JP3710404B2 - ヒト血小板由来増殖因子レセプター - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は診断および治療薬に関し、より詳細には血小板由来増殖因子レセプターに基づく組成物に関する。
【0002】
発明の背景
血小板由来増殖因子(PDGF)は、間充織由来の細胞についての主要なマイトジェンである。このタンパク質マイトジェンは通常ふたつのポリペプチド鎖AおよびBがジスルフィド結合で連結されてなる32kDa のタンパク質ヘテロダイマーである。 PDGF ABヘテロダイマーに加えて、PDGFのふたつのホモダイマー体(AAおよびBBと示される)が同定された。
【0003】
PDGF−仲介 分裂促進の第一段階は、PDGFが細胞膜で、そのレセプターに結合することである。この反応は、レセプター チロシンキナーゼの活性化、フォスファチジルイノシトールの代謝回転上昇、ひとつの群の遺伝子の発現増大、フォスフォリパーゼA2の活性化、細胞の変形、細胞内カルシウム濃度の上昇、細胞内pHの変化、結合したPDGFの内在化および分解を含む初期の細胞性応答の多様性の引き金を引く。これらの変化は、次に標的レセプター含有細胞の増殖速度の上昇へと続く。
【0004】
ポリペプチドがインビトロで特定細胞タイプの成長を刺激する能力は、それがインビボで同じ機能を果たす証明にはならないが、細胞上の多くの増殖因子の役割を研究して生物全体における役割が決定される。インビトロで、血小板由来増殖因子は、繊維芽細胞、平滑筋細胞およびグリア細胞のような間充識由来の細胞についての血漿中の主要なポリペプチドマイトジェンである。インビボで、PDGFは血液中にて自由に循環しないが、循環する血小板のα顆粒中に保有されている。血液凝固および血小板の癒着中に顆粒が放出されると、しばしば損傷血管の部位で、すなわちPDGFが血管の修復に寄与する。PDGFは動脈性平滑筋の動脈血管の中間から内膜への移動を刺激することができ、ここで筋肉細胞は増殖できる。これが損傷の初期応答になると思われる。
【0005】
PDGFは研究されて、どのように細胞の増殖が体内で制御されるのかが決定された。増殖因子は傷の治癒、アテローム硬化症、骨髄増殖性疾患、および細胞のガン性形質転換(特にc-myc およびc-fos )に関与してきた。これゆえに、PDGFアゴニストは傷の治癒の促進に有効となるであろう。PDGFアンタゴニストはアテローム硬化症の予防、心臓血管の介入後に生じる血管細狭化、およびガン性の形質転換の阻止に有効となるであろう。
【0006】
PDGFと細胞との相互反応は、部分的にマイトジェンについてのレセプターにより仲介される。PDGFレセプターはそれゆえに増殖因子によるマイトジェン性の刺激における成分としてたいへん重要である。しかしPDGFとそのレセプターとの間の、ならびにPDGFレセプターと細胞性成分との間の直接的な相互反応を特徴づけることは不可能であるため、異常または所望でないPDGFの応答を特徴とする生理状態または疾患を診断または治療するために必要な薬剤の開発が阻止されてきた。これらの理由により、PDGFレセプターの構造的ならびに生理的性質を特徴づける劇的な必要性が存在する。
【0007】
発明の要約
本発明によれば、ヒト血小板由来増殖因子レセプター(hPDGF-R)ポリペプチドをコードする DNA配列が単離され、配列決定された。
【0008】
ひとつの態様において、分泌または哺乳類細胞の膜に結合できるPDGF−レセプタータンパク質をコードする、ひとつまたそれ以上の配列を含む発現構造物が提供される。膜結合性レセプターは機能的に野生型と同様または均等であるべきであり、これゆえにレセプターが欠如している細胞に対するPDGF感受性のマイトジェン応答を付与する。構造物は、とりわけ、大量のPDGF−レセプターまたは断片を作るために、細胞のPDGF応答を増大するために、PDGF結合に応答してマイトジェンの信号を形質導入することに関与するポリペプチドレセプターの領域を決定するために、レセプターの突然変異類似体を提供するために、薬剤の生理活性を評価するために、そしてレセプター遺伝子の染色体部位に近い配列の統合性をプロービングするために使用できる。特に、種々の可溶性レセプターの断片が提供され、その多くが hPDGF-Rタンパク質が結合した細胞の種々の性質を有する。これらの構造物を使用する新規方法も提供される。
【0009】
本発明は、ヒト血小板由来増殖因子レセプター(hPDGF-R)ポリペプチド部分をコードする、少なくとも約24の一連のヌクレオチドを含む約50Kbp より小さい、精製され、単離された組換え核酸を提供する。好ましくはそのセグメントは可溶性ポリペプチドである。特定の態様において、そのセグメントは本質的に、BタイプまたはAタイプ hPDGFレセプター(例えば表2または表3のポリペプチド配列)の完全長の細胞外領域から成る。他の態様において核酸はリン酸化部位のセグメントをコードする。
【0010】
普通、コードされたセグメントは約 300アミノ酸よりも小さい(好ましくはPDGFに結合できるであろう)、リン酸化の基質であることができ、またはPI3キナーゼに結合できる。他の態様において、コードされたセグメントは実質的に完全な細胞内領域を欠いている。
本発明はまた記載された核酸で形質転換された細胞を包含し、その細胞は典型的には哺乳類細胞である。特別な態様において、細胞はさらに非−真菌種から発生したグリコシル化酵素を含有する。
【0011】
発現ベクターも提供され、特定の態様においては、セグメントをコードする核酸ヌクレオチドは、プロモーターに作動可能なように連結される。提供される組み換え核酸はさらに、 hPDGF-Rセグメントに融合されるヘテロロガスなポリペプチドをコードする。
【0012】
本発明のもうひとつの観点として、 hPDGF-Rアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する化合物の能力を評価するための方法が提供され、それは対照の細胞からのPDGF−誘導応答の量を、hPDGF-Rペプチド断片をコードする核酸で形質転換した細胞中のものと比較する工程から成る。種々の態様において、PDGF−誘導応答は細胞中の DNA合成を測定することによって比較される。細胞をPDGFを持つ細胞と接触させた後。
【0013】
ポリペプチドの態様には、血小板由来増殖因子(PDGF)結合活性またはチロシンキナーゼ活性を有する少なくとも約20のアミノ酸の実質的に純粋な hPDGF-Rポリペプチド断片を含む。典型的にはこのポリペプチド断片は可溶性であろう。
【0014】
他の態様において、タイプ B hPDGF-Rの約1から始まり約 499で終止するアミノ酸を本質的に含む hPDGF-R結合活性を有するhPDGF-R断片が提供され、これは例えば表2に表したもの、又はタイプA hPDGF-Rの約1から始まり約 501で終止するアミノ酸を本質的に含む、例えば表3に表したものである。本発明は非グリコシル化hPDGF-R断片を有する組成物を包含し、好ましくは断片は実質的に純粋である。他の態様において、 hPDGF-R断片は、非−真菌および非−ヒトのグリコシル化パターンを表す。特に有用な組成物は、タイプB又はタイプ A hPDGF-R(例えば表2または表3に表したもの)の本質的に細胞外領域の hPDGF-Rポリペプチド断片を有する。さらなる態様は:(a)ヒト血小板由来増殖因子レセプター(hPDGF-R)断片をコードする組み換え核酸;および(b)発現時に該断片をグリコシル化することができる非−真菌のグリコシル化酵素、の組み合わせから成る。
【0015】
本発明は細胞に hPDGF-R活性を導入するための種々の方法を提供し、それは少なくとも約 500ダルトンの hPDGF-Rタンパク質断片を細胞に導入する工程から成る。試料中のPDGFレセプターについてのリガンドの存在をアッセイするための方法も提供され、それは:
(a)試料と hPDGFレセプターリガンド結合部位とを混合し;そして(b)リガンドと hPDGFレセプターリガンドとの間の結合を検出することから成る。
【0016】
PDGFレセプターの細胞内領域に関して、本発明はレセプターキナーゼ挿入領域を含む約 200アミノ酸より小さい単離ポリペプチドを提供する。種々の態様において、ポリペプチドはリン酸化アミノ酸残基(例えばホスホチロシン)を有する。通常ポリペプチドは、PDGFレセプターのキナーゼ挿入セグメントに実質的にホモロガスな配列、例えば表2または表3の配列、を有する。本発明はまたポリペプチドと薬学的に受容できるキャリアーを含有する組成物を提供する。
【0017】
本発明により種々の方法が提供され、それは第二タンパク質のリン酸化領域に結合する第一タンパク質の生物活性を変調させるための方法を含むが、この方法は第一タンパク質にリン酸化領域のペプチド類似体を付加する工程を含み、ここで類似体は第一タンパク質の第二タンパク質への結合を阻害することができる。標的リン酸化ポリペプチドに結合するタンパク質の結合を阻害できる分子を選択するための他の方法も提供される。この方法は、第二分析中の分子の不存在下でタンパク質を標的リン酸化ポリペプチドに接触させ;そしてこれらの分析を比較して、結合に対する分子の効果を決定する工程を有する。特定の態様において、これらの接触工程は連続して行われる。
【0018】
提供されるようなPI3キナーゼ活性を変調さるための他の方法は、リン酸化PDGFレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドをPI3キナーゼに加え、これによってポリペプチドとPI3キナーゼとの間の結合を可能にする工程から成る。
【0019】
本発明は、試料からPDGFレセプターキナーゼ挿入セグメントに結合できるタンパク質を精製する方法を提供し、それは試料をPDGFレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドと実質的にホモロガスなリン酸化ポリペプチドの類似体と接触させることによりタンパク質を特異的にリン酸化ポリペプチドに結合させる工程からなる。
【0020】
PDGFレセプターに結合できるタンパク質をコードする核酸を単離する方法も提供され、これは標識したリン酸化PDGFレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドと種々のタンパク質を発現している細胞とを混合し、それによってリン酸化ポリペプチドに結合するタンパク質を生産するための核酸を発現する細胞を標識し;そして標識されたこれらの細胞を単離する工程から成る。この方法は特に、PI3キナーゼまたは c-fmsをコードする核酸を単離するために有効である。
【0021】
ヒト血小板由来増殖因子(hPDGF-R)組成物が本発明により提供される。これらの組成物は完全長の天然形態、天然形態の断片、これらの断片の融合タンパク質、それらを含む各々の修飾形態、ならびに多−タンパク質複合体であろう。特に、 hPDGF-R機能を表す可溶性ポリペプチドが、細胞外および細胞内領域の両方で入手できるように作られる。
【0022】
hPDGFレセプターに基づくタンパク質組成物の生産法が提供される。種々の hPDGF-Rタンパク質組成物をコードする核酸構造物も開示される。この核酸構造物は細胞を形質転換させるのに有用となり、商業的に有用な量のタンパク質組成物を生産するための有効な経済的手段を提供するであろう。これらの細胞、および hPDGFレセプターを含有する他の物は、診断およびPDGFのマイトジェン作用の機構を研究するためにも有効となるであろう。それらは、PDGFリガンド結合のシグナル伝達に影響する新しい薬剤の評価のために、ならびに hPDGFレセプターが関与する疾患の治療のために使用されるであろう。構造物は、細胞をトランスフェクトするために使用でき、機能的に野生型レセプターと均等な膜−結合レセプターを提供し、レセプターを欠く細胞に対してはPDGF−感受性マイトジェン応答を付与する。トランスフェクションした細胞を、細胞のPDGF−誘導応答を研究するためのモデルとして使用することができ、PDGFリガンド結合に応答してシグナルを伝達することに関与する領域が決定され、それらの生理活性についての薬剤を評価する。コードされたレセプターまたはそれらの結合領域は、PDGF類似体を評価するために使用できる。
【0023】
レセプター断片およびその類似体は、PDGFリガンド結合に応答してシグナルを伝達することに関与するレセプターポリペプチドの領域を決定するために使用されるであろう。特に、構造的な特徴物(例えば、リガンド結合決定基)の種々の組み合わせを試験する能力は、リガンド結合親和性に対する重要度、リガンド特異性および生理応答を決定するためにレセプターの特徴を精密に吟味することを可能にする。
【0024】
hPDGF-Rタンパク質は抗体試薬を製造するためにも使用されることが見いだされるであろう。これらの試薬はレセプターポリペプチドと相互作用、刺激、特に分子的相互作用ができるべきである。
PDGF結合能を有する可溶性タンパク質は、診断試料中のPDGF定量のための、リガンド結合のために修飾された決定基と天然、修飾または誘導されたリガンドとの間の結合相互作用の可溶性試験のための、そして hPDGF-Rポリペプチドに対するモノクローナル抗体のスクリーニングのための試薬として、PDGF作用のブロッキングにも有効となるであろう。
【0025】
DNA配列は遺伝的異常(例えば、多くの成長−制御遺伝子が集まる染色体5の領域、 c-kit腫瘍形成遺伝子付近の染色体4の領域における欠損、または再配列)を検出するプローブとして、またはチロシンキナーゼまたはホモロガスな遺伝子をコードする他の遺伝子を検出するためにも使用されるであろう。
【0026】
PDGFレセプターの細胞質性領域の特定領域、その中のキナーゼ挿入(KI)領域は、PDGFレセプターを、他の細胞性タンパク質と相互反応(例えば結合など)させることができる。これらの領域に実質的にホモロガスなペプチドは有機類似体分子と同様に、PDGFレセプターと他のタンパク質との間の相互反応を阻害するために、PDGFレセプターが相互反応するタンパク質を同定、スクリーニングそして精製するために、ならびにこれらのタンパク質をコードする遺伝子をクローニングするために使用できる。これらのホモロガスなペプチドは、医薬的な診断薬および治療用薬剤(例えば、PDGFレセプター活性および他のタンパク質とのレセプター相互反応に影響する)としても使用されるであろう。
【0027】
さらには、リン酸化残基のタンパク質−タンパク質相互反応に対する役割を理解することにより、それは他のレセプターとリン酸化タンパク質に応用される。特定のポリペプチドセグメントまたは実質的ホモロガスなセグメント(例えば、リン酸化部位)の特異的アミノ酸のリン酸化は特に生物学的に重要である。タンパク質相互反応のリン酸化部位および領域の同定は、そのような相互反応を阻害するために有効な試薬を調製するために重要であり、そのようなタンパク質の機能を変調させることを導く。ペプチド類似体もまた、リン酸化残基と相互反応するタンパク質を同定および精製するために、ならびにこれらのタンパク質をコードする遺伝子を単離およびクローニングするために有用であろう。
【0028】
概 要
I.一般的説明
A.PDGF-R
1.構造的特徴
a.細胞外領域
i.シグナル配列
ii.Igドメイン
b.トランスメンブラン セグメント
c.細胞内領域
i.チロシン キナーゼ
ii.挿入体
2.機 能
a.PDGFを結合
b.PDGF-Rペプチドを結合
c.チロシンキナーゼ活性
B.生理学的機能
1.細胞性
2.組織分化
3.生体性
【0029】
II.ポリペプチド
A.可溶性形態
B.末端短縮形態
C.融合タンパク質
D.遺伝的多様性(部位特異的突然変異)
E.タンパク質を含む組成物
【0030】
III.核 酸
A.単離核酸
B.組換え核酸
C.核酸を含む組成物
【0031】
IV.PDGF-Rの作成法
A.タンパク質精製
1.誘導PDGFとの親和性
2.種々のリガンド、同一レセプター
B.核酸の発現
V.抗 体
VI.使用法
A.診 断
B.治 療
【0032】
I.一般的説明
単離された完全長のヒト血小板由来増殖因子(hPDGF)レセプターmRNAは、膜−全長セグメント(トランスメンブランセグメントと呼ばれる)と同様な単一の疎水性ポリペプチドセグメントをコードする。トランスメンブランセグメントに隣接するPDGF-Rアミノのこのセグメントは細胞外領域を形成し、一方トランスメンブランに隣接するカルボキシセグメントは細胞内領域と呼ばれる。アミノ末端から、細胞外領域は NH2−末端疎水性の推定シグナル配列、ならびに第二、第三、第四および第五免疫グロブリン−様ドメイン(それぞれIgII, IgIII, IgIVおよびIgVと呼ばれる)を有する。 hPDGF-Rの外部領域中の様々な構造的特徴が同定されているが、この領域が定める最も重要な機能的性質は、レセプターリガンド(たとえば、PDGFファミリーの員およびその類似体)への結合である。
【0033】
部分的に細胞内領域が、分割されたチロシンキナーゼ構造ドメインの存在により特徴づけられる。ヒトタイプBレセプターポリペプチドにおいて、この領域は約 244残基長であり、約 104アミノ酸の挿入物を有する。表2参照。ヒトタイプAレセプターポリペプチドにおいても、このチロシンキナーゼドメインは約 244残基長であり、約 103アミノ酸の挿入物を有する。表3参照。部分的に機能的にこのドメインはチロシンキナーゼ活性により定義されており、典型的にはリガンドの細胞外領域への結合により変調され、二量体状態で機能するように思われる。リン酸化のための基質は、レセプターポリペプチド鎖に付随する様々なチロシン残基、およびレセプターに結合した他のタンパク質を含む。部分的にチロシンキナーゼドメインも他のチロシンキナーゼ活性含有タンパク質中の同様なドメインに対するそのホモロジーにより定義されている。Yardenら(1986)Nature 323:226-232 を参照。実際の境界自体は、同様なドメインにより定義され、2−3のアミノ酸残基(多分、多くても約7残基)により変化してよいが、しかしおそらく約4残基内、もっとも確実には約1から2残基であろう。タンパク質はそれが原型的に細胞内領域を欠いている場合、実質的に完全な細胞内領域を欠き、特にチロシンキナーゼドメインを欠いており;同様な概念が完全なトランスメンブラン領域の欠損に関しても与えられる。
【0034】
典型的なPDGF-R核酸配列は、一過性の NH2−末端疎水性配列をコードし、これは通常、膜転移過程中に切断される。シグナル配列の古典的な機能は、発生期のポリペプチド鎖を膜結合リボゾームに向かわせ、これによって膜転移を導き、引き続きプロセッシングおよびターゲッティング工程が起こる。シグナル配列は典型的には転移過程で除去されるので、成熟ポリペプチド中にはシグナル配列は無い。しかし、成熟タンパク質の他のアミノ隣接配列の特徴は、レセプター断片の発現、または正しい配置、または標的にも重要であるかもしれない。
【0035】
レセプターの種々の領域についての推定境界を表1に示し、これは一部マウスPDGFとホモロガスであるものから誘導された。特に、疎水性セグメントが同定されて、そしてその構造的ホモロジーと膜全長セグメントの物理的性質の特徴からトランスメンブランセグメントと命名された。このセグメントは、タンパク質を細胞外領域と細胞内領域とに分割する。細胞内領域は、チロシンキナーゼ活性を表すと思われる種々の他のレセプターに対するホモロジーを有し、このレセプターは示すように挿入領域を持たないが、他のチロシンキナーゼセグメントに対して高いホモロジーの領域内にはめ込まれている。
【0036】
【0037】
レセプターの細胞内領域はチロシンキナーゼ活性を含む。PDGFレセプターは分割された、約 103または 104アミノ酸の挿入セグメントを持つチロシンキナーゼドメインが特徴である。この挿入セグメントは調節的な、ならびに以下に詳細に記載する他の性質を有する。
本発明はPDGFレセプターに関連した単離した核酸およびポリペプチドを提供する。単離した分子は実質的に天然の形態に見いだされる天然に存在する分子の物質から分離されたもののひとつである。
【0038】
例えば、単離されたポリペプチドは天然に存在するヒト細胞成分(例えば、ヒト核酸、脂質、および他のタンパク質)から実質的に精製されたもののひとつである。特に目的とするものは遺伝子組換えまたは削除技術によって分離されるであろうポリペプチドの同一領域内のセグメントである。すなわち、本明細書において使用されるように、たとえそれがホモロガスな細胞タイプ中で発現されようとも単離および操作された遺伝子配列の発現生成物は単離ポリペプチドである。ホモロガスな細胞により発現され、合成的に作成された形態または分子は固有の単離分子である。
【0039】
生理学的に、このレセプターは多くの代謝変化(例えばフォスファチジルイノシトールレベル、pH、カルシウムイオンレベル、細胞骨格構造、遺伝子発現、cAMPレベル、およびリガンドレセプターレベル)の開始の要因である。
【0040】
タイプAおよびタイプB PDGFレセプターは、種々の二量体の組み合わせと混合された時、機能的レセプター複合体を作り、また種々のPDGF形態(例えばAA, ABおよびBB形)に対して特徴的な結合親和性も有する。例えば、aタイプBアイソフォームレセプターはBBアイソフォームPDGFに高い親和性で結合し、ABアイソフォームPDGFにはより低い親和性で結合し、そしてAAアイソフォームPDGFには低い親和性かまた親和性を持たない。タイプAアイソフォームレセプターは、AAアイソフォームPDGFに高い親和性で結合し、ABヘテロダイマーおよびBBアイソフォームPDGFには低い親和性を持つ。
【0041】
“リガンド”という用語は、通常血小板由来増殖因子ファミリーの分子を言い、これは増殖因子結合に関与するセグメントに結合する。また、リガンドはレセプターに対する天然のリガンド、またはレセプターの類似体のいずれかを補助する分子であり、結合するか、天然リガンドの機能的類似体である。機能的類似体は構造的変更を有するリガンドであってよく、または適当なリガンド結合決定基と相互反応する分子形を有する全く無関係な分子であってもよい。リガンドはアゴニストまたはアンタゴニストとして役立ち、これについては Goodmanら(編集)(1990) 、グッドマンとギルマン:治療のための薬学的基礎(第8版)、パーガモン出版(Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed) Pergamon Press) を参照のこと。
【0042】
II.ポリペプチド
PDGFレセプターは同様なポリペプチドの二量体で、構成ポリペプチドが二量体化したレセプターのリガンドに対する親和性を決定すると思われる。
AAホモ二量体PDGFリガンドは好ましくは高い親和性で hPDGFレセプターのひとつの形態により結合し、そしてこの形態はAレセプター、αレセプターおよび本明細書中で使用されるように、タイプAレセプターポリペプチド(A-hPDGF-R)として呼ばれるポリペプチド鎖と関連している。レセプターダイマーは明らかにタイプAレセプターポリペプチドのホモダイマーである。
【0043】
BBホモ二量体PDGFリガンドは好ましくは、高い親和性で hPDGF−レセプターの二つと結合する。これらの形態は、Bレセプター、βレセプターおよび本明細書中で使用されるように、タイプBレセプターポリペプチド(B-hPDGF-R)として呼ばれる第二ポリペプチド鎖と関連する。これらのふたつのレセプター二量体形態は、明らかにBレセプターポリペプチドのホモ二量体およびタイプB/タイプA形態のヘテロ二量体である。
【0044】
タイプAおよびタイプBポリペプチドの命名は、各アイソフォームすべての対立遺伝子を網羅することを意図している。すなわち、天然に存在するそれぞれの変異体は本発明に包含され、それらは他の変異体、類似体、および改良された配列である。
ひとつのタイプ B-hPDGF-R対立遺伝子をコードするcDNA配列のヌクレオチド配列が、推定されるレセプター前駆体のアミノ酸配列と共に表2に説明されている(配列番号第:1を見よ)。以下の記載は、マウスおよび他の増殖因子レセプターおよびタンパク質との相似に基づくおおまかな構造的、ならびに機能的特徴を示すものである。
【0045】
アミノ酸番号1から始まる配列はヒトPDGF-Rの成熟形態の推定のアミノ末端に対応する。初めの32アミノ酸(−32から−1と呼ばれる)は、推定されるシグナルペプチド配列をコードする。推定のトランスメンブラン配列はアミノ酸残基val(500)からtrp(524)に対応する。N−グリコシル化の可能性部位は対応するアミノ酸配列がasn(13)-ser(15);asn(57)-thr(50);asn(71)-ser(73);asn(183)- ser(185);asn(198)-thr(200) ;asn(260)-thr(262) ;asn(275)- thr(277);asn(322)-thr(324) ;asn(339)-ser(341) ;asn(436)- ser(438);and asn(447)-thr(449).
の部位である。推定のチロシンキナーゼドメインは、約arg(663)とleu(766)との間のアミノ酸挿入により中断されている、表1参照。推定のポリアデニレーション部位は与えられたcDNA配列の3′末端である。
【0046】
表2.パネルA--?
12418-14ディスクからのタイプ B hPDGF-Rの配列、核酸及びポリペプチド配列の両方の01表をファイル;
ひとつのタイプ A hPDGF-R対立遺伝子をコードするcDNA配列のヌクレオチド配列が、推定されるレセプター前駆体のアミノ酸配列と共に表3に説明されている(配列番号第:3を見よ)。記載された構造的特徴は、ここでもマウスおよび他の増殖因子レセプターおよびタンパク質との相似に基づく。
【0047】
アミノ酸番号1から始まる配列はヒトPDGF-Rの成熟形態の推定のアミノ末端に対応する。初めの23アミノ酸(−23から−1と呼ばれる)は、推定されるシグナルペプチド配列をコードする。推定のトランスメンブラン配列はアミノ酸残基leu(502)からtrp(526)に対応する。N−グリコシル化の可能性部位は対応するアミノ酸配列がasn(19)-ser(21);asn(53)-ser(55);asn(80)-thr(82);asn(156)- thr(158);asn(330)-thr(332) ;asn(336)-thr(338) ;asn(435)- thr(437);and asn(445)-ser(447).
の部位である。推定のチロシンキナーゼドメインは、約lys(665)とleu(767)との間のアミノ酸挿入により中断されている、表1参照。
【0048】
表3.パネルA
12418-14ディスクからのタイプ A hPDGFの配列;02表をファイル;
表2および3に見られるように、推定されるタイプAおよびタイプBレセプターの細胞内チロシンキナーゼドメインは、80%同一残基を有する。推定されるタイプAおよびタイプBレセプターの細胞外領域は約34−35%の同一残基を有し、さらに14%の残りの残基が保存的に置換されている、すなわち同様な化学的性質を有するアミノ酸での置換である。明示された hPDGFレセプターのトランスメンブラン領域は、約48%の同一残基を有する。その52%残基は異なるが、70%は保存的置換である。表に見られるように、両方のレセプター配列は約 103または 104アミノ酸により推定のチロシンキナーゼ領域を中断されるアミノ酸の挿入を有する。ふたつのポリペプチド全体のホモロジーは約44%である。
【0049】
血小板由来増殖因子レセプター(PDGF-R)という用語は、PDGF-Rの特徴的性質を有する組成物を言う。天然のヒトPDGFレセプターは PDGF-Rs種の例であり、その配列は表2および3に開示され、ならびに対立遺伝子変異体である。天然のレセプターは典型的には180kdの分子量を有する膜糖タンパク質である。レセプターは通常は動脈平滑筋細胞、繊維芽細胞、グリア細胞に見いだされるが、通常は内皮細胞または血液細胞中には観察されない。
【0050】
上記のように、PDGFレセプターは3つのおもな同定領域を有する。第一はPDGFに対するリガンド結合決定基を含む細胞外領域であり、すなわちリガンド結合セグメントである。細胞外領域はまた、上記のような特徴を有するIg−様ドメインに分割される。第二の主要同定領域はトランスメンブラン領域であり、そして第三は細胞内領域である。細胞内領域はチロシンキナーゼドメインの特徴的タイプを含有し、キナーゼ挿入(KI)セグメントにより干渉されている。
【0051】
“ヒト”なる記載は、組成物の起源について言う。ひとつの使用において、ひとつの点で、組成物中に、ヒトまたはヒト−由来細胞または天然に存在するヒト細胞からのマイナーな変異体が見い出されることを意味する。タンパク質または核酸または配列に関しては、天然のヒト遺伝子または遺伝子に密接に関連した遺伝子によってコードされる組成物を言う。すなわち、本発明はタンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸を含む。核酸は RNA, cDNA、ゲノム DNA、合成形態、および混合ポリマー、センスおよびアンチセンス鎖の両方を含む。すなわち開示された情報からのタンパク質は、たとえ合成的に作成されても、ヒトの配列であると考えられる。さらに、各アイソフォームの種々の対立遺伝子もそれぞれヒトPDGF-Rであると考えられる。
【0052】
したがって本明細書において使用される目的において、用語ヒトPDGF-Rは、ポリペプチドに適用された時、タンパク質またはポリペプチドを意味し、これは表2または3に表されたアミノ酸配列およびそれらの任意の対立遺伝子またはそれらの断片に実質的にホモロガスである。たいていは hPDGF-Rは記載されたPDGF-R配列に少なくとも約80%ホモロガスであり、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは95%のホモロジーを持つであろう。レセプターは普通、関連配列により提供される hPDGF-Rに共通の幾つかの生物的活性を表すであろう、それは例えばPDGF結合、チロシンキナーゼ結合活性、フォスファチジルイノシトール3′キナーゼ(PI3キナーゼ)結合、または免疫的性質である。 hPDGFレセプターは一次構造が共通な分子形態を包含し、化学的ならびに生物的変更をも包含し、それは例えばグリコシル化、リン酸化、ユビキニゼーション(ubiquinization)、ジスルフィド結合、および基本的な一次構造およびその他の小さな変更である。
【0053】
特に、グリコシル化の変更が含まれ、これは合成及びプロセッシング、またはさらなるプロセッシング過程の間になされるポリペプチドのグリコシル化パターンの変更により作られる。特にこれに付随する好ましい手段は、通常そのようなプロセッシングに与えられる酵素を提供する細胞由来の酵素(例えば哺乳類グリコシル化酵素)にポリペプチドを暴露する。また、リン酸化されたアミノ酸残基である同一一次アミノ酸配列の変異体も包含し、これは例えばリン酸化アミノ酸残基、リン酸化セリンまたはリン酸化スレオニンなどである。
【0054】
タイプ B hPDGF-Rは、上述した性質の hPDGF-Rポリペプチドのアイソフォームであり、その配列のすべての対立遺伝子およびそれに由来するわずかに変更した配列を含む。一般的にこの用語はタンパク質、特にヒトタイプBアイソフォームの特徴である物の断片を含む。対応する意味がタイプ A hPDGF-Rに関しても意図される。
特定の使用において、この用語は機能的レセプターにも適用される。説明したように、機能的形態はタイプAレセプターポリペプチド、またはタイプBレセプターポリペプチドの二量体複合体、またはヘテロ二量体形態であると考えられている。
【0055】
ヘテロロガスな融合タンパク質は、同様な様式で天然に、または非天然に融合したタンパク質またはセグメントの融合である。すなわち、免疫グロブリンと hPDGF-Rポリペプチドとの融合生成物は、典型的なペプチド結合で融合された配列を有する連続的なタンパク質分子であり、典型的には単一の翻訳生成物として作られているが、免疫グロブリンと hPDGF-Rポリペプチドの両方に依存した性質を表す。同様な概念がヘテロロガスな核酸配列にも適用される。
【0056】
ポリペプチド断片またはセグメントは、少なくとも約5アミノ酸のアミノ酸残基に伸長しており、しばしばそれは少なくとも約7アミノ酸、通常は少なくとも約9アミノ酸、より普通には少なくとも約11アミノ酸、典型的には少なくとも約13アミノ酸、より典型的には少なくとも約15アミノ酸であり、種々の態様において少なくとも約17アミノ酸である。核酸においては、断片またはセグメントは少なくとも約6ヌクレオチドのヌクレオチド残基に伸長しており、しばしばそれは少なくとも約9ヌクレオチド、通常は少なくとも約12ヌクレオチド、より普通には少なくとも約15ヌクレオチド、典型的には少なくとも約18ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約21ヌクレオチドであり、種々の態様において少なくとも約24またはそれより多いヌクレオチドである。
【0057】
ポリペプチド断片は、天然のポリペプチドまたは断片(例えばPDGF-Rポリペプチド)の活性の特徴に実質的に寄与する時、“生理学的に活性”である。典型的には、 hPDGF-Rポリペプチドは機能的レセプターと結合した時、生物的状況(例えば生物体内、またはインビトロの生物的状況)においてレセプターにより達成される一組の活性を有する。 hPDGF-Rの場合には、機能的断片はこれらの生理学的活性、または hPDGF-Rレセプターの特徴とする活性を有し、これはPDGF結合、チロシンキナーゼ活性、およびレセプターに仲介されるマイトジェン性のまたは他の細胞性応答を含む。しかしタンパク質断片は、生命維持に必要な構造的な拘束のような他の特異的または固有の機能を表すこともでき、グリコシル化のための基質部位を提供し、細胞性標的のシグナル配列に寄与し、マウスPDGF-Rにおいて特徴的なエピトープの不在を与え、または固有に所有されている、現在は認識されていない機能を与える。
【0058】
ポリペプチドの溶解性は、条件およびポリペプチドに依存する。多くのパラメーターがポリペプチドの溶解性に影響し、それには温度、電解質条件、ポリペプチドの大きさや分子の特徴、そして溶媒の性質が含まれる。ポリペプチドが使用される温度は典型的には約4℃から約65℃の範囲である。通常は温度は約18℃よりも高い温度が使用され、より普通には約22℃よりも高い。診断の目的には、温度は通常およそ室温またはより暖かいが、アッセイ中の成分の変性温度よりは低いであろう。治療の目的には温度は通常は体温であり、典型的にはヒトには37℃、しかし特定の状況においては、温度はその部位またはインビトロでより高く、または低くてよい。
【0059】
電解質は通常、およそその場所での生理条件であるが、有利により高い、または低いイオン強度に変更してよい。実際のイオンは、使用される生理的または分析状況の標準緩衝液に合うように変更してよい。
ポリペプチドの大きさおよび構造は、一般的に実質的に安定な球状であり、通常は変性状態ではない。ポリペプチドは、4量体で他のポリペプチドと会合してもよく、例えば溶解性を付与する。
溶媒は通常生物適合性の緩衝液であり、生物活性を保存するために使用され、通常はおよそ生理的な溶媒であろう。界面活性剤、典型的には緩和な非−変性のものが加えられる場合もある。
【0060】
溶解性は通常、スベドベリ単位で測定され、これは特定条件下の分子の沈降速度の測定である。沈降速度の測定は古典的に分析超遠心法で行われたが、現在では典型的には標準的な遠心で行われる。Freifelder (1982) Physical Biochemistry (第二版), W.H.FreemanおよびCantorおよびSchimmel (1980) Biophysical Chemistry 、第1−3部、W.H.Freeman & Co., サンフランシスコ、を参照、これらは参照により本明細書に編入される。大まかな測定として、推定される可溶性ポリペプチドを含有する試料を標準的な全サイズ超遠心に、約50Krpmで10分かけると、可溶性分子は上澄みに留まるであろう。可溶性粒子またはポリペプチドは典型的には約30Sより小さいであろう、より典型的には15Sより小さく、通常約10Sより小さく、より通常には約6Sより小さいであろう、特定の態様においては、好ましくは約4Sより小さく、より好ましくは3Sより小さいであろう。
【0061】
本明細書で提供されるPDGFレセプターまたはレセプターの特別な細胞外領域は、それぞれのPDGFへの親和性により精製されて使用することができる。完全長、または全細胞外領域は、表2のタイプBレセプターのリガンド−結合決定基を含むが、約leu(1)からlys(499)に広がる。完全長、または全細胞外領域は、表3のタイプA hPDGF-Rのリガンド−結合決定基を含むが、約gln(1)からglu(501)に広がる。リガンド−結合決定基は種々のPDGFレセプター対立遺伝子により変化し、いずれも全細胞外領域の5%である。リガンド結合に必須な最小量のタンパク質配列は、細胞外量の種々のセグメントを切り出して、リガンド結合を測定することにより決定される。リガンド−レセプター相互反応の研究は、リガンド−結合領域がレセプターの細胞外領域に位置していることを指示する。リガンド結合の特異性に対する種々の残基の効果に関する、より洗練された研究も、本発明の試薬により可能となる。本出願に使用される時、本発明のPDGFレセプターまたはPDGF-Rリガンド−結合活性は、PDGF、PDGFアゴニストまたはアンタゴニストまたは hPDGFレセプターに特異的な他のリガンドに結合できる能力を持つことを意味する。通常このようなリガンドはPDGFファミリーの一員であり、典型的にはヒトからの形態であろう。それゆえに、外部領域は類似体がアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確立するために有用である。
【0062】
PDGF-Rは、他の多くの増殖因子レセプターと同様に天然に多量体複合体として見いだされるであろう、二量体形が最も存在すると思われる。即ち、レセプターの他の重要領域は、細胞外またはそうではないこれらのセグメントであろうし、これは二量体化またはタンパク質−タンパク質相互反応に関与する。
【0063】
完全長のポリペプチドに加えて、本発明は生物的に活性なポリペプチドの断片またはその類似体を提供し、ペプチドの相互反応を刺激する有機分子を含む。有意な生物的活性には、リガンド−結合、免疫的性質、二量体会合、キナーゼ基質としての役割、PDGF-Rタンパク質に特異的結合するための他のメディエーターとの相互反応、そしてヒトPDGFレセプターポリペプチドの特徴である他の生物的活性がある。免疫的活性には、標的とする免疫系での免疫原性機能を含み、結合について免疫的エピトープを共有し、ヒトPDGFレセプターエピトープについて競合体または置換抗原のいずれかの役割を果たす。これらの免疫的活性のアッセイは当業界に周知であり、以下の実験法の章を参照にされたい;HarlowおよびLane (1989) Antibodies:A Laboratory Manual 、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク;およびEscobedoら (1988) J.Biol.Chem. 263: 1482-1487 、これらは参照により本明細書に編入される。例えば、リガンド−結合または他のセグメントは異なる新たな融合ポリペプチドまたは断片との間で“交換”できる。すなわち、特異性の新たな組み合わせを表す新たなキメラポリペプチドがリガンド−結合特異性および細胞内領域との機能的連結から生じるであろう。例えば、他の関連するポリペプチドからのIgドメインが加えられるか、またはこれらのレセプターのIg−様ドメインと置換されるであろう。生成したタンパク質はしばしば、ハイブリッド機能および性質を持つであろう。
【0064】
免疫的性質に関しては、連続的に反復するポリペプチドセグメントである免疫原性で作られることができ、これによって高度に免疫原性のタンパク質を作成する。別法として、そのようなポリペプチドは特異的結合に対する高度に有効な競合体を提供するであろう。 hPDGFレセプターポリペプチドに対する抗体の生産は以下に記載する。
【0065】
本発明はPDGFレセプターの断片およびそれに実質的にホモロガスなポリペプチドを含む他のポリペプチドも提供する。本発明のレセプターペプチドは一般的に、天然に存在する hPDGFレセプターの配列と少なくとも約80%のホモロジーを表し、典型的には天然のレセプター配列と少なくとも約85%、より典型的には少なくとも約90%のホモロジー、通常は少なくとも約95%のホモロジー、より通常には少なくとも約97%のホモロジーを有する。比較配列の長さは一般的には少なくとも約16アミノ酸を表し、通常は少なくとも約20残基、より通常には少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残基、好ましくは約35残基より長い。
【0066】
ポリペプチドに関するホモロジーは、典型的には配列分析用ソフトウェアを使用して(例えばウィスコンシン州 53705,マジソン,ユニバーシティーアベニュー1710、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターのジェネティクス コンピューター グループの配列分析ソフトウェアパッケージを参照)測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、削除、置換および他の修飾が与えられたホモロジーの測定を使用した同様な配列と合致する。保存的置換は典型的には以下の群内の置換を含む:グリシン、アラニン:バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リシン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。
【0067】
レセプターと他のホモロガスな、またはヘテロロガスなタンパク質との間の融合ポリペプチドも提供される。ホモロガスなポリペプチドは種々の増殖因子レセプター間で融合されることができ、結果として例えばハイブリッドタンパク質はひとつのレセプターのリガンド特異性ともうひとつの細胞内領域を表し、またはレセプターは、広がった、または弱められた結合特異性を有することができる。同様にヘテロロガスな融合は誘導タンパク質の性質または活性の組み合わせを表すように構成される。典型的な例はレポーターポリペプチド(例えばルシフェラーゼ)とレセプター(例えばリガンド−結合セグメント)のセグメントまたはドメインとの融合であり、所望のリガンドの存在および位置が容易に決定されることができる。例えば、Dullら、米国特許第 4,859,609(これは参照により本明細書に編入される)を参照にされたい。他の遺伝子融合対には、細菌性β−ガラクトシダーゼ、trpE、プロテインA、β−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母アルファ融合因子がある。例えば、Godowskiら (1988) 、Science 241:812-816 を参照。
【0068】
そのようなポリペプチドはリン酸化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分の付加、特にリン酸基と同様な分子形を有するものにより化学的に改変されたアミノ酸残基を有してもよい。ある態様においては、改変は試薬を標識するために、または精製の標的(例えばアフィニティーリガンド)として提供されて有効となる。
融合タンパク質は典型的には組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれかで作ることができる。核酸操作法に関する技術は一般的に記載されているが、例えばSambrookら (1989) 、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第二版)、1−3巻これは参照により本明細書に編入される。合成ポリペプチド法に関する技術は例えばMerrifield (1963) J.Amer.Chem.Soc. 85 :2149-2156 ;Merrifield (1989) Science 232:341-347 ;およびAthertonら (1986) 固相ペプチド合成:実践的研究 (Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach) 、 IRL出版、オックスフォード;これらのそれぞれは参照により本明細書に編入される。
【0069】
完全なレセプターの断片も本明細書に包含される。種々の断片にはトランスメンブラン セグメント(これは細胞表面付着機能を付与する)を含む。細胞内または細胞外セグメントのいずれかが削除されている種々の断片が生産される。例えば、PDGFレセプターまたは他のタンパク質のトランスメンブラン セグメントを含む断片はリガンド結合決定基と組合わされて、リガンド結合領域が結合した膜を提供するであろう。細胞内領域との同様な構造物を調製することができ、例えばチロシンキナーゼ セグメントを結合した膜を生成する。
【0070】
特に、リガンド結合決定基を含む可溶性断片が、遊離のリガンドを吸着するために作成されるであろう。この可溶性断片は診断および治療の目的でPDGF仲介応答をブロックするために使用できる。
もうひとつの態様において、細胞内断片と類似体が調製されるであろう。チロシンキナーゼドメイン中のキナーゼ挿入領域(KI)は特に有用な断片であり以下に記載される。
【0071】
タンパク質のリン酸化領域のペプチド類似体は、他のタンパク質のリン酸化領域とホモロジーな実質的に一次配列を有するペプチドである。そして少なくともひとつのリン酸化または同様に誘導された残基を、他のタンパク質のリン酸化領域中の同様なリン酸化領域の対応する位置に有する。そのような領域がふたつまたはそれより多くのリン酸化領域を有する所では、特定の態様において、ペプチド類似体は唯一のそのようなリン酸化または同様に誘導された残基を有するであろう。そのようなリン酸化残基は一般的に、フォスフォチロシン、フォスフォセリン、またはフォスフォスレオニンがある。このペプチド類似体は、ある場合には、ひとつまたはそれより多くの非天然アミノ酸を有するであろう、それは例えばビオチン化、リン酸化、スルホン化、またはグリコシル化により化学的に改変された残基を含む。それは一般的にモノマーまたは反復ペプチド単位のマルチマーであろう。そしてしばしばヘテロロガスなタンパク質またはペプチド断片と結合するであろう。そのようなヘテロロガスなタンパク質またはペプチドは(例えば、免疫グロブリン、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、trpEまたはプロテインA)である。Godowskiら (1988) Science 241:812-816 を参照。そのようなペプチド類似体は一般的に可溶性、または固相支持体に結合している(例えばニトロセルロース、ナイロン、カラム充填物質(例えば Sepharoseビーズ)、磁気ビーズ、ガラスウール、細胞または他の物質。
【0072】
正常タンパク質の機能に重要なタンパク質のリン酸化領域は、しばしば多くの方法によって同定されるであろう。例えば、欠損や点突然変異でもうひとつのタンパク質に対する結合能力が変化した突然変異タンパク質、改変された酵素活性または他のタンパク質の性質の改良の分析である。方法は当業界において周知であり、インビボでペプチド領域がリン酸化されているかを決定することができる。例えば、KazlauskasおよびCooper (1989) Cell 58 :1121-1133 ; Williams (1989) Science 243 :1564-1570 ;およびWahlら (1990) J.Biol.Chem. 265:3944を参照。直接的な構造決定(例えば、x−線結晶解析または2D-NMR)を使用して位置および相互反応を測定でき、これはリガンドとエフェクター結合活性の両方のどの改変が相互反応に影響するかを導く。
【0073】
種々の細胞外領域中および細胞内領域態様において、断片は一般的に少なくとも約1200ダルトン、しばしば少なくとも2400ダルトン、典型的には少なくとも3000ダルトン、より典型的には少なくとも3600ダルトン、そして好ましい態様の幾つかにおいては少なくとも4200ダルトンまたはそれより大きい。
【0074】
III.核 酸
本発明の核酸組成物は一般的に RNAまたは DNA形であるが、混合したポリマーでもあるだろう。記載された DNAの態様は、通常ゲノム DNAまたはcDNA、合成により調製されたものから由来したものであるか、またはそれらの混合物であろう。 DNA組成物は一般的に、 hPDGF-Rまたはその断片をコードする完全なコード領域を含み、例えば少なくとも8コドン(24bp)、通常は少なくとも12コドン、より通常には少なくとも約15コドン、典型的には少なくとも約20コドン、より典型的には少なくとも約30コドン、そしてこのましくはそれより大きい。ひとつまたはそれより多いイントロンが存在してもよい。
【0075】
hPDGF-Rという用語は、核酸に適用された場合、おおざっぱにhPDGF-Rポリペプチド、断片または変異体を言い、タンパク質融合体または欠損変異体を含む。配列またはその相補体が、ヌクレオチドトリプレットのユニバーサルコードにより与えられ、ポリペプチドの一次構造に翻訳される時、核酸はポリペプチドをコードする。
“単離された”核酸は核酸(例えば、RNA, DNAまたは混合ポリマー)であり、これは実質的に天然のヒト配列(例えば、リボゾーム、ポリメラーゼおよび他のヒトゲノム配列)に天然に付随する他のDNA配列から分離される。この用語は天然に存在する環境から取り出された核酸を包含し、ならびに組換えまたはクローン化 DNA単離物および化学的に合成された類似体または生物的にヘテロロガスな系で合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子には分子の単離形態を含む。単離核酸は一般的に分子が均一な組成物だが、ある態様においてはわずかな異成分を含むだろう。この異質性は典型的にはポリマーの末端または部分に見いだされ、所望の生物機能または活性には重要ではない。
【0076】
“コードする”という用語は、一般的に翻訳できる形態中に存在する配列情報を言い、通常は操作できるようにプロモーターに連結されている。機能的プロモーターがその配列の翻訳または発現を増大する時、配列は操作できるようにプロモーターに連結される。同じ情報内容がすぐにアクセスできる形態に存在し、特にセンス鎖の発現を促進する配列に連結されている場合、アンチ−センス鎖もその配列をコードしていると考えられる。情報は遺伝子コードの標準法または改良法を使用して転換できる。例えば、Watsonら (1987) 、The Molecular Biology of the Gene (第4版)、第1および2巻、ベンジャミン,メンロパーク カリフォルニア州(Benjamin, MenloPark, California)。
【0077】
“組換え”という用語は天然には存在しない核酸配列を言い、またはふたつの異なる分離している配列のセグメントの人工的組み合わせにより作られたものを言う。この人工的組み合わせはしばしば化学合成手段または核酸の単離セグメントの人工的操作(例えば、遺伝子工学的技術による)による。それは通常、典型的には配列認識部位に導入または除去して、コドンを同一または保存的アミノ酸をコードする重複するコドンに置き換える。別法として、所望の機能の核酸セグメントを一緒に繋いで通常天然には存在しない、所望の機能の組み合わせを含む単一の遺伝的産物を生成する。制限酵素認識部位はしばしばそのような人工的操作物の標的であり、例えばプロモーター、 DNA複製部位、制御配列、コントロール配列、または設計により有効な特徴を組み入れることができる。同じ概念は組換え(例えば融合、ポリペプチド)にも意図される。ホモロガスな配列は、比較した時、同一性を表す。核酸についてホモロジーに関する基準は、この技術について一般的に使用されるホモロジーについての測定か、またはハイブリダイゼーション条件のいずれかで表される。ハイブリダイゼーション条件は以下に記載されるが、さらに対応するヒトとマウスセグメントとの間のホモロジーにより制限される。記載したパラメーターに加えて、記載したホモロジー特異性は比較されるセグメントである対応するマウスセグメントが、記載されたヒトセグメントに適合するための十分な条件によって制限されるように、ホモロジーはヒトとマウス配列の間の同一性によって制限されるであろう。
【0078】
核酸内容物中の実質的なホモロジーとは、比較する場合、セグメントまたはそれらの相補鎖のいずれかが、適当なヌクレオチド挿入および削除を有して至適に配列した時に、少なくとも約60%残基、通常は少なくとも約70%、より通常には少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、そしてより好ましくは少なくとも95−98%のヌクレオチドの同一性を意味する。択一的に、実質的なホモロジーはセグメントが選択的条件下において鎖またはその相補鎖、典型的には表2または3から由来した配列を使用したものにハイブリダイズする時にホモロジーが存在する。ハイブリダイゼーションの選択性はハイブリダイゼーションの発生が特異性が全く無い場合よりもより選択的である時に存在する。典型的には選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約14ヌクレオチドの長さにわたって、少なくとも約55%のホモロジー、好ましくは約65%、より好ましくは少なくとも75%、そして最も好ましくは少なくとも約90%ある時に起こるであろう。Kanehisa (1984) Nuc.Acid Res. 12 :203-213を参照のこと(これは参照により本明細書に編入される)。記載したようにホモロジーの長さの比較は、より長くてもよく、そして特定の態様においては、しばしば少なくとも約17ヌクレオチドの長さにわたり、通常は少なくとも約20ヌクレオチド、より通常には少なくとも約24ヌクレオチド、典型的には少なくとも約28ヌクレオチドより典型的には少なくとも約32ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約36ヌクレオチドかそれより長い。ホモロジーに関するストリンジェント条件は、典型的にハイブリダイゼーション反応において制御された塩、温度、有機溶媒および他のパラメーター条件の組み合わされたストリンジェンシーになるであろう。ストリンジェントな温度条件は一般的に30℃を越える温度、典型的には37℃を越え、そして好ましくは45℃を越える。ストリンジェントな塩条件は、通常は1000mMより低く、典型的には 500mMより低く、そして好ましくは 200mMよりも低い。しかしパラメーターの組み合わせは任意の単一パラメーターの測定よりもさらにより重要である。WetmurおよびDavidson (1968) J.Mol.Biol. 31 :349-370 を参照のこと(これは参照により本明細書に編入される)。
【0079】
これらの対立遺伝子の野生型タイプが一般的に採用されるが、ある状況においてはひとつまたはそれ以上の突然変異、わずかな変更を導入してもよく、それは例えば削除、置換または挿入のようなものであり、アミノ酸配列の変更を生じ、アミノ酸配列またはアミノまたはカルボキシ末端のわずかな突然変異または変更を与える。hPDGF-Rともうひとつのタンパク質との間の遺伝子融合、またはタイプAとタイプB形との間の融合が有効になる状況もある。通常ゲノム性の核酸は、しばしば約50kbを越えることは無く、より頻繁には約40kbを越えることは無く、典型的には約30kbを越えることは無く、より典型的には約20kbを越えることは無く、通常は約10kbを越えることはなく、そして種々の態様において、好ましくは約6kbを越えないであろう。そのような配列は任意のまたはすべてのイントロンが除去されてよい。
【0080】
hPDGF-Rをコードする DNA断片は、実質的に hPDGF-Rとホモロジーを共有する他の種のPDGFレセプターをコードする DNAを単離するために有用である。細胞内チロシンキナーゼ領域からの断片を使用して他のチロシンキナーゼを単離することができる。少なくとも約10ヌクレオチド、通常には少なくとも約20ヌクレオチド、より通常には少なくとも約30ヌクレオチドを有する DNA断片の部分、および hPDGF-Rをコードする DNA配列からの約6knt(キロヌクレオチド)より少ない、通常は約0.5kntより少ない部分がプローブとして使用される。このプローブは hPDGF-Rまたはその断片をコードする RNAが細胞に存在するかどうかを決定するために使用できる。
【0081】
加えて、タイプBヒトPDGFレセプター遺伝子は染色体5に位置し、ここには多くの成長制御関連遺伝子が集まっている。すくなくともひとつの遺伝子疾患、5qマイナス症候群はこの領域の欠損が関与することが示された。タイプAレセプター遺伝子は、 c-kitガン原遺伝子に近い染色体4に位置する。これらの配列はしばしば無欠の遺伝子であり、これらの染色体領域の完全性を診断するために使用されるであろう。 hPDGF-R遺伝子配列の断片は、マーカーとしてゲノムのこれらの重要な構造を釣り上げて、ゲノムのこれら領域に関連する遺伝子疾患を診断するために使用される。択一的にこの配列は染色体領域の完全性を試験するための他の断片を単離するために有効である。
【0082】
本発明の融合タンパク質を製造するために使用される組換え核酸配列は、頻繁には天然または合成配列から由来するものである。多くの天然遺伝子配列は種々のライブラリー、cDNAまたはゲノムから適当なプローブを使用して入手可能である。国立衛生研究所のGenBankTMを参照。ヒトPDGFレセプターの典型的プローブは、標準法に従い表2または3の配列から、またはそれらの対立遺伝子から選択されるであろう。BeaucageおよびCarruthers (1981) Tetra. Letts. 22 :1859-1862 により記載されたフォスフォアミダイト法は適当な合成 DNA断片を生成するであろう。二重鎖断片は、相補鎖を合成して適当な条件下で鎖をアニーリングするか、または適当なプライマー配列を有する DNAポリメラーゼを使用して相補鎖を加えることによりしばしば得られる。
【0083】
IV.PDGF レセプター及び断片を作成するための方法
本発明で提供される新規核酸はPDGFレセプターを作成するために有効である。 DNA断片またはそれらの部分は、 hPDGF-Rのための発現構造物を調製するために使用される。発現構造物は通常は、天然のまたは他のプロモーターの転写制御下で hPDGF-Rをコードするひとつまたはそれより多い DNA配列を含む。 hPDGF-Rをコードするひとつより多い配列が構造物中に存在する時、配列はレセプターの同一または異なる形態(通常は異なる)をコードするであろう。通常プロモーターは哺乳類細胞で発現するための真核生物プロモーターであり、哺乳類細胞はPDGFレセプターがあっても無くてもよい。転写制御配列は典型的にはヘテロロガスなエンハンサーまたはプロモーターを含み、それは宿主により認識されている。適当なプロモーターの選択は、宿主に依存するが、trp, lacおよびファージプロモーター、tRNAプロモーターおよび糖溶解酵素プロモーターのようなプロモーターが知られている。例えばSambrookら (1989) を参照。便利なことには、複製システム、転写および翻訳制御配列とともに繊維芽増殖因子レセプター DNA配列の挿入部位を含む入手可能な発現ベクターを使用することができる。細胞系と発現ベクターとの作業可能な例は、Sambrookら (1989) 同上、 Metzgerら (1988) 、Nature 334:31-36 、それぞれ参照により本明細書に編入される。特に非−真菌中で発現が起こる場合、非−真菌、プロモーターが好ましい。時には他の細胞タイプ中で配列を発現させることが有効かもしれないし、適当なプロモーターを選択できる。そして場合によっては、誘導可能なプロモーターが好ましい。他の状況では、異なる細胞タイプにより与えられる同様なグリコシル化パターンを提供するグリコシル化酵素を同時発現することが望まれる。
【0084】
原核生物宿主中で DNA配列を伸ばしたり、またはレセプタータンパク質またはその断片を生成したい場合には、好ましいプロモーターは原核生物プロモーターであり、例えばtrp, lacおよびlambdaであり、その他の有用な原核生物プロモーターについてはSambrookら (1989) を参照されたい。通常、強力なプロモーターを使用する高レベルの転写および発現が提供されるであろう。
【0085】
発現構造物はしばしば適当な細胞性宿主中で染色外で安定に存在できるベクター中に含有されるか、または宿主のゲノム中に統合される。発現構造物は宿主中へ挿入できる配列によって境界を定めることができ、例えば、トランスポゾン配列、溶原性のウイルス配列などである。通常マーカーが発現構造物に与えられ、これはその発現構造物を有する宿主細胞の選択を可能にする。マーカーは同じDNA分子であってもなくてもよく、好ましくは同じ DNA分子である。
哺乳類細胞において、レセプター遺伝子それ自体が便利なマーカーを提供するであろう。しかし、原核生物細胞中では細胞毒性剤、原栄養体への栄養要求性宿主の付与、検出できる生成物の生産などのマーカーがより便利であろう。
【0086】
発現構造物は目的宿主細胞によって認識される複製系に結合される。種々の複製系にはウイルス複製系(例えばレトロウイルス、シミアン、ウイルス、ウシパピローマウイルス、などのような)を含む。加えて構造物は増幅しうる遺伝子に連結され(例えばDHFR遺伝子)所望の hPDGF-R遺伝子の多数のコピーを作ることができる。Schimke, R.(1984) Cell 37 :705-713 、および Kaufmanら (1985) Mol.Cell.Biol. 5:1750-1759 ;それぞれ参照により本明細書に編入される。
【0087】
特にレセプターポリペプチドを、非真菌のグリコシル化パターンを与える系で発現させることが望まれる。この場合には通常のパターンはその発現系により自然に提供されるものとなる。しかしパターンは、ヘテロロガスな発現系に導入された適当なグリコシル化タンパク質に暴露させることにより、例えば非グリコシル化形態に変更されるであろう。例えばPDGFレセプター遺伝子は、哺乳類または他のグリコシル化酵素(好ましくは非真菌種から、ある態様においては非ヒト種から生成した)をコードするひとつまたはそれより多くの遺伝子と共に同時トランスフェクションされることができる。この方法を使用して特定の哺乳類グリコシル化パターンが原核生物または他の細胞から達成される。
【0088】
発現構造物を宿主細胞に導入する手段は特定構造および標的宿主により変化する。導入は任意の便利な手段により達成することができ、それには融合、接合、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、注入などが含まれる。例えばSambrookら(1989)、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーガイド、第3巻、コールドスプリングハーバ−出版、これは参照により本明細書に編入される。レセプターの種々の形態をコードする構造物の単一細胞への導入も意図されている。宿主は通常不滅化細胞である(例えば培養中に連続的に継代生育できる細胞)。大部分、これらの細胞は便利な哺乳類細胞であり、 hPDGF-Rを発現でき、ならびに所望により適当な成熟ポリペプチドを提供するように操作することができる。操作により、意図されるものはグリコシル化、ユビキチネーション、ジスルフィド結合形成、一般的な翻訳後修飾などである。通常宿主は hPDGF-Rを細胞の膜に挿入するためのシグナル配列を認識する。分泌が望まれる場合は、トランスメンブラン配列を一般的に削除または突然変異してタンパク質の膜配位を防ぐ。
【0089】
原核生物および真核生物の両方の広範な宿主がペプチドの発現に使用される。有用な宿主は細菌、例えばE. Coli., 酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、典型的には不滅化された種々のマウス細胞系、サル細胞系、チャイニーズハムスター卵巣細胞系、ヒト細胞系、それらの誘導物などである。ある場合には、細胞は悪性宿主誘導細胞で、または野生型細胞はガン遺伝子、腫瘍発生ウイルスなどで形質転換されるであろう。
【0090】
ある状況下においては、例えばシグナル配列およびトランスメンブラン領域が細胞膜のレセプターペプチドを支配する構造物でPDGFレセプターを欠く哺乳類細胞をトランスフェクトすることが望まれる。形質転換またはトランスフェクトした細胞の子孫も包含することを意図する。リンパ球および心筋細胞がレセプター欠如の主な細胞例である。チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、内皮細胞系および多くのヒト腫瘍細胞系もPDGFレセプターを欠く。
hPDGFレセプターおよび断片を含む組成物および細胞は、 hPDGFレセプターに付随する診断の目的に、ならびに疾患および医学的状況を研究または処置するために使用できる。可溶性細胞外リガンド結合断片の使用は、既に一般的に記載されている。加えて、細胞内領域の種々のセグメントは、リン酸化アミノ酸残基を含む。リン酸化の部位はセグメントと他のポリペプチドとの反応に重要である。反応の性質および特異性は、リン酸化の有無および完全なレセプターの断片、または関連配列に高度に依存しており、反応を変調するために有効である。すなわち、細胞内領域断片には重要な使用目的を見いだす。
【0091】
明らかな配列を含有するクローニング媒体を発現する細胞は、特定の活性に影響を与えるために必要なPDGFレセプターの特異的部位を定めるために使用できる。別法として、これらの細胞は選択したレセプターが種々のリガンド(PDGFおよび類似体)に結合する能力を評価して、これによりPDGF−誘導の細胞応答を促進または阻害するための薬剤の能力を評価する有力な手段を提供する。
【0092】
完全長の天然PDGF-R配列を含有する DNAまたはmRNAをトランスフェクト、注入、感染またはエレクトロポレーションした細胞は、天然または野生型レセプターを発現し、従ってしばしば完全長セグメントよりも少ない応答は所望の同等な機能を有するであろう。精製レセプターまたはレセプターポリペプチド断片の特異的濃度は、リガンド(PDGF)の天然PDGFレセプターへの結合をブロックするために使用できる。別法として、レセプターまたは断片に対する抗体も同様の効果を有する。特に、本明細書では細胞外領域のエピトープに対する抗体がリガンド−レセプター結合をブロックできることを実証した。他の抗体はレセプターポリペプチドの二量体化をブロックするであろう、そして従ってレセプター機能を変調するであろう。
均一で明らかなポリペプチドおよび DNA配列が、抗体上昇とその結合の特異性を定めるために使用できるであろう。特に、レセプターの特異的領域(例えばリガンド−結合セグメント)に対する抗体は診断および治療に使用されるであろう。レセプターの領域に特異的なPDGF-R、PDGF-Rポリペプチド、および抗体試薬は、PDGF仲介活性の制御を研究するために使用できる。細胞内断片(特にキナーゼ挿入セグメント)は重要な使用法を有するであろう。
【0093】
PDGFは組織修復、胚形性に役割を持ち、ならびにアテローム硬化症、骨髄増殖性疾患およびいくつかの癌に関与するらしい。これらの症状の処置は可溶性細胞外断片または抗体の治療的投与による弱化に対応する。例えばPDGFアゴニストは細胞の増殖的成長を刺激し、ひとつの効果は傷の修復、筋肉再生、および動脈壁増殖に極めて有効である。PDGFアンタゴニストはいくつかの場合は過剰な応答を遮断するため、またはPDGF応答を変調するために使用される。
【0094】
ヒトPDGF-R細胞外領域からの約5から 200の間の、好ましくは約10または15から50の間の可溶性PDGF-Rポリペプチドを含有する組成物が記載されている。ひとつの態様において、ポリペプチドは表2のタイプBヒトPDGFレセプターの残基1から 499からの、または表3のタイプAヒトPDGFレセプターの残基1から 501からの少なくとも約80アミノ酸を含有する。
もうひとつの態様において、細胞内領域の断片は種々の使用法を有する。特に、KI領域は、およびその断片または類似体は、リン酸化領域の相互反応を、認識相互反応(通常はもうひとつのタンパク質による結合)でブロックまたは変調するために使用される。これらの相互反応はしばしばさらなるシグナル伝達および細胞応答に重要である。
【0095】
トランスフェクトした細胞により発現された hPDGF-Rタンパク質にも様々な使用法がある。もしペプチドが分泌されると、ペプチドは典型的には発現宿主が生育する上澄みから単離されるであろう。分泌されない場合、典型的にはペプチドは例えば溶解物から単離されるであろう。このペプチドは一般的には、HPLC、電気泳動、勾配遠心、アフィニティークロマトグラフィー、(例えばPDGFカラムクロマトグラフィーを使用する)、および他のタンパク質生化学に使用されるタンパク質精製法を使用する便利な技術によって単離され、実質的に純粋な生成物(例えば特に細胞成分混入物を含まない)が得られる。例えばJacoby (1984) Method in Enzymology、第 104巻、アカデミックプレス、ニューヨーク;Scopes (1987) タンパク質生成:理論と実践(Protein Purification:Principle and Practice、(第2版)、スプリンガー ファーラーグ(Springer Verlag)、ニューヨーク;ドイツ(編集)(1990) タンパク質精製ガイド(Guide to Protein Purification)、Method in Enzymology、第 182巻;それぞれは参照により本明細書に編入される。
【0096】
タイプBレセプターの約leu(1)から始まりlys(499)のアミノ末端配列のレセプタータンパク質、またはタイプAレセプターの約gln (1) からglu(501)のアミノ末端配列のレセプタータンパク質アミノ酸は、これらは全細胞外領域を形成し、そして特にレセプタータンパク質のPDGFリガンド結合部位を形成するが、PDGFのアフィニティー精製に有用であると思われる。細胞外領域は、PDGFアゴニストおよびアンタゴニストとして有用な薬剤を定めるために固体支持体に固定するか、または溶液中に自由に存在して使用できる。
【0097】
タンパク質の細胞内領域は、タイプBレセプターの約val(500)から始まりカルボキシ末端まで、またはタイプAレセプターのleu(502)からのカルボキシ末端までであるが、これらも周知技術によるタンパク質リン酸化のためのチロシンキナーゼとして使用される。加えて、タイプBレセプターのアミノ末端配列のアミノ酸met(−32) からGly(−1)、およびタイプAレセプターの約met(−23) からCys(−1)は、トランスフェクトした細胞膜を貫通する構造タンパク質を支配するシグナル配列を構成する。これらのシグナル配列は hPDGF-Rと共に使用されるが、他のタンパク質と融合される場合は、そのタンパク質と共に使用されると期待される。
【0098】
ヒトPDGFレセプターポリペプチド断片は、短縮された核酸配列の直接的発現または hPDGFレセプターの標準的プロテアーゼ処理のいずれかによって生成され、好ましくは精製される。いずれの方法のための試薬も本明細書で提供される。
【0099】
診断目的として、これらの試薬は標的試料中のPDGFまたはPDGFレセプターの測定法を提供する。その測定法は:
標的試料を hPDGFレセプターポリペプチドセグメントと混合し;
そして該ポリペプチドと該試料の間の結合の程度を決定する、工程からなる。
【0100】
本発明は形質転換細胞も提供し、これは初代形質転換体の子孫も含み、少なくともヒトPDGFレセプターのセグメントにホモロガスなポリペプチドを発現することができる。好適な態様は、細胞が実質的にヒトPDGFレセプターの全細胞外領域にホモロガスなポリペプチドを発現する場合であり、可溶性タンパク質を含む。
【0101】
V.抗 体
種々のPDGFレセプターおよびペプチド断片に対するポリクローナルおよび/またはモノクローナルも調製できる。合成ペプチドはペプチド合成機で調製でき、キャリアー分子(例えば、カギ穴巻貝ヘモシアニン)に結合して、数カ月間にわたり、ラビットに注射する。ラビットの血清をPDGFレセプタータンパク質または断片に対する免疫性について試験する。モノクローナル抗体は、マウスに hPDGF-Rタンパク質、 hPDGF-Rポリペプチドまたは高レベルのクローン化PDGFレセプターをその細胞表面に発現している細胞を注射することによって作成される。モノクローナルを ELISAにより検索して、PDGFレセプタータンパク質またはそのポリペプチドとの特異的免疫活性を試験する。Harlow及びLane (1988) 、抗体:ア ラボラトリーマニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)コールドスプリンダハーバー出版、ニューヨークを参照(これは参照により本明細書に編入される)。これらの抗体はアッセイ、または他の薬品として有用である。
【0102】
一旦、十分量の所望の hPDGFレセプターポリペプチドが単離されたら、タンパク質は様々な目的に利用される。典型的な使用法としては、これらのレセプターへ特異的に結合する抗体の生産である。これらの抗体は、通常ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり、通常インビトロまたはインビボの技術により(例えば定義され、認識されている特定抗原決定基またはエピトープの目標に対して)生成される。通常エピトープは、連続したアミノ酸残基の分子形により与えられるが、連続的に一列でなくてもよく、しかし二次または三次構造により間隔的に接近している。特に、表2または表3に記載された少なくとも6つの連続したアミノ酸の配列にホモロガスなペプチドは、免疫原として有効である。最も興味のあるエピトープは、細胞外領域に見いだされるシグナルセグメントまたは免疫グロブリンドメインからのものであり、特にPDGFリガンド結合領域の周りのものである。しかし、他のセグメントもまた重要であり、それは細胞内領域のリン酸化部位、例えばリン酸化されている、またはされていないキナーゼ挿入セグメントである。
【0103】
ポリクローナル抗体の生産については、適当な標的免疫系が選択され、典型的にはマウスまたはラビットである。実質的に精製された抗原が、免疫学者に周知の動物または他のパラメーターに適する方法による様式で免疫系に与えられる。注射の典型的部位は支脚皿、筋肉内、腹腔内または皮内である。もちろん、ある時は他の種、ヤギ、ヒツジ、ウシ、モルモット、およびラットがマウス、ラビットに代わるであろう。
【0104】
免疫応答は普通、イムノアッセイでアッセイされる。通常はそのようなイムノアッセイは抗原源の精製を含み、例えば同一細胞により抗原が生産されたのと同じ様式で生産される。イムノアッセイは、場合によってはラジオイムノアッセイ、酵素−結合アッセイ(ELISA)、蛍光アッセイ、または他の多くの任意に選択されるものであり、その中の多くは機能的に均等であるが、特定条件下で利点を有するかもしれない。
【0105】
108M-1、好ましくは 109から1010の、またはより強い親和性を持つモノクローナル抗体は、典型的には、例えばHarlowおよびlane、抗体:ア ラボラトリーマニュアル、 CSHラボラトリー (1988) ;またはGoding (1986) 、モノクローナル抗体:理論と実践 (第2版)、アカデミック プレス、ニューヨーク;に記載されている標準法に従って作成される。これらのそれぞれの文献は参照により本明細書に編入される。端的には、適当な動物が選択されて、所望の免疫感作を引き続き行う。適当な期間が経過した後、その動物の脾臓を取り出して、各脾臓細胞を融合し、典型的には適当な選択条件下で不滅化したミエローマ細胞と融合する。その後、クローン的に分離して各クローンについて、所望する抗原の領域に特異的な適当な抗体生産を試験する。
【0106】
他の適当な技術には、リンパ球を抗原性ポリペプチドにインビトロ暴露する、または別法としてファージまたは同様なベクター中でのライブラリーの選択がある。Huseら (1989) “Generation of aLarge Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phase Lambda”Science 246:1275-1281 を参照、これは参照により本明細書に編入される。本発明のポリペプチドおよび抗体は改変して、またはせずに使用できる。多くの場合、ポリペプチドと抗体は検出しうる信号を与える物質と共有的または非共有的に結合することにより標識される。広範な標識および結合技術が周知であり、科学文献および特許明細書に詳細に報告されている。適当な標識には、放射核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などがある。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149;および 4,366,241号がある。また組換え免疫グロブリンも作成され、 Cabillyの米国特許第4,816,567号を参照のこと。
【0107】
完全長ペプチドまたはその一部分は、特定の態様において、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を生産するために使用される。抗体は適当な脊椎動物(例えばマウス)を抗体のペプチドまたは断片で、またはアジュバントと混合して免疫感作することにより作成される。通常、2回又はそれより多い免疫感作が行われ、血液または脾臓が最終注射の数日後に回収される。ポリクローナル抗血清については、免疫グロブリンが沈殿し、単離、アフィニティー精製を含んで精製される。モノクローナル抗体については、脾細胞が不滅化リンパ球(例えばミエローマ系)とハイブリドーマに選択的な条件で融合される。ハイブリドーマは一般的に限定希釈条件下でクローン化され、その上澄みが所望の特異性を有する抗体について検索される。抗体を生産するための技術は文献で周知であり、Goding (1986), Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)アカデミックプレス、N.Y.ならびにHarlowおよびLane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual 、コールドスプリングハーバー ラボラトリー、ニューヨーク、そして米国特許第4,381,292、4,451,570および 4,618,577に例示されており、これらは参照により本明細書に編入される。これらにより作成された抗体は種々の細胞応答の要因であるレセプターの部分を、ならびにレセプター自体の一般的プロセッシングおよび成熟を詳細に検討するために多くの利用法を有する。抗体アゴニストおよびアンタゴニストも生産されるであろう。
【0108】
免疫原性および結合の特異性を決定するための試薬として役立つ部分および断片は本明細書にて提供される。
【0109】
VI.使用法
本発明はヒト血小板由来増殖因子レセプター(hPDGF-R) 精製法を、細胞中でPDGFレセプターを合成する方法と同様に提供するものである。これらの方法により生産される均一なレセプター、レセプターおよびレセプターの一部分をコードする核酸配列、これらの配列を含有する発現媒体、PDGF−レセプターを含む細胞そしてレセプターに対する抗体も提供する。特に目的とするものはレセプターの断片であり、これは特定リガンドへの結合を、レセプターと競合する機能的結合部位を有する。例えば Orchanskyら(1988)“血小板由来増殖因子レセプターの短縮された形態のフォスファチジルイノシトール結合 (Phosphatidylinositol Linkage of Truncated From ofthe Platelet-derived Growth Factor Receptor)" J.Biol.Chem. 263:15159-15165 を参照。これはPDGFレセプターの細胞外領域がPDGFリガンドに結合できる証拠を提供する。また、リガンド結合への細胞応答に重要な他のタンパク質と反応するリン酸化のためのリン酸化断片および部位を提供する。特に可溶性細胞外領域セグメントが提供される。
【0110】
トランスフェクトされた細胞はPDGFへの細胞応答を研究するために使用される。制御された研究のために、PDGFレセプターを欠く哺乳類細胞を、 hPDGF-Rをコードする DNA配列を含む発現構造物でトランスフェクトすることができる。レセプターをコードする細胞が生産され、これはしばしば機能的に野生型タイプレセプターと同等であり、細胞にPDGF−感受性マイトジェン性応答を付与する。このように、天然に存在するPDGFの結合の性質は、断片および合成化合物についてタンパク質様および非タンパク質様の両方について分析される。実施例の章で実証するように、トランスフェクトされた細胞が使用されて、PDGFのAA形はタイプBレセプターチロシンキナーゼを活性化することが測定された。単一細胞中のタイプAおよびタイプBレセプターポリペプチドの存在は、レセプター結合の性質を研究することを容易にし、そしてレセプターの相互反応さえも研究できるであろう。
【0111】
PDGF−仲介マイトジェン原性の研究に加えて、トランスフェクトされた細胞が使用され、PDGFアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する薬剤能力を評価することができる。特に、トランスフェクトされた細胞を、試験薬と接触させて、応答量を測定する(例えばレセプターチロシンキナーゼ活性または DNA合成速度をPDGFまたはその類似体の存在または不存在下での対照細胞と比較する)。別法として、非治療的な状況において、溶液中に存在するPDGF類似体とPDGFレセプターとの間の結合の阻害に関する方法が提供される。この方法はPDGFレセプターペプチド(例えば表2または表3に記載された配列とホモロガスなペプチド)を、溶液に加えるか、またはペプチドの突然変異または修飾から成る工程を含む。PDGF変異体に対する結合親和性もそのような細胞により評価される。結合の阻害は、レセプターまたはリガンドについての競合または結合の妨害により起こる。このアッセイは、試験リガンドの存在または不存在の比較により使用され、または置換アッセイ(これは置換するリガンドを結合が生じた後に加える)による。
【0112】
しかし、上述したように、PDGFレセプターは二量体で機能するようである。レセプターの可溶性形態は二量体化を妨害し、態様によってはPDGFリガンドについての競合親和性とは異なる機構によりシグナルの伝達を遮断するのに効果的であることもある。可溶性、または種々のレセプター形態の細胞内またはトランスメンブラン断片は、二量体化を妨害し、従って少なくともあるタイプのまたはある断片のシグナル伝達を遮断する。
【0113】
この考察により、PDGFレセプターにPDGFが結合するのを阻害するのに有効量のPDGFレセプター遮断薬を患者に投与することから成る、インビボPDGFレセプター調節活性を変調する方法が提供される。ある場合には、レセプター複合体の機能的集合により、またはさらにレセプターと細胞応答に影響する重要な他のタンパク質(例えばフォスフォチロシン結合相互反応)により遮断がリガンド結合のレベルで起こるであろう。上記のごとく、タンパク質のPDGFファミリーは、多くの重要な生理学的過程を制御する重要な役割を持つ。可溶性PDGF-Rポリペプチドはこれらの過程のPDGF調節の程度を変調させるのに一般的に効果的である。この理由から、レセプターの可溶性形態はPDGFの競合的結合部位として有効である。同様に、短縮されたPDGF結合部位、または突然変異した結合部位(特に記載したヒト形態からのもの)は、場合によっては天然形態のものと同等に効果的で、経費上および投与に際しての医学的副作用という意味でもより低コストである。
【0114】
本明細書により提供される試薬は、PDGF類似体、またはレセプターについてのPDGF−様リガンド、またはPDGFレセプターポリペプチド生産の定量的検出または診断に使用される。種々の医学的状況は、これらのタンパク質のいずれかの異常生産レベルによって指示される(例えば種々の腫瘍状態)。従って、今これらの試薬に依存した診断試験が入手できる。
【0115】
種々のPDGFタイプで、セグメントをキメラレセプターに組こんで、種々のリガンドに関する親和性の多様性を有する種々のタイプのレセプターを形成する。本発明の遺伝子およびタンパク質で、種々の組織タイプに特異的な種々のパターンおよびレセプタータイプの間の識別が見いだされる。従ってPDGFレセプター発現の差異に基づく組織マーカーが得られる。
【0116】
ヒトPDGFレセプターの細胞外の種々の領域を含有する可溶性断片は、完全なタイプB PDGFレセプターと同じく高親和性結合を維持することが示された。ヒトレセプターの細胞外領域は CHO細胞中で高レベルで発現され、培地に分泌された。リガンドの存在下では、可溶性細胞外断片は、 BB-PDGFが生理的マイトジェン応答の特徴である応答を開始する能力を遮断する。可溶性断片は唯一 BB PDGFに結合する高親和性も保持しているが、 AA PDGFによるマイトジェン効果は変化しない。ヒト細胞外領域を使用したさらなる実験では、この断片はリガンドの存在についてアッセイするための(例えば競合により)結合セグメントとして使用できる。これらの結果は、PDGFに過剰に応答する様々な症状を治療する可能性を示唆し、例えばそれはアテローム硬化症、骨肉腫、グリア芽腫である。マイトジェン性応答は可溶性細胞外断片の使用を通じて弱めることができる。
【0117】
PDGFへの生理学的応答の遮断はリガンドのレセプターへの結合を阻害することから生じ、おそらく競合的阻害を通じて行われると思われる。すなわち本発明のインビトロアッセイは、これらレセプターのリガンド結合セグメントまたは固相基材に結合した断片を含む可溶性断片を一般的に使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメント突然変異および修飾の、またはリガンド突然変異または修飾(例えばリガンド類似体)の効果の診断用測定を可能にする。
【0118】
可溶性断片はまた、レセプターと修飾リガンド(例えばビオチン化AAアイソフォームまたは他のPDGF形)との相互作用を試験するためにも使用される。リガンド作用を遮断するためのもうひとつの手段は、適当な多タンパク質(multi-protein) レセプター会合(例えば二量体化)、または他のタンパク質との細胞内領域相互作用を妨害する事になろう。特に、特定のリン酸化という出来事が他の細胞内機能を媒介する他のタンパク質との相互作用を制御することを実証する。このための種々のアッセイが当業界で周知であり、以下に記載される。
【0119】
レセプター成分は、同等物または、他のタイプのポリペプチド(例えばタイプAおよびタイプB形からの断片を交換すること)からの、または他の関連ペプチド(例えばマウスレセプターまたは関連レセプター)からの対応する可溶性断片で置換することができる。
さらに、タイプAホモ二量体は3つのすべてのPDGFに結合し、タイプA結合断片はリガンド結合の実質的普遍性を表す。タイプA結合断片は、一般的なPDGF結合試薬を調製するために有効である。
効果的な治療に必要な薬剤量は、多くの種々の因子に依存し、それには投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および他の投与薬剤がある。従って治療投与量は力価を測定して安全性と効力を至適化すべきである。
【0120】
典型的にはインビトロで使用される投薬量は、これらの薬剤のその場所での投与に関して有効な量の手引きを与えることができる。特定の疾患の治療のために有効投与量の動物試験は、さらにヒトの投薬量に関する予想を与えるであろう。様々な考察が、たとえばGilmanら(編集)(1990) グッドマンおよびギルマン:治療のための薬学的基礎(Goodman and Gilman; The Pharmacological Bases of Therapeutics)、第8版、パーガモン出版(Pergaman Press);およびレミングトンの薬化学(Remington's Pharmaceutical Science) 、17版(1990)、マック出版社、イーストン,ペンシルバニア州(MackPublishing Co., Easton Penn.) ;それぞれ参照により本明細書に編入される。投与法についてもその中に述べられており、例えば経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮的拡散等がある。薬学的に受容できるキャリアーは、水、塩、緩衝液およびメルクインデックス、メルク社、ラーウェイ,ニュージャジー州 (Mack Index: Merck Co., Rahway, New Jersey) に記載された他の成分がある。
【0121】
PDGFとそのレセプターの高い親和性から、これらの薬剤の低投与量が最初は有効であると思われる。例えば投薬量範囲は通常1mM濃度より少ない、典型的には約10μMより少ない、普通は約 100nM濃度より少ない、好ましくは約10pM(ピコモル)より少ない、そして最も好ましくは約1fM(フェントモル)より少ない量が適当なキャリアーとともに期待される。徐放性製剤、または徐放性用装置が連続的な投与にしばしば利用される。レセプターの細胞内セグメントは、PDGFレセプターおよび関連レセプターの両方において、以下に詳細に記載するさらなる使用に用いられる。
【0122】
医薬組成物は非経口的、局所的、経口的、または局部的投与により投与され、それには例えば予防および/または治療を目的とした噴霧式薬剤または経皮投与を含む。医薬組成物を、投与法に依存した種々の単位投薬量形態で投与できる。例えば、経口投与に適する単位投薬量形態には、粉末、錠剤、ピル、カプセルおよび糖衣錠がある。
【0123】
薬剤組成物はしばしば静脈内に投与される。従って本発明は、受容できるキャリアー、好ましくは水溶性キャリアー中に溶解または懸濁した化合物の溶液を含む静脈投与用の組成物を提供する。種々の水溶性キャリアーが使用でき、例えば水、緩衝化された水、 0.4%塩溶液、などである。これらの組成物は便利で周知な技術により滅菌されるか、または濾過滅菌することができる。生成した水溶液は使用のために包装、または凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液に混合される。組成物は要求されるおよその生理学的条件に必要とされる薬学的に受容される補助物質(例えばpH調整試薬、緩衝化試薬、強壮剤、湿潤剤などであり、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど)を含有してもよい。
【0124】
固体組成物については、便利な非毒性キャリアーを含有でき、それは例えば薬品級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロース、マグネシウム、炭酸塩などである。経口投与のためには、医薬的に受容できる非毒性組成物が、任意の通常使用される賦形剤(例えばすでに記載したようなもの)を混合することによって形成され、その量は一般的に活性成分の10−95%、好ましくは約20%(レミングトン、同上を参照)である。
【0125】
噴霧式薬剤の投与に関しては、化合物は好ましくは界面活性剤および液体発泡剤とともに微細に分割された形態で供給される。界面活性剤はもちろん非毒性でなければならないし、好ましくは液体発泡剤に可溶性である。そのような試薬の代表として、6から22個の炭素原子を有するエステルまたは脂肪酸の部分エステルがあり、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ラノリン酸、リノール酸、オレステアリン酸(olesteric)と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物、例えばエチレングリコール、グリセロール、エリスルトール、アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトールから誘導されるヘキシトール無水物およびこれらエステルのポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体がある。しばしば混合エステル、例えば混合した、または天然のグリセリドを使用する。界面活性剤はある態様において、成分の 0.1%−20重量%、好ましくは0.25−5%を構成する。組成物の平衡は通常液体発泡剤である。液化した液体発泡剤は典型的には周囲条件でガス状であり、加圧下で凝縮される。適当な液化した液体発泡剤のなかで5個までの炭素を含有する、ブタンおよびプロパンのような低級アルカン、および好ましくはフッ素化または塩化フッ素化したアルケンである。上記の混合物も使用される場合がある。噴霧式薬剤を製造するには、適当なバルブを装備した容器を適当な液体発泡剤で充填し、これには微細に分割された化合物剤と界面活性剤が含まれる。成分はこのようにバルブの作動まで加圧状態で維持される。
【0126】
化合物を含有する組成物は、予防および/または治療処置のために投与されることができる。治療的投与には、上記のように組成物はすでに罹患している患者に投与され、その量は疾患またはその合併症を治癒、または少なくとも部分的に阻止するために十分な量である。これを達成するための量は“治療に有効な投与量”と定義される。これに有効な量は疾患の程度および患者の体重と一般的症状による。
【0127】
予防的投与には、本発明の化合物を含有する組成物が特定の疾患にかかっていると疑われる、または罹患する危険性があると思われる患者に投与される。そのような量は“予防に有効な投与量”として定義される。この使用において、正確な量はここでも患者の健康状態と体重による。
【0128】
特に重要な本発明の観点として、大部分の増殖因子が複数の形質発現を調節し、それが内在するタンパク質チロシンキナーゼ活性を持つ細胞表面のレセプターとの結合及び活性化に依存するという認識がある。チロシンキナーゼ活性を持つ増殖因子レセプターあるいはレセプターチロシンキナーゼは非常に良く似た分子構造を示す。たとえば、それらは大きな細胞外リガンド結合領域、疎水性のトランスメンブレン領域、チロシンキナーゼ触媒ドメインを含んだ細胞質すなわち細胞内領域から構成される。レセプターチロシンキナーゼは一般的にリガンド結合セグメントとタンパク質のチロシンキナーゼ部位から構成され、それらは細胞膜で分離される。従って、細胞外リガンドの結合によって生ずるレセプターの活性化は、細胞膜障壁を通して転送され細胞内領域にある機能の活性化を意味する。
【0129】
本発明は、ポリペプチドセグメントの特定のアミノ酸側鎖のリン酸化が、ある種のタンパク質間相互作用に大変重要であるという発見を利用している。相互作用領域あるいは結合領域に存在する側鎖のリン酸化は相互作用を調節する。PDGFレセプターとホスファチジルイノシトール3′キナーゼ(PI3キナーゼ)の相互作用の場合には、限定されたキナーゼ挿入配列内のホスホチロシンの存在がレセプターとPIキナーゼ間の相互作用すなわち結合に重要であり、それによってPI3′キナーゼの活性が発現される。リン酸化されていないKIセグメントは、PI3キナーゼとの結合活性を失う。このような観察は、その他の結合タンパク質とリン酸化セグメントの相互作用に一般的に応用できる。このような相互作用の性質と特異性を究明することにより、ペプチドあるいはリン酸化ペプチドの類似体として機能する有機物などの類似体が調製される。
【0130】
チロシンキナーゼは大きく2種類に分類され、トランスメンブレンレセプターと細胞質内の非レセプターキナーゼが相当し、2番目のグループの大部分はチロシンキナーゼでもいわゆるsrc ファミリーに属する。レセプターキナーゼ遺伝子は、PDGFレセプターを含めて構造的特徴を共有しており、例えばアミノ末端のシグナルペプチドは細胞膜糖タンパク質の特徴を持ち、トランスメンブレンセグメントはレセプタータンパク質の細胞外及び細胞内領域を限定し分離している。レセプタータンパク質のアミノ末端部はリガンド結合部位を含む細胞外領域を構成する。レセプタータンパク質のカルボキシル末端部はレセプターの細胞内領域を構成し、そこにキナーゼ活性が存在する。レセプターキナーゼは、細胞外領域のリガンド結合によるシグナルを細胞内区画へ、そして細胞内の二次伝達物質を通して最終的には核に伝達する機能に関与する。
【0131】
確立されたレセプターチロシンキナーゼ(RTK) の一次配列の詳細な比較からサブドメイン構造あるいはセグメントの共有部分と固有部分を同定可能で、それは RTKファミリーを独立のグループに分類することを可能とし、例えばYarden and Ullrich (1988) Ann.REv. Biochem.57:443-478 およびUllrich and Schlessinger (1990) Cell 61 :203-212 に報告されており、それらは参照により本明細書に編入される。
【0132】
PDGFレセプターはそのようなサブクラスの一員である。このようなレセプターは、マクロファージ増殖因子(CSF-1-R) および推定上のレセプターc-kit を含めて、少なくとも2種類の異なった構造的特徴を共有している。それらは細胞外領域のシステインに富むレセプタークラスターが欠失しており、別の保存された反復構造を持ち、その反復構造には5種類の免疫グロブリン様レセプターが含まれ、このレセプターサブクラスのメンバーのリガンド結合領域が持つ共通構造を示唆している。
【0133】
それ以上に、 RTKを他のサブクラスと比較した場合、このグループのメンバーの触媒ドメインは、長くそして構造的に固有の、親水的な、プロリンに富んだ77−107 アミノ酸側鎖の挿入セグメントで中断されている。この“キナーゼインサート”(KI)は、キナーゼインサート領域とも見做され、触媒ドメインを2つのセグメントに分割し、他のチロシンキナーゼドメインとのホモロジーから定義される。それぞれのレセプターサブファミリー内でもこれらKI配列は高度に分化しており、逆にニワトリやネコ、ヒトのような進化的に異なった種間では強固に保存されている。関連するサブファミリーのメンバーは、 FGFレセプターやfig 及びbek を含め、細胞外領域に免疫グロブリン様反復配列を同様に持っているけれども、数としては3回だけであり、10−19側鎖のキナーゼインサート配列がチロシンキナーゼセグメントの対応する部分に位置している。
【0134】
RTKリガンドは細胞内で複数の形質発現応答を誘導し、様々な細胞種で細胞周期の進行、 DNA合成、細胞増殖を生じさせる。リガンド結合によって、様々な細胞膜反応が開始され、イオン輸送やグルコース輸送、細胞膜キナーゼ、ピノサイトーシス、細胞膜の波打ち、そしてそれ以外の細胞骨格や形態的な変化がその中に含まれる。解糖系やポリアミン合成、S6リボソームタンパク質のリン酸化を含む一定数の細胞質内経路の活性化によって、このような応答は平行して行なわれる。リガンド結合後に、特定の遺伝子(c-myc やc-fosなど) の転写パターンの変更が数分以内に検出され、タンパク質やRNA, DNAなどの高分子合成の増加が3−20時間内に観察される。PDGFは独自の能力を持ち、ホスファチジルイノシトールの代謝回転を促進するプロテインキナーゼC、およびタイプEプロスタグランジンを合成するプロテインキナーゼAを活性化する。
【0135】
レセプター機能の正確な制御の重要性が、レセプター由来癌遺伝子に発見された様々な種類の構造変異体が常に活性化され、結果として分子制御機構の破壊およびレセプターシグナルの変更をもたらす事実から主張された。ヒト癌に見られる最も一般的な細胞障害は、レセプターの過剰発現と関連した自己分泌活性を含む。沢山の癌および癌細胞株では、PDGF-A鎖やPDGF-B鎖、PDGFレセプターポリペプチドを含み、増殖因子とそのレセプターが共に発現されていることが見つかっている。自己分泌レセプター活性化は、正常な成長制御を破壊する一つの筋書きを示している。基本的に、チロシンキナーゼ活性を持つ全てのレセプターは、発癌の潜在性を秘めている。突然変異を誘発する更に多くのタイプが、レセプターチロシンキナーゼの過剰発現のような特定の例と同様に、動物やヒトの癌で検出されることが予期される。正常な細胞代謝やシグナル伝達のそのような欠損の理解と制御が、癌の診断や治療に重要な役割を演ずるだろう。
【0136】
リガンドによって活性化された場合、PDGFβ−レセプターはチロシン側鎖にリン酸化を受ける。EK and Heldin (1982) J.Biol.Chem. 257 :10486 やFracklton et al. (1981) J.Biol.Chem. 259:7909, Kazlauskas and Cooper(1989) Cell 58 :1121, Yarden et al. (1986) Nature 323:226-232 を参照すること。この“自動リン酸化”反応の機構は、レセプターのダイマー形成をリガンドが誘導し、ダイマーのそれぞれ2本のポリペプチド鎖が他の鎖をリン酸化するリン酸基転移反応に依存すると考えられる。刺激されたPDGFレセプターの主なリン酸化部位はチロシンキナーゼドメインのカルボキシル末端部に位置し、ヒトおよびマウス両方のタイプBレセプターのtyr(825)、およびキナーゼインサート領域のヒトおよびマウス両方のタイプBのtyr(719)で、これはキナーゼをコードする配列を2つの部分に分離している。自動リン酸化されるその他の部位がまだ発見されていないことは、十分に可能性がある。
【0137】
リガンドに誘導されたレセプターの自動リン酸化による結果の1つは、レセプターの細胞内領域の立体構造の変化であると思われる。このような活性化された状態では、シグナル伝達に大変重要な何種類かの細胞質分子とレセプターは物理的な相互作用が可能である。
【0138】
活性化によって、様々なタンパク質のチロシンリン酸化と複合体の形成が達成される。最初に述べるべきであるのは85kDタンパク質で、PIキナーゼと推定され、p81と見做されるタンパク質と同一であり、Kaplan et al.(1987) Cell 50 :1021を参照すること。その後、一定数のその他の蛋白質がPDGFレセプターと複合体を形成し、PDGFの刺激でチロシンリン酸化を受けることが示されている。その中には、複合体で活性化されるセリン/トレオニンキナーゼRaf-1;Morrison et al.(1989) Cell 58 :649-657 を参照や、ホスホリパーゼC−γ;Morrison et al.(1990) Mol.Cell.Biol.10:2359-2366を参照、ras 活性の制御に関与するGTPase活性化タンパク質である GAP;kaplan et al.(1990) Cell 58 :1121-1133 を参照、が含まれる。PDGF処理により、それらタンパク質のいくつかのキナーゼ活性が増加する。
【0139】
最近、3種類のsrc ファミリーのチロシンキナーゼ(pp60-c-src,p59-fyn, pp62-c-yes)とp81、PDGFレセプターとの間に一時的な複合体形成が発見された。更に、PDGF処理によってそれらタンパク質のチロシンキナーゼ活性が刺激され、src ファミリーキナーゼがPDGFとの応答に何らかの役割を担っていることが示唆される。チロシン側鎖のリン酸化は標的タンパク質の持つ細胞分裂能力を活性化すると思われ、それは酵素活性を増強させる、あるいは他の細胞質タンパク質との相互作用を変更させることによって生ずる。
【0140】
SH2システムは、PDGFレセプターに適用できる特有のメカニズムと特性に対して、可能と思われる指針を与える。ある種の非レセプターチロシンキナーゼでは 100アミノ酸程度の保存された非触媒領域を共有しており、 srcホモロジー領域2(SH2)ドメインと呼ばれる。Fpおよび SrcチロシンキナーゼのSH2ドメインは、多分に隣接するキナーゼドメインと相互作用して制御すると考えられ、キナーゼドメインによりリン酸化されたタンパク質との結合サイトを形成すると考えられる。
【0141】
ホスホリパーゼC−γ(PLC-γ)およびp21-ras GTPase活性化タンパク質(GAP) は、2つの隣接したSH2ドメインを持つ。最近の研究では、SH2ドメインが GAPやv-Crk, p60-c-srcのようなタンパク質に対して特定のチロシンリン酸化リガンドとの複合体形成能力を与えることが示された。このような結果とPDGF-Rとの関連は、未だに不明確である。具体的なPDGFレセプターでは、リガンドにより活性化されたPDGFレセプターがPLC-γおよびRaf-1, 85kDa PI-3キナーゼを含むシグナル分子複合体形成を引き起こす。
【0142】
レセプター介在タンパク質として最初に同定されたシグナル分子は、ホスファチジルイノシトール−3′キナーゼ(PI3キナーゼ)であった。この酵素は元々ポリオーマミドルT抗原やc-src タンパク質、形質転換v-src タンパク質と免疫沈降で共沈するキナーゼとして発見された。PI3キナーゼ活性もホスホチロシンであり、PDGFで活性化された細胞のライセートからレセプターにより免疫沈降された。細胞増殖の調節におけるPI3キナーゼの役割はまだ決定されていない。けれども、この酵素は沢山の増殖因子から調節を受け、増殖因子処理細胞にはイノシトール環の3位にリン酸化を受けたホスホイノシチドやイノシトールリン酸が高水準で含まれる。PI3キナーゼと結合しないミドルT抗原やPDGFレセプターの変異体は、細胞分裂活性を消失している。PI3キナーゼ活性の原因であるタンパク質はまだ十分に特定されていない。しかし、ミドルT/c-src 複合体およびPDGFレセプターと免疫沈降で共沈する実験の81−85kDタンパク質の存在とその酵素活性が緊密に関係していることから、85kDタンパク質がPI3キナーゼであるかキナーゼの重要なサブユニットであることを強く示唆している。
【0143】
PDGFレセプターの限定領域がPI3キナーゼとの相互作用を調節する能力を持ち、キナーゼインサート(KI)領域を欠失している変異タイプB PDGFレセプターの分析から証明された。このレセプター変異体(ΔKI)は細胞増殖の刺激およびPI3キナーゼとの結合能力を失っているが、チロシンキナーゼ活性やホスホリパーゼCを経由するPI加水分解を含めたPDGF結合に対するいくつかの応答を刺激した。最近の研究では、リガンド活性化ΔKI変異レセプターはPI3キナーゼとの結合性は失っているけれども、PLC-γ及び c-Raf-1タンパク質とは野生型のレセプターよりも強固に結合することが示されている。しかし、変異レセプターは c-Raf-1のチロシン側鎖をリン酸化できず、PLC-γの結合にはレセプターのチロシンリン酸化が要求される。ヒトタイプB PDGFレセプター変異体は、キナーゼインサートドメインに1ヵ所のリン酸化部位を持っており、それはヒトタイプBレセプターと同様にtyr(719)であったが、フェニルアラニンに置換された場合には同様にPI3キナーゼとの結合性を失った。これらの実験は、PI3キナーゼが直接tyr(719)を含むキナーゼインサート領域に結合するのか、あるいはキナーゼインサート領域と立体的に依存したレセプターの他の部分が結合反応に含まれるのか、いずれかを示している。
【0144】
タイプB PDGFレセプターとPI3キナーゼ間の相互作用を直接研究するために、in vitroシステムを設定した。このシステムでは、PI3キナーゼとPDGFレセプターの相互作用を阻害する目的で、キナーゼインサートドメインのレセプター配列に由来する合成ペプチドの能力を試験することができた。相互作用を阻害できたのは、tyr (719) を含むキナーゼインサートドメインの高度に保存された領域を示すチロシンリン酸化ペプチドであった。しかし、PI3キナーゼとPDGFレセプターの結合を阻害するペプチドは、チロシンがリン酸化された場合に限定された。配列を変更したペプチドでは、チロシンをリン酸化しても、阻害活性は認められなかった。これら研究から、特定配列にあるホスホチロシンが細胞質シグナル分子の結合に認識部位を与えていることが示された。
【0145】
in vitroシステムはPDGFレセプターとPI3キナーゼの相互作用の研究に使用された。PDGFレセプターと結合するホスホプロテインは、3T3細胞をPDGFで刺激し、抗−タイプB PDGFレセプター抗体で細胞ライセートを免疫沈降し、免疫沈降物中のリン酸化されるレセプター結合タンパク質を検出するために免疫沈降物の分析を行なった。図1a“+”を参照すること。これらのホスホプロテインには、85kDa タンパク質と最近PI3キナーゼ活性と関連するとされる110kDaタンパク質が含まれた。図1cを参照すること。in vitro実験では、タイプB PDGFレセプターが昆虫細胞で発現されており、部分精製され、抗−レセプター抗体とPtrotein A Sepharoseを使って固定された。このレセプターはin vitroで自動的にリン酸化され、従ってレセプターのリガンド活性化状態を模倣する立体構造を持つと思われた。密度制限されたBALB/c 3T3 細胞の細胞ライセートの細胞質をその固定化レセプターと混ぜ、結合体を十分に洗浄した。PI3キナーゼ活性がレセプターと結合したタンパク質複合体に発見された(図1d)。
【0146】
レセプター結合性ホスホプロテインは、 32P-ATPを用いたin vitroキナーゼアッセイで検出された。図1bの“−”を参照すること。見かけ上の分子量が140kD, 120/110kD(時々ダブレットとなる)、85kD, 74kDの、少なくとも4種類のレセプター結合性タンパク質が放射性標識された(160kD及び 150kDはそれぞれbaculovirusで発現されるレセプターとその前駆体である)。140kDのバンドは以前PLC-γと同定されており、74kDのバンドにはraf-1 キナーゼ及び多分に他の分子が同様に含まれる。85kDのバンドと一緒に移動する85kDタンパク質は、PDGF刺激細胞から調製した細胞ライセートの抗−ホスホチロシン免疫沈降では、これまでPI3キナーゼであると考えられていた。 baculovirusの発現レセプターと結合する85kD及び 110kDタンパク質は、銀染色解析でも同様に観察されていた。細胞ライセートを固定化キナーゼインサート欠損変異体と反応させた場合、PI3キナーゼの結合が見られず、 110kD及び85kDホスホプロテインが変異レセプターに結合しなかった。図2a及び図2bを参照すること。このin vitroの結果は、この変異レセプターがインタクトな細胞ではPI3キナーゼと結合しないとする従来の指標と一致した。
【0147】
ライセートを作成する前に 3T3細胞をPDGFで刺激すると、in vitroでレセプターと結合可能なPI3キナーゼの量が激減し(図1d)、それに伴ってレセプターと結合する85kD及び 110kDホスホプロテインも減少した(図1b“+”レーン)。けれどもこの現象に対する説明は十分明確になっておらず、結果として細胞のPDGF前処理がin vitroでのレセプターと細胞質タンパク質との結合に影響を与えているため、結合はPDGFに制御される過程に特徴的であることが指摘される。
【0148】
自動リン酸化されたPDGFレセプターは、in vitroでジャガイモアシッドフォスファターゼ(PAP)によって脱リン酸化され、BALB/c 3T3細胞ライセート由来のPI3キナーゼ及び84kDタンパク質との結合性を失う(図3b及びc)。この発見は、PDGFレセプターのリン酸化がそれらのタンパク質が相互作用を行なうために必要であったことを示している。
【0149】
レセプターとPI3キナーゼの相互作用部位を決定するために、リン酸化された合成ペプチドを作成し、in vitroでレセプターと85kDタンパク質およびPI3キナーゼ活性との結合を競合させた。従来の資料では、キナーゼインサート領域がPDGFレセプターとPI3キナーゼ活性との結合に含まれることが示唆されていた。マウスとヒトPDGFタイプA及びタイプBレセプターのキナーゼインサート領域の配列を精査し、特に配列のホモロジーの高い20アミノ酸領域(全キナーゼインサート領域に対して12%同一性で比較し、ヒトとマウスのPDGFタイプBレセプターでは20個のうち8個が同一)を発見した。マウスタイプB PDGFレセプター配列の 705から 724までのアミノ酸を持つペプチド(Y719)を合成した。このペプチド配列には2ヵ所のチロシン側鎖Y708とY719が含まれる。マウス配列の 719番目のチロシンは、ヒトタイプB PDGFレセプターのtyr(719)にも対応し、レセプターの既知の自動リン酸化部位である。
【0150】
この配列から派生した一連の合成ペプチドのレセプターと85kD/PI3キナーゼ活性との相互作用の阻害能力を決定するために、固定化レセプターと混合する前に 3T3細胞ライセートを様々なペプチドで反応させた。これら実験の結果が図4に示されている。図4aの最初のレーンには、ペプチドが存在しない条件で野生型のレセプターと結合したリン酸化タンパク質が示されている。矢印はPI3キナーゼ活性と共に精製される85kDタンパク質を示している。その他のレーンには、Y719ペプチドの派生物が存在する条件でレセプターに結合したタンパク質が示されている。表4を参照すること。レセプターと結合する前に、 3T3細胞ライセートとリン酸化されていないY719ペプチド(Y719)を予め反応させた場合、レセプター結合タンパク質のパターンには変化が見られなかった。対照的に 719位をリン酸化されたこのペプチドの派生物(Y719P)をインキュベーションに加えた場合、85kDホスホプロテインの結合を阻害し(図4a)、レセプターとPI3キナーゼ活性との結合を禁止した(図4b)。719位に対応する位置にホスホチロシンを持つけれども一次配列を変更されたこのペプチドの組換え型は、85kDタンパク質の結合阻止に失敗し、レセプターとPI3キナーゼ活性との結合も阻止できなかった。
【表1】
アスタリスク(*)はリン酸基の位置を示している。
【0151】
14アミノ酸しか含まないY719Pペプチドの短縮型(Y719P short)とチロシン 708を含まない型も85kDタンパク質の結合阻害を示し(図4a、レーン4)、レセプターへのPI3キナーゼ活性との結合を阻止した。驚くべきことに、 719位にチロシンを持ち 708位にホスホチロシンを持つペプチドが、レセプターへのPI3キナーゼ活性との結合を阻止した(図4、レーン6)。この発見は、チロシン 708がこれまでマップされなかったレセプターの自動リン酸化部位の一つである可能性を示唆している。 708位と 719位の両方ホスホチロシンを持つペプチド(Y708P/Y719P)も85kDタンパク質の結合を阻害した(図4、レーン8)。 Y708Pの短縮型および Y719Pも活性を阻害した(図4、レーン4及び9)。
【0152】
レセプターと85kD及びPI3キナーゼ活性の結合を阻止するために必要なペプチドの量を決定するため、 3T3細胞ライセートを様々な濃度のリン酸化ペプチド(Y719P)と予め反応させた。図5に示されるように、レセプターと85kDタンパク質(図5a)及びPI3キナーゼ活性(図6B)の結合を50%阻害するためには、5μM程度のY719で十分であった。 100μMまでの濃度の非リン酸化ペプチドでは、レセプターとPI3キナーゼ活性との結合に影響を与えなかった。従って、 Y719Pペプチドによるレセプターと85kDおよびPI3キナーゼの共通する阻害は、85kDタンパク質がPI3キナーゼ酵素のサブユニットであるとする仮説を支持する。
【0153】
次に、レセプターに結合するその他のシグナル分子に対するペプチドの阻害能力を調べた。 3T3細胞ライセートを Y719Pペプチドの存在下あるいは非存在下で反応させ、その後にレセプターの免疫沈降を行なった。レセプターとPLC-γおよび GAPの結合は、特異抗体を用いたイムノブロット解析で決定し(図6)、これらの分子が自動リン酸化レセプターと特異的に結合する従来の研究を支持した。レセプターとそれらの分子の結合は Y719Pリン酸化ペプチドでは影響を受けなかった。従って、 Y719Pペプチドはレセプターと85kD/PI3キナーゼ活性の結合を特異的に阻害し、 GAPあるいはPLC-γとレセプターの相互作用には影響しなかった。
【0154】
レセプターと85kDタンパク質の相互作用を性質を決定するために、修飾したウェスタンブロット法を用いた、PDGFレセプターvaculovirusを感染させたSf9細胞のPDGFレセプターを抗−レセプター抗体で免疫沈降してin vitroで32P標識し、電気泳動で分離しニトロセルロースに転写された 3T3細胞ライセートのタンパク質に結合するプローブとした。放射性標識PDGFレセプターは未刺激の 3T3細胞ライセートの85kDに直接結合した(図7、レーン1)。PDGF処理 3T3細胞ライセートでは、放射性標識PDGFレセプターと反応させても全く結合が見られず(図7、レーン2)、PDGF刺激細胞ライセートの85kDタンパク質は固定化PDGFレセプターと結合できないという発見(図1b)と一致した。細胞ライセートタンパク質を含むニトロセルロースペーパーを Y719Pペプチドと予め反応させると、放射性標識レセプターは85kDタンパク質と結合できなかった(図7、レーン4)。非リン酸化ペプチド(Y719)あるいは組換え型ペプチド(Y719 scrambled)は、レセプターと85kDタンパク質の結合に影響を与えなかった(図7、レーン3と5)。この実験は85kDタンパク質を示した(図7、レーン3と5)。この実験は直接85kDタンパク質がPDGFレセプターに結合し、他の分子の存在を要求しないことを示した。直接の結合反応にはチロシン 719を含むキナーゼインサート領域の20アミノ酸セグメントを含むと思われこのセグメントのチロシンリン酸化が相互作用には必要であると思われた。
【0155】
これらの結果は、タイプB PDGFレセプターの細胞内領域がシグナル伝達の役割を演じているような分子と相互作用することを示している。レセプターとPI3キナーゼやPLC-γ, GAP, raf -1のようなシグナル分子の物理的な結合は、レセプターのチロシンがリン酸化されたときにのみ生じる。図1aを参照すること。レセプターとPI3キナーゼの結合に含まれるレセプターの領域が限定された。短縮型ペプチドは、PI3キナーゼとリン酸化レセプターのin vitroでの結合を阻害する目的で使用された。結合を阻害するペプチドの最も妥当な説明は、このペプチドがレセプターを模倣し直接PI3キナーゼに結合することである。このような方法で、これらは拮抗的なアンタゴニストとして作用する。チロシンリン酸化ペプチドだけが阻害活性を持つという観察から、ホスホチロシンが直接レセプターとPI3キナーゼの結合に関係していることが示唆される。しかし、ホスホチロシンを持つ組換え型のペプチドがPI3キナーゼと相互作用しなかったことから、ホスホチロシン単独では結合に十分ではない。従ってレセプターのこの部分の一次配列が、レセプターとPI3キナーゼの結合に要求される構造的情報に必須である。アミノ酸13個の短いペプチドがPI3キナーゼと正常に結合する本来のレセプター領域を模倣する構造的情報を十分に含んでいること(表4)は、幾分驚くべきことである。
【0156】
タイプB PDGFレセプターのチロシン 719が、インタクトな細胞内と同様にin vitroでもレセプターの自動リン酸化部位の一つである。従って、チロシン 719付近のKIドメインの部分は、in vivo でのレセプターとPI3キナーゼの結合に直接含まれると思われる。ここに示される資料は、2個のチロシン側鎖のいずれかをリン酸化(Y708PあるいはY719P)されたY719の派生物が、in vitroアッセイにおいてレセプターとPI3キナーゼの結合を効果的に阻害したことを示している。同様の配列と相互作用が、適当なフラグメント配列による阻害に従う。特に、リン酸化部位として知られている配列は、これ以外の介在タンパク質との相互作用を阻害する類似体を選択するために使用されるだろう。PI3キナーゼはc-fms タンパク質およびミドルT抗原と結合することが知られており、両方のタンパク質は共にin vivo でチロシンがリン酸化されている。ミドルT抗原のリン酸化部位(チロシン 315)は、この実験で使用されたY719ペプチドある程度ホモロガスな配列である(10個のうち5個が同一)。どのc-fms タンパク質のチロシンリン酸化部位もY719ペプチドとは明確な類似性を示さなかった。しかし、 Y719PペプチドはPI3キナーゼとc-fms タンパク質の結合をin vitroで阻害した。従って、c-fms タンパク質の自動リン酸化部位はPDGFレセプターの相当するドメインと類似した二次構造を持つ領域である。
【0157】
これらの発見は、シグナル分子が特定の配列にあるホスホチロシンを認識することを示している。キナーゼインサート欠失変異体とGAPやPLC-γ, c-raf-1の相互作用のパターンと、 GAPおよびPLC-γとレセプターの結合を阻害するためにこの報告で用いられたペプチドの能力欠如は、レセプターの異なった領域、多分に異なった自動リン酸化部位を含む、が特定のシグナル分子との結合に関与していることを示している。このような分子とレセプターの結合はシグナル分子を局在化させ、その活性を制御する。レセプターキナーゼによるその他の細胞タンパク質のチロシンリン酸化は、シグナル分子と結合するタンパク質としてそれらを標的にし、本発明は天然本来のシグナルを効果的に模倣あるいは妨害する方法および試薬作成のための材料を提供する。たとえば、 hPDGFレセプターあるいは関連チロシンキナーゼタンパク質のフラグメントは、それらの間および機能的に関連するタンパク質の本来の相互作用を効果的に阻害する。ここに述べられたリン酸化インサートを持ち、構造と機能共にホモロジーを示すその他の配列およびタンパク質に関しては、Williams (1989) Science 243:1564-1570 やYarden et al.(1986) Nature 323:226-232, GenBankTMを参照すること。
【0158】
本発見はKIセグメントの類似体を生産する方法を導く。例えば、加水分解を受けない部分を持つ短いペプチドは、リン酸化部位をスルフォン化部位に置換することなどにより、しばしば作成される。あるいは、構造的に十分にホモロジーを持つその他の有機分子が、PI3キナーゼあるいはその他の機能調節タンパク質との機能的相互作用のためにしばしば選択される。更に、ペプチドの一部がキメラ類似体あるいは修飾ペプチド、その他の部分が相互作用に重要な類似構造の特徴を持つ有機分子などが作成されるだろう。従って、特定の相互作用的特徴を示す分子が利用可能になり、それらには天然あるいは合成的に生成された化合物が含まれる。次の実例を参照すれば、本発明はより良好に理解されるだろう。次の例は、例証を行なうために提示されるのであって、制限を設ける為ではない。
【0159】
実験条件
一般的に、標準的な DNA組換え技術が、種々の出版物に述べられており、例えばSambrook et al.(1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory やAusubel,et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, vols.1and 2 and supplements, Wu and Grossman (eds.)(1987) Methods in Enzymology Vol.53 (Recombinant DNA Part D)があり、ここではそれぞれを資料として引用している。これらの方法の間に見られる違いは、あったとしても、極めて小さい。
【0160】
I.ヒト腎臓λ GT11 cDNA ライブラリー及びヒト胎盤λ GT10 cDNA ライブラリーの検索
250,000プラークのヒト腎臓cDNAライブラリーをスクリーニングするプローブとして、マウスPDGFレセプター(mPDGF-R)タンパク質をコードする全長の DNA配列を使用した。ニックトランスレーションを用いて12×108cpm/μgの比活性を持つプローブを作成した。30%フォルムアミド、1×Denhardt's溶液、5×SSC,. 0.02Mリン酸ナトリウムpH6.5 、 500μg/mlのサケ精子 DNAを含むハイブリダイゼーションバッファー中で、フィルターとプローブ(105cpm/ml)を反応させた。40℃で14時間のハイブリダイゼーションの後に、フィルターを55℃で 0.2×SSC 及び 0.1% SDSを用いて4回洗浄し、更に65℃で 0.2×SSC を用いて2回洗浄した。
【0161】
全長の mPDGF-Rプローブを用いた再スクリーニングの後に、10個の陽性クローンを得た。個々のクローンを単離し、 EcoR I制限酵素を用いて制限酵素解析を行なった。HK−6と命名した最も長いインサート(2.3kb)を含むクローンの特徴を更に調べ、ジデオキシターミネーター法で塩基配列を解析した。HK−6クローンにはレセプターの3554塩基から5691塩基までとポリAテールから9塩基を加えた塩基配列が含まれた。
【0162】
2.3kbのHK-6 DNAから調製されたニックトランスレーション処理プローブを用いて、 250,000プラークのヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングでは厳密性の高いハイブリダイゼーションで行なった(上述のハイブリダイゼーションバッファーに50%フォルムアミドを添加)。フィルターを5×105cpm/mlのプローブと14−16時間42℃で反応させた。フィルターを65℃で 0.1% SSC及び 0.1% SDSを用いて4回洗浄した。
【0163】
HK−6プローブを用いた二次スクリーニングの後、7クローンを単離して EcoR I制限酵素を用いて制限酵素解析を行なった。 4.5kbのインサートを含むクローン(HP−7)を選択し、特徴を調べた。このクローンの塩基配列が表2に示されたおり、タイプBヒトPDGFレセプター(B-hPDGF-R)をコードしていた。
【0164】
II.発現ベクターの作成
タイプBヒトPDGFレセプターの完全なコーディング領域を含む4.5kb DNA断片をHP−7クローンから EcoR I消化により単離した。ゲルから精製された断片を、SV40発現ベクター PSV7Cのポリリンカー領域にある EcoR Iサイトヘクローン化した。 pSV7d発現ベクターは、University of California, Davis のP.Luciw によって得られたSV40の初期プロモーター領域(SV40の塩基配列5190−5270)を含む pMLの派生物で、 EcoR Iおよび SmaI, XbaI, SalIの制限酵素認識部位とそれに続く3つの転写終了コドン(TAA)及びSV40ポリアデニレーションシグナル(SV40の塩基配列2556−2770)を含む(Truett et al. (1984) DNA 4:333-349)。HP−7クローンから得られたcDNA配列を含む EcoR I断片を pSV7dの EcoR Iサイトに挿入した。得られた発現ベクターでは、 B-hPDGF−レセプター遺伝子がSV40プロモーターの転写制御を受けた。
【0165】
SV40プロモーターに対してPDGFレセプターインサート(4.5kb)が正しい方向をむいていることを確認するため、レセプター配列の573位と発現ベクターのポリリンカー領域を切断する SmaI制限酵素で陽性クローンを消化した。
正しい転写向にレセプターを含むクローンからは 4.0kbインサートと、発現ベクターとレセプター5′末端の 573塩基対を含んだ3.2kb断片を放出した。このプラスミドPSVRH5を、抗生物質ネオマイシンの耐性を与えるPSV2neo プラスミドと一緒に細胞へ導入した。
【0166】
III.細胞培養と CHO 細胞への導入
U.C.S.F. Tissue Culture Facilityから入手した CHO細胞のKI株を、10% FCS (UCSF Tissue Culture Facility)及びペニシリンとストレプトマイシンを含むHam's F-12培地を用いて37℃と5% CO2/95% airの条件で培養を行なった。
pSVRH5プラスミドDNA(10μg)とpSV2neo (1μg)を1×106の CHO細胞に、Van der Eb et al. (1980), Methods in Enzymology (1980) 65:826-839 のカルシウム沈殿法を用いて導入し、導入DNAの分解を防ぐために10μgのクロロキノン二リン酸(CDP)を添加した。12時間の培養後に細胞をトリプシン処理し、5倍に希釈して再播種した。24時間後に、ネオマイシン類似体の抗生物質G418(GIBCO)を 400μg/mlの濃度になるように培地に加えた。選択を2週間続けた後、独立したコロニーを取り出して24穴プレートに移した。コンフルエント状態の培養に対してPDGFレセプターの存在を抗−レセプター抗体を用いたイムノブロットで確認した。このアッセイで陽性を示すコロニーを最終制限希釈法を用いて単一細胞にクローン化した。
【0167】
安定な形質導入クローンに対して、 RNAプロテクションアッセイを用いた測定によりタイプB PDGFレセプターメッセージの発現を試験し、抗−ホスホチロシン抗体を用いてPDGFで刺激されたレセプタータンパク質の存在を検出した。
【0168】
IV. CHO 細胞での B-hPDGF-R cDNA の発現
SV40初期プロモーターの転写制御を受けるヒトレセプター DNAを含むプラスミド DNAを導入した CHO細胞(CHO-HR5)とマウスレセプター DNAを含む同様のプラスミドを導入した CHO細胞(CHO-R18)を、Escobedo et al.(1988) J.Biol.Chem. 263:1482-1487 に以前示した方法で可溶化した。 Escobedo et al. (1988) J.Biol.Chem.及びKeating et al. (1987) J.Biol.Chem. 262:7932-7937 に以前報告したレセプターのカルボキシル末端領域の配列を認識する特異的な抗体を用いて、抽出物をウェスタンブロット解析で調べた。195kDaタンパク質が本来のレセプターであり、160kDaタンパク質がレセプターの前駆体である。
【0169】
形質導入細胞でのレセプタータンパク質の発現は、レセプターの細胞内配列を認識する抗体を用いて行なわれた。ヒトレセプターを最高水準に発現するクローンを以後の研究のために選定した。この形質導入細胞は、以下の競合的結合研究で示されるように、125I-PDGFで標識されるレセプターを持つ。
【0170】
V.異なったフォームの PDGF とタイプBレセプターの競合的結合
タイプBレセプターサイトと競合するヒト組換えAAおよびBBホモダイマーの能力と、 125I標識PDGF(調製法は以下に表示)の置換が調べられた。各ホモダイマーはイースト発現システムで選択的に作成されてイースト培地から精製され、その他の間充織細胞増殖因子を含まないため、従ってヒト発現システムに存在するかも知れない因子による汚染の影響を回避した。
【0171】
BALV/c 3T3 細胞と CHO形質導入細胞(CHO-HR5)を、AAあるいはBBの濃度が増加する状態で 125I-PDGFと反応させた。全細胞懸濁液中で、37℃45分間の結合を行なった。Ficoll勾配遠心で未結合の放射性標識PDGFを除去した。非特異的結合は、 CHO細胞を 125I-PDGFと反応させることにより決定し、結合放射活性の25%を占めた。
結合研究は、形質導入細胞がレセプターと hPDGFの相互作用を研究するモデルとして使用できることを示した。特にこの研究では、形質導入されたタイプBヒトPDGFレセプターが本来のマウスレセプターと機能的に等しいことが、次の結果から示された。PDGFのAA及びBBフォーム共にヒトレセプター形質導入物の 125I-PDGF標識部位と競合した。形質導入されたタイプBヒトPDGFレセプターと同様に本来のマウスレセプターは、BBフォームの方がAAフォームよりも高い親和性を示した。イーストで発現した場合、PDGFのAAフォームは劣った処理を受けるらしく、形質導入細胞及びマウス 3T3細胞の両者に対してBBフォームよりも低い親和性を与えた。競合パターンの一致は、本来のマウスレセプターと同様にAAフォームが形質導入タイプBヒトPDGFレセプターと相互作用することを示し、これらのレセプターが機能的に等しいことを示した。
【0172】
VI.PDGF レセプターチロシンキナーゼの活性化
タイプBレセプターチロシンキナーゼを活性化する組換えAA及びBBホモダイマーとヒト部分精製 AB PDGFを研究した。イースト由来AA及びBBホモダイマーのフォームと血小板由来ABフォームは導入されたヒトレセプターの自動リン酸化を刺激した。
【0173】
BALV/c 3T3 細胞とヒトPDGFレセプターを導入された CHO細胞 (CHO-HR5)を、異なるフォームのPDGF(AA, BBおよびAB)の増大する濃度で反応させた。引き続いて SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、リン酸化されたレセプターを抗−ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロットで同定した。
【0174】
レセプタータンパク質は200kDa分子量マーカーと一緒に泳動された。導入されたヒトレセプターの自動リン酸化を刺激するために有効なそれぞれのフォームの濃度は、本来のマウス 3T3レセプターあるいは形質導入されたマウスレセプターに同様の自動リン酸化を与える濃度と同等であった。
【0175】
PDGFのAAフォームがタイプBレセプターのレセプターチロシンキナーゼを活性化することを、これらの結果は初めて示した。形質導入細胞を使用する以前には、AAフォームが hPDGF活性を持つかどうか、あるいはタイプBレセプターでも単一レセプターがそれら全てのPDGFフォームを認識できるのかどうかは示されていなかった。更に、マウス 3T3細胞でPDGFに刺激されるチロシンキナーゼ活性に対応する野生型レセプターと機能的に等しいタイプBレセプターをヒトcDNAがコードすることを示した。
従って、形質導入細胞はPDGFで誘導されるマイトジェン反応を研究するモデルとして有用である。
【0176】
VII. CHO 形質導入細胞の RNA 合成の割合
BALV/c 3T3 細胞とタイプBヒトPDGFレセプターを導入されたCHO細胞(CHO-HR5)を、飽和濃度にある3種類のPDGFフォームで反応させた。ネガティブ及びポジティブコントロールとして、それぞれ未処理細胞と牛胎児血清(FCS)で処理した細胞を使用した。 DNAへ取り込まれる 3H−チミジンの水準を、前述したように酸不溶性成分の放射活性として決定した。
【0177】
タイプBヒトPDGFレセプターあるいはタイプBマウスPDGFレセプターの CHO細胞への導入は、PDGF感受性マイトジェン反応を与えた。全てのPDGFフォームは、タイプBヒトPDGFレセプター導入細胞でも本来のレセプターを産生するマウス細胞でも DNA合成を刺激した。
これらの資料は、A鎖のホモダイマー及びB鎖のホモダイマーが、血小板由来ABフォームと同様に、タイプBヒトcDNA配列によってコードされるレセプターを通して作用するマイトジェンであることを示した。マウス 3T3細胞や導入されたタイプBヒトレセプターを含む CHO細胞に対するこれらPDGFフォームのマイトジェン作用は、機能的に等しいレセプターで反応が調節されたことを示した。
【0178】
VIII.タイプ A PDGF レセプターの発現と単離
タイプAレセプターが上述したタイプBレセプターのように単離され、異なる点は違うプローブを使用したこととハイブリダイゼーション及びスクリーニングを厳密性の低い条件で行なったことであり、次のような性質が示される。特に、既に公表されているチロシンキナーゼのアミノ酸配列と高度なホモロジーを持つタイプBレセプターチロシンキナーゼの領域が同定され、そのアミノ酸配列はHRDLAARNであった。チロシンキナーゼ共通配列をコードするオリゴヌクレオチドを作成し、次のような配列を示した:
GTT(G/C)CGXGCXGCCAGXTC(G/C)CGXTG
【0179】
ここで、G/CはG又はCのいずれかを示し、XはA,T,C,Gのいずれも使用できることを意味している。ヒト胎盤λGT10 cDNAライブラリーの上述したようなスクリーニングを、6×SSC, 0.1% SDS, 5×Denhardt's溶液を含むバッファーと42℃の厳密性の低い条件で次のように行なった。52℃で2×SSC の洗浄を行ない、フィルターのスクリーニングを行なった。タイプAレセプターをコードするクローンを単離し、タイプBレセプター遺伝子で示した方法で塩基配列を決定した。
【0180】
タイプAレセプター(A-hPDGF-R)をコードする遺伝子の DNA配列とそこから推定されるアミノ酸配列を表3上に示した。
このベクターを、タイプBレセプタークローンで述べたように、形質導入 CHO細胞に使用した。ベクターがコードする配列の発現により、形質導入 CHO細胞が3種類の全PDGFフォームと結合し、AAホモダイマーと優先的に結合する、機能的なレセプターを産生した。
【0181】
IX. pSV-SRX1d 発現ベクターの細胞外齧歯類 PDGF-R 断片構造と齧歯類細胞外領域を用いた DUKX-B11 細胞の形質導入
分泌される齧歯類PDGFタイプBレセプター(タイプB PDGF-R) 細胞外領域(XR)を発現させるため、齧歯類PDGF-RのcDNAクローンを変異させてコドン 500と 501の間に StuI制限酵素認識部位を導入し、コドン 500をバリンからアルギニンに変更した。 1.7kbの EcoRI− StuI断片を、フレーム内プロリンコドンの次にC末端の停止コドンを加えられたpIBI-25 (IBI) に挿入した。 1.7kbのEcoRI− XbaI断片を pSV-7DHFRに転送し、そこではXR発現が SV-40初期プロモーターで制御され、アデノウィルスメジャー後期プロモーターで制御される増幅用マーカーのジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)転写ユニットが含まれる。完全なプラスミドはシグナル配列とPDGF-Rの最初の 499アミノ酸(細胞外領域)、続いてアルギニン、プロリン、停止コドンをコードする。
【0182】
cDNAの発現には、dhfr欠失 CHO突然変異細胞のDUKX-B11を用いた。10cmの組織培養プレートで5μgの pSV-SRX1dプラスミドを用いてDUKX-B11細胞の形質導入を行ない、10%透析仔牛血清と 200μg/mlプロリン、 100U/mlペニシリン、 100μg/mlストレプトマイシンを添加した核酸を含まないMEM-α(GIBCO)を用いて発現の選択を行なった。コロニーを抽出し、コンディションドメディウムに対して SDS電気泳動とレセプター細胞外領域に対して作用するポリクローナルPDGF-R抵抗(Ab77)によるウェスタンブロッティングを用いて解析しスクリーニングを行なった。
【0183】
メトトレキサートを用いた齧歯類細胞外領域の発現の増幅
陽性の形質導入細胞を、最初に1,2,5,10nMとして、メトトレキサート濃度を増加しながら順に処理した。最高濃度にあるコロニーを、次にメトトレキサート濃度を10倍(20, 50, 100nM) に上げて処理を行なった。最高濃度にあるコロニーを再び取り出して更に高濃度のメトトレキサート濃度で処理を行なった。それぞれの段階にあるコロニーのコンディションドメディウムを SDS電気泳動と抗−PDGF-R抗体(Ab77)を用いたウェスタンブロッティングで解析を行ない、細胞外領域タンパク質の発現を調べた。最も大量に細胞外領域タンパク質を分泌するメトトレキサート(5μM)耐性細胞を、DPXR (DUK-PDGF-R細胞外領域) 細胞と命名した。O-glycanase (Genzyme Co.)とN-glycanase (Genzyme Co.)を用いて、細胞外領域タンパク質の酵素処理を行なった。簡単に説明を行なうと、小麦胚芽アグルチニン(WGA) アフィニティークロマトグラフィー(50nM、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.4)を用いて部分精製した細胞外領域タンパク質を N-glycanase(10U/ml)を用いて一晩37℃で処理し、更に O-glycanase(2mU/ml)で2時間処理した。次にサンプルを5分間煮沸し、 SDS電気泳動とAb77を用いたウェスタンブロッティングで解析を行なった。
【0184】
コンディションドメディウム
95%コンフルエントなDPXR細胞を、無血清 DME H21培地で2回洗浄した。10% protein-free Serum Substitute (UCSF Cell CultureFacility)を添加した4mlの DME H21培地を10cm培養プレートに移した。様々なアッセイに使用された齧歯類細胞外領域ポリペプチドを含むコンディションドメディウムを、特に指定のない限り、48時間DPXR細胞を培養した後に回収した。
【0185】
125 I-BB-PDGF の調製
BB-PDGF(Chiron Corporationからの贈り物)をヨウ素化した。簡単に説明を行なうと、シリコン処理を行なったポリプロピレンチューブ内で 2.5μgの BB-PDGFをロータリーエバーポレーターで処理した。 BB-PDGFを10μlの 0.1Mホウ酸ナトリウム(pH 8.5)に溶解した。 125I−モノヨード Bolton Hunter試薬(500μCi;Amersham)を窒素雰囲気で乾固した。前もって調製しておいた BB-PDGFを乾燥 Bolton Hunter試薬に加え、15分間4℃で反応させた。50μgのクエンチ溶液(0.1Mホウ酸ナトリウム、 0.2MグリシンpH 8.5)を反応混合物に加え、更に10分間4℃で反応させた。1mg/ml BSA (ICNBiochemicals)を含む 0.1M酢酸で平衡化した PD-10カラム (Pharmacia) に反応混合物全体を添加し、同一バッファーで溶出した。
【0186】
X.結合アッセイ
PDGFレセプターポリペプチドの可溶性断片の生産、及びそれらを用いたアッセイに関して、Kimball and Warren (1984) Biochim. Biophys.Acta 771:82-88 やvan der Schaal et al.(1984) Anal. Biochem. 140:48-55, van Driel et al.(1989) J.Biol.Chem. 264: 9533-9538, Heldin et al. (1988) EMBO J. 7:1387-1393, Williamset al. (1982) Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 79 :5867-5870, Williamset al. (1984) J.Biol.Chem. 259:5287-5294 、そして特にOrchanskyet al. (1988) "Phosphatidylinositol Linkage of a Truncated Form of the Platelet-derived Growth Factor Receptor" J.Biol. Chem. 263:15159-15165 に技術及び結果が報告されており、従ってここではそれぞれの資料を資料として含める。特に Orchanskyの報告には、PDGFレセプターの細胞外領域全体が、TMおよび細胞内領域と分離された後でも、未だにPDGFリガンドと結合能力を保持していることが示されている。
【0187】
細胞全体の結合アッセイでは、 PBS/EDTA(2mM)で浮遊させた2×104 R18細胞(PDGFタイプBレセプター導入CHO細胞)を10μlの血小板を殆ど含まない血清と PBS/Hepes(25mM最終pH 7.4)で反応させた。12.5μlから 200μlのDPXR細胞コンディションドメディウム(上述の方法で収集)を、最終容量を 250μlとして20から1.25倍希釈となるように結合混合物に加えた。混合物を一晩4℃で攪拌し、 750μlのFicoll勾配(PBS中に28.5% Ficoll-Paque (Pharmacia)) を用いて4℃で遠心した。上清を吸引し、細胞沈殿物の放射活性をガンマカウンターで測定した。
【0188】
BB-PDGFへの親和性を測定するため、細胞外領域タンパク質をプラスチック表面に吸着させて固定した。 WGAアフィニティークロマトグラフィー精製された50μlの細胞外領域(約80nM、銀染色より推定)を10mlの 25mM Tris-Cl, 75mM NaCl, 20mM NH4HCO3、pH 7.5溶液で希釈し、 100μlづつを96穴 ELISAマイクロタイタープレート(Dynatech Products Co.)の各ウェルに分注した。4℃で一晩の反応後、そのプレートを1回洗浄し 100mM NaCl, 25mM Hepes, pH7.35に溶解した 0.5%ゼラチンで3時間4℃でブロックした。次にプレートを結合バッファー(0.3%ゼラチン、100mM NaCl, 25mM Hepes, pH7.35)で2回洗浄した。125I-BB-PDGFおよび/あるいは未標識のBB-PDGFを最終容量 100μlとなるようにウェルに加え、プレートを4℃で16時間反応させ、恒常状態の結合とした。プレートを再び結合バッファーで3回洗浄し、ガンマカウンターで測定するために200μlの1% SDS, 0.5% BSA溶液を用いて抽出した。
【0189】
架橋実験
特に WGAクロマトグラフィーで精製された細胞外領域ポリペプチド(25μl,〜50nM)と 0.2μCiの125I-BB-PDGF(最終濃度2nM)および各濃度の未標識 BB-PDGFを、最終容量を 100μlに調整して4℃3時間反応させた。
次に細胞外領域タンパク質とリガンドを、1mM bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3)(cat. #21579, Pierce Chemicals, Rockford, Illinois)を用いて室温で30分間の架橋を行なった。 25mM TrisバッファーpH 7.4を添加して5分間放置し、反応を停止した。レセプター抗体(Ab77)を用いて細胞外領域タンパク質を免疫沈降し、 SDS電気泳動で解析した。
【0190】
自動リン酸化アッセイ
細胞外領域タンパク質(1ml)を含むコンディションドメディウムを BB-PDGFと4℃で3時間反応させた。混合物を静止期のヒトPDGF A−レセプター導入 CHO細胞あるいはBALV/c 3T3 細胞の単層細胞シートを含む Falcon 6穴組織培養プレート(1ml/ウェル)に加えた。細胞と混合物を10分間37℃で反応させ、次に血清を含まない DME培地で洗浄し、Ripand溶解バッファーで溶解した。細胞ライセートを SDS電気泳動と抗−ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロッティングで解析した。
【0191】
マイトジェン活性
BALV/c 3T3 細胞を96穴組織培養プレートで3日間培養し、Q−培地(1mg/mlインシュリン及び2μg/mlトランスフェリン、0.5mg/ml BSAを含むDMEM)で24時間処理し静止期を作成した。細胞外領域タンパク質を含むコンディションドメディウムを新鮮なDME H21培地を用いて2倍の連続希釈を行ない、2nM BB-PDGFと4℃で3時間反応させた後、BALV/c 3T3 細胞に加えた(200μl/ウェル)。細胞を37℃で18時間培養した。1μCiの〔 3H〕−チミジン(50μl)を各ウェルに加え、4時間放置した。細胞を冷 PBSで2回洗浄し、冷トリクロル酢酸溶液(TCA, 5%)で固定した。沈殿した細胞破砕物を十分に冷 TCA(5%)で洗浄し、シンチレーション測定のために0.25N HaOH 溶液に溶解した。
【0192】
XI.ヒト細胞外領域
ヒトレセプターに対する構成方法や発現、可溶性細胞外レセプター断片の切断あるいは欠失類似体生理学的効果の決定は、ここに述べられた核酸やポリペプチド、その他の試薬類を用いて行なわれた。
【0193】
ヒト欠失および切断構成体
PDGF-R構成体
Mp18PRを作成するために、ヒトタイプ B hPDGF-Rの3.9kb EcoR I− Hind III cDNA 断片を M13Mp18の EcoR I− Hind III サイトにサブクローンした。技術に関しては、この資料に引用してあるManiatiset al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor, N.Y.を参照すること。サブクローニングの認識を、制限酵素切断解析と Sanger et al. (1977) Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 74 :5463に述べられているジデオキシチェインターミネーションシークエンシングを用いて行なった。in vitro変異に用いるオリゴヌクレオチドは Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol., 154:367 の方法に従って作成した。オリゴヌクレオチドを用いたMp18PRのin vitro欠失変異体を作成する戦略に関しては、図8に概略を示した。簡単に説明すると、欠失変異により可溶性タイプB hPDGFレセプター細胞外領域を作成するためにオリゴヌクレオチドを設計した。ヒトPDGFレセプターの適当な領域に合致する変異オリゴヌクレオチドを、欠失体を生成するために使用した。変異作成全体を通してアンチセンス鎖を使用した。PΔ1の変異にはテンプレートとしてMp18PRを用いた。PΔ1は41bpのオリゴマーをD5のリシン499(K499)の後にある TAG停止コドンに導入され、トランスメンブレン(TM)および細胞内キナーゼドメイン(K)を除去されており、 Mp18PΔ1 を生成した。PΔ1は 530aa 148aa前駆タンパク質をコードしている。
【0194】
ヒトPDGFレセプター構成体はその後、Takabe et al.(1988) Molec. Cell Biol. 8:466 に述べられている pCDL-SRα296 の派生物pBJ1の EcoR I− Hind IIIサイトにサブクローンされ、Southern andBerg (1982) J.Mol.Appl.Gen., 1:327 に述べられている pSV2NEOと一緒にチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に導入された。
構成体の機能は、次のように示された。
0.33nM PDGF BBリガンドサンプルを4℃で1時間以下の条件で前処理した。
【0195】
1.ポリクローナル抗−ヒトPDGF抗体(この抗体はヒト PDGF AAおよびPDGF BB, PDGF ABを認識する)
2.18nM(PDGF BBに対しモル比で60倍)ヒトタイプB PDGFレセプター
3.レセプターと抗体を含んだリン酸平衡化生理食塩水(PBS)、あるいは
4.リガンドだけを含むリン酸平衡化生理食塩水(PBS)
実験の重複セットで、0.33nM PDGF AAを3種類の前処理条件即ち上述2.3.4.で処理した。ヒトタイプB PDGFレセプターは余りPDGF AAを認識しないけれども、以前としてこのリガンドがNIH 3T3細胞に発現されるヒトタイプA PDGFレセプターを活性化するため、ヒトタイプB PDGFレセプター及び PDGF BB−依存性活性化に対する細胞毒性などの非特異的で一般的な細胞効果のコントロールとなる。
前処理した材料は最終容量を 0.5mlとした。それらを6ウェル組織培養ディッシュの各ウェルに加え、各ウェルには4℃に冷却された NIH 3T3細胞の血清飢餓(静止期)にあるコンフルエントレイヤーが含まれた。細胞と反応混合物を攪拌、即ち4℃で2時間揺り動かした。次に4℃のリン酸平衡化生理食塩水で2回洗浄した。1ウェル当たり40μlの125mM Tris (hydroxymethyl) amino methane (Tris), pH 6.8, 20%(v/v)グリセリン、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、2%(v/v)2−メルカプトエタノール、 and 0.001%ブロモフェノールブルー(SDSサンプルバッファーとして知られる)を加え、次に40μlの100mM Tris, pH 8.0、30mMピロリン酸ナトリウム、50mMふっ化ナトリウム、5mMエチレンジアミン4酢酸(EDTA)、5mM ethylenebis (oxyethylenenitrilio)tetraacetic acid,1%(w/v) SDS、 100mMジチオトレイトール、2mMふっ化フェニルメチルスルフォニル(PMSF)、 200μMバナジン酸ナトリウム溶液を細胞に加えた。細胞は可溶化され、その可溶化物に更に40μlの SDSサンプルバッファーを加えた。この材料を5分間煮沸し、 7.5%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルの単一サンプルウェルに添加した。細胞性タンパク質を電気泳動で分離した。
【0196】
分離されたタンパク質をニトロセルロースへ電気的に転写し、得られた“ウェスタンブロット”を 0.5%(w/v)塩化ナトリウム、5mg/mlウシ血清アルブミン、50mM Tris 、pH 7.5溶液(ブロッキングバッファーと命名)を用いて室温で20分間の処理を3回繰り返した。ブロッキングバッファーで1/1000希釈したPY20(市販されているホスホチロシンに対するモノクローナル抗体〔ICN 〕)を用いてブロットを4℃で一晩反応した。ブロットを3回洗浄し、それぞれ室温で20分間ブロッキングバッファーを使用した。ブロットに対して4μCiの125I-Protein A〔Amersham〕を含むブロッキングバッファーを用いて室温で1時間反応させ、3回の洗浄を室温でそれぞれ20分間ブロッキングバッファーを用いて行なった。1枚のインテンシファイングスクリーンを用いてブロットをX線フィルムに−70℃で48時間感光させ、通常の試薬で現像を行なった。
【0197】
XII.PDGF プレートアッセイ
ポリスチレンマイクロタイタープレート(Immulon, DynatechLaboratorise)をタイプBヒトPDGFレセプターの細胞外領域断片(上述)でコートし、1ウェル当たり10−100ng のこのタンパク質を 100μlの25mM Tris, 75mM NaCl、pH7.35溶液で添加した。このタンパク質は形質導入 CHO細胞で発現され、無血清培地(GIBCO MEMα)に 0.2−1μg/ml、総タンパク質量として 150−300 μg/mlの濃度で回収された。ヒトタイプB PDGFレセプターの細胞外領域断片の濃縮と部分精製を行なうため、小麦胚芽アグルチニン−Sepharoseへ4℃で培地を(48ml/hで)1mM PMSF の存在下に添加した。十分な洗浄後、タンパク質を 0.3M N−アセチル−グルコーサミン、25mM Hepes, 100mM NaCl, 1mM PMSF、pH 7.4溶液で溶出した。この分画を0.15M重炭酸アンモニウムpH 7.9溶液で平衡化されたSephacrylS-200 HR(Pharmacia)に添加した。レセプター(3−10ng/μl)を含む分画を SDS電気泳動とレセプター細胞外領域のペプチドに結合するウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。これらの分画(3−10ng/μl)を用いて、上述したようにマイクロタイタープレートのコーティングを行なった。次にウェルから溶液を除去し、それぞれ 200μlの 0.5%ゼラチン(Bio-Rad, EIA grade)、25mM Hepes, 100mM NaCl、pH 7.4溶液を用いて1回洗浄し、 150μlの同一溶液で4℃で3時間放置した。ウェルから溶液を除去し、 0.3%ゼラチン、25mM Hepes, 109mMNaCl、pH 7.4溶液(各 150μl)で2回洗浄した。プレートを氷の上に置き、90μlのこの 0.3%ゼラチン溶液を各ウェルに加えた(非特異的結合の試験に用いるウェルには80μlだけを加え、次に10μlの0.01mg/ml未標識PDGFを含む 0.3%ゼラチン溶液を加えた)。ジヨード Bolton Hunter試薬(Amersham)を用いて 52,000CPM/ngとなるように4℃でPDGF BB (Amgen)をヨウ素化し、約 40,000CPMを1ウェル当たりに加え、10μlの 0.024% BSA、 0.4%ゼラチン、20mM Hepes, 80mM NaCl、70mM酢酸、pH 7.4溶液とした。プレートを4℃で4時間放置し、その後それぞれ 150μlの 0.3%ゼラチン、25mM Hepes, 100mM NaCl、pH 7.4溶液を用いて4℃で3回洗浄した。ウェルに 200μlの1% SDS, 0.05% BSA溶液を加えて残存する結合放射活性を可溶化し、ガンマカウンターで測定した。非特異的結合を 150倍過剰の未標識PDGF BB (Amgen) の存在下に決定し、総結合125I-PDGF の約7%であった。
【0198】
これらの研究は他の増殖因子混入を除去した増殖因子の調整を利用することを可能にし、測定されたPDGF反応の全体をこの単一形質導入レセプター DNAに寄与させるレセプター発現システムの使用を可能にした。
【0199】
XIII.細胞内領域
細胞培養および組換え vaculovirus
BALB c/3T3 細胞のクローンA31, C.D.Scher, Children's Hospitalof Philadelphia, PA.から入手を、10%牛血清とペニシリン及びストレプトマイシン(各50μg/ml)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。Spodoptera fruqiperda (Sf9) 細胞(M.Summers, Texas A&M, TXより)を、10%牛胎児血清、 3.3g/lイーストレイト、 3.3g/lラクトアルブミン加水分解物及びペニシリンとストレプトマイシン各50μg/mlを添加した Grace's培地で増殖させた。組換えタイプB PDGFレセプター及びPDGFタイプBレセプターΔKI変異 vaculovirusベクターを通常方法に従って作成した。組み替え vaculovirusを感染後48−60時間のSf9細胞の上清から回収し、感染多重度(MOI)を1とした。
【0200】
抗体、マイトジェン、ペプチド
細胞外領域に位置する合成ペプチド(アミノ酸 425−446)を認識する抗−タイプB PDGFレセプター抗体(Ab77)を使用した。モノクローナル抗−PLC-γ抗体は S.G.Rhee, NIH, Bethesda, MDから親切にも提供を受け、抗−GAP 抗体はF.McCormick, Cetus Corp., Emeryville, Californiaから提供を受けた。組換え BB-PDGFはChiron Corp.Emeryville, Californiaに所属するC.G.Nascimentoから提供を受けた。結合実験に使用したペプチドは従来のペプチド合成装置で調整し、チロシンリン酸化ペプチドを合成するためにリン酸化チロシン(N-Boc-Tyr-O-〔PO3Bzl2〕, Peninsula Laboratory, Belmont, California)を使用した。
【0201】
結合アッセイ
in vivo 結合を Morrison et al. (1989) Cell 58 :649-657 に従って行なった。血清飢餓培養BALB/c 3T3 細胞(107細胞)を、2nM PDGF の存在下あるいは非存在下で培養した。細胞ライセートを抗−レセプター抗体あるいは抗−ホスホチロシン抗体を使って免疫沈降した。免疫複合体を、PI3キナーゼ活性の存在を検出し、レセプターに結合したタンパク質を決定するアッセイに使用した。in vitro結合実験を Morrison et al. (1989) あるいは Morrison et al. (1990) Mol.Cell.Biol. 10 :2359-2366 に従って行なった。代表的には、 vaculovirus発現タイプB PDGFレセプターを、感染 (MOI:10)後48−60時間のSf9細胞から抗−レセプター抗体を用いた免疫沈降で回収した。感染細胞を冷 PBSで2回洗浄し、1mlの溶解バッファー(1% NP-40, 20mM Tris (pH 8.0), 173mM NaCl、10%グリセリン、2mM EDTA 、1mMふっ化フェニルメチルスルフォニル(PMSF)、アプロチニン(0.15U/ml)、20μMロイペプチン、1mMオルトバナジン酸ナトリウム)を用いて4℃で20分間の振とうにより溶解した。大部分の実験(図3の説明に示した場合を除いて)では、免疫沈降されたレセプターをin vitroで自動リン酸化するために、20mM Tris (pH 7.5), 20mM MnCl, 100μM ATPを含むバッファー中に25℃で15分間放置した。ライセートを13,000Xgで10分間遠心し、不溶性物質を除去した。ライセートを抗−レセプター抗体(1:500 希釈)と4℃で4時間反応した。レセプター−抗体複合体をProtein-A Sepharose (Sigma) を用いて沈殿させ、洗浄を順にRIPAバッファー(0.1% SDSを含む溶解バッファー)、洗浄バッファー1〔 0.5% NP-40, 0.5M LiCl, 50mM Tris (pH 7.4) 〕、10mMTris (pH 7.4) を用いて行なった。PI3キナーゼ結合アッセイを行なうため、固定化レセプターをBALB/c 3T3 細胞ライセートと4℃で3時間反応させた。免疫複合体を順に冷 PBS、 0.5% NP-40, 0.5M LiCl and 50mM Tris (pH 7.4)溶液で洗浄した。ペプチドを使用する実験では、BALB/c 3T3 細胞ライセートをそのペプチド(50μM)と4℃で30分間予め反応させておき、それから昆虫細胞システムに発現されるPDGFレセプタータンパク質と反応させた。
【0202】
in vitro キナーゼ及び PI 3キナーゼ活性
in vitroプロテインキナーゼ活性を測定するため、免疫沈降物をプロテインキナーゼバッファー(30mM Tris (pH 7.4), 10mM MnCl2)と10μCiの〔γ-32P〕-ATP 3,000Ci/mmol中で25℃15分間反応させた。4×Laemmli 添加ゲルバッファーを加えて反応を停止した。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグラフィーを用いてサンプルを解析した。PI3キナーゼ活性はKaplan et al. (1986) Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 83 :362-364 に示された方法で解析した。免疫複合体をPI3キナーゼバッファー(30mM Hepes (pH 7.3), 30mM MgCl2、 200μMアデノシン、40μM ATP)及び0.2mg/mlの超音波処理ホスホイノシトール(PI)、10μCi〔γ-32P〕-ATP(3,000Ci/mmol)で25℃10分間反応させた。アデノシンをPI3キナーゼアッセイに加えたのは、混入するPI4キナーゼ活性を完全に阻害するためである。 100μlの塩酸を加えて反応を停止した。反応生成物をクロロフォルムで抽出し、薄相クロマトグラフィーで分離した。PIから PIPへの変換を測定するため、 TLCプレートをX線フィルムに2−3時間露光した。
【0203】
レセプターの脱リン酸化
1mMオルトバナジン酸の存在下及び非存在下で、レセプター免疫沈降物を4μgのジャガイモアシッドホスファターゼと30℃で30分間反応させた、 Morrison et al. (1989) を参照すること。 RAP処理後に免疫沈降物を1mMオルトバナジン酸ナトリウムを含むRIPAバッファーで3回洗浄し、それから 3T3細胞ライセートと反応させた。
【0204】
PDGF レセプタープローブを用いた 85kD タンパク質の“ブロッティング”
ニトロセルロースメンブレンに転写した細胞ライセートタンパク質を用いて、PDGFレセプターと直接結合するそれらタンパク質の能力を解析し、その操作をニトロセルロースメンブレンに対して32P−標識PDGFレセプターをプローブとして行なった。放射性標識レセプタープローブを調製するため、 baculovirus−発現レセプターを106 Sf9細胞から免疫沈降した。免疫複合体を洗浄し、上述の自動リン酸化によって標識した。標識レセプターを免疫複合体から解離させるため、 100℃の可溶化バッファー(0.4% SDS, 100mM NaCl,2mM EDTA 、2mM β−メルカプトエタノール、50mMトリエタノールアミン、pH 7.4)で繰り返し処理を行なった。抽出物を集め、β−メルカプトエタノールを含まず10mMヨードアセトアミドと1%Triton X-100を加えた可溶化バッファーで希釈した。 SDSポリアクリルアミド電気泳動とそれに続くオートラジオグラフィーによるこの物質の解析から、レセプターが単独で存在することが呈示された。BALB/c 3T3 細胞ライセートを調製し SDS電気泳動を行なった。SDSの非存在下でタンパク質をニトロセルロースフィルターに電気的に転写した。フィルターを放射性標識PDGFレセプターと4℃で12時間反応させ、2% Triton X-100 を含みβ−メルカプトエタノールを含まない可溶化バッファーで洗浄した。ペプチド競合実験のために、フィルターを32P−標識レセプタープローブ及び 2.5μMの指定ペプチドと上述の方法で反応させた。
【0205】
本明細書中のすべての文献および特許出願は、それぞれの個別の文献および特許出願が特別にかつ別個に参照により編入されるのと同程度に、参照により編入される。本発明はいま完全に記載され当業者にとって、これの多くの変更及び修飾が添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく可能であることが明らかである。
【0206】
【配列表】
【0207】
【表2】
【0208】
【表3】
【0209】
【表4】
【0210】
【表5】
【0211】
【表6】
【0212】
【表7】
【0213】
【表8】
【0214】
【表9】
【0215】
【表10】
【0216】
【表11】
【0217】
【表12】
【0218】
【表13】
【0219】
【表14】
【0220】
【表15】
【0221】
【表16】
【0222】
【表17】
【0223】
【表18】
【0224】
【表19】
【0225】
【表20】
【0226】
【表21】
【0227】
【表22】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は85kD/PI3キナーゼとタイプB PDGFレセプターとの結合を説明する。リン酸化タンパク質とPDGFレセプター(aおよびb)およびフォスファチジルイノシトール3′キナーゼ(PI3キナーゼ)活性(cおよびd)との結合が、完全な細胞(aおよびc)とインビトロ(bおよびd)で研究された。完全な細胞の実験において、PDGF−刺激(+)または対照細胞(−)が可溶化され、レセプターは抗−レセプター抗体を使用して免疫沈降された。レセプターが結合したリン酸化タンパク質はレセプター−結合タンパク質複合体を MnCl2およびγ32P-ATP でインキュベーションし、続いて SDSポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより検出した。PDGF−刺激レセプターは85kDおよび 110kDリン酸化タンパク質およびPI3キナーゼ活性に結合したが未刺激レセプターはそうではなかった。等量のレセプターを刺激したおよび未刺激の細胞の溶解物から免疫沈降した。インビトロ結合は、バキュロウィルス−発現レセプターをPDGF−刺激(+)または未刺激(−)細胞とインキュベーションすることにより行った。レセプターが結合したリン酸化タンパク質(b)およびPI3キナーゼ活性(d)を検出した。85kDタンパク質の位置を矢印で示す。
【図2】図2は、インビトロで85kDタンパク質およびPI3キナーゼと、野生型およびキナーゼ挿入欠損突然変異体レセプターとの結合を説明する。未刺激の 3T3細胞からの溶解物を、野生型PDGFタイプBレセプターまたはバキュロウイルス発現系を使用して調製した免疫沈降したキナーゼ挿入欠損突然変異体レセプターと共に混合した。レセプター−結合タンパク質を含有する免疫沈降物を徹底的に洗浄した。インビトロタンパク質キナーゼアッセイ(パネルa)またはPI3キナーゼ活性は(パネルb)をタンパク質について行った。パネル(a)の第一列は、細胞溶解物と混合していないバキュロウイルス−発現レセプターのインビトロタンパク質キナーゼアッセイを表す。パネル(a)の第二および第三列の最上ふたつのバンドは、バキュロウイルス−発現レセプター(第二列)または突然変異したレセプター(第三列)からのものであり、ならびにそれぞれの前駆体である。矢印は85kDタンパク質を指示する。
【図3】図3はPI3キナーゼ活性と85kDタンパク質との結合に、レセプター自己リン酸化が必要であることを説明する。PDGFレセプターは、野生型PDGFレセプター組換えバキュロウイルスで感染させたSf9細胞から免疫沈降した。リン酸化レセプターを含有する免疫沈降物を可溶化した 3T3細胞溶解物とともにインキュベーションした。PI3キナーゼアッセイ(aおよびb)、ならびにインビトロキナーゼアッセイ(c)を行った。(a)PI3キナーゼ活性とリン酸化PDGFレセプターとの結合は、ジャガイモ酸性フォスファターゼ(PAP)または PAPにオルトバナデートを加えた物とインキュベーションした。
【図4】図4は、85kDリン酸化タンパク質およびPI3キナーゼ活性がレセプターと結合することをブロックするために、ペプチドの使用を説明する。表AIに掲げられたペプチドは免疫沈降レセプターとのインキュベーションに先立って、未刺激の 3T3細胞溶解物とともに予備インキュベーションされた。レセプター−結合リン酸化タンパク質(パネルa)およびレセプター−結合PI3キナーゼ活性(パネルb)の検出は、図1および2のように行われた。85kDタンパク質を矢印で示す。
【図5】図5はペプチド Y719Pの濃度依存性ブロッキング活性を説明する。一連の濃度のペプチド Y719Pが、タンパク質(パネルa)またはPI3キナーゼ活性(パネルb)のバキュロウイルス−発現免疫沈降レセプターへの結合のブロッキング能力を試験された。矢印は85kDリン酸化タンパク質を示す。アッセイは図1,2および3に記載されるように行われた。
【図6】図6はPDGFレセプターとPLC-γまたは GAPとの結合が、 3T3未刺激溶解物とレセプターリン酸化ペプチド、 Y719Pとの予備インキュベーションによっては影響されないことを説明する。ペプチド/溶解物混合物を、免疫沈降バキュロウイルス−発現レセプターと図1,2、および3に記載されるようにインキュベーションした。レセプター複合体中のPLC-γおよび GAPの存在をPLC-γおよび GAP抗体をプローブとしてイムノブロット分析により測定した。“溶解物”と記した列において、 3T3細胞の粗溶解物は対照としてイムノブロットされ、PLC-γおよび GAPの電気泳動的位置を表した。
【図7】図7は、可溶性放射標識レセプターと固定化85kDタンパク質(“レセプターブロット”)との結合を説明する。バキュロウイルス−発現PDGFレセプターをレセプター抗体を使用して免疫沈降させ、レセプターをインビトロで自己リン酸化により32P−標識した。可溶化された放射標識レセプターを使用して、対照(1,3,4、および5列)またはPDGF刺激(2列)細胞からの SDS−ポリアクリルアミドゲル分画溶解物を含有するニトロセルロースフィルターを釣り上げた。ペプチド競合実験では(レーン3,4および5)、ペプチドが、放射標識レセプタープローブと共にニトロセルロースフィルターに添加された。矢印は85kDタンパク質の位置を指示する。
【図8】図8は、可溶性 hPDGF-R細胞外領域のインビトロ生産を支配したオリゴヌクレオチドについての戦略を説明する。使用した省略記号は:
PR=PDGFR ;完全
P=PDGFR ;細胞外領域
TM=トランスメンブラン領域
K=キナーゼ
S=シグナル配列
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