGGCCTTTC AGCTACATGG CTACAGCTTC AGCCACTTAG GCCCCAGCCA GACAGAGCAG 1886 TGCTGTGTGG GTACTGAGTG CTGACTTAGG ATATTAATGT GCTGCAACAC GTTCATGACC 1946 AGGCTTTGAA GGTGACAGTC TGACAATGTG TTGGAGACAC TCTGAAGGGC AAGTGAACAG 2006 ACATACTGTG AAATGGCTCG ACAGGAGGAG CCTGAATTGT GGGGTCTGTG GAGGCAGCCA 2066 GCTGTTTCTG TACAGGGTAC ACTTGACTAT GGGTATGCAT CTGCAGGCAG TAGCTGCAGC 2126 CCTCCTGTGC CTGTGTACAC ATGACTACAG GGGCCAGTGT CACTGACTGG CCATAACTGC 2186 AGTGTCTCCT AACTGGGTGT GCTTTATGCT TCAGCTTCCC GGGGAGGAGC AGTGGAGCCA 2246 GCTTCCTCAC CCCTTCTTGC CTTCTCTCTG CCTGACCTGG AACTTGGGCT TTCGCCCATT 2306 GCCCTCTGAA GCTGCTTCCC ATCTGATGTC ACTGGGAGAC AGCAGCTGTA TGTGTGGGGT 2366 ATTGGGGTGC AGGTAGATTA GAGCTGTGAA ATCCATGTAC ATTAATACCC AATGGGATAA 2426 ACCTAGAATT TTTTTTTTTT TACTCTGAAC TCTGAATTGT TTTGTGCACA TATTTCTGCT 2486 ACCACCGAAA CTGTATTATA CAGATAAATA AACAACTTGA AACTTAAAAA AAAA 2540 配列番号：２ 配列の長さ：４３５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：コリンキナーゼ活性を有する。 配列 Met Lys Thr Lys Phe Cys Thr Gly Gly Glu Ala Glu Pro Ser Pro Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Ser Cys Gly Gly Ser Ala Ala Pro Thr Pro Gly Val 20 25 30 Gly Gln Gln Arg Asp Ala Ala Gly Glu Leu Glu Ser Lys Gln Leu Gly 35 40 45 Gly Arg Ser Gln Pro Leu Ala Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu 50 55 60 Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Leu Ala Asp Glu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Pro Arg Thr Arg Arg Arg Ala Tyr Leu Trp Cys Lys Glu Phe Leu Pro 85 90 95 Gly Ala Trp Arg Gly Leu Arg Glu Asp Gln Phe His Ile Ser Val Ile 100 105 110 Arg Gly Gly Leu Ser Asn Met Leu Phe Gln Cys Ser Leu Pro Asp Ser 115 120 125 Ile Ala Ser Val Gly Asp Glu Pro Arg Lys Val Leu Leu Arg Leu Tyr 130 135 140 Gly Ala Ile Leu Lys Met Gly Ala Glu Ala Met Val Leu Glu Ser Val 145 150 155 160 Met Phe Ala Ile Leu Ala Glu Arg Ser Leu Gly Pro Lys Leu Tyr Gly 165 170 175 Ile Phe Pro Gln Gly Arg Leu Glu Gln Phe Ile Pro Ser Arg Arg Leu 180 185 190 Asp Thr Glu Glu Leu Cys Leu Pro Asp Ile Ser Ala Glu Ile Ala Glu 195 200 205 Lys Met Ala Thr Phe His Gly Met Lys Met Pro Phe Asn Lys Glu Pro 210 215 220 Lys Trp Leu Phe Gly Thr Met Glu Lys Tyr Leu Asn Gln Val Leu Arg 225 230 235 240 Leu Lys Phe Ser Arg Glu Ala Arg Val Gln Gln Leu His Lys Phe Leu 245 250 255 Ser Tyr Asn Leu Pro Leu Glu Leu Glu Asn Leu Arg Ser Leu Leu Gln 260 265 270 Tyr Thr Arg Ser Pro Val Val Phe Cys His Asn Asp Cys Gln Glu Gly 275 280 285 Asn Ile Leu Leu Leu Glu Gly Gln Glu Asn Ser Glu Lys Gln Lys Leu 290 295 300 Met Leu Ile Asp Phe Glu Tyr Ser Ser Tyr Asn Tyr Arg Gly Phe Asp 305 310 315 320 Ile Gly Asn His Phe Cys Glu Trp Met Tyr Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys 325 330 335 Tyr Pro Phe Phe Arg Ala Asn Ile Gln Lys Tyr Pro Thr Arg Lys Gln 340 345 350 Gln Leu His Phe Ile Ser Ser Tyr Leu Thr Thr Phe Gln Asn Asp Phe 355 360 365 Glu Ser Leu Ser Ser Glu Glu Gln Ser Ala Thr Lys Glu Asp Met Leu 370 375 380 Leu Glu Val Asn Arg Phe Ala Leu Ala Ser His Phe Leu Trp Gly Leu 385 390 395 400 Trp Ser Ile Val Gln Ala Lys Ile Ser Ser Ile Glu Phe Gly Tyr Met 405 410 415 Glu Tyr Ala Gln Ala Arg Phe Asp Ala Tyr Phe Asp Gln Lys Arg Lys 420 425 430 Leu Gly Val * 435

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明においてクローニングされたＣＫ遺伝子
を含むｃＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列（配列番号：１）
の一部（５’末端側部分）を示す図である。

【図２】本発明においてクローニングされたＣＫ遺伝子
を含むｃＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列（配列番号：１）
の一部（中間部分）を示す図である。

【図３】本発明においてクローニングされたＣＫ遺伝子
を含むｃＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列（配列番号：１）
の一部（中間部分）を示す図である。

【図４】本発明においてクローニングされたＣＫ遺伝子
を含むｃＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列（配列番号：１）
の一部（３’末端側部分）を示す図である。

【図５】図１〜４に示したＣＫをコードする領域に対応
するアミノ酸配列の前半部分（Ｎ末端側）のみを取り出
した図である。

【図６】図１〜４に示したＣＫをコードする領域に対応
するアミノ酸配列の後半部分（Ｃ末端側）のみを取り出
した図である。なお、図１〜６において、直線、波線、
点線、二重線のアンダーラインを引いた領域は酵母ＣＫ
と相同性の高い領域を示す。

【図７】（Ａ）及び（Ｂ）は、図１〜６に示した酵母Ｃ
Ｋと相同性の高い領域の具体的なアミノ酸の比較図であ
る。（Ａ）は直線アンダーライン領域における比較図、
（Ｂ）は波線アンダーライン領域における比較図であ
る。

【図８】（Ａ）〜（Ｃ）は、図１〜６に示した酵母ＣＫ
と相同性の高い領域の具体的なアミノ酸の比較図であ
る。（Ａ）は点線アンダーライン領域における比較図、
（Ｂ）及び（Ｃ）は二重線アンダーライン領域における
比較図である。なお、以上の図７、８においてａ列は酵
母のＣＫの、ｂ列はラットのＣＫに、ｃ列は酵母トラン
スポートタンパク質の比較領域を示し、また、「＊」は
同一のアミノ酸の存在を、「・」は類似のアミノ酸の存
在を示す。更に、図７、８においてのアミノ酸配列にお
けるアルファベットは以下のアミノ酸を示す。 Ａ：Ａｌａ Ｃ：Ｃｙｓ Ｄ：Ａｓｐ Ｅ：Ｇｌｕ Ｆ：Ｐｈｅ Ｇ：Ｇｌｙ Ｈ：Ｈｉｓ Ｉ：Ｉｌｅ Ｋ：Ｌｙｓ Ｌ：Ｌｅｕ Ｍ：Ｍｅｔ Ｎ：Ａｓｎ Ｐ：Ｐｒｏ Ｑ：Ｇｌｎ Ｒ：Ａｒｇ Ｓ：Ｓｅｒ Ｔ：Ｔｈｒ Ｖ：Ｖａｌ Ｗ：Ｔｒｐ Ｙ：Ｔｙｒ

【図９】（Ａ）は抗ＣＫ−Ｐ血清によるＣＫ−Ｐ及びＣ
Ｋ−Ｒの阻害活性を示すグラフ、（Ｂ）は抗ＣＫ−Ｒ血
清によるＣＫ−Ｐ及びＣＫ−Ｒの阻害活性を示すグラフ
である。

【図１０】クローンＬｉ３７、Ｌｉ２７９、Ｌｉ３９９
の比較図である。

【図１１】ラットＣＫと酵母ＣＫのドット マトリック
ス アナリシスの結果を示すグラフである。

【図１２】組換えプラスミドｐＫＩＹＯの構築過程を示
す図である。

【図１３】プラスミドｐＶＬＣＫ１の構築過程を示す図
である。なお、図１２、１３において、制限酵素名が括
弧内に示されている末端は、括弧内の制限酵素で切断さ
れた後にクレノウフラグメントによって平滑化された末
端を示し、黒枠はラットＣＫをコードする領域を示し、
矢印は該領域でコードされるＣＫのＮ末端からＣ末端へ
の方向を示す。

【図１４】各種ＧＳＴ−ＣＫ融合蛋白質におけるＧＳＴ
に融合させたＣＫ部分の位置を示す図である。なお、横
軸はＣＫ全アミノ酸配列におけるアミノ酸番号を示す。

【図１５】コリンキナーゼアイソザイムのｃＤＮＡの制
限酵素地図の比較図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｔ 7831−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 8413−4Ｃ Ｄ 8413−4Ｃ 39/395 Ｐ 8413−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第１図に示すアミノ酸配列を有すること
   を特徴とするラットコリンキナーゼ。
2. 【請求項２】 ラットコリンキナーゼをコードすること
   を特徴とするＤＮＡ塩基配列。
3. 【請求項３】 ラットコリンキナーゼのエピトープをコ
   ードすることを特徴とするＤＮＡ塩基配列。
4. 【請求項４】 請求項１または２のいずれかに記載のＤ
   ＮＡ塩基配列の全部もしくは一部を有することを特徴と
   する単離ＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の単離ＤＮＡ断片をベク
   ターに組み込んでなることを特徴とする組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項４に記載の単離ＤＮＡ断片をベク
   ターに組み込んでなる組換えＤＮＡで宿主を形質転換し
   て得られることを特徴とする形質転換体。
7. 【請求項７】 コリンキナーゼをコードするＤＮＡ塩基
   配列から選定されたＤＮＡ塩基配列を有する二種のオリ
   ゴヌクレオチドを調製する過程と、これらのオリゴヌク
   レオチドをプライマーとして、生体由来のＤＮＡのポリ
   メラーゼ チェイン リアクションを行い、コリンキナ
   ーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する過程と、増幅さ
   れたＤＮＡ断片を単離する過程とを含むことを特徴とす
   るコリンキナーゼ遺伝子の単離方法。
8. 【請求項８】 コリンキナーゼをコードするＤＮＡ塩基
   配列から選定されたＤＮＡ塩基配列を有する二種のオリ
   ゴヌクレオチドを調製する過程と、これらのオリゴヌク
   レオチドをプライマーとして、生体由来のＤＮＡのポリ
   メラーゼ チェイン リアクションを行い、コリンキナ
   ーゼ遺伝子の一部を有するＤＮＡ断片を増幅する過程
   と、該増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして、生体由
   来のＤＮＡからコリンキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
   を選択し、単離する過程とを有することを特徴とするコ
   リンキナーゼ遺伝子の単離方法。
9. 【請求項９】 コリンキナーゼをコードするＤＮＡ塩基
   配列から選定されたＤＮＡ塩基配列を有するオリゴヌク
   レオチドを調製する過程と、該オリゴヌクレオチドをプ
   ローブとして、生体由来のＤＮＡからコリンキナーゼ遺
   伝子を含むＤＮＡ断片を選択し、単離する過程とを有す
   ることを特徴とするコリンキナーゼ遺伝子の単離方法。
10. 【請求項１０】 動物のコリンキナーゼに対する抗体を
    含む癌診断薬。
11. 【請求項１１】 ＭＭＡ−アガロースによるアフィニテ
    ィークロマトグラフィーを行う過程を有することを特徴
    とするラットコリンキナーゼの精製方法。