JP3471879B2 - セリンキナーゼ活性の抑制方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、ｐｉ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合分子、サブユニットの存在検出方法、ｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤 - Google Patents
セリンキナーゼ活性の抑制方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、ｐｉ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合分子、サブユニットの存在検出方法、ｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はセリンキナーゼ活性の抑
制方法、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ
（以下、ＰＩ３−キナーゼと称する）のサブユニット間
の結合活性の調整方法、ＰＩ３−キナーゼのサブユニッ
ト結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞
系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニス
ト、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合
分子、サブユニットの存在検出方法、ＰＩ３−キナーゼ
活性の抑制剤製造方法、およびＰＩ３−キナーゼ活性の
抑制剤に関し、詳しくは、ＰＩ３−キナーゼのｐ１１０
およびｐ８５サブユニット間の結合活性を抑制する方法
に関する。この発明は、ＰＩ３−キナーゼ活性を調整す
る方法を提供するものであり、外部刺激に対する細胞の
反応を調節するものである。より具体的には、ｐ８５サ
ブユニットのＳＨ２間ドメインに位置する残留基を従来
手段によって無効化することによって、前記サブユニッ
ト間の結合活性に干渉し、その結果、ＰＩ３−キナーゼ
活性を調整する。
制方法、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ
（以下、ＰＩ３−キナーゼと称する）のサブユニット間
の結合活性の調整方法、ＰＩ３−キナーゼのサブユニッ
ト結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞
系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニス
ト、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合
分子、サブユニットの存在検出方法、ＰＩ３−キナーゼ
活性の抑制剤製造方法、およびＰＩ３−キナーゼ活性の
抑制剤に関し、詳しくは、ＰＩ３−キナーゼのｐ１１０
およびｐ８５サブユニット間の結合活性を抑制する方法
に関する。この発明は、ＰＩ３−キナーゼ活性を調整す
る方法を提供するものであり、外部刺激に対する細胞の
反応を調節するものである。より具体的には、ｐ８５サ
ブユニットのＳＨ２間ドメインに位置する残留基を従来
手段によって無効化することによって、前記サブユニッ
ト間の結合活性に干渉し、その結果、ＰＩ３−キナーゼ
活性を調整する。
【０００２】本発明は、更に、ＰＩ３−キナーゼのセリ
ンキナーゼ活性配列に関し、ＰＩ３−キナーゼのセリン
キナーゼ活性を調整する方法に関し、これは前記ｐ１１
０サブユニットのＤＲＨＮＳＮ配列を無効化することに
よって達成される。この方法は、ＰＩ３−キナーゼ活性
全体に影響を与えるのに使用できる。
ンキナーゼ活性配列に関し、ＰＩ３−キナーゼのセリン
キナーゼ活性を調整する方法に関し、これは前記ｐ１１
０サブユニットのＤＲＨＮＳＮ配列を無効化することに
よって達成される。この方法は、ＰＩ３−キナーゼ活性
全体に影響を与えるのに使用できる。
【０００３】更に、本発明は、前記ｐ８５サブユニット
の、６０８位置のセリン残留基における燐酸化を刺激す
るアゴニストを提供し、ここで、前記セリン残留基に於
ける燐酸化の結果、ＰＩ３−キナーゼの活性が抑制され
る。
の、６０８位置のセリン残留基における燐酸化を刺激す
るアゴニストを提供し、ここで、前記セリン残留基に於
ける燐酸化の結果、ＰＩ３−キナーゼの活性が抑制され
る。
【０００４】本発明は、更に、ＰＩ３−キナーゼの活性
に対するアゴニスト（作動体）及びアンタゴニスト（拮
坑体）にも関する。
に対するアゴニスト（作動体）及びアンタゴニスト（拮
坑体）にも関する。
【０００５】
【従来の技術】最近、信号変換分子と細胞表面レセプタ
に結合した二次メッセンジャ系の構造及び作用に関する
我々の知識に大きな進歩があった。ポリペプチド成長因
子レセプタのサブセットは、プロテインチロシンキナー
ゼ族に属し、リガンド結合後におけるこれらレセプタの
活性は、レセプタの自己燐酸化と、数多くの細胞間基質
プロテインの燐酸化とを伴う（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ ｅ
ｔ ａｌ．１９９０参照）。これまでレセプタの自己燐
酸化の重要性は不明であったが、最近のいくつかの研究
所から提供された証拠によれば、これはレセプタプロテ
インと、推定成長調節プロテインとの間の複合物質、例
えば、ホスホリパーゼ Ｃγ（ＰＬＣγ）（Ｍｅｉｓｅ
ｎｈｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８９）、ホスファ
チジルイノシトールＰＩ３−キナーゼ（Ｃｏｕｇｈｌｉ
ｎ，Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．１９８９）ＧＴＰａｓｅ−
活性化プロテイン（ＧＡＰ）（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａ
ｌ．１９９０）、セリン／トレオニンキナーゼ Ｒａｆ
（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔａｌ．１９８９）、及び、プ
ロテインチロシンキナーゼのｓｒｃ族の構成要素（Ｋｙ
ｐｔａ， ＲＭ ｅｔ ａｌ． １９９０）（Ｃａｎｔ
ｌｅｙ，Ｌｃ ｅｔａｌ． １９９１参照）等の形成を
媒介している可能性があることが示唆されている。
に結合した二次メッセンジャ系の構造及び作用に関する
我々の知識に大きな進歩があった。ポリペプチド成長因
子レセプタのサブセットは、プロテインチロシンキナー
ゼ族に属し、リガンド結合後におけるこれらレセプタの
活性は、レセプタの自己燐酸化と、数多くの細胞間基質
プロテインの燐酸化とを伴う（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ ｅ
ｔ ａｌ．１９９０参照）。これまでレセプタの自己燐
酸化の重要性は不明であったが、最近のいくつかの研究
所から提供された証拠によれば、これはレセプタプロテ
インと、推定成長調節プロテインとの間の複合物質、例
えば、ホスホリパーゼ Ｃγ（ＰＬＣγ）（Ｍｅｉｓｅ
ｎｈｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８９）、ホスファ
チジルイノシトールＰＩ３−キナーゼ（Ｃｏｕｇｈｌｉ
ｎ，Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．１９８９）ＧＴＰａｓｅ−
活性化プロテイン（ＧＡＰ）（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａ
ｌ．１９９０）、セリン／トレオニンキナーゼ Ｒａｆ
（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔａｌ．１９８９）、及び、プ
ロテインチロシンキナーゼのｓｒｃ族の構成要素（Ｋｙ
ｐｔａ， ＲＭ ｅｔ ａｌ． １９９０）（Ｃａｎｔ
ｌｅｙ，Ｌｃ ｅｔａｌ． １９９１参照）等の形成を
媒介している可能性があることが示唆されている。
【０００６】ＰＩの回収率が高いために、ＰＩキナーゼ
活性と活性化レセプタとの関係が注目されており、その
燐酸化誘導体が、ホルモンや成長因子の作用や、ＤＮＡ
及びＲＮＡウィルスによる細胞の形質転換に暗示（ｉｍ
ｐｌｉｃａｔｅｄ）されてきた（Ｗｈｉｔｍａｎ，Ｍ
ｅｔ ａｌ．１９８８； Ｃａｎｔｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ． １９９１参照）。
活性と活性化レセプタとの関係が注目されており、その
燐酸化誘導体が、ホルモンや成長因子の作用や、ＤＮＡ
及びＲＮＡウィルスによる細胞の形質転換に暗示（ｉｍ
ｐｌｉｃａｔｅｄ）されてきた（Ｗｈｉｔｍａｎ，Ｍ
ｅｔ ａｌ．１９８８； Ｃａｎｔｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ． １９９１参照）。
【０００７】ＰＩキナーゼは、複数種のものが存在する
ことが知られている。繊維芽細胞は少なくとも二つのＰ
Ｉキナーゼ活性を有し、これらはその界面活性剤に対す
る感度と運動特性とによって区別される（Ｗｈｉｔｍａ
ｎ，Ｍ ｅｔ ａｌ．１９８７）。即ち、タイプＩ（非
イオン界面活性剤によって抑制される）とタイプＩＩ
（非イオン界面活性剤によって刺激され、アデノシンに
よって抑制される）である。最近、ウシ属の脳内におい
て第三の別のタイプ（タイプＩＩＩ）が発見されている
が、その性質についてはまだよく判っていない（Ｅｎｄ
ｅｒｍａｎ，Ｇｅｔ ａｌ． １９８７）。プロテイン
チロシンキナーゼに会合する二次メッセンジャ系の探求
において、一つのタイプのＰＩキナーゼ活性が特に注目
されている。というのは、この活性が活性化した、血小
板から誘導された成長因子（ＰＤＧＦ）レセプタ（Ｋａ
ｐｌａｎ，Ｄ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７； Ｃｏｕ
ｇｈｌｉｎ， ＳＲ ｅｔ ａｌ．，１９８９）および
ポリオマミドルＴ抗原／ｐｐ６０c-src複合体（Ｗｈｉ
ｔｍａｎ，Ｍ ｅｔ ａｌ．１９８５）と免疫沈降する
ことが証明されたからである。この活性は、イノシトー
ルリングのＤ−３位置において燐酸化される新規なイノ
シトール脂質を生成するタイプＩのＰＩキナーゼによる
ものであることが証明された（Ｗｈｉｔｍａｎ， Ｍ．
ｅｔ ａｌ．，１９８８）。より最近では、この酵素
が、更に、ＣＳＦ−１レセプタ，ｋｉｔや（Ｖａｒｔｉ
ｃｏｖｓｋｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．，１９８９）、表
皮成長因子（ＥＧＦ）レセプタ（Ｂｊｏｒｇｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９０）や、ＰＤＧＦアルファ−レセプタ
（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１）や、インスリンレセ
プタ（Ｒｕｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、
肝細胞成長因子レセプタ、ｍｅｔ（Ｇｒａｚｉａｎｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９１）や、更に、活性化非−レセプ
タプロテイン−チロシンキナーゼ（Ｆｕｋｕｉ及びＨａ
ｎａｆｕｓａ，１９８９； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９０； Ｖａｒｔｉｃｏｖｓｋｉ ｅｔａｌ．，１
９９１）とも会合することが判った。
ことが知られている。繊維芽細胞は少なくとも二つのＰ
Ｉキナーゼ活性を有し、これらはその界面活性剤に対す
る感度と運動特性とによって区別される（Ｗｈｉｔｍａ
ｎ，Ｍ ｅｔ ａｌ．１９８７）。即ち、タイプＩ（非
イオン界面活性剤によって抑制される）とタイプＩＩ
（非イオン界面活性剤によって刺激され、アデノシンに
よって抑制される）である。最近、ウシ属の脳内におい
て第三の別のタイプ（タイプＩＩＩ）が発見されている
が、その性質についてはまだよく判っていない（Ｅｎｄ
ｅｒｍａｎ，Ｇｅｔ ａｌ． １９８７）。プロテイン
チロシンキナーゼに会合する二次メッセンジャ系の探求
において、一つのタイプのＰＩキナーゼ活性が特に注目
されている。というのは、この活性が活性化した、血小
板から誘導された成長因子（ＰＤＧＦ）レセプタ（Ｋａ
ｐｌａｎ，Ｄ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７； Ｃｏｕ
ｇｈｌｉｎ， ＳＲ ｅｔ ａｌ．，１９８９）および
ポリオマミドルＴ抗原／ｐｐ６０c-src複合体（Ｗｈｉ
ｔｍａｎ，Ｍ ｅｔ ａｌ．１９８５）と免疫沈降する
ことが証明されたからである。この活性は、イノシトー
ルリングのＤ−３位置において燐酸化される新規なイノ
シトール脂質を生成するタイプＩのＰＩキナーゼによる
ものであることが証明された（Ｗｈｉｔｍａｎ， Ｍ．
ｅｔ ａｌ．，１９８８）。より最近では、この酵素
が、更に、ＣＳＦ−１レセプタ，ｋｉｔや（Ｖａｒｔｉ
ｃｏｖｓｋｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．，１９８９）、表
皮成長因子（ＥＧＦ）レセプタ（Ｂｊｏｒｇｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９０）や、ＰＤＧＦアルファ−レセプタ
（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１）や、インスリンレセ
プタ（Ｒｕｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、
肝細胞成長因子レセプタ、ｍｅｔ（Ｇｒａｚｉａｎｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９１）や、更に、活性化非−レセプ
タプロテイン−チロシンキナーゼ（Ｆｕｋｕｉ及びＨａ
ｎａｆｕｓａ，１９８９； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９０； Ｖａｒｔｉｃｏｖｓｋｉ ｅｔａｌ．，１
９９１）とも会合することが判った。
【０００８】ＰＩ３−キナーゼ活性は、生体外及び生体
内の両方で、会合したプロテイン−チロシンキナーゼに
よってチロシン残留基上で燐酸化可能な免疫沈降物内に
おける８５ｋＤプロテインの存在と密接に関連づけられ
てきた（Ｋａｐｌａｎ，ＤＲｅｔ ａｌ．，１９８７；
Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，１９
８７； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。最
近、ウシの脳からのＰＩ３−キナーゼの６５０倍精製が
記載され、それは最高純粋調整物に存在する他のタンパ
ク質のうちでも、ＰＤＧＦ及びＥＧＦレセプタの生体外
基質であることが証明された８５ｋＤのタンパク質を含
有していた（モーガン・エス・ジェィ他１９９０（Ｍｏ
ｒｇａｎ，Ｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．１９９０））。このタ
ンパク質由来のトリプシンペプチドからの配列情報を使
用して、ｐ８５α及びＰ８５βと命名された２つの相同
のウシｐ８５タンパク質（Ｏｔｓｕ．Ｍ ｅｔ ａｌ．
１９９１）が最近クローン化されている。他の２つのグ
ループが別々に、異なる方法を用いてネズミ及びヒトｐ
８５α同族体をクローン化している（Ｅｓｃｏｂｅｄ
ｏ，ＪＡ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ； Ｓｋｏｌｎｉ
ｃｋ，Ｅ Ｙ ｅｔａｌ．，１９９１）。これら両方の
ｐ８５タンパク質は、生体外で燐酸化ＰＤＧＦレセプタ
と直接結合することが証明し得る（Ｏｔｓｕ． Ｍ ｅ
ｔ ａｌ．１９９１； Ｅｓｃｏｂｅｄｏ Ｊ Ａ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９１ｂ）。これらのタンパク質は、種
々の細胞系で発現する際にＰＩ３−キナーゼ活性のレセ
プタ結合サブユニットとして作用すると考えられてい
る。しかし、ｐ８５タンパク質に対して生成された抗体
を使用した、125Ｉ標識されたウシ脳ＰＩ３−キナーゼ
の免疫沈降は、８５ｋＤのタンパク質と共に分子量が１
１０ｋＤの第２のタンパク質を沈降させる（Ｏｔｓｕ
Ｍ． ｅｔ ａｌ．１９９１）。
内の両方で、会合したプロテイン−チロシンキナーゼに
よってチロシン残留基上で燐酸化可能な免疫沈降物内に
おける８５ｋＤプロテインの存在と密接に関連づけられ
てきた（Ｋａｐｌａｎ，ＤＲｅｔ ａｌ．，１９８７；
Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，１９
８７； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。最
近、ウシの脳からのＰＩ３−キナーゼの６５０倍精製が
記載され、それは最高純粋調整物に存在する他のタンパ
ク質のうちでも、ＰＤＧＦ及びＥＧＦレセプタの生体外
基質であることが証明された８５ｋＤのタンパク質を含
有していた（モーガン・エス・ジェィ他１９９０（Ｍｏ
ｒｇａｎ，Ｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．１９９０））。このタ
ンパク質由来のトリプシンペプチドからの配列情報を使
用して、ｐ８５α及びＰ８５βと命名された２つの相同
のウシｐ８５タンパク質（Ｏｔｓｕ．Ｍ ｅｔ ａｌ．
１９９１）が最近クローン化されている。他の２つのグ
ループが別々に、異なる方法を用いてネズミ及びヒトｐ
８５α同族体をクローン化している（Ｅｓｃｏｂｅｄ
ｏ，ＪＡ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ； Ｓｋｏｌｎｉ
ｃｋ，Ｅ Ｙ ｅｔａｌ．，１９９１）。これら両方の
ｐ８５タンパク質は、生体外で燐酸化ＰＤＧＦレセプタ
と直接結合することが証明し得る（Ｏｔｓｕ． Ｍ ｅ
ｔ ａｌ．１９９１； Ｅｓｃｏｂｅｄｏ Ｊ Ａ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９１ｂ）。これらのタンパク質は、種
々の細胞系で発現する際にＰＩ３−キナーゼ活性のレセ
プタ結合サブユニットとして作用すると考えられてい
る。しかし、ｐ８５タンパク質に対して生成された抗体
を使用した、125Ｉ標識されたウシ脳ＰＩ３−キナーゼ
の免疫沈降は、８５ｋＤのタンパク質と共に分子量が１
１０ｋＤの第２のタンパク質を沈降させる（Ｏｔｓｕ
Ｍ． ｅｔ ａｌ．１９９１）。
【０００９】ＰＩ３−キナーゼは、リガンド刺激、また
は細胞の形質転換の結果として活性化されるプロテイン
チロシンキナーゼと会合する、数が増大しつつある潜在
的シグナリングタンパク質の一つである。ＰＩ３−キナ
ーゼは、又、様々な種類のレセプタと直接的又は間接的
に関連する細胞間信号処理において重要な働きをしてい
る可能性があり、更に、いくつかの細胞内においては、
有糸分裂の原因となる現象における重要な規定能である
可能性もある（Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；
Ｖａｌｉｕｓ ａｎｄ Ｋａｚｌｕｕｓｋａｓ，１９
９３）。ＰＩ３−キナーゼは、ＰＩのイノシトールリン
グのＤ３位置及びその燐酸化誘導体を燐酸化し、ＰＩ
（３）Ｐ，ＰＩ（３，４）Ｐ２，及びＰＩ（３，４，
５）Ｐ３を生成する。鎮静状態の細胞が、血小板由来の
成長因子（ＰＤＧＦ）や表面性（ＥＧＦ）等のペプチド
成長因子によって刺激された時において、ＰＩ（３，
４）Ｐ２，及びＰＩ（３，４，５）Ｐ３のレベルの急激
な上昇が観察された。
は細胞の形質転換の結果として活性化されるプロテイン
チロシンキナーゼと会合する、数が増大しつつある潜在
的シグナリングタンパク質の一つである。ＰＩ３−キナ
ーゼは、又、様々な種類のレセプタと直接的又は間接的
に関連する細胞間信号処理において重要な働きをしてい
る可能性があり、更に、いくつかの細胞内においては、
有糸分裂の原因となる現象における重要な規定能である
可能性もある（Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；
Ｖａｌｉｕｓ ａｎｄ Ｋａｚｌｕｕｓｋａｓ，１９
９３）。ＰＩ３−キナーゼは、ＰＩのイノシトールリン
グのＤ３位置及びその燐酸化誘導体を燐酸化し、ＰＩ
（３）Ｐ，ＰＩ（３，４）Ｐ２，及びＰＩ（３，４，
５）Ｐ３を生成する。鎮静状態の細胞が、血小板由来の
成長因子（ＰＤＧＦ）や表面性（ＥＧＦ）等のペプチド
成長因子によって刺激された時において、ＰＩ（３，
４）Ｐ２，及びＰＩ（３，４，５）Ｐ３のレベルの急激
な上昇が観察された。
【００１０】上述の理由及びＰＩ３−キナーゼの潜在的
利用価値のために、ＰＩ３−キナーゼの主構造、即ち、
そのＰＩ３−キナーゼ活性、ｐ８５とｐ１１０サブユニ
ット間におけるサブユニット間相互作用、及びｐ１１０
サブユニットに内在すことが判っている新規なセリンキ
ナーゼ活性を調べるために実験を行った。ｐ８５及びｐ
１１０サブユニットの結合ドメインと、ｐ１１０サブユ
ニットの新規なプロテインセリンキナーゼ発生の発見
は、ＰＩ３−キナーゼ活性の調節の研究において大きな
可能性を有するものである。
利用価値のために、ＰＩ３−キナーゼの主構造、即ち、
そのＰＩ３−キナーゼ活性、ｐ８５とｐ１１０サブユニ
ット間におけるサブユニット間相互作用、及びｐ１１０
サブユニットに内在すことが判っている新規なセリンキ
ナーゼ活性を調べるために実験を行った。ｐ８５及びｐ
１１０サブユニットの結合ドメインと、ｐ１１０サブユ
ニットの新規なプロテインセリンキナーゼ発生の発見
は、ＰＩ３−キナーゼ活性の調節の研究において大きな
可能性を有するものである。
【００１１】ＰＩ３−キナーゼの主構造の確定は、その
信号変換プロセスにおける機能を理解する基本であっ
た。脳又は肝臓由来の精製ウシＰＩ３−キナーゼは、８
５及び１１０ｋＤａの異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍ
ｅｒ）である（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９９０； Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｍｏｒ
ｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９０； Ｓｈｉｂａｓａｋｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ｃＤＮＡクローン化によ
って、触媒活性を持たない、それぞれｐ８５α及びｐ８
５βと命名された二つの形状のｐ８５が記載されている
（Ｏｔｓｕ ｅｔａｌ．，１９９１）。ｐ８５の一次配
列の分析は、ｓｒｃ族のタンパク質の形質転換の研究の
最初に記載されている、多数の非触媒ドメインを有する
マルチドメイン構造を備えたタンパク質を示している。
そのＮ末端には、Ｓｒｃ相同領域３ドメイン（ＳＨ３）
が存在し（Ｐａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎ
ｇｅｒ，１９９３参照）、その隣には、ブレークポイン
トクラスタ領域遺伝子ＢＣＲの生成物に非常に類似した
配列を備えた領域が存在している（Ｏｔｓｕ ｅｔａ
ｌ．１９９１）。ＢＣＲタンパク質にはラスに対するＧ
ＡＰ活性を有しているので、ｐ８５のこの領域は、小さ
なＧＴＰ結合タンパク質と相互作用する可能性がある
（Ｆｒｙ１９９２参照）。前記分子のＣ末端側半分は、
二つのＳＨ２ドメインによって支配され（Ｐａｗｓｏｎ
ａｎｄ Ｇｉｓｈ，１９９２参照）、これらのドメイ
ンの間にはらせん状配座を有することが予測された領域
が存在する（Ｐａｎａｙｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．１９９
２）。これらの互いに異なった作用ドメインが存在する
ことは、ｐ８５タンパク質が多重の相互作用的及び調節
的機能を有していることを示唆している。ｐ８５のモジ
ュラ構造によって、このタンパク質の構造の研究と作用
の研究との両方が容易になり、これによって、そのＰＩ
３−キナーゼ複合体における機能に関する我々の理解が
急速に進んだ。
信号変換プロセスにおける機能を理解する基本であっ
た。脳又は肝臓由来の精製ウシＰＩ３−キナーゼは、８
５及び１１０ｋＤａの異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍ
ｅｒ）である（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９９０； Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｍｏｒ
ｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９０； Ｓｈｉｂａｓａｋｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ｃＤＮＡクローン化によ
って、触媒活性を持たない、それぞれｐ８５α及びｐ８
５βと命名された二つの形状のｐ８５が記載されている
（Ｏｔｓｕ ｅｔａｌ．，１９９１）。ｐ８５の一次配
列の分析は、ｓｒｃ族のタンパク質の形質転換の研究の
最初に記載されている、多数の非触媒ドメインを有する
マルチドメイン構造を備えたタンパク質を示している。
そのＮ末端には、Ｓｒｃ相同領域３ドメイン（ＳＨ３）
が存在し（Ｐａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎ
ｇｅｒ，１９９３参照）、その隣には、ブレークポイン
トクラスタ領域遺伝子ＢＣＲの生成物に非常に類似した
配列を備えた領域が存在している（Ｏｔｓｕ ｅｔａ
ｌ．１９９１）。ＢＣＲタンパク質にはラスに対するＧ
ＡＰ活性を有しているので、ｐ８５のこの領域は、小さ
なＧＴＰ結合タンパク質と相互作用する可能性がある
（Ｆｒｙ１９９２参照）。前記分子のＣ末端側半分は、
二つのＳＨ２ドメインによって支配され（Ｐａｗｓｏｎ
ａｎｄ Ｇｉｓｈ，１９９２参照）、これらのドメイ
ンの間にはらせん状配座を有することが予測された領域
が存在する（Ｐａｎａｙｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．１９９
２）。これらの互いに異なった作用ドメインが存在する
ことは、ｐ８５タンパク質が多重の相互作用的及び調節
的機能を有していることを示唆している。ｐ８５のモジ
ュラ構造によって、このタンパク質の構造の研究と作用
の研究との両方が容易になり、これによって、そのＰＩ
３−キナーゼ複合体における機能に関する我々の理解が
急速に進んだ。
【００１２】最近までｐ１１０タンパク質に関しては、
ほとんどなにも知られていなかった。今日までただ一つ
の形状のｐ１１０タンパク質しかクローン化されておら
ず、その発現研究によれば、これのみでタンパク質にＰ
Ｉ３−キナーゼ活性をエンコードすることが可能である
ことが明らかである。この働きはＨｉｌｅｓ ｅｔａ
ｌ．１９９２に記載されており、この文献の内容全体を
参考資料とする。クローン化されたｐ１１０は、空胞化
タンパク質分類に関係するイーストＰＩ３−キナーゼ、
Ｖｐｓ３４ｐと相同である（Ｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｅ
ｍｒ，１９９０； Ｓｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９
３）。ｐ１１０の配列分析によれば、Ｖｐｓ３４ｐとの
余剰キナーゼのモチーフ及び配列比較が明らかとなり、
更に最近になってクローン化されたＴｏｒ２、即ち、Ｇ
Ｉ進行に必要であるもう一つの推測イーストＰＩ３−キ
ナーゼ相同体によって、触媒ドメインを、タンパク質の
Ｃ末端領域に指定することが可能となった（Ｈｉｌｅｓ
ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ｐ１１０のＮ末端領域の
配列分析によれば、如何なる周知のタンパク質に対して
も大きな相同性が認められず、この領域は調節的機能を
果たしている可能性がある。
ほとんどなにも知られていなかった。今日までただ一つ
の形状のｐ１１０タンパク質しかクローン化されておら
ず、その発現研究によれば、これのみでタンパク質にＰ
Ｉ３−キナーゼ活性をエンコードすることが可能である
ことが明らかである。この働きはＨｉｌｅｓ ｅｔａ
ｌ．１９９２に記載されており、この文献の内容全体を
参考資料とする。クローン化されたｐ１１０は、空胞化
タンパク質分類に関係するイーストＰＩ３−キナーゼ、
Ｖｐｓ３４ｐと相同である（Ｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｅ
ｍｒ，１９９０； Ｓｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９
３）。ｐ１１０の配列分析によれば、Ｖｐｓ３４ｐとの
余剰キナーゼのモチーフ及び配列比較が明らかとなり、
更に最近になってクローン化されたＴｏｒ２、即ち、Ｇ
Ｉ進行に必要であるもう一つの推測イーストＰＩ３−キ
ナーゼ相同体によって、触媒ドメインを、タンパク質の
Ｃ末端領域に指定することが可能となった（Ｈｉｌｅｓ
ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ｐ１１０のＮ末端領域の
配列分析によれば、如何なる周知のタンパク質に対して
も大きな相同性が認められず、この領域は調節的機能を
果たしている可能性がある。
【００１３】ＰＩ３−キナーゼは、例えば、ＰＩ３−キ
ナーゼの最終的に基質へのアクセスを備えた細胞膜への
トランスロケーションや、それに続く、タンパク質チロ
シンキナーゼ（ＰＴＫｓ）との会合及びそれによる燐酸
化等の一連の事象によって調節されている可能性がある
（Ｐａｎａｙｏｔｏ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｉｅｌｄ，１
９９２）。ＰＩ３−キナーゼがそのＳＨ２ドメインを介
してＰＴＫｓのホスホチロシン含有配列と結合すること
によって、独立的に、ある程度の酵素の活性を生じさせ
ることができる。インシュリンレセプタ基質上の潜在的
ＰＩ３−キナーゼ位置に対応するチロシン燐酸化ペプチ
ド、ＩＲＳ−１あるいは、非損傷ＩＲＳ−１タンパク質
が生体内においてＰＩ３−キナーゼを活性化することが
証明された（Ｂａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；
Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。同
様に、公知の生体内結合位置である前記ＰＤＧＦＢレセ
プタのＹ751に対応するホスホチロシン−含有ペプチド
の追加は、更に、生体外のＰＩ３−キナーゼ活性をも生
じさせる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９
３）。更に、このＹ751−ホスホペプチドの結合の直後
において、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブユニットと、
特にそのＮ末端ＳＨ２ドメインが配座変化を受けること
が示された（Ｐａｎａｙｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９
９２）。ｐ８５タンパク質におけるこの誘発された配座
変化は、会合ｐ１１０サブユニットに伝達され、従って
その活性化に貢献する可能性がある。
ナーゼの最終的に基質へのアクセスを備えた細胞膜への
トランスロケーションや、それに続く、タンパク質チロ
シンキナーゼ（ＰＴＫｓ）との会合及びそれによる燐酸
化等の一連の事象によって調節されている可能性がある
（Ｐａｎａｙｏｔｏ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｉｅｌｄ，１
９９２）。ＰＩ３−キナーゼがそのＳＨ２ドメインを介
してＰＴＫｓのホスホチロシン含有配列と結合すること
によって、独立的に、ある程度の酵素の活性を生じさせ
ることができる。インシュリンレセプタ基質上の潜在的
ＰＩ３−キナーゼ位置に対応するチロシン燐酸化ペプチ
ド、ＩＲＳ−１あるいは、非損傷ＩＲＳ−１タンパク質
が生体内においてＰＩ３−キナーゼを活性化することが
証明された（Ｂａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；
Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。同
様に、公知の生体内結合位置である前記ＰＤＧＦＢレセ
プタのＹ751に対応するホスホチロシン−含有ペプチド
の追加は、更に、生体外のＰＩ３−キナーゼ活性をも生
じさせる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９
３）。更に、このＹ751−ホスホペプチドの結合の直後
において、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブユニットと、
特にそのＮ末端ＳＨ２ドメインが配座変化を受けること
が示された（Ｐａｎａｙｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９
９２）。ｐ８５タンパク質におけるこの誘発された配座
変化は、会合ｐ１１０サブユニットに伝達され、従って
その活性化に貢献する可能性がある。
【００１４】ｐ８５はそのＳＨ２ドメインを介してレセ
プタと結合するので、酵素を基質へのアクセスを備えた
膜に位置移動させたり、あるいは、ｐ１１０サブユニッ
トに固有のＰＩ３−キナーゼ活動の活性化をもたらす前
記サブユニット間の相互作用によって、会合触媒サブユ
ニットに固有の酵素活性を調節することが可能である。
ＰＴＫｓへの結合によってｐ８５タンパク質に誘発さ
れ、次に会合触媒ドメインに伝達されてその活性化を生
じさせる変化を提供するもう一つ別のメカニズムが存在
する。このような変化は、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サ
ブユニット、特に、そのＮ末端ＳＨ２ドメインが、新規
なＰＩ３−キナーゼの結合位置である、ＰＤＧＦ Ｂ−
レセプタのＹ751に対応するホスホチロシン含有ペプチ
ドに結合する時に検出された（Ｐａｎａｙｏｔｏｕ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２）。
プタと結合するので、酵素を基質へのアクセスを備えた
膜に位置移動させたり、あるいは、ｐ１１０サブユニッ
トに固有のＰＩ３−キナーゼ活動の活性化をもたらす前
記サブユニット間の相互作用によって、会合触媒サブユ
ニットに固有の酵素活性を調節することが可能である。
ＰＴＫｓへの結合によってｐ８５タンパク質に誘発さ
れ、次に会合触媒ドメインに伝達されてその活性化を生
じさせる変化を提供するもう一つ別のメカニズムが存在
する。このような変化は、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サ
ブユニット、特に、そのＮ末端ＳＨ２ドメインが、新規
なＰＩ３−キナーゼの結合位置である、ＰＤＧＦ Ｂ−
レセプタのＹ751に対応するホスホチロシン含有ペプチ
ドに結合する時に検出された（Ｐａｎａｙｏｔｏｕ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２）。
【００１５】更に、ｐ８５又はｐ１１０サブユニット、
例えばチロシン、セリンまたはトレオニン残基における
燐酸化によってキナーゼ活性を調節できることが発見さ
れた。酵素をホスホチロシルプロテインホスファターゼ
によって処理した後においてＰＩ３−キナーゼ活性が減
少するという報告は、活性化ＰＴＫによってＰＩ３−キ
ナーゼをチロシン燐酸化することによってＰＩ３−キナ
ーゼ活性を増加させることが可能であるという考えに一
致している（Ｒｕｉｚ−Ｌａｒｒｅａ ｅｔａｌ．，１
９９３）。
例えばチロシン、セリンまたはトレオニン残基における
燐酸化によってキナーゼ活性を調節できることが発見さ
れた。酵素をホスホチロシルプロテインホスファターゼ
によって処理した後においてＰＩ３−キナーゼ活性が減
少するという報告は、活性化ＰＴＫによってＰＩ３−キ
ナーゼをチロシン燐酸化することによってＰＩ３−キナ
ーゼ活性を増加させることが可能であるという考えに一
致している（Ｒｕｉｚ−Ｌａｒｒｅａ ｅｔａｌ．，１
９９３）。
【００１６】ＰＩ３−キナーゼ複合体の成分のセリン及
びトレオニン燐酸化は、酵素を調節する機能をも有して
いる可能性がある。というのは、鎮静状態の細胞から免
疫沈降されたＰＩ３−キナーゼのｐ８５αサブユニット
が、セリン及びトレオニン残基において燐酸化されるこ
とが複数の研究によって示されたからである（Ｋａｐｌ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｒｏｃｈｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９３）。ＰＩ３−キナーゼの精製されたウシ
脳調剤が、会合タンパク質セリンキナーゼと共同精製
（ｃｏｐｕｒｉｆｙ）することが示され、更に、Ｃａｒ
ｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３の最近の報告は、
ＰＩＫキナーゼと称される類似の活性が、ラットの肝臓
ＰＩ３−キナーゼと共同精製し、それを調節する可能性
があることを示した。
びトレオニン燐酸化は、酵素を調節する機能をも有して
いる可能性がある。というのは、鎮静状態の細胞から免
疫沈降されたＰＩ３−キナーゼのｐ８５αサブユニット
が、セリン及びトレオニン残基において燐酸化されるこ
とが複数の研究によって示されたからである（Ｋａｐｌ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｒｏｃｈｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９３）。ＰＩ３−キナーゼの精製されたウシ
脳調剤が、会合タンパク質セリンキナーゼと共同精製
（ｃｏｐｕｒｉｆｙ）することが示され、更に、Ｃａｒ
ｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３の最近の報告は、
ＰＩＫキナーゼと称される類似の活性が、ラットの肝臓
ＰＩ３−キナーゼと共同精製し、それを調節する可能性
があることを示した。
【００１７】会合タンパク質−セリンキナーゼの性質お
よびＰＩ３−キナーゼの調節におけるその推定される役
割を明らかにするために、いくつかの実験が行われた。
具体的には、単体又は複合体としての、野生型及び突然
変異体の組換え型ＰＩ３−キナーゼのサブユニットは、
ｐ８５タンパク質に対する変異性を備えた、ＰＩ３−キ
ナーゼの内在的ホスホイノシタイド（ｐｈｏｓｐｈｏｉ
ｎｏｓｉｔｉｄｅ）キナーゼ活性とタンパク質−セリン
キナーゼ活性の両方を有していることを示す。更に、燐
酸化の高い化学量論数によって、ｐ８５タンパク質にお
いて一つのセリン燐酸化位置が設定される。ＰＩ３−キ
ナーゼと会合したタンパク質セリンキナーゼ活性の操作
によって、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制する方法をここ
に提供する。会合タンパク質セリンキナーゼ活性の作用
物質及びアンタゴニストも提供される。ＰＩ３−キナー
ゼ活性を調節する手段を提供する、調節性ｐ８５サブユ
ニットとｐ１１０触媒ドメインとの間の相互作用を操作
する方法が開発された。
よびＰＩ３−キナーゼの調節におけるその推定される役
割を明らかにするために、いくつかの実験が行われた。
具体的には、単体又は複合体としての、野生型及び突然
変異体の組換え型ＰＩ３−キナーゼのサブユニットは、
ｐ８５タンパク質に対する変異性を備えた、ＰＩ３−キ
ナーゼの内在的ホスホイノシタイド（ｐｈｏｓｐｈｏｉ
ｎｏｓｉｔｉｄｅ）キナーゼ活性とタンパク質−セリン
キナーゼ活性の両方を有していることを示す。更に、燐
酸化の高い化学量論数によって、ｐ８５タンパク質にお
いて一つのセリン燐酸化位置が設定される。ＰＩ３−キ
ナーゼと会合したタンパク質セリンキナーゼ活性の操作
によって、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制する方法をここ
に提供する。会合タンパク質セリンキナーゼ活性の作用
物質及びアンタゴニストも提供される。ＰＩ３−キナー
ゼ活性を調節する手段を提供する、調節性ｐ８５サブユ
ニットとｐ１１０触媒ドメインとの間の相互作用を操作
する方法が開発された。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主要課題の一
つは、ｐ８５サブユニットとｐ１１０サブユニットとの
間の相互作用を操作してＰＩ３−キナーゼ活性を調節す
る方法を提供することにある。具体的には、ｐ８５及び
ｐ１１０サブユニット間の会合または結合を阻止するこ
とが、下流側の信号形質導入経路を調節する手段とな
る。その結合位置を明らかにすることは、この相互作用
のインヒビタ、即ち、アンタゴニストの分析にも役立
つ。本発明は、ｐ８５及びｐ１１０サブユニット間の相
互作用を妨げるアンタゴニストをも提供する。これらの
アンタゴニストは、通常、ｐ１１０サブユニットとの結
合を阻止するｐ８５サブユニットの臨界領域と結合、相
互反応または会合する。これらのアンタゴニストを使用
することにより、ｐ８５及びｐ１１０サブユニット間の
相互作用が阻止され、更に、触媒活性が減少する。更
に、これらのアンタゴニストは、拮坑的結合分析による
ＰＩ３−キナーゼのサブユニットの存在検出にも利用可
能である。
つは、ｐ８５サブユニットとｐ１１０サブユニットとの
間の相互作用を操作してＰＩ３−キナーゼ活性を調節す
る方法を提供することにある。具体的には、ｐ８５及び
ｐ１１０サブユニット間の会合または結合を阻止するこ
とが、下流側の信号形質導入経路を調節する手段とな
る。その結合位置を明らかにすることは、この相互作用
のインヒビタ、即ち、アンタゴニストの分析にも役立
つ。本発明は、ｐ８５及びｐ１１０サブユニット間の相
互作用を妨げるアンタゴニストをも提供する。これらの
アンタゴニストは、通常、ｐ１１０サブユニットとの結
合を阻止するｐ８５サブユニットの臨界領域と結合、相
互反応または会合する。これらのアンタゴニストを使用
することにより、ｐ８５及びｐ１１０サブユニット間の
相互作用が阻止され、更に、触媒活性が減少する。更
に、これらのアンタゴニストは、拮坑的結合分析による
ＰＩ３−キナーゼのサブユニットの存在検出にも利用可
能である。
【００１９】本発明のもう一つの課題は、核酸分子を含
有する発現ベクターを提供する。前記アンタゴニストの
ためのそのコードが、ここに開示される。本発明の更に
別の課題は、上記発現ベクターとトランスフェクション
されるホスト細胞を提供することである。
有する発現ベクターを提供する。前記アンタゴニストの
ためのそのコードが、ここに開示される。本発明の更に
別の課題は、上記発現ベクターとトランスフェクション
されるホスト細胞を提供することである。
【００２０】本発明は、更に、ｐ１１０サブユニットが
その基質、即ちｐ８５サブユニットと高い親和力で結合
する場合にのみ検出可能な新規な内在性タンパク質−セ
リンキナーゼ活性を操作することによって、ＰＩ３−キ
ナーゼ活性を抑制する方法をも提供する。不十分なＰＩ
３−キナーゼ活性によって特徴付けられる病状に苦しむ
患者を治療する薬剤は、ＰＩ３−キナーゼ活性を増加さ
せるためにアゴニストを含有する薬用構成物を含む。
その基質、即ちｐ８５サブユニットと高い親和力で結合
する場合にのみ検出可能な新規な内在性タンパク質−セ
リンキナーゼ活性を操作することによって、ＰＩ３−キ
ナーゼ活性を抑制する方法をも提供する。不十分なＰＩ
３−キナーゼ活性によって特徴付けられる病状に苦しむ
患者を治療する薬剤は、ＰＩ３−キナーゼ活性を増加さ
せるためにアゴニストを含有する薬用構成物を含む。
【００２１】
【課題を解決するための手段】上記課題を達成するた
め、本発明にかかるセリンキナーゼ活性の抑制方法の特
徴構成は、ＰＩ３−キナーゼ酵素のセリンキナーゼ能力
を抑制する方法であって、ＰＩ３−キナーゼのＤＲＨＮ
ＳＮ配列を無効化する工程を有する点にある。
め、本発明にかかるセリンキナーゼ活性の抑制方法の特
徴構成は、ＰＩ３−キナーゼ酵素のセリンキナーゼ能力
を抑制する方法であって、ＰＩ３−キナーゼのＤＲＨＮ
ＳＮ配列を無効化する工程を有する点にある。
【００２２】前記配列が標的変異によって、もしくはセ
リンキナーゼ作用を抑制する分子との相互作用によって
無効化されるものであることが好ましい。
リンキナーゼ作用を抑制する分子との相互作用によって
無効化されるものであることが好ましい。
【００２３】前記分子が、前記ＰＩ３−キナーゼ酵素の
主要サブユニットの前記ＤＲＨＮＳＮ配列に特定的に結
合する抗体、もしくは前記ＤＲＨＮＳＮ配列に特定的に
結合するモノクローナル抗体であると都合がよい。
主要サブユニットの前記ＤＲＨＮＳＮ配列に特定的に結
合する抗体、もしくは前記ＤＲＨＮＳＮ配列に特定的に
結合するモノクローナル抗体であると都合がよい。
【００２４】本発明にかかるＰＩ３−キナーゼのサブユ
ニット間の結合活性の調整方法の特徴構成は、ＰＩ３−
キナーゼのｐ８５サブユニットとｐ１１０サブユニット
との間の結合を抑制する方法であって、前記ＰＩ３−キ
ナーゼのｐ８５サブユニットのＳＨ２間領域を無効化す
る工程を有する点にある。
ニット間の結合活性の調整方法の特徴構成は、ＰＩ３−
キナーゼのｐ８５サブユニットとｐ１１０サブユニット
との間の結合を抑制する方法であって、前記ＰＩ３−キ
ナーゼのｐ８５サブユニットのＳＨ２間領域を無効化す
る工程を有する点にある。
【００２５】前記ＰＩ３−キナーゼのｐ８５βサブユニ
ットのアミノ酸残基４４５〜アミノ酸残基４８５を有す
る領域を無効化する工程を有するか、もしくは前記ＰＩ
３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのアミノ酸残基４
７８〜アミノ酸残基５１３を有する領域を無効化する工
程を有することが好ましい。
ットのアミノ酸残基４４５〜アミノ酸残基４８５を有す
る領域を無効化する工程を有するか、もしくは前記ＰＩ
３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのアミノ酸残基４
７８〜アミノ酸残基５１３を有する領域を無効化する工
程を有することが好ましい。
【００２６】本発明にかかるアンタゴニストの特徴構成
は、ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットに結合するリ
ガンドのための分離アンタゴニストであって、このアン
タゴニストが、前記ｐ８５サブユニットに結合すること
によってセリンである位置６０８に於ける燐酸化が阻止
され、これによってＰＩ３−キナーゼ活性が減少すると
共に、前記アンタゴニストが無効化されたＤＲＨＮＳＮ
配列に対応するアミノ酸配列を有する点にある。
は、ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットに結合するリ
ガンドのための分離アンタゴニストであって、このアン
タゴニストが、前記ｐ８５サブユニットに結合すること
によってセリンである位置６０８に於ける燐酸化が阻止
され、これによってＰＩ３−キナーゼ活性が減少すると
共に、前記アンタゴニストが無効化されたＤＲＨＮＳＮ
配列に対応するアミノ酸配列を有する点にある。
【００２７】本発明にかかるＰＩ３−キナーゼのサブユ
ニット結合抗体の特徴構成は、ｐ８５サブユニットのＳ
Ｈ２間領域に位置するエピトープにおいてＰＩ３−キナ
ーゼの前記ｐ８５サブユニットに特定的に結合する分離
抗体であって、この抗体は、前記ＰＩ３−キナーゼの前
記ｐ８５サブユニットとｐ１１０サブユニットとの間の
結合に干渉する点にある。
ニット結合抗体の特徴構成は、ｐ８５サブユニットのＳ
Ｈ２間領域に位置するエピトープにおいてＰＩ３−キナ
ーゼの前記ｐ８５サブユニットに特定的に結合する分離
抗体であって、この抗体は、前記ＰＩ３−キナーゼの前
記ｐ８５サブユニットとｐ１１０サブユニットとの間の
結合に干渉する点にある。
【００２８】前記抗体は、少なくとも前記ＰＩ３−キナ
ーゼの前記ｐ８５βサブユニットのアミノ酸残基４４５
〜アミノ酸残基４８５を有するエピトープに特定的に結
合すること、もしくは少なくとも前記ＰＩ３−キナーゼ
の前記ｐ８５αサブユニットのアミノ酸残基４７８〜ア
ミノ酸残基５１３を有するエピトープに特定的に結合す
るが好ましい。
ーゼの前記ｐ８５βサブユニットのアミノ酸残基４４５
〜アミノ酸残基４８５を有するエピトープに特定的に結
合すること、もしくは少なくとも前記ＰＩ３−キナーゼ
の前記ｐ８５αサブユニットのアミノ酸残基４７８〜ア
ミノ酸残基５１３を有するエピトープに特定的に結合す
るが好ましい。
【００２９】更に、前記抗体がモノクローナル抗体であ
ると都合がよい。
ると都合がよい。
【００３０】本発明にかかるハイブリドーマ細胞系の特
徴構成は、請求項１０の抗体を生成ものである点ある。
徴構成は、請求項１０の抗体を生成ものである点ある。
【００３１】本発明の核酸分子の特徴構成は、ＰＩ３−
キナーゼのｐ８５サブユニットのＳＨ２間領域へ遺伝暗
号を指定する核酸分子に対合し、その発現を抑制する分
離核酸分子である点にある。
キナーゼのｐ８５サブユニットのＳＨ２間領域へ遺伝暗
号を指定する核酸分子に対合し、その発現を抑制する分
離核酸分子である点にある。
【００３２】前記分離核酸分子が、前記ＰＩ３−キナー
ゼのｐ８５βサブユニットのアミノ酸残基４４５〜アミ
ノ酸残基４８５を有する領域に遺伝暗号を指定するこ
と、もしくは前記ＰＩ３−キナーゼのｐ８５αサブユニ
ットのアミノ酸残基４７８〜アミノ酸残基５１３を有す
る領域に遺伝暗号を指定することが好ましい。
ゼのｐ８５βサブユニットのアミノ酸残基４４５〜アミ
ノ酸残基４８５を有する領域に遺伝暗号を指定するこ
と、もしくは前記ＰＩ３−キナーゼのｐ８５αサブユニ
ットのアミノ酸残基４７８〜アミノ酸残基５１３を有す
る領域に遺伝暗号を指定することが好ましい。
【００３３】更に、本発明にかかるＰＩ３−キナーゼの
サブユニット間の結合活性の調整方法は、ＰＩ３−キナ
ーゼのｐ８５サブユニット及びｐ１１０サブユニット間
の結合を抑制する方法であって、ｐ８５を含有するサン
プルを請求項１０の抗体に接触させる工程を有する点に
ある。
サブユニット間の結合活性の調整方法は、ＰＩ３−キナ
ーゼのｐ８５サブユニット及びｐ１１０サブユニット間
の結合を抑制する方法であって、ｐ８５を含有するサン
プルを請求項１０の抗体に接触させる工程を有する点に
ある。
【００３４】更に、本発明にかかるセリンキナーゼ活性
の抑制方法の特徴構成は、ＰＩ３−キナーゼ酵素のセリ
ンキナーゼ活性を抑制する方法であって、前記ＰＩ３−
キナーゼのｐ８５サブユニットの位置６０８においてセ
リン残基を無効化、又はこれに干渉する工程を有する点
にある。
の抑制方法の特徴構成は、ＰＩ３−キナーゼ酵素のセリ
ンキナーゼ活性を抑制する方法であって、前記ＰＩ３−
キナーゼのｐ８５サブユニットの位置６０８においてセ
リン残基を無効化、又はこれに干渉する工程を有する点
にある。
【００３５】前記セリンキナーゼ活性の抑制方法は、前
記セリン残基が標的変異によって無効化されると都合が
よい。
記セリン残基が標的変異によって無効化されると都合が
よい。
【００３６】本発明にかかるアゴニストの特徴構成は、
ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットに結合するリガン
ドのための分離アゴニストであって、前記アゴニストが
前記ｐ８５サブユニットに結合することによってセリン
であるアミノ酸残基位置６０８に於ける燐酸化が刺激さ
れ、これによって前記ＰＩ３−キナーゼのキリンキナー
ゼ活性が増加し、前記アゴニストが、少なくとも、前記
ＰＩ３−キナーゼ活性を示す前記ＰＩ３−キナーゼの前
記ｐ１１０サブユニットの領域に対応するＰＩ３−キナ
ーゼ触媒活性を備えたドメインを有する点にある。
ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットに結合するリガン
ドのための分離アゴニストであって、前記アゴニストが
前記ｐ８５サブユニットに結合することによってセリン
であるアミノ酸残基位置６０８に於ける燐酸化が刺激さ
れ、これによって前記ＰＩ３−キナーゼのキリンキナー
ゼ活性が増加し、前記アゴニストが、少なくとも、前記
ＰＩ３−キナーゼ活性を示す前記ＰＩ３−キナーゼの前
記ｐ１１０サブユニットの領域に対応するＰＩ３−キナ
ーゼ触媒活性を備えたドメインを有する点にある。
【００３７】本発明の核酸分子の特徴構成は、前記アゴ
ニストに遺伝暗号を指定する分離核酸分子である点にあ
る。
ニストに遺伝暗号を指定する分離核酸分子である点にあ
る。
【００３８】本発明のプラスミドの特徴構成は、前記核
酸分子を含有する点にある。
酸分子を含有する点にある。
【００３９】本発明の細胞系の特徴構成は、請求項２２
の核酸分子にトランスフェクションした細胞系であっ
て、前記核酸分子によってエンコードされたタンパク質
を発現する点にある。
の核酸分子にトランスフェクションした細胞系であっ
て、前記核酸分子によってエンコードされたタンパク質
を発現する点にある。
【００４０】前記細胞系が、請求項２３のプラスミドに
トランスフェクションした細胞系であって、前記核酸分
子によってエンコードされたタンパク質を発現するも
の、もしくは真核細胞系であってもよい。
トランスフェクションした細胞系であって、前記核酸分
子によってエンコードされたタンパク質を発現するも
の、もしくは真核細胞系であってもよい。
【００４１】本発明にかかるＰＩ３−キナーゼ活性を抑
制するサブユニット結合分子の特徴構成は、ＰＩ３キナ
ーゼのｐ８５サブユニットに結合する分子であって、こ
の分子が前記サブユニットに結合することによりセリン
である位置６０８における、事前の燐酸化が保護され、
これによってＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するものであ
る点にある。
制するサブユニット結合分子の特徴構成は、ＰＩ３キナ
ーゼのｐ８５サブユニットに結合する分子であって、こ
の分子が前記サブユニットに結合することによりセリン
である位置６０８における、事前の燐酸化が保護され、
これによってＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するものであ
る点にある。
【００４２】前記分子が抗体であり、前記抗体がモノク
ローナル抗体であることが好ましい。そして、本発明の
ハイブリドーマ細胞系の特徴構成は、請求項２９のモノ
クローナル抗体を生成する点にある。
ローナル抗体であることが好ましい。そして、本発明の
ハイブリドーマ細胞系の特徴構成は、請求項２９のモノ
クローナル抗体を生成する点にある。
【００４３】本発明にかかるサブユニットの存在検出方
法の特徴構成は、サンプル中におけるｐ８５サブユニッ
トの存在検出方法であって、以下の工程を有する点にあ
る。即ち、 ａ）請求項２１のアゴニストを有する前記サンプルを、
前記分離アゴニストと特定的に結合可能な既知量の前記
ｐ８５サブユニットと接触させる工程、 ｂ）前記アゴニストの前記既知量のｐ８５サブユニット
との結合の競合的抑制を、前記サンプル中におけるｐ８
５サブユニットの存在を示すものとして検出する工程。
法の特徴構成は、サンプル中におけるｐ８５サブユニッ
トの存在検出方法であって、以下の工程を有する点にあ
る。即ち、 ａ）請求項２１のアゴニストを有する前記サンプルを、
前記分離アゴニストと特定的に結合可能な既知量の前記
ｐ８５サブユニットと接触させる工程、 ｂ）前記アゴニストの前記既知量のｐ８５サブユニット
との結合の競合的抑制を、前記サンプル中におけるｐ８
５サブユニットの存在を示すものとして検出する工程。
【００４４】本発明にかかるＰＩ３−キナーゼ活性の抑
制剤製造方法の特徴構成は、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑
制するための薬剤を製造する方法であって、ＰＩ３−キ
ナーゼ酵素のＤＲＨＮＳＮ配列に結合、又はこれに干渉
することが可能な物質を選択し、この物質を医療用に調
合する工程を有する点にある。
制剤製造方法の特徴構成は、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑
制するための薬剤を製造する方法であって、ＰＩ３−キ
ナーゼ酵素のＤＲＨＮＳＮ配列に結合、又はこれに干渉
することが可能な物質を選択し、この物質を医療用に調
合する工程を有する点にある。
【００４５】更に、本発明にかかるＰＩ３−キナーゼ活
性の抑制剤の特徴構成は、不十分なＰＩ３−キナーゼ活
性によって特徴付けられる病状を有する患者を治療する
薬剤であって、それを必要とする患者に、ＰＩ３−キナ
ーゼ活性を増加させる作用を有する請求項２１に記載の
アゴニストを有する点にある。
性の抑制剤の特徴構成は、不十分なＰＩ３−キナーゼ活
性によって特徴付けられる病状を有する患者を治療する
薬剤であって、それを必要とする患者に、ＰＩ３−キナ
ーゼ活性を増加させる作用を有する請求項２１に記載の
アゴニストを有する点にある。
【００４６】
【作用】本発明は、前記ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブ
ユニットとｐ１１０サブユニットとの結合を抑制する方
法に関する。この発明は、ＰＩ３−キナーゼ活性を調節
し、更に細胞の外部刺激に対する反応を調節する方法を
提供するものである。即ち、ｐ８５サブユニットのＳＨ
２間ドメイン、詳しくは、ＰＩ３−キナーゼの、ｐ８５
αサブユニットのアミノ酸残基４７８からアミノ酸残基
５４３を含む領域に位置する残基と、ｐ８５βサブユニ
ットのアミノ酸残基４４５〜４８５残基を、従来手段に
よって無効化することによって、セリンキナーゼ活性を
減少させる。アンタゴニスト分子としてこれらの結合領
域に干渉することによって、更に、前記両サブユニット
間の結合に影響を与え、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制す
る。特に、前記臨界領域に結合する抗体は、前記両サブ
ユニット間の結合に干渉することが可能である。
ユニットとｐ１１０サブユニットとの結合を抑制する方
法に関する。この発明は、ＰＩ３−キナーゼ活性を調節
し、更に細胞の外部刺激に対する反応を調節する方法を
提供するものである。即ち、ｐ８５サブユニットのＳＨ
２間ドメイン、詳しくは、ＰＩ３−キナーゼの、ｐ８５
αサブユニットのアミノ酸残基４７８からアミノ酸残基
５４３を含む領域に位置する残基と、ｐ８５βサブユニ
ットのアミノ酸残基４４５〜４８５残基を、従来手段に
よって無効化することによって、セリンキナーゼ活性を
減少させる。アンタゴニスト分子としてこれらの結合領
域に干渉することによって、更に、前記両サブユニット
間の結合に影響を与え、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制す
る。特に、前記臨界領域に結合する抗体は、前記両サブ
ユニット間の結合に干渉することが可能である。
【００４７】サブユニット間結合領域及び会合ＰＩ３−
キナーゼ及びセリンキナーゼ活性に関する上述の発明に
基づき、前述の活性を抑制又は増強する作用を有する、
本発明のアンタゴニスト及びアゴニスト分子を生成、使
用して、ＰＩ３−キナーゼ活性の効果を模倣する（アゴ
ニスト）ことによって、あるいは両サブユニット間の相
互作用を阻止する（アンタゴニスト）ことによって、上
述したｐ８５及びｐ１１０サブユニット間の相互作用を
研究することが可能である。アンタゴニスト分子は、前
述したように、一つのサブユニット、即ち、ｐ８５、と
の接触時に、サブユニットｐ１１０との相互作用を阻止
する特定結合領域を対象とする抗体として構成すること
が出来る。これらの抗体は、従来の方法によってハイブ
リドーマ細胞系を生成することによって作られるモノク
ローナル抗体とすることが可能である。
キナーゼ及びセリンキナーゼ活性に関する上述の発明に
基づき、前述の活性を抑制又は増強する作用を有する、
本発明のアンタゴニスト及びアゴニスト分子を生成、使
用して、ＰＩ３−キナーゼ活性の効果を模倣する（アゴ
ニスト）ことによって、あるいは両サブユニット間の相
互作用を阻止する（アンタゴニスト）ことによって、上
述したｐ８５及びｐ１１０サブユニット間の相互作用を
研究することが可能である。アンタゴニスト分子は、前
述したように、一つのサブユニット、即ち、ｐ８５、と
の接触時に、サブユニットｐ１１０との相互作用を阻止
する特定結合領域を対象とする抗体として構成すること
が出来る。これらの抗体は、従来の方法によってハイブ
リドーマ細胞系を生成することによって作られるモノク
ローナル抗体とすることが可能である。
【００４８】前記アンタゴニストは、又、セリンキナー
ゼ燐酸化に関与する特定の残基を阻止するｐ８５サブユ
ニット用アンタゴニストとして構成することが可能であ
る。特に好ましいのは、上述したようにｐ８５サブユニ
ットのセリン６０８残基に結合、またはこれを阻止する
アンタゴニストである。これらの分子のアンタゴニスト
作用は、これら分子が過剰な、又は好ましくないキナー
ゼ活性に特徴付けられる状況において利用可能であるこ
とを示唆するものである。
ゼ燐酸化に関与する特定の残基を阻止するｐ８５サブユ
ニット用アンタゴニストとして構成することが可能であ
る。特に好ましいのは、上述したようにｐ８５サブユニ
ットのセリン６０８残基に結合、またはこれを阻止する
アンタゴニストである。これらの分子のアンタゴニスト
作用は、これら分子が過剰な、又は好ましくないキナー
ゼ活性に特徴付けられる状況において利用可能であるこ
とを示唆するものである。
【００４９】特定の結合領域のための遺伝暗号を指定す
る核酸分子に対合または、その発現を抑制する核酸分子
を生成することも可能であり、特に好ましいのは、ＳＨ
２間領域のための遺伝暗号を指定する核酸配列に対合す
る分子であり、最も好ましいのは、ｐ８５βのアミノ酸
残基４４５〜４８５及びｐ８５αのアミノ酸残基４７８
〜５１３に対合する分子である。
る核酸分子に対合または、その発現を抑制する核酸分子
を生成することも可能であり、特に好ましいのは、ＳＨ
２間領域のための遺伝暗号を指定する核酸配列に対合す
る分子であり、最も好ましいのは、ｐ８５βのアミノ酸
残基４４５〜４８５及びｐ８５αのアミノ酸残基４７８
〜５１３に対合する分子である。
【００５０】前記アゴニスト分子は、更に、病態障害に
よって活性度が正常よりも低い場合、即ち、化学療法に
おいて有用である。アゴニストは、好ましくは、位置６
０８のセリン残基に於けるｐ８５サブユニットの燐酸化
を刺激し、該セリン残基に於ける燐酸化によってＰＩ３
−キナーゼ活性が抑制される。前記アゴニストは、好ま
しくは、互いに異なったキナーゼ族間の配列の保存に基
づく領域由来のアミノ酸配列を含む。
よって活性度が正常よりも低い場合、即ち、化学療法に
おいて有用である。アゴニストは、好ましくは、位置６
０８のセリン残基に於けるｐ８５サブユニットの燐酸化
を刺激し、該セリン残基に於ける燐酸化によってＰＩ３
−キナーゼ活性が抑制される。前記アゴニストは、好ま
しくは、互いに異なったキナーゼ族間の配列の保存に基
づく領域由来のアミノ酸配列を含む。
【００５１】アンタゴニスト又はアゴニスト分子及びそ
の配列の同定後、これらの特定配列を発現させる方法
は、これら配列、即ち、それらに組み込まれた分子を発
現するためのプラスミドトランスフェクション細胞を含
有するベクターを生成することによって行うことが出来
る。
の配列の同定後、これらの特定配列を発現させる方法
は、これら配列、即ち、それらに組み込まれた分子を発
現するためのプラスミドトランスフェクション細胞を含
有するベクターを生成することによって行うことが出来
る。
【００５２】従って、要約すると、以上の記載によっ
て、ｐ８５とｐ１１０サブユニット間の結合を抑制する
ことにより、ＰＩ３−キナーゼ活性を調節可能であるこ
とが立証されたのである。又、ｐ１１０サブユニットの
ＤＲＨＮＳＮ配列を調節、または無効化することによっ
て、Ｐ１１０サブユニットのタンパク質セリンキナーゼ
活性に影響を与えることが可能である。セリンキナーゼ
活性の増大はＰＩ３−キナーゼ活性を低下させる。リガ
ンド用のアゴニストは、ｐ８５サブユニットに結合する
ことによって、セリンキナーゼ活性を増加させ、ｐ８５
サブユニットの燐酸化を刺激する。このようなアゴニス
トは、恐らく、生体内におけるセリンキナーゼ活性量の
増加を提供するか、あるいは、ｐ８５サブユニットによ
り効率的に結合するものである。好ましくは、このアゴ
ニストは、ｐ１１０サブユニットの前記触媒ドメインに
対応する配列の少なくとも一部を含有している。
て、ｐ８５とｐ１１０サブユニット間の結合を抑制する
ことにより、ＰＩ３−キナーゼ活性を調節可能であるこ
とが立証されたのである。又、ｐ１１０サブユニットの
ＤＲＨＮＳＮ配列を調節、または無効化することによっ
て、Ｐ１１０サブユニットのタンパク質セリンキナーゼ
活性に影響を与えることが可能である。セリンキナーゼ
活性の増大はＰＩ３−キナーゼ活性を低下させる。リガ
ンド用のアゴニストは、ｐ８５サブユニットに結合する
ことによって、セリンキナーゼ活性を増加させ、ｐ８５
サブユニットの燐酸化を刺激する。このようなアゴニス
トは、恐らく、生体内におけるセリンキナーゼ活性量の
増加を提供するか、あるいは、ｐ８５サブユニットによ
り効率的に結合するものである。好ましくは、このアゴ
ニストは、ｐ１１０サブユニットの前記触媒ドメインに
対応する配列の少なくとも一部を含有している。
【００５３】特定の結合領域及び特定領域に存在する新
規なセリンキナーゼ活性の知見は、ＰＩ３−キナーゼ活
性を制御し、シグナル変換路を調節するための、治療／
診断補助手段及び分析手段の提供において大きな可能性
を与えるものである。更に、ｐ８５サブユニットのセリ
ン６０８残基を変化させる方法は、セリンキナーゼ活性
を抑制する手段を提供するものである。この変化は、公
知の方法、即ち、当業者にとって周知の、場所−指定、
標的変異、欠失、その他の方法によって行うことができ
る。
規なセリンキナーゼ活性の知見は、ＰＩ３−キナーゼ活
性を制御し、シグナル変換路を調節するための、治療／
診断補助手段及び分析手段の提供において大きな可能性
を与えるものである。更に、ｐ８５サブユニットのセリ
ン６０８残基を変化させる方法は、セリンキナーゼ活性
を抑制する手段を提供するものである。この変化は、公
知の方法、即ち、当業者にとって周知の、場所−指定、
標的変異、欠失、その他の方法によって行うことができ
る。
【００５４】更に、両サブユニット間の結合、及び、ｐ
１１０サブユニットのセリンキナーゼ活性を抑制する方
法と、サブユニットの構造の解明とによって、これらの
サブユニットに結合するリガンドのためのアゴニスト及
びアンタゴニストの同定が可能になる。本発明は、前記
アゴニスト及びアンタゴニスト、これらアゴニスト又は
アンタゴニストに遺伝暗号を指定する核酸分子、核酸分
子を含有する、前記バキュロウィルスベクター等の発現
ベクターをも提供するものである。更に、本発明は、前
記核酸分子を発現するための、発現ベクター又はプラス
ミドも含む。
１１０サブユニットのセリンキナーゼ活性を抑制する方
法と、サブユニットの構造の解明とによって、これらの
サブユニットに結合するリガンドのためのアゴニスト及
びアンタゴニストの同定が可能になる。本発明は、前記
アゴニスト及びアンタゴニスト、これらアゴニスト又は
アンタゴニストに遺伝暗号を指定する核酸分子、核酸分
子を含有する、前記バキュロウィルスベクター等の発現
ベクターをも提供するものである。更に、本発明は、前
記核酸分子を発現するための、発現ベクター又はプラス
ミドも含む。
【００５５】更に、ｐ８５サブユニットのＳＨ２間領域
を含むアンタゴニストのために遺伝暗号を指定する核酸
分子に対合するａｎｔｉｓｅｎｓｅ核酸分子を、その発
現の抑制の為に利用することが出来る。このように、ｐ
８５とそのｐ１１０触媒ドメインとの結合が抑制される
のである。
を含むアンタゴニストのために遺伝暗号を指定する核酸
分子に対合するａｎｔｉｓｅｎｓｅ核酸分子を、その発
現の抑制の為に利用することが出来る。このように、ｐ
８５とそのｐ１１０触媒ドメインとの結合が抑制される
のである。
【００５６】本発明は、更に、前記ベクターとトランス
フェクション感染可能な細胞又は細胞系を提供するもの
であり、これらの細胞は、真核及びほ乳類細胞から由来
させることが可能である。例えば、アゴニスト分子とト
ランスフェクションしたＳｆ９細胞内のバキュロウィル
ス発現系がその一例として挙げられる。
フェクション感染可能な細胞又は細胞系を提供するもの
であり、これらの細胞は、真核及びほ乳類細胞から由来
させることが可能である。例えば、アゴニスト分子とト
ランスフェクションしたＳｆ９細胞内のバキュロウィル
ス発現系がその一例として挙げられる。
【００５７】更に、本発明は前記両サブユニット間の結
合に干渉する分子又は抗体を提供する。
合に干渉する分子又は抗体を提供する。
【００５８】本発明は、又、許容可能なアジュバント、
希釈液、キャリアとともに、及び／又は単位投与量状態
での薬用として調合されたアンタゴニスト又はアゴニス
トとして実施可能である。適当な調合又は複合を行うた
めに、従来式の薬事慣行を利用することが出来る。
希釈液、キャリアとともに、及び／又は単位投与量状態
での薬用として調合されたアンタゴニスト又はアゴニス
トとして実施可能である。適当な調合又は複合を行うた
めに、従来式の薬事慣行を利用することが出来る。
【００５９】従って、本発明の調合剤は、静脈注射、皮
下注射、筋内注射、眼内注射、点眼（ｏｐｔｈａｌｍｉ
ｃ）、心室内注射、頭がい内注射、きょう膜内注射、脊
髄内注射、脳槽内注射、腹膜内注射、局所注射、鼻こう
内注射、噴霧投与、乱切投与等の非経口的投与や、経口
投与、口内投与、直腸又はちつ内投与に適用可能であ
る。
下注射、筋内注射、眼内注射、点眼（ｏｐｔｈａｌｍｉ
ｃ）、心室内注射、頭がい内注射、きょう膜内注射、脊
髄内注射、脳槽内注射、腹膜内注射、局所注射、鼻こう
内注射、噴霧投与、乱切投与等の非経口的投与や、経口
投与、口内投与、直腸又はちつ内投与に適用可能であ
る。
【００６０】本発明の調合剤は、更に、本発明の核酸分
子発現のホスト細胞の患者への移植による投与、又は、
本発明の調合剤を放出する外科的インプラントの使用に
よる投与に適用可能である。移植は、特定の腫瘍箇所に
行うことも可能である。
子発現のホスト細胞の患者への移植による投与、又は、
本発明の調合剤を放出する外科的インプラントの使用に
よる投与に適用可能である。移植は、特定の腫瘍箇所に
行うことも可能である。
【００６１】非経口投与用調合剤は、溶液又は懸濁液と
して形成することが出来、又、経口投与用には、錠剤又
はカプセルとして形成し、更に、鼻こう内投与用として
は、粉末、鼻こう点滴剤、又は噴霧剤として形成するこ
とができる。調合剤を製造する周知技術は、例えば、”
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”誌に記載されている。
して形成することが出来、又、経口投与用には、錠剤又
はカプセルとして形成し、更に、鼻こう内投与用として
は、粉末、鼻こう点滴剤、又は噴霧剤として形成するこ
とができる。調合剤を製造する周知技術は、例えば、”
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”誌に記載されている。
【００６２】一般的に、本発明のアゴニスト又はアンタ
ゴニストタンパク質フラグメントは、非経口投与用とし
て、約０．１〜１０％ ｗ／ｖの化合物を含有する水溶
性生理的バッファ溶液として提供可能である。一般的な
投与量の範囲としては、一日につき、体重１ｋｇ当り約
１μｇ〜１ｇの範囲であり、好ましい用量は約０．０１
ｍｇ〜１００ｍｇの範囲である。好ましい投与量は、恐
らく、治癒されるべき状態のタイプ、進行状態、患者の
全体的健康状態、調製剤の組成および投与の経路等によ
って変化する。
ゴニストタンパク質フラグメントは、非経口投与用とし
て、約０．１〜１０％ ｗ／ｖの化合物を含有する水溶
性生理的バッファ溶液として提供可能である。一般的な
投与量の範囲としては、一日につき、体重１ｋｇ当り約
１μｇ〜１ｇの範囲であり、好ましい用量は約０．０１
ｍｇ〜１００ｍｇの範囲である。好ましい投与量は、恐
らく、治癒されるべき状態のタイプ、進行状態、患者の
全体的健康状態、調製剤の組成および投与の経路等によ
って変化する。
【００６３】これらのアンタゴニスト及びアゴニスト分
子は、更に、サンプル中の分子からｐ８５タンパク質を
選別する手段を提供するものである。この方法は、既知
量の本発明のアゴニスト又はアンタゴニストを、ある量
のサンプルタンパク質に接触させ、サンプル中に存在す
るｐ８５タンパク質と前記アゴニスト又はアンタゴニス
トとの結合を測定するものである。
子は、更に、サンプル中の分子からｐ８５タンパク質を
選別する手段を提供するものである。この方法は、既知
量の本発明のアゴニスト又はアンタゴニストを、ある量
のサンプルタンパク質に接触させ、サンプル中に存在す
るｐ８５タンパク質と前記アゴニスト又はアンタゴニス
トとの結合を測定するものである。
【００６４】本発明は、更に、不十分なＰＩ３−キナー
ゼ活性によって特徴付けられる病状を有する患者を治療
するためのアゴニストの使用を提供するものである。Ｐ
Ｉ３−キナーゼ活性のためのアゴニストを有するのに加
えて、この合成物には、前記アゴニストの取り込みを容
易にするための、キャリア、アジュバント、希釈剤、補
形薬等を含ませることが出来る。本発明は、更に、ｐ８
５サブユニットへの結合のためのｐ１１０と競合するア
ゴニスト又はアンタゴニストを提供する。
ゼ活性によって特徴付けられる病状を有する患者を治療
するためのアゴニストの使用を提供するものである。Ｐ
Ｉ３−キナーゼ活性のためのアゴニストを有するのに加
えて、この合成物には、前記アゴニストの取り込みを容
易にするための、キャリア、アジュバント、希釈剤、補
形薬等を含ませることが出来る。本発明は、更に、ｐ８
５サブユニットへの結合のためのｐ１１０と競合するア
ゴニスト又はアンタゴニストを提供する。
【００６５】公知の技術を使用してｐ８５及びｐ１１０
サブユニットの構造及びこれらの相互作用を研究するこ
とによって、ｐ１１０フラグメントの作用を模倣する分
子を設計することが可能になる。
サブユニットの構造及びこれらの相互作用を研究するこ
とによって、ｐ１１０フラグメントの作用を模倣する分
子を設計することが可能になる。
【００６６】
【発明の効果】ＰＩ３−キナーゼのセリンキナーゼ活性
を調節する方法は、ｐ１１０サブユニットのＤＲＨＮＳ
Ｎ配置を無効化したり、あるいはこれに干渉することに
よって達成され、ＰＩ３−キナーゼ活性全体に影響を与
えるのに利用できる。
を調節する方法は、ｐ１１０サブユニットのＤＲＨＮＳ
Ｎ配置を無効化したり、あるいはこれに干渉することに
よって達成され、ＰＩ３−キナーゼ活性全体に影響を与
えるのに利用できる。
【００６７】以下の例を参照することによって、本発明
はより良く理解されるであろう。但し、これらの例は例
示の目的のためにのみここに開示されるものであって、
本発明の範囲をなんら限定するものではない。
はより良く理解されるであろう。但し、これらの例は例
示の目的のためにのみここに開示されるものであって、
本発明の範囲をなんら限定するものではない。
【００６８】
【実施例】以下の例は、ｐ１１０サブユニットがｐ８５
αまたはｐ８５βと再構成されて活性ＰＩ３−キナーゼ
複合体を形成可能であることを示すものである。両サブ
ユニット間の結合が起こることを確証した後、ｐ８５α
のＳＨ２間領域がｐ１１０への結合に必要であることが
判明した。正確な結合位置を確かめるためにマッピング
実験を行うことによって、前記ＳＨ２間領域内の領域
が、サブユニット間相互作用に寄与していることが判明
した。ｐ１１０に対するｐ８５の具体的結合位置及びｐ
８５の前記ＳＨ２間領域の構造も、上記のように明らか
にされた。
αまたはｐ８５βと再構成されて活性ＰＩ３−キナーゼ
複合体を形成可能であることを示すものである。両サブ
ユニット間の結合が起こることを確証した後、ｐ８５α
のＳＨ２間領域がｐ１１０への結合に必要であることが
判明した。正確な結合位置を確かめるためにマッピング
実験を行うことによって、前記ＳＨ２間領域内の領域
が、サブユニット間相互作用に寄与していることが判明
した。ｐ１１０に対するｐ８５の具体的結合位置及びｐ
８５の前記ＳＨ２間領域の構造も、上記のように明らか
にされた。
【００６９】ｐ８５／ｐ１１０結合領域に対する知見に
より、ＰＩ３−キナーゼ活性を制御、調節するためこの
結合に干渉するメカニズムが提供される。結合が無い場
合には、以下の実験によってＰＩ３−キナーゼ活性が測
定不能であることが示される。「ＰＩ３−キナーゼ活
性：サブユニット間相互作用の構造及び機能の分析」
（以下、「サブユニット間相互作用」と称する）、ＥＭ
ＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ１３，Ｎｏ．３（１９９
４年２月１日発行予定）を参照。この文献の内容全体を
参考資料とする。更に、具体的な結合領域の知見によっ
て、ｐ８５及びｐ１１０間の相互作用に対するアンタゴ
ニストを調合して、ＰＩ３−キナーゼ活性を調節する性
質と方法を更に研究することができる。
より、ＰＩ３−キナーゼ活性を制御、調節するためこの
結合に干渉するメカニズムが提供される。結合が無い場
合には、以下の実験によってＰＩ３−キナーゼ活性が測
定不能であることが示される。「ＰＩ３−キナーゼ活
性：サブユニット間相互作用の構造及び機能の分析」
（以下、「サブユニット間相互作用」と称する）、ＥＭ
ＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ１３，Ｎｏ．３（１９９
４年２月１日発行予定）を参照。この文献の内容全体を
参考資料とする。更に、具体的な結合領域の知見によっ
て、ｐ８５及びｐ１１０間の相互作用に対するアンタゴ
ニストを調合して、ＰＩ３−キナーゼ活性を調節する性
質と方法を更に研究することができる。
【００７０】以下の実験例は、更に、Ｓｆ９細胞に発現
した組換え体ＰＩ３−キナーゼが会合タンパク質キナー
ゼを示し、タンパク質−セリンキナーゼ活性が前記ｐ１
１０サブユニットに内在的であることを示している。
「ＰＩ３−キナーゼは二重変異性酵素である。：内在タ
ンパク質−セリンキナーゼ活性による自己調節」と題す
るＤｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．の論文（以下「二重変異
性」と称する）、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ１
３，Ｎｏ．３（１９９４年２月１日発行予定）参照。こ
の文献の内容全体を参考資料とする。
した組換え体ＰＩ３−キナーゼが会合タンパク質キナー
ゼを示し、タンパク質−セリンキナーゼ活性が前記ｐ１
１０サブユニットに内在的であることを示している。
「ＰＩ３−キナーゼは二重変異性酵素である。：内在タ
ンパク質−セリンキナーゼ活性による自己調節」と題す
るＤｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．の論文（以下「二重変異
性」と称する）、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ１
３，Ｎｏ．３（１９９４年２月１日発行予定）参照。こ
の文献の内容全体を参考資料とする。
【００７１】例 １
ＰＩ３−キナーゼのｐ８５及びｐ１１０サブユニットの
ＰＩ３−キナーゼ活性における関係及び役割をよりよく
理解するために、これらサブユニット間の相互作用と結
合現象を調べた。ｐ１１０サブユニットに関する一連の
実験によって、ｐ１１０が、生体内と生体外との両方に
おいて、ｐ８５αまたはｐ８５βと再構成して、活性Ｐ
Ｉ３−キナーゼ複合体を形成することが判った。ｐ８５
αサブユニットとｐ１１０サブユニットとは、Ｓｆ９細
胞内において共同発現された時、安定的な複合体を形成
することが知られている（Ｈｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．１
９９２）。ｐ８５βもｐ１１０タンパク質と再構成して
活性複合体を形成するか否かを確かめるため、昆虫細胞
を、ｐ８５α及びｐ１１０またはｐ８５β及びｐ１１０
組換え体バキュロウィルスと共同感染させた。
ＰＩ３−キナーゼ活性における関係及び役割をよりよく
理解するために、これらサブユニット間の相互作用と結
合現象を調べた。ｐ１１０サブユニットに関する一連の
実験によって、ｐ１１０が、生体内と生体外との両方に
おいて、ｐ８５αまたはｐ８５βと再構成して、活性Ｐ
Ｉ３−キナーゼ複合体を形成することが判った。ｐ８５
αサブユニットとｐ１１０サブユニットとは、Ｓｆ９細
胞内において共同発現された時、安定的な複合体を形成
することが知られている（Ｈｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．１
９９２）。ｐ８５βもｐ１１０タンパク質と再構成して
活性複合体を形成するか否かを確かめるため、昆虫細胞
を、ｐ８５α及びｐ１１０またはｐ８５β及びｐ１１０
組換え体バキュロウィルスと共同感染させた。
【００７２】より具体的には、サマーズとスミス（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ１９８７）に記載され
ているように、昆虫細胞を培養内に維持し、ｐ８５α及
びｐ８５βタンパク質を、前述のようにバキュロウィル
スベクターを使用して昆虫細胞内で発現させた（Ｇｏｕ
ｔ ｅｔ ａｌ．１９９２； Ｏｔｓｕ ｅｔ ａｌ．
１９９１）。ｐ１１０発現組換え体バキュロウィルス
は、ヒルズら（Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）に
記載されている。
ｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ１９８７）に記載され
ているように、昆虫細胞を培養内に維持し、ｐ８５α及
びｐ８５βタンパク質を、前述のようにバキュロウィル
スベクターを使用して昆虫細胞内で発現させた（Ｇｏｕ
ｔ ｅｔ ａｌ．１９９２； Ｏｔｓｕ ｅｔ ａｌ．
１９９１）。ｐ１１０発現組換え体バキュロウィルス
は、ヒルズら（Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）に
記載されている。
【００７３】会合分析は以下の要領で行った。Ｓｆ９細
胞を、適当なバキュロウィルスに感染させた（Ｇｏｕｔ
ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１
９９２に記載の通り）。感染して２日後、細胞を収穫し
て５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，（ｐＨ７．４）、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＦ，５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５００μＭ オル
トバナジウム酸ナトリウム塩、２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び
アプロチニンの１００カリクレイン インヒビタ単位
内、にて溶離した。次に、溶離物を、適当な抗体を使用
して免疫沈降させるか、あるいはＰＩ３−キナーゼが結
合することが示されているヒトＰＤＧＦ−βレセプタの
チロシン７５１を包囲する配列由来のホスホペプチド親
和性カラム、ＤＹ751ＶＰＭＬ（Ｇ）に適用した（Ｆｒ
ｙ ｅｔｌ ａｌ．１９９２； Ｏｓｔｕ ｅｔ ａ
ｌ．１９９１）。
胞を、適当なバキュロウィルスに感染させた（Ｇｏｕｔ
ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１
９９２に記載の通り）。感染して２日後、細胞を収穫し
て５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，（ｐＨ７．４）、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＦ，５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５００μＭ オル
トバナジウム酸ナトリウム塩、２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び
アプロチニンの１００カリクレイン インヒビタ単位
内、にて溶離した。次に、溶離物を、適当な抗体を使用
して免疫沈降させるか、あるいはＰＩ３−キナーゼが結
合することが示されているヒトＰＤＧＦ−βレセプタの
チロシン７５１を包囲する配列由来のホスホペプチド親
和性カラム、ＤＹ751ＶＰＭＬ（Ｇ）に適用した（Ｆｒ
ｙ ｅｔｌ ａｌ．１９９２； Ｏｓｔｕ ｅｔ ａ
ｌ．１９９１）。
【００７４】Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９２に記載
の方法でｐ１１０抗血清を飼養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
精製ｐ８５αに対して飼養された親和性精製ポリクロー
ナル抗体は、Ｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ．１９９２に記載さ
れている。ｐ８５α及びｐ８５βタンパク質用のモノク
ローナル抗体は、Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９３に記載
されており、この文献の内容全体をここに参考資料とす
る。免疫沈降は、前述したようにＯｔｓｕ ｅｔ ａ
ｌ．１９９３に記載の方法で行った。
の方法でｐ１１０抗血清を飼養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
精製ｐ８５αに対して飼養された親和性精製ポリクロー
ナル抗体は、Ｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ．１９９２に記載さ
れている。ｐ８５α及びｐ８５βタンパク質用のモノク
ローナル抗体は、Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９３に記載
されており、この文献の内容全体をここに参考資料とす
る。免疫沈降は、前述したようにＯｔｓｕ ｅｔ ａ
ｌ．１９９３に記載の方法で行った。
【００７５】具体的には、Ｓｆ９細胞を、図１に示すよ
うに、Ａｉ（レーン１）、ｐ８５α（レーン２）、また
はｐ１１０（レーン３）ウィルスと感染されるか、ある
いは、ｐ８５α及びｐ１１０ウィルス（レーン４−６）
またはｐ８５β及びｐ１１０ウィルス（レーン７−９）
と共同感染させた。これらの細胞の溶離物を、ｐ８５α
（レーン１及び４）に対して飼養されたポリクローナル
親和性精製抗体、ｐ８５β（レーン２及び７）に対して
飼養されたモノクローナル抗体、ｐ１１０（レーン３，
５，８）に対して飼養されたポリクローナル親和性精製
抗体を使用して免疫沈降させるか、あるいは、固定Ｙ
751ホスホペプチド親和性ビーズ（レーン６及び９）に
固定させた。酵素複合体を、クーマシーブルー染色７．
５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析するか、もしく
は、ＰＩ３−キナーゼ分析を行った。ＰＩ３−キナーゼ
分析は、上述の方法で免疫沈降物に対して行った（図
１、Ａｉｉ参照）。
うに、Ａｉ（レーン１）、ｐ８５α（レーン２）、また
はｐ１１０（レーン３）ウィルスと感染されるか、ある
いは、ｐ８５α及びｐ１１０ウィルス（レーン４−６）
またはｐ８５β及びｐ１１０ウィルス（レーン７−９）
と共同感染させた。これらの細胞の溶離物を、ｐ８５α
（レーン１及び４）に対して飼養されたポリクローナル
親和性精製抗体、ｐ８５β（レーン２及び７）に対して
飼養されたモノクローナル抗体、ｐ１１０（レーン３，
５，８）に対して飼養されたポリクローナル親和性精製
抗体を使用して免疫沈降させるか、あるいは、固定Ｙ
751ホスホペプチド親和性ビーズ（レーン６及び９）に
固定させた。酵素複合体を、クーマシーブルー染色７．
５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析するか、もしく
は、ＰＩ３−キナーゼ分析を行った。ＰＩ３−キナーゼ
分析は、上述の方法で免疫沈降物に対して行った（図
１、Ａｉｉ参照）。
【００７６】バキュロウィルス発現ｐ８５α及びｐ１１
０の二重感染物において、両方のタンパク質が、ａｎｔ
ｉ−ｐ８５αまたはａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物内
に、又は、前記酵素がＹ751ホスホペプチド親和性ビー
ズに固定された時に検出された。図１のＡｉ、レーン
４，５及び６参照。又、すべての親和性及び免疫沈降物
がＰＩ３−キナーゼ活性を有していることが判明した。
図１のＡｉｉ、レーン４，５及び６参照。ＰＩ３−キナ
ーゼ分析は、Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９３に記載され
ている方法で行った。
０の二重感染物において、両方のタンパク質が、ａｎｔ
ｉ−ｐ８５αまたはａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物内
に、又は、前記酵素がＹ751ホスホペプチド親和性ビー
ズに固定された時に検出された。図１のＡｉ、レーン
４，５及び６参照。又、すべての親和性及び免疫沈降物
がＰＩ３−キナーゼ活性を有していることが判明した。
図１のＡｉｉ、レーン４，５及び６参照。ＰＩ３−キナ
ーゼ分析は、Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９３に記載され
ている方法で行った。
【００７７】ウィルス発現ｐ８５β及びｐ１１０におい
ても類似の結果が得られた。ｐ８５β又はｐ１１０サブ
ユニットに向けられた、あるいはＹ751ホスホペプチド
親和性ビードに固定された抗体と免疫沈降した感染細胞
溶離物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された時に、
ｐ８５βとｐ１１０との両方を含有していることが判っ
た。図１のＡｉ、レーン７，８及び９参照。これらのサ
ンプルのＰＩ３−キナーゼ活性もテストしたところ、そ
のｐ８５β／ｐ１１０複合体が酵素的に活性であること
が判った。図１のＡｉ、レーン７，８及び９参照。
ても類似の結果が得られた。ｐ８５β又はｐ１１０サブ
ユニットに向けられた、あるいはＹ751ホスホペプチド
親和性ビードに固定された抗体と免疫沈降した感染細胞
溶離物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された時に、
ｐ８５βとｐ１１０との両方を含有していることが判っ
た。図１のＡｉ、レーン７，８及び９参照。これらのサ
ンプルのＰＩ３−キナーゼ活性もテストしたところ、そ
のｐ８５β／ｐ１１０複合体が酵素的に活性であること
が判った。図１のＡｉ、レーン７，８及び９参照。
【００７８】ｐ８５β／ｐ１１０複合体中で沈降された
クーマシーブルー染色タンパク質のレベルは、同量のｐ
１１０抗体又はＹ751ホスホペプチド親和性ビーズを使
用した場合にｐ８５α／ｐ１１０複合体中において沈降
することが観察されるレベルと実質的に同じである。ｐ
８５αとｐ８５βとの両方が昆虫細胞内においておよそ
同じレベルで発現するので、（Ｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ．
１９９２）、Ｓｆ９細胞内におけるｐ８５β／ｐ１１０
複合体の形成は、恐らく、ｐ８５α／ｐ１１０複合体の
形成と同じ程度に効率的である。ｐ８５α／ｐ１１０複
合体とｐ８５β／ｐ１１０複合体とのいずれとも比較可
能な量のＰＩ３−キナーゼ活性が沈降されたので、恐ら
く、ｐ１１０は昆虫細胞内においていずれのｐ８５イソ
フォーム（イソ型タンパク質：ｉｓｏｆｏｒｍｓ）とも
安定した活性ＰＩ３−キナーゼ複合体を形成することが
出来るものと考えられる。
クーマシーブルー染色タンパク質のレベルは、同量のｐ
１１０抗体又はＹ751ホスホペプチド親和性ビーズを使
用した場合にｐ８５α／ｐ１１０複合体中において沈降
することが観察されるレベルと実質的に同じである。ｐ
８５αとｐ８５βとの両方が昆虫細胞内においておよそ
同じレベルで発現するので、（Ｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ．
１９９２）、Ｓｆ９細胞内におけるｐ８５β／ｐ１１０
複合体の形成は、恐らく、ｐ８５α／ｐ１１０複合体の
形成と同じ程度に効率的である。ｐ８５α／ｐ１１０複
合体とｐ８５β／ｐ１１０複合体とのいずれとも比較可
能な量のＰＩ３−キナーゼ活性が沈降されたので、恐ら
く、ｐ１１０は昆虫細胞内においていずれのｐ８５イソ
フォーム（イソ型タンパク質：ｉｓｏｆｏｒｍｓ）とも
安定した活性ＰＩ３−キナーゼ複合体を形成することが
出来るものと考えられる。
【００７９】例 ２
前記ＰＩ３−キナーゼ複合体の二つのサブユニットが生
体外において翻訳後に会合することが可能か否かを確か
めるために、結合分析を行った。前記ＰＩ３−キナーゼ
複合体のサブユニットの一方を、先ず、適当なマトリッ
クスに固定し、次に、これを溶液中にて他のサブユニッ
トに結合させた。先ず、イソフォーム変異性モノクロー
ナル抗体を使用して感染昆虫細胞から免疫沈降したｐ８
５タンパク質を、プロテインＡセファロースビーズに収
集した。次に、これらの免疫複合体を、予めｐ１１０ウ
ィルスによって感染させておいた昆虫細胞の溶離物と培
養した。次に、これらを洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は
ＰＩ３−キナーゼ分析によって分析した。又、これに代
えて、ｐ１１０を感染昆虫細胞から免疫沈降させ、溶離
物発現のｐ８５αと温置し、次に上述の方法で処理し
た。
体外において翻訳後に会合することが可能か否かを確か
めるために、結合分析を行った。前記ＰＩ３−キナーゼ
複合体のサブユニットの一方を、先ず、適当なマトリッ
クスに固定し、次に、これを溶液中にて他のサブユニッ
トに結合させた。先ず、イソフォーム変異性モノクロー
ナル抗体を使用して感染昆虫細胞から免疫沈降したｐ８
５タンパク質を、プロテインＡセファロースビーズに収
集した。次に、これらの免疫複合体を、予めｐ１１０ウ
ィルスによって感染させておいた昆虫細胞の溶離物と培
養した。次に、これらを洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は
ＰＩ３−キナーゼ分析によって分析した。又、これに代
えて、ｐ１１０を感染昆虫細胞から免疫沈降させ、溶離
物発現のｐ８５αと温置し、次に上述の方法で処理し
た。
【００８０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブルー染
色によって、ｐ８５αとｐ８５βとの両方がｐ１１０と
結合することが観察された（図１のＢｉ、レーン１及び
２参照）。ＰＩ３−キナーゼ活性が分析された（図１の
Ｂｉｉ，レーン１および２）ｐ１１０が固定された場合
においても類似の結果が得られ、結合ｐ８５αタンパク
質は、生体外における結合後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおい
てクーマシーブルーによって染色されたタンパク質とし
て検出される（図１、Ｂｉｉｉ，レーン２参照）。
色によって、ｐ８５αとｐ８５βとの両方がｐ１１０と
結合することが観察された（図１のＢｉ、レーン１及び
２参照）。ＰＩ３−キナーゼ活性が分析された（図１の
Ｂｉｉ，レーン１および２）ｐ１１０が固定された場合
においても類似の結果が得られ、結合ｐ８５αタンパク
質は、生体外における結合後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおい
てクーマシーブルーによって染色されたタンパク質とし
て検出される（図１、Ｂｉｉｉ，レーン２参照）。
【００８１】例 ３
ｐ１１０の結合の原因となるｐ８５αの特定領域を求め
るために、前記相互作用に関連するｐ８５のドメインの
分析を行った。
るために、前記相互作用に関連するｐ８５のドメインの
分析を行った。
【００８２】ｐ８５αの様々なサブドメインのＧＳＴ溶
融タンパク質を構成し、グルタチオン−セファロースビ
ーズ上に固定した（図２，Ａ参照）。これらのタンパク
質を、組換え体バキュロウィルス発現ｐ１１０によって
感染させたＳｆ９細胞から調合された細胞溶離物ととも
に、親和性分析に使用した。これら複合体を洗浄し、Ｐ
Ｉ３−キナーゼ活性分析を行った。ＧＳＴ単体、およ
び、野生型溶離物と培養したグルタチオン−セファロー
スビーズに固定されたＧＳＴαｐ８５とが、対照として
使用された。
融タンパク質を構成し、グルタチオン−セファロースビ
ーズ上に固定した（図２，Ａ参照）。これらのタンパク
質を、組換え体バキュロウィルス発現ｐ１１０によって
感染させたＳｆ９細胞から調合された細胞溶離物ととも
に、親和性分析に使用した。これら複合体を洗浄し、Ｐ
Ｉ３−キナーゼ活性分析を行った。ＧＳＴ単体、およ
び、野生型溶離物と培養したグルタチオン−セファロー
スビーズに固定されたＧＳＴαｐ８５とが、対照として
使用された。
【００８３】図２Ｂは、キナーゼ活性が、全長ＧＳＴｐ
８５αタンパク質（レーン１）か、あるいはｐ８５αの
ＳＨ２間領域（レーン３）のいずれかとのみ関連してい
ることを示す。ＰＩ３−キナーゼ活性は、ＧＳＴ単体
（レーン７）には結合せず、内生昆虫細胞ＰＩ３−キナ
ーゼ活性は、対照溶離物と培養した場合には全長ＧＳＴ
ｐ８５αタンパク質に固定しなかった（データ図示せ
ず）。
８５αタンパク質（レーン１）か、あるいはｐ８５αの
ＳＨ２間領域（レーン３）のいずれかとのみ関連してい
ることを示す。ＰＩ３−キナーゼ活性は、ＧＳＴ単体
（レーン７）には結合せず、内生昆虫細胞ＰＩ３−キナ
ーゼ活性は、対照溶離物と培養した場合には全長ＧＳＴ
ｐ８５αタンパク質に固定しなかった（データ図示せ
ず）。
【００８４】例 ４
ｐ８５タンパク質全体におけるｐ８５αとｐ１１０のＳ
Ｈ２間領域間の相互作用を調べるために、ＳＨ間領域内
のエピトープに結合するモノクローナル抗体を、サブユ
ニット間会合を阻止するのに使用した。昆虫細胞からの
ｐ８５αを、ｐ８５αのＳＨ２間領域に位置するエピト
ープに結合する二つのモノクローナル抗体Ｕ９およびＵ
１５、又はＢＣＲドメインを認識する二つの対照抗体を
使用して、免疫沈降させた（Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，１
９９３）。これらの免疫複合体を洗浄し、予めｐ１１０
ウィルスに感染させておいた昆虫細胞の溶離物と培養し
た。結合したタンパク質を、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びＰＩ３−キナーゼ分析により分析した。
Ｈ２間領域間の相互作用を調べるために、ＳＨ間領域内
のエピトープに結合するモノクローナル抗体を、サブユ
ニット間会合を阻止するのに使用した。昆虫細胞からの
ｐ８５αを、ｐ８５αのＳＨ２間領域に位置するエピト
ープに結合する二つのモノクローナル抗体Ｕ９およびＵ
１５、又はＢＣＲドメインを認識する二つの対照抗体を
使用して、免疫沈降させた（Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，１
９９３）。これらの免疫複合体を洗浄し、予めｐ１１０
ウィルスに感染させておいた昆虫細胞の溶離物と培養し
た。結合したタンパク質を、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びＰＩ３−キナーゼ分析により分析した。
【００８５】４種すべての抗体によって類似量のｐ８５
αが、免疫沈降していることがクーマシーブルー染色に
よって観察された（図３，Ａ，レーン１−４参照）。し
かしながら、ＳＨ２間領域を認識する二つの抗体によっ
て免疫沈降されたｐ８５αに固定されたＰＩ３−キナー
ゼ活性の量（図３，Ｂ，レーン３及び４）は、ＢＣＲド
メインに対する抗体によって免疫沈降されたｐ８５αに
結合された活性の量（図３，Ｂ，レーン１及び２）より
もかなり少なかった。このデータから、ｐ１１０サブユ
ニットへの結合には、ｐ８５αのＳＨ２間領域が必要で
あることと、ＳＨ２領域に対しての変異性を有する抗体
が両サブユニット間の結合を抑制することとが明らかで
ある。
αが、免疫沈降していることがクーマシーブルー染色に
よって観察された（図３，Ａ，レーン１−４参照）。し
かしながら、ＳＨ２間領域を認識する二つの抗体によっ
て免疫沈降されたｐ８５αに固定されたＰＩ３−キナー
ゼ活性の量（図３，Ｂ，レーン３及び４）は、ＢＣＲド
メインに対する抗体によって免疫沈降されたｐ８５αに
結合された活性の量（図３，Ｂ，レーン１及び２）より
もかなり少なかった。このデータから、ｐ１１０サブユ
ニットへの結合には、ｐ８５αのＳＨ２間領域が必要で
あることと、ＳＨ２領域に対しての変異性を有する抗体
が両サブユニット間の結合を抑制することとが明らかで
ある。
【００８６】例 ５
ＳＨ２間領域のどのサブ領域が、ｐ１１０サブユニット
の直接結合に関係しているかを調べるために、ｐ８５α
のＳＨ２間領域の両端部に、欠失を導入し、この領域の
大きさを１７５アミノ酸（４２５−６００）から１０４
残基（４５１−５５５）へと縮小させた（図４，Ａ参
照）。ＧＳＴ融合タンパク質として発現する裁頭ＳＨ２
間領域を、グルタチオン−セファロースビーズに固定
し、次に、予めＰ１１０に感染させておいた昆虫細胞の
溶離物と温置した。会合ＰＩ３−キナーゼ活性を測定し
た。
の直接結合に関係しているかを調べるために、ｐ８５α
のＳＨ２間領域の両端部に、欠失を導入し、この領域の
大きさを１７５アミノ酸（４２５−６００）から１０４
残基（４５１−５５５）へと縮小させた（図４，Ａ参
照）。ＧＳＴ融合タンパク質として発現する裁頭ＳＨ２
間領域を、グルタチオン−セファロースビーズに固定
し、次に、予めＰ１１０に感染させておいた昆虫細胞の
溶離物と温置した。会合ＰＩ３−キナーゼ活性を測定し
た。
【００８７】ＧＳＴ−ｐ８５α融合タンパク質の構造
ＰＩ３−キナーゼのウシＰ８５ サブユニット（Ｏｔｓ
ｕ ｅｔ ａｌ．１９９１）のＳＨ３ドメイン（アミノ
酸１−８６）、ＢＣＲ相同領域（アミノ酸１２５−３２
２）、及びヘリカルＳＨ２間ドメイン（アミノ酸４２５
−６００，４２５−５５５，４５１−６１６，４５１−
６００，４５１−５５５）に対応する配列を、ＰＣＲに
よって増幅し、ｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）へクローン化した。クローン化を容易にするた
めに、オリゴヌクレオチドのＮ−及びＣ−末端にＢａｍ
ＨＩ及びＥｃｏＲＩ位置をそれぞれ含ませた。５’から
ＥｃｏＲＩ位置への各クローン化配列の末端には、終止
コドンを含ませた。配列システム（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）を使用してＰＣＲフラグメントを確認し
た。全長ｐ８５α（アミノ酸１−７２４）を、ＢｇＩＩ
Ｉ及びＥｃｏＲＩでｐＧＥＸ−２Ｔ−ＳＨ３を消化する
ことにより、ｐＧＥＸ−２Ｔへサブクローン化し、この
フラグメントを、ｐ８５αタンパク質の残りのコード化
領域を含有するブルー・スクリプト・ベクター（Ｏｔｓ
ｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１）内のｐ８５αからの類似
切断されたカートリッジによって置き換えた。ｐ８５α
のＣ−及びＮ−末端ＳＨ２ドメインとｐ８５αＮ−Ｃ構
造とが記載されている（Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２）。
ｕ ｅｔ ａｌ．１９９１）のＳＨ３ドメイン（アミノ
酸１−８６）、ＢＣＲ相同領域（アミノ酸１２５−３２
２）、及びヘリカルＳＨ２間ドメイン（アミノ酸４２５
−６００，４２５−５５５，４５１−６１６，４５１−
６００，４５１−５５５）に対応する配列を、ＰＣＲに
よって増幅し、ｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）へクローン化した。クローン化を容易にするた
めに、オリゴヌクレオチドのＮ−及びＣ−末端にＢａｍ
ＨＩ及びＥｃｏＲＩ位置をそれぞれ含ませた。５’から
ＥｃｏＲＩ位置への各クローン化配列の末端には、終止
コドンを含ませた。配列システム（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）を使用してＰＣＲフラグメントを確認し
た。全長ｐ８５α（アミノ酸１−７２４）を、ＢｇＩＩ
Ｉ及びＥｃｏＲＩでｐＧＥＸ−２Ｔ−ＳＨ３を消化する
ことにより、ｐＧＥＸ−２Ｔへサブクローン化し、この
フラグメントを、ｐ８５αタンパク質の残りのコード化
領域を含有するブルー・スクリプト・ベクター（Ｏｔｓ
ｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１）内のｐ８５αからの類似
切断されたカートリッジによって置き換えた。ｐ８５α
のＣ−及びＮ−末端ＳＨ２ドメインとｐ８５αＮ−Ｃ構
造とが記載されている（Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２）。
【００８８】その結果は図４，Ｂ（レーン２−６）に示
され、ＳＨ２間領域のいずれかの端部からのアミノ酸の
欠失によって、結合ＰＩ３−キナーゼ活性の量が徐々に
減少する。ＳＨ２間構造を分裂させることは、恐らく、
推定ドメインを不安定化させ、タンパク質間相互作用を
妨げる。更に、その結果によって、ｐ８５αのＳＨ２間
ドメインの残基４５１−５５５間の１０４アミノ酸の構
造要素、即ち、ｐ１１０タンパク質と会合ＰＩ３−キナ
ーゼ活性に直接に結合可能な要素が明らかになった（図
４，Ｂ，レーン６）。
され、ＳＨ２間領域のいずれかの端部からのアミノ酸の
欠失によって、結合ＰＩ３−キナーゼ活性の量が徐々に
減少する。ＳＨ２間構造を分裂させることは、恐らく、
推定ドメインを不安定化させ、タンパク質間相互作用を
妨げる。更に、その結果によって、ｐ８５αのＳＨ２間
ドメインの残基４５１−５５５間の１０４アミノ酸の構
造要素、即ち、ｐ１１０タンパク質と会合ＰＩ３−キナ
ーゼ活性に直接に結合可能な要素が明らかになった（図
４，Ｂ，レーン６）。
【００８９】更に、Ｎ−末端ＳＨ２ドメインの３’端部
からＣ−末端ＳＨ２ドメインの５’端部へのＧＳＴｐ８
５βの一連の組欠失を、ＳＨ２領域内における結合位置
を特定するために構成した。つぎに、これらのＧＳＴ融
合タンパク質とｐ１１０との間の相互作用を、上述の方
法によって測定した。
からＣ−末端ＳＨ２ドメインの５’端部へのＧＳＴｐ８
５βの一連の組欠失を、ＳＨ２領域内における結合位置
を特定するために構成した。つぎに、これらのＧＳＴ融
合タンパク質とｐ１１０との間の相互作用を、上述の方
法によって測定した。
【００９０】ＧＳＴ ｐ８５β 融合タンパク質の構造
全長ｐ８５β、ｐ８５β（４４５−７２４）、ｐ８５β
（４８６−７２４）及びｐ８５β（５１６−７２４）が
Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．１９９２に記載されて
いる。図５参照。ｐ８５β△４８６−５１６を求めるた
めに、ＧＳＴｐ８５β（１−７２４）をＢａｍＩＩＩ及
びＢｇＩＩＩと消化し、フラグメント残基４８６−５１
６を除去し、次に自己結合させた。ｐ８５β△４４５−
４８５及びｐ８５β△４４５−４６９を、ｐ８５β ｃ
ＤＮＡからの二つのＰＣＴ生成物（ｐ８５β△４４５−
４８５用としてＰ３と、ｐ８５β△４４５−４６９用と
してＰ４）を増幅することによって構成した。Ｐ３は、
ヌクレオチド１４５７−１９６６を、そしてＰ４はヌク
レオチド１４０８−１９６６を包囲し、両方が５’端部
に導入されたＡｃｃＩを有していた。Ｐ３とＰ４との両
方を、ＡｃｃＩとＫｐｎＩとによって消化し、次に、Ａ
ｃｃＩ及びＫｐｎＩ消化ＧＳＴｐ８５β１−７２４にそ
れぞれ結合させた。
（４８６−７２４）及びｐ８５β（５１６−７２４）が
Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．１９９２に記載されて
いる。図５参照。ｐ８５β△４８６−５１６を求めるた
めに、ＧＳＴｐ８５β（１−７２４）をＢａｍＩＩＩ及
びＢｇＩＩＩと消化し、フラグメント残基４８６−５１
６を除去し、次に自己結合させた。ｐ８５β△４４５−
４８５及びｐ８５β△４４５−４６９を、ｐ８５β ｃ
ＤＮＡからの二つのＰＣＴ生成物（ｐ８５β△４４５−
４８５用としてＰ３と、ｐ８５β△４４５−４６９用と
してＰ４）を増幅することによって構成した。Ｐ３は、
ヌクレオチド１４５７−１９６６を、そしてＰ４はヌク
レオチド１４０８−１９６６を包囲し、両方が５’端部
に導入されたＡｃｃＩを有していた。Ｐ３とＰ４との両
方を、ＡｃｃＩとＫｐｎＩとによって消化し、次に、Ａ
ｃｃＩ及びＫｐｎＩ消化ＧＳＴｐ８５β１−７２４にそ
れぞれ結合させた。
【００９１】ＳＨ２領域の大半を含有する、全長ＧＳＴ
ｐ８５β（１−７２４）及びＧＳＴｐ８５β（４４５−
７２４）は、ＰＩ３−キナーゼ活性に結合可能であるこ
とが明らかであった（図５，Ｂ，レーン１及び２参
照）。しかしながら、ＧＳＴｐ８５β（４８６−７２
４）やＧＳＴｐ８５β（５１６−７２４）の欠失等の、
ＳＨ２領域内に進行する欠失を備えた突然変異体はＰＩ
３−キナーゼ活性に結合することが出来なかった（図
５，Ｂ，レーン３および４参照）。これらの結果は、ｐ
８５βの７１アミノ酸領域（残基４４５−５１６）が、
ｐ８５βタンパク質とｐ１１０との間の相互作用に関係
していることを示している。
ｐ８５β（１−７２４）及びＧＳＴｐ８５β（４４５−
７２４）は、ＰＩ３−キナーゼ活性に結合可能であるこ
とが明らかであった（図５，Ｂ，レーン１及び２参
照）。しかしながら、ＧＳＴｐ８５β（４８６−７２
４）やＧＳＴｐ８５β（５１６−７２４）の欠失等の、
ＳＨ２領域内に進行する欠失を備えた突然変異体はＰＩ
３−キナーゼ活性に結合することが出来なかった（図
５，Ｂ，レーン３および４参照）。これらの結果は、ｐ
８５βの７１アミノ酸領域（残基４４５−５１６）が、
ｐ８５βタンパク質とｐ１１０との間の相互作用に関係
していることを示している。
【００９２】ｐ８５β内における結合位置をより正確に
調べるために、この領域、例えば、ＧＳＴ−８５β△４
８６−５１６、ＧＳＴ−８５β△４４５−４８５及びＧ
ＳＴ−８５β△４４５−４６９、において欠失を有する
突然変異体を構成した（図５，Ａ、突然変異体５，６及
び７参照）。これらの突然変異体の機能を上述の方法で
分析した。結合後、ＰＩ３−キナーゼ活性は、ＧＳＴ−
８５β△４８６−５１６とＧＳＴ−８５β△４４５−４
６９との両方が、野生型のＧＳＴｐ８５βと比較して、
約６５％のＰＩ３−キナーゼ活性とまだ結合可能である
ことを示した（図５，Ｂ，レーン５及び７参照）。しか
しながら、欠失突然変異体ＧＳＴ−８５β△４４５−４
８５（ｐ８５αにおける残基４５２−４９２と相同）
は、検出可能なＰＩ３−キナーゼ活動と結合することは
出来なかった（図５，Ｂ，レーン６参照）。従って、Ｐ
Ｉ３−キナーゼのｐ８５βへの結合には４０アミノ酸領
域が必須であると確定された。
調べるために、この領域、例えば、ＧＳＴ−８５β△４
８６−５１６、ＧＳＴ−８５β△４４５−４８５及びＧ
ＳＴ−８５β△４４５−４６９、において欠失を有する
突然変異体を構成した（図５，Ａ、突然変異体５，６及
び７参照）。これらの突然変異体の機能を上述の方法で
分析した。結合後、ＰＩ３−キナーゼ活性は、ＧＳＴ−
８５β△４８６−５１６とＧＳＴ−８５β△４４５−４
６９との両方が、野生型のＧＳＴｐ８５βと比較して、
約６５％のＰＩ３−キナーゼ活性とまだ結合可能である
ことを示した（図５，Ｂ，レーン５及び７参照）。しか
しながら、欠失突然変異体ＧＳＴ−８５β△４４５−４
８５（ｐ８５αにおける残基４５２−４９２と相同）
は、検出可能なＰＩ３−キナーゼ活動と結合することは
出来なかった（図５，Ｂ，レーン６参照）。従って、Ｐ
Ｉ３−キナーゼのｐ８５βへの結合には４０アミノ酸領
域が必須であると確定された。
【００９３】ｐ１１０タンパク質への結合にｐ８５αの
類似の領域が関係しているか否かを調べるために、ｐ８
５βにおいて生成されたものと相同の欠失を構成し（図
５，Ａ，突然変異体１０参照）、そのＰＩ３−キナーゼ
活性に対する結合能力を分析した。この欠失突然変異体
ＧＳＴｐ８５α−ＮＣ２△４７８−５１３（ｐ８５βの
アミノ酸残基４７１−５０１と相同）は、欠失の無い類
似の構造体ＧＳＴｐ８５αＮＣ（図５、Ｂ，レーン９参
照）と比較して、ＰＩ３−キナーゼ活性と結合すること
は出来なかった（図５、Ｂ，レーン１０参照）。これら
の結果は、ｐ１１０触媒サブユニットの結合を仲介する
のに必要なｐ８５αにおける３５アミノ酸領域を特定す
るものである。従って、ｐ８５αのアミノ酸残基４７８
−５１３とｐ８５βのアミノ酸残基４４５−４８５と
が、ｐ１１０とＰＩ３−キナーゼ活性の結合に必須であ
る。
類似の領域が関係しているか否かを調べるために、ｐ８
５βにおいて生成されたものと相同の欠失を構成し（図
５，Ａ，突然変異体１０参照）、そのＰＩ３−キナーゼ
活性に対する結合能力を分析した。この欠失突然変異体
ＧＳＴｐ８５α−ＮＣ２△４７８−５１３（ｐ８５βの
アミノ酸残基４７１−５０１と相同）は、欠失の無い類
似の構造体ＧＳＴｐ８５αＮＣ（図５、Ｂ，レーン９参
照）と比較して、ＰＩ３−キナーゼ活性と結合すること
は出来なかった（図５、Ｂ，レーン１０参照）。これら
の結果は、ｐ１１０触媒サブユニットの結合を仲介する
のに必要なｐ８５αにおける３５アミノ酸領域を特定す
るものである。従って、ｐ８５αのアミノ酸残基４７８
−５１３とｐ８５βのアミノ酸残基４４５−４８５と
が、ｐ１１０とＰＩ３−キナーゼ活性の結合に必須であ
る。
【００９４】例 ６
ｐ８５結合領域に生体外分析を行って、ＰＩ３−キナー
ゼの野生型と突然変異体ｐ８５αとの生体内会合を調べ
た。全長ｐ８５αと、その結合位置（ｐ８５α△４７８
−５１３）内に欠失を有する突然変異体ｐ８５αを、マ
ウス−Ｌ細胞において一時発現させるために構成した。
ゼの野生型と突然変異体ｐ８５αとの生体内会合を調べ
た。全長ｐ８５αと、その結合位置（ｐ８５α△４７８
−５１３）内に欠失を有する突然変異体ｐ８５αを、マ
ウス−Ｌ細胞において一時発現させるために構成した。
【００９５】野生型ウシｐ８５α（Ｗｐ８５α）の発現
用のＳＲαプラスミド（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．１
９８８）、または、ｐ１１０用の結合場所を有さない突
然変異体ウシ全長ｐ８５α（ｐ８５α△４７８−５１
３）を記載の方法で構成し（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．刊
行物として提出）、それぞれ、ＳＲα−Ｗｐ８５α
（Ｗ）及びＳＲαｐ８５α△４７８−５１３（Ｍ）と指
定した。半集密性マウスＬ−細胞を、ＤＥＡＥデキスト
ラン法を使用して、１０μｇのＳＲα−Ｗｐ８５αまた
はＳＲαｐ８５△４７８−５１３プラスミドとトランス
フェクション感染させた。６０時間後、２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ（ｐＨ７．６）、１％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ）Ｐ−４０、１０％のグリセロール、１３７ｍＭのＮ
ａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍ
ＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのオルトバナデ
ートナトリウム塩、それに、タンパク質−Ｇアガロース
に結合したマウスｐ８５α（Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ
ａｌ．１９９２）の認識不能なａｎｔｉ−ｐ８５αモノ
クローナル抗体（Ｇ１２）２μｇと免疫沈降した一時発
現ウシｐ８５αを含有するバッファ内で、細胞を溶離し
た。次に、これらのサンプルを、ｐ８５αのＣ末端を認
識するポリクローナル抗体を使用したウェスタン・ブロ
ッティング又はＰＩ３−キナーゼ分析によって分析し
た。
用のＳＲαプラスミド（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．１
９８８）、または、ｐ１１０用の結合場所を有さない突
然変異体ウシ全長ｐ８５α（ｐ８５α△４７８−５１
３）を記載の方法で構成し（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．刊
行物として提出）、それぞれ、ＳＲα−Ｗｐ８５α
（Ｗ）及びＳＲαｐ８５α△４７８−５１３（Ｍ）と指
定した。半集密性マウスＬ−細胞を、ＤＥＡＥデキスト
ラン法を使用して、１０μｇのＳＲα−Ｗｐ８５αまた
はＳＲαｐ８５△４７８−５１３プラスミドとトランス
フェクション感染させた。６０時間後、２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ（ｐＨ７．６）、１％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ）Ｐ−４０、１０％のグリセロール、１３７ｍＭのＮ
ａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍ
ＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのオルトバナデ
ートナトリウム塩、それに、タンパク質−Ｇアガロース
に結合したマウスｐ８５α（Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ
ａｌ．１９９２）の認識不能なａｎｔｉ−ｐ８５αモノ
クローナル抗体（Ｇ１２）２μｇと免疫沈降した一時発
現ウシｐ８５αを含有するバッファ内で、細胞を溶離し
た。次に、これらのサンプルを、ｐ８５αのＣ末端を認
識するポリクローナル抗体を使用したウェスタン・ブロ
ッティング又はＰＩ３−キナーゼ分析によって分析し
た。
【００９６】図６，Ａは、同等量の野生型（Ｗ）と突然
変異体ｐ８５α（Ｍ）とがこれらの細胞から免疫沈降さ
れたことを示しており（レーン２及び３参照）、トラン
スフェクション感染されていない対照マウス細胞（ＮＭ
Ｇ）（レーン１）からは外生マウスｐ８５αは免疫沈降
されなかった。しかしながら、ＰＩ３−キナーゼ活性
は、野生型ｐ８５αとのみ会合することが判り（図６、
Ｂ、レーン３参照）、突然変異体ｐ８５α（図６、Ｂ、
レーン４参照）、あるいは、トランスフェクション感染
されていない細胞（図６、Ｂ、レーン１参照）の免疫沈
降においてはＰＩ３−キナーゼ活性は観察されない。
変異体ｐ８５α（Ｍ）とがこれらの細胞から免疫沈降さ
れたことを示しており（レーン２及び３参照）、トラン
スフェクション感染されていない対照マウス細胞（ＮＭ
Ｇ）（レーン１）からは外生マウスｐ８５αは免疫沈降
されなかった。しかしながら、ＰＩ３−キナーゼ活性
は、野生型ｐ８５αとのみ会合することが判り（図６、
Ｂ、レーン３参照）、突然変異体ｐ８５α（図６、Ｂ、
レーン４参照）、あるいは、トランスフェクション感染
されていない細胞（図６、Ｂ、レーン１参照）の免疫沈
降においてはＰＩ３−キナーゼ活性は観察されない。
【００９７】例 ７
ＰＩ３−キナーゼ活性への結合の原因となるｐ８５α及
びｐ８５βの臨界領域の特定後、ｐ８５α及びｐ８５β
と相互作用するｐ１１０の比較領域の研究を行った。様
々なｐ１１０の領域を包囲するＧＳＴｐ１１０融合タン
パク質を準備した（図７、Ａ参照）。そして、昆虫細胞
発現システムに発現されるｐ８５に結合するこれらのｐ
１１０融合タンパク質の能力を評価した。
びｐ８５βの臨界領域の特定後、ｐ８５α及びｐ８５β
と相互作用するｐ１１０の比較領域の研究を行った。様
々なｐ１１０の領域を包囲するＧＳＴｐ１１０融合タン
パク質を準備した（図７、Ａ参照）。そして、昆虫細胞
発現システムに発現されるｐ８５に結合するこれらのｐ
１１０融合タンパク質の能力を評価した。
【００９８】ＧＳＴ−ｐ１１０融合タンパク質の構造
アミノ酸１−１２８（ｐ１１０−１）、１２３−４５８
（ｐ１１０−２）、５７７−１０６８（ｐ１１０−
３）、６０１−９６０（ｐ１１０−４）、７６０−９６
０（ｐ１１０−５）、７６０−１０６９（ｐ１１０−
６）、１−４９（ｐ１１０−１．１）、１−８１（ｐ１
１０−１．２）、１−１０８（ｐ１１０−１．３）、２
０−８１（ｐ１１０−１．４）、および２０−１０８
（ｐ１１０−１．５）に対応するｐ１１０ ｃＤＮＡの
領域（Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）をＰＣＲに
よって増幅した。クローン化を容易にするために、Ｂａ
ｍＩＩＩとＥｃｏＲＩとを、５’および３’オリゴヌク
レチドにそれぞれ添加した。増幅後、ＰＣＲ生成物がＢ
ａｍＩＩＩとＥｃｏＲＩとともに切断され、ｐＧＥＸ−
２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ結合された。アミノ酸１
−３５（ｐ１１０−１．６）及び３７−１２８（ｐ１１
０−１．７）発現のＧＳＴ融合構成物は、以下から構成
された。プラスミドｐ１１０−１．６のために、ｐ１１
０−１がＢａｍＩＩＩ及びＥｃｏＲＩと消化され、その
端部を、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼによる処理によっ
て平滑に切断し、このプラスミドをＴ４ ＤＮＡリガー
ゼによって環状にした。プラスミドｐ１１０−１．７の
ために、ｐ１１０−１がＢａｍＩＩＩと消化され、その
端部を、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼによる処理によっ
て平滑に切断した。両端部にはＢｇＩＩＩリンカー（１
２−ｍｅｒｓ： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）が添加され、プラスミドを更にＢａｍＩＩＩで制
限した。プラスミド含有バンドをゲル精製し、このプラ
スミドをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって環状にした。発
現構造体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）で形質転換された。グルタチオンＳ−
トランスファラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の発現
は、前述の方法によって行った（Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈ
ｎｓｏｎ，１９８８）。
（ｐ１１０−２）、５７７−１０６８（ｐ１１０−
３）、６０１−９６０（ｐ１１０−４）、７６０−９６
０（ｐ１１０−５）、７６０−１０６９（ｐ１１０−
６）、１−４９（ｐ１１０−１．１）、１−８１（ｐ１
１０−１．２）、１−１０８（ｐ１１０−１．３）、２
０−８１（ｐ１１０−１．４）、および２０−１０８
（ｐ１１０−１．５）に対応するｐ１１０ ｃＤＮＡの
領域（Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）をＰＣＲに
よって増幅した。クローン化を容易にするために、Ｂａ
ｍＩＩＩとＥｃｏＲＩとを、５’および３’オリゴヌク
レチドにそれぞれ添加した。増幅後、ＰＣＲ生成物がＢ
ａｍＩＩＩとＥｃｏＲＩとともに切断され、ｐＧＥＸ−
２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ結合された。アミノ酸１
−３５（ｐ１１０−１．６）及び３７−１２８（ｐ１１
０−１．７）発現のＧＳＴ融合構成物は、以下から構成
された。プラスミドｐ１１０−１．６のために、ｐ１１
０−１がＢａｍＩＩＩ及びＥｃｏＲＩと消化され、その
端部を、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼによる処理によっ
て平滑に切断し、このプラスミドをＴ４ ＤＮＡリガー
ゼによって環状にした。プラスミドｐ１１０−１．７の
ために、ｐ１１０−１がＢａｍＩＩＩと消化され、その
端部を、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼによる処理によっ
て平滑に切断した。両端部にはＢｇＩＩＩリンカー（１
２−ｍｅｒｓ： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）が添加され、プラスミドを更にＢａｍＩＩＩで制
限した。プラスミド含有バンドをゲル精製し、このプラ
スミドをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって環状にした。発
現構造体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）で形質転換された。グルタチオンＳ−
トランスファラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の発現
は、前述の方法によって行った（Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈ
ｎｓｏｎ，１９８８）。
【００９９】図７，Ｂは、６つの融合タンパク質ｐ１１
０．１−ｐ１１０．６の内、ｐ１１０．１のみが高い親
和性で、ｐ８５α（レーン１６）とｐ８５β（レーン１
７）とに結合することができたことを示している。対照
Ｓｆ９細胞溶離物においては結合は検出されず、その他
の構造体のいずれにおいてもいずれのサブユニットとの
結合も観察されなかった。このことは、ｐ１１０のアミ
ノ酸残基１−１２８からなる領域がｐ８５タンパク質に
対する結合箇所を有していることを示すものである。
０．１−ｐ１１０．６の内、ｐ１１０．１のみが高い親
和性で、ｐ８５α（レーン１６）とｐ８５β（レーン１
７）とに結合することができたことを示している。対照
Ｓｆ９細胞溶離物においては結合は検出されず、その他
の構造体のいずれにおいてもいずれのサブユニットとの
結合も観察されなかった。このことは、ｐ１１０のアミ
ノ酸残基１−１２８からなる領域がｐ８５タンパク質に
対する結合箇所を有していることを示すものである。
【０１００】ｐ１１０の最初の１２８アミノ酸の様々な
領域を包む７つの他のＧＳＴ融合タンパク質ｐ１１０−
１．１−ｐ１１０−１．７が構成された（図８参照）。
これらの内の、ｐ１１０−１．３とｐ１１０−１．５と
が、ｐ８５αとｐ８５βとの両方に結合した（図９，レ
ーン２０，２１及び１４，１５をそれぞれ参照）。その
他の構造体は、どれも、いずれのｐ８５サブユニットに
対しても結合能力を示さなかった。これらの結果は、ｐ
１１０のアミノ酸残基２０−１０８が、ｐ８５サブユニ
ットとの結合における最小構造体であることを示す。
領域を包む７つの他のＧＳＴ融合タンパク質ｐ１１０−
１．１−ｐ１１０−１．７が構成された（図８参照）。
これらの内の、ｐ１１０−１．３とｐ１１０−１．５と
が、ｐ８５αとｐ８５βとの両方に結合した（図９，レ
ーン２０，２１及び１４，１５をそれぞれ参照）。その
他の構造体は、どれも、いずれのｐ８５サブユニットに
対しても結合能力を示さなかった。これらの結果は、ｐ
１１０のアミノ酸残基２０−１０８が、ｐ８５サブユニ
ットとの結合における最小構造体であることを示す。
【０１０１】例 ８
ｐ８５とｐ１１０サブユニットの結合領域に基づいて、
ＳＨ２間領域の構造を更に調べた。ＳＨ２間領域は、主
にその性質がα−ヘリカルであり、４つのヘリカル束が
存在しているかもしれないことが示唆されている（Ｐａ
ｎａｙｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＳＨ２間
領域の配列を、Ｏｗｌ １９．０データベースにおいて
アミノ酸配列をサーチするのに使用した（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｌｕｂ， Ｌｅｅｄｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕ．Ｋ．）。上から２０番目
までの内の１２の対が、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ領域を
有するタンパク質ミオシン又はパラミオシンからの配列
を有していた。上位５対は、ｐ８５のイソフォーム（イ
ソ型タンパク質）を備えていた。一列配置されたアミノ
酸配列間における百分率配列一致は比較的低く、しばし
ばヘプタッド反復が一列配列されていた。
ＳＨ２間領域の構造を更に調べた。ＳＨ２間領域は、主
にその性質がα−ヘリカルであり、４つのヘリカル束が
存在しているかもしれないことが示唆されている（Ｐａ
ｎａｙｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＳＨ２間
領域の配列を、Ｏｗｌ １９．０データベースにおいて
アミノ酸配列をサーチするのに使用した（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｌｕｂ， Ｌｅｅｄｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕ．Ｋ．）。上から２０番目
までの内の１２の対が、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ領域を
有するタンパク質ミオシン又はパラミオシンからの配列
を有していた。上位５対は、ｐ８５のイソフォーム（イ
ソ型タンパク質）を備えていた。一列配置されたアミノ
酸配列間における百分率配列一致は比較的低く、しばし
ばヘプタッド反復が一列配列されていた。
【０１０２】タンパク質構造に関するブルックヘーブン
・データバンクのアミノ酸配列（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ
ｅｔ ａｌ．，１９７７）もサーチした。類似している
ことが判った上位３配列の内の２つは、その構造が１５
オングストローム分解に分解された２ストランドα−ヘ
リカルｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ筋肉タンパク質であるト
ロポミオシンを備えていた（Ｐｈｉｌｉｐｓ ｅｔ ａ
ｌ．１９７９）。同様に、トロポミオシンに一致するア
ミノ酸配列はきわめて低かった（１７５以上のアミノ酸
残基中において２０％）が、ＳＨ２間領域におけるヘプ
タッド反復及びトロポミオシンのそれは、配置のかなり
の部分において一致していた。トロポミオシンの配列分
析（Ｈｏｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７２； Ｐａｒ
ｒｙ，１９７５； ＭｃＬａｃｈｌａｎ及びＳｔｅｗａ
ｒｔ，１９７９）は、残基ａ及びｄが疎水性残基として
保存されたヘプタッド反復のこわされていない列（ａ，
ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ）ｎを示しており、これはその構造
が ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌのα−ヘリックスである可
能性があることを示唆している。ｐ８５αおよびｐ８５
βのヘリカルドメインのより古い配列分析（Ｐａｎａｙ
ｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２ その全内容をここ
に組み入れる）は、ａおよびｄが疎水性である形状の二
つの長いこわされていないヘプタッド反復（ａ，ｂ，
ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ）ｎの存在を示した。
・データバンクのアミノ酸配列（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ
ｅｔ ａｌ．，１９７７）もサーチした。類似している
ことが判った上位３配列の内の２つは、その構造が１５
オングストローム分解に分解された２ストランドα−ヘ
リカルｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ筋肉タンパク質であるト
ロポミオシンを備えていた（Ｐｈｉｌｉｐｓ ｅｔ ａ
ｌ．１９７９）。同様に、トロポミオシンに一致するア
ミノ酸配列はきわめて低かった（１７５以上のアミノ酸
残基中において２０％）が、ＳＨ２間領域におけるヘプ
タッド反復及びトロポミオシンのそれは、配置のかなり
の部分において一致していた。トロポミオシンの配列分
析（Ｈｏｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７２； Ｐａｒ
ｒｙ，１９７５； ＭｃＬａｃｈｌａｎ及びＳｔｅｗａ
ｒｔ，１９７９）は、残基ａ及びｄが疎水性残基として
保存されたヘプタッド反復のこわされていない列（ａ，
ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ）ｎを示しており、これはその構造
が ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌのα−ヘリックスである可
能性があることを示唆している。ｐ８５αおよびｐ８５
βのヘリカルドメインのより古い配列分析（Ｐａｎａｙ
ｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２ その全内容をここ
に組み入れる）は、ａおよびｄが疎水性である形状の二
つの長いこわされていないヘプタッド反復（ａ，ｂ，
ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ）ｎの存在を示した。
【０１０３】ｐ８５のＳＨ２間領域におけるヘプタッド
反復と、その、トロポミオシン、パラミオシン、ミオシ
ン等のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ配列を備えたアミノ酸配
列の類似性は、ドメインが ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌの
α−ヘリックスから構成されていることを示唆するもの
である。ＳＨ２間領域の更なる分析は、その配列が、二
つの７０−残基α−ヘリックスのアンチ−パラレルｃｏ
ｉｌｅｄ−ｃｏｉｌである構造と一致していることを示
した（ｐ８５αにおける残基４４１−５１２及び５１８
−５８８）（図１０及び図１１参照）。
反復と、その、トロポミオシン、パラミオシン、ミオシ
ン等のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ配列を備えたアミノ酸配
列の類似性は、ドメインが ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌの
α−ヘリックスから構成されていることを示唆するもの
である。ＳＨ２間領域の更なる分析は、その配列が、二
つの７０−残基α−ヘリックスのアンチ−パラレルｃｏ
ｉｌｅｄ−ｃｏｉｌである構造と一致していることを示
した（ｐ８５αにおける残基４４１−５１２及び５１８
−５８８）（図１０及び図１１参照）。
【０１０４】ｐ８５α及びｐ８５βタンパク質における
欠失を互いに比較し、これに対応する活性損失と考慮し
た場合、ｐ８５αのｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ残基４７８
−４９２のヘリックス−１の内の４分割の内の第三番目
が、ＰＩ３−キナーゼ活性と結合できない欠失突然変異
体のおいては存在しない二つのｐ８５タンパク質の間の
共通領域であることが判明した（図１０，Ａ参照）。ｐ
８５αのヘリックス−１の上半分、残基４５２−４７６
（図１０，Ｄ参照）、又はｐ８５αのヘリックス−１の
下の四分の１の残基４９２−５２３（図１０，Ｃ参照）
のいずれかを除去する欠失は、前記コイル状構造体を不
安定化し、ｐ１１０タンパク質との会合の障害となる
が、その結合を完全に抑制するものではない。ｐ８５α
の残基４７８−４９２が除去された場合にのみ、機能の
完全な損失が観察され（図１０，Ｂ参照）、ｐ１１０タ
ンパク質がｐ８５と結合しないことが判る。
欠失を互いに比較し、これに対応する活性損失と考慮し
た場合、ｐ８５αのｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ残基４７８
−４９２のヘリックス−１の内の４分割の内の第三番目
が、ＰＩ３−キナーゼ活性と結合できない欠失突然変異
体のおいては存在しない二つのｐ８５タンパク質の間の
共通領域であることが判明した（図１０，Ａ参照）。ｐ
８５αのヘリックス−１の上半分、残基４５２−４７６
（図１０，Ｄ参照）、又はｐ８５αのヘリックス−１の
下の四分の１の残基４９２−５２３（図１０，Ｃ参照）
のいずれかを除去する欠失は、前記コイル状構造体を不
安定化し、ｐ１１０タンパク質との会合の障害となる
が、その結合を完全に抑制するものではない。ｐ８５α
の残基４７８−４９２が除去された場合にのみ、機能の
完全な損失が観察され（図１０，Ｂ参照）、ｐ１１０タ
ンパク質がｐ８５と結合しないことが判る。
【０１０５】両方のｐ８５タンパク質の配列分析は、ｐ
８５αの残基４７８−４９２が、一つの保守アミノ酸変
化を除いたアミノ酸レベルにおける二つのタンパク質間
において、同等の三つのヘプタッド反復（ｐ８５αの残
基４７０−４９７）に含まれていることを示している
（図１０，Ａ参照）。ｐ８５αの残基４７０−４９７の
合成ペプチドを、セファロースビーズと化学的に結合さ
せたが、ｐ１１０及びＰＩ３−キナーゼ活性に結合させ
ることは出来なかった。ｐ８５欠失突然変異体のｐ１１
０結合特性の分析は、ＳＨ２間領域のヘリックス−１が
主としてＰＩ３−キナーゼ複合体の二つのサブユニット
間の相互作用の原因となっている一方、ヘリックス２は
恐らくヘリックス−１の折り畳みのための構造要素を提
供していることを示唆している。安定した構造体を生成
するためには、ｐ８５およびｐ１１０サブユニット間の
相互作用のために、恐らく、ｐ８５αのヘリックス−１
の４７０−４９７に対応する領域と、ヘリックス２の隣
接領域とが必要である。
８５αの残基４７８−４９２が、一つの保守アミノ酸変
化を除いたアミノ酸レベルにおける二つのタンパク質間
において、同等の三つのヘプタッド反復（ｐ８５αの残
基４７０−４９７）に含まれていることを示している
（図１０，Ａ参照）。ｐ８５αの残基４７０−４９７の
合成ペプチドを、セファロースビーズと化学的に結合さ
せたが、ｐ１１０及びＰＩ３−キナーゼ活性に結合させ
ることは出来なかった。ｐ８５欠失突然変異体のｐ１１
０結合特性の分析は、ＳＨ２間領域のヘリックス−１が
主としてＰＩ３−キナーゼ複合体の二つのサブユニット
間の相互作用の原因となっている一方、ヘリックス２は
恐らくヘリックス−１の折り畳みのための構造要素を提
供していることを示唆している。安定した構造体を生成
するためには、ｐ８５およびｐ１１０サブユニット間の
相互作用のために、恐らく、ｐ８５αのヘリックス−１
の４７０−４９７に対応する領域と、ヘリックス２の隣
接領域とが必要である。
【０１０６】表１は、ヘプタッド反復の各位置における
２０のアミノ酸のそれぞれの発生率を示す。この表は更
に、ヘプタッド反復の７つの位置のそれぞれにおいて発
生する、無極性（Ａｌａ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｖ
ａｌ，ＰｈｅおよびＴｙｒ）、ベーシック（塩基性）及
び酸性残基の率も示している。表１は、更に、ｐ８５の
ＳＨ２間ドメインにおける二つの予想ヘリックスが、２
−ストランドα繊維性タンパク質と多くの共通した特徴
を有していることを示している（Ｔａｂｌｅｓ，Ｃｏｎ
ｗａｙ及びＰａｒｒｙ，１９９０参照）。
２０のアミノ酸のそれぞれの発生率を示す。この表は更
に、ヘプタッド反復の７つの位置のそれぞれにおいて発
生する、無極性（Ａｌａ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｖ
ａｌ，ＰｈｅおよびＴｙｒ）、ベーシック（塩基性）及
び酸性残基の率も示している。表１は、更に、ｐ８５の
ＳＨ２間ドメインにおける二つの予想ヘリックスが、２
−ストランドα繊維性タンパク質と多くの共通した特徴
を有していることを示している（Ｔａｂｌｅｓ，Ｃｏｎ
ｗａｙ及びＰａｒｒｙ，１９９０参照）。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】前記ヘプタッド反復のａ及びｄの位置にお
いて、その残基の７５．６％は無極性である。ヘリック
スの外側位置（ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ）におけるアミノ酸
の４９％が荷電しているのに対し、位置ａ及びｄの残基
の僅かに１２％のみが荷電している。他のｃｏｉｌｅｄ
−ｃｏｉｌタンパク質と比較して、位置ａ，ｄのＩｌ
ｅ，ＰｈｅおよびＴｙｒの比率が比較的高い（Ｃｏｎｗ
ａｙ及びＰａｒｒｙ，１９９０）ことは、ｐ８５ヘリッ
クスがアンチーパラレルであるのに対し、他のｃｏｉｌ
ｅｄ−ｃｏｉｌタンパク質におけるヘリックスはパラレ
ルであるという可能性に関係しているかもしれない。
いて、その残基の７５．６％は無極性である。ヘリック
スの外側位置（ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ）におけるアミノ酸
の４９％が荷電しているのに対し、位置ａ及びｄの残基
の僅かに１２％のみが荷電している。他のｃｏｉｌｅｄ
−ｃｏｉｌタンパク質と比較して、位置ａ，ｄのＩｌ
ｅ，ＰｈｅおよびＴｙｒの比率が比較的高い（Ｃｏｎｗ
ａｙ及びＰａｒｒｙ，１９９０）ことは、ｐ８５ヘリッ
クスがアンチーパラレルであるのに対し、他のｃｏｉｌ
ｅｄ−ｃｏｉｌタンパク質におけるヘリックスはパラレ
ルであるという可能性に関係しているかもしれない。
【０１０９】ｐ８５及びｐ１１０タンパク質間の結合は
非常に親和性が高く、ＰＩ３−キナーゼ複合体の解離と
なる適当な状態は達成されていない（Ｆｒｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２， Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，１９９
３）。更に、これら二つのサブユニット間の相互作用
が、ホスホチロシンの存在とは無関係であることも知ら
れており（Ｒ．Ｄｈａｎｄ，未出版）、ｐ８５タンパク
質のための結合コンセンサスを提供するようなｐ１１０
領域の富プロリンモチーフは存在しない。Ｌｅａｄｓ
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｅｌｉｏｐｏ
ｕｌｏｓ，１９８９）を使用した二次的構造予想によれ
ば、ｐ１１０タンパク質に直接結合することが証明され
ているＮ−末端１２０残基の約６０％が、α−ヘリカル
形質転換を受け、約２０％がβシート形質転換を受ける
であろうことが予測されている。従って、ｐ１１０のＮ
−末端領域は、α／β領域から構成され、そこで、前記
α−ヘリクッスはｐ８５のＳＨ２間領域との相互作用を
形成する可能性がある。ｐ８５αにおける主な結合位置
は、ヘリックス−１の残基４７８−４９２の間であると
考えられるので、この領域に、Ｍｅｔ−４７９（図１
０、Ｃにおける位置Ｃ）、Ａｌａ−４８３（図１０，Ｃ
における位置Ｇ）、そしてＡｌａ−４９６（図１０，Ｃ
における位置Ｃ）から形成される小さな疎水性ポケット
が存在していることが注目される。ｐ１１０のＮ−ｔｅ
ｒｍｉｎｕｓはその性質において約４８％疎水性である
ので、このポケットがｐ１１０タンパク質との高い親和
性相互作用の形成に重要な役割を果たしている可能性が
ある。
非常に親和性が高く、ＰＩ３−キナーゼ複合体の解離と
なる適当な状態は達成されていない（Ｆｒｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２， Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，１９９
３）。更に、これら二つのサブユニット間の相互作用
が、ホスホチロシンの存在とは無関係であることも知ら
れており（Ｒ．Ｄｈａｎｄ，未出版）、ｐ８５タンパク
質のための結合コンセンサスを提供するようなｐ１１０
領域の富プロリンモチーフは存在しない。Ｌｅａｄｓ
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｅｌｉｏｐｏ
ｕｌｏｓ，１９８９）を使用した二次的構造予想によれ
ば、ｐ１１０タンパク質に直接結合することが証明され
ているＮ−末端１２０残基の約６０％が、α−ヘリカル
形質転換を受け、約２０％がβシート形質転換を受ける
であろうことが予測されている。従って、ｐ１１０のＮ
−末端領域は、α／β領域から構成され、そこで、前記
α−ヘリクッスはｐ８５のＳＨ２間領域との相互作用を
形成する可能性がある。ｐ８５αにおける主な結合位置
は、ヘリックス−１の残基４７８−４９２の間であると
考えられるので、この領域に、Ｍｅｔ−４７９（図１
０、Ｃにおける位置Ｃ）、Ａｌａ−４８３（図１０，Ｃ
における位置Ｇ）、そしてＡｌａ−４９６（図１０，Ｃ
における位置Ｃ）から形成される小さな疎水性ポケット
が存在していることが注目される。ｐ１１０のＮ−ｔｅ
ｒｍｉｎｕｓはその性質において約４８％疎水性である
ので、このポケットがｐ１１０タンパク質との高い親和
性相互作用の形成に重要な役割を果たしている可能性が
ある。
【０１１０】ｐ８５タンパク質のＳＨ２間領域における
脂質−結合位置も明らかにされた。この領域を特定的に
認識する二つのモノクローナル抗体が、特にＰＩ ４，
５Ｐ 2〜ｐ８５サブユニットにおいて、燐脂質の結合を
抑制することが示された（Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９
９３）。アミノ酸配列分析は、ｐ８５αのＳＨ２間領域
において、プロフィリンやゲルソリン等において見られ
るものと類似し、これらのタンパク質にＰＩ ４，５Ｐ
2結合特性を与えることが示された、短いベーシックモ
チーフの存在を示している（Ｊａｍａｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。更
に、ｐ８５βにおいて相同残基がよく保存され、これ
は、それがこれらのタンパク質において調節的機能を果
たしていることを示唆している。ｐ８５タンパク質がＳ
Ｈ２間領域を介してｐ１１０と結合することが示されて
いるので、前記脂質結合位置は、恐らく、ＰＩ３−キナ
ーゼ、特にＰＩ ４，５Ｐ2用の基質結合ポケットの一
部を形成するものである。
脂質−結合位置も明らかにされた。この領域を特定的に
認識する二つのモノクローナル抗体が、特にＰＩ ４，
５Ｐ 2〜ｐ８５サブユニットにおいて、燐脂質の結合を
抑制することが示された（Ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９
９３）。アミノ酸配列分析は、ｐ８５αのＳＨ２間領域
において、プロフィリンやゲルソリン等において見られ
るものと類似し、これらのタンパク質にＰＩ ４，５Ｐ
2結合特性を与えることが示された、短いベーシックモ
チーフの存在を示している（Ｊａｍａｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。更
に、ｐ８５βにおいて相同残基がよく保存され、これ
は、それがこれらのタンパク質において調節的機能を果
たしていることを示唆している。ｐ８５タンパク質がＳ
Ｈ２間領域を介してｐ１１０と結合することが示されて
いるので、前記脂質結合位置は、恐らく、ＰＩ３−キナ
ーゼ、特にＰＩ ４，５Ｐ2用の基質結合ポケットの一
部を形成するものである。
【０１１１】例 ９
ＰＩ３−キナーゼのサブユニット間相互作用の研究に加
えて、ラット肝臓ＰＩ３−キナーゼにおいてタンパク質
セリン／トレオニンキナーゼ活性も報告されている（Ｃ
ａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。しかし
ながら、この研究は、この活性が、固く結合した細胞酵
素を示すものなのか、あるいは、ＰＩ３−キナーゼ複合
体の要素に内在するものかについては開示していない。
実際には、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒは、セリンキナーゼ活性
はＰＩ３−キナーゼと物理的に関連してはいるが、ＰＩ
３−キナーゼから識別不能であることを示唆している。
ｃＤＮＡクローン化と、それに続く前記酵素の二つのサ
ブユニットの発現のプロセスによって、会合セリンキナ
ーゼのより詳細な研究が可能になった。これらの研究を
次に詳述する。
えて、ラット肝臓ＰＩ３−キナーゼにおいてタンパク質
セリン／トレオニンキナーゼ活性も報告されている（Ｃ
ａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。しかし
ながら、この研究は、この活性が、固く結合した細胞酵
素を示すものなのか、あるいは、ＰＩ３−キナーゼ複合
体の要素に内在するものかについては開示していない。
実際には、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒは、セリンキナーゼ活性
はＰＩ３−キナーゼと物理的に関連してはいるが、ＰＩ
３−キナーゼから識別不能であることを示唆している。
ｃＤＮＡクローン化と、それに続く前記酵素の二つのサ
ブユニットの発現のプロセスによって、会合セリンキナ
ーゼのより詳細な研究が可能になった。これらの研究を
次に詳述する。
【０１１２】昆虫細胞（Ｓｆ９）を、ｐ８５α又はｐ８
５βのいずれかの単体の発現を仲介するバキュロウィル
スによって感染させるか、あるいは、ｐ１１０発現のウ
ィルスと共同感染させた。これらのｐ８５α／ｐ１１０
およびｐ８５β／ｐ１１０複合体を、ｐ８５又はｐ１１
０サブユニットのいずれかを対象とする抗体で免疫沈降
させるか、あるいは、これらの複合体を、Ｙ751ホスホ
ペプチド親和性カラムに固定した（Ｏｔｓｕ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１； Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９
２）。固定されたタンパク質を次にタンパク質キナーゼ
分析に使用した。
５βのいずれかの単体の発現を仲介するバキュロウィル
スによって感染させるか、あるいは、ｐ１１０発現のウ
ィルスと共同感染させた。これらのｐ８５α／ｐ１１０
およびｐ８５β／ｐ１１０複合体を、ｐ８５又はｐ１１
０サブユニットのいずれかを対象とする抗体で免疫沈降
させるか、あるいは、これらの複合体を、Ｙ751ホスホ
ペプチド親和性カラムに固定した（Ｏｔｓｕ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１； Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９
２）。固定されたタンパク質を次にタンパク質キナーゼ
分析に使用した。
【０１１３】具体的には、Ｓｆ９細胞を、野生型ウィル
ス（図１２，レーン１−４）；ｐ８５α（レーン５）；
ｐ８５β（レーン６）に感染させるか、あるいは、ｐ８
５α／ｐ１１０ウィルス（レーン７，８及び９）又はｐ
８５β／ｐ１１０ウィルス（レーン１０，１１及び１
２）と共同感染させた。これらの細胞の溶離物を、ｐ８
５αに対して飼養したポリクローナル、親和性精製抗体
（レーン１及び７）、ｐ８５βに対して飼養したモノク
ローナル抗体（レーン２及び１０）、ｐ１１０に対して
飼養した、あるいは固定Ｙ751ホスホペプチド（レーン
４，５，６，９及び１２）に固定したポリクローナル、
親和性精製抗体（レーン３，８及び１１）、を使用して
沈降させた。そして、これらのサンプルの生体外タンパ
ク質キナーゼ分析を行い、更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び
オートラジオグラフィによって分析した。
ス（図１２，レーン１−４）；ｐ８５α（レーン５）；
ｐ８５β（レーン６）に感染させるか、あるいは、ｐ８
５α／ｐ１１０ウィルス（レーン７，８及び９）又はｐ
８５β／ｐ１１０ウィルス（レーン１０，１１及び１
２）と共同感染させた。これらの細胞の溶離物を、ｐ８
５αに対して飼養したポリクローナル、親和性精製抗体
（レーン１及び７）、ｐ８５βに対して飼養したモノク
ローナル抗体（レーン２及び１０）、ｐ１１０に対して
飼養した、あるいは固定Ｙ751ホスホペプチド（レーン
４，５，６，９及び１２）に固定したポリクローナル、
親和性精製抗体（レーン３，８及び１１）、を使用して
沈降させた。そして、これらのサンプルの生体外タンパ
ク質キナーゼ分析を行い、更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び
オートラジオグラフィによって分析した。
【０１１４】その結果は、ｐ１１０が存在しない場合に
おいては、ｐ８５αとｐ８５βのいずれもが生体外にお
いて燐酸化されなかったことを示している（図１２参
照）（レーン５及び６）。しかしながら、前記昆虫細胞
が、ｐ１１０発現のウィルスと共同感染された場合にお
いては、ｐ８５αとｐ８５βタンパク質の両方が、該複
合体のいずれかのサブユニット（図１２，レーン７−８
および１０−１１）に対する抗体を使用した免疫沈降後
における、あるいは、前記ホスホペプチド・カラムへの
結合後（図１２，レーン９及び１２）の分析において、
かなり燐酸化されていることが判った。これらの状態に
おいて、ｐ１１０タンパク質はあまり燐酸化されず、い
ずれの抗体においても、又は、対照感染細胞からのホス
ホペプチド親和性ビーズにおいてはその他の燐酸化タン
パク質は検出されなかった（図１２，レーン１−４参
照）。
おいては、ｐ８５αとｐ８５βのいずれもが生体外にお
いて燐酸化されなかったことを示している（図１２参
照）（レーン５及び６）。しかしながら、前記昆虫細胞
が、ｐ１１０発現のウィルスと共同感染された場合にお
いては、ｐ８５αとｐ８５βタンパク質の両方が、該複
合体のいずれかのサブユニット（図１２，レーン７−８
および１０−１１）に対する抗体を使用した免疫沈降後
における、あるいは、前記ホスホペプチド・カラムへの
結合後（図１２，レーン９及び１２）の分析において、
かなり燐酸化されていることが判った。これらの状態に
おいて、ｐ１１０タンパク質はあまり燐酸化されず、い
ずれの抗体においても、又は、対照感染細胞からのホス
ホペプチド親和性ビーズにおいてはその他の燐酸化タン
パク質は検出されなかった（図１２，レーン１−４参
照）。
【０１１５】更に、ｐ８５α／ｐ１１０ウィルスと共同
感染させた昆虫細胞の溶離物を、ａｎｔｉ−８５ポリク
ローナル抗体を使用して免疫感染させた。次に、これら
のサンプルを、Ｍｎ2+とＭｇ2+との量を様々に変化させ
た状態でタンパク質キナーゼ分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
及びオートラジオグラフィによって分析した（データ図
示せず）。キナーゼ活性に対するＭｎ2+およびＭｇ2+の
存在の効果を比較するこれらの実験の結果は、キナーゼ
活性がＭｎ2+の存在に完全に依存していることを示し
た。これは、ラット肝臓から精製されたＰＩ３−キナー
ゼと会合することが発見されたセリンキナーゼ活性にお
いて金属イオンが必要であることと一致している（Ｃａ
ｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
感染させた昆虫細胞の溶離物を、ａｎｔｉ−８５ポリク
ローナル抗体を使用して免疫感染させた。次に、これら
のサンプルを、Ｍｎ2+とＭｇ2+との量を様々に変化させ
た状態でタンパク質キナーゼ分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
及びオートラジオグラフィによって分析した（データ図
示せず）。キナーゼ活性に対するＭｎ2+およびＭｇ2+の
存在の効果を比較するこれらの実験の結果は、キナーゼ
活性がＭｎ2+の存在に完全に依存していることを示し
た。これは、ラット肝臓から精製されたＰＩ３−キナー
ゼと会合することが発見されたセリンキナーゼ活性にお
いて金属イオンが必要であることと一致している（Ｃａ
ｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【０１１６】例 １０
Ｙ751ホスホペプチドを使用して親和性精製したＰＩ３
キナーゼ複合体のホスホアミノ酸分析も、この複合体に
関連するタンパク質キナーゼ活性の性質を調べるために
行った。親和性精製後、生体外燐酸化は、ｐ８５サブユ
ニットがホスホセリンのみを含有していることを示し
（図１３，Ａ参照）、これはカーペンターらの報告（Ｃ
ａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）に一致し
ている。同じ条件下において生体外でｐ１１０サブユニ
ットに取り込まれた燐酸のレベルは、低すぎてホスホア
ミノ酸分析は不可能であった。
キナーゼ複合体のホスホアミノ酸分析も、この複合体に
関連するタンパク質キナーゼ活性の性質を調べるために
行った。親和性精製後、生体外燐酸化は、ｐ８５サブユ
ニットがホスホセリンのみを含有していることを示し
（図１３，Ａ参照）、これはカーペンターらの報告（Ｃ
ａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）に一致し
ている。同じ条件下において生体外でｐ１１０サブユニ
ットに取り込まれた燐酸のレベルは、低すぎてホスホア
ミノ酸分析は不可能であった。
【０１１７】生体内におけるＰＩ３−キナーゼ複合体の
燐酸化状態を調べるために、昆虫細胞を、バキュロウィ
ルス発現で、32ｐ−ＰＯ4と代謝標識されたｐ８５α及
びｐ１１０と共同感染させた。これらの細胞の溶離物
を、Ｙ751ホスホペプチドビーズに固定し、次に洗浄し
て、ＳＤＳバッファ溶出タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル分析後のクーマシーブルー染色によって可視化し
た。これらのゲルのオートラジオグラフィは、クーマシ
ーブルー染色によって決まるタンパク質の存在量に対し
て、ｐ８５αに取り込まれた燐酸のレベルがｐ１１０に
取り込まれた燐酸のレベルよりもはるかに高いことを示
した（図１３，Ｂ，レーン１及び２）。ホスホアミノ酸
分析は、標識化を生体内で行った場合（図１３，Ｃｉ）
にｐ８５αはホスホセリンとホスホトレオニンとの両方
を含有するのに対して、ｐ１１０サブユニットは、ホス
ホセリンのみを含有している（図１３，Ｃｉｉ）ことを
示した。
燐酸化状態を調べるために、昆虫細胞を、バキュロウィ
ルス発現で、32ｐ−ＰＯ4と代謝標識されたｐ８５α及
びｐ１１０と共同感染させた。これらの細胞の溶離物
を、Ｙ751ホスホペプチドビーズに固定し、次に洗浄し
て、ＳＤＳバッファ溶出タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル分析後のクーマシーブルー染色によって可視化し
た。これらのゲルのオートラジオグラフィは、クーマシ
ーブルー染色によって決まるタンパク質の存在量に対し
て、ｐ８５αに取り込まれた燐酸のレベルがｐ１１０に
取り込まれた燐酸のレベルよりもはるかに高いことを示
した（図１３，Ｂ，レーン１及び２）。ホスホアミノ酸
分析は、標識化を生体内で行った場合（図１３，Ｃｉ）
にｐ８５αはホスホセリンとホスホトレオニンとの両方
を含有するのに対して、ｐ１１０サブユニットは、ホス
ホセリンのみを含有している（図１３，Ｃｉｉ）ことを
示した。
【０１１８】燐酸化の反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を
調べるために、ｐ８５α／ｐ１１０の抗−ｐ１１０免疫
沈降物を使用した。ｐ８５αの燐酸化のＫｍ（ＡＴＰ）
値は、約４μＭであった。次に、ｐ８５αの燐酸化の化
学量を、過剰ＡＴＰ（５０μＭ）の存在下において測定
した。燐酸のおよそ０．９ｍｏｌが、１ｍｏｌのｐ８５
αタンパク質に組み込まれていた。この燐酸化の度合
は、ラット肝臓から精製されたＰＩ３−キナーゼに会合
することが報告されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｅｔ
ａｌ．，１９９３）ＰＩＫキナーゼに関して観察された
程度と一致しており、これは、一つの主要な自己燐酸化
場所が使用されていることを示唆するものである。
調べるために、ｐ８５α／ｐ１１０の抗−ｐ１１０免疫
沈降物を使用した。ｐ８５αの燐酸化のＫｍ（ＡＴＰ）
値は、約４μＭであった。次に、ｐ８５αの燐酸化の化
学量を、過剰ＡＴＰ（５０μＭ）の存在下において測定
した。燐酸のおよそ０．９ｍｏｌが、１ｍｏｌのｐ８５
αタンパク質に組み込まれていた。この燐酸化の度合
は、ラット肝臓から精製されたＰＩ３−キナーゼに会合
することが報告されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｅｔ
ａｌ．，１９９３）ＰＩＫキナーゼに関して観察された
程度と一致しており、これは、一つの主要な自己燐酸化
場所が使用されていることを示唆するものである。
【０１１９】例 １１
ＰＩ３−キナーゼのタンパク質キナーゼ活性がｐ１１０
サブユニットに内生的なものであり、会合昆虫細胞活動
に依るものでないことが今や明らかである。ｐ１１０サ
ブユニットを変異させることによって、ＰＩ３−キナー
ゼとタンパク質セリンキナーゼ活性との両方が破壊され
ることが判った。いずれのｐ８５タンパク質アミノ酸配
列も、他のタンパク質キナーゼの配列に対する（Ｈａｎ
ｋｓｅｔ ａｌ．，１９８８）、あるいは他のタンパク
質のＡＴＰ又はＧＴＰ−結合ドメインの配列に対する
（Ｓａｒａｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）認識可能
なモチーフを示さないので、余剰キナーゼモチーフを有
し、燐酸をＡＴＰからＰＩへ転移出来るｐ１１０サブユ
ニットが、内生的タンパク質−セリンキナーゼ活性を有
する物質の最も有力な候補である可能性が高い。ｐ１１
０サブユニットは、周知のタンパク質キナーゼの活性場
所及びイーストＰＩ３−キナーゼ，Ｖｓｐ３４ｐ，Ｈｉ
ｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、内において保存され
るアミノ酸を含有している。ヌクレオチド燐酸部分（モ
エティ）の結合と、古典的なタンパク質キナーゼにおけ
る燐酸転移酵素活性のためには、ＤＲＨＮＳＮ配列が必
須である（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
サブユニットに内生的なものであり、会合昆虫細胞活動
に依るものでないことが今や明らかである。ｐ１１０サ
ブユニットを変異させることによって、ＰＩ３−キナー
ゼとタンパク質セリンキナーゼ活性との両方が破壊され
ることが判った。いずれのｐ８５タンパク質アミノ酸配
列も、他のタンパク質キナーゼの配列に対する（Ｈａｎ
ｋｓｅｔ ａｌ．，１９８８）、あるいは他のタンパク
質のＡＴＰ又はＧＴＰ−結合ドメインの配列に対する
（Ｓａｒａｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）認識可能
なモチーフを示さないので、余剰キナーゼモチーフを有
し、燐酸をＡＴＰからＰＩへ転移出来るｐ１１０サブユ
ニットが、内生的タンパク質−セリンキナーゼ活性を有
する物質の最も有力な候補である可能性が高い。ｐ１１
０サブユニットは、周知のタンパク質キナーゼの活性場
所及びイーストＰＩ３−キナーゼ，Ｖｓｐ３４ｐ，Ｈｉ
ｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、内において保存され
るアミノ酸を含有している。ヌクレオチド燐酸部分（モ
エティ）の結合と、古典的なタンパク質キナーゼにおけ
る燐酸転移酵素活性のためには、ＤＲＨＮＳＮ配列が必
須である（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【０１２０】ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅキナー
ゼと公知のタンパク質キナーゼとに明らかに共有されて
いるＤＲＨＮＳＮ配列の機能的重要性を、場所−指定オ
リゴヌクレオチド特異誘発を利用して調べた。ウシｐ１
１０のＤＲＨＮＳＮモチーフ内における、アルギニン９
１６をプロリン（Ｒ９１６Ｐ）に変換するポイント特異
誘発を行った。そのプロトコルは、Ｄｈａｎｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｄｕａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙに詳述され
ている。
ゼと公知のタンパク質キナーゼとに明らかに共有されて
いるＤＲＨＮＳＮ配列の機能的重要性を、場所−指定オ
リゴヌクレオチド特異誘発を利用して調べた。ウシｐ１
１０のＤＲＨＮＳＮモチーフ内における、アルギニン９
１６をプロリン（Ｒ９１６Ｐ）に変換するポイント特異
誘発を行った。そのプロトコルは、Ｄｈａｎｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｄｕａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙに詳述され
ている。
【０１２１】簡単に説明すると、ｐ１１０のアルギニン
９１６を、オリゴヌクレチド仲介特異誘発によってプロ
リン残基に変化させた。オリゴヌクレチド５’ＴＧＧＧ
ＡＡＴＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡＧＴＡ−
３’を合成し（ＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕ．
Ｋ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ”Ｄｏｕｂｌｅ Ｔａ
ｋｅ”特異誘発キットを使用して、Ｒ９１６Ｐ変異をｐ
１１０−Ｂａｍ ＨＩ（Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１
９９２）に組み込むのに使用した。前記Ｒ９１６Ｐ変異
に加えて、このオリゴヌクレチドは、サイレントコドン
変化によって、新規なＢａｍＨＩ位置を導入するもので
ある。Ｒ９１６変異を含む８０２ベースペアＰｓｔＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩカートリッジ配列を、ＤＮＡ配列分析に
よって確認した。
９１６を、オリゴヌクレチド仲介特異誘発によってプロ
リン残基に変化させた。オリゴヌクレチド５’ＴＧＧＧ
ＡＡＴＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡＧＴＡ−
３’を合成し（ＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕ．
Ｋ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ”Ｄｏｕｂｌｅ Ｔａ
ｋｅ”特異誘発キットを使用して、Ｒ９１６Ｐ変異をｐ
１１０−Ｂａｍ ＨＩ（Ｈｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１
９９２）に組み込むのに使用した。前記Ｒ９１６Ｐ変異
に加えて、このオリゴヌクレチドは、サイレントコドン
変化によって、新規なＢａｍＨＩ位置を導入するもので
ある。Ｒ９１６変異を含む８０２ベースペアＰｓｔＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩカートリッジ配列を、ＤＮＡ配列分析に
よって確認した。
【０１２２】Ｓｆ９細胞内に於ける発現のために、バキ
ュロウィルス転移ベクター，ｐ３６Ｃ−Ｐ１１０（Ｈｉ
ｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）からの９０３ベース
ペアＰｓｔＩ−ＫｐｎＩカートリッジを、前記Ｒ９１６
Ｐ変異を含むｐ１１０ＢａｍＨＩプラスミドからの対応
カートリッジに置換した。
ュロウィルス転移ベクター，ｐ３６Ｃ−Ｐ１１０（Ｈｉ
ｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）からの９０３ベース
ペアＰｓｔＩ−ＫｐｎＩカートリッジを、前記Ｒ９１６
Ｐ変異を含むｐ１１０ＢａｍＨＩプラスミドからの対応
カートリッジに置換した。
【０１２３】変異誘発を含む実験は、ｐ１１０サブユニ
ットが、ＰＩ３−キナーゼの触媒サブユニットであるこ
とを明らかにした。図１４，Ａ参照：記載の抗体と免疫
沈降した感染昆虫細胞の溶離物の７．５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥクーマシーブルー染色を以下の要領で処理した。ａ
ｎｔｉ−ｐ８５α（レーン１）、ａｎｔｉ−ｐ１１０
（レーン２）、生体外でＳｆ９細胞を含有するｐ１１０
と飼養した、ａｎｔｉ−８５α免疫沈降物（レーン
３）、ｐ８５α／ｐ１１０ウィルスと共同感染させた昆
虫細胞のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物（レーン４）、
ａｎｔｉ−ｐ８５α（レーン５）、ｐ１１０Ｒ９１６Ｐ
に感染させた昆虫細胞のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物
（レーン６）、生体外でＳｆ９細胞を含有する突然変異
体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐで飼養したａｎｔｉ−ｐ８５α
免疫沈降物（レーン７）、予めｐ８５α／突然変異体ｐ
１１０−Ｒ９１６Ｐウィルスと共同感染させた昆虫細胞
のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物（レーン８）。そし
て、Ｂ： Ａに記載の要領で感染させ記載された免疫沈
降物に対してＰＩ３−キナーゼ分析を行った。
ットが、ＰＩ３−キナーゼの触媒サブユニットであるこ
とを明らかにした。図１４，Ａ参照：記載の抗体と免疫
沈降した感染昆虫細胞の溶離物の７．５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥクーマシーブルー染色を以下の要領で処理した。ａ
ｎｔｉ−ｐ８５α（レーン１）、ａｎｔｉ−ｐ１１０
（レーン２）、生体外でＳｆ９細胞を含有するｐ１１０
と飼養した、ａｎｔｉ−８５α免疫沈降物（レーン
３）、ｐ８５α／ｐ１１０ウィルスと共同感染させた昆
虫細胞のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物（レーン４）、
ａｎｔｉ−ｐ８５α（レーン５）、ｐ１１０Ｒ９１６Ｐ
に感染させた昆虫細胞のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物
（レーン６）、生体外でＳｆ９細胞を含有する突然変異
体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐで飼養したａｎｔｉ−ｐ８５α
免疫沈降物（レーン７）、予めｐ８５α／突然変異体ｐ
１１０−Ｒ９１６Ｐウィルスと共同感染させた昆虫細胞
のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物（レーン８）。そし
て、Ｂ： Ａに記載の要領で感染させ記載された免疫沈
降物に対してＰＩ３−キナーゼ分析を行った。
【０１２４】先ず、内生ホスホイノシチドキナーゼ活性
に対する変異誘発の効果を評価した。昆虫細胞を、ｐ８
５α及びｐ１１０ウィルスのいずれか一方、またはこれ
らの両方で感染させた。その後、免疫沈降したｐ８５α
及びｐ１１０を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上における分解
後、クーマシーブルー染色されたタンパク質として視覚
化することが出来た（図１４，Ａ，レーン１及び２参
照）。
に対する変異誘発の効果を評価した。昆虫細胞を、ｐ８
５α及びｐ１１０ウィルスのいずれか一方、またはこれ
らの両方で感染させた。その後、免疫沈降したｐ８５α
及びｐ１１０を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上における分解
後、クーマシーブルー染色されたタンパク質として視覚
化することが出来た（図１４，Ａ，レーン１及び２参
照）。
【０１２５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に示されているよう
に、二つのタンパク質を生体外で会合させた場合、ある
いは、これらが昆虫細胞内において発現された場合に、
タンパク質がｐ８５αと安定した複合体を形成すること
が判った（図１３，Ａ，レーン３及び４参照）。これら
のサンプルの分析はｐ１１０タンパク質のみが活性であ
ることを示した（図１４，Ｂ，レーン２参照）。ｐ１１
０を生体外又は生体内においてｐ８５αと固定した時に
活性複合体が形成された（図１４，Ｂ，レーン３及び４
参照）。免疫沈降したｐ１１０−Ｒ９１６Ｐも、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色によって可視化
され（図１４，Ａ，レーン６参照）、野生型ｐ１１０タ
ンパク質と共同移入（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）することが
判った（図１４，Ａ，レーン２）。
に、二つのタンパク質を生体外で会合させた場合、ある
いは、これらが昆虫細胞内において発現された場合に、
タンパク質がｐ８５αと安定した複合体を形成すること
が判った（図１３，Ａ，レーン３及び４参照）。これら
のサンプルの分析はｐ１１０タンパク質のみが活性であ
ることを示した（図１４，Ｂ，レーン２参照）。ｐ１１
０を生体外又は生体内においてｐ８５αと固定した時に
活性複合体が形成された（図１４，Ｂ，レーン３及び４
参照）。免疫沈降したｐ１１０−Ｒ９１６Ｐも、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色によって可視化
され（図１４，Ａ，レーン６参照）、野生型ｐ１１０タ
ンパク質と共同移入（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）することが
判った（図１４，Ａ，レーン２）。
【０１２６】突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐ及びｐ８
５αによって共同感染された昆虫細胞が、ａｎｔｉ−ｐ
１１０抗体を使用した免疫沈降によって分析された時
（図１４，Ａ，レーン８参照）、あるいは、突然変異体
免疫精製ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐを生体外でｐ８５αと会
合させた時（図１４，Ａ，レーン７参照）、安定した複
合体が回収された。
５αによって共同感染された昆虫細胞が、ａｎｔｉ−ｐ
１１０抗体を使用した免疫沈降によって分析された時
（図１４，Ａ，レーン８参照）、あるいは、突然変異体
免疫精製ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐを生体外でｐ８５αと会
合させた時（図１４，Ａ，レーン７参照）、安定した複
合体が回収された。
【０１２７】前記突然変異体ｐ１１０を含有する免疫沈
降物は、すべて、ＰＩ３−キナーゼ活性を有していない
ことが判った（図１４，Ｂ，レーン６，７，８）。突然
変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐの発現及び結合能力は、野
生型ｐ１１０のそれと対応しているので、このデータ
は、変異が、恐らく、ｐ１１０タンパク質の構造を完全
に破壊することなく、このタンパク質の触媒位置を破壊
したことを示すものである。
降物は、すべて、ＰＩ３−キナーゼ活性を有していない
ことが判った（図１４，Ｂ，レーン６，７，８）。突然
変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐの発現及び結合能力は、野
生型ｐ１１０のそれと対応しているので、このデータ
は、変異が、恐らく、ｐ１１０タンパク質の構造を完全
に破壊することなく、このタンパク質の触媒位置を破壊
したことを示すものである。
【０１２８】例 １２
ＰＩ３−キナーゼ不活性突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６
Ｐを使用して、会合タンパク質セリンキナーゼ活性に対
する突然変異の効果を調べた。図１５参照。昆虫細胞
を、ｐ８５α及び野生型ｐ１１０（レーン１）、ｐ８５
α及び突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１５Ｐウィルス（レー
ン２）、ｐ１１０単体（レーン３）、突然変異体ｐ１１
０−Ｒ９１６Ｐ単体（レーン４）と共同感染させた。こ
れらの細胞の溶離物を、ｐ１１０サブユニットに対する
抗体と免疫沈降させ、次にこれらの免疫沈降タンパク質
を生体外で燐酸化させた。
Ｐを使用して、会合タンパク質セリンキナーゼ活性に対
する突然変異の効果を調べた。図１５参照。昆虫細胞
を、ｐ８５α及び野生型ｐ１１０（レーン１）、ｐ８５
α及び突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１５Ｐウィルス（レー
ン２）、ｐ１１０単体（レーン３）、突然変異体ｐ１１
０−Ｒ９１６Ｐ単体（レーン４）と共同感染させた。こ
れらの細胞の溶離物を、ｐ１１０サブユニットに対する
抗体と免疫沈降させ、次にこれらの免疫沈降タンパク質
を生体外で燐酸化させた。
【０１２９】ｐ８５αサブユニットは、野生型ｐ１１０
と複合された時に生体外で燐酸化されることが観察され
た（図１５，Ａ，レーン１参照）。これに対して、突然
変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐと会合したｐ８５サブユニ
ットは、この分析においては燐酸化されていなかった
（図１５，Ａ，レーン２参照）。野生型ｐ１１０も突然
変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐのいずれも、自己燐酸化は
観察されなかった（図１５，Ａ，レーン３及び４参
照）。
と複合された時に生体外で燐酸化されることが観察され
た（図１５，Ａ，レーン１参照）。これに対して、突然
変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐと会合したｐ８５サブユニ
ットは、この分析においては燐酸化されていなかった
（図１５，Ａ，レーン２参照）。野生型ｐ１１０も突然
変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐのいずれも、自己燐酸化は
観察されなかった（図１５，Ａ，レーン３及び４参
照）。
【０１３０】例 １３
ｐ１１０サブユニットが生体外においてｐ８５αに結合
しこれを燐酸化することによってトランス−キナーゼ活
性を示す可能性を調べた。以下の実験の結果は、図１
５，Ｂに示されている。昆虫細胞からのｐ８５αを、Ｙ
751ホスホペプチドカラムを使用してＳｆ９細胞から親
和精製し、次に、バキュロウィルス組換え体発現ｐ１１
０（レーン１）、突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐ（レ
ーン２）、非処理体（レーン３）に感染のＳｆ９細胞の
溶離物と飼養した。これらの複合体を洗浄し、生体外タ
ンパク質キナーゼ分析し、更にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオ
ートラジオグラフィで分析した。
しこれを燐酸化することによってトランス−キナーゼ活
性を示す可能性を調べた。以下の実験の結果は、図１
５，Ｂに示されている。昆虫細胞からのｐ８５αを、Ｙ
751ホスホペプチドカラムを使用してＳｆ９細胞から親
和精製し、次に、バキュロウィルス組換え体発現ｐ１１
０（レーン１）、突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐ（レ
ーン２）、非処理体（レーン３）に感染のＳｆ９細胞の
溶離物と飼養した。これらの複合体を洗浄し、生体外タ
ンパク質キナーゼ分析し、更にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオ
ートラジオグラフィで分析した。
【０１３１】単体で発現したｐ８５αは燐酸化されてい
なかった（図１５，Ｂ，レーン３）が、一方、野生型ｐ
１１０に生体外で固定されたｐ８５αはかなり燐酸化さ
れていた（図１５，Ｂ，レーン１参照）。これに対し
て、突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐと複合されたｐ８
５αは、燐酸化されていなかった（図１５，Ｂ，レーン
２参照）。
なかった（図１５，Ｂ，レーン３）が、一方、野生型ｐ
１１０に生体外で固定されたｐ８５αはかなり燐酸化さ
れていた（図１５，Ｂ，レーン１参照）。これに対し
て、突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐと複合されたｐ８
５αは、燐酸化されていなかった（図１５，Ｂ，レーン
２参照）。
【０１３２】ｐ８５αの燐酸化が、昆虫細胞に発現した
ｐ８５にのみ関係しているものでないことを確認するた
めに、ＧＳＴ融合タンパク質としてバクテリア発現した
ｐ８５αを、代替タンパク質源として使用した。ＧＳＴ
−ｐ８５αを親和性樹脂に固定し、次に以下の段落に記
載の要領で処理した。固定後、生体外キナーゼ分析は、
ＧＳＴ ｐ８５α単体では会合タンパク質キナーゼ活性
が無いことを示した（図１５，Ｃ，レーン３参照）。し
かし野生型ｐ１１０との会合によっては、ｐ８５α融合
タンパク質はかなり燐酸化した（図１５，Ｃ，レーン１
参照）。突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐに固定したＧ
ＳＴｐ８５αにおいては燐酸化は認められない（図１
５，Ｃ，レーン２参照）。
ｐ８５にのみ関係しているものでないことを確認するた
めに、ＧＳＴ融合タンパク質としてバクテリア発現した
ｐ８５αを、代替タンパク質源として使用した。ＧＳＴ
−ｐ８５αを親和性樹脂に固定し、次に以下の段落に記
載の要領で処理した。固定後、生体外キナーゼ分析は、
ＧＳＴ ｐ８５α単体では会合タンパク質キナーゼ活性
が無いことを示した（図１５，Ｃ，レーン３参照）。し
かし野生型ｐ１１０との会合によっては、ｐ８５α融合
タンパク質はかなり燐酸化した（図１５，Ｃ，レーン１
参照）。突然変異体ｐ１１０−Ｒ９１６Ｐに固定したＧ
ＳＴｐ８５αにおいては燐酸化は認められない（図１
５，Ｃ，レーン２参照）。
【０１３３】例 １４
ｐ８５及びｐ１１０との会合において他のタンパク質が
検出されるか否かを調べるために更に実験を行った。そ
の結果を図１６に示す。具体的には、野生型ウィルス
（レーン１）；ｐ８５α及びｐ１１０（レーン２）、又
はｐ８５αのみ（レーン３）と感染させた昆虫細胞を、
１６時間で35Ｓメチオニンで標識化した。次に、これら
の細胞の溶離物を、Ｙ751カラムに固定した。数回の洗
浄後、ＳＤＳバッファによって遊離させたラジオ標識タ
ンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、オートラジオ
グラフィによって検出した。
検出されるか否かを調べるために更に実験を行った。そ
の結果を図１６に示す。具体的には、野生型ウィルス
（レーン１）；ｐ８５α及びｐ１１０（レーン２）、又
はｐ８５αのみ（レーン３）と感染させた昆虫細胞を、
１６時間で35Ｓメチオニンで標識化した。次に、これら
の細胞の溶離物を、Ｙ751カラムに固定した。数回の洗
浄後、ＳＤＳバッファによって遊離させたラジオ標識タ
ンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、オートラジオ
グラフィによって検出した。
【０１３４】その結果によれば、野生型のバキュロウィ
ルスに感染させた昆虫細胞からの親和性ホスホペプチド
に固定されたタンパク質は存在しない。更に、組換え体
バキュロウィルス発現ｐ８５αのみ、あるいはＰ８５α
とｐ１１０とで感染させた細胞からは、３日間のオート
ラジオグラフィ後においてさえも、その他の会合タンパ
ク質は検出されなかった。
ルスに感染させた昆虫細胞からの親和性ホスホペプチド
に固定されたタンパク質は存在しない。更に、組換え体
バキュロウィルス発現ｐ８５αのみ、あるいはＰ８５α
とｐ１１０とで感染させた細胞からは、３日間のオート
ラジオグラフィ後においてさえも、その他の会合タンパ
ク質は検出されなかった。
【０１３５】マクロ分子を細分化し精製するために、ス
クローズ勾配分析も行った。これらの結果を図１７に示
す。ｐ１１０ウィルスのみ、あるいはｐ１１０及びｐ８
５の両方と感染させたＳｆ９細胞の溶離物を、スクロー
ズ勾配上で分離し、そのフラクションのＰＩ３−キナー
ゼ及びＰＩタンパク質キナーゼセリン活性を分析した。
沈降は左から右の方向に行った。ＰＩ３−キナーゼ活性
は、ｐ１１０（図１７，Ａ）及びｐ１１０／ｐ８５α
（図１７，Ｃ）発現の分割細胞溶離物から免疫精製され
た。スクロース勾配上で分離されたｐ１１０感染細胞の
分析は、ＰＩ３−キナーゼ活性の大部分（図１７，Ａ）
と、フラクション７にピークを有する、そのモノマーと
してのマイグレーションと比較可能な分子重量を備えた
ｐ１１０タンパク質（データ図示せず）とを示した。
クローズ勾配分析も行った。これらの結果を図１７に示
す。ｐ１１０ウィルスのみ、あるいはｐ１１０及びｐ８
５の両方と感染させたＳｆ９細胞の溶離物を、スクロー
ズ勾配上で分離し、そのフラクションのＰＩ３−キナー
ゼ及びＰＩタンパク質キナーゼセリン活性を分析した。
沈降は左から右の方向に行った。ＰＩ３−キナーゼ活性
は、ｐ１１０（図１７，Ａ）及びｐ１１０／ｐ８５α
（図１７，Ｃ）発現の分割細胞溶離物から免疫精製され
た。スクロース勾配上で分離されたｐ１１０感染細胞の
分析は、ＰＩ３−キナーゼ活性の大部分（図１７，Ａ）
と、フラクション７にピークを有する、そのモノマーと
してのマイグレーションと比較可能な分子重量を備えた
ｐ１１０タンパク質（データ図示せず）とを示した。
【０１３６】上述のようにｐ１１０はあまり自己燐酸化
せず、従って検出できないので、ｐ８５をタンパク質キ
ナーゼ活性のための外性基質として使用した。各フラク
ションの免疫沈降物を生成し、精製ｐ８５αタンパク質
で飼養し（Ｇｏｕｔ ｅｔａｌ．，１９９２）、次に、
キナーゼ活性を分析した。図１７，Ｂの結果は、ＰＩ３
−キナーゼ活性のピークと正確に共同移動した燐酸化ｐ
８５のピークを示している。
せず、従って検出できないので、ｐ８５をタンパク質キ
ナーゼ活性のための外性基質として使用した。各フラク
ションの免疫沈降物を生成し、精製ｐ８５αタンパク質
で飼養し（Ｇｏｕｔ ｅｔａｌ．，１９９２）、次に、
キナーゼ活性を分析した。図１７，Ｂの結果は、ＰＩ３
−キナーゼ活性のピークと正確に共同移動した燐酸化ｐ
８５のピークを示している。
【０１３７】ｐ１１０及びｐ８５αウィルスと予め共同
感染させておいた昆虫細胞の溶離物に対しても類似の分
析を行った。ＰＩ３−キナーゼ活性は、フラクション１
０−２でピークとなり、ｐ１１０及びｐ８５αのヘテロ
ダイマーの分子重量に一致する分子重量で分割された
（図１７，Ｃ）。ｐ１１０（図１７，Ｄ）に対して特異
的な、あるいはｐ８５に対して特異的な（データ図示せ
ず）抗体で予め免疫沈降させておいたタンパク質セリン
キナーゼ活性も、ＰＩ３−キナーゼと、ｐ８５及びｐ１
１０タンパク質と共同移動していた。このデータは、タ
ンパク質セリンキナーゼ活性が恐らくＰＩ３−キナーゼ
複合体に内生的なものであることを示している。
感染させておいた昆虫細胞の溶離物に対しても類似の分
析を行った。ＰＩ３−キナーゼ活性は、フラクション１
０−２でピークとなり、ｐ１１０及びｐ８５αのヘテロ
ダイマーの分子重量に一致する分子重量で分割された
（図１７，Ｃ）。ｐ１１０（図１７，Ｄ）に対して特異
的な、あるいはｐ８５に対して特異的な（データ図示せ
ず）抗体で予め免疫沈降させておいたタンパク質セリン
キナーゼ活性も、ＰＩ３−キナーゼと、ｐ８５及びｐ１
１０タンパク質と共同移動していた。このデータは、タ
ンパク質セリンキナーゼ活性が恐らくＰＩ３−キナーゼ
複合体に内生的なものであることを示している。
【０１３８】例 １５
更に、両方のキナーゼ活性が類似のチオール所要量を有
していると判断された。多数の真核源から分離されたＰ
Ｉキナーゼが、ｓｕｌｐｈｙｄｒｉｌ−ｍｏｄｉｆｙｉ
ｎｇ試薬による処理（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９８
８； Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９９１）や、他
のキナーゼ内における処理に感作することが知られてい
る。
していると判断された。多数の真核源から分離されたＰ
Ｉキナーゼが、ｓｕｌｐｈｙｄｒｉｌ−ｍｏｄｉｆｙｉ
ｎｇ試薬による処理（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９８
８； Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９９１）や、他
のキナーゼ内における処理に感作することが知られてい
る。
【０１３９】ＰＩ３−キナーゼおよび会合セリンキナー
ゼ活性が、類似のチロール所要量を有しているか否かを
調べるために、次の実験を行った。昆虫細胞を、ｐ８５
α／ｐ１１０複合体（図１８，Ａ，レーン１−６）か、
あるいはｐ１１０のみ（図１８，Ｂ，レーン７−１２）
と感染させた。それらの免疫沈降物を、ＰＩ３−キナー
ゼバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で
二回洗浄した。それらサンプルを、摂氏２２度で１５分
間、０．３ｍＭ ５，５’−ジチオール−ビス（２−ニ
トロベンゼン酸)(Ｎｂｓ2）で処理、あるいは処理しな
かった。前記複合体を、ＰＩ３−キナーゼバッファで三
回洗浄することによって、過剰試薬を除去し、次にその
免疫沈降物を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度を
増加させながら、摂氏２２度で１５分間飼養した。対照
サンプルは、最終濃度３００ｍＭのＤＴＴのみによって
飼養した。残りのＤＴＴを、溶離物バッファで洗浄する
ことによって除去し、その免疫沈降物の、ＰＩ３−キナ
ーゼ分析、または、下記の生体外キナーゼタンパク質分
析を行った。
ゼ活性が、類似のチロール所要量を有しているか否かを
調べるために、次の実験を行った。昆虫細胞を、ｐ８５
α／ｐ１１０複合体（図１８，Ａ，レーン１−６）か、
あるいはｐ１１０のみ（図１８，Ｂ，レーン７−１２）
と感染させた。それらの免疫沈降物を、ＰＩ３−キナー
ゼバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で
二回洗浄した。それらサンプルを、摂氏２２度で１５分
間、０．３ｍＭ ５，５’−ジチオール−ビス（２−ニ
トロベンゼン酸)(Ｎｂｓ2）で処理、あるいは処理しな
かった。前記複合体を、ＰＩ３−キナーゼバッファで三
回洗浄することによって、過剰試薬を除去し、次にその
免疫沈降物を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度を
増加させながら、摂氏２２度で１５分間飼養した。対照
サンプルは、最終濃度３００ｍＭのＤＴＴのみによって
飼養した。残りのＤＴＴを、溶離物バッファで洗浄する
ことによって除去し、その免疫沈降物の、ＰＩ３−キナ
ーゼ分析、または、下記の生体外キナーゼタンパク質分
析を行った。
【０１４０】実験を行い、その結果を図１８，Ａに示
す。生体外ＰＩ３−キナーゼ分析は、以下の要領で処理
されたこれらの細胞のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物に
対して行った。即ち、無処理（図１８，Ａ，レーン１及
び７）、３００ｍＭ ＤＴＴ（レーン２及び８）、０．
３ｍＭ Ｎｂｓ2で処理したもの（レーン３及び９）、
３ｍＭ ＤＴＴ（レーン４及び１０）、３０ｍＭ ＤＴ
Ｔ（レーン５及び１１）、３００ｍＭ ＤＴＴ（レーン
６及び１２）でそれぞれ飼養した０．３ｍＭ Ｎｂｓ2
で前処理した免疫沈降物。
す。生体外ＰＩ３−キナーゼ分析は、以下の要領で処理
されたこれらの細胞のａｎｔｉ−ｐ１１０免疫沈降物に
対して行った。即ち、無処理（図１８，Ａ，レーン１及
び７）、３００ｍＭ ＤＴＴ（レーン２及び８）、０．
３ｍＭ Ｎｂｓ2で処理したもの（レーン３及び９）、
３ｍＭ ＤＴＴ（レーン４及び１０）、３０ｍＭ ＤＴ
Ｔ（レーン５及び１１）、３００ｍＭ ＤＴＴ（レーン
６及び１２）でそれぞれ飼養した０．３ｍＭ Ｎｂｓ2
で前処理した免疫沈降物。
【０１４１】Ｎｂｓ2およびＤＴＴで処理した生体外キ
ナーゼ活性を調べるために更に別の実験を行った。ｐ８
５α／ｐ１１０バキュロウィルスに予め共同感染させて
おいたＳｆ９細胞の溶離物を、更に以下の方法で処理し
た。前記溶離物を、ａｎｔｉ−ｐ１１０抗体で免疫沈降
し、次のように処理した。即ち、無処理（図１８，Ｂ，
レーン１）、３００ｍＭ ＤＴＴ（レーン２）、０．３
ｍＭ Ｎｂｓ2（レーン３）、０．３ｍＭ Ｎｂｓ2で前
処理し、次にそれぞれ、３ｍＭ ＤＴＴ（レーン４）、
３０ｍＭ ＤＴＴ（レーン５）、そして３００ｍＭ Ｄ
ＴＴ（レーン６）で飼養したもの。次にこれらのサンプ
ルの、生体外キナーゼ分析を行い、更に、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析を行った。燐酸化されたタンパク質は、オート
ラジオグラフィによって可視化された。その結果を図１
８，Ｂに示す。
ナーゼ活性を調べるために更に別の実験を行った。ｐ８
５α／ｐ１１０バキュロウィルスに予め共同感染させて
おいたＳｆ９細胞の溶離物を、更に以下の方法で処理し
た。前記溶離物を、ａｎｔｉ−ｐ１１０抗体で免疫沈降
し、次のように処理した。即ち、無処理（図１８，Ｂ，
レーン１）、３００ｍＭ ＤＴＴ（レーン２）、０．３
ｍＭ Ｎｂｓ2（レーン３）、０．３ｍＭ Ｎｂｓ2で前
処理し、次にそれぞれ、３ｍＭ ＤＴＴ（レーン４）、
３０ｍＭ ＤＴＴ（レーン５）、そして３００ｍＭ Ｄ
ＴＴ（レーン６）で飼養したもの。次にこれらのサンプ
ルの、生体外キナーゼ分析を行い、更に、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析を行った。燐酸化されたタンパク質は、オート
ラジオグラフィによって可視化された。その結果を図１
８，Ｂに示す。
【０１４２】前記サンプルが０．３ｍＭ Ｎｂｓ2で飼
養された場合に於て約９５％のＰＩ３−キナーゼ活性が
失われ（図１８，Ａ，レーン３及び９参照）、タンパク
質セリンキナーゼ活性の類似の損失も観察された（図１
８，Ｂ，レーン３参照）。両方の触媒活性を、ＤＴＴの
濃度を増加させながら前記修飾酵素を飼養することによ
って回復させることができた（図１８，Ａ，レーン４−
６及び１０−１２；図１８，Ｂ，レーン４−６参照）。
３００ｍＭの最終濃度で、ＤＴＴのみで前記ＰＩ３−キ
ナーゼ複合体またはｐ１１０を飼養することによって、
ＰＩ３−キナーゼ活性（図１８，Ａ，レーン２及び８）
と、タンパク質セリンキナーゼ活性（図１８，Ｂ，レー
ン２）の両方が、僅かに活性化された。
養された場合に於て約９５％のＰＩ３−キナーゼ活性が
失われ（図１８，Ａ，レーン３及び９参照）、タンパク
質セリンキナーゼ活性の類似の損失も観察された（図１
８，Ｂ，レーン３参照）。両方の触媒活性を、ＤＴＴの
濃度を増加させながら前記修飾酵素を飼養することによ
って回復させることができた（図１８，Ａ，レーン４−
６及び１０−１２；図１８，Ｂ，レーン４−６参照）。
３００ｍＭの最終濃度で、ＤＴＴのみで前記ＰＩ３−キ
ナーゼ複合体またはｐ１１０を飼養することによって、
ＰＩ３−キナーゼ活性（図１８，Ａ，レーン２及び８）
と、タンパク質セリンキナーゼ活性（図１８，Ｂ，レー
ン２）の両方が、僅かに活性化された。
【０１４３】Ｎｂｓ2及びＤＴＴ処理の相対的投与量依
存性を調べるために更に別の実験を行った。図１８，Ｃ
は、両方のキナーゼ活性における、Ｎｂｓ2による不活
性化の曲線と、ＤＴＴ濃度増加による再活性化の曲線を
示している。Ｎｂｓ2による不活性化と、ＤＴＴによる
再活性化との両方が、両方のキナーゼ活性において、実
質的に等しい投与量反応−曲線を示した（図１８，Ｃ参
照）。
存性を調べるために更に別の実験を行った。図１８，Ｃ
は、両方のキナーゼ活性における、Ｎｂｓ2による不活
性化の曲線と、ＤＴＴ濃度増加による再活性化の曲線を
示している。Ｎｂｓ2による不活性化と、ＤＴＴによる
再活性化との両方が、両方のキナーゼ活性において、実
質的に等しい投与量反応−曲線を示した（図１８，Ｃ参
照）。
【０１４４】活性の損失は、恐らく、前記触媒ドメイン
における必須システイン残基とｔｈｉｏｎｉｔｒｏｂｅ
ｎｚｏａｔｅ（Ｎｂｓ-）アニオン（ｓ）との間のジス
ルフィド結合の形成に依るものである。
における必須システイン残基とｔｈｉｏｎｉｔｒｏｂｅ
ｎｚｏａｔｅ（Ｎｂｓ-）アニオン（ｓ）との間のジス
ルフィド結合の形成に依るものである。
【０１４５】例 １６
ｐ８５αタンパク質のｐ１１０への結合が、ｐ８５がタ
ンパク質キナーゼ活性のための基質として作用するため
の前提必要条件であるか否かを調べるために更に実験を
行った。ｐ８５αのサブドメインの様々なＧＳＴ融合タ
ンパク質を、タンパク質セリンキナーゼ活性の基質であ
る可能性のあるタンパク質として利用した。ＧＳＴ融合
タンパク質を調合する方法については、Ｄｈａｎｄ，Ｄ
ｕａｌＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｉｎｆｒａ．（１９９
３）により詳細に記載されている。具体的なＧＳＴ融合
タンパク質は、図１９，Ａに記載されている。
ンパク質キナーゼ活性のための基質として作用するため
の前提必要条件であるか否かを調べるために更に実験を
行った。ｐ８５αのサブドメインの様々なＧＳＴ融合タ
ンパク質を、タンパク質セリンキナーゼ活性の基質であ
る可能性のあるタンパク質として利用した。ＧＳＴ融合
タンパク質を調合する方法については、Ｄｈａｎｄ，Ｄ
ｕａｌＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｉｎｆｒａ．（１９９
３）により詳細に記載されている。具体的なＧＳＴ融合
タンパク質は、図１９，Ａに記載されている。
【０１４６】ｐ１１０タンパク質を、昆虫細胞から免疫
沈降させ、各ＧＳＴ融合タンパク質の同量、もしくはＧ
ＳＴタンパク質のみを、ｐ１１０と混合し、これらのタ
ンパク質を生体外で燐酸化させた。タンパク質キナーゼ
分析は、Ｈｉｌｅｓ ｅｔａｌ．１９９２に記載の要領
で行ったが、但し、ここで使用したキナーゼバッファ
は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、
０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０％ グリ
セロールを含有していた。燐酸化タンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィによって分析した。
この実験の結果を図１９，Ｂに示す。
沈降させ、各ＧＳＴ融合タンパク質の同量、もしくはＧ
ＳＴタンパク質のみを、ｐ１１０と混合し、これらのタ
ンパク質を生体外で燐酸化させた。タンパク質キナーゼ
分析は、Ｈｉｌｅｓ ｅｔａｌ．１９９２に記載の要領
で行ったが、但し、ここで使用したキナーゼバッファ
は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、
０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０％ グリ
セロールを含有していた。燐酸化タンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィによって分析した。
この実験の結果を図１９，Ｂに示す。
【０１４７】ｐ１１０への結合の原因となるｐ８５αの
領域は、アミノ酸残基４７８−５１４を含んでいた。と
いうのは、欠失を有さない類似の構造体と比較して、欠
失突然変異体ｐ８５αＮ−Ｃ△４７８−５１４はｐ１１
０またはＰＩ３−キナーゼ活性に対して全く結合不能に
されているからである。行われた実験（データ図示せ
ず）は、ｐ１１０によって燐酸化されたタンパク質は、
既に結合することが証明されていたタンパク質のみであ
ることを示している。全長ｐ８５αと、アミノ（Ｎ）及
びカーボキシル（Ｃ）末端ＳＨ２ドメイン及びこれらの
間の領域を含むｐ８５αＮ−Ｃドメインのみが、ｐ１１
０によって燐酸化されているのが判った。ＳＨ２間ドメ
インは、ＰＩ３−キナーゼ活性と結合することが知られ
てるが、この分析においては燐酸化されていなかった。
例５参照。
領域は、アミノ酸残基４７８−５１４を含んでいた。と
いうのは、欠失を有さない類似の構造体と比較して、欠
失突然変異体ｐ８５αＮ−Ｃ△４７８−５１４はｐ１１
０またはＰＩ３−キナーゼ活性に対して全く結合不能に
されているからである。行われた実験（データ図示せ
ず）は、ｐ１１０によって燐酸化されたタンパク質は、
既に結合することが証明されていたタンパク質のみであ
ることを示している。全長ｐ８５αと、アミノ（Ｎ）及
びカーボキシル（Ｃ）末端ＳＨ２ドメイン及びこれらの
間の領域を含むｐ８５αＮ−Ｃドメインのみが、ｐ１１
０によって燐酸化されているのが判った。ＳＨ２間ドメ
インは、ＰＩ３−キナーゼ活性と結合することが知られ
てるが、この分析においては燐酸化されていなかった。
例５参照。
【０１４８】これらの結果は、もしもキナーゼ残基に対
する生体外燐酸化の場所が、前記二つの隣接ＳＨ２ドメ
インのいずれか一方、もしくはＳＨ２間ドメインの両側
に位置する領域内に存在するならば説明可能である。こ
のデータは、ｐ１１０タンパク質−セリンキナーゼ活性
は、ｐ８５の様々な結合されていないサブドメインのみ
では燐酸化を生じさせるには不十分であるので、ｐ１１
０が特定の基質ｐ８５と高い親和性で結合する場合に初
めて検出可能であるということを示唆するものである。
する生体外燐酸化の場所が、前記二つの隣接ＳＨ２ドメ
インのいずれか一方、もしくはＳＨ２間ドメインの両側
に位置する領域内に存在するならば説明可能である。こ
のデータは、ｐ１１０タンパク質−セリンキナーゼ活性
は、ｐ８５の様々な結合されていないサブドメインのみ
では燐酸化を生じさせるには不十分であるので、ｐ１１
０が特定の基質ｐ８５と高い親和性で結合する場合に初
めて検出可能であるということを示唆するものである。
【０１４９】例 １７
バキュロウィルス発現ｐ８５α／ｐ１１０によって感染
させたＳｆ９細胞から精製したｐ８５αサブユニットの
ホスホアミノ酸分析は、該サブユニットがホスホセリン
を含有していることを示した。生体内ほ乳類細胞中のｐ
８５αにおける燐酸化位置を特定するために、種々の源
からの、生体内と生体外の両方で燐酸化されたｐ８５サ
ブユニットを使用した。生体内で燐酸によって標識化し
たＳｆ９及びＳＧＢＡＦ−１細胞からの精製ＰＩ３−キ
ナーゼに、Ｙ751ホスホペプチドカラムを使用して、ホ
スホペプチドマッピングを行った。
させたＳｆ９細胞から精製したｐ８５αサブユニットの
ホスホアミノ酸分析は、該サブユニットがホスホセリン
を含有していることを示した。生体内ほ乳類細胞中のｐ
８５αにおける燐酸化位置を特定するために、種々の源
からの、生体内と生体外の両方で燐酸化されたｐ８５サ
ブユニットを使用した。生体内で燐酸によって標識化し
たＳｆ９及びＳＧＢＡＦ−１細胞からの精製ＰＩ３−キ
ナーゼに、Ｙ751ホスホペプチドカラムを使用して、ホ
スホペプチドマッピングを行った。
【０１５０】他の細胞に関して前述したように、ウシア
ドレナールコルテックスゾナ通性細胞のｐＳＶ３neo と
のトランスフェクションによって、ＳＧＢＡＦ−１細胞
線が形成された（Ｗｈｉｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９
８７）。ＳＧＢＡＦ−１細胞は、１０％ ＦＣＳ，１０
ｉ．ｕ．のペニシリン／ｍｌと、１０μｍのストレプ
トマイシン／ｍｌとを含有のＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅ
ａｇｌｅｓ媒体（ＤＭＥＭ）中で保持した。昆虫細胞
（Ｓｆ９）培養の維持は、前述し、更に、Ｓｕｍｍｅｒ
ｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８７）に記載されている
方法で行った。
ドレナールコルテックスゾナ通性細胞のｐＳＶ３neo と
のトランスフェクションによって、ＳＧＢＡＦ−１細胞
線が形成された（Ｗｈｉｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９
８７）。ＳＧＢＡＦ−１細胞は、１０％ ＦＣＳ，１０
ｉ．ｕ．のペニシリン／ｍｌと、１０μｍのストレプ
トマイシン／ｍｌとを含有のＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅ
ａｇｌｅｓ媒体（ＤＭＥＭ）中で保持した。昆虫細胞
（Ｓｆ９）培養の維持は、前述し、更に、Ｓｕｍｍｅｒ
ｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８７）に記載されている
方法で行った。
【０１５１】先ず、予めｐ８５α及びｐ１１０ウィルス
に共同感染させておいてＳｆ９細胞からのホスホペプチ
ドに結合させたＰＩ３−キナーゼを使用して、燐酸化位
置を生体外で標識化した。又、バクテリア発現ＧＳＴ−
ｐ８５αとＧＳＴ−ｐ８５αＮ−Ｃとをグルタチオン−
セファロースビーズに結合させ、ｐ１１０感染Ｓｆ９細
胞の溶離物から免疫沈降したＰ１１０と生体外会合させ
た。これらのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で溶
解し、オートラジオグラフィによって同定されたｐ８５
αタンパク質を、前記ゲルから摘出した。トリプシン消
化後、ｐ８５αタンパク質消化物を、逆相ＨＰＬＣで分
析し、溶離フラクションを、チェレンコフ放射を分析す
ることによって検出した。
に共同感染させておいてＳｆ９細胞からのホスホペプチ
ドに結合させたＰＩ３−キナーゼを使用して、燐酸化位
置を生体外で標識化した。又、バクテリア発現ＧＳＴ−
ｐ８５αとＧＳＴ−ｐ８５αＮ−Ｃとをグルタチオン−
セファロースビーズに結合させ、ｐ１１０感染Ｓｆ９細
胞の溶離物から免疫沈降したＰ１１０と生体外会合させ
た。これらのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で溶
解し、オートラジオグラフィによって同定されたｐ８５
αタンパク質を、前記ゲルから摘出した。トリプシン消
化後、ｐ８５αタンパク質消化物を、逆相ＨＰＬＣで分
析し、溶離フラクションを、チェレンコフ放射を分析す
ることによって検出した。
【０１５２】具体的には、実験の条件は下記の通りであ
る。パネルＡ： ｐ８５α／ｐ１１０ウィルスと共同感
染し、生体外で燐酸で標識化したＳｆ９細胞からのホス
ホペプチド−精製ＰＩ３−キナーゼ； Ｂ： 生体内で
燐酸で標識化したＳＧＡＦ−１細胞からの上述の方法で
処理されたＰＩ３−キナーゼ； Ｃ： ［γ32Ｐ］ＡＴ
Ｐの存在下において生体外で燐酸化されたｐ８５α／ｐ
１１０ウィルスと共同感染したＳｆ９細胞からのホスホ
ペプチド−精製ＰＩ３−キナーゼ。ＧＳＴ−ｐ８５α
（パネルＤ）及びＧＳＴ−ｐ８５αＮ−ＣＳＨ２（パネ
ルＥ）は、グルタチオン−セファロースビーズに結合さ
れ、次に、Ｓｆ９細胞溶離物含有のｐ１１０と飼養し
た。複合タンパク質は、［γ32Ｐ］の存在下において生
体外で燐酸化された。図２０に示す結果は、タンパク質
が生体外で標識化されていた場合と生体内で標識化され
ていた場合のいずれの場合においても、同じ主ホスホペ
プチドが、すべての種々の調合物質からのｐ８５αのマ
ップに検出されたことを示している。
る。パネルＡ： ｐ８５α／ｐ１１０ウィルスと共同感
染し、生体外で燐酸で標識化したＳｆ９細胞からのホス
ホペプチド−精製ＰＩ３−キナーゼ； Ｂ： 生体内で
燐酸で標識化したＳＧＡＦ−１細胞からの上述の方法で
処理されたＰＩ３−キナーゼ； Ｃ： ［γ32Ｐ］ＡＴ
Ｐの存在下において生体外で燐酸化されたｐ８５α／ｐ
１１０ウィルスと共同感染したＳｆ９細胞からのホスホ
ペプチド−精製ＰＩ３−キナーゼ。ＧＳＴ−ｐ８５α
（パネルＤ）及びＧＳＴ−ｐ８５αＮ−ＣＳＨ２（パネ
ルＥ）は、グルタチオン−セファロースビーズに結合さ
れ、次に、Ｓｆ９細胞溶離物含有のｐ１１０と飼養し
た。複合タンパク質は、［γ32Ｐ］の存在下において生
体外で燐酸化された。図２０に示す結果は、タンパク質
が生体外で標識化されていた場合と生体内で標識化され
ていた場合のいずれの場合においても、同じ主ホスホペ
プチドが、すべての種々の調合物質からのｐ８５αのマ
ップに検出されたことを示している。
【０１５３】ｐ１１０によって生体外で燐酸化されトリ
プシンと消化されたバクテリアＧＳＴｐ８５αＮ−Ｃが
同じホスホペプチドを含有しているので、このことは、
ホスホセリン残基がｐ８５タンパク質のＣ−末端半分内
に存在していることを示唆するものである。ホスホペプ
チドは、ｐ８５α及びｐ１１０ウィルスに共同感染し、
生体外で燐酸化されたＳｆ９細胞からの大量調製ｐ８５
のトリプシン消化物から精製され、次に、質量及びＮ−
末端配列分析を行った。自動アミノ末端エドマン分解に
よって、前記ホスホペプチドのアミノ末端が確認され、
その結果、このアミノ末端がＫＬＮＥＷＬＧＮＥＮＴＥ
ＤＱＹＳＬＶＥＤＤＥＤＬＰＨＨＤＥＫの配列を有して
いることが示唆された。質量分析は、質量が、燐酸化残
基を含有しないペプチドの質量は３４８４ｋＤａである
はずであるが故に、このペプチドにおける単一の燐酸化
位置と一致する３５８３ｋＤａであることを示した。ホ
スホアミノ酸分析は、分子がもっぱら生体外でセリン上
で燐酸化されることを示し、これらの結果は、Ｓｅｒ−
６０８が燐酸化の主要位置であることを示すものであ
る。例１０参照。生体内で標識化されたＳｆ９細胞のホ
スホアミノ酸分析においては、ホスホトレオニンも検出
された（図１３参照）が、ホスホトレオニンを含有する
ペプチドを回収することは不可能であった。
プシンと消化されたバクテリアＧＳＴｐ８５αＮ−Ｃが
同じホスホペプチドを含有しているので、このことは、
ホスホセリン残基がｐ８５タンパク質のＣ−末端半分内
に存在していることを示唆するものである。ホスホペプ
チドは、ｐ８５α及びｐ１１０ウィルスに共同感染し、
生体外で燐酸化されたＳｆ９細胞からの大量調製ｐ８５
のトリプシン消化物から精製され、次に、質量及びＮ−
末端配列分析を行った。自動アミノ末端エドマン分解に
よって、前記ホスホペプチドのアミノ末端が確認され、
その結果、このアミノ末端がＫＬＮＥＷＬＧＮＥＮＴＥ
ＤＱＹＳＬＶＥＤＤＥＤＬＰＨＨＤＥＫの配列を有して
いることが示唆された。質量分析は、質量が、燐酸化残
基を含有しないペプチドの質量は３４８４ｋＤａである
はずであるが故に、このペプチドにおける単一の燐酸化
位置と一致する３５８３ｋＤａであることを示した。ホ
スホアミノ酸分析は、分子がもっぱら生体外でセリン上
で燐酸化されることを示し、これらの結果は、Ｓｅｒ−
６０８が燐酸化の主要位置であることを示すものであ
る。例１０参照。生体内で標識化されたＳｆ９細胞のホ
スホアミノ酸分析においては、ホスホトレオニンも検出
された（図１３参照）が、ホスホトレオニンを含有する
ペプチドを回収することは不可能であった。
【０１５４】例 １８
ＰＩ３−キナーゼの調節は、会合タンパク質セリン／ト
レオニンキナーゼによって達成可能である。ｐ８５α及
びｐ１１０タンパク質を発現するウィルスによって共同
感染させておいた昆虫細胞の溶離物を、ｐ１１０サブユ
ニットに対する抗体で免疫沈降させた。これらの免疫複
合体を、［γ32Ｐ］ＡＴＰの存在下において、０，１，
２，５，１０，２０そして４０分間へと徐々に時間を増
やしながら、燐酸化させた（図２１，Ａ，レーン１−７
参照）。各時間後ごとに、ＭｎＣｌ2をキレート化し除
去するために、１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有溶離物バッファ
でよく洗浄することによって反応を停止させた。次に、
これらの免疫複合体を二つの部分に分解し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ及びオートラジオグラフィによるタンパク質の分
析に使用し（図２１，Ａ）、のこりのサンプルをＰＩ３
−キナーゼ分析した（図２１，Ｂ）。
レオニンキナーゼによって達成可能である。ｐ８５α及
びｐ１１０タンパク質を発現するウィルスによって共同
感染させておいた昆虫細胞の溶離物を、ｐ１１０サブユ
ニットに対する抗体で免疫沈降させた。これらの免疫複
合体を、［γ32Ｐ］ＡＴＰの存在下において、０，１，
２，５，１０，２０そして４０分間へと徐々に時間を増
やしながら、燐酸化させた（図２１，Ａ，レーン１−７
参照）。各時間後ごとに、ＭｎＣｌ2をキレート化し除
去するために、１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有溶離物バッファ
でよく洗浄することによって反応を停止させた。次に、
これらの免疫複合体を二つの部分に分解し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ及びオートラジオグラフィによるタンパク質の分
析に使用し（図２１，Ａ）、のこりのサンプルをＰＩ３
−キナーゼ分析した（図２１，Ｂ）。
【０１５５】図２１，Ｂは、ｐ８５αサブユニットに観
察される燐酸化のレベル増加が、それに対応するＰＩ３
−キナーゼ活性における減少と平行していることを示し
ている。ＭｎＣｌ2及び［γ32Ｐ］ＡＴＰの存在下にお
いて酵素を２０分間温置した後、約８０％のキナーゼ活
性が消滅する。この効果は、不活性化酵素をホスファタ
ーゼによって処理することによって逆行させることが可
能である。セリン燐酸化酵素（図２１，Ｃ，レーン２）
を、ホスホプロテイン ホスファターゼ２Ａ，レーン
３、又はアルカリホスファターゼ，レーン４のいずれか
によって処理することによって、［γ32Ｐ］ＡＴＰがｐ
８５αサブユニットから除去された。これらのホスファ
ターゼ−処理サンプルの平行ＰＩ３−キナーゼ分析は、
活性の回復を示した（図２１，Ｄ，レーン１−４参
照）。非処理のＰＩ３−キナーゼも、アルカリホスファ
ターゼあるいはホスホプロテイン ホスファターゼ２Ａ
のいずれかと温置してみたが、ＰＩ３−キナーゼ活性に
おいて顕著な変化は観察されなかった。
察される燐酸化のレベル増加が、それに対応するＰＩ３
−キナーゼ活性における減少と平行していることを示し
ている。ＭｎＣｌ2及び［γ32Ｐ］ＡＴＰの存在下にお
いて酵素を２０分間温置した後、約８０％のキナーゼ活
性が消滅する。この効果は、不活性化酵素をホスファタ
ーゼによって処理することによって逆行させることが可
能である。セリン燐酸化酵素（図２１，Ｃ，レーン２）
を、ホスホプロテイン ホスファターゼ２Ａ，レーン
３、又はアルカリホスファターゼ，レーン４のいずれか
によって処理することによって、［γ32Ｐ］ＡＴＰがｐ
８５αサブユニットから除去された。これらのホスファ
ターゼ−処理サンプルの平行ＰＩ３−キナーゼ分析は、
活性の回復を示した（図２１，Ｄ，レーン１−４参
照）。非処理のＰＩ３−キナーゼも、アルカリホスファ
ターゼあるいはホスホプロテイン ホスファターゼ２Ａ
のいずれかと温置してみたが、ＰＩ３−キナーゼ活性に
おいて顕著な変化は観察されなかった。
【０１５６】参考文献
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【０１５７】
【図１】バキュロウィルスによって発現したｐ８５α及
びｐ８５βの、バキュロウィルス発現ｐ１１０と共同感
染した時に昆虫細胞内において安定した活性複合物を形
成する能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＩ３−キナー
ゼ分析を示す図
びｐ８５βの、バキュロウィルス発現ｐ１１０と共同感
染した時に昆虫細胞内において安定した活性複合物を形
成する能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＩ３−キナー
ゼ分析を示す図
【図２】ＧＳＴ−融合タンパク質に対するＰＩ３−キナ
ーゼ活性を示す図
ーゼ活性を示す図
【図３】ＳＨ２及びＢＣＲドメイン間の会合ＰＩ３−キ
ナーゼ活性においてエピトープと結合する抗体の分析を
示す図
ナーゼ活性においてエピトープと結合する抗体の分析を
示す図
【図４】ｐ１１０と直接結合するＳＨ２間領域に於ける
領域の所在と、ＰＩ３−キナーゼ活性の分析を示す図
領域の所在と、ＰＩ３−キナーゼ活性の分析を示す図
【図５】ｐ１１０の結合に必要なｐ８５αの４７８−５
１３とｐ８５βの４４５−４８５のアミノ酸残基の所在
とＰＩ３−キナーゼ活性を示す図
１３とｐ８５βの４４５−４８５のアミノ酸残基の所在
とＰＩ３−キナーゼ活性を示す図
【図６】ＳＲαＷｐ８５α（Ｗ）又はＳＲαＷｐ８５α
△４７８−５１３（Ｍ）プラスミドにトランスフェクシ
ョン感染したマウスＬ細胞のウェスタンブロット分析結
果を示す図
△４７８−５１３（Ｍ）プラスミドにトランスフェクシ
ョン感染したマウスＬ細胞のウェスタンブロット分析結
果を示す図
【図７】ｐ８５に結合するｐ１１０の領域の所在を示す
図
図
【図８】ｐ８５に結合するｐ１１０の領域の所在を示す
図
図
【図９】ｐ８５に結合可能なｐ１１０の領域のマッピン
グを示す図
グを示す図
【図１０】ウシのｐ８５α及びｐ８５βの配列の比較図
【図１１】ｐ８５のコイル状コイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃ
ｏｉｌ）ドメインの略図
ｏｉｌ）ドメインの略図
【図１２】Ｍｎ2+依存タンパク質キナーゼ活性用の基質
としてのｐ８５α及びｐ８５βのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オ
ートラジオグラフィ分析結果を示す図
としてのｐ８５α及びｐ８５βのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オ
ートラジオグラフィ分析結果を示す図
【図１３】生体内及び生体外におけるＰＩ３−キナーゼ
活性のＳＤＳ／ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィによる
ホスホアミノ酸分析結果を示す図
活性のＳＤＳ／ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィによる
ホスホアミノ酸分析結果を示す図
【図１４】ＰＩ３−キナーゼのｐ１１０サブユニットの
ＳＤＳ／ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィと分析結果を
示す図
ＳＤＳ／ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィと分析結果を
示す図
【図１５】ｐ１１０サブユニットのタンパク質キナーゼ
分析とＳＤＳ／ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィを示す
図
分析とＳＤＳ／ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィを示す
図
【図１６】35Ｓメチオニン標示トランスフェクション感
染細胞由来の溶離物のＳＤＳ／ＰＡＧＥオートラジオグ
ラフィを示す図
染細胞由来の溶離物のＳＤＳ／ＰＡＧＥオートラジオグ
ラフィを示す図
【図１７】スクロース濃度グラディエントに関するＰＩ
３−キナーゼ及びセリンキナーゼ活性の分析結果を示す
図
３−キナーゼ及びセリンキナーゼ活性の分析結果を示す
図
【図１８】所要Ｎｂｓ2及びＤＴＴ−チオール実験を示
す図
す図
【図１９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィ
によるＧＳＴ−ｐ８５α突然変異体の生体外キナーゼ分
析を示す図
によるＧＳＴ−ｐ８５α突然変異体の生体外キナーゼ分
析を示す図
【図２０】生体内及び生体外において燐酸化されたｐ８
５αのホスホペプチドマッピングを示す図
５αのホスホペプチドマッピングを示す図
【図２１】ｐ８５αのセリン燐酸化とＰＩ３−キナーゼ
活性の抑制を示す図
活性の抑制を示す図
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｑ 1/48 5/00 Ｂ
(72)発明者 マイケル・デレク・ウォーターフィール
ド
イギリス バークシャー アールジー13
１アールエヌ ニューベリー スピー
ン スピーン・レーン（無番地） シャ
ントマーレ
(72)発明者 イアン・ドナルド・ハイルズ
イギリス ケント ビーアール２ ７エ
ルキュー ブロムリー ヘイズ ジョー
ジ・レーン 62
(72)発明者 イヴァン・タラソヴィッチ・ガウト
イギリス ロンドン エヌ６ ６エヌユ
ー ハイゲート・ウェスト・ヒル 91
(72)発明者 春日 雅人
兵庫県神戸市東灘区御影町御影平野
1591‐３‐205
(72)発明者 米澤 一仁
兵庫県神戸市中央区楠町６丁目２‐15-
301
(56)参考文献 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，1993，
Ｖｏｌ．13， ＮＯ．９， ｐ．5560−
5566
Ｃｅｌｌ，1991， Ｖｏｌ．65，
ｐ．91−104
Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ，1992， Ｖｏｌ．８， ｐ．429−
462
Ｃｅｌｌ，1992， Ｖｏｌ．70，
ｐ．419−429
Ｃｅｌｌ，1992， Ｖｏｌ．71，
ｐ．359−362
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，1993，
Ｖｏｌ．13， Ｎｏ．３， ｐ．1657−
1665
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 9/12
C12N 9/99
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
(54)【発明の名称】 セリンキナーゼ活性の抑制方法、ＰＩ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、Ｐ
Ｉ３−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分
子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット
結合分子、サブユニットの存在検出方法、ＰＩ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびＰＩ
３−キナーゼ活性の抑制剤
Claims (17)
- 【請求項１】 ＰＩ３−キナーゼ酵素のセリンキナーゼ
活性を抑制する方法であって、ＰＩ３−キナーゼのｐ１
１０サブユニットのＤＲＨＮＳＮ配列またはｐ８５サブ
ユニットのＳＨ２間領域の配列を無効化する工程を有す
るセリンキナーゼ活性の抑制方法。 - 【請求項２】 前記配列が標的変異によって無効化され
る請求項１に記載のセリンキナーゼ活性の抑制方法。 - 【請求項３】 前記配列が、前記ＰＩ３−キナーゼ酵素
のｐ１１０サブユニットの前記ＤＲＨＮＳＮ配列に特定
的に結合する抗体との相互作用によって無効化される請
求項１に記載のセリンキナーゼ活性の抑制方法。 - 【請求項４】 前記抗体が、前記ＤＲＨＮＳＮ配列に特
定的に結合するモノクローナル抗体である請求項３に記
載のセリンキナーゼ活性の抑制方法。 - 【請求項５】 ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブユニット
とｐ１１０サブユニットとの間の結合を抑制する方法で
あって、前記ＰＩ３−キナーゼのｐ８５βサブユニット
のアミノ酸残基４４５〜アミノ酸残基４８５を有する領
域またはｐ８５αサブユニットのアミノ酸残基４７８〜
アミノ酸残基５１３を有する領域を無効化する工程を有
する、ＰＩ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の
調整方法。 - 【請求項６】 ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットに
結合するリガンドとしての分離アンタゴニストであっ
て、このアンタゴニストが、前記ｐ８５サブユニットに
結合することによってセリンである位置６０８に於ける
燐酸化が阻止され、これによってＰＩ３−キナーゼ活性
が減少すると共に、前記アンタゴニストが無効化された
ＤＲＨＮＳＮ配列を含有するｐ１１０サブユニットであ
る。 - 【請求項７】 ｐ８５サブユニットのＳＨ２間領域に位
置するエピトープにおいてＰＩ３−キナーゼの前記ｐ８
５サブユニットに特定的に結合する分離抗体であって、
前記抗体は少なくとも前記ＰＩ３−キナーゼの前記ｐ８
５βサブユニットのアミノ酸残基４４５〜アミノ酸残基
４８５を有するエピトープに特定的に結合するかまたは
前記ＰＩ３−キナーゼの前記ｐ８５αサブユニットのア
ミノ酸残基４７８〜アミノ酸残基５１３を有するエピト
ープに特定的に結合するものであり、それにより前記Ｐ
Ｉ３−キナーゼの前記ｐ８５サブユニットとｐ１１０サ
ブユニットとの間の結合に干渉する、ＰＩ３−キナーゼ
のサブユニット結合抗体。 - 【請求項８】 モノクローナル抗体である請求項７に記
載のＰＩ３−キナーゼのサブユニット結合抗体。 - 【請求項９】 請求項８に記載のＰＩ３−キナーゼのサ
ブユニット結合抗体を生成するハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項１０】 ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブユニッ
ト及びｐ１１０サブユニット間の結合を抑制する方法で
あって、ｐ８５を含有するサンプルを請求項７の抗体に
接触させる工程を有する、ＰＩ３−キナーゼのサブユニ
ット間の結合活性の調整方法。 - 【請求項１１】 ＰＩ３−キナーゼ酵素のセリンキナー
ゼ活性を抑制する方法であって、前記ＰＩ３−キナーゼ
のｐ８５サブユニットの位置６０８においてセリン残基
を無効化、又はセリン残基に干渉する工程を有するセリ
ンキナーゼ活性の抑制方法。 - 【請求項１２】 前記セリン残基が標的変異によって無
効化される請求項１１に記載のセリンキナーゼ活性の抑
制方法。 - 【請求項１３】 ＰＩ３キナーゼのセリンである位置６
０８において燐酸化されているｐ８５サブユニットに結
合する分子であって、前記分子が前記サブユニットに結
合することによりセリンである位置６０８における燐酸
化が保護され、これによってＰＩ３−キナーゼ活性を抑
制する分子であり、かつ前記分子が抗体または標的化さ
れたＤＲＨＮＳＮ配列を含有するｐ１１０サブユニット
である、サブユニット結合分子。 - 【請求項１４】 前記分子が抗体である請求項１３に記
載のＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合
分子。 - 【請求項１５】 前記抗体はモノクローナル抗体である
請求項１４に記載のＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するサ
ブユニット結合分子。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載のモノクローナル抗
体を生成するハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項１７】 ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するため
の薬剤を製造する方法であって、ＰＩ３−キナーゼ酵素
のＤＲＨＮＳＮ配列に結合、又はＤＲＨＮＳＮ配列に干
渉することが可能な物質を選択し、ここで前記物質は抗
体または標的化されたＤＲＨＮＳＮ配列を含有するｐ１
１０サブユニットであり、この物質を医療用に調合する
工程を有する、ＰＩ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00431394A JP3471879B2 (ja) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | セリンキナーゼ活性の抑制方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、ｐｉ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合分子、サブユニットの存在検出方法、ｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00431394A JP3471879B2 (ja) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | セリンキナーゼ活性の抑制方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、ｐｉ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合分子、サブユニットの存在検出方法、ｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07203963A JPH07203963A (ja) | 1995-08-08 |
| JP3471879B2 true JP3471879B2 (ja) | 2003-12-02 |
Family
ID=11580999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00431394A Expired - Fee Related JP3471879B2 (ja) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | セリンキナーゼ活性の抑制方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、ｐｉ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合分子、サブユニットの存在検出方法、ｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3471879B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9521987D0 (en) * | 1995-10-26 | 1996-01-03 | Ludwig Inst Cancer Res | Phosphoinositide 3-kinase modulators |
| HU223344B1 (hu) * | 1997-08-13 | 2004-06-28 | Máté Hidvégi | Immunstimuláns és metasztázist gátló fermentált, szárított anyag, ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények, eljárás az előállítására és alkalmazásai |
| US5993300A (en) * | 1997-08-18 | 1999-11-30 | Hashimoto; Hiroshi | Ultrasonic vibration composite processing tool |
-
1994
- 1994-01-20 JP JP00431394A patent/JP3471879B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９２， Ｖｏｌ．８， ｐ．４２９−４６２ |
| Ｃｅｌｌ，１９９１， Ｖｏｌ．６５， ｐ．９１−１０４ |
| Ｃｅｌｌ，１９９２， Ｖｏｌ．７０， ｐ．４１９−４２９ |
| Ｃｅｌｌ，１９９２， Ｖｏｌ．７１， ｐ．３５９−３６２ |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３， Ｖｏｌ．１３， Ｎｏ．３， ｐ．１６５７−１６６５ |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３， Ｖｏｌ．１３， ＮＯ．９， ｐ．５５６０−５５６６ |
Also Published As
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|---|---|
| JPH07203963A (ja) | 1995-08-08 |
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