【発明の詳細な説明】
ヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドの細胞外領域ドメイン
発明の分野
本発明は成長因子に対するレセプター、特にヒト血小板由来成長因子レセプター
(hPDGF−R)に関する。より詳しくは、ヒト血小板由来成長因子レセプタ
ーの様々な複合構造体を提供し、これらの構造体はこのレセプターの天然の細胞
外領域において見い出せるリガンド結合性領域を保持している。更に、かかるポ
リペプチドをコードし、典型的には発現のためのプロモーターをも含んで成る組
換え核酸、及び発現した細胞外複合構造体のアミノ又はカルボキシ末端上の融合
ペプチドを提供する。細胞外領域の種々のドメインにおいて含まれているアミノ
酸を含むエピトープを認識する抗体を提供する。
かかるポリペプチド及び核酸を含んで成る細胞、並びにこれらの試薬の診断利用
も提供する。
発明の背景
ポリペプチド成長因子は分裂促進剤(ミトゲン)であり、これは細胞の形質膜の
上にあるレセプターに特異的に結合することにより細胞に作用する。血小板由来
成長因子(PDGF )は生化学応答の種々の群、例えばイオン流出における変
化、様々なキナーゼの活性化、細胞の形状の変化、様々な遺伝子の転写及びリン
脂質代謝に関連する酵素活性の調節を刺激する0例えばBe1lら(1989)
Effects ofPlatelet Factors on Migra
tfon of Cu1tured Bovine Aortic65 : 1
057−1065を参照のこと。
血小板由来成長因子は高等動物、特に温血動物、例えば哺乳動物において見い出
せる。インビトロにおいて、PDGPは間葉起源の細胞、例えば繊維芽細胞、平
滑筋細胞及びダリア細胞のための血清中の主要たるポリペプチドミトゲンである
。インビボにおいては、PDGFは血液の中で通常は自由に循環せず、しかしな
がら循環する血小板のアルファー顆粒の中に貯蔵される。凝血及び血小板接着の
際、通常は損傷した血管の部分においてこの顆粒が放出され、これにより血管の
修復にPDGFは関与する。 pocpは動脈平滑筋細胞の動脈の中間から内側
の層に至る移動を刺激することができ、ここでこの筋細胞は増殖しうる。これが
傷害への初期応答のようである。
PDGFは創傷治癒に、アテローム症に、骨髄増殖病に、そして細胞の癌化形質
転換に関与する遺伝子、特にC−!及びc−b型の刺激にも関連している。
血小板由来成長因子は2本の相同なポリペプチド鎖より成る;これはジスルフィ
ンド連結した16キロダルトンタンパク質の二量体である。これらのポリペプチ
ドには2つのタイプ、即ちB型鎖とA型鎖とがある。この成長因子二量体の3つ
の形態は、2本のA型鎖のホモニ置体、2本のB型鎖のホモニ量体、及びA型鎖
とB型鎖とのへテロニ量体に相当することが見い出されている。これら3通りの
異なる組合せのそれぞれはPDGFイソフオーム(isofor■)と呼ばれて
いる。 PDGFについては、Rossら(1986) The Biolog
y of Platelet−Derived Growth Factor’
Ce1l 46 : 155−169を参照のこと、マウス及びヒトに由来す
る成長因子配列は相同性が高い。
PDGFは血小板由来成長因子レセプター(PDGF−R)に結合することによ
って作用する。このレセプターは典型的には間葉起源の細胞上に見い出せる。そ
の機能的なレセプターは2つのトランスメンブラン糖タンパク質を含んで成る形
態にありながら作用し、それぞれは約180キロダルトンである。2種類の異な
るポリペプチド、B型レセプターポリペプチド及びA型レセプターポリペプチド
が単離されている。
マウス血小板由来成長因子レセプターポリペプチドのB型レセプターポリペプチ
ドの配列はYardenら(1986) Nature 323 : 226−
233に公開されている。A型ヒト血小板由来成長因子レセプター(hPDGF
−R)ポリペプチドの配列はMatsuiら(1989) 5cience 2
43 : 800−803に開示されている。
これらPDGFレセプターは通常3種類の主要な同定可能な領域を有する。第1
はトランスメンプラン(TM)6N域であり、これは形質膜に達すると、細胞に
対して外部のレセプター領域と細胞に対して内部のレセプター領域とを分ける。
第2 fil域は細胞外領域(XR)であり、これはポリペプチド成長因子に結
合するドメイン(即ち、リガンド結合性ドメイン)を含む、第3は細胞内領域(
IR)であり、これはチロシンキナーゼ活性を保有する。このチロシンキナーゼ
活性は、約100個のアミノ酸のインサートを有することで注目に値し、それに
比べてほとんどの他のレセプターのチロシンキナーゼドメインは隣接し合ってい
るか、又は短いインサートセグメントを有する。
ヒl−B型及びヒトA型レセプターポリペプチドの完全配列は他に例えば本明細
書に参考として組入れるU、S、S、N、 07/309.322に報告されて
いる。しかしながら、数多くの目的のため、全長機能性タンパク質より小さい又
は短いものが所望されるであろう0例えば、小さめの分子は折衷循環(comp
ros+1sed circulation) ?+1域をより簡単に標的とす
ることができ、又は注目の様々な活性と無関係のエピトープもしくは外来ドメイ
ンをほとんど示さない、若干改質された活性の範囲又は異なる特異性を有する機
能性類似体は非常に有用であろう。
従って、血小板由来成長因子レセプターポリペプチドに共通する生物学的活性を
示す新規の複合構造体の利用は研究用試薬、診断用試薬及び治療用試薬としての
多大な用途を有するであろう、特に、血小板由来成長因子レセプターポリペプチ
ドの細胞外領域における重要なポリペプチド特性の同定は、このドメインの特定
の特性の置換及び欠失を可能にするであろう、更に、インビトロアッセイ系の利
用は細胞障害性又は膜崩壊性化合物の能力を試験するのに担う。
発明の概要
本発明に従い、改質されたヒト血小板由来レセプターポリペプチドの規定の構造
体を提供する。細胞外領域ドメイン構造体が同定され、そしてこのレセプターセ
グメントの改質及び組合せ配列度えを行う、細胞結合型及び可溶性型の改質セグ
メントの両者は、それらを用いるアッセイに関する方法のために有用にされ、従
ってリガンドl1fR体のスクリーニングを可能にする。
本発明は、細胞外ドメインDI、D2又はD3に由来する1又は複数の血小板由
来の成長因子(PDGF)リガンド結合性領域(LBR)を含んで成る約8〜4
00のアミノ酸の血小板由来成長因子レセプター(hPDGF−R)フラグメン
トを提供し、ここでこのフラグメントは血小板由来の成長因子リガンドに結合す
る。一般に、このフラグメントは約5nM又はそれより優れた結合親和力を示し
、そしてドメインD3システィン内領域に由来する少なくとも約6又は8個の隣
接アミノ酸、好ましくは少なくとも約15個以上の隣接アミノ酸の配列を有する
であろう。このフラグメントは通常トランスメンプラン領域を欠いている。他の
態様において、このフラグメントは可溶性であり、実質的に純粋であり、又はド
メインD3に由来する少なくとも1つのりガント結合性領域を有している。この
フラグメントは例えば表1又は表2に由来する、B型又はA型のPDGF−RL
BRフラグメントに由来しうる。特定のI11様において、このフラグメントは
以下の一般式の群より選ばれる;
a)Xa D@ Xc?
b ) Xa−D+w−XI−On−XC;c ) Xa−Ds−XI−Dn−
X2−Dp−Xc ;及びd ) Xa−ロー−XI−on−X2−Dp−X3
−Dq−Xc ;e ) Xa−Ds+−XI−On−X2−Dp−Xa−Dq
−X4−Dr−Xc ;(ここで、このフラグメントはDI −02−03−0
4−05ではなく;Xa、 Xl、 X2. Xa及びXcのそれぞれは、存在
しているならば、Dドメインを欠くポリペプチドセグメントであり;そしてOs
、 Dn+ Dp及びDqのそれぞれは互いに独立して、Di、 D2. D3
. D4及びDsより成る群から選ばれる)、好ましいフラグメントは以下a)
口l−02−D3又はD3−D4−05;及びb ) DI−02−03−04
又はD2−03−04−05より成る群から選ばれる。
本発明は更に、ドメインD3に由来する少なくとも1つの血小板由来成長因子(
PDGF )リガンド結合性領域(LBR)を含んで成る約10〜350のアミ
ノ酸の可溶性ヒト血小板由来成長因子レセプター(hPDGF−R)を包括し、
ここでこのフラグメントは血小板由来の成長因子リガンドに特異的に結合する0
通常、このフラグメントはドメインD3のシスティン内領域に由来する少なくと
も約15個の隣接アミノ酸の配列を含んで成り、そして約5nM以上の結合親和
力を有している。その他の有用なフラグメント態様は可溶性であり、実質的に純
粋であり、又は例えば表1又は表2に由来する、B型又はA型のPDGF−1?
LBRであろう。
本発明は更に核酸配列を含み、これは前記したポリペプチドフラグメントをコー
ドするものを含んでいる0通常、この核酸配列は、このフラグメントをコードす
る配列に一般に作動連結したプロモーターを含んでいる。
本発明の核酸又はペプチドを含んで成る細胞も包括する。特定の細胞の態様にお
いて、この細胞は哺乳動物細胞であり、そしてしばしば核酸及びこの核酸のタン
パク質発現生成物の両者を含むであろう。
前記の組成物は、天然のPDGF−Rエピトープではなく、記載のPDGF−R
フラグメントのエピトープを認識する抗体を提供する。この抗体は通常モノクロ
ーナル抗体であろう。
本発明はまた生物学的サンプルのPDGFレセプター結合活性を測定するための
方法を提供し、この方法は以下の工程:a)第1の分析において、前記のPDG
F−Rフラグメントの存在下においてサンプルのアリコートをPDGFリガンド
に接触させる;b)第2の分析において、このPDGF−Rフラグメントの非存
在下においてサンプルのアリコートをPDGFリガンドに接触させる;次いでC
)この2つの分析における結合の程度を比較する;ことを含んで成る。ある状況
においては、PDGF−Rフラグメントは細胞又は固相基板、例えばマイクロタ
イター皿に結合しておく。
本発明は更に、生物学的サンプルのPDGFリガンド含有量を測定するための方
法を包括し、この方法は以下の工程:a)第1の分析において、前記のPDGF
−Rフラグメントの存在下においてサンプルのアリコートをリガンド結合性領域
(LBR)に接触させる;
b)第2の分析において、このPDGF−Rフラグメントの非存在下においてサ
ンプルのアリコートをLBRに接触させる;次いでC)この2つの分析における
結合の程度を比較する;ことを含んで成る。一定の態様において、この接触工程
は同時に行う。
図面の簡単な説明
図1は可溶性hPDGF−R細胞外ドメインのオリゴヌクレオチド特異的インビ
トロ欠失突然変異誘発のための手法を示す、これらの構造体の多くは可溶性ペプ
チドであるか、又はそれらの改質されたものでありうる。
利用している略語は:
PR=PDGF−R、インタクト
P =P[1GF−17;細胞外領域
TM=トランスメンプラン
に=キナーゼ
S=シグナル配列、である。
図2は様々な欠失ポリペプチドを発現させるために用いた、pcDL−Sα29
6に由来するプラスミドの構造である。
図3はpcDLα296に由来するプラスミドpBJΔの構造を示す。
Takabeら(1988) Mo1.Ce11.Biol、 8 : 466
−472を参照のこと。
1 、pcDL−5Rα296をXho Iで切断する。
2、ポリリンカー(χhol−Xbal−Sfi I−NotI−EcoRI−
EcoRV−H4ndlff−C1a 1−5al I )をXho Iで切断
したベクターに挿入する。
3、 5allはXho 1部位に適合する;従って5all及びXho r部
位の両者を築きあげる。
4、 SV4016Sスプライス連結部はもはや存在していない。
図4はヒトB型PDGFレセプターポリペプチドによるレセプターのリン酸化の
阻害を示す、リン酸化チロシンに結合する試薬によるラベル化は、このレセプタ
ーポリペプチドフラグメントの存在下においてリン酸化活性が減少することを示
す。
好ましい態様の詳細な説明
■、一般的な説明
A、 PDGF−R
1、構造の特徴
a、細胞外ドメイン(XR)
i、シグナル配列
ii、Dドメイン(Ig一様)
b、トランスメンプランセグメント(TM)C9細胞内ドメイン(IR)
2.11能
a、結合リガンド(PDGFI[似体)b、チロシンキナーゼ活性
c、 PDGF−Rペプチドへの結合(二量体形成)d、リン酸化セグメント
B、生理学的機能
1、細胞
2、組織分化
3、有機体
■、ポリペプチド
2、システィン残基
B、可溶性型、細胞外領域
C1省略型/欠失型
り、融合タンパク質
E、遺伝子変異体(部位特異的突然変異誘発化)F、タンパク質を含んで成る組
成物
■、核酸
A、単離した核酸
B9組換核酸
C0核酸を含んで成る組成物
IV、PDGF−R構造体を作製するための方法A、タンパク質精製
1、誘導化PDGFとの親和力
2、欅々なリガンド、同一のレセプターB、核酸の発現
C1合成方法
■、抗体
■、利用のための方法
A0診断用
B、治療用
■、一般的な説明
A、血小板由来成長因子レセプター(PDGF−R)ヒト血小板由来成長因子レ
セプター(hPDGF−R)は典型的には2つのポリペプチドを含んで成る。同
一であるか又は若干のみ異なることのあるこれらのポリペプチドはリガンドの結
合の機能的活性及びリガンド結合シグナルの細胞への変換(transduci
ng)の際に関与する。
この血小板由来成長因子レセプターは、グリコジル化された約180キロダルト
ンのタンパク質の主要成分を有するものとして同定されている。この糖タンパク
質は血小板由来成長因子レセプターポリペプチドとして同定されている。ポリペ
プチドの2つの相同な形態の一次構造が報告されている。B型レセプターの核酸
及びマウスに由来するその対応のポリペプチド配列はYardenら(1986
) Nature 323 :226−232において報告されており;そして
相同性遺伝子配列がヒトから単離されている。 U、S、S、N 07/309
,322を参照のこと、ヒトA型レセプター配列がMatsuiらC1989)
5cience 243 : 800−803に報告されている。これらのレ
セプターポリペプチドの2つの異なる形態が相同性であるにもかかわらず、それ
らは2の別々の遺伝子によりコードされる。
機能的なレセプターは明らかにこれらのポリペプチドの二量体、即ちB型レセプ
ターポリペプチドもしくはA型レセプターポリペプチドのホモニ量体のいづれか
、又はB型レセプターポリペプチドとA型レセプターポリペプチドのへテロニ量
体を含んでいる。このレセプターのこのような形態、即ちA^、 8B又はAB
形態(マウスもしくはヒトのいづれか、又は可能としてその他の哺乳動物に由来
する)の結合特異性は血小板由来成長因子(POGF)の種々の形態のそれぞれ
に対して異なる。
PDGF−Rは近縁レセプターの科(ファミリー)の構成員である0例えばYa
rdenら、前掲を参照のこと、かかるレセプターポリペプチドのそれぞれは疎
水性膜に広がる領域(膜透過のためのTM) 、規則的な間隔の開いたシスティ
ン残基を有する大きな細胞外領域(XR)、及び細胞内チロシンキナーゼ活性を
有する細胞質の細胞内領域(IR)を有している。PDGF−RのXllは5つ
のβ饋に富む免疫グロブリン(Ig)樟ドメインを含む推定構造を有する。
これらのIgtlドメインのそれぞれは約100個のアミノ酸より成り、より詳
しくは約88〜約114個のアミノ酸に範囲し、第4ドメインを除き、規定的な
間隔の開いたシスティン残基を含む、マウス及びヒト型のPDGF−Rを含む種
々の成長因子レセプターの構造的特徴の多くは相同性である。従って、本明細書
で規定する構造的特徴の多くはその他の近縁タンパク質に共有されている。しか
しながらほとんどの場合、特定の構造的特徴についての機能との関係はわかって
いない。
細胞内領域(IR)はトランスメンブラン(TM)セグメントにカルボキシ近位
するPDGF−Rのセグメントである。この細胞内領域はある程度、スプリント
チロシンキナーゼ構造ドメインの存在により特徴付けられている。ヒ)B型レセ
プターポリペプチドにおいて、チロシンキナーゼドメインは約244個のアミノ
酸であり、約104個のアミノ酸のインサートを有している0表1を参照のこと
、ヒトA型レセプターポリペプチドにおいて、そのドメインは約244のアミノ
酸の長さであり、約103個のアミノ酸のキナーゼインサートを有している。表
2を参照のこと。機能性において、このドメインはある程度、そのチロシンキナ
ーゼ活性によって規定され、これは典型的には細胞外領域において見い出せる結
合部位へのリガンドの結合によって調節され、そして二量体の状態で機能するこ
とが認められている。リン酸化のための基質には、付随のレセプターポリペプチ
ド鎖上の種々のチロシン残基、及びこのレセプターに結合するその他のタンパク
質が含まれる。このチロシンキナーゼドメインは更にある程度、その他のチロシ
ンキナーゼ活性含有タンパク質における類似のドメインに対するその相同性によ
り規定される。 Yardenら(1986)Nature 323 : 22
6−232を参照のこと、三量化レセプター複合体の各IR上セグメントその他
のポリペプチド鎖上の特定のチロシン残基をリン酸化することが認められている
。
ヒトレセプターポリペプチドの各トランスメンプランセグメントは約24又は2
5のアミノ酸の長さであり、そして疎水性アミノ酸残基によって特徴付けられて
いる。これらのセグメントは膜に達するセグメントの特徴的な配列を有している
。ヒトB型レセプターのポリペプチドにおいて、このトランスメンプラン傾城は
およそval (500)からtrp (524)にまで及ぶ約25のアミノ酸
の長さであることが認められており、一方、ヒトA型レセプターポリペプチドに
おいては、このトランスメンプランセグメントはおよそtau (502)から
trp (526)にまで及ぶ約24個のアミノ酸であると認められている0例
えばC1aesson−Welshら(1989) Proc、Natl、Ac
ad、Sci、 USA、 86 : 4917−4921を参照のこと。
ポリペプチド又は核酸は、もしそれが天然のヒト起源に由来する、又は部分的に
由来するなら、「ヒト」配列である0例えば、ヒト細胞に由来する、又はヒト遺
伝子配列によりもとからコードされるタンパク質はヒトタンパク質であろう、更
に、天然のヒトサンプルにおいて見い出せる配列に対する高い類似性を基礎とし
て選んだのなら、又はそれに由来するなら、配列はヒトである。
融合ポリペプチド又は核酸は、自然には互いに連なっていない配列に由来するセ
グメントの融合の結果としての分子である。従って、キメラタンパク質又は核酸
は融合分子である。異種タンパク質は異なる起源に由来するタンパク質である。
B、生理学的機能
PDGF−Rは少なくとも4つの主要な異なる生物学的機能を有することが認め
られた。第1はリガンド、通常はPDGFミトゲンタンパク質又はそれらの類似
体との結合である。これらのりガント及び類似体は作動因子又は拮抗因子として
も働く、リガンド結合性領域(LBR)より成るこのリガンド結合部位は細胞外
領域(XR)の中にある。この機能性レセプターはりガントの結合に応答してシ
グナルを変換せしめ、従って生ずる応答はリガンド調節型活性である。リガンド
はPDGP又はその類似体でありうるため、シグナルは通常PDGF調節型であ
ろう。
第2生物活性はチロシンキナーゼ酵素活性に関連する。この活性は典型的にはり
ガント結合に応答して細胞内的に活性化される。しかしながら、これらのレセプ
ターは明らかに二量体状態で機能するため、鎖間結合相互作用が第3の生物学的
活性と考えられ、これはブロッキング剤が介在しうる。二量体相互作用、詳しく
は機能性リガンド結合又はチロシンキナーゼ活性のブロッキング又は干渉は、レ
セプタータンパク質フラグメントにより仲介されうる。従って、天然又は他のレ
セプターポリペプチドへのこのレセプタードメインの類似体の導入はりガント仲
介活性のPDGF仲介に影響を及ぼす付加手段として働きうる。
PDGFレセプターの第4の機能は、他のタンパク質、例えばPI3キナーゼに
対する結合性基質としてである。特に、このPDGFレセプターはりガント結合
又はその他の現象に応答して様々な位置にてリン酸化される。この結合相互作用
は、結合性タンパク質の細胞又は代謝応答を更に活性する部分の上の酵素活性を
活性化する。
「リガンド」なる語は、通常血小板由来の成長因子の科の構成員である分子であ
って、リガンド結合性領域(LBR)に結合するものを言う、この結合性領域は
典型的にはXRの中に見い出せる。更に、リガンドは、レセプターが結合する天
然リガンドとして、又はリガンドの機能的類似体のいづれかとして働く分子であ
る。この類似体は作動因子又は拮抗因子として働きうる。典型的なリガンドは天
然PDGFの構造的特徴を共有する分子、例えば類似のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド又はリガンドと分子特性を共有しているその他の分子であろう9分子
がリガンドとして機能するかどうかの決定は、リガンドの結合によって変化する
パラメーター又は応答、例えば二量体又はチロシンキナーゼ活性の測定に依存す
る0例えばGilmanら(編) (1990)並列μn and工山咀1し」
肚」勧1ム遅四山1L旺組Lor Thera eutics、第8版、Per
gamon Press (本明細書に参考として組入れる)を参照のこと。
このレセプターはりガント結合性領域(LBR) 、言い換えればPDGF及び
その類似体のようなりガントの結合の親和力及び特異性の両方を決定するうえで
重要な領域を有している。このリガンド結合性領域はレセプターとりガントとの
結合相互作用を決定する。典型的には、これらの領域はりガント分子とレセプタ
ーとの接点である。これらの分子の相互作用は結晶グラフ技術により、又はレセ
プターのどの領域がリガンド相互作用において重要であるかを調べることによっ
て決定できる。 PDGFレセプターの細胞外領域の様々なセグメントがリガン
ド結合性領域を構成し、一方、その他のセグメントはりガントを適切に結合させ
るようにLBRを適切な配置に立体的に並べる構造セグメントを構成する。
一般に、このフラグメントは少なくとも約6個の隣接アミノ酸、通常は少なくと
も約8個の隣接アミノ酸、より通常には少な(とも約10個の隣接アミノ酸、好
ましくは少なくとも約13個の隣接アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも
約15個以上の隣接アミノ酸の配列を有するであろう0通常、LBRは各Ig様
ドメイン、例えばドメインDI、D2.D3.D4及びD5のシスティン(又は
相当物)内残基内にあるであろう、これらは好ましくはD3配列に由来するが、
DI及びD2に由来する配列も一般的であろう0時折り、D4゜D5又は他のタ
ンパク質に由来する配列がLBI?機能を提供するであろう。
システィン(又は相当物)外領域は構造的機能を、ドメイン間スペーサーセグメ
ントと同様に提供する。システィン内領域又はセグメントは表4及び5に示し、
そしてc、c’ 、c′、D及びEで示すセグメントを、B及びFセグメントと
の一部と共に表示の通り含んで成る。システィン外残基はA及びGで示すセグメ
ント、並びにB及びFの一部を含んで成る。
リガンド結合性領域はある程度、PDGFリガンド結合の親和力に及ぼすその存
在の重要性により、又はその影響によって規定される。
通常の、天然の全長PDGF−Rは約0.2sMのKdで結合する0例えば、D
uanら(1991) J、Biol、Chem、 266 : 413−41
8(本明細書に参考として組入れる)を参照のこと。LBIIは、その存在がリ
ガンド結合に有用な影響を及ぼす、一般には少なくとも2倍、通常は少なくとも
4倍、より通常には少なくとも約8倍、そして好ましくは約12倍以上にするポ
リペプチドのセグメントである。 PDGFリガンドに結合する本発明のフラグ
メントは一般に約10tIM以下、より一般には約1μM以下、通常は約0.1
μM以下、より通常には約10nM以下、好ましくは約1nM以下、そしてより
好ましくは約0.5nM以下のKdで結合するであろう。
エピトープは抗原決定基であり、これは抗体応答を潜在的に又は事実上誘発させ
る。これは抗体結合領域又はその相当物により規定される構造的特徴と呼ばれる
こともある。エピトープは免疫原性である必要はないが、しかしながら抗体分子
又はその相当物のための結合部位として働くであろう。
■、ポリペプチド
表1はヒ)B型車小板由来の成長因子レセプターポリペプチドの一つの対立遺伝
子の配列を開示する。核酸配列及びその対応のタンパク質配列の両方を提供する
。この核酸配列はSeq、ID No、 1に相当する。アミノ酸配列はSeq
、ID No、 2に相当する。相同性のマウス配列がYardenら(198
8)ハture 323 : 226−232に報告されている。マウスのPD
GFレセプターポリペプチドの配列はヒトレセプターポリペプチドの領域、ドメ
イン及びβ−鎖セグメントに共通する構造的特徴も示す、マウスのポリペプチド
、及びその他の近縁のレセプターに由来するものは、類似のドメイン、相同性β
−鎖セグメント及びセグメント間配列、並びに一般的な交換又は置換のための相
同配列の起源として寄与するであろう。
l−土
ヒ)B型PDGFレセプターのポリペプチドの対立遺伝子及びタンパク質の配列
入TG CGG C”1”’r CCに GにT CCG 入〒G CCA C
CT CTG CCCCTCAAA GGCGAG CTCbTC237
Mat krq Lau pro Gly Ala Mat Pro 入1a
Ljlu 入1a Lau Lys Gly GLu La普@シu −LS
TTG CTGTCT CTCC’rに TTA CTT CTC(SM CC
A CAG ATCTCT CAG 11.QCC1にTCP1i8
Lau Lau 5ar Lau Lau Lau Lau Lau Glu
Pro Gin Hls Bar Gln GIYL4u uan 2
C;TCACA CCCCCG GGG CCA GAG CTT CTCCT
CAAT GTCTCC入GC入cc ’rrc cτT Rコ9
Val Thr PL−OPro Gly PrOGlu Lau Val L
au A+!n Val 5@r Sar rhr Ph@ual 19
CTG 入CCTGCTCCCCT 丁CA GCT CCG GTG C,T
G TGG Gk入 CGG ATG TCe c入に G`に )90
Lau Thr Cys Sar Gly Ser Ala Pro Val
tau Trp Glu 入rli Mat Bar Gi氏@Glu 36
CCCCCA CAG GAA 入子c ccc 大入G GCCCAG CA
T eGc Ace TTCTCC入GCCTC(TC44P
Pro Pro Gin Glu Mat 入1a Lys Ala Gin
Asp Gly Thr Ph唸 5ar 5ar Val@Lau 51
ACA CTG ACC大入CC′TCACT にGG CTA GACACG
CGA CAA TACTrT TOCAcCCAC49Q
丁hr Lau Thr Asn XAu Thr Gly しmu 入sp
Thr Gly Glu Tyr Pha eys 丁hr@His 7a
入AT CACTCCCCT ccx c’rc GAに kcc CAT G
AG CGG 大入入 COCCTCTAC^τCTrT5Sコ
入an Asp Sar Arg Gly IJu Glu Thr 入sp
Glu 入i +−Yl’ 入rq Lau Tyr Hl刀@Pha 87
m CCA QAT CCCAce (TG GGCTrCC’TCCCT A
AT GAT GCCGAG CAA CTA TrC59S
Val Pro 入sp Pro Thr Val Gly Ph@ TAu
Pro 入sn Asp 入工a Glu Glu Lau@Pha 104
人Te TTT CTCAC(l GAA ATA ACT GAG 入TCA
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19
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C1n Thr Val Val Arg Gin Gly C1u Asn
工1@τhT: L4u Mat CYS 工1e Va1H1e 206
表1、頁2
表1、頁3
人CCATC入子CTCCCTT 入τCATCC’rCATCATCCTT
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1a Bar Lau Xis 工1m Lau 工l@ Mat Lsu T
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Pro Glu 人rq Thr CYs AQ 入1a Thr IJu エ
エt 入sn GLu Ser Pro Val Lau rar 767
表1、頁4
表1、頁5
表2はヒトA型皿小板由来成長因子レセプターポリペプチドの対立遺伝子の配列
を開示する。核酸配列及びその対応のタンノ々り質配列の両方を提供する。この
核酸配列はSeq、ID No、 5に相当する。アミノ酸配列はSeq、ID
No、 4に相当する。他のヒ)A型対立遺伝子配列はMatsuiら(19
89) 5cience 243 : 800−803に報告されてし為る。
盗−−1
ヒ)A型PDGFレセプターのポリペプチドの対立遺伝子及びタンパク質の配列
表2、頁2
τ入T CGA AGC五人^ Tτ入 入λG CTに 入τCCにT GC
T AAG G入入 G入入 GkCAGT GGCCAT@lコ01
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入1a Val Lye 5ar ’Qr Thr Pha@Glu コB5
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19
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C;T CTG 入CT TrCGeCAAA CTG 1U07
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aly 入rq VaL Thr Ph働 入La Lys@Val 470
表2、頁3
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Gly Lys Val Val Glu Gly Thr@Ala 5119
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Mat Lyll Val 入1a Val Lys M≠煤@ku 606
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ATCr GGA ’L”’1’C入ACCCT CCT fAT 227゜
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Lau Lau 人Sp Lau Lsu 5er PhPl Thr 77
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G にCT TCA AAA 入AT WT GTC(:入b2576
Tyr Gin Val 入1a krq Gly Mat Glu Pha
Lau Ala Ser Lys Asn Cys Val@14is 79コ
表2、頁4
表2、頁5
ポリペプチド又は核酸は、それが組成において対応のポリマーの少なくとも約3
0%、典型的には少なくとも約50%、より典型的には少なくとも約70%、通
常は少なくとも約80%、より通常には少なくとも約90%、好ましくは少なく
とも約95%、そしてより好ましくは少なくとも約98%以上を含んで成るとき
に実質的に純粋又は実質的に精製されている。
細胞外領域の可溶性フラグメントは一般に約400個以下のアミノ酸、通常は約
350個以下のアミノ酸、より通常には約300個以下のアミノ酸、典型的には
約200個以下のアミノ酸、そして好ましくは約150個以下のアミノ酸であろ
う。
A、Dドメイン
数多くの観察に基づき、これらのPDGFレセプターポリペプチドの細胞外領域
(χR)は5つの免疫グロブリン様ドメインを含んで成る。
第1に、そのアミノ配列はIg様ドメイン構造の特徴的な5つのセグメントを含
み、それぞれのセグメントは免疫グロブリンドメインについての適切なサイズを
有している。第4を除く各セグメントは、免疫グロブリン様ドメインの診断特性
である特徴的な間隔の開いたシスティン残基を有している。このレセプターポリ
ペプチド配列は免疫グロブリン様ドメイン構造のその他の特徴、例えば特徴的に
位置したトリプトファン及びチロシン残基の存在を示している。このレセプター
ポリペプチドと、真性免疫グロブリンドメインの対応のセグメントとの直接的な
比較は、PDGFレセプターポリペプチドドメインと免疫グロブリンドメインと
の統計学的に有意な類似性を示した0例えば−illiams (1989)
5cience 243 : 1564−1570を参照のこと。
このレセプターポリペプチドドメインが免疫グロブリンドメインの折りたたみパ
ターンを帯びている説はこのレセプターポリペプチドの推定二次構造を調べるこ
とによって強めることができる。
相同性地図化分析を行うとき、PDGFレセプターポリペプチドは細胞外領域に
おいて5つのIg−mドメインを示し、それぞれのドメインは5、規定されたI
d?!ドメインに統計学的に有意な相同性を示す。
例えば−tlliaasとBarclay (198B ) 劾ル2…、 t■
uno1.郭oches、 6 :381−405を参照のこと。相同の領域は
特に1g様ドメインに対して有意な配列相同性を示し、そしてIg様トドメイン
特徴的な特定の二次及び三次構造のモチーフを示すであろう、このドメイン構造
は好ましくはドメイン構造の境界にほぼ一致する境界を有するようなセグメント
であろう、これらの境界は好ましくは約9個以内のアミノ酸、典型的には約7個
以内のアミノ酸、より典型的には約5個以内のアミノ酸、通常は約3個以内のア
ミノ酸、そしてより通常には1個以内のアミノ酸で一致する0例えばCanto
rとSchimmel (1980)Bfophysical Chemist
r−第1−1[1巻、Freeman and Co、、 5anFranci
sco ; Creighton (1984) Proteins : 5t
ructure and Mo1ec farPrqμ汀土1−es、 Fre
eman and Co、、 New York i並びに―atsonら(1
987)The Mo1eeular Biolo of the Gene、
第1及び第2巻、Benjamir+。
Menlo Park、 Ca1ifornia (それぞれ本明細書に参考と
して組入れる)を参照のこと。
ヒトB型及びヒトA型レセプターポリペプチドの配列は、それらのベーター鎖ト
ポロジーを推定するために分析に付されうる。疎水性配列パターンのフーリエ分
析及びGarnier−Robson計算法(例えばGarnierら(197
8) J、門o1.Bio1.120 : 97を参照のこと)をターンプレデ
ィクタ−プログラム(turn predictor program)と組合
せることは(Cohenら(1986) Bioc側1■u25二266に報告
)、特徴的な構造パターンを提供する。このパターンは上記の通りに分析したと
きに、各ドメインにおいて共通β−鎖セグメントを示す。
PDGFレセプターの最初の2つの1glドメイン、Dl及びD2は約7つのβ
−鎖セグメントであって、アミノ近位からカルボキシ近位の方向に向って挙げて
、A5、B、C,D、E、F及びGセグメントと表示するものを有する3、第3
、第4及び第5のIg様トドメインD3.D4及びD5はC′で表示する追加の
β−鎖セグメントを含むのに十分な長さである。第5ドメイン、D5は種々の重
鎮ドメインと長さにおいて最も近く類似する。B型しセプターポリペプチドD5
は更に、C′で表示する追加のβ−鎖セグメントを含んで成る。
これらの特徴及び表示は、B型及びA型hP[1GF−Rポリペプチドにおける
ドメイン及びセグメントとマウスのB型PDGFレセプターポリペプチドのセグ
メントとの相同性にある程度基づき、そして更に、その他のタンパク質、特にそ
の他の成長因子レセプター上に見い出せるその他の1g様上セグメント対する相
同性に基づ<a csf lレセプター及びc−kitプロト癌遺伝子は類似の
Ig様ドメイン構成を有する。例えば−illiams (1989) 5ci
er+ce 243 : 1564−1570を参照のこと。
ドメイン構造はある程度、近縁のレセプターを含む他のタンパク質において見い
出せる!、様ドメインに共通する特徴を基礎とする。
例えば旧1richとSchlessiger (1990) Ce1l 61
: 203−212 ; YardenとUllrich (198) An
n、Rev、Bjochem、 57 : 443−78を参照のこと。
本明細書で開示する2種類の対立遺伝子に関するドメイン境界を以下に示すが、
しかしながら異なる対立遺伝子はその境界に関して位置が若干異なりうる9表1
4を参照のこと。
■g様ドメイン(mドメイン)は細胞外領域におけるシスティン残基の規則的な
間隔を特徴とする。それぞれが約100のアミノ酸の長さであるこれらの5つの
ドメインはβ−シートに富む構造を有し、免疫グロブリンの可変又は定常領域に
類似する。 Williams (1989)Science 243 : 1
964−1570を参照のこと、天然のXRmドメインアミノ近位ドメインD1
から、XRのカルボキシ近位末端のD5にわたって順に番号付けした。
マウスのB型PDGFレセプターポリペプチド遺伝子のエキソン構造も妥当な適
合度でこのドメイン構造に一致する。イントロンーエキソン構造と機能性単位と
の関係は、この境界がポリペプチドの機能性単位を規定するという仮説を更に裏
付けする0例えば、Williai+sとBarclay (1988) An
n、Rev、lm5uno1.Biochew、 6 : 381−405を参
照のこと、これらの各セグメントについての境界を、本明細書に開示する2つの
対立遺伝子に関する下記に示し、そして類似の境界が配列及び機能的相同性の位
置において、その他の対立遺伝子において見い出せるであろう。
ヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドのアミノ近位1g様ドメインは
Dlで表示した。D1ドメインは、B型レセプターポリペプチドにおいておよそ
Ieu (1)からpro (101)にまで及び、そしてA型レセプターポリ
ペプチドにおいておよそgln (1)からpr。
(101)にまで及ぶ。表14を参照のこと。D1ドメインは明らかに約7つの
β−シートセグメントを有する。
天然のヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドのカルボキシ近位方向に
おける次のIg様トドメインD2で表示した。このD2ドメインはB型レセプタ
ーポリペプチドにおいておよそthr (92)からset (181)にまで
、そしてA型レセプターポリペプチドにおいておよそasp (102)からs
et (189)にまで及ぶ、このD2ドメインはA、B、C,D、E、F及び
Gで表示する約7つのβ−シート鎖も有することが認められている。
天然のヒトPDGFレセプターポリペプチド上に見い出せる第3のIg様トドメ
インD3と表示した。このD3ドメインはB型レセプターポリペプチドにおいて
およそtie (182)がらgly (282)にまで、そしてA型レセプタ
ーポリペプチドにおいておよそglu (190)からgly (290) ニ
まで及ぶ。このD3 FメインはA、B、C,C’ 、D。
E、F及びGで表示する約8つのβ−シート鎖を有することが認められている。
天然のヒトPDGFレセプターポリペプチドにおいて見い出せる第4のIg様ト
ドメインD4で表示した。このD4ドメインはB型レセプターポリペプチドにお
いておよそtyr (283)からpro (384)にまで、そしてA型レセ
プターポリペプチドにおいておよそphe (291)からpro (391)
にまで及ぶ、このD4ドメインは約8つのβ−シート鎖を有することが認められ
ている。D4ドメインは特徴的なシスティン残基を欠き、それらがB型配列にお
いて示すval (306)と■et(364)、そしてA型配列において示す
val (313)とile (371)になっていることに注目すべきである
。
第5のIg様トドメイン1)5で表示した。このD5ドメインはB型レセプター
ポリペプチドにおいておよそval (385)からIys (499)にまで
、そしてA型レセプターポリペプチドにおいておよそset (392)からg
lu (501)にまで及ぶ、B型レセプターポリペプチドのD5はA、B、C
,C’、C′、 D、 E、F及びGで表示する約9つの推定β−シート鎖を有
し、他方、A型レセプターポリペプチドはC#上セグメント欠く約8つのβ−鎖
セグメントのみを有している。
これらのドメインとβ−鎖セグメントとのおよその境界を表14に挙げる。これ
らのセグメントの明らかにされた配列を表4及び5に示す。このレセプターポリ
ペプチドの他の対立遺伝子も、上記のように相同又は構造解析のいづれかによっ
て解析されうる。
! 口 V ジ 51
1 仁 o B m m
= コ ヨ ;3i
摸笥のp1ドメインは前記の+j、 トB型レセプターポリペプチド及びヒトA
型し七ブターポリペブチFの配列である。しかし7ながら、所7の+1ガント結
合機能を保持する適合的なアミノ酸置換、押入及び欠失がなされうる。この機能
は通常適切な構造セグメントの利用による、!、8Rセグメントを正しい方向に
維持することによって保持されるであろう。保存性置換は典型的には以下のグル
ープ内置換を含むニゲリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;ア
スパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン
;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン、A型とB型のレセプ
ターポリペプチド間の、又は別の近縁のレセプターポリペプチド間を含む、種々
のドメイン由来のβ−シートセグメント又はこのセグメントの中間の配列の置換
又は交換が実施されうる。β−上セグメント及びF内の模範のシスティン(ただ
し、B型のDiにおいてはval (306)とset (364) 、そして
A型D4においてはval (313) とile (371))の外側のセグ
メントはそれらの間の残基、例えばC,C’ 、C’、D;及びEのβ−鎖セグ
メントはど重要ではない。更に、これら開示されているセグメントに相同なセグ
メント7、例えば適合性アミノ酸置換、挿入及び欠失されたものが置き代わりう
る。類似のドメイン及びセグメントの起源には、ヒト又はその他の哺乳類に由来
する近縁レセプターポリペプチドが含まれる。非哺乳類レセプターポリペプチド
も有意なる相同性を示しうることがあり、従って類似のセグメントの起源として
寄与しうる。
その他のIg様トドメインびセグメントも置き代わりうる。
本発明は開示した及び記述したセグメント及びドメインとの相同性を示すポリペ
プチドを包括している。これは開示した配列の隣接アミノ酸、典型的には少なく
とも約8個の隣接アミノ酸、より典型的には少なくとも約11個の隣接アミノ酸
、通常には少なくとも約14個の隣接アミノ酸1.より通常に(1大小なくとも
約17個例削tアミノ酸、そして好ましくは少なくとも約21個以上の防接アミ
ノ酸を含んで成る。Lf3R七グメントを保持している構造体が量も有用である
8本発明は更にこれらの配列の改質、例Aば挿入、欠失及び別のアミ、)酸との
置換を含む。大量に又はわずかのいづれかでのグリ」シル化修飾、同様に他の配
列修飾が考えられる。従って、これらのアミノ酸配列を含んで成る改質タンパク
質、例えば類似体は通常その機能又は構造のいづれにおいてこれらのタンパク質
と実質的に同等であろう。
β−シート鎖はペプチド配列における個々の挿入又は欠失によって若干長くする
又は短くしてよい、従って、一定の態様は、β−シート鎖の特定の配列又はそれ
らの鏡開配列に付加又は欠失を行うことにより、若干長めの又は短めの特定のド
メインを有するであろう。
適切なドメイン内及びドメイン間相互作用の保持の構造条件に合うようにセグメ
ントを挿入又は欠失させてよい、特に、このタンパク質の二次及び三次構造を妨
害する変化は好ましくないであろう0例えばCantorとSchimsel
(1990)及びCreighton (1989)を参照のこと。更に、β−
シート鎖の外側及びドメインの間の領域においてアミノ酸又はセグメントを挿入
又は欠失させてよい。典型的には、置換は類似の特性を有するアミノ酸により、
そして付加又は欠失はレセプターの生物学的機能、例えばリガンド結合性を保持
せしめるものの中で選ばれるであろう。
β−シートセグメントの配列は典型的にはヒl−B型ポリペプチド又はヒトA型
ポリペプチド由来の配列と、約50%以上相違せず、より典型的には約39%以
下、通常は約29%以下、そしてより通常には約20%以下で相違する。各ドメ
インの非β−シート鎖それぞれに通しる匹敵の類似性が好ましい。
ドメイン間の境界はある程度、Ig様トドメインおけるドメインに関する定義に
よって規定される。類似のドメインの例は免疫グロブリン及び成長因子レセプタ
ーポリペプチドにおいて見い出せる。
DlとD2iD2とD3iD3とDi;及びDiとD5の間のドメイン境界はほ
ぼエクソン位置に相当しており、このドメイン構造が進化的及び機能的単位に対
応するという仮説を更に裏付ける。例えば1lla tsonら、(1987)
The Mo1ecular Biology of the Gene、第
1及び第2巻、Benjamin、 Menlo Park+ Ca1ifor
niaを参照のこと。
表4及び5に示した配列により示されている通り、D2ドメインはD1ドメイン
に類似な特徴を有している。このドメインの第3セグメント、又はD3も相同性
を示すが、しかしながらCで表示する更なるβ−鎖セグメントを有している。D
4セグメント又はDiは、他のドメインにおいては一般にシスティンに相当する
位置にて非システィン残基を有する。示しているB型対立遺伝子において、その
残基はval (306)及びset (364)であり、一方A型対立遺伝子
においては、その残基はval (313)及びile (371)である、ド
メイン5、又はD5は、共通のシスティン残基及び更なるC′β−鎖セグメント
を有し、そしてB型レセプターポリペプチドは更なるC″β−鎖セグメントを有
している。
本発明はりガント結合性構造体を含んで成る、典型的には実質的に完全なドメイ
ンを含んで成る様々な構造体を提供する。これらの構造体はりガントを結合させ
るための、又はインタクトレセプターポリペプチドを代替するような様々な用途
を有するであろう。例えば、個々のドメインそれぞれは、個々のポリペプチドの
みを含んで成るか、又は別のペプチド、例えばhPDGF−1?のようなレセプ
ターペプチドのT?l及びIR領領域融合されていてよい0例えば表6を参照の
こと。これらの個々の単一ドメインポリペプチドは、これらの特定の)′メイン
に関連する比活性を、好ましくは作動因子又は拮抗因子として、好ましくはイン
タクトレセプターポリペプチド又はXRと共通の特徴を伴って示すであろう、こ
れらのドメインはりガントに結合するのに天然のPI)GPレセプターと競合す
る、PDGF−Rポリペプチドの競合インヒビターとしても働くことが好ましい
0本発明は単一ドメインの繰り返し配列も提供する。@えば、D1ドメイン自体
を提供し、単一ポリペプチドにおけるD 1−D に置体を提供し、Dl−Di
−DI)リブレット反復体も提供する。更に大量のドメイン数に至るまで、数多
くの機能、例えば免疫学特性、種々の天然PDGF−R配列の特色が示されるで
あろう、D2.D3.Di及びD5それぞれの類似体の構造体を、組合せ物と一
緒に提供する0表6.7,8゜9及び10を参照のこと。これらは通常XRの可
溶性フラグメントであるか、又はPDGF−1? TI’lセグメントを含む別
のポリペプチド、好ましくはIR上セグメント伴って融合されていることがある
。
単一ドメイン形態のXRドメイン構造
DI D2 D3 Di D5
二重ドメイン形態のXI?ドメイン構造DI−DI D2−DI D3−DI
Di−DI D5−DIDI−D2 D2−D2 Di−D2 Di−D2 D
5−D2DI−D3 D2−D3 D3−D3 Di−D3 D5−D3DI−
Di D2−Di D3−Di Di−Di D5−D4DI−D5 D2−D
5 D3−D5 Di−D5 D5−D5表−」−
三重ドメイン形態のXRドメイン構造
DI−W D2−W D3−W D4−W D5−WここでWは表2に挙げた2
5通りの可能な組合せのそれぞれであり、この表においては全部で125の要素
が挙げられる。
四重ドメイン形態のXRドメイン構造
DI−X D2−X D3−X D4−X D5−XここでXは表5に挙げる1
25通りの可能な組合せそれぞれであり、この表において全部で625の要素が
挙げられる。
三重ドメイン形態のXRドメイン構造
DI−Y D2−Y D3−Y D4−Y D5−YここでYは表6に挙げる6
25通りの可能な組合せそれぞれであり、この表において全部で3124の要素
が挙げられる。
更に、本発明はドメイン構造間にスペーサー領域を有する類似の構遺物を提供す
る。特に、表4及び5に示すドメインのシスティン内残基に相当する領域が有用
である0例えば、スペーサーポリペプチドを隣接し合うドメインの間に挿入する
か、又は重要なリガンド結合性セグメント、典型的には前記のシスティン内セグ
メント内に見い出せる例えばB、C,C’、C’、D、E及びFβ−鎖セグメン
トの間に間隔を置いてよい、従って例えば、構造D 1−X 1−Dlのポリペ
プチドが提供され、ここでXlはスペーサーセグメントであってDドメインでは
ない。ドメインの順序は逆転させてよく、従って本発明はD2−Di又はD2−
Xi−DIのようなポリペプチドも提供する。詳しくは、ペプチドDi−XI−
D3がDI−D2−D3となる又は包含することを避けるため、非Dドメイン特
色のXlを提供する。
本発明の他の特に好ましい態様は前記の細胞外領域ドメイン構造を、ヒト血小板
由来成長因子レセプターの別のセグメント、特にトランスメンプランセグメント
(TM)及び細胞内領域(IR)と組合されて有するポリペプチドである。従っ
て、本発明はアミノからカルボキシに至る方向において変更した順序の細胞外領
域ドメインを有するレセプターポリペプチド、例えば05−D4−03−02−
Dl−TM−IRポリペプチド、又はある場合には反転した様々なドメインのレ
セプターポリペプチドを提供する。更には欠失したインタクトドメインを有する
レセプターポリペプチド及びそれに更なるドメインが付加されたレセプターポリ
ペプチドを提供する。その例にはDI−02−03−TM−IR又は[1l−0
2−03−04−Tll−IRが挙げられる。特に、表6゜7.8.9及び10
に記載のXR上セグメント有する融合体が好ましい態様である。
Dドメインの改質された組合せは天然レセプターを擬態し、且つ、異なるものと
予測される。この改質ポリペプチドはある態様において、改質された結合親和力
、例えば高いもしくは低い親和力を示すか、又は様々なリガンドもしくはりガン
ト類似体に結合する様々なスペクトラムを示すものと予測されるであろう、これ
らは変化したりガント結合性変換効率又は改質された鏡開結合親和力をも有しう
る。
本発明は血小板由来成長因子レセプター、好ましくはヒトレセプターの様々な機
能を示すのに必要な最少構造特性を決定するための手段を提供する。マウス又は
その他の哺乳動物種において似たような決定が行われうるが、ヒトレセプターが
診断又は治療目的のために典型的に好ましいであろう。
機能的活性、例えばリガンド結合のための最小領域を決定するため、その活性に
ついてのアッセイを開発した。主要のレセプター機能は前記した通り、リガンド
結合、チロシンキナーゼ活性及びレセプターの三量化を含む、これらの分子機能
それぞれについての簡単、且つ、迅速なアッセイが開発できうる。リガンド結合
アッセイは例えばGronwaldら(1988) Proc、Nat’1.A
cad、Sci、 US^85 : 3435−34391Heldinら(1
98B) EMBOJ、 7 : 1387−1393 i及びEscobed
oら(1988)Science 240 : 1532−1534に記載され
ている。レセプター三量化アッセイは例えばYardenとSchlessin
ger (1987) Biochemistr 26 :1434−1442
及び1443−1451に記載されている。
特定の他のタンパク質と相互作用する部位を決定するための他の手段として、例
えばX線結晶学又は2次元N?IR技術が、どのアミノ酸残基が分子接触領域を
成すかの指針を提供するであろう、タンパク質構造決定の詳細な説明については
、例えば本明細書に参考として組入れたBlundel IとJohnson
(1976) Protein Cr 5tallo ra h *Acade
mic Press、 New Yorkを参照のこと拳リガンド結合アッセイ
にはラベル化リガンドの結合又は結合性に関する競合アッセイが含まれる。シグ
ナル変換はりガント結合活性により調節される活性例えばチロシンキナーゼを測
定することにより、又はレセプター構造におけるコンホメーション的もしくは他
の変化の測定によって間接的にアッセイされうる0例えば、レセプターポリペプ
チドに特異的に結合する又はリガンドの結合によってそれから解離する、抗体又
は他の結合性タンパク質が利用されうる。
レセプターの三量化は蛍光消失又は他の光学手段を含む近位(ブロクシミティー
)アッセイによって測定されうる0種々の近位アッセイが知られており、例えば
υl1richとSchlessinger (1990) Ce旦61 :
203−212 ; YardenとSchlessinger (1987)
Biochemistr 26 :14344942及び1443−1451
;を参照のこと(これらは本明細書に参考として組入れる)。
アッセイが開発できたら、ドメイン又は他のセグメント、例えばLBHの様々な
組合せがその活性の影響について試験されうる。競合阻害アッセイはリガンドに
結合できるような構造体を検定しうる。
試験する最初のドメイン構造は通常側々のドメインとし、単独で、又はキメラタ
ンパク質もしくはこのレセプターのTM−IR上セグメント連結させて行う0種
々の対立遺伝子、個りのドメインへの改質、又は関連キメラドメインが試験され
るであろう、欠失及びキメラタンパク質の両方が作製されるであろう。
各ドメインの種々の組合せを作製し、そしてどれが測定活性に影響するかを選ぶ
のに試験する。これらのドメインの反復体、例えばDi−DIを試験すべきであ
る。どの単一ドメインも機能に影響を及ぼさないなら、種々の2重ドメイン構造
、例えばDI−02−TM−Ill。
D2−03−TM−It?、 D3−04−TM−IR及びD4−05−TM−
IRを順に調べる。
表6.7,8.9及び10に挙げる選択した組合せを作製し、そして試験した。
可溶性型を作るため、適当なアミノ末端セグメントを付加するのが通常所望され
、そのいくつかはD1ドメインの中に、又は前駆体型の中に存在していることが
予測されうる。適切な分泌及びプロセシングは種々のアミノ近位特性、例えばシ
グナル配列、及び適切な標的化及びプロセシングに必須な他の特徴に依存しうる
0例えばWatsonら(19B?) The Mo1ecular Biol
四 of the Gene、第1及び2巻、Benjaain、 Menlo
Park、 Ca1iforniaを参照のこと。
一定の機能を調節又はそれに競合するのに特に有効である適切な!=’メインが
選ばれたら、β−鎖セグメントのレベルに至るより詳細な分析を進める。β−鎖
又]よ鏡開セグメントそれぞれの樺ノ・なキメラ、欠失、挿入又は置換構造体を
前記の通りに作り、そして試験する。各!l!i造休は標体の遺伝子工学の方法
、特に合成プライマーを用いる方法によって作れる。かかる因子を利用する手順
は例えばSawbrookら(1989) holecIIlへ1!−9」−9
yIL田1ユj−濃Laborator Manuaユ、第1〜3巻、Co1d
Spring Harbor Press及びAu5ubelら(&W) (
1989)QUμ山上rotoeols in Mo1ecular Blol
o l+ Wileyに記載されている(それぞれ本明細書に参考として組入れ
る)。
B、可溶性型
いくつかの態様において、細胞外領域のみを提供する。従って、トランスメンブ
ランセグメントを有さない細胞外領域全体は、通常可溶性ポリペプチドであろう
。トランスメンプラン領域及び細胞内領域から独立し、従ってそれらを欠(細胞
外領域全体はりガント結合性ペプチドとして働き続けることが示された。特に、
可溶性ポリペプチドDI−D2−D3−D4−D5が種々のPDGFの型に結合
することが実証されている。 PDGFの型に対する結合特異性が、包含されて
いる特定のドメインにある程度依存するにもかかわらず、リガンド結合の特異性
の改質は様々な異なるドメインの置換又はドメインの配置変えによって行われう
る。他の相同性セグメントによる置換、例えば血小板由来成長因子に結合する抗
体のような抗体分子に由来するIg様ドメインを置換することも行われうる。他
方、別の近縁成長因子又はリガンドレセプター、例えばPGFレセプター又は他
のPI)GFレセプター由来のドメインを置換してよい、ドメインの順序も、例
えばD5− D4− D3− D2− DIのように変えてよい。
特に、細胞外構造体にとって通常最も重要である活性はりガントの結合性に関連
する。例えば、ドメインD4及びD5は可溶性細胞外領域P11GF−Rポリペ
プチドのりガント結合性にとって必須ではないことが発見されている。残りのド
メインのうら、もしドメインD3が1′メインD1及びD2から離されているな
ら、構造体D I−D2は低親和力でのみリガンドに結合するが、しかしDiD
2−03構造体は高親和力でリガンドに結合する。
典型的なhP[1GF−111核酸配列は一過性アミノ末端疎水性配列をコード
し、これは通常膜トランスロケーション過程の際に切断される。
シグナル配列の伝統的な機能は発生ポリペプチド鎖を膜結合リポソームに導き、
これにより膜トランスロケーション又は細胞標的化をもたらすことにある。しか
しながら、シグナル配列は典型的にはトランスロケーション過程において除去さ
れるため、シグナル配列は通常成熟タンパク質には存在していない1通常、シグ
ナル配列は本発明の所望の可溶性ペプチドの上流に連結されているであろう。
ポリペプチドの溶解度は環境及びこのポリペプチドに依存する。
温度、電解質環境、このポリペプチドのサイズ及び分子特性、並びに溶媒の性質
を含む数多くのパラメーターがポリペプチドの溶解度に影響する。典型的には、
このポリペプチドを利用する温度は約4°Cから約65゛Cに範囲する0通常、
利用する温度は約18℃以上であり、そしてより通常には約22℃以上である。
治療目的のため、その温度は通常は体温、典型的にはヒトにとって37°Cであ
るが、一定の状況のもとでは、この温度は現場(in 5itu)で、又はイン
ビトロで高められる又は低められうる。
電解質は通常はぼ現場生理学条件であろうが、しかし都合により高い又は低いイ
オン強度に変更されうる。実際のイオンは生理学又は分析学内容物に用いられる
標準緩衝液に合うように改質されうる。
ポリペプチドのサイズ及び構造は実質的に安定で球状であるべきであり、そして
通常は変性状態にない、このポリペプチドは四次構造において他のポリペプチド
と会合し、て例えば可溶性が授けられている。
溶媒は通常、生物活性の維持のために用いられるタイプの生物学的適α性緩衝液
であり、そして通常は生理学的溶媒に近いであろう。
ある場合、典型的には温和な非変性的な清浄剤を加えてよい。
溶解度は通常スベトバーグ(Svedberl )単位において測定され、これ
は特定の条件のもとての分子の沈降速度の尺度である。沈降速度の決定は伝統的
に分析用超遠心機において行われていたが、しかしながら現在は一般に標準の超
遠心機において行われている。
Freifelder (1982) Physical Bjochemis
try (第2版) 、W、H,Freeman及びCantorと5chis
+w+el (1980) Bto h 5teal Chemistr、1〜
3部、讐、)1.Freeman & Co、、 San Francisco
を参照のこと(それぞれ本明細書に参考として組入れる)。おおまかな決定とし
て、「可溶性Jポリペブチ1′を含むサンプルを標準のフルサイズ鰯遠心機の中
で約50krpsで約10分間遠心する。可溶性分子はこの上清液の中に残るで
あろう。可溶性粒子又はポリペプチドは典型的には約30S以下、より典型的に
は約15S以下、通常は約10S以下、より通常には約6S以下、そして特別な
態様においては、好ましくは約4S以下、そしてより好ましくは約3S以下であ
ろう。
本発明は血小板由来成長因子レセプターリガンド結合活性を有する血小板由来成
長因子ポリペプチド及びタンパク質を提供する0本発明のレセプターには表6.
7,8.9及び10に示したようなPDGFレセプターアミノ酸配列が含まれる
。また、相同性配列、対立遺伝子変異体、誘発化突然変異体、択一的に発現した
変異体、及び天然材料より回収したPDGFレセプターコード化核酸に高緊張条
件のもとてハイブリダイズするDNAによりコードされたタンパク質を提供する
。
本発明の血小板由来成長因子レセプターペプチドはドメインD1゜D2.D3.
D4及びD5におけるhPDGFレセプター配列の天然のドメインと少なくとも
約80%の相同性を、典型的にはレセプター配列の天然型と少なくとも約85%
の相同性を、より典型的には少なくとも約90%の相同性を、通常は少なくとも
約95%の相同性を、そしてより通常には少なくとも約97%の相同性を示すで
あろう。
ポリペプチドについての相同性は一般に配列解析ソフトウェア−を用いて決定さ
れる。例えば、5equence Analysts Software Pa
ckageof the Genetics Computer Group、
University of WisconsinBiotechnolog
y Center+ 1710 Ut+1versity Avenue+ M
adison、 Wiscons奄■
53705を参照のこと。タンパク質解析ソフトウェア−は種々の置換、欠失、
置換及びその他の改質に帰する相同性の尺度を利用して類似の配列同志を合わせ
る。1!似の又は相同のLBRセグメントの置換既知の配列において行われるこ
とができ、これにより改質された親和力及びリガンド結合特異性を有する新たな
結合分子が作られる。
種りのその他のソフトウェア−解析プログラムがポリペプチドのコンホメーショ
ン構造を解析せしめることができる。相同なコンホメーションはアミノ酸配列の
適切な挿入、欠失、置換又は修飾によって達成されもする。ドメイン及びβ−鎖
セグメントのコンホメーション構造は部分的にしか理解されていないため、本発
明は開示の配列に対する様々な改質及びその構造特性の保持も包括する。
特に、リガンド結合性機能は細胞外ドメイン、特にLBHに局在すると信じられ
ており、従って可溶性型は好ましくはその特定機能を保持するであろう。PDG
Fレセプターの可溶性フラグメントはインビトロ又はインビボの両方において天
然レセプターの機能を代替するために、又はPDGF結合に関して競合すること
によって妨害する、例えば阻止するために有用であろう、他方、可溶性型はPD
GFレセブタ−ポリペプチドの三量化を妨害することがある。このタンパク質は
通常二量体にある、又はそれにおいて機能する。レセプターの三量化は適切な生
理学的シグナル変換にとって必須であることがあり、そしてフラグメントの導入
はその三量化を阻止することによってこれらの過程を妨害するのに働きうる。
PDGFレセプターポリペプチドは伝統的なタンパク質化学の技術を利用して精
製されうる0例えばDeutscher (W)(1990) Guide t
。
Purification ; Methods in Enzysology
s第182巻(本明細書に参考として組入れる)を参照のこと、他方、レクチ
ンアフィニティークロマトグラフィ一工程、又は特異性の高いりガントアフィニ
ティークロマトグラフィー手順、例えばタンパク質ミトゲンのシスティン残基を
介してビオチンにコンジュゲートされたPDGFを利用するものが利用されうる
。精製PDGFレセプターポリペプチドは、Imamuraら(198B) B
ioche艶Bio h s、Res、cos+sun、 155 : 583
−590ニ記載のように、第一アミノ基を介してPDGFにカップル化された活
性化CH−セファロースを利用するPDGFアフィニティークロマトグラフィー
のような方法によって獲得されうる。
特異的抗体の有用性に応じて、イムノアフィニティークロマトグラフィーを利用
しても特定のPDGFレセプターペプチド構造体が精製されうる。下記の通りに
調製した抗体を不活性基体に固定化させて特異性の高いイムノアフィニティーカ
ラムを作ることができる0例えばHarlowとLane (1990) Mo
noclonal Antibodies : A LaboratorMan
ual、 Co1d Spring Harbor Laboratory(本
明細書に参考として組入れる)を参照のこと。
種々の細胞又は組織が出発材料として選ばれることができ、通常は所望のレセプ
ター構造体又はポリペプチドの大量の発現に基づいて選ばれる。高発現性プロモ
ーター配列、好ましく誘発性プロモーターが組換え配列に作動連結されうる。こ
のプロモーターはそれが配列をプロモートするように作動する場合に作動連結さ
れている。
比較的大量のレセプタータンパク質を含む適切な細胞(PDGFの高親和結合に
より決定)を、PDGFレセプターがポリペプチドの変異体によって形質転換さ
せることができる。これらは欠失又は挿入を有する構造によりPDGFレセプタ
ーの天然型に代わるように利用されうる。
リガンド結合性領域(LBR)又はその他のセグメントは、種々の新しい融合構
造体又はフラグメント間で「スヮップコされうる。従って、セグメントの新たな
組合せを示している新たなキメラポリペプチドが、種々の機能性ドメインの構造
連結により得られうる。所望の、又は改質された特異性を授けるリガンド結合性
領域を、別の機能を有する他のドメインと組合わせてよく、例えば各1g様トド
メイン別の近縁ポリペプチド由来の類似のドメインで置き代えてよく、又は種々
の対立遺伝子もしくは類似のレセプター間でLBRを組合わせてよい。
本発明はまた、レセプターポリペプチドドメインと他の相同性又は異種タンパク
質との融合ポリペプチドを提供する。相同性タンパク質は、類似であるが異なる
成長因子レセプターの融合体であることができ、例えば他の細胞内ドメインを有
する一方のレセプターのりガント特異性を示すバイブリドタンパク質、あるいは
改変アフィニティー又は広いもしくは狭い結合特異性を有しうるレセプターがも
たらされうる。同様に、異種融合体を作製することができ、これは誘導タンパク
質の特性又は活性の組合せを示す、典型的な例はレポーターポリペプチド、例え
ばルシフェラーゼと、レセプターのドメイン、例えばヒト血小板由来成長因子レ
セプターの細胞外領域に由来するりガント結合性ドメインとの融合体であり、こ
れにより、所望のりガントの存在又は位置は容易に決定されうる0例えばDul
lら、米国特許第4,859,609号を参照のこと(本明細書に参考として組
入れる)、その他の遺伝子融合パートナ−には細菌β−ガラクトシダーゼ、tr
pE、プロティンA1β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロ
ゲナーゼおよび酵母α−交配因子が挙げられる0例えばGodowskiら(1
988) 5cience 241 : 812−816を参照のこと。種々の
規定の機能を有する更なる配列が、GenBank (商標)(Nationa
l In5titutes of Health)シーケンスデーターバンクを
介して探索することによって見つけられうる。異種融合タンパク質は天然には互
いに連結しているのが見い出せない配列を含むものである。従って、異種融合タ
ンパク質は2つの類似で相同な配列の融合体でありうる。
融合タンパク質は典型的には、発現を伴う組換核酸法又は合成ポリペプチド法の
いづれかにより作られるであろう、核酸の操作についての技術は一般に、例えば
本明細書に参考として組入れるSamb−rookら (1989)のMo1e
cular C1onin : A Laborator Manual (第
2版)第1〜3巻、Co1d Spring Harbor Laborato
ryに記載されている。ポリペプチドの合成についての技術は例えばそれぞれ本
明細書に参考として組入れる、Merrifield (1963) J、Am
er、Chem、Soc、 85:2149−2456 ; ^theronら
(1989) 5olid Phase Pe tide S nthesi
s:A Practical A roach、 IRL Press+ 0x
ford ;及びMerrifield(1986)Science 232
: 341−347に記載されている。
本発明の融合タンパク質を作るのに利用される組換核酸配列は天然又は合成配列
に由来しうる。数多くの天然遺伝子配列が種々のcDNAより、又は適当なプロ
ーブを用いてゲノムライブラリーより獲得できる0例えばGenBank(商標
) National In5titutes of Healthを参照のこ
と。
血小板由来成長因子レセプター遺伝子を単離するための典型的なプローブは標準
の手順に従った表1及び2の配列から選ばれうる。
適切な合成りNAフラグメントは例えばBeaucageとCarruther
s (1981)Tetra、Letts、22 : 1859−1862に記
載のホスホラミジット法によって調製されうる。二本鎖フラグメントは、相補鎖
を合成し、次いでこれらの鎖を適当な条件のもとでハイブリダイズさせ合うこと
により、又は適当なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を
付加することのいづれかにより獲得できる。
■、核酸
本発明は前述の様々なPDGFレセプター配列をコードする核酸配列を提供する
1表1及び2のそれぞれにはヒ)B型及びA型PDGFレセプターポリペプチド
をコードする対応のcDNA配列が記載されている。
核酸文脈における実質的相同性とは、このセグメント又はその相補鎖のいづれか
が、比較されたとき、適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って適当に並べられ
たとき、少なくとも残基の約60%、典型的には少なくとも約70%、より典型
的には少なくとも約80%、通常は少なくとも約90%、そしてより通常にはヌ
クレオチドの少なくとも約95〜98%同しであることを意味する。適切なヌク
レオチド挿入又は欠失にはドメイン間配列、又はドメインにおけるシスティンの
外側のものが含まれるが、しかしシスティンの組内の配列(又はD4ドメインに
おけるその対応物)が通常保持されていることが非常に重要であろう、構造相同
性とは、少なくとも約14個のヌクレオチドの鎖にわたって少なくとも約55%
、典型的には少なくとも約65%、より典型的には少なくとも約75%、通常は
少なくとも約90%、そしてより通常には少なくとも95%以上ある場合に存在
する。
他方、実質的な相同性はセグメントが特定のハイブリダイゼーション条件のもと
で鎖又はその補体にハイブリダイズするであろう場合に存在し、典型的には表1
又は2に由来の少なくとも約20の隣接ヌクレオチドの配列を用いる。しかし2
ながら、通常は大きめのセグメント、例えば少なくとも約30の隣接ヌクレオチ
ド、より通常には少なくとも約40、そして好ましくは約50以上が好ましい、
ハイブリダイゼーションの選択性は特異性の完全に欠失したものより選択的なハ
イブリダイゼーションが生じたときに存在する。 KanehiSa(1984
) 展哄^cids Res、 12 : 203−213(本明細書に参考と
して組入れる)を参照のこと。
緊張ハイブリダイゼーション条件は通常約1M以下、典型的には約700mM以
下、より典型的には約500mM以下、通常は約40(1wM以下、より通常に
は約300−門以下、そして好ましくは約200mM以下の塩濃度を含むであろ
う、温度条件は典型的には約20°C以上、より典型的には約25°C以上、通
常は約30°C以上、より通常には約37℃以上、そして好ましくは約40℃を
趙え、これは特定の用途に依存する。その他の要因、とりわけ、塩基組成及び相
補鎖の大きさ、有機溶媒の存在、並びに塩基誤対合の程度を含む要因がハイブリ
ダイゼーションの緊張度に有意に影響を及ぼし、パラメーターの組合せはいづれ
かの絶対的手段よりも重要である。
表1及び2に提供するPDGFレセプターコード化配列の配列を基礎としてプロ
ーブを作ることができる。このプローブは標準の方法によって他のPDGFレセ
プター核酸配列を単離するのに利用されうる。
例えばSambrookら (1989) Mo1ecular C1onin
: Laborator迫す旦、第1〜3 S、 C5HPress、 N、
Y、 (本明細書に参考として組入れる)を参照のこと、相同性核酸を利用する
ことにより、その他の類似の核酸が選ばれうる。他方、これらの同−又は類似の
レセプターポリペプチドをコードする核酸を、遺伝コードにおける冗語(red
undancy)を利用して合成又は選別できうる。種々のコドン置換を導入し
てよく、例えばサイレント変化により、種々の常用の制限部位を提供する、又は
特定の系についての発現性を最適化する、例えば最適コドン用語に合わせること
ができる。突然変異を導入して、レセプターの特性を改質させる、おそらくはり
ガントの結合親和力、鏡開親4和力、又はポリペプチドの分解又は代謝速度を変
えることができる。
本発明のIINA組成物はゲノムDNA又はcDNAに由来し、合成により調製
されるか、又は種々の組合せのバイブリドでありうる。天然では連なっていない
配列を含んで成る組換核酸も本発明によって提供する。単離されたDNA配列に
は、プライマーもしくはハイブリダイゼーションによって獲得された、又は制限
酵素等の処理に付された任意の配列を含む。
合成オリゴヌクレオチドはMatteucciら(1981) J、八−、Ch
em、Soc。
103 : 3185に従うトリエステル法により、又は市販の自動オリゴヌク
レオチド合成装置による他の方法によって作られうる。オリゴヌクレオチドは過
剰量のポリヌクレオチドキナーゼによりラベル化されうる(例えば、0.1ナノ
モルの基質に対して約IO単位を、50aMのトリス、pH7,6,5mMのジ
チオスレイトール、lO*MのMgC1□、1〜2mMのATP、 1.7pm
o!eの”P−ATP(2,9a+Ci/wsole)、0.1mMのスペルミ
ジン、0.1sHのEDTAと共に用いる)、プローブはニックトランスレーシ
ョン、フレノウ補完反応、又は当業界に知られるその他の方法によっても作られ
うる0例えばSambrookらを参照のこと。
様々なタイプのcDNA又はゲノムライブラリーが新たな対立遺伝子又は近縁配
列のためにスクリーンに付されうる。 eDNAライブラリーの選択は通常、所
望のレセプターに関するmRNAに冨む組織源に対応する。ファージライブラリ
ーが通常は好ましいが、しかしながらプラスミドライブラリーも利用できる。ラ
イブラリーのクローンをプレート上にまき、スクリーンのための基板に移し、変
性させ、そして所望の配列の存在についてプローブする。
例えば、プラークハイブリダイゼーション手順に関して、バクテリオファージを
含む各プレートをデエプリケートでニトロセルロースフィルター紙(Mtlli
pore−HATF)にレプリケートさせる。ファージDNAを5005MのN
a0)1. 1.5MのNaC1のような緩衝液により約1分間変性させ、次い
で例えば0.5Mのトリス−)1cI、pH7,5,1,5MのNaClで中和
する(3回、各10分づつ)0次にフィルターを洗う、乾かした後、これらのフ
ィルターを一般には、例えば真空オープンの中で80°Cで2時間焼く、このデ
エプリケートフィルターを42°Cで4〜24時間、101/フイルターのDN
^ハイブリダイゼーション緩衝液〔20〜50%のホルムアルデヒド、5×のS
SC,pH1,0,5Xのデンハーツ溶液(ポリビニルピロリドン+フィコール
及びウシ血清アルブミン;1×−それぞれ0.02%〕、501IMのリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH7,0,0,2%のSO3及び50μg/mlの変性サケ
精子DNA)で予備ハイブリダイズさせる。適切なプローブとのハイブリダイゼ
ーションは42°Cで16時間、放射性ラベル化プローブを含む101/フイル
ターのlX10’Cp−/1のDN^(ハイブリダイゼーション緩衝液を用いて
行ってよい。ホルムアルデヒドの最終濃度はプローブの長さ及び所望する緊張度
に従って変える0例えば、ハイブリダイゼーション条件及び配列相同性について
の詳細は、本明細書にそれぞれ参考として組開示したアミノ酸配列に基づ(オリ
ゴヌクレオチドプローブは部位特異的突然変異誘発又は組換え融合もしくは欠失
構造体を作るために利用されうる9例えば好ましいオリゴヌクレオチド因子につ
いては表11及び12を参照のこと、 Kimbelら(1987) Meth
ods in Hnz −molo■154 : 367に記載されているよう
な方法が利用されうる。配列PΔ1からPΔ9はそれぞれSeq、ID No、
6〜14に相当し、そして配列PΔ101からPΔ109はそれぞれSeq、
ID No、15〜23〜に相当する。
表11
ヒ)B型PDGF−R突然変異誘発オリゴマー捷案ヒl−A型PDGP−R突然
変異誘発オリゴマー本発明に従い、PDGF−Rの完全横道配列を実質的にコー
ドする任意の単離化D)iA配列がプローブとして利用できうる。他方、PDG
F−[1疎水性シグナル配列及びその翻訳開始部位をコードする任意のDNA配
列が利用されうる。 PDGF−R活性(例えばリガンド又はPDGF−R結合
性)を示すインタクトドメインを実質的にコードする単離された部分DNA配列
も本発明の一部である。好ましいプローブはPDGFレセプターポリペプチドの
cDNAクローンである。
本発明において用いるDNA配列は通常、インタクトドメイン構造、典型的には
少なくとも約5コドン(15ヌクレオチド)、より典型的には少なくとも約9コ
ドン、通常は少なくとも約13コドン、より通常には少なくとも約18コドン、
好ましくは少なくとも約25コドン、そしてより好ましくは約35コドンを含ん
で成る。1又は複数のイントロンも存在していてよい、この数のヌクレオチドは
通常、PDGFレセプター配列と特異的にハイブリダイズするであろう有効なプ
ローブにとって必要とされるほぼ最小の長さである0例えば、PDGF−Rの特
徴的なエピトープは長いペプチドにおいてコード化されうる0通常、野生型配列
が利用されるであろうが、ある状況においては、l又は複数の突然変異、例えば
欠失、置換、挿入又は反転が導入されうる。これらの改質はアミノ酸配列におい
て変化をもたらすことがあり、サイレント突然変異を担い、制限部位を変える、
又は特定の突然変異を担うことがある。このゲノム配列は通常的200kbを超
えず、より通常には約100kbを超えず、好ましくは約0.5kbより大きく
ないであろう。
PDGFレセプターペプチドをコードするDNA配列に由来する少なくとも約1
0個のヌクレオチドを有するDNA配列の部分、より典型的には少なくとも約1
5個のヌクレオチド、通常は少な(とも約20個のヌクレオチド、より通常には
少な(とも約25個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約30個のヌ
クレオチドのそれが利用されるであろう、これらのプローブは典型的には約6k
b以下、通常は約3.Okb以下、そして好ましくは約1kb以下であろう。こ
れらのプローブは特定のPDGF−RをコードするmRNAが細胞又は種々の組
織の中に存在しているかどうかを決定するためにも利用されうる。
所望の血小板由来成長因子レセプターフラグメントをコードする天然又は合成り
NAフラグメントは通常、インビトロ細胞培養物に導入されて発現されることの
可能なりNA構造体の中に組込む。通常このDNA構造体は単細胞宿主、例えば
酵母又は細菌の中での複製に適するものであろうが、しかしながらゲノムの中へ
の組込みを伴って及び伴わないで、培養哺乳動物の、もしくは植物の又はその他
の真核細胞系に導入することを意図するものであってもよい、ヒト細胞が好まし
い宿主でありうる。高等の真核生物宿主細胞が通常は好ましく、なぜならそのグ
リコジル化及びタンパク質プロセシングパターンはヒトのプロセシングを擬態し
がちであるからである。細菌又は酵母の中への導入のために調製したDNA構造
体は典型的には、宿主により認識される複製系、所望のレセプターポリペプチド
構造体をコードする目的のDNAフラグメント、このポリペプチドコード化セグ
メントに作動連結した転写及び翻訳開始調節配列、並びにこのポリペプチドコー
ド化セグメントに作動連結した転写及び翻訳終止調節配列を含むであろう、この
転写調節配列は典型的には、宿主により認識される異種エンハンサ−又はプロモ
ーターを含むであろう。
適切なプロモーターの選択は宿主に依存するであろうが、しかしながらtrp、
Iac及びファージプロモーター、tRNAプロモーター及び解糖酵素プロモ
ーターのようなプロモーターが知られており、且つ、有用である0例えば5al
brookら(1989)を参照のこと、複製系、並びに転写及び翻訳調節配列
を、血小板由来成長因子レセプターDNA配列に関する挿入部位と共に含む常用
の有用な発現ベクターが採用されうる。細胞系と発現ベクターとの有効な組合せ
例は例えば5asbrookら(1989)に記載されているi Metzge
rら(1988) Nature334 : 31−36 も参照のこと。
これらの細胞のための発現ベクターは、発現コントロール配列、例えば複製起点
、プロモーター、エンハンサ−及び必須のプロセシング情報部位、例えばリポソ
ーム結合部位、RN^スプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終止配列を
含みうる。好ましくは、このエンハンサ−又はプロモーターはこのPDGFレセ
プターポリペプチドをコードする遺伝子に天然に結合しているものであろうが、
しがしながら数多くのケースにおいて他のものが同等又はより適切でありうるこ
とが理解されるであろう、その他の好ましい発現コントロール配列は、ウィルス
、例えばSV40.アデノウィルス、牛バビロマウィルス等に由来するエンハン
サ−又はプロモーターである。
同櫟に、好ましいプロモーターは免疫グロブリン生産細胞において天然に見い出
せるものであるが(例えば、米国特許第4,663.281号を参照のこと;本
明細書に参考として組入れる)、シかしながら、SV40、ポリオーマウィルス
、サイトメガロウィルス(ヒト又はネズミ)並びに種々のレトロウィルス、例え
ばネズミ白血病ウィルス、ネズミ又はラウス肉腫ウィルス及び旧■に由来するL
TR,更にはPI)GF−R遺伝子にとって内因性であるプロモーターを利用し
てよい。
Enhancer and Eukar otic Gene Ex ress
ton (1983) Co1d SpringHarbor Press+
N、Y、 (本明細書に参考として組入れる)を参照のこと。
注目のDNAセグメント、例えばPDGFレセプターポリペプチド遺伝子又はc
DN^DNA配列ベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変わりうるよく知られ
た方によって宿主細胞の中に移し入れることができる0例えば、塩化カルシウム
トランスフェクシッンは原核細胞に一般に利用されており、他方リン酸カルシウ
ム処理が他の細胞宿主にとって利用されうる。一般にはSambrookら(1
989) Mo1ecularり男1」三」−は的」上カヨ(岨虹(第2版)
C5HPress(本明細書に参考として組入れる)を参照のこと、「形質転換
細胞」とは形質転換細胞の子孫も含むことを意味している。
精製ポリペプチドと同様に、リガンド結合性セグメント、細胞外ドメイン及び細
胞内ドメインに関連する核酸配列は特に有用である。
これらの遺伝子セグメントは類似の生物活性を示す新たな遺伝子のスクリーニン
グのためのプローブとして有用であろうが、これらの遺伝子の調節要素も重要で
ありうる。
TV、PDGFレセプターポリペプチド構造体を作るための方法DNA配列はP
DGF−11ポリペプチドを発現させるためにも利用できる。
例えば、約21個のヌクレオチド(約7個のアミノ酸をコードする)から約2.
1kb(約700個のアミノ酸)のDNA配列を、PDGFレセプター特異的活
性、典型的にはリガンド結合性を有するポリペプチドを発現させるのに利用され
うる。特に、リガンド結合性領域を保持する構造体が有用であり、なぜならこれ
らの構造体は結合活性を保有するからである。
特に、PDGF−R核酸配列の遺伝子操作を促進せしめるために種々の合成リン
カ−及びプローブが作製されうる。この構造体をコードする配列の適切な操作に
おいて有用な大量のフラグメント又はセグメントを作るのにポリメラーゼ連鎖反
応(PCR)技術が適用されうる。
例えばInn1sら(1990) PCRProtocols Academi
c Pressを参照のこと。他方、核酸合成装置は、例えば表1又は2に由来
の任意の予備選定配列にハイブリダイズさせるための、又は特定のドメインもし
くはセグメントを配列に付加もしくは欠失させる操作のための、十分に大量のフ
ラグメントを捷供することができる。特に重要なセグメントはLBRであろう。
大量のレセプタータンパク質は、適合性宿主、例えば旦一旦ユ(E、co旦)、
酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は蛙の卵母細胞において、発現媒体の中に含ま
れているレセプター全体又はレセプターの一部を発現させることによって製造さ
れうる。この発現媒体は当業界に周知の方法、例えばリン酸カルシウム沈殿(以
下に詳細)、リボフェクチンエレクトロポレーション又はDEAEデキストラン
形質転換を利用して細胞の中に導入することができる。
通常、哺乳動物細胞は不死化細胞系であろう、 PDGF−R及びその対応のり
ガントの特性を調べるため、PDGFレセプターを欠く、又は低レベルのそれを
有する哺乳動物細胞をトランスフェクト又は形質転換させるのが有用であろう、
好ましくは、シグナル配列はペプチドを細胞膜に導くため、又は分泌させるため
に働きうる。有意な量のPDGFレセプターを欠く細胞にはチャイニーズハムス
ター卵巣(CHO)細胞、はとんどの上皮細胞系及び種々のヒト腫瘍細胞系が含
まれる。
野生型レセプターと機能的に同等であり、従ってPDGF感受性ミトゲン応答を
担うレセプターをコードするDNA配列を含む形質転換又はトランスフェクトさ
れた細胞が選別できる。かかる細胞は様々な更なるPDGFレセプターポリペプ
チドの結合特性の分析を可能にするであろう、トランスフェクト細胞は、PDG
F拮抗因子又は作動因子としての組成物又は薬剤の有効性の評価のためにも利用
されうる。レセプターチロシンキナーゼのレベル又は核酸合成の速さは、トラン
スフェクト細胞を薬剤又はリガンドと接触させ、次いでコントロールに対してこ
の種々のりガント類偵体の効果を比較することによって決定できる。宿主として
利用されている最も一般的な原核細胞はE、コリの株であるが、その他の原核細
胞、例えばバチルススブチリス(Bacillus 5ubtilis)又はシ
ュードモナス(ガJ止1組u)も利用できうる。インタクト構造ドメインを含ん
で成るレセプターポリペプチド、レセプターの一部、又はPDGF−R活性を有
するポリペプチドをコードする配列のフラグメント又は一部を含む本発明のDN
A配列は、PDGF−Rポリペプチド又はPDGF−R活性を有するポリペプチ
ドに関する発現媒体又は構造体を製造するために利用できる0通常、コントロー
ル配列は哺乳動物細胞における発現のためには真核系プロモーターであろう、い
くつかの媒体においては、レセプター自体のコントロール配列も利用できうる。
E、コリを形質転換させるための一般的な原核系プラスミドベクターはρBR3
22又はその誘導体、例えばプラスミドpkt279 (C1ontech)で
ある、 Bolavarら(1977)Gene、2 : 95を参照のこと、
原核系ベクターは転写開始のための原核系プロモーターを、任意的にオペレータ
ーと一緒に含みうる。最も一般的に利用されている原核系プロモーターの例には
ベーターラクタマーゼ(ペニシリナーゼ);ラクトース(lac)プロモーター
(Changら (1977)ハ旦p、198 : 1056を参照のこと);
トリプトファンプロモーター(trp) (Goeddellら(1980)
Nucleic Ac1d Res、、 8:457を参照のこと);P+ プ
ロモーター;及びN−遺伝子リポソーム結合性部位(Shimatakeら(1
981) Nature、292:128−を参照のこと)が含まれる(それぞ
れの文献は本明細書に参考として組入れる)。
酵母に関連して利用されるプロモーターはエノラーゼ遺伝子に由来するプロモー
ター(Hollandら (1981) J、Biol、Chem、 256
: 1385を参照のこと);又は解糖酵素、例えば3−ホスホグリセラーテキ
ナーゼの合成のためのプロモーター(旧tzemanら(1980) J、Bi
ol、Chem。
255を参照のこと)でありうる。
適切な天然でない哺乳動物には、SV40に由来する初期及び後期プ又はネズミ
ム口二一(■uloney)白血病ウィルス、マウス乳癌ウィルス、鳥肉腫ウィ
ルス、アデノウィルス■、生バピロマウィルス又はポリオーマに由来するプロモ
ーターが含まれるであろう、更に、この構造体は増幅遺伝子、例えばジヒドロホ
レートリダクターゼ(DHPR)と連結されてよく、これによりPDGFレセプ
ター遺伝子の多数のコピーが作られうる。例えばKaufmanら(1985)
Mo1.and Ce1l。
Biol、 5 : 1750−1759 ;並びにLevinsonらEPO
公開番号0117059号及び0117060号を参照のこと(それぞれは本明
細書に参考として組人Sci、 USA、 69 : 2110を参照のこと)
;又はPbC1法(Maniatisら(1982)Molecular C1
onin : A Laborator Manual+ Co1d Spri
ng HarborPressを参照のこと)を含む様々な方法によって形質転
換されうる。
法を用いて形質転換されうる。真核細胞に関しては、哺乳動物細胞はリン酸カル
シウム沈殿法(例えば、Graha−とvan der Eb (197B)■
rgjg74.52 : 546)を用いて;又はりポフエクチン(BRL)も
しくはレトロウィルス感染により (例えばG11boa (1983) dM
ani ulation of Gene Ex ression、第9章、A
cademic Pres p、175を参照のこと)トランスフェクトされう
る。適切な配列を含む実際の発現ベクターはリゲーション及び制限酵素を包括す
る標準技術に従って製造されうる0Maniatis前掲を参照のこと、DNA
の特定の部位を切断する市販の制限酵素はNew England BioLa
bs、 Beverly。
Massachusettsより入手できる。
特に、他の遺伝子を伴う同時形質転換が特に有用である0例えば、核酸を他のプ
ロセシング酵素と一緒に発現させることが所望されうる、かかる酵素にはシグナ
ルペプチダーゼ、第三コンホメーシヨンを担う酵素又はグリコジル化酵素が含ま
れる。この発現方法は発現宿主において欠いていることのある、例えば原核発現
系における哺乳動物様グリコジル化のプロセシング機能を担うことができる。他
方、発現のために選ばれる宿主細胞はそのようなプロセシング酵素の天然の発現
に基づいて選ばれうる。
細胞クローンはベクターの作製法に応じてマーカーを利用することによって選別
される。このマーカーは同−又は別のDNA分子上にあってよいが、好ましくは
同一のDNA分子上にある。哺乳動物細胞に関しては、レセプター遺伝子自体が
最良のマーカーでありうる。
原核系宿主においては、形質転換体はアンピシリン、テトラサイタリン又はその
他の抗生物質に対する耐性によって選別されうる。温度感受性又は補助に基づ(
特定の生成物の生産は適切なマーカーとして寄与しうる。 PDGF−Rレセプ
タータンパク質又はペプチドフラグメントを回収及び精製するのに様々な方法が
利用されうる。ペプチドは宿主のリゼートより単離できうる。ペプチドは、もし
分泌されるならば細胞上清液から単離されうる0次にPDGF−Rペプチドを上
記の通り、HPLC,電気泳動又はアフィニティークロマトグラフィー、例えば
イムノアフィニティーもしくはりガントアフィニティーを用いて更に精製する。
PDGF−R関連種のcDN^DNAンを単離するのに利用することのできる他
の方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の利用を包括する0例えば5aiki
ら(1985) 5cience 230 : 1350を参照のこと。この手
法において、PDGF−R配列の別々の領域に対応する2つのオリゴヌクレオチ
ドを合成し、次いでPCR反応に用い、典型的には−RN^起源からレセプター
関連5RNA転写体を増幅させる。オリゴヌクレオチドのアニーリング及びPC
R反応は低い緊張条件のもとで行う、生ずる増幅フラグメントをサブクローンし
、次いで生ずる組換コロニーを5tp−ラベル化全長PDGF−RcDNAによ
り釣り出す、高めではなく、低めの緊張条件のもとてハイブリダイズするクロー
ンばPDGF−R関連−RN^転写体を表わす、この手法は択一的なスプライシ
ングの結果として生ずる変異PDGF−RcDN八種へ単離するのにも利用でき
る。Froh−anら(1988) Proc、Nat’l Acad、Sci
、 USA 85:8998を参照のこと。
■、抗体
様々なPDGFレセプター構造体、レセプターペプチド及びペプチドフラグメン
トに対するポリクローナル及び/又はモノクローナル抗体も製造されうる。ペプ
チドフラグメントはペプチド合成装置で合成的に製造でき、そして担体分子(即
ち、キーホール結合ヘモシアニン)にカップルさせ、次いでウサギに数ケ月にわ
たって注射せしめる。このウサギの血清をPDGPレセプタータンパク質又はフ
ラグメントに対する免疫反応性について試験する。モノクローナル抗体はマウス
にPDGF−Rタンパク質、PDGF−Rポリペプチド又は細胞表層上に高レベ
ルのクローン化PDGFレセプターを発現するマウス細胞を注射することによっ
て作られうる。モノクローナル抗体をELISAによってスクリーンし、次いで
PDGFレセプタータンパク質又はそのポリペプチドとの特異的な免疫反応性に
ついて試験する。 )larlowとLane(1988) Antibodi
es : A 1.aborator Manual+ C3Harbor P
ress(本明細書に参考として組入れる)を参照のこと、これらの抗体はアッ
セイ及び薬品に有用であろう。
十分な量の所望のPDGFレセプターポリペプチド作製体が獲得できたら、この
タンパク質は様々な目的のために利用されうる。典型的な用途はこれらのレセプ
ターの特徴的なエピトープに特異的に結合する抗体の生産にある。これらの抗体
はポリクローナル又はモノクローナルであることができ、そしてインビボ又はイ
ンビトロ技術により生産されうる。
ポリクローナル抗体の製造のため、典型的にはマウス又はウサギである適切な標
的免疫系を選ぶ、実質的に精製された抗原を動物にとって適切である方法及び免
疫学者によく知られる他のパラメーターにより決定される状況においてこの免疫
系に提供する。注射のための典型的な箇所は足の裏、筋肉内、腹腔内又は皮肉に
ある。むろん典型的には哺乳動物、しかし可能としては鳥類又はその他の動物の
ような他の種がマウス又はウサギの代わりになることができる。
免疫学的応答は通常イムノアッセイによっ°Cアッセイされる0通常、かかるイ
ムノアッセイは例えば抗原が生産されたのと同一の細胞により及び同一の状況に
おいて生産された抗原の起源のある程度の精製を包括する。イムノアッセイはラ
ジオイムノアッセイ、酵素結合アッセイ(ELISA) 、蛍光アッセイ、又は
数多くの選択のうちのいづれかあってよく、はとんどは機能的に同等であるが、
特定の条件のもとて特定の利点を示しうる。
少なくとも約10’M−’、好ましくは10@、 10”又はそれより高い親和
力を有する抗体は、例えば本明細書に参考として組入れる!(arlo@とLa
ne (198B)^ntibodies : A Laborator Ma
nual、 C3HPresSi又はGoding (1986) Monoc
lonal Antibodies : Prjnci 1eand Prac
tice (第2版)^cadesic Press、 New Yorkに記
載の標準手法によって作られるであろう、簡潔すると、適当な動物を選び、そし
て所望の免疫プロトコールを続ける。適当な期間の後、かかる動物肺臓を切り出
し、そして個々の肺臓細胞を典型的には不死化ミエローマ細胞に適当な選択条件
のもとで融合させる。その後、これらの細胞をクローン選別し、次いで各クロー
ンの上清液を抗原の所望の領域に対して特異的な適切な抗体のその生産性につい
て試験する。
他の適切な技術には、リンパ球の抗原性ポリペプチドへの試験管内側し又はそう
でなければファージもしくは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選別
が包括される。本明細書に参考として組入れるHuseら”Generatio
n of a Large Combjnatorial Libraryof
the Imsunoglobulin Repertotre in Ph
age Lamda″ 5cience246 : 1275−1280198
9)を参照のこと0本発明のポリペプチド及び抗体は改質を伴って又は伴わない
で利用されうる。しばしば、このポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナル
を提供する物質を共有的又は非共有的のいづれかによって連結せしめることによ
ってラベル化されるであろう、広範囲にわたる種々のラベル及びコンシュゲージ
ロン技術が知られており、そして科学及び特許文献の両方にかなり報告されてい
る。適当なラベルには注射性核種、酵素、基質、補体、インヒビター、蛍光物質
、ケミルミネツサー、磁粒子等が含まれる。かかるラベルの利用を教示する特許
には、米国特許第3、817.837号;第3,850,752号;第3.93
9,350号;第3,996.345号;第4,277.437号;第4,27
5,140号;及び第4,366.241号が含まれる。
更に、組換免疫グロブリンも製造されうる。 Cabillyの米国特許第4.
816,567号を参照のこと。
特に注目の抗体はりガント結合性領域に対して発生させたものである。これらに
はリガンドとして機能するいくつかの抗体が含まれるであろう。あるいは、抗体
は改質レセプターにとってのりガントとして働きうる化合物について選択するた
めに利用されうる0例えばMeyer(1990) Na旦re 347 :
424−425 ;及びPa1nら(1990) Nature347 : 4
44−447を参照のこと;それぞれ本明細書に参考として組入れる。
■、利用方法
本発明は、血小板由来成長因子レセプター(PDGF−R)ポリペプチドの精製
方法及び細胞内でP[lGFレセプターを合成するための方法を提供する。更に
、これらの方法によって製造した相同レセプター、このレセプター又はこのレセ
プターの一部をコードする核酸配列、並びにこれらの配列を含む発現担体、PD
GFレセプターを含んで成る細胞、及びこのレセプターに対する抗体を提供する
。特に、本発明は、ドメインの組合せの配置変えされたレセプター様タンパク質
の結合性及びその他の活性をアッセイするための方法を提供する。
ヒトB型PDGFレセプタータンパク質の細胞外ドメインはレセプター活性アフ
セイにおいてPDGF BBリガンドを効果的に結合させるために利用される。
NIH3T3細胞結合化PDGFレセプターに対するPDGF BBリガンドの
結合性を測定した。リガンドの結合は細胞に結合したレセプターのリン酸(活性
)をもたらす、レセプターのリン酸化は多段プロセスで追尾され、これは第1に
NIH3T3細胞の可溶化及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
での細胞抽出物の電気泳動による細胞タンパク質の分離を包含する。ゲルをニト
ロセルロース上にプロットし、次いでリン酸化PDGFレセプターの検出を補助
するために抗ホスホチロシンモノクローナル抗体で処理する。モノクローナル抗
体は、このアッセイの最終段階にて導入する抗体結合化125−1プロテインへ
のオートラジオグラフィーを介して識別化させる。
もしヒトB型レセプタータンパク質(PDGF BBリガンドに対して約60倍
モル過剰)をリガンドと1時間、NIH3T3細胞とのインキュベーション前に
予備インキュベートしたら、細胞結合化PDGFレセプターのリン酸化はない、
このことは、ヒトB型PDGFレセプタータンパク質が溶液の中でPDGF B
Bリガンドと結合し、そしてリガンドが細胞結合化PDGFレセプターを活性化
するのを妨害することを示唆する。
従って、LB)lを含むポリペプチドは正常なPDGF応答をブロックする。
本発明の構造体を含むドメインは診断及び治療薬として有用であろう。このレセ
プターポリペプチドはりガントを検出又は結合せしめるためのアフィニティー試
薬として、及びレセプター様タンパク質と相互作用する、例えばレセプタータン
パク質の三量化に影響を及ぼすものとして利用されうる。このポリペプチドは、
レセプター又はそのフラグメントに結合する他のタンパク質を検出又は精製する
ための試薬としても有用であろう。
このレセプターポリペプチドはその他の試薬、例えば改質レセプターに固有の結
合性エピトープに特異的な抗体を作るうえでの用途も見い出せるであろう、特に
、新たに作ったりガント結合決定セグメントに対して発生せしめた抗体はこの改
質レセプターのためのりガントとして寄与しうる。これらの技術はレセプターの
様々な機能体を分け、これによってPDGF結合に応答する種々のエフェクター
機能それぞれを他から単離すること客担う。
本発明の改質レセプターはそれらに対するリガンドをアッセイするための方法も
提供する0例えば、可溶性リガンド結合性フラグメントは、リガンド結合アッセ
イにおいて有用な特性である、リガンド結合のための競合部位として有用であろ
う、特に、本発明はPDGF結合阻害についてスクリーンするためのアッセイを
提供し、大量の化合物のスクリーニングを可能とする。これらの化合物はインビ
トロでアッセイされることができ、これは細胞障害性又は膜崩壊性化合物の試験
を可能にする。当該の固相系は再現性のある、高感度で、特異的な、そして容易
に自動化されるアッセイ手順を可能とする。
リガンド結合活性をアッセイするために、ポリスチレン製96穴プレートをLB
Rを有する適当な構造体でコートすることができる。
更に、リガンド結合性ドメインに対する改質は種々のりガント結合親和性を有す
る結合領域組合せをもたらすであろう、従って、リガンドが及ぼす応答の調節は
適当な親和性改質化類似体を含ませる4とによって容易に達成されうる。
これらの改質化レセプターを利用する固相アッセイも開発でき、未改質結合領域
よりも高感度又は向上した能力を提供する。
これらの試薬を含んで成る診断キットも提供する。このキットは典型的には、本
発明の診断試薬が結合している区分けされた囲い、例えばプラスチック基板を含
んで成る。この包装品は典型的には種々の緩衝剤、ラベル試薬、及び実施すべき
診断検査にとって適切な他の試薬も含む、関連の試薬の利用及び結果の判断のた
めの仕様書が提供されるであろう。
特に、細胞外ドメインの重要な機能性セグメントを通常プラスチック又はその他
の面相基板に結合させることがある。この結合領域は通常、改質化結合性セグメ
ントの親和性とりガント結合性スペクトラムとの組合せに対して選ばれる。適当
なりガントを通常導入してリガンド結合活性及び親和性を決定する0種々のLB
Rの組合せが利用され、そして異なる改質化された、例えばラベル化されたりガ
ントのための試験に用いられうる。
更に、これらのペプチドは治療用投与にとって有用であろう、有効な治療にとっ
て必要な試薬の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状況及びその他の
投与された医薬品に依存するであろう。
従って、処置用量は安全性及び薬効を最適化するために力価検定すべきである。
一般には、インビトロにおいて利用する用量は、これらの試薬の現場投与にとっ
て有用な量の有用な指針を担うことができる。特定の障害の処置にとって有効な
用量の動物試験はヒトの用量の推定指標を更に提供するであろう0種々の考察が
例えば本明細書に参考として組入れるGi 1eanら(W)(1990) G
oodman and G11−想コ:田り防払μ匪回山測Ba5is of
Ther朋見旦■、第8版、Pergawon Press ;及び7ヱhar
maceutical 5ciences(19B5)第7版、Mack Pu
blishing (:o、、 Easton、 Penn ;に述べられてい
る。
投与方法、例えば経口、静脈内、腹腔膜内、又は筋肉内投与、経皮拡散等がそれ
らに記述されている。薬理的に許容されうる担体には水、生理食塩水、緩衝液及
び例えばMerck Index+ Merck & Go、。
Rahway、 New Jerseyに記述の他の化合物が含まれるであろう
、 PDGFとそのレセプターとの強い親和結合力のため、低用量のこれらの試
薬がまず有効であると予測されるであろう、従って用量の範囲は適切な担体を伴
って、通常1mMの濃度以下、典型的には約10μMの濃度以下、通常は約11
00n以下、好ましくは約10pM (ピコモラー)以下、そして最も好ましく
は約1fM(フェムトモラー)以下であろう。
該薬学組成物は予防及び/又は治療的処買のために非経口的、局所的、経口的又
は局在投与により、例えばエアロゾール又は経皮的に投与されるであろう、この
薬学組成物は投与方法に依存して様々な単位投与形態において投与されうる0例
えば経口投与に適切である単位投与形態には粉末、錠剤、ビル、カプセル及び糖
剤が含まれる。
好ましくほこの薬学組成物は静脈内投与する。従って、本発明は静脈投与のため
の組成物を提供し、これは適当な担体、好ましくは水性担体の中に溶けている又
は懸濁されている化合物の溶液を含んで成る。様々な水性担体、例えば水、緩衝
水、0.4%の食塩水等が利用されうる。これらの組成物は常用のよく知られた
滅菌操作によって滅菌されうるか、又は滅菌濾過されうる。得られる水性溶液を
そのまま利用するために包装するか、又は凍結乾燥させる。この凍結乾燥調製物
は投与前に滅菌水性溶液と組合わせる。該組成物は適切な生理条件に必要とされ
る薬理的に許容されうる補助物質、例えばpH11節及び緩衝剤、等張調節剤、
湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、塩化カルシカム、ソルビタ:/モノラウレート、■リヱタノールアミンオ
レエート等を含んでいてよい。
固形組成物のため、常用の無毒な固形担体が利用でき、これには例えば薬理等級
のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリ
ンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシ
ウム等が含まれる。経口投与のため、薬理的に許容されうる無毒な組成物は、任
意の通常利用される賦形剤、例えば前記したものと、一般的に10〜95%、好
ましくは約20%の活性成分を含ませることにより作る(む凪コ1並前掲を参照
のこと)。
エアロゾール投与のためには、この化合物を好ましくは界面活性剤及び噴射剤と
一緒に細く分割した状態で供給される。さらにこの界面活性剤は無毒でなくては
ならず、そして好ましくは噴射剤において可溶性である。かかる試薬の代表例は
6−22個の炭素原子を含む脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタノン酸、ラウリ
ン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リルン酸、オクタノン酸及び
オレイン酸と、脂肪多価アルコール又はその環式無水物、例えばエチレングリコ
ール、グリセロール、エルトリトール、アラビトール、マンニトール、ソルビト
ール、ソルビトールに由来するヘキシトール無水物とのエステル又は部分エステ
ル、並びにこれらのエステルのポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレン誘
導体である。複合エステル、例えば複合又は天然グリセリドが利用できうる。
界面活性剤はこの組成物の0.1〜20重量%、好ましくは0.25〜5重量%
を構成していてよい、この組成物の残りは通常噴射剤である。
液化噴射剤は典型的には周囲条件で気化し、そして加圧のもとで凝縮する。適当
な液化噴射剤には、5回までの炭素原子を含む低級アルカン、例えばブタン及び
プロパンがあり;そしてフッ素化又はフルオロ塩素化アルカンが好ましい。以上
の混合物も利用されうる。
エアロプールの製造において、適切なバルブの41いた容器に、細(分割した化
合物及び界面活性剤を含む適切な噴射剤を充填する。これらの成分はバルブの作
動により放出されるまで高圧で維持されている。
該化合物を含んで成る組成物は予防及び又は治療用処置のために投与されうる。
治療的用途においては、組成物を前記の通り、疾患に既に苦しむ患者にこの疾患
の症状及びその合併症を治癒する、又は少なくともある程度緩和させるのに十分
な量で投与する。これを達成せしめるのに適切な量を「治療的有効投与量」と定
義する。この用途に有効な量は疾患の重症度並びに患者の体重及び−膜状態に依
存するであろう。
予防的用途においては、本発明の化合物を含む組成物を特定の疾患に敏感な、又
はそうでなければ危険性のある患者に投与する。かかる量は「予防的有効投与量
」と定義する。この用途においては、ここでも正確な量は患者の健康状態及び体
重に依存する。
本発明は以下の実施例を参照することによりより良く理解されるであろう、以下
の例は限定ではなく例証のために提供する。
実験
一般に、組換DNA技術の標準的操作は種々の論文、例えば本明細書に参考とし
て組入れるSambrookら(1989) Mo1ecular C1oni
n : ALaborator Manu I、 Co1d Spring L
aboratory ; Au5ubelら(1987)Current ro
tocols in Mo1ecular Biolou、第1及び2巻と付録
;並びに−UとGross曽an (&i) (1987) ハ肋郵L」−モv
刀す1j上、第53巻(Recombinant DNA Part D)に記
述されている。
■、竺上豊惣五11
ヒトレセプター由来可溶性細胞外レセプターフラグメントの省略型又は欠失Um
体の作製、発現及び生理学的効果の決定のための同等の複数の技術が核酸、ポリ
ペプチド及びここで提供するその他の試薬を利用して実施されうる。
A、B型セグメント
B型レセプターポリペプチドの構造体は以下の通りに作った:ヒトB型hPDG
F−Rの3.9kbのEcoRI −Hlndll[cDNAフラグメントを旧
3 Mp18のEcoRI−旧ndn1部位の中にサブクローンしてベクターM
p18PRを作った。操作については、本明細書に参考として組入れるMani
atisら (1982) Mo1ecu!ar C1onin :八Labo
rator Manual。
Co1d 5prin(Harbor、 N、Y、を参照のこと、サブクローニ
ングの評価は、Sangerら(1977) Proc、Nat’1.Acad
、Sci、 USA、 74 : 5463に記載の制限酵素消化分析及びジデ
オシキ連鎖停止シーケンシングによって作った。オリゴヌクレオチド特異的イン
ビトロ突然変異誘発をKunkelら(1987) Methods in H
nz sol、、 154 : 367に記載の方法に従って行った。門p18
PRのオリゴヌクレオチド特異的インビトロ欠失突然変異誘発のための手法を図
1に概略した。
簡潔すると、一連のオリゴヌクレオチドをデザインし、欠失突然変異誘発により
入れ子穴(nested)セットの可溶性B型hPDGFレセプター細胞外ドメ
イン1〜5(D1〜D5)を作り上げた。これらのドメインをドメイン1〜ドメ
イン5(D1〜D5)と表示し、適当な真核発現係の中での発現に適する。突然
変異オリゴヌクレオチドの詳細はヒトPDGFレセプターの対応の領域と並べて
表10に挙げている0表13に示している得られる構造体をラベル化した。全体
にわたり、突然変異誘発のためにアンチセンス鎖を利用した。Pb0゜Pb2.
Pb3. Pb4及びPb5の突然変異誘発は鋳型としてMP18Pl?を利
用し、そしてPb6. Pb7. Pb0及びPb9の突然変異誘発は鋳型とし
てM+)18PΔ1を利用した。 41bpのオリゴマーであるPb0はD5の
リジン49!(K4?9)の後にTAG停止コドンを導入せしめ、従ってトラス
ンメンプラン(TM)及び細胞内キナーゼドメイン(K)全体を除去せしめ、M
p18PΔ1をもたらした(図1参照のこと)。
Pb0は530..148’ sa前駆体タンパク質をコードする。
ヒトB型PDGP R発現構造体
−Hind m部位の中にサブクローンし、次いで5outhernとBerg
(1982)J、Mo1.A 1.Gen、、1 : 327に記載の通りニ
psV2NEOと共に、チャイニーズハムスター卵巣細胞(C)10)中にトラ
ンスフェクトせしめた。
図2及び3参照のこと。
この構造体の機能は以下の通りに実証される:0.33nMのPDGF BBリ
ガンドのサンプルを4℃で1時間、以下の条件のもとてブレインキュベートする
:
1、ヒトPDGFに対するポリクローナル抗体(この抗体はヒトPDGFAA、
PDGF BB及びPDGF ABを認識する);2、18nM(PDGF
BBに対して60倍モル過剰)のヒトB型PDGFレセプター;
3、このレセプター及び抗体を入れるリン酸緩衝生理食塩水;又は
4、リガンド自体以外の添加物なし。
デエブリケートセットの実験において、0.33nMのPDGF AAを上記の
3通りのインキュベージロン条件、例えば上記の2.3と4でインキュベートし
た。ヒトB型PDGFレセプターはPDGF AAを認識することが認められな
かったが、このリガンドはNIH3T3細胞由来の細胞結合型ヒトA型PDGF
レセプターを活性化せしめたので、これはヒトB型PDGFレセプター特異性及
びPDGF 88依存活性、対、非特異的一般細胞作用、例えば、細胞障害性に
ついてのコントロールとなる。
プレインキュベートした材料は0.5mlの最終容量とした。これらを、4°C
に冷やした無血清(休止) NIH3T3細胞の集密層を含む6穴組織培養皿の
各ウェルの中に入れた。これらの細胞及びインキュベーション混合物を4°Cで
2時間撹拌、例えばゆらした0次にそれらを4 ”Cのリン酸緩衝食塩水で2回
洗った。マイクロタイターウェル当り 125mMのトリス (ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン(トリス)、PH6,8,20%(V/V)のグリセロール、
2%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SOS) 、2%の(V/V)の2
−メルカプトエタノール及び0.001%のブロムフェノールブルー(SOSサ
ンプル緩衝液として知られる)40μmを加え、次いで100mMのトリス、p
)18.0+30−Mのビロリン酸ナトリウム、50−Mのフッ化ナトリウム、
5■Hのエチレンジアミン四酢酸(EDTA) 、5mMのエチレンビス(オキ
シエチレンニトリリオ)四酢酸、1%(w/v)のSDS 、100+wMのジ
チオスレイトール、2■Hのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)
及び200μMのバナジン酸ナトリウム 40μlを細胞に加えた。これらの細
胞は可溶化し、そして40ulの更なるSOSサンプル緩衝液をこの溶解物に加
えた。この材料を5分間煮沸し、そして7.5%のドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲルの単一ゲルサンプルウェルに載せた。細胞性タンパク質を電
気泳動によって分離させた。
分離したタンパク質をエレクトロトランスファーでニトロセルロースに移し、そ
して得られる「ウェスタンプロット」を室温で20分間、0.5%(W/V)の
塩化ナトリウム、5sg/請lのウシ血清アルブミン、50MMのトリス、pH
7,5(ブロッキング緩衝液と呼ぶ)を3回交換しながらインキュベートした。
1/1000希釈率のブロッキング緩衝液中のPY20 (ホスホチロシンに
対する市販のモノクローナル抗体(ICN〕)をこのプロットと4℃で一夜イン
キュベートした。このプロットをブロッキング緩衝液の中で室温で20分間、3
回洗った。
このプロットをブロッキング緩衝液中の4μCi/40μlの1!SI−プロテ
ィンA (Amershaw)と室温で1時間インキュベートし、次いでブロッ
キング緩衝液の中で室温で20分づつ3回洗った。このプロットをX線フィルム
に、−70”Cの一枚の増強スクリーンで48h暴露せしめ、次いで標準の試薬
により現像した。
図4は上記の条件とりガントを加えていない(PDGFなし)の追加の条件によ
るオートラジオダラムの結果を示す、この追加の条件は任意のリガンドなしての
細胞結合化レセプターの活性(例えばリン酸化)のレベルを規定する。抗体及び
ヒ)B型PDGFレセプターの両者ともPDGF BBによる細胞結合化PDG
Fレセプターの活性を中和せしめた。このことは、PDGFレセプター活性にと
ってリガンドが役格立たずのものとなる、リガンドへの直接的な結合及び封鎖に
基づくことが明らかである。 p185はレセプター位置を示している。
B、 A復配列
表12の突然変異誘発オリゴヌクレオチドを利用する類似の操作を利用して、表
15に挙げるA型構造体を作製する。A型作製体は実際には製造していないが、
しかしこれらの方法によって容易に製造されうることに注目すべきである。これ
らの構造体の機能を試験するのに類似のアッセイが利用される。
予想のヒ)A型PDGF−R発現構造体C9PDGFブレートアッセイ
ポリスチレンマイクロタイタープレート (■■wulon+ Dynatec
hLabora tor 1es)にB型ヒトPDGFレセプター(前記)の細
胞外領域フラグメントを、ウェル当り 100μmの25−Hのトリス、75曽
HのNaC1+pH7,75中の約10−100 ngのこのタンパク質を4°
Cで12〜18時間インキュベートすることによってコートせしめた。トランス
フェクト化C)+O細胞においてタンパク質を発現させ、そして0.2〜ltI
g/mlの濃度で無血清培地(Gibco MUMα)中で集め、総タンパク質
濃度150〜300 μg/蒙1であった。
ヒトPDGF B型レセプター細胞外領域フラグメントを濃縮し、次いでこの培
地を小麦胚芽凝集素−セファロースに4℃(48■1/hにて)にて1i+Mの
PMSFの存在下で通すことによって精製した。よく洗った後、タンパク質を0
.3MのN−アセチル−グルコサミン、25−MのHEPES、 100mMの
NaCl、1 mMのPMSR,pH7,4の中で溶離させた。この画分を次に
0.15Mの炭酸水素アンモニウムpH7,9の中で平衡化した5ephacr
y S−200HR(Pharmacia)に適用した。レセプター(3〜10
ng/端1)を含む画分を5O3−PAGE、及びこのレセプターの外部領域に
由来するドメイン1(DI)セグメントに対して標準の方法により作ったポリク
ローナルウサギ抗体を伴うウェスタンブロッティングによって検定した。
これらの両分(3〜10ng/ml)を上記の通りマイクロタイターウェルをコ
ートするために用いた0次にこれらのウェルを排液し、0.5%のゼラチン(B
io−Rad、 EIA級) 、25mMのHepes+ 100mMのNaC
1゜pH7,4200*Iで1回洗い、次いで同一の溶液150μlで24℃で
1〜2時間インキュベートした。このウェルを排液し、そして0.3%のゼラチ
ン、25mMのHepes+ 100mMのNaC1,pH7,4(各150.
!11)で2回すすいだ、各ウェルに0.3%のカゼイン溶液90μlを入れた
(非特異的結合を試験するのに用いたウェルには80μmしか入れず、次いで0
.3%のゼラチン溶液中の0.01i+g/mlの非ラベル化PDGF 10μ
mを入れた)、ジ−ヨードポルトンハンター(Bolton Hunter)試
薬(Amersha−)でP[lGF BB (A−gen)を4℃で52.0
00 CPM/ngまでヨウ素化し、次いでウェル当り、0.024%のBSA
、 0.4%のゼラチン、20−MのHepes+ 8抛HのNaCl、 7抛
Hの酢酸、PH7,4を含む10μm中の約40.000 CPMを加えた。こ
のプレートを24°Cで2−3時間インキュベートし、その後、このウェルを0
.3%のゼラチン、25mMのHepes 。
100mMのNaC1,pFI7.41507/ lづつで3回洗った。残留結
合放射活性物をウェルから、200μlの1%のSO5,0,5%のBSAの中
で可溶化し、ガンマ−カウンターで計測した。150倍過剰量の非ラベル化PD
GF BB (Amgen)の存在下において非特異的結合を決定し、それは全
結合”’I−PDGFの約7%であった。
Δ型し/−fPブタ・−フラグメントを泪いて類似のアッセイが可能であろう。
しかしながら、A型1/セブターフラグノントはB型フラグメントよりも他のタ
ンパク質の存在に対してより敏感であり、従ってセ°ラチンとは異なるコーティ
ング試薬をデするものと思われる。ヘモグロビンが緩衝中のゼラチンにほぼ同一
の濃度で代用される゛。有用であろうその他のブロッキングタンパク質は例えば
Sig■a Cbemi−cal Companyより選べる。タンパク質のタ
イプ及び濃度を最適化する力価検定はこのレセプタータンパク質結合に影響を及
ぼさないタンパク質を見い出すのに実施されるであろう。
本アッセイはトランスフェクト化CHO細胞において発現され、そしてアフィニ
ティー及びゲルクロマトグラフィーにより部分精製された5μg/ウェル以下の
レセプター可溶性型を必要とする。ヨウ素化PDGF−BBを利用して、10p
g以下のリガンドの特異的結合性が100μg/ウェルのアッセイ容量において
検出されうる。4°Cにて、固定化レセプターに対する”’I−PDGP BB
の結合は飽和となることができ、従って高親和力となる。 5catchard
分析によるKdはウェル当り1.8X10”部位を伴って約1nMであった。1
00倍過剰量の低温PDGFBBの存在下において決定した非特異的結合は通常
全結合の約5〜10%のみであった。この結合は、過剰の低温PDGF AAが
”5I−PDGF BB結合を阻害しない限り、リガンドのイソフオームに対し
ても特異的であった。更に、溶液中のB型PDGFレセプターの外部領域はその
固定化形態と、ヨウ素化PDGF BBの結合に対して競合する(ICio=5
nM)。4°Cで4時間後に結合した”’I−PI)GF BB結合は結合用緩
衝液の中でゆっくりと解離したが(t+zz>6h)、150倍過剰量の非ラベ
ル化PDGF BB(t +zz < 1 h )の添加により完全に置換され
た(t+/l<lh)。
これらの試験は、他の成長因子の夾雑物を有さない成長因子調製物の有用性ζよ
り、及びレセプター発現系の利用により可能となり、ここで測定されたPDGF
応答の全゛Cはこの単一・iランスフェクト化しセブクーcDNAに寄与しうる
。
本明細書における全ての文献及び特許出@は本明細書に参考として組入れる。本
発明を完全に説明し7たきたが、任意の変更及び改良は本発明の範囲をm脱する
ことな(実施されうろことを当業者は理解しているであろう。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人: Wolf、 DavidToslinson、 Jataes
E。
Eretto、 Larry J。
Gtese、 Ne1ll A。
Escobedo、 Jaime A。
Williai*s、 Lewis T。
(ii)発明の名称:ヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドの細胞外
領域ドメイン
(iii)配列の数:23
(tv)宛先:
(A)住所: T(VNSEND and TOWNSEND(B)街: 5t
euart 5treet Tower、 20th Floor\One M
arket1aza
(C)市: San Francisc。
(D)州: Ca1ifornia
(E)国:υS
(F ) ZIP : 94105
(v)コンピューター読取方式:
(A)媒体タイプ: Floppy disk(B)コンピューター: IBM
PCCompatible(C)作動システム: PC−005/MS−00
5(D)ソフトウェアー: Patentrn Re1ease l11.o+
VersionH,25
(vi)現出頃日:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(vi)代理人/代理店の情報:
(A)名称: Ching、 Edwin P。
(B)登録番号: 34.090
(C)参考/事件番号: 1241B−14(tx)通信情報:
(A)を話: (415) 326−2400(B)テレファックス: (41
5) 326−2422(2)SEQ 10 NO:1についての情報=(i)
配列の特@:
(A)長さ: 5427塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖:二本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNAから−RNA(迅)仮説:なし
くiv)アンチセンス:なし
くvt)起源:
(A)生111I:人類
(B)株ニラムダgtl。
(ix)特@:
(A)名称/キー: C05
(B)位置: 187..3504
(xi)配列の詳細:SEQ 10 NO: 1 :GGAGcPASC 人C
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4024
(i)配列の特徴
(A)長さ: 1106アミノ酸
(B)タイブ:アミノ酸
(D)トポロジ一二線状
(ii)分子のタイブ:タンパク質
(xi)配列の詳細:SEQ 10 No: 2 :Thr PM Val L
au Thr Cys Sar c′1.y Sar 入1a Pro Val
Val Trp G工U 入iMat S@r Gin G工u Pro P
ro Gin Giu Mat 入1a Lys 入1aG工n 入sp Gl
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Pro G1n 入sp Glu Pro Glu Pro1060 1065
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Pro Glu Pro Glu Lau Glu Gin10フ5 10B0
1085
L@u Pro 入sp 5@r Gly Cys Pro 入1a Pro
入rq 人1a Glu 入1a Glu ksp 5ar(2)SEQ rD
NO: 3についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ: 4100塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖:二本鎖
(D)トポロジー二線状
(iv)アンチセンス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(B)株ニラムダgtlO
(ix)特徴:
(A)名称/キー: CD5
(B)位置: 129..3395
CTCGCT GCT CCA ff1c (T(i CTCCTCT丁t:
CTOAT? GTG ATCATCT(u CTT ニアT4
Val Ala Ala Ala Van L@u Van Lau Lau
val Zl* Val ml−エエ・ S@r LauSコo l)5 54
0
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T CTCCTCGeA (:AA GGA )JJk 2P18
Val にi! krq Al19 し−u 入La 入1a 入r9 人sn
VaL シ龜u Lau Ala GLn +Ly Ly■
815 1120 8’15 8コO
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era ace GTG 入λG 丁cc λτG ;τP4
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Ph* Lau Pro V龜I Lys 丁rp M@CGCT C(T G
AG AGCArc ’!Tτ CAC入ACCTC丁ACAce ACA C
TC入Gτ G入T CTC27g2人1a Pro alu Sar 工is
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GAIS kTc 入TCG?G AAA 丁QCTCG 五人c A17 G
AG CCC; CACAAG AGA eec TCe Q954
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Lu Pro GLu Lys krq Pro 5at9コ0 935 94
0
入八入 五人G 八G〒 τ入丁 G入入 五人^ ^T?C入Cロテク C入
CTτcc’rc 入^G λGT CAC仁λ丁 305O
Lys Lys Sur Tyr Glu Lys 工111 Hjj Lau
入mp Ph* Lau Lyg 5*r ^mpH工5Set PM し川
(2)SEQ ID No: 4についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ: 1089アミノ酸
(B)タイプ:アミノ酸
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ:タンパク質
(xi)配列の詳細:SEQ 10 No: 4 :oat Gly Thr
Ser His Pro Ala Pha Lau Val Lau C1y
Cym Lau Lau Thrl 5 10 15
Gly Lau Ser L4u X1e Lau Cys Gin Lau
5@r Lau Pro Sir工1m Lau Pr。
20 25 コロ
入sn C1u Asn Glu Lys Val Val Gin L4Iu
入sn Sar Sar Pha Sar Lau 入r■
コ5 40 45
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Pro 入gp Pro 入sp Val 入1a Ph■
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Met: Glu Ala Lau LYII Thr V≠P
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225 2コ0 2コ5 24゜
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Pro Gly Glu Val Lye Gly LysGly Zla T
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260 21i5 27゜
TYττhr Lau Thr Val Pro Glu 入1a Thr V
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H1s Glu Lys Gly Ph−工1a Glu工1a LYII P
r。τhrコロ5 コ1o コニ5 コ2゜
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コ25 ココ。 ココ5
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人@n Leu Thr Ljlu 工l@ Glu Ash tau 丁hr
Glu 工1e Thr Thr 入sp Val Gl■
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45
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4”5 490 495
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4゜
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in Lau Pro Tyr Asp 5@r Arq Trp Glu P
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Pro GLu Ly露 Pr口 Lyg Lys Glu690 695 フ
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フ05 710 715 720
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入sp Tyr M@t Asp Mat Lys G1n725 7コ0 7
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人1a Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met
Lau Glu 入r:q Lys Glu Val 5a■
740 745 フ50
Lys Tyr Ser Asp 工me Gin 入rg Sar Lau
Tyr Amp Arq pro Ala Sat ↑yr755 フロ0 7
65
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Val Lys 入gn Lau Lau Ser 入sp7フ0 775 フ
80
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入sp Lau Lau Sar Phe 丁hr Tyr185 790 7
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Ala Sar LYII 入sr+ Cys Val H奄■
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Lau 入1a Gin Gly Lyg :la Va11120 825
IIココ
Lys Ila Cys Mp Pha Gly L4u 入la 人rq 人
sp 工me Met HLs Asp Ser Asn8コ5 1140 8
45
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la Lau Lau Trp Glu Ile Phe Ser Lau に
ly Glyτhr pr口TyrPro Gly Met Met Val
ksp Ser Thr Pha ”Pyro 入an LY* X1* Ly
s S億r G撃■
tyr Arg Met 入1a Lyg Pro Asp His 入1a
Thr 5er Glu Val Tyr Glu Zl@Met Val L
ys Cys Trp Asn 5@r C1u Pro GLu Lys ^
q Pro 5ar Phe ?yr9コ0 915 940
Sir Tyr Glu Lys 工1e His Lau Amp Pha
Lau Lys Sar 入gp His Pro λ工a965 970 9
フ5
(2) SEQ ID No: 5についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ: 6375塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖:二本鎖
(D)トポロジー二線状
(ii )分子のタイプ: cDNA−mRNA(ii)仮説:なし
く1v)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物二人類
(B)株ニラムダgtl。
(ix)特徴:
(A)名称/キー: CD5
CB)位置: 129..3395
(D)他の情報:/注−「この配列のヌクレオチド番号1は先の長さ4000の
配列のヌクレオチド番号1と同じである」(xi)配列の詳細:SEQ 10
NO: 5 :丁入AAσrTcc’r ccc入ccc丁GCACC入入五人
?(JC: (、CCCCATTTk CATc入TCAC入 G入Gτ入■■
bCτ 216゜
TC丁入Tに(:AGA mGGTcJJkc τ入τTτCCA?A AGA
AT入GGGA T入GCTrCCTC; 入GCCACC`CC2220
τ入丁A丁丁八CCC入へτCG五人入入τ ^τ入五人C入丁C^ cccc
入H入入入五人 Acraα入τrracλG入入G丁五人噤@4500
rTcτTCTTCeCTO人TO入五人GCTTTCGCα入CCCC入五人
入TkTG TkτT丁T−丁C入 45607丁入入入T五人CCTτ入^G
6コ75(2)SEQ 10 NO: 6についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:41塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)Mニ一本鎖
(D)トポロジー:線状
<ii)分子のタイプ: cDNA
(ii)仮説:なし
く iv )アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物二人類
(xi)配列の詳細:SEQ ID No: 6 :(i)配列の特徴
(A)長さ:41塩基対
(B)タイプ二核酸
(C)鎖ニ一本鎖
(D)トポロジー−線状
(ii)分子のタイプ: cDNA
(iti)仮説:なし
くtv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(xi)配列の詳細:SEQ 10 No: 7 :(2)SEQ 10 NO
: 8についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ=41塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖ニ一本饋
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA
(ii)仮説:なし
くiv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物二人類
(xi)配列の詳細:SEQ ID No: 8 :ATCACCGTGG T
TGAGAGCGG CTAGCTTCCT GTAGGGGGCT G 41
(2)SEQ 10 No: 9についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:41塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)IIニ一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA
(ji)仮説:なし
くiv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物二人類
(xi)配列の詳細:SEQ ro No: 9 :TACAGACTCCAG
GTGTCATCCTAGCTTCCT GTAGGGGGCT G 41(2
)SEQ 10 NO:10についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:44塩基対
(ii)分子のタイプ: cDNA
(iii)仮説:なし
くtv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:10:CTCTACATCT Tτ
GTGCCAGA TCCCTAGCTT CCTGTAGGGG GCTG
44(2) SEQ In No : 11についての情報:(1)配列の特徴
(A)長さ=45塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)[ニ一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA
(tti)仮説:なし
く iv )アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(xi)配列の詳細:SEQ ro NO:11:CAGATCTCTCAGG
GCCTGGT CACCGTGGGCTTCCTCCCTA ATCAT 4
5(2) SHQ ID No : 12についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ=48塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖ニ一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA
(tj)仮説:なし
く iv )アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物二人類
(xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:12:CAGATCTCTCAGG
GCCTGGT CATCAACGTCTCTGTGAACG CAGTGCA
G 48(2)SEQ ID NO:13についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:45塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖ニ一本鎖
(D)トポロジー二線状
(ii )分子のタイプ: cDNA
(iii)仮説:なし
くiv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物二人類
(xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:13:CAGATCTCTCAGG
GCCTGGT CATCGTGCGG CTCCTGGGAG AGCTG
45(2) SEQ 10 No : 14についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ=42塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)IIニ一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA
(ij)仮説:なし
く1v)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:14:CAGATCTCTCAGG
GCCTGGT CGTCCGAGTG CTGGAGCTAA GT 42(
2”) SEQ ID No : 15についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:41塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)IIニ一本饋
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA〜mRNA(ji)仮説:あり
(iv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(B)株ニラムダgtl。
(xi)配列の詳111:SEQ ID NO:15:GCTCCCACCCT
GCGTTCTGA ATAACTGGCG GATTCGAGGG G 41
(2) SEQ ID No : 16についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:41塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖ニ一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA〜m[1NA(iii)仮説:あり
(iv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(xi)配列の詳11:sEQ ro NO:16:GAACTGTTAA C
TCAAGTTCCTTAACTGGCG GATTCGAGGG G(2)
SEQ ID No : 17についての情報;(i)配列の特徴
(A)長さ:41塩基対
(B)タイプ:核酸
CC)*ニー末鎖
(D)トポロジー二線状
(ii)分子のタイプ: cDNA 〜mRNA(溢)仮説:あり
(iv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物二人類
(B)株ニラムダgtlO
(xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:17:ATTTCTGTCCATG
AGAAAGG TTAACTGGCG GATTCGAGGG G(2)SE
Q In NO:1Bについての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:41塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖ニー末鎖
(D)トポロジー−線状
(ii)分子のタイプ: cDNA〜mRN^(ii)仮説:あり
(tv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(B)株ニラムダgtl。
41 (xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:18:TATGCTTTAA
AAGCAACATCATAACTGGCG GATTCGAGGG G 4
(2) SEQ 10 No : 19についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ:44塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖ニー末鎖
(D)トポロジー二線状
(ii )分子のタイプ: cDNA〜−RIIIA(if)仮説:あり
(iv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(B)株ニラムダgtl。
41 (xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:19:(i)配列の特徴
(A)長さ=45塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)頷ニー末鎖
(D)トポロジー=wA状
(11)分子のタイプ: cDNA〜wRNA(iii)仮説:あり
(iv )アンチ−センス:なし
くvi)起源;
(A)生物二人類
(B)株ニラムダgtlO
(xi)配列の詳細:SEQ ID NO:20:AGCCTAATCCTCT
GCCAGCT TGATGTAGCCTTTGTACCTC丁AGGA 45
(2) SEQ ID NO: 21についての情報:(i)配列の特徴
(A)長さ;48塩基対
(B)タイプ:核酸
CC)鎖ニー末鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDNA〜−RNA(in)仮説:あり
(iv)アンチ−センス:なし
くvi)起−a:
(A)生物:人類
(B)株ニラムダgtl。
(xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:21:AGC(:TAATCCTC
TGCCAGCT TGAGCTGGAT CTAGAAATGG AAGCT
CTT 48(2) SEQ ID No : 22についての情報:(i)配
列の特徴
(A)長さ:45塩基対
(B)タイプ;核酸
(C)[ニー末鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子のタイプ: cDN^〜s+RNA(ij)仮説:あり
(1v)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物:人類
(B)株ニラムダgtlO
(xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:22:AGCCTAATCCTCT
GCCAGCT TTTCATTGAA ATCAAACCCA CCTTC4
5(2) SEQ 10 No : 23についての情報:CB)タイプ:核酸
(C)鎖ニー末鎖
(D)トポロジー二線状
(ii)分子のタイプ: cDNA〜−12NA(iii)仮説:あり
(iv)アンチ−センス:なし
くvi)起源:
(A)生物−人類
(B)株ニラムダ@t10
(xi)配列の詳細:SEQ 10 NO:23:AGCCTAATCCTCT
GCCAGCT TTCATCCATT CTGGACTTGG TC42In
ternat1msl^ppHcatlon)Io、PCTA11121<1’
673(1フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号C12N 5/10
15/12 Z N A
C12P 21108 8214−48GOIN 33153 D 8310−
2JY 8310−2J
//(Cl3F 21102
C12R1:91)
8412−4B
(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、MC,NL、SE)、0A(BF
、BJ、CF、CG、CI、CM、GA、GN、ML、MR,SN、TD、TG
)、AT、 AU、 BB、 BG、 BR,CA、 CH,C5,DE。
DK、 ES、FI、 GB、 HU、JP、 KP、 KR,LK、LU、M
G、MN、 MW、NL、No、PL、RO、RU、SD、5E
(71)出願人 ウィリアムス、ルウイス ティー。
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94920゜ティブロン、アベニダ ミラフ
ロアーズI
C12N 5100 B
(72)発明者 エスコベド、ジエイム ニー。
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94117゜サンフランシスコ、アッパー
テラス
#3 455
(72)発明者 ウィリアムス、ルウイス ティー。
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94920゜ティブロン、アベニダ ミラフ
ロアーズ(72)発明者 ウォルフ、デビット
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94303゜パロ アルド、ベルビュー ド
ライブ
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(72)発明者 トムリンソン、ジェームズ イー。
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94122゜サンフランシスコ、トウウエル
ブス アベニュ 1489
(72)発明者 フレット、ラリ−ジエイ。
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94002゜ベルモント、ニスコンデイド
ウェイ
(72)発明者 ギース、ネイル ニー。
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94110゜サンフランシスコ、ゾロアズ
レーン