JP2001510684A - アッセイ、治療法及び治療手段 - Google Patents

アッセイ、治療法及び治療手段

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Abstract

(57)【要約】 ＡＴＭおよび関係するタンパク質キナーゼ、例えば、ＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫとｐ５３との相互作用、特にこれらのタンパク質によるＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８のリン酸化が開示される。タンパク質の活性はＤＮＡの存在において増加することが示される。タンパク質およびｐ５３または同様なリン酸化部位を有する他のタンパク質の間の相互作用によるリン酸化のモジュレーターのアッセイが提供される。ＤＮＡまたはＮＴＡを使用するＡＴＭまたはＡＴＲを精製する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、既知のタンパク質の間の相互作用、したがって治療の関係において
重要な多数の細胞のプロセス、の驚くべき発見および特性決定に基づく、スクリ
ーニング方法、ペプチド、模倣物、および使用方法に関する。問題のタンパク質
はＡＴＭおよびｐ５３であり、そして本発明者らはＡＴＭがｐ５３を多数の特異
的部位においてリン酸化することを見出した。この相互作用は、関連キナーゼ活
性を有する他の関係するタンパク質、特にＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫ、およびｐ
５３に類似するリン酸化部位を有する他のタンパク質で認められる。本発明の他
の面は、ＡＴＭがＤＮＡに結合すること、およびこのような結合がＡＴＭによる
ｐ５３のリン酸化に対して効果を有することである。
【０００２】 抹消血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）は、多数の衰弱症候、例えば、進行性小脳
変性、眼皮膚の（ｏｃｃｕｌｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ）抹消血管拡張、成長遅延、
免疫欠損および早期の老化のある種の特徴により特徴づけられる、ヒトの常染色
体性劣性疾患である（Ｊａｃｋｓｏｎ、１９９５；Ｍｅｙｎ、１９９５；Ｓｈｉ
ｌｏｈ、１９９５、において概観されている）。Ａ−Ｔ患者はほぼ１００倍の癌
の発生率を示し、特にリンパ球系由来の悪性疾患にかかりやすい。さらにＡ−Ｔ
ヘテロ接合体は、集団の約１％を構成し、乳癌のより高い発生率を示すと報告さ
れている（Ｅａｓｔｏｎ、１９９４；Ｍｅｙｎ、１９９５）が、これは論争を呼
んでいる（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ他、１９９７）。細胞レベルにおいて、Ａ−Ｔ
は高度の染色体の不安定性、放射線耐性ＤＮＡ合成、およびイオン化放射線（Ｉ
Ｒ）および放射線類似作用薬剤に対する過敏性により特徴づけられる。
【０００３】 さらに、Ａ−Ｔ細胞は放射線誘発Ｇ１−Ｓ、Ｓ、およびＧ２−Ｍ細胞周期のチ
ェックポイントを欠如し、これらのチェックポイントはＤＮＡの複製または有糸
分裂の前のゲノムの修復を可能とするために、ＤＮＡ損傷に応答して細胞周期を
抑制すると考えられている（Ｈａｌａｚｏｎｅｔｉｓ他、１９９３；Ｂｅａｍｉ
ｓｈ他、１９９４；ＢｅａｍｉｓｈおよびＬａｖｉｎ、１９９４；Ｋｈａｎｎａ
他、１９９５；Ｂａｒｌｏｗ他、１９９６；ＸｕおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１
９９６）。Ａ−Ｔ細胞はＩＲに応答するｐ５３の誘導の欠如または高度の遅延を
示す（Ｋａｓｔａｎ他、１９９２；ＫｈａｎｎａおよびＬａｖｉｎ、１９９３；
ＬｕおよびＬａｎｅ、１９９３；ＸｕおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９６）。
ｐ２１／ＷＡＦ１／ＣＩＰ１およびＧａｄｄ４５のｐ５３仲介転写活性化、およ
びＧ１サイクリン依存性キナーゼの引き続く阻害もまたＩＲ暴露後にＡ−Ｔ細胞
において欠如する（Ａｒｔｕｓｏ他、１９９５；Ｋｈａｎｎａ他、１９９５）。
しかしながら、ＬｕおよびＬａｎｅ、１９９３は、正常細胞およびＡ−Ｔ細胞か
らのｐ５３の応答における非常にわずかの差を報告した。
【０００４】 さらに、酵母はＡＴＭ相同体（Ｍｅｃ１）を有するが、ｐ５３をもたない（Ｇ
ｏｆｆｅａｕ他）。Ｍｅｃ１ｐの可能な基質についての最良のデータはＳｐｋ１
／Ｒａｄ５３である（Ｓｕｎ他；Ｓａｎｃｈｅｚ他）。 Ａ−Ｔ患者において突然変異した遺伝子は、ＡＴＭ（Ａ−Ｔ仲介）と呼ばれ、
マッピングされ、そのｃＤＮＡがクローニングされた（Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、１
９９５ａ；Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、１９９５ｂ）。配列の分析において、ＡＴＭ遺
伝子は約３５０ｋＤａのポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、そのカ
ルボキシル末端領域における推定上のキナーゼドメインによって、タンパク質の
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼファミリーの１メンバーであ
ることを明らかにされた（Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、１９９５ａ；Ｓａｖｉｔｓｋｙ
他、１９９５ｂ）。古典的ＰＩ３−キナーゼ、例えば、ＰＩ３−キナーゼ自体は
、シグナルトランスダクションに関係し、そして細胞内の第２メッセンジャーと
して作用するイノシトール脂質をリン酸化する（ＫａｐｅｌｌｅｒおよびＣａｎ
ｔｌｅｙ、１９９４、において概観されている）。ＡＴＭはＰＩ３−キナーゼタ
ンパク質ファミリーのサブセットと類似性を有し、このサブセットは、ＡＴＭと
同様に、細胞周期のコントロールおよび／またはＤＮＡ損傷の検出およびシグナ
リングに関係するタンパク質を含む（概観については、下記の文献を参照のこと
：Ｈｕｎｔｅｒ、１９９５；ＫｅｉｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、１９９５；
Ｚａｋｉａｎ、１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎ、１９９６）。
【０００５】 このサブグループには、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴｏｒ１ｐおよびＴｏｒ２ｐおよびそれらの
哺乳類の相同体のＦＲＡＰが包含され、これらはＳ相への進行をコントロールし
、そして、少なくとも一部分、翻訳の調節により機能をコントロールする（Ｂｒ
ｏｗｎおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、１９９６）。また、このサブグループには、
ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）触媒サブユニット（ＤＮＡ−
ＰＫcs）が包含され、これはＩＲに対する感受性および部位特異的Ｖ（Ｄ）Ｊ組
換えの実行不能に導く欠陥を有する（ＪａｃｋｓｏｎおよびＪｅｇｇｏ、１９９
５；Ｊａｃｋｓｏｎ、１９９６、において概観されている）。同定されたＰＩ３
−キナーゼファミリーのＡＴＭサブグループの他のメンバーは、サッカロミセス
・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴｏｒ１ｐおよびＭｅｃ１ｐ、な
らびにシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｏｍｂｅ）（ｒａｄ３）、ドロソフィラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｐｐｈ
ｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ｍｅｉ−４１）およびヒトＦＲＰ１／Ａ
ＴＲのＭｅｃ１ｐ相同体を包含する（ＫｅｉｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、１
９９５；Ｚａｋｉａｎ、１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎ、１９９６）。ＡＴＭを使用
するときのように、これらのタンパク質の欠如は、ゲノムの不安定性、ＤＮＡ損
傷因子に対する過敏性、およびＤＮＡ損傷誘導細胞周期のチェックポイントのコ
ントロールの欠如に導く。
【０００６】 ＡＴＭは、それ以上生化学的機能をもたないことが示されていない、サッカロ
ミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴｏｒ１ｐに最も類似する
（同一性および類似性は、それぞれ、４５％および６６％である）。ＡＴＭはＤ
ＮＡ−ＰＫcsから非常に分岐しており（２８％の同一性および５１％の類似性）
、ＰＩ３−キナーゼと本質的に同一の相同性を有する（真正な脂質キナーゼ：（
２４％の同一性および５１％の類似性）。こうして、配列の比較単独から、ＡＴ
ＭはＤＮＡ−ＰＫcsに類似するタンパク質キナーゼまたはＰＩ３−キナーゼに類
似する脂質キナーゼであることを予測することができない。
【０００７】 遺伝的データはＤＮＡ損傷の認識およびその修復におけるＡＴＭ様タンパク質
の掛かり合いを示すが、これらのタンパク質が機能するメカニズムはよく理解さ
れていない。臨床的症状およびＡＴＭにおける突然変異から生ずる細胞の表現型
について非常によく知られているが、ＡＴＭタンパク質が機能するメカニズムに
ついてはほとんど知られていない。最近の研究において、ＤＮＡ−ＰＫcsと同様
に、ＡＴＭは偏在的に発現され、細胞核の中に主として局在化される（Ｃｈｅｎ
およびＬｅｅ、１９９６；Ｌａｋｉｎ他、１９９６；Ｂｒｏｗｎ他、１９９７；
Ｗａｔｔｅｒｓ他、１９９７）。 ＡＴＭがＰＩ３−キナーゼファミリーの１メ
ンバーであるという認識は、ＡＴＭの主要な機能がイノシトールリン脂質をリン
酸化できることを多少示唆する。Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、（１９９５、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６８、１７４９−１７５３）は、例えば、タンパク質のリン酸化を論じ
ている。事実、この証拠のある部分において、ＡＴＭは我々がここにおいて確立
したものと非常に異なる方法において機能することを示唆している。例えば、Ａ
−Ｔ患者のＢ細胞およびＴ細胞の作動に応答する、欠陥のあるチロシンのリン酸
化およびカルシウム移動化は、Ａ−Ｔ細胞における細胞質内のシグナリング経路
の欠陥の考えを支持する（ＳａｖｉｔｓｋｙのＳｃｉｅｎｃｅの論文１９９５に
記載されている）。これらのデータはＫｈａｎｎａ他、（１９９７、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）において提供された。また、この論文には、ＡＴＭが機能でき
る異なる方法を示唆する、種々の他のデータが要約されている。
【０００８】 Ｓａｖｉｔｓｋｙ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５）は、あるＡ−Ｔ患者におい
て観察されるインスリン依存性真性糖尿病が、インスリンによるグルコース輸送
に影響を与えるＰＩ３−キナーゼに類似する方法におけるＡＴＭの作用を反映し
うることを述べている。彼らは、また、ＡＴＭについてのパラダイムとしてアポ
プトーシスの制御によりＰＩ３−キナーゼを論じている、すなわち、Ａ−ＴがＰ
Ｉ３−キナーゼと同様に働くことを示唆することによって、Ａ−Ｔの特徴の多数
を説明することができる。
【０００９】 あるＡ−Ｔ細胞はＡＴＤＣと呼ばれる遺伝子により補足されることが示され、
ＡＴＤＣの産物は細胞質であるビメンチンと呼ばれる中間体のフィラメント状タ
ンパク質と相互作用する（Ｂｒｚｏｓｋａ他；ＰＮＡＳ）。Ａ−Ｔ細胞系統が異
常に凝集したアクチンフィラメントを有し、ＡＴＭの役割が細胞質の中に存在す
ることを示唆すると、彼らは述べている。
【００１０】 我々はＡＴＭを精製した。我々が報告するように、ＡＴＭはＤＮＡと結合し、
そしてＤＮＡにより刺激される、関連タンパク質キナーゼ活性を有する。さらに
、ＡＴＭはｐ５３のキナーゼとして作用し、そしてリン酸化部位はｐ５３ポリペ
プチドの機能的に重要な領域に存在することを我々は示す。これらの部位はＳｅ
ｒ１５およびＴｈｒ１８である。また、ＤＮＡ−ＰＫもまたｐ５３のＳｅｒ１５
およびＴｈｒ１８部位をリン酸化することができ、そしてＡＴＲはＳｅｒ１５を
リン酸化することを我々は示す。さらに、ｐ５３のこれらの部位のリン酸化は、
細胞内の分解についてｐ５３をターゲットするタンパク質であるＭｄｍ−２との
ｐ５３の相互作用を崩壊させることを我々は示す。
【００１１】 これらの部位ターゲッティングすることによって、ＡＴＭはＤＮＡの結合のた
めにｐ５３を活性化し、および／またはＭｄｍ−２の解離を引き起こし、こうし
てｐ５３を安定化し（そのタンパク質の量を増加させ）、それが転写を活性化で
きるようにする。 ｐ５３のＴｈｒ１８は、我々の知る限りでは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおいてリン酸化されることがが示されていない。この部位は、特性決
定されたＤＮＡ−ＰＫコンセンサスリン酸化部位に合致しない。したがって、こ
こでリン酸化の我々の発見は完全に予期せざることである。
【００１２】 Ｓｅｒ１５はＤＮＡ−ＰＫによりリン酸化されるが、それにもかかわらず、特
にＤＮＡ損傷に応答するそのリン酸化がＡ−Ｔ細胞において変更されることを示
すデータは存在しないので、ＡＴＭによるそのリン酸化もまた驚くべきことであ
る。 この研究および後述する研究に基づいて、本発明は、種々の面において、ＡＴ
Ｍ（およびＡＴＲ）とｐ５３との間の相互作用、特にＡＴＭおよびＡＴＲにより
ｐ５３リン酸化、およびこれらのタンパク質によるＤＮＡの結合（これはｐ５３
のリン酸化に対する効果を増強することがさらに示された）のモジュレーション
を提供する。
【００１３】 本発明の種々の面は、ＡＴＭとｐ５３との間の相互作用、特にＡＴＭによるｐ
５３のリン酸化をモジュレートする因子のスクリーニング法およびアッセイにお
ける、ＡＴＭ（または関係するキナーゼ、例えば、ＡＴＲまたはＤＮＡ−ＰＫ）
およびｐ５３（ＤＮＡの存在または不存在における）の使用を提供する。 それ以上の面は、ＡＴＭ、または関係するキナーゼ、例えば、ＡＴＲまたはＤ
ＮＡ−ＰＫと、ＡＴＭによりリン酸化されるｐ５３におけるそれらに対して相同
のリン酸化部位を含む他の分子との間の相互作用のモジュレーション、および有
用な因子のスクリーニング法およびアッセイにおけるこれらの分子の使用を提供
する。簡素化のために、本発明の開示の多くはＡＴＭおよびｐ５３について言及
する。しかしながら、特記しない限り、このような言及のすべてはＡＴＭと、Ａ
ＴＭによりリン酸化されるｐ５３におけるそれらの１つに対して相同のリン酸化
部位を含む他の分子との間の相互作用に等しく適用可能であることを理解すべき
である。
【００１４】 同様に、本明細書における開示に基づいて、本発明は、ｐ５３の部位、特にＳ
ｅｒ１５およびＴｈｒ１８をリン酸化することができる、関連タンパク質キナー
ゼ活性を有する他のタンパク質キナーゼの使用に拡張される。典型的には、これ
らの他のキナーゼのタンパク質キナーゼドメインは、ＡＴＭの対応するドメイン
と少なくとも３０％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも３５％の配
列の同一性、より好ましくは少なくとも４０％の配列の同一性、より好ましくは
少なくとも５０％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列の同
一性、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列の同一性を共有するだろう。
このようなキナーゼの例は、ＡＴＭ（また、ＦＲＰ１として知られている、Ｃｉ
ｍｐｒｉｃｈ他、１９９６参照）およびＤＮＡ−ＰＫcsである。
【００１５】 このような分子は、種々の手段により同定することができる。例えば、ｐ５３
および／またはペプチドフラグメント、例えば、ｐ５３のＮ末端の４２アミノ酸
など、または関係するリン酸化部位を含む約１０アミノ酸のアラニンの走査およ
び検出分析を使用して、ｐ５３のリン酸化に重要である残基について、情報を得
ることができる。突然変異を使用して、リン酸化に影響を与える残基および影響
を与えない残基を同定することができる。主要な残基が同定されたとき、適当な
らば配列中の保存的変動（下記を参照のこと）を考慮して、残基の同一または類
似するパターンを含むタンパク質について、コンピューター配列データベースに
より走査することができる。次いで、候補の分子をＡＴＭによるリン酸化の１以
上のアッセイ（例えば、後述するアッセイ）において使用することができる。
【００１６】 下記においてさらに説明するように、ｐ５３のＡＴＭによるリン酸化をモジュ
レートする、特に阻害するペプチドおよび非ペプチジル因子の設計において、ま
た、ＡＴＭによりリン酸化されたｐ５３における部位のいずれかにおけるリン酸
化のための主要な残基の同定を使用することができる。 ＡＴＭとｐ５３（または、ＡＴＲ、または同様な関連キナーゼ活性を有する関
係するタンパク質、およびＡＴＭによりリン酸化されるｐ５３におけるそれらの
１つに対して相同のリン酸化部位を含む他の分子を想起しなくてはならない）と
の間の相互作用をモジュレートすることができる因子を得る方法は、適当な終点
を使用して、被験物質の存在および不存在における相互作用を評価する方法を包
含する。アッセイ系を使用して、ＡＴＭのキナーゼ活性、ＡＴＭのＤＮＡの結合
および／または１以上の他の分子とのＡＴＭの相互作用を決定することができる
。リン酸化アッセイのために、全長のｐ５３、ｐ５３のトランケーテッド部分、
または他のタンパク質（例えば、ＧＳＴ）に融合されたｐ５３の部分、またはこ
れらの任意の適当な変異型または誘導体を使用することができる。ｐ５３のリン
酸化領域に対応するペプチドを使用して、ペプチドのリン酸化アッセイを開発す
ることができる。前述の任意のリン酸化は、種々の手順、例えば、後述する手順
の任意のものによりアッセイし、そして高い処理量のスクリーニングアプローチ
に採用することができる。ＤＮＡの結合の妨害をアッセイすることができるが、
キナーゼ活性の阻害はいっそう感受性であり、ＤＮＡの結合の阻害に対するより
広範な種類のインヒビターを同定することができるので、本発明の熟練したオペ
レーターにより好まれるであろう。
【００１７】 ＡＴＭキナーゼ活性は２つのＮ末端のｐ５３部位のいずれについてもアッセイ
することができる。リン酸化をアッセイするとき、ＤＮＡをアッセイ系の中に含
めることが好ましい。ＡＴＭ仲介リン酸化事象の２つの部位のインヒビターおよ
びアクチベーターのために、関係するが、異なるスクリーンを構成することがで
きる。
【００１８】 一般に、ＡＴＭによるｐ５３（または他の分子）のリン酸化のモジュレーショ
ンは最も重要である。この面を下記において詳細に説明する。しかしながら、ラ
イブラリー技術の組合わせは、潜在的に非常に大きい数の異なる物質をポリペプ
チドとの相互作用および／またはポリペプチドの活性をモジュレートする能力に
ついて試験する効率よい方法を提供することに注目することは価値がある。この
ようなライブラリーおよびそれらの使用は、なかでも、天然の産物、小さい分子
およびペプチドのすべての方法について、この分野において知られている。ペプ
チドのライブラリーの使用はある種の環境において好ましいことがある。
【００１９】 細胞レベルにおいて、Ａ−Ｔ細胞は、染色体の不安定性、放射線感受性を表示
し、イオン化放射線で処理後のｐ５３誘導において損傷され、そして転写因子Ｎ
ＦｋＢの変更された調節を示す。こうして、野生型ＡＴＭ遺伝子は腫瘍サプレッ
サーとして機能し、神経学的変性および通常老化に関連する他の変性状態のサプ
レッサーである。
【００２０】 本発明がベースとする、本明細書において報告する結果が与えられると、ＡＴ
Ｍ関連キナーゼ活性のアクチベーターおよびインヒビターを同定し、種々の目的
の任意のものに適当な因子を獲得し、設計し、使用することができる。 Ａ−Ｔ療法。 ＡＴＭまたはＡＴＲのアクチベーターはＡ−Ｔでヒトを治療す
るとき実用性を有することを証明することができる（下記においてさらに説明す
る）。
【００２１】 免疫系の機能のモジュレーション。 Ａ−Ｔ患者は免疫不全を表示し、ＡＴＭ
が完全に機能的な免疫系の発生に必要であることを証明する。したがって、ＡＴ
ＭまたはＡＴＲのモジュレーターを免疫系の機能の調節において使用することが
できる。 ＡＩＤＳの療法。 ＡＩＤＳの最終段階に入るヒトのリンパ球は短縮されたテ
ロメアを有し、そしてこれはリンパ球が免疫系をもはや補充できないようにする
ことが示された。Ａ−Ｔ患者の細胞は、正常の個体の細胞よりもテロメアを急速
に失い、ＡＴＭがテロメアの長さのホメオスタシスにおいて陽性の役割を演ずる
ことを証明する。したがって、ＡＴＭ機能のアクチベーターはこれらの個体にお
けるセネッセントリンパ球のテロメアを長くすることによってＡＩＤＳの個体の
治療における実用性を見出し、こうして免疫系の補充を可能とする。
【００２２】 ｐ５３療法。 ＡＴＭによりリン酸化されたｐ５３の部位の同定は、これが非
常に調節的重要性を有することを示す。事実、ＡＴＭによりリン酸化されたｐ５
３上のＮ末端の部位は、タンパク質Ｍｄｍ−２との相互作用においてフランキン
グ配列と一緒に機能することが示された「保存された領域Ｉ」として知られてい
る領域内に存在する（Ｋｕｓｓｉｅ他、１９９６；Ｐｉｃｋｓｌｅｙ他、１９９
４；Ｍｏｍａｎｄ他、１９９２；Ｃｈｅｎ他、１９９３およびおよびその中の参
考文献を参照のこと）。Ｍｄｍ−２は２つのメカニズムによりｐ５３の陰性のレ
ギュレーターとして働く。第１に、Ｍｄｍ−２はｐ５３転写活性化ドメインをマ
スクし、ｐ５３活性化遺伝子を停止させる（Ｍｏｍａｎｄ他、１９９２）。第２
に、Ｍｄｍ−２は細胞内の分解のためにｐ５３ターゲッティングすることが最近
示された（Ｋｕｂｂｕｔａｔ他、１９９７；Ｈａｕｐｔ他、１９９７）。したが
って、ＡＴＭによるｐ５３のリン酸化がＭｄｍ−２とのその相互作用を崩壊させ
、こうして転写的に活性なｐ５３のレベルを増加させるということを、我々のデ
ータは示す。したがって、この知識を利用して、ｐ５３をターゲッティングする
新規な治療剤−例えば、突然変異のｐ５３への結合により、この分子のＡＴＭ仲
介活性化を模擬する小さい分子−を発生させることができる。
【００２３】 これらの部位の任意の１以上におけるリン酸化は、ｐ５３と多数のタンパク質
との相互作用に影響を与えることができる。Ｍｄｍ２が結合するｐ５３上の部位
内のＴｈｒ１８（この相互作用の特性決定について、例えば、下記の文献を参照
のこと：Ｃｈｅｎ他、（１９９３）、Ｋｕｓｓｉｅ他、（１９９６）、Ｐｉｃｋ
ｓｌｅｙ他、（１９９４）およびＭｏｍａｎｄ他、（１９９２））および最小の
Ｍｄｍ２結合配列に近接して存在するＳｅｒ１５の位置が与えられると、Ｍｄｍ
２は１つの特定の例である。事実、１９９７年１０月に発行されたＳｈｉｅｈ他
による報告は、Ｓｅｒ１５におけるリン酸化がｐ５３−Ｍｄｍ２の相互作用を崩
壊させることができることを示す。ｐ５３のリン酸化を使用して、ｐ５３と多数
の他のタンパク質との相互作用に影響を与えることができ、このようなタンパク
質は下記のものを包含する：ＣＢＰ（Ｇｕ他；Ｌｉｌｌ他）、ｐ５３のアミノ末
端の１２３アミノ酸内に結合するアデノウイルスのＥ１Ｂタンパク質（Ｋａｏ他
、１９９０）、残基Ｌｅｕ−２２およびＴｒｐ−２３は重要な役割を演ずる（Ｌ
ｉｎ他、１９９４）、転写因子ＸＰＤ（Ｒａｄ３）およびＸＰＢ、ならびに鎖特
異的ＤＮＡ修復に関係するＣＳＢ（Ｗａｎｇ他、１９９５）、ＴＦＩＩＨ（Ｘｉ
ａｏ他、１９９４）、Ｅ２Ｆ１およびＤＰ１（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ他、１９９５）
、細胞複製プロテインＡ（ＬｉｎおよびＢｏｔｃｈａｎ、１９９３）、複製因子
ＲＰＡ（Ｄｕｔｔａ他、１９９３）、ＷＴ１（Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ他、１９９
３）、ＴＡＴＡ結合性タンパク質（Ｓｅｔｏ他、１９９２、Ｔｒｕａｎｔ他、１
９９２、Ｍａｒｔｉｎ他、１９９３）、およびＴＡＦ（ＩＩ）４０およびＴＡＦ
（ＩＩ）６０（Ｔｈｕｔ他、１９９５）。
【００２４】 下記においてさらに説明する本発明によるアッセイは、これらの相互作用のい
ずれかに対するＡＴＭによるｐ５３のリン酸化の役割を決定することができ、そ
してこのようなリン酸化をモジュレートすることができることが見出された因子
を使用して、これらの相互作用のいずれかを、例えば、治療の関係において、崩
壊または促進することができる。
【００２５】 テロメア長さのモジュレーション。 Ａ−Ｔ細胞は加速されたテロメア短縮の
速度を示す（Ｍｅｔｃａｌｆｅ他、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１３、３５０−３５３）。こうして、ＡＴＭ活性のレギュレーターを使用して
、テロメア長さをコントロールすることができる。ＡＴＭはテロメラーゼ酵素自
体の一部分であるように見えない（Ｍｅｔｃａｌｆｅ他は、テロメラーゼのレベ
ルがＡ−Ｔ細胞において正常であることを示す；また、我々のデータおよびＰａ
ｎｄｉｔａ他、１９９５のデータは、Ａ−Ｔ細胞が多少短縮されたテロメアを有
するが、抑制されたレベルのテロメアをもたないことを示す）。こうして、ＡＴ
Ｍはテロメアの一部分として働かず、テロメア長さのホメオスタティックメカニ
ズムの一部分として働く。したがって、抗ＡＴＭ薬剤は抗テロメア薬剤と相乗的
に働くであろう。
【００２６】 老化。 Ａ−Ｔ患者は増強された老化速度を表し、年齢増加に関連する多数の
症状（神経学的変質、癌、免疫学的欠陥、およびその他）を表し、そして彼らの
細胞は培養において短縮された寿命を示す。したがって、ＡＴＭ活性をモジュレ
ートする因子を使用して、早期および正常の老化に関連する疾患の状態を治療／
予防することができる。
【００２７】 腫瘍／癌の療法。 これは後述される。ＡＴＭの作用をモジュレートする薬剤
を使用して、Ａ−Ｔ患者を治療し；−細胞のテロメアを短縮することによって細
胞の成長の潜在的能力に影響を与えることにより−癌を治療し；免疫系を操作し
−Ａ−Ｔ患者は多少免疫不全である；−腫瘍およびその他の放射線増感により−
腫瘍を治療することができる（下記を参照のこと）。また、ＡＴＭのモジュレー
ターを使用して、テロメア長さおよびその他に影響を与えることによって、細胞
の成長の潜在的能力を制限することができる。ｐ５３に対する連鎖はｐ５３療法
を可能とし、癌細胞中のｐ５３を活性化し、これは、アポプトーシスまたは他の
経路を介して、細胞の成長の阻止しおよび／または細胞の死亡に導くことができ
る。
【００２８】 ＡＴＭ（またはＡＴＲ、ＤＮＡ−ＰＫまたは関係するキナーゼ）のアクチベー
ターを使用して、例えば、細胞を損傷させないで、細胞周期のチェックポイント
の停止を活性化することによって細胞の増殖を阻害することができ、これは腫瘍
、癌、乾癬、アテローム性動脈硬化症および他の過形成疾患の治療において使用
することができる。アクチベーターは、細胞を損傷させないで、細胞中のｐ５３
を活性化するために使用することができる。正常の細胞（ｐ５３＋）が増殖を停
止するように、患者の細胞を処理することができ、こうして患者の細胞は細胞分
裂またはＤＮＡ複製を妨害して細胞を殺す薬剤の投与による殺しに対して不応性
であるが、腫瘍細胞（それらの多数はｐ５３陰性である）は増殖を停止せず、結
局前述の薬剤により選択的に殺される。１例として、ＡＴＭアクチベーターはＡ
ＴＭおよびｐ５３の双方を認識しかつそれらに結合することができるが、ｐ５３
のＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８部位のリン酸化を妨害しないペプチド、またはＤ
ＮＡを使用して観察された活性化と同様な方法においてＡＴＭを活性化すること
ができる物質を包含する。
【００２９】 本発明による因子を使用して、癌の放射線療法および化学療法を増強すること
ができる。イオン化放射線（ＩＲ）および放射線類似作用性薬剤は癌を治療し、
そして主としてＤＮＡ損傷を負わせることによって癌細胞を殺すために普通に使
用される。ＡＴＭを欠如する細胞は、イオン化放射線および放射線類似作用性物
質に対して過敏性である。こうして、ＡＴＭのインヒビターはイオン化放射線お
よび放射線類似作用性物質の殺す作用に対して細胞を過敏性とする。こうして、
ＡＴＭインヒビターは癌の放射線療法および化学療法において補助薬として使用
することができる。
【００３０】 細胞の成長能力は、例えば、癌、老化、およびＡＩＤＳの治療において、モジ
ュレートされることができる。ＡＴＭはテロメアの染色体末端の長さのコントロ
ールにおいてきわめて重要な役割を演ずることが確立された（Ｍｅｔｃａｌｆｅ
他）。大部分の正常の細胞の型におけるテロメア末端は各細胞分裂において短縮
され、そして過度に短縮されたテロメアを有する細胞は分裂することができない
。こうして、テロメアは大部分の正常の哺乳動物細胞の増殖能力を制限する「分
裂計数装置」として機能すると考えられる。したがって、ＡＴＭ機能のインヒビ
ターは、癌細胞または前癌細胞の成長潜在的能力を制限することによって、癌の
進行の防止において実用性を有する。ＡＴＭのアクチベーターは、成長停止から
セネッセント細胞を放出するために使用することができ、こうして老化した個体
の治療において実用性を有することができる。さらに、ＡＩＤＳの最終段階に入
るヒトのリンパ球は短縮されたテロメアを有し、そしてこれはこれらの細胞がも
はや増殖できず、免疫系を補充できないようにすることができることが最近示さ
れた。したがって、ＡＴＭアクチベーターはこのような細胞のテロメアを長くし
、細胞の増殖能力を回復させる。
【００３１】 関係するタンパク質の産生の阻害により、ＡＴＭとｐ５３との間の相互作用を
阻害することができる。例えば、アンチセンス調節により発現に影響を及ぼす適
当な核酸を使用することによって、これらの成分の１以上の産生を阻害すること
ができる。遺伝子の発現をダウンレギュレートするためにアンチセンス遺伝子ま
たは部分的遺伝子配列を使用することは、現在よく確立されている。二本鎖ＤＮ
Ａを「逆向き」にプロモーターの制御下に配置し、こうしてＤＮＡの「アンチセ
ンス」鎖の転写がターゲット遺伝子の「センス」鎖から転写された正常のｍＲＮ
Ａに対して相補的であるＲＮＡを生ずるようにする。次いで相補的アンチセンス
ＲＮＡ配列はｍＲＮＡと結合して二本鎖を形成し、ターゲット遺伝子からの内因
的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害すると考えられる。これが作用の実際の
モードであるか否かはなお不確実である。しかしながら、この技術が働くという
ことは確立された事実である。
【００３２】 他の可能性は、転写時に核酸を特異的部位において切断することができるリボ
ザイムを産生し−こうして遺伝子の発現に影響を及ぼすとき、また、有用である
、核酸を使用することである。リボザイムについてのバックグラウンドの参考文
献は下記のものを包含する：Ｋａｓｈａｎｉ−ＳａｂｅｔおよびＳｃａｎｌｏｎ
、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２（３）：２１３−２
２３、およびＭｅｒｃｏｌａおよびＣｏｈｅｎ、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２（１）：４７−５９。
【００３３】 こうして、ＡＴＭおよびｐ５３の相互作用、特にＡＴＭによるｐ５３のリン酸
化を阻害または増強する、種々の方法およびモジュレーターの使用は、本発明の
それ以上の面として提供される。ＡＴＭおよびｐ５３の相互作用、特にＡＴＭに
よるｐ５３のリン酸化の崩壊、妨害またはモジュレーションの目的は、前述しか
つ後述するように、このような相互作用により仲介される活性をモジュレートす
ることであることができる。
【００３４】 本発明の種々の面は、ＡＴＭとＤＮＡとの間の相互作用のモジュレーションに
関する。このような相互作用は最初に確立されたと、ここで我々は考え、そして
、さらにＡＴＭによるｐ５３のリン酸化に対してある効果を有することが示され
た。ＡＴＭは細胞質中のミクロソーム膜と会合していることを示唆するデータが
存在し（Ｗａｔｔｅｒｓ他、１９９７およびＢｒｏｗｎ他、１９９７；はＡＴＭ
が細胞質小胞の中にも存在することを示す）、そしてＡ−Ｔ細胞もまたＢ細胞お
よびＴ細胞中の細胞膜からのシグナリングを欠如することが報告された（上を参
照）ので、ＡＴＭがＤＮＡ結合性タンパク質であることは驚くべきことであった
。さらに、ＡＴＭがそのようによくＤＮＡに結合するであろうことは驚くべきこ
とであった。使用しかつ後述する精製法は種々の他の（既知の）ＤＮＡ結合性因
子を精製せず、しかもＡＴＭはＤＮＡアフィニティークロマトグラフィー手法を
使用して非常に選択的（単一工程において約１００倍）に精製される。
【００３５】 本発明は、１つの面において、ＡＴＭまたはＡＴＲを精製するためのＤＮＡの
使用を提供する。それ以上の面において、本発明は、ＡＴＭまたはＡＴＲの活性
、特にｐ５３（または他の分子）のリン酸化のアッセイにおけるＤＮＡの使用を
提供する。 我々は、また、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アガロースを使用する、他の驚くべ
きルートを介してＡＴＭおよびＡＴＲを精製した。ＮＴＡはＮｉ2+のための４つ
のキレート化部位を有する。他のＮｉ2+マトリックス、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）
アガロース（Ｎｉ2+のための３つのキレート化部位を有する）はＡＴＭに弱くの
み結合することを我々は見出した。これらのＮｉ2+マトリックスは、通常、ある
範囲のＨｉｓ残基（通常６つは最良の結合を与える）を介して金属イオンをキレ
ート化するタンパク質を精製するために、一般に互換的に使用される。ＡＴＭは
１連続の６、５またはさらに４つのＨｉｓ残基をもたないので、ＡＴＭまたはＡ
ＴＲがＮｉ結合カラムにより精製されることは驚くべきことである。さらに、２
つのマトリックスは一般に互換的に使用されるので、ＡＴＭがよくＮＴＡに結合
するが、ＩＤＡマトリックスに弱くのみ結合することはさらに驚くべきことであ
る。
【００３６】 ＡＴＭはＤＮＡ損傷の検出およびシグナリングにおいて他の因子と協調して疑
いなく働く。事実、我々のデータはＡＴＭが固有のＤＮＡ刺激ｐ５３キナーゼ機
能を有することを明らかにするが、追加のポリペプチドの存在はＡＴＭ活性の増
加と相関することを我々は反復して観測した。こうして、我々の最も高度に精製
された調製物は、等しい量のＡＴＭを含有するが、追加の共精製ポリペプチドを
も有する調製物よりも、かなり低い活性を有する。これらはＡＴＭポリペプチド
のコンフォメーションを変更することによって、ＤＮＡへのＡＴＭの結合を促進
しおよび／またはそのキナーゼ活性を作動させる働きをするようである。したが
って、ＡＴＭ、または関連キナーゼ活性を有するタンパク質に対する言及は、本
明細書において記載する方法により得ることができる調製物の中に存在する関連
ポリペプチドまたはコファクターと組み合わせて、精製されたＡＴＭ（または関
係するタンパク質）およびＡＴＭ（または関係するタンパク質）の双方を包含す
る。
【００３７】 本発明によるアッセイは、例えば、ＡＴＭ活性を刺激するタンパク質画分につ
いてアッセイすることによる、このような追加のポリペプチドの同定において使
用することができる。そのキナーゼ活性を増強する（例えば、自然に）コファク
ターの同定および／または獲得におけるＡＴＭまたはＡＴＲの使用は、本発明に
より提供される。ＡＴＭ活性は、ある種の環境下に、１以上の因子によりマスク
することができる（下記の論考の節を参照のこと）。したがって、本発明は、こ
のような因子の同定および／または獲得におけるＡＴＭの使用も提供する。
【００３８】 例えば、ＡＴＭキナーゼ活性を増強する、ＡＴＭのタンパク質または他のコフ
ァクターは、ＡＴＭ活性をモジュレートする他のルートを提供する、これのイン
ヒビターの設計において使用することができる。これを同様に使用して、例えば
、ＡＴＭ活性の１以上のリプレッサーを阻害することによって、ＡＴＭを活性化
する誘導化因子へのルートを提供することができる。
【００３９】 本発明は、種々の面において、ＡＴＭタンパク質とｐ５３との間の相互作用、
特にＡＴＭによるｐ５３のリン酸化を、適当な因子を使用して、モジュレートし
、妨害または中断し、増加または増強することを提供する。前述したように、今
回、ＡＴＭはタンパク質キナーゼであり、他の分子、特にＡＴＭによりリン酸化
されるｐ５３中の部位の１つに対して相同である部位を含むタンパク質に対して
高度に作用するようであることが、最初に確立された。さらに、本発明は、ＡＴ
Ｍ、特にＤＮＡ−ＰＫおよびＡＴＲに類似する関連キナーゼ活性を有するタンパ
ク質の使用に拡張される。本発明は、このようなリン酸化のモジュレーションに
拡張され、そして便宜上例示の目的で、かつある種の関係において好ましい態様
として、ｐ５３を使用する本明細書における開示を考えるとき、これを考慮に入
れるべきである。
【００４０】 ＡＴＭとｐ５３との間の相互作用をモジュレートすることができる因子は、Ｓ
ｅｒ１５およびＴｈｒ１８を包含するアミノ酸残基内に位置する部位の間の相互
作用をブロックすることができる。 ｐ５３のリン酸化部位における相互作用に加えて、ＡＴＭおよびｐ５３はいず
れかのタンパク質または双方のタンパク質内の１以上の他の部位において相互作
用することができる。このような部位における相互作用に影響を与えることは、
ＡＴＭによるｐ５３のリン酸化に対してある効果を有することができる。アラニ
ンの走査および欠失の分析のような技術を用いて、タンパク質、特にｐ５３の種
々のフラグメントおよび誘導体を使用して、これを分析することができる。本発
明は、好ましくはＡＴＭによるｐ５３のリン酸化のモジュレーションを生ずる、
任意の部位におけるＡＴＭとｐ５３との間の相互作用のモジュレーションを包含
する。
【００４１】 ＡＴＭタンパク質の完全なアミノ酸配列は解明され、そしてＳａｖｉｔｓｋｙ
他、１９９５ａ、１９９５ｂおよび図６ａに記載されており、それらのうちのア
ミノ酸残基のナンバリングが使用されている。キナーゼドメインは図６ａにおい
てマークされている。ｐ５３のアミノ酸配列は図７ａに示されており、それらの
うちのアミノ酸残基のナンバリングが使用されている。これらの配列はヒト配列
である。ＡＴＭおよびｐ５３は脊椎動物、特に哺乳動物の間で保存されている−
例えば、Ｓｏｕｓｓｉ他の図２を参照のこと。ＡＴＭによりリン酸化されること
が本明細書において示されている残基の領域におけるｐ５３の保存について−し
たがって、本発明は、その面の任意のものにおいて、他の脊椎動物、特に哺乳動
物、例えば、霊長類、例えば、サル、齧歯類、例えば、マウスまたはラット、ブ
タ、ウマ、雌牛、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、およびその他の、ｐ５３および／
またはＡＴＭの使用に拡張される。ＡＴＲ（また、ＦＲＰ１として知られている
）のアミノ酸配列および核酸配列は、Ｃｉｍｐｉｃｈ他、１９９６に記載されて
いる。アミノ酸配列は図８ａとして再現されている。ＤＮＡ−ＰＫのアミノ酸配
列はＨａｒｔｌｅｙ他、１９９５において提供されており、そして図９ａに記載
されている。これらのタンパク質の核酸配列は、図６ｂ、図７ｂ、図８ｂおよび
図９ｂとしても含まれている。
【００４２】 本発明に従い有用な因子はスクリーニング技術により同定することができる。
スクリーニング技術は、試験下の因子がＡＴＭタンパク質またはＡＴＭの適当な
フラグメント（例えば、図６上にマークした、キナーゼドメインのアミノ酸残基
、またはこれらの領域の任意のより小さいフラグメントを包含する）と、ｐ５３
またはそのフラグメント、またはその適当なアナログ、フラグメントまたは変異
型との相互作用を阻害または崩壊するかどうかを決定することを含む。ｐ５３の
好ましいフラグメントの１つのクラスは、Ｓｅｒ１５またはＴｈｒ１８における
リン酸化部位の一方または双方を含むものである。
【００４３】 ＡＴＭまたはｐ５３の適当なフラグメントは、対応タンパク質と相互作用する
残基を含むフラグメントを包含する。より小さいフラグメント、およびこのフラ
グメントのアナログおよび変異型を同様に使用することができ、例えば、欠失の
分析またはアラニンの走査のような技術を使用して同定することができる。 こうして、本発明は、ｐ５３と相互作用することができ、および／またはＡＴ
Ｍとｐ５３との間の相互作用、特にＡＴＭによるｐ５３のリン酸化を阻害するこ
とができるＡＴＭのペプチドフラグメントを提供し、そしてＡＴＭと相互作用す
ることができ、および／またはｐ５３とＡＴＭとの間の相互作用、特にＡＴＭに
よるｐ５３のリン酸化を阻害することができるｐ５３のペプチドフラグメントを
提供し、このようなペプチドフラグメントは関係するタンパク質の欠失の分析お
よび／またはアラニンの走査により得ることができる−配列の中に適当な突然変
異を作り、タンパク質の１つの突然変異したフラグメントを他のタンパク質また
はそのフラグメントと一緒にし、そしてｐ５３またはそのフラグメントの相互作
用、好ましくはリン酸化を測定する。好ましい態様において、ペプチドは、後述
するように、短かく、そして関係する対応タンパク質と相互作用することができ
、および／または関係する相互作用を阻害することができる、最少部分であるこ
とができる。
【００４４】 スクリーニング法およびアッセイを下記においていっそう詳しく説明する。 ＡＴＭとｐ５３との相互作用を崩壊するために使用することができる因子の１
つのクラスは、対応ｐ５３またはＡＴＭ（既に前述した）と相互作用するｐ５３
またはＡＴＭの配列のモチーフをベースとするペプチドである。このようなペプ
チドは短い傾向があり、そして長さが約４０アミノ酸以下、好ましくは約３５ア
ミノ酸以下、より好ましくは約３０アミノ酸以下、より好ましくは約２５アミノ
酸以下、より好ましくは約２０アミノ酸以下、より好ましくは約１５アミノ酸以
下、より好ましくは約１０アミノ酸以下、または９、８、７、６、５またはそれ
より小さいことができる。本発明は、また、野生型ＡＴＭまたはｐ５３配列の変
異型または誘導体であるが、ｐ５３またはＡＴＭと相互作用することができる能
力（それぞれ、場合に応じて）および／またはＡＴＭとｐ５３との間の相互作用
、特にＡＴＭによるｐ５３のリン酸化をモジュレートすることができる能力を保
持するペプチドを包含する。
【００４５】 野生型ＡＴＭまたはｐ５３フラグメントを使用する代わりに、ペプチドまたは
ポリペプチドは、１以上のアミノ酸の１以上の付加、挿入、欠失および置換によ
り、野生型アミノ酸配列から１以上のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含
むことができる。こうして、例えば、他の生物からの、変異型、誘導体、アレレ
、突然変異体および相同体が包含される。
【００４６】 好ましくは、アミノ酸配列は、関係するＡＴＭまたはｐ５３フラグメント配列
のフラグメントとの相同性を共有し、好ましくは少なくとも約３０％、または４
０％、または５０％、または６０％、または７０％、または７５％、または８０
％、または８５％、または９０％、または９５％の相同性を示す。こうして、Ａ
ＴＭまたはｐ５３のペプチドフラグメントは、野生型配列に関して、１、２、３
、４、５、５より大きい、または１０より大きいアミノ酸の変更、例えば、置換
を含むことができる。好ましくは、ＡＴＭのペプチドフラグメントは、図６に示
すようなキナーゼドメインのすべてまたは一部分の配列をベースとする。好まし
くは、ｐ５３フラグメントはＡＴＭによりリン酸化される部位の回りの分子のＮ
末端の配列をベースとする、すなわち、アミノ酸のモチーフＰＰＬＳＱＥＴＦＳ
Ｄ、またはより一般的に、モチーフＳｘｘＴを含み、ここでｘは任意のアミノ酸
である。
【００４７】 特定の配列を本明細書において開示するペプチドの誘導体は、ある種の態様に
おいて、特定のペプチドと同一の長さであるか、あるいはそれより短いことがで
きる。他の態様において、ペプチド配列またはその変異型は、前述したように、
より大きいペプチドの中に含まれ、これはＡＴＭまたはｐ５３の追加の部分を含
むか、あるいは含まないことができる。ＡＴＭまたはｐ５３中の関係する特定の
ペプチドフラグメントに隣接するか、あるいはそれに対して異種である、１、２
、３、４または５以上の追加のアミノ酸をペプチドの１つまたは双方の末端に含
めることができる。
【００４８】 （ＡＴＭおよびｐ５３に対する参考文献はＡＴＭおよび関係するタンパク質、
例えば、ＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫおよびＡＴＭによりリン酸化されるｐ５３中
の１つに対して相同である部位を含む他のタンパク質に等しく適用されることを
忘れてはならない。） よく理解されるように、アミノ酸レベルにおける相同性は一般にアミノ酸の類
似性および同一性による。類似性は「保存的変動」、すなわち、１つの疎水性残
基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの他の残基との
置換、または１つの極性残基と他の残基との置換、例えば、アルギニンとリジン
、グルタミン酸とアスパラギン酸、またはグルタミンとアスパラギンとの置換を
可能とする。類似性はＡｌｔｓｃｈｕｌ他、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２１５：４０３−１０のＴＢＬＡＳＴＮプログラム（これはこの分野におい
て標準的に使用されている）により定義しかつ決定することができる。相同性は
、関係する野生型アミノ酸配列と比較して、関係するポリペプチドの全長にわた
るか、あるいは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、７５、１０
０またはそれより大きいアミノ酸にわたることができる。
【００４９】 前述したように、変異型ポリペプチドの配列およびペプチドおよび非ペプチド
のアナログおよび模倣物を、下記においてさらに説明するように、使用すること
ができる。 本発明の種々の面は、単一の分子または２以上の成分を含む組成物であること
ができ、図６または図７に表されているような配列を含む、特に図６においてマ
ークされているＡＴＭキナーゼドメイン内のＡＴＭまたはｐ５３のペプチドフラ
グメント、このような配列から本質的に成るペプチド、変異型、誘導体またはア
ナログの配列を含むペプチド、あるいはＡＴＭまたはｐ５３と相互作用する能力
および／またはＡＴＭまたはｐ５３の間の相互作用をモジュレート、崩壊または
妨害する能力を有する非ペプチドのアナログまたは模倣物を包含する物質を提供
する。
【００５０】 変異型は、個々のアミノ酸が、この分野において理解されているようにかつ上
に示した、密接に関係する他のアミノ酸と置換することができるペプチドを包含
する。 ペプチドの非ペプチドの模倣物は、下記においてさらに説明される。 前述したように、本発明によるペプチドおよび本発明の種々の面において使用
するためのペプチドは、開示されるＡＴＭまたはｐ５３のフラグメント、例えば
、それぞれ、図６および図７にその配列が示されているフラグメント、を含むか
、あるいはから本質的に成ることができる。１以上の追加のアミノ酸が含まれる
場合、このようなアミノ酸はＡＴＭまたはｐ５３に由来するか、あるいはＡＴＭ
またはｐ５３に対して異種または外来であることができる。ペプチドは、特にペ
プチドが非ＡＴＭまたはｐ５３の（すなわち、異種または外来である）配列、例
えば、ポリペプチドまたはタンパク質のドメインに融合されている場合、より大
きい融合タンパク質内に包含されることができる。
【００５１】 本発明は、また、ペプチドの誘導体、例えば、カップリング相手、例えば、エ
フェクター分子、標識、薬物、トキシンおよび／または担体または輸送分子、お
よび／またはターゲッティング分子、例えば、抗体またはその結合性フラグメン
トまたは他のリガンドに結合されたペプチドを包含する。本発明のペプチドを双
方のホスファチジルおよび非ホスファチジルカップリング相手にカップリングす
る技術は、この分野においてよく知られている。１つの態様において、担体分子
はアンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）のホメオドメインに由来する
１６ａａのペプチド配列（例えば、名称「Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ」で販売されて
いる）であり、これは末端のＣｙｓ残基を介してペプチドにカップリングさせる
ことができる。「Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ」分子およびその性質はＷＯ９１／１８
９８１号に記載されている。
【００５２】 ペプチドは化学的合成により完全にまたは部分的に発生させることができる。
本発明の化合物は、よく確立された、標準的液相または、好ましくは、固相のペ
プチド合成法に従い容易に製造することができ、それらの合成法の一般的説明は
広く入手可能である（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒ
ｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州（１９８４）；Ｍ．ＢｏｄａｎｚｓｋｙおよびＡ
．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州（１９８
４）；およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａ Ｕｓｅｒｓ
Ｍａｎｕａｌ、ＡＢＩ Ｉｎｃ．、フォスターシティー、カリフォルニア州）か
、あるいは本発明の化合物は、溶液中で、液相法によるか、あるいは固相、液相
および溶液化学の任意の組合わせにより、例えば、まずそれぞれのペプチド部分
を完成し、次いで所望ならばかつ適当ならば、存在する保護基を除去した後、そ
れぞれの炭酸またはスルホン酸またはそれらの反応性誘導体の反応により残基Ｘ
を導入することによって、製造することができる。
【００５３】 本発明によるホスファチジル分子（ペプチドまたはポリペプチド）を製造する
他の好都合な方法は、発現系において核酸を使用することによって、それをコー
ドする核酸を発現することである。 したがって、本発明は、種々の面において、本発明のポリペプチドおよびペプ
チドをコードする核酸も提供する。
【００５４】 一般に、本発明による核酸は、単離物として、単離されたおよび／または精製
された形態で提供されるか、あるいは天然に会合された物質を含まないか、ある
いは実質的に含まない、例えば、発現のための可能な１以上の調節配列を除外し
て、ヒトゲノム中の遺伝子をフランキングする核酸を含まないか、あるいは実質
的に含まない。核酸は完全にまたは部分的に合成であることができ、そしてゲノ
ムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。本発明による核酸はＲＮ
Ａを含む場合、示された配列に対する言及は、ＵがＴで置換された、ＲＮＡ同等
体を言及するとして解釈すべきである。
【００５５】 本発明によるポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸配列は、入手可能
な核酸配列またはクローンが与えられると、本明細書の中に含まれる情報および
参考文献およびこの分野において知られている技術（例えば、下記の文献を参照
のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
、１９９２）を使用して、当業者が容易に製造することができる。これらの技術
は、（ｉ）例えば、ゲノム源からの、このような核酸の試料を増幅するためのポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学的合成、または（ｉｉｉ）
ｃＤＮＡ配列の製造を包含する。
【００５６】 この分野において知られている任意の適当な方法において、例えば、エンコー
ディングＤＮＡを取り、発現すべき部分のいずれかの側の適当な制限酵素認識部
位を同定し、そしてＤＮＡから前記部分切断することによって、ＡＴＭまたはｐ
５３フラグメントをコードするＤＮＡを発生させ、使用することができる。次い
で、前記部分を標準的商業的に入手可能な発現系において適当なプロモーターに
作用可能に連鎖させることができる。他の組換えアプローチは、ＤＮＡの関係す
る部分を適当なＰＣＲプライマーで増幅することである。例えば、部位特異的突
然変異誘発を使用して、修飾されたＡＴＭまたはｐ５３ペプチドを発現させるか
、あるいは核酸を発現するために使用される宿主細胞中のコドンの優先を考慮し
て、ＡＴＭまたはｐ５３配列を修飾することができる。
【００５７】 核酸配列を発現させるために、その発現をコントロールするように核酸に作用
可能に連鎖された１以上のコントロール配列を有するベクターの中に、配列を組
込むことができる。ベクターは、他の配列、例えば、挿入された核酸の発現を推
進するプロモーターまたはエンハンサーを含み、そして宿主細胞において産生さ
れたポリペプチドが細胞から分泌されるように、分泌シグナルをコードする融合
および／または核酸としてポリペプチドまたはペプチドが産生されるように核酸
配列を含むことができる。次いで、ベクターが機能的である宿主細胞の中にベク
ターを形質転換し、ポリペプチドが産生されるように宿主細胞を培養し、そして
ポリペプチドを宿主細胞または取り囲む媒質から回収することによって、ポリペ
プチドを製造することができる。この分野においてこの目的のために、原核細胞
または真核細胞が使用され、これらは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母
の株および真核細胞、例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞を包含する。
【００５８】 こうして、本発明は、ポリペプチドまたはペプチド（開示されたような）を製
造する方法も包含し、この方法はポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸
（一般に、本発明による核酸）からの発現を含む。これは、このようなベクター
を含む宿主細胞を培養により増殖することによって、好都合に実施することがで
きる。ポリペプチドおよびペプチドは、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系、例えば、網
状赤血球のライゼイト中で発現させることができる。
【００５９】 種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングし、発現させる系
はよく知られている。適当な宿主細胞は、細菌、真核細胞、例えば、哺乳動物お
よび酵母細胞、およびバキュロウイルス系を包含する。異種ポリペプチドの発現
のためにこの分野において入手可能な哺乳動物細胞系統は、チャイニーズハムス
ター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞および多数の他の細胞を
包含する。普通の好ましい細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００６０】 適当な調節配列、例えば、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、
ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適当ならば他の
配列を含有する適当なベクターを選択するか、あるいは構築することができる。
ベクターは、適当ならば、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはフ
ァージミドであることができる。それ以上の詳細については、下記の文献を参照
のこと：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。例えば、核酸構
築物、突然変異誘発、配列決定、細胞の中へのＤＮＡ導入および遺伝子の発現、
およびタンパク質の分析において、核酸を操作する、多数の既知の技術およびプ
ロトコールは下記の文献に詳述されている：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ他、編、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２。
【００６１】 こうして、本発明のそれ以上の面は、本明細書において開示するような、異種
核酸を含有する宿主細胞を提供する。 本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）の中に組込むことがで
きる。組込みは、標準的技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列の封入に
よって、促進させることができる。核酸は細胞内の染色体外のベクター上に存在
するか、あるいはそうでなければ細胞に対して識別可能に異種または外来である
ことができる。
【００６２】 なお他の面は、核酸を宿主細胞の中に導入することを含む方法を提供する。導
入は、限定なしに「形質転換」と一般に言及することができ（特にｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ導入のために）、任意の利用可能な技術を使用することができる。真核細胞
について、適当な技術は、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介トランスフェクショ
ンおよびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアまたは、昆虫
細胞について、バキュロウイルスを使用するトランスダクションを包含すること
ができる。細菌細胞について、適当な技術は、塩化カルシウムの形質転換、エレ
クトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクション
を包含することができる。別法として、核酸の直接的注入を使用することができ
る。
【００６３】 マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性または感受性遺伝子を、この分野にお
いてよく知られているように、問題の核酸を含有するクローンの同定に使用する
ことができる。 導入後、例えば、遺伝子の発現の条件下に宿主細胞（宿主細胞は実際に形質転
換された細胞を包含することができるが、細胞は形質転換された細胞の子孫であ
ろう）を培養して、コードされたポリペプチド（またはペプチド）が産生される
ようにすることによって、核酸からの発現を引き起こすか、あるいは可能とする
ことができる。ポリペプチドを発現させ、適当なシグナルリーダーペプチドにカ
ップリングさせる場合、ポリペプチドを細胞から培地の中に分泌させることがで
きる。発現による産生後、ポリペプチドまたはペプチドを、場合に応じて、宿主
細胞および／または培地から単離および／または精製し、引き続いて、所望なら
ば、例えば、１以上の追加の成分を含有することができる組成物、例えば、１以
上の薬学上許容される賦形剤、ベヒクルまたは担体を含む医薬組成物の処方にお
いて、使用することができる（例えば、下記を参照のこと）。
【００６４】 本発明によるホスファチジル分子をコードする核酸の導入をｉｎ ｖｉｖｏに
おいて遺伝子治療により実施して、ＡＴＭまたはｐ５３の間の相互作用を崩壊ま
たは妨害することができる。 こうして、本発明による核酸を含有する宿主細胞は、例えば、細胞または細胞
の祖先の中への核酸の導入および／または細胞または祖先に対して内因性の配列
の遺伝的変更（前記導入または変更はｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにお
いて実施することができる）の結果として、動物、特に哺乳動物であり、ヒトま
たは非ヒト、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類、
ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、畜牛またはウマであることができるか、ある
いは鳥類、例えば、ニワトリである、生物内で（例えば、ソーマの中で）構成す
ることができる。このような細胞からなる遺伝的に修飾されたまたはトランスジ
ェニック動物または鳥類は、また、本発明のそれ以上の面として提供される。
【００６５】 これは療法上の目的を有することができる。（遺伝子治療は後述される）。ま
た、特に相同的内因的配列の代わりに、生物の細胞内に突然変異体、アレレ、誘
導体または変異型の配列を存在させると、コードされたポリペプチドの活性をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏにおいてモジュレートする物質、あるいはそうでなければ療法上
の潜在的能力を有することが示された物質を試験および／または研究するときの
モデルとして生物を使用することができる。しかしながら、好都合には、このよ
うな物質についての少なくとも予備的アッセイをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、す
なわち、宿主細胞内で、または無細胞系において実施することができる。細胞に
対する被検化合物の作用をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて確立する場合、それらの細
胞または同一または同様な型の細胞をｉｎ ｖｉｖｏ試験のために適当な宿主動
物の中に移植することができる。
【００６６】 例えば、動物系、例えば、活性ｐ５３に頼る異種移植片を含む腫瘍モデルにお
いて、ｐ５３の機能または活性を測定することができる。動物を放射線療法また
は化学療法および投与された被検物質に暴露することができる。放射線療法また
は化学療法に対して動物における反応の増強は、ｐ５３のＡＴＭリン酸化のブロ
ッキングを示すであろう。
【００６７】 適当なスクリーニング法はこの分野において慣用されている。スクリーニング
法は、ラジオイムノアッセイ、シンチレーションプロクシメトリーアッセイおよ
びＥＬＩＳＡ法のような技術を包含する。適当には、ＡＴＭタンパク質もしくは
フラグメントまたはｐ５３もしくはフラグメント、あるいはそれらのアナログ、
誘導体、変異型または機能的模倣物を固定化し、次いで他方を被験因子の存在に
おいて適用する。シンチレーションプロクシメトリーアッセイにおいて、ビオチ
ン化タンパク質フラグメントをストレプトアビジンコーテッドシンチラント−固
定化ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍにより製造されている）に結合させる。次いで、
放射性ペプチドが固定化されたフラグメントに結合するとき、放射性誘導シンチ
レーションを測定することによって、放射能標識化ペプチドの結合を測定する。
こうして、これを遮断する因子は相互作用のインヒビターである。ＡＴＭとｐ５
３との間の相互作用をモジュレートする因子についてスクリーニングする他の方
法および手段は後述される。
【００６８】 １つの一般的面において、本発明は、ＡＴＭとｐ５３との間の相互作用をモジ
ュレートする、例えば、崩壊または妨害する能力を有する物質をアッセイする方
法を提供し、この方法は、 （ａ） ＡＴＭのペプチドフラグメント、または関連キナーゼ活性を有するタ
ンパク質、または開示したその誘導体、変異型またはアナログ、ｐ５３の関係す
るフラグメントまたはその変異型、誘導体またはアナログを含む物質を包含する
本発明による物質を接触させる、 ことを含む。
【００６９】 前記物質（例えば、ＡＴＭのフラグメントを含みかつｐ５３のフラグメントを
含む）の間の相互作用を崩壊、減少、妨害するか、あるいは完全にまたは部分的
に壊滅し、そしてＡＴＭおよび／またはｐ５３の活性をモジュレートすることが
できる被検化合物をこうして同定することができる。 ２つの物質の間の相互作用を増加または増強する因子は、陽性に試験される因
子の不存在において、物質の相互作用を防止する条件下に、同定することができ
る。
【００７０】 本発明の他の一般的面は、場合に応じて、ＡＴＭまたはｐ５３の関係する領域
と相互作用することができる物質をアッセイする方法を提供し、この方法は、 （ａ） ＡＴＭのペプチドフラグメントまたは開示したｐ５３と相互作用する
か、あるいはＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質と相互作用する
ｐ５３のペプチドフラグメントを含む、関連キナーゼ活性を有するタンパク質、
または開示されたこのようなペプチドフラグメントの変異型、誘導体またはアナ
ログを被検化合物と接触させ、そして （ｂ） 前記物質と被検化合物との間の相互作用を測定する、 ことを含む。
【００７１】 ＡＴＭの関係する部分と相互作用することが見出された被検化合物を、ｐ５３
とのＡＴＭの相互作用をモジュレートする、例えば、崩壊または妨害する能力お
よび／またはｐ５３および／またはＡＴＭの活性または既に前述したＡＴＭまた
はｐ５３により仲介される他の活性に影響を与える能力について試験することが
できる。
【００７２】 同様に、ｐ５３の関係する部分と相互作用することが見出された被検化合物を
、ＡＴＭとのｐ５３の相互作用をモジュレートする、例えば、崩壊または妨害す
る能力および／またはＡＴＭおよび／またはｐ５３の活性または既に前述したｐ
５３またはＡＴＭにより仲介される他の活性に影響を与える能力について試験す
ることができる。
【００７３】 本発明の他の一般的面は、ｐ５３の活性に影響を与えることができる物質をア
ッセイする方法を提供し、この方法は、 （ａ） ｐ５３および被検化合物を接触させ、そして （ｂ） ｐ５３の活性を測定する、 ことを含む。
【００７４】 ｐ５３とＡＴＭとの間の相互作用、好ましくはＡＴＭによるｐ５３のリン酸化
に対する作用に帰属させるべき活性に対する被検化合物の作用を可能とするｐ５
３の活性を、ＡＴＭの存在および不存在において、測定することができる（下記
においてさらに説明する）。 測定することができるｐ５３の活性は、タンパク質、例えば、ｐ２１（ＷＡＦ
１）の発現の誘導、イオン化放射線に対する細胞の感受性、ｐ５３誘導アポプト
ーシス活性、ｐ５３誘導抗増殖活性、細胞のｐ５３誘導セネッセンスを包含する
。
【００７５】 ＡＴＭによるｐ５３のリン酸化をモジュレートすることができる因子のアッセ
イにおいて、このようなリン酸化部位のいずれかを含む、ｐ５３の適当なフラグ
メントを使用することができる。Ｓｅｒ１５および／またはＴｈｒ１８部位にお
けるリン酸化を測定しようとする場合、ＤＮＡを一般にアッセイ系の中に添加し
て、ＡＴＭの要求されるキナーゼ活性を刺激することができる。記載したように
、本発明は、また、非ヒトｐ５３および本明細書において同定したヒトｐ５３の
部位に等しい部位におけるリン酸化に拡張される。こうして、アッセイにおいて
、Ｓｅｒ１５および／またはＴｈｒ１８におけるリン酸化部位を含む全長のｐ５
３またはｐ５３のフラグメントの誘導体を使用することができる。
【００７６】 さらに、本発明は、例えば、アッセイにおける、しかしまた多数の他の関係に
おける、ＡＴＭによるｐ５３のリン酸化を刺激のためのＤＮＡの使用を提供する
。このようなリン酸化は、ヒトｐ５３のＳｅｒ１５および／またはＴｈｒ１８、
または他の種、特に脊椎動物、例えば、哺乳動物のｐ５３中の等しい部位におけ
るリン酸化を包含することができる。
【００７７】 本発明によるアッセイは、ＤＮＡ−ＰＫcsキナーゼ活性のインヒビターを含み
、そのキナーゼによる重複したリン酸化の複雑化した問題を回避することができ
る。このようなＤＮＡ−ＰＫcsキナーゼ活性のインヒビターはＡＴＭキナーゼ活
性に影響を与えないであろう。 本発明による他のアッセイは、ＡＴＭによるＤＮＡの結合をモジュレートする
因子についてのアッセイである。ＡＴＭによるＤＮＡの結合の測定のために適当
な条件を使用して、インヒビターおよび／またはアクチベーターをスクリーニン
グすることができる。
【００７８】 こうして、本発明の他の面は、ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパ
ク質によるＤＮＡの結合に影響を与えることができる化合物をアッセイする方法
を提供し、この方法は、 （ａ） ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質によるＤＮＡの結
合のインヒビターである化合物の不存在において、前記物質が前記ＤＮＡに結合
する条件下に、ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質、またはＤＮ
Ａに結合できるそれらのフラグメント、変異型または誘導体である物質、ＤＮＡ
、および被検化合物を接触させ、そして （ｂ） 前記物質と前記ＤＮＡとの間の結合を測定する、 ことを含む。
【００７９】 ＡＴＭによるＤＮＡの結合のアクチベーターをアッセイ法により同様に同定す
ることができる。このアッセイ法において、ＡＴＭによるＤＮＡの結合の増強因
子である被検化合物の不存在において、物質がＤＮＡに結合しない条件下に、前
記物質、ＤＮＡおよび被検化合物を一緒にする。アクチベーターは、ＤＮＡの不
存在においてＡＴＭ関連キナーゼ活性を活性化する物質またはＡＴＭおよびｐ５
３の相互作用を増強する物質を包含し、それら物質の双方はＤＮＡ損傷、例えば
、照射により引き起こされるＤＮＡ損傷の不存在において、ｐ５３の応答の誘導
を可能とする。
【００８０】 ＤＮＡの結合は、任意の適当な技術、例えば、電気泳動の移動度のシフトのア
ッセイ（ＥＭＳＡ）、ＵＶタンパク質−ＤＮＡ架橋、化学的またはＤＮアーゼＩ
フットプリント法、およびその他により測定することができる。 ＡＴＭによるＤＮＡの結合の測定は、リン酸化の測定と組み合わせて、順次に
または同時に実施することができる。例えば、予備的スクリーンはＡＴＭによる
ＤＮＡの結合をモジュレートする分子を同定することができ、次いでこのような
物質をアッセイにおいて使用して、ｐ５３のリン酸化をモジュレートする（また
はしない）それらの能力を測定することができる。ＡＴＭによるＤＮＡの結合を
モジュレートする能力の前にリン酸化をモジュレートする能力を測定する逆の方
法もまた可能であり、また、２つのアッセイを平行して実施することができる。
【００８１】 ｉｎ ｖｉｔｒｏの予備的アッセイを実施し、次いでｉｎ ｖｉｖｏのアッセ
イを実施するか、あるいは２つのアッセイを平行して実施することができる。 もちろん、当業者は、試験アッセイにおいて得られた結果を比較する、任意の
適当な対照実験を設計するであろう。 本発明によるアッセイ法を実施した後、ＡＴＭとｐ５３との間の相互作用をモ
ジュレートする能力および／またはＡＴＭまたはｐ５３の活性または仲介された
活性を阻害する能力に対する陽性を試験する化合物、物質または分子を単離およ
び／または製造および／または使用することができる。
【００８２】 当業者は日常の技量および知識を使用して、本発明のアッセイの正確なフォー
マットを変化させることができる。例えば、物質を検出可能な標識で標識化し、
固体の支持体上に固定化された他の物質と接触させることによって、物質の間の
相互作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究することができる。特にペプチジル物質のた
めの、適当な検出可能な標識は、組換え的に製造されたペプチドおよびポリペプ
チドの中に組込むことができる35Ｓ−メチオニンを包含する。組換え的に製造さ
れたペプチドおよびポリペプチドは、抗体で標識化することができるエピトープ
を含有する融合タンパク質としても発現させることができる。
【００８３】 固体の支持体上に固定化するタンパク質は、固体の支持体に結合してそのタン
パク質に対する抗体を使用するか、あるいはそれ自体知られている他の技術によ
り固定化することができる。好ましいｉｎ ｖｉｔｒｏの相互作用は、グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を包含する融合タンパク質を利用する
。これはグルタチオンアガロースビーズ上に固定化することができる。前述の型
のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのフォーマットにおいて、固定化されたＧＳＴ−融
合ポリペプチドに結合する標識化されたペプチドまたはポリペプチドの量を減少
させる能力を測定することによって、被検化合物をアッセイすることができる。
これはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によりグルタチオン−アガロ
ースビーズを分画することによって測定可能である。あるいは、ビーズをすすい
で非結合タンパク質を除去し、そして、例えば、適当なシンチレーションカウン
ターの中に存在する標識の量を計数することによって、結合したタンパク質の量
を測定することができる。
【００８４】 本発明によるアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの形態を取ることもできる
。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは細胞系統、例えば、酵母株または哺乳動物の細胞系
統において実施することができ、ここにおいて関係するポリペプチドまたはペプ
チドは細胞の中に導入された１以上のベクターから発現される。 ＡＴＭとｐ５３との間の相互作用をモジュレートする被検化合物の能力は、い
わゆる２−ハイブリッドアッセイにより測定することができる。
【００８５】 例えば、場合に応じてＡＴＭまたはｐ５３のフラグメントを含有するポリペプ
チドまたはペプチド、または開示したそのペプチジルアナログまたは変異型を、
ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、酵母転写因子ＧＡＬ４のそれに融合させることが
できる。（ＡＴＭの特に好ましいフラグメントは、キナーゼドメインまたはキナ
ーゼドメインのフラグメントを含むか、あるいはそれらであることができる。）
ＧＡＬ４の転写因子は２つの機能的ドメインを含む。これらのドメインは、ＤＮ
Ａ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢＤ）およびＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ
４ＴＡＤ）である。１つのポリペプチドまたはペプチドをそれらのドメインの１
つに融合し、そして他のポリペプチドまたはペプチドをそれぞれの対応物に融合
することによって、問題の２つのポリペプチドまたはペプチドが相互作用すると
きにのみ、機能的ＧＡＬ４転写因子は回復する。
【００８６】 こうして、リポーター遺伝子の転写を活性化することができるＧＡＬ４ＤＮＡ
結合部位に多分連鎖されたリポーター遺伝子を使用することによって、ポリペプ
チドまたはペプチドの相互作用を測定することができる。このアッセイのフォー
マットは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２
４５−２４６に記載されている。この型のアッセイのフォーマットは、哺乳動物
細胞および酵母の双方において使用することができる。ＤＮＡ結合ドメインおよ
び転写活性化ドメインの他の組合わせ、例えば、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン
およびＶＰ６０転写活性化ドメインはこの分野において入手可能であり、そして
好ましい。
【００８７】 ＡＴＭのポリペプチドまたはペプチドとｐ５３のポリペプチドまたはペプチド
との間の相互作用を妨害するペプチドまたは他の物質を探すために、ＡＴＭまた
はｐ５３のポリペプチドまたはペプチドを（例えば）ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメ
インを有する融合物として使用し、対応物のｐ５３またはＡＴＭのポリペプチド
またはペプチドを（例えば）ＶＰ６０を有する融合物として使用することができ
、そしてこれらは第３の発現カセットを含み、この発現カセットは別の発現ベク
ター上に存在することができ、この発現ベクターからペプチドまたは多様なおよ
び／またはランダムな配列のペプチドのライブラリーを発現させることができる
。リポーター遺伝子の発現の減少（例えば、β−ガラクトシダーゼの場合におい
て、青色の弱化）は、ＡＴＭ／ｐ５３の相互作用を崩壊するペプチドの存在から
生じ、この相互作用はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写活性化のために要求さ
れる。被験物質がペプチジルでなく、前記第３発現カセット内でコード核酸から
発現させることができない場合、被験物質を外因的に供給して同様な系を使用す
ることができる。
【００８８】 ２−ハイブリッドアッセイを実施して、２つのポリペプチドまたはペプチドの
間の相互作用を妨害する物質を探すとき、酵母細胞の代わりに哺乳動物細胞を使
用することが好ましいことがある。同一原理が適用され、そして適当な方法はこ
の分野においてよく知られている。 本発明による好ましいアッセイにおいて、このアッセイの終点、すなわち、問
題の相互作用に対する被験因子の作用を評価するために決定される点は、ｐ５３
またはそのフラグメント、変異型または誘導体、またはＡＴＭによりリン酸化さ
れるｐ５３中のリン酸化部位の１つに対して相同のリン酸化部位を含む他の分子
のリン酸化である。
【００８９】 こうして、本発明の他の面は、 （ａ） ｐ５３をリン酸化するＡＴＭのフラグメントを少なくとも含む物質、
ＡＴＭによりリン酸化される部位を含むｐ５３のフラグメントを少なくとも含む
物質、および被検化合物を接触させ、そして （ｂ） 前記部位におけるリン酸化を測定する、 ことを含むアッセイを提供する。
【００９０】 もちろん、ＡＴＭおよび／またはｐ５３の任意の適当な変異型または誘導体を
このようなアッセイにおいて使用することができる。 リン酸化は、例えば、次のようにして測定することができる。ｐ５３またはそ
のフラグメント、変異型または誘導体を、例えば、ビーズまたはプレート上に、
固定化し、そして抗体を使用するか、あるいは部位がリン酸化されたとき、その
部位がリン酸化されないときと異なるアフィニティーで関係するリン酸化部位に
結合する他の結合性分子（例えば、Ｍｄｍ２またはそのフラグメント）を使用し
てリン酸化を検出する。このような抗体は、この明細書中のどこかで説明した、
任意の標準的技術により、例えば、リン酸化されたペプチド（例えば、ｐ５３の
フラグメント）を使用して、得ることができる。ｐ５３またはその関係するフラ
グメント、変異型または誘導体のリン酸化された形態と非リン酸化形態とを区別
する結合性分子の結合は、当業者に入手可能な、任意の技術を使用して評価する
ことができ、このような技術は、適当な標識、例えば、蛍光の存在の測定を包含
することができる。リン酸化は、ｐ５３またはそのフラグメント、変異型または
誘導体を適当な支持体、例えば、ビーズまたはプレート上に固定化することによ
って測定することができ、ここで支持体を、例えば、標準的シンチレーションプ
ロクシメトリーアッセイにおいて、シンチラントで含浸させ、リン酸化は放射性
リン酸塩の組込みの測定により決定される。ｐ５３またはそのフラグメント、変
異型または誘導体の中へのリン酸塩の組込みは、酸、例えば、トリクロロ酢酸で
沈降させ、そして沈降物をニトロセルロース濾紙上に収集し、次いで放射能標識
化されたリン酸塩の組込みを測定することによって、測定することができる。
【００９１】 ＡＴＭによるｐ５３のリン酸化を阻害することができる因子は、ＡＴＭの酵素
的に活性な部位の触媒性質に影響を与えることができるＡＴＰアナログまたは他
の物質を包含することができる。リン酸化のインヒビターは、図６においてマー
クされたキナーゼドメイン（ヒトＡＴＭについて）内のＡＴＭと相互作用するこ
とができる。このドメイン内の残基は、ｐ５３との相互作用およびリン酸化の触
媒反応に関係する。このドメインの外側の残基もまたｐ５３との相互作用に関係
し、そしてこのような相互作用を妨害する因子は、この明細書中のどこかで説明
したように、リン酸化に影響を与えることができる。
【００９２】 本発明のアッセイに添加することができる被験物質または被検化合物の量は、
通常、使用する化合物の型に依存して手探り法により決定されるであろう。典型
的には、約０．００１ｎＭ〜１ｍＭまたはそれ以上の濃度、例えば、０．０１ｎ
Ｍ〜１００μＭ、例えば、０．１〜５０μＭ、例えば、約１０μＭの推定上のイ
ンヒビター化合物を使用することができる。ペプチドが被験物質であるとき、よ
り高い濃度を使用することができる。弱い作用を有する分子でさえ、それ以上の
研究および開発のために有用な重要な化合物であることがある。
【００９３】 使用できる化合物は、薬剤スクリーニングプログラムにおいて使用される天然
または合成の化合物であることができる。いくつかの特性決定されたまたはされ
ていない成分を含有する植物の抽出物を使用することもできる。 いずれかのタンパク質形中の相互作用部位に対して向けられた抗体は、推定上
のインヒビター化合物の他のクラスを形成する。候補のインヒビター抗体を特性
決定することができ、そしてそれらの結合領域は相互作用を崩壊する原因となる
一本鎖抗体またはそれらのフラグメントを提供することを決定することができる
。
【００９４】 この分野において標準的である技術を使用して、抗体を得ることができる。抗
体を生産する方法は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ
、ヒツジまたはサル）をタンパク質またはそのフラグメントで免疫化することを
含む。この分野において知られている種々の技術を使用して免疫化された動物か
ら抗体を獲得し、そして、好ましくは問題の抗原に対して抗体の結合を使用して
、スクリーニングすることができる。例えば、ウェスタンブロッティング技術ま
たは免疫沈降法を使用することができる（Ａｒｍｉｔａｇｅ他、１９９２、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）。動物からの抗体および／または抗体産生細胞
の単離は、動物を犠牲にする工程を伴うことがある。
【００９５】 哺乳動物をペプチドで免疫化する別法または補助的方法として、例えば、機能
的免疫グロブリン結合性ドメインをそれらの表面上に表示するラムダバクテリオ
ファージまたはフィラメント状バクテリオファージを使用して、発現された免疫
グロブリンの可変ドメインの組換え的に産生されたライブラリーから、タンパク
質に対して特異的な抗体を得ることができる；例えば、ＷＯ９２／０１０４７号
参照。ライブラリーは実験を受けたことがない、すなわち、タンパク質（または
フラグメント）で免疫化されていない生物から得られた配列から構築されるか、
あるいは問題の抗原に暴露された生物から得られた配列を使用して構築された抗
体であることができる。
【００９６】 本発明による抗体は多数の方法で修飾することができる。事実、用語「抗体」
は必要な特異性を有する結合性ドメインを有する、任意の結合性物質を包含する
として解釈すべきである。こうして、本発明は、抗体フラグメント、抗体の誘導
体、機能的同等物および相同体、例えば、合成分子および抗原またはエピトープ
に結合させる抗体の形状を模倣する形状をもつ分子を包含する。
【００９７】 抗原または他の結合相手に結合することができる抗体フラグメントの例は次の
通りである：ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメン
ト；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；Ｖ
Ｈドメインから成るｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ
’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジサルファイド架橋により結合された
２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント。一本鎖Ｆｖフラグメント
も包含される。
【００９８】 本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、遺伝的突然変
異または他の変化に付すことができる。さらに、当業者は理解するように、モノ
クローナル抗体を組換えＤＮＡ技術に付して、もとの抗体の特異性を保持する他
の抗体またはキメラ抗体を生産することができる。このような技術は、抗体の免
疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、
異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に導入す
ることを含むことができる。例えば、ＥＰ１８４１８７Ａ号またはＥＰ−Ａ−０
２３９４００号参照。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１
２０６９４号またはＥＰ−Ａ−０１２５０２３号に記載されている。
【００９９】 所望の結合特性をもつ抗体を産生することができるハイブリドーマ、ならびに
抗体（抗体のフラグメントを包含する）をコードする核酸を含有しかつこれらを
発現することができる宿主細胞、真核細胞または原核細胞は本発明の範囲内に入
る。本発明は、また、抗体が産生される、好ましくは分泌される条件下に、抗体
を産生できる細胞を増殖させることを含む、抗体を生産する方法を提供する。
【０１００】 試料に対する抗体の反応性は、適当な手段により決定することができる。個々
のリポーター分子を使用する標識化は１つの可能性である。リポーター分子は、
検出可能な、好ましくは測定可能な、シグナルを直接的または間接的に発生する
ことができる。リポーター分子の結合は、直接的、間接的、共有結合的である、
例えば、ペプチド結合または非共有結合を介することができる。ペプチド結合を
介する結合は、抗体およびリポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発
現の結果であることができる。結合を決定するモードは本発明の特徴ではなく、
そして当業者は彼らの採択および一般的知識に従い適当なモードを選択すること
ができる。
【０１０１】 例えば、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸からの発現によるポリ
ペプチドまたはペプチドの生産後に、本発明によるポリペプチドまたはペプチド
を精製および／または単離するとき、また、抗体を使用することができる。抗体
は、ＡＴＭ／ｐ５３（またはＡＴＲ／ｐ５３）の活性を阻害することを予想して
、それらの相互作用を崩壊するために療法的関係（これは予防を包含することが
できる）において有用であることがある。例えば、抗体は、放射線療法および／
または化学療法（既に前述したように）に暴露される細胞、例えば、腫瘍細胞の
中にマイクロインジェクトすることができる。本発明によれば、抗体はこの明細
書中のどこかで説明する他の療法的および非療法的目的に使用することができる
。
【０１０２】 他の候補のインヒビター化合物は、ポリペプチドまたはペプチドのフラグメン
トの３次元構造をモデル化し、そして合理的薬剤の設計を使用して、特定の分子
の形状、大きさおよび電荷の特性をもつ潜在的インヒビター化合物を提供するこ
とにに基づくことができる。 ＡＴＭおよび／またはｐ５３の活性に影響を与える能力を有することが見出さ
れた化合物は、説明したように、多数の関係において療法的および他の可能性を
有する。療法的処置のために、このような化合物は任意の他の活性物質と組み合
わせて、例えば、抗腫瘍の療法の他の抗腫瘍化合物または療法、例えば、放射線
療法または化学療法のために、使用することができる。このような場合において
、本発明のアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏで実施するとき、ｐ５３およびＡＴＭ（
またはそれらの適当なフラグメント、変異型または誘導体）の間の相互作用のモ
ジュレーションの程度または試験する化合物により引き起こされるｐ５３のリン
酸化または活性のモジュレーションの程度を測定することを必要としない。その
代わりに、ＤＮＡ修復、相同組換え、細胞の生活能力、細胞の死滅（例えば、放
射線療法および／または化学療法の存在および不存在における）、レトロウイル
スの組込み、およびその他に対する作用を測定することができる。このような修
飾されたアッセイは本発明の主要なアッセイと平行して実施するか、あるいはそ
れに引き続いて実施して、このような作用が前記インヒビター化合物により引き
起こされたＡＴＭおよびｐ５３の間の相互作用の阻害の結果であるが、単に一般
的毒性作用ではないことを確証することができる。
【０１０３】 こうして、１以上の主要なスクリーン（例えば、無細胞系における）を使用し
て、ＡＴＭおよび／またはｐ５３と相互作用する能力および／またはＡＴＭおよ
び／またはｐ５３の活性をモジュレートする能力を有するとして同定された因子
は、１以上の二次スクリーンを使用して、さらに評価することができる。二次ス
クリーンは、細胞の放射線増感および／または放射線類似作用性薬剤に対する増
感、染色体テロメア長さに対する作用、照射または他の細胞の障害後の細胞周期
の停止の誘導または防止、イオン化放射線の照射または他の細胞の障害後のｐ５
３の誘導の作用、またはｐ２１または下流のｐ５３ターゲットの誘導について試
験することを含むことができる。
【０１０４】 ＡＴＭおよび／またはｐ５３の活性をモジュレートするか、あるいはそれに影
響を与える物質または因子を同定した後、前記物質または因子をさらに研究する
ことができる。さらに、前記物質または因子を製造しおよび／または製造におい
て、すなわち、組成物、例えば、薬物、医薬組成物または薬剤の製造および処方
において使用することができる。これらは、例えば、この明細書中のどこかで説
明する目的のいずれかのために、個体に投与することができる。
【０１０５】 前述したように、因子はペプチジル、例えば、前述の配列を包含するペプチド
であることができるか、あるいはこのようなペプチドの機能的アナログであるこ
とができる。 本明細書において使用するとき、表現「機能的アナログ」は、問題のペプチド
と同一の活性を有し、ＡＴＭおよびｐ５３の間の相互作用を妨害することができ
る、ペプチドの変異型または有機化合物に関する。このようなアナログの例は、
接触区域においてＡＴＭまたはｐ５３のドメインの３次元構造、特にＡＴＭまた
はｐ５３において出現するかぎアミノ酸残基の配置、に類似するようにモデル化
された化合物を包含する。
【０１０６】 それ以上の面において、本発明は、前記物質の模倣物を設計するか、あるいは
前記模倣物をスクリーニングする方法における、前記物質の使用を提供する。 したがって、本発明は、ｐ５３またはＡＴＭの結合または阻害の生物学的活性
、ｐ５３またはＡＴＭのアロステリック阻害の活性、および／またはＡＴＭ／ｐ
５３の相互作用をモジュレートする、例えば、阻害する活性を有するＡＴＭまた
はｐ５３の模倣物を設計する方法を提供し、この方法は、 （ｉ） 生物学的活性を有する物質を分析して、活性のために必須でありかつ
重要であるアミノ酸残基を決定して、薬作用発生団を定め、そして （ｉｉ） 薬作用発生団をモデル化して、候補の生物学的活性を有する模倣物
を設計しおよび／またはスクリーニングする、 ことを含む。
【０１０７】 適当なモデル化技術はこの分野において知られている。これはいわゆる「模倣
物」の設計を含み、この設計は機能的相互作用、蛍光発生オリゴヌクレオチド、
化合物がそれらの相互作用を再現できるような方法において配置された官能基を
含有する化合物の分子および設計の研究を含む。 既知の薬学的に活性な化合物に対する模倣物の設計は、「主要な」化合物をベ
ースとする薬剤の開発に対する既知のアプローチである。活性化合物の合成が困
難であるか、あるいは高価である場合、あるいは特定の投与法に不適当である場
合、例えば、ペプチドが消化管中のプロテアーゼにより急速に分解される場合、
これは望ましいことがある。模倣物の設計、合成および試験を使用して、大量の
分子をターゲット性質についてランダムにスクリーニングすることを回避するこ
とができる。
【０１０８】 所定のターゲット性質を有する化合物から模倣物を設計するとき普通に用いら
れる、いくつかの工程が存在する。第１に、ターゲット性質の決定において決定
的なおよび／または重要な化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合にお
いて、これはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによって、例
えば、各残基を順次に置換することによって、実施することができる。化合物の
活性領域を構築するこれらの部分または残基は、その「薬作用発生団」として知
られている。
【０１０９】 いったん薬作用発生団が見出されると、その構造をその物理的性質、例えば、
立体化学、結合性、大きさおよび／または電荷に従い、ある範囲の源、例えば、
分光学的技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲを使用して、モデル化する。このモ
デル化プロセスにおいて、コンピューターによる分析、類似性のマッピング（こ
れは原子の間の結合よりむしろ、薬作用発生団の電荷および／または体積をモデ
ル化する）および他の技術を使用することができる。
【０１１０】 このアプローチの変法において、リガンドおよびその結合相手の三次元構造を
モデル化する。リガンドおよび／または結合相手が結合時にコンフォメーション
を変化させる場合、これは特に有用であり、これによりモデルはこれを考慮して
模倣物の設計を可能とする。 次いで、薬作用発生団を模擬する化学的基をグラフト化することができる鋳型
分子を選択する。模倣物が合成容易であり、薬学上許容され、かつｉｎ ｖｉｖ
ｏにおいて分解しないと同時に、主要な化合物の生物学的活性を保持するように
、鋳型分子およびそれにグラフト化された化学的基を好都合に選択することがで
きる。次いで、このアプローチにより見出された１以上の模倣物をスクリーニン
グして、それらがターゲット性質を有するかどうか、あるいはそれらがそれをど
の程度に示すかを見ることができる。次いでそれ以上の最適化または修飾を実施
して、ｉｎ ｖｉｖｏまたは臨床的試験のための１以上の最終的模倣物に到達す
ることができる。
【０１１１】 このアプローチにより見出された１以上の模倣物をスクリーニングして、それ
らがターゲット性質を有するかどうか、あるいはそれらがそれをどの程度に示す
かを見ることができる。次いでそれ以上の最適化または修飾を実施して、ｉｎ
ｖｉｖｏまたは臨床的試験のための１以上の最終的模倣物に到達することができ
る。
【０１１２】 この型の模倣物ならびに療法におけるそれらの使用は、本発明の他の面を形成
する。 さらに、本発明は、ｐ５３および／またはＡＴＭと相互作用し、および／また
はＡＴＭおよびｐ５３の間の相互作用をモジュレートし、例えば、阻害し、およ
び／またはＡＴＭおよび／またはｐ５３の活性を阻害することができる物質につ
いてのスクリーニングにおける、開示した配列を含むペプチド、またはＡＴＭま
たはｐ５３と相互作用しおよび／またはＡＴＭおよびｐ５３の間の相互作用をモ
ジュレートし、例えば、阻害し、および／またはＡＴＭおよび／またはｐ５３の
活性をモジュレートすることができる、その誘導体、活性部分、アナログ、変異
型または模倣物の使用を提供する。
【０１１３】 一般に、本発明による、このような物質、例えば、インヒビターは単離された
および／または精製された形態で、すなわち、実質的に純粋な形態で提供される
。これを組成物の中に添加することができ、ここでそれは少なくとも約９０％の
活性成分、より好ましくは少なくとも約９５％の活性成分、より好ましくは少な
くとも約９８％の活性成分を含む。しかしながら、このような組成物は、不活性
の担体物質または薬学上許容されかつ生理学上許容される賦形剤を含むことがで
きる。後述するように、本発明による組成物は開示したインヒビター化合物に加
えて、１以上の他の療法上の用途を有する分子、例えば、抗腫瘍剤を含むことが
できる。
【０１１４】 本発明は、種々の面において、本明細書において開示するものに従う、ＡＴＭ
およびｐ５３の相互作用および／またはＡＴＭまたはｐ５３仲介活性、性質また
は経路のモジュレーターとして同定された物質ばかりでなく、かつまたこのよう
な物質を含んでなる医薬組成物、薬物、薬剤または他の組成物、このような組成
物を、例えば、この明細書中のどこかで説明する目的のために、患者に投与する
ことからなる、予防的治療を含むことができる、方法、例えば、この明細書中の
どこかで説明する目的のために、投与するための組成物の製造における、このよ
うな物質使用、およびこのような物質を薬学上許容される賦形剤、ビヒクルまた
は担体、および必要に応じて他の成分と混合することを含む、医薬組成物を製造
する方法を提供する。
【０１１５】 細胞、例えば、腫瘍細胞におけるＡＴＭまたはｐ５３仲介活性に影響を与える
療法により、ヒトまたは動物の体を治療する方法において使用するために、本発
明による物質、例えば、ＡＴＭおよびｐ５３の相互作用のインヒビターを提供す
ることができる。本発明による物質を使用する治療法の他の目的は、この明細書
中のどこかで説明されている。
【０１１６】 こうして、本発明は、さらに、例えば、この明細書中のどこかで説明する目的
のために、ＡＴＭおよび／またはｐ５３仲介活性をモジュレートする方法を提供
し、この方法はＡＴＭとｐ５３タンパク質との間の相互作用をモジュレート、阻
害またはブロックする因子を投与することを含み、このような方法はこのような
モジュレーション、阻害またはブロッキングが望ましい治療において有用であり
、また、この方法はＡＴＭとｐ５３タンパク質との間の相互作用を増加し、増強
しまたは強化する因子を投与することを含み、このような方法はこれが望ましい
治療において有用である。
【０１１７】 本発明は、さらに、ＡＴＭとｐ５３タンパク質との間の相互作用を妨害する因
子を患者に投与することを含む、治療方法を提供する。このような治療の典型的
な目的はこの明細書中のどこかで説明されている。 それが個体に投与すべき本発明によるポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分
子、小さい分子、模倣物または他の薬学上有用な化合物であるかどうかにかかわ
らず、投与は好ましくは「予防的に有効な量」または「治療的に有効な量」であ
り（場合に応ずるが、予防は療法と考えることができる）、これは個体に利益を
示すために十分である。投与される実際の量、および投与の速度および時間経過
は治療すべき疾患の特質および程度に依存するであろう。治療の処方、例えば、
投与量およびその他の決定は一般的実施者および他の医師の責任の範囲内である
。
【０１１８】 組成物は、治療すべき症状に依存して、単独であるいは他の治療と組合わせて
、同時にまたは順次に投与することができる。 本発明による、本発明に従い使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて
、薬学上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者によく知られて
いる他の物質を含むことができる。このような物質は無毒であり、そして活性成
分の効能を妨害してはならない。担体または他の物質の正確な特質は、経口的、
または注射、例えば、皮内、皮下または静脈内の注射であることができる、投与
の経路に依存する。
【０１１９】 経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であ
ることができる。錠剤は固体担体、例えば、ゼラチンまたはアジュバントを含む
ことができる。液状医薬組成物は、一般に、液状担体、例えば、水、石油、動物
性または植物性の油、鉱油または合成油を含む。 生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール、例えば、
エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含
めることができる。
【０１２０】 静脈内、皮内または皮下の注射、または病気の部位における注射のために、活
性成分は発熱物質を含まずかつ適当なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経
口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば、等張ベヒクル、例
えば、塩化ナトリウム溶液、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液を使用して、適
当な溶液を調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および
／または他の添加剤を必要に応じて添加することができる。
【０１２１】 リポソーム、特にカチオン性リポソームを担体処方物において使用することが
できる。 前述の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．（編）、１
９８０に記載されている。
【０１２２】 因子は局在化された方法において腫瘍部位または所望の部位に投与するか、あ
るいは因子を腫瘍または他の細胞をターゲッティングする方法において因子を送
出することができる。 ターゲッティング療法に従い、ターゲッティング系、例えば、抗体または細胞
特異的リガンドを使用して、活性因子をいっそう特異的にある種の型の細胞に送
出すことができる。種々の理由で、例えば、因子が許容されえないほどに毒性で
ある場合、あるいはそれがそうでなければ多過ぎる投与量を必要とする場合、あ
るいはそれがそうでなければターゲット細胞の中に入ることができない場合、タ
ーゲッティングは望ましいことがある。
【０１２３】 これらの因子を直接的に投与すする代わりに、細胞の中に、例えば、ウイルス
ベクターの中に、導入されたコード遺伝子から発現させることによって、それら
をターゲット細胞中で生産することができる（ＶＤＥＰＴ技術の変法−下文参照
）。ベクターを処理すべき特定の細胞にターゲッティングすることができるか、
あるいはベクターはターゲット細胞により多少選択的にスイッチされる調節因子
を含有することができる。
【０１２４】 因子（例えば、小さい分子、模倣物）を前駆体の形態で投与して、処理すべき
細胞の中で産生されるか、あるいは前記細胞にターゲッティングされる活性因子
により、活性形態に変換することができる。この型のアプローチは時にはＡＤＥ
ＰＴまたはＶＤＥＰＴとして知られており、前者は細胞特異的抗体への結合によ
りアクチベーターを細胞にターゲッティングすることを含むが、後者はウイルス
ベクター中のコードＤＮＡからの発現によりベクター中でアクチベーター、例え
ば、酵素を産生することを含む（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１号またはＷＯ
９０／０７９３６号参照）。
【０１２５】 不活性であるが、体の中で活性形態に変換される因子を投与することができる
。例えば、因子をリン酸化することができ（例えば、安定性を改良するために）
ホスフェートは体の中で切断されて因子の活性な形態を提供する。 組成物は、治療すべき症状、例えば、癌、ウイルス感染またはＡＴＭまたはｐ
５３仲介作用が望ましい任意の他の症状に依存して、単独であるいは他の治療と
組合わせて、同時にまたは順次に投与することができる。
【０１２６】 ＡＴＭおよびｐ５３の相互作用をモジュレートし、例えば、妨害し、および／
または活性または他のＡＴＭまたはｐ５３仲介の細胞の経路または機能を誘導ま
たはモジュレートすることができるポリペプチドまたはペプチドをコードする、
本発明による核酸は、遺伝子治療の方法において、例えば、個体の治療において
、例えば、障害を（完全にまたは部分的に）予防または治療する目的で、または
この明細書中のどこかで説明する他の目的で使用することができる。
【０１２７】 ベクター、例えば、ウイルスベクターは、先行技術において、広範な種類の異
なるターゲット細胞の中に核酸を導入するために使用されてきている。典型的に
は、ベクターをターゲット細胞に暴露して、トランスフェクションを十分な比率
の細胞において起こして、所望のポリペプチドの発現から有用な治療または予防
の効果を提供するできるようにする。トランスフェクトされた核酸をターゲッテ
ィングされた細胞の各のゲノムの中に永久的に組込ませて、長く持続する作用を
提供することができるか、あるいは治療を周期的に反復しなくてはならないこと
がある。
【０１２８】 ウイルスベクターおよびプラスミドのベクターの双方の、種々のベクターはこ
の分野において知られており、例えば、米国特許第５，２５２，４７９号および
ＷＯ９３／０７２８２号を参照のこと。特に、多数のウイルスは遺伝子転移ベク
ターとして使用されてきており、これらのベクターはパポーバウイルス、例えば
、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶおよびＥ
ＢＶ、およびレトロウイルスを包含する。先行技術の多数の遺伝子治療のプロト
コールにおいて、無能化ネズミレトロウイルスが使用されてきている。
【０１２９】 ウイルスベクターの使用に対する別法として、細胞の中に核酸を導入する他の
既知の方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、機械的技術
、例えば、マイクロインジェクション、リポソームにより仲介される転移および
直接的ＤＮＡ吸収およびレセプター仲介ＤＮＡ転移を包含する。 レセプター仲介ＤＮＡ転移は核酸を特定の細胞に特異的にターゲッティングす
る技術の１例である。この技術において、核酸をポリリジンを介してタンパク質
リガンドに結合させ、リガンドはターゲット細胞の表面上に存在するレセプター
に対して特異的である。
【０１３０】 関係するポリペプチド、ペプチドまたは本明細書において開示する他の物質の
相互作用をモジュレートまたは妨害することができるポリペプチド、ペプチドま
たは他の物質、あるいはペプチジルのこのような分子をコードする核酸分子は、
キット、例えば、外部の環境からその内容物を保護する適当な容器の中に密閉さ
れたキットで提供することができる。このようなキットは使用説明書を含むこと
ができる。
【０１３１】 それ以上の面において、本発明は、精製されたＡＴＭおよび精製されたＡＴＲ
を提供する。例えば、約１０％の純度、より好ましくは約２０％の純度、より好
ましくは約３０％の純度、より好ましくは約４０％の純度、より好ましくは約５
０％の純度、より好ましくは約６０％の純度、より好ましくは約７０％の純度、
より好ましくは約８０％の純度、より好ましくは約９０％の純度、より好ましく
は約９５％の純度の精製されたＡＴＭまたはＡＴＲ、または実質的に純粋なＡＴ
ＭまたはＡＴＲをＤＮＡを使用して得ることができる。このようなＤＮＡはＡＴ
ＭまたはＡＴＲが結合する任意の形態であることができ、このような形態は一本
鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ニックＤＮＡ、共有結合的に閉じたＤＮＡ環およびそ
の他を包含する。これらの任意のものおよびすべては、下記において実験的に示
すように、ＡＴＭにより結合されることは驚くべきことである。
【０１３２】 １つの面において、本発明は、ＡＴＭまたはＡＴＲを精製するためのＤＮＡの
使用を提供する。 他の面において、本発明は、ＡＴＭまたはＡＴＲを精製する方法を提供し、こ
の方法はＡＴＭまたはＡＴＲをＤＮＡと接触させることを含む。ＡＴＭまたはＡ
ＴＲを包含する物質の混合物を固定化されたＤＮＡ（例えば、ビーズまたはアガ
ロース上に、そして特異的に結合性の分子、例えば、ストレプトアビジンまたは
ビオチンを介して共有結合的または非共有結合に）と接触させることができ、そ
して結合しない分子を洗浄除去する。
【０１３３】 我々は、また、ＮＴＡを使用して、好ましくはＮｉ2+の存在において、ＡＴＭ
およびＡＴＲを精製できることを確立した。ＮＴＡは任意の適当な支持体、例え
ば、アガロースまたはセファローズ上に存在することができる。こうして、本発
明のそれ以上の面は、ＡＴＭまたはＡＴＲ精製するためのＮＴＡ、好ましくはＮ
ｉ2+の使用を提供する。
【０１３４】 本発明の他の面は、ＡＴＭまたはＡＴＲをＮＴＡ、好ましくはＮｉ2+と接触さ
せ、そして結合しない分子を洗浄除去することを含む、ＡＴＭまたはＡＴＲを精
製する方法を提供する。 ＤＮＡを使用する精製を、ＮＴＡ、好ましくはＮｉ2+を使用する精製と、順次
にまたは同時に、組合わせることができる。
【０１３５】 いずれの技術も、ＡＴＭ活性をモジュレートする因子、例えば、ＡＴＭとＤＮ
Ａとの間の相互作用に影響を与える因子の同定に使用することができる。 精製においてＤＮＡおよび／またはＮＴＡと接触するＡＴＭは、分子の混合物
、例えば、細胞の抽出物、例えば、Ａ−Ｔ患者の細胞、または生物、例えば、ヒ
トの正常の細胞、またはコードＤＮＡからタンパク質を発現する組換え宿主細胞
、例えば、細菌細胞、真核生物（例えば、哺乳動物または酵母）の細胞または昆
虫細胞、例えば、バキュロウイルスの発現系における細胞からの抽出物の中に存
在することができる。精製に引き続いて、適当な発現系、例えば、細胞中で、コ
ード核酸からの発現により、組換え的にＡＴＭの産生を実施することができる。
【０１３６】 精製後、ＡＴＭは必要に応じて、例えば、ｐ５３または他の分子のそのリン酸
化をモジュレートする因子のアッセイにおいて、特異的抗体または他の結合性分
子の発生または獲得において、または療法的関係において、例えば、個体におい
て野生型ＡＴＭの不存在を補償するために（例えば、Ａ−Ｔの患者において）使
用することができる。
【０１３７】 本発明の種々のそれ以上の面および態様は、本発明の開示にかんがみて、当業
者にとって明らかであろう。次に、本発明のある種の面および態様を１例として
既に上述した図面を参照して説明する。 ＤＮＡへのＡＴＭの結合 ビオチン化ランダムｄｓ５０マーのオリゴヌクレオチドをストレプトアビジン
酸化鉄粒子にカップリングさせ、そしてこれらを使用してＨｅＬａ細胞核抽出物
からＤＮＡ結合性タンパク質を回収した。このアプローチにおいて、ＡＴＭはこ
のｄｓＤＮＡのランダム片を有する粒子と相互作用することが明らかにされた（
図１Ａ）。ストレプトアビジン酸化鉄粒子単独はＡＴＭと結合することができな
いので、この結合はＤＮＡの存在のためである（図１Ａ）。重要なことには、配
列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質Ｓｐ１およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ
ＩＩ）を含有する非特異的ＤＮＡ相互作用性タンパク質複合体の双方は、これら
の研究において使用したランダムＤＮＡフラグメントと安定に相互作用すること
ができない（図１Ａ）。さらに、粗製の核抽出物の中に存在するＤＮＡ−ＰＫcs は、そのＤＮＡターゲッティング成分Ｋｕが存在するという事実にかかわらず、
固定化されたＤＮＡに非常に不十分にのみ結合する（データは示されていない）
。顕著には、タンパク質の定量において、９０％より多いＡＴＭがＤＮＡがカッ
プリングした粒子に結合する条件下に、全体の核タンパク質の２％より少なくが
保持されることが明らかにされた。それゆえ、これらの研究におけるＤＮＡによ
るＡＴＭの保持は高度に特異的である。
【０１３８】 前述のアッセイから明らかなように、ＡＴＭ、またはＡＴＭ複合体は二本鎖Ｄ
ＮＡのランダム片に結合することができる。追加の研究において、ＡＴＭは、ま
た、他の無関係のオリゴヌクレオチドを含有する粒子により結合されることが明
らかにされ、相互作用が配列特異的でないことが強く示唆される（データは示さ
れていない）。ＡＴＭのＤＮＡ結合性をさらに研究するために、種々の大きさお
よび構成を有する１系列のＤＮＡを試験した。これらの研究において、結合およ
び初期の洗浄を５０ｍＭのＫＣｌの存在において実施し、次いで結合した物質を
１００、２５０および５００ｎＭのＫＣｌにおける順次の洗浄により溶離した。
ＤＮＡとＡＴＭとの間の相互作用がＤＮＡ−二本鎖の大きさに依存することを図
１Ｂは証明する。こうして、ｄｓ１５マーでは、多少のＡＴＭは非結合画分の中
になお存在し、そして大部分の結合した物質はより低い塩の洗浄液の中に溶離さ
れる。しかしながら、二本鎖の大きさが増加するにつれて、それはＡＴＭの結合
において漸進的にいっそう有効となり、こうして５０ｂｐ以上のｄｓオリゴヌク
レオチドを使用するとき、ＡＴＭの結合はほとんど定量的であり、そしてすべて
の結合したＡＴＭはより高い塩の洗浄液の中に溶離される（図１Ｂ）。
【０１３９】 種々のＤＮＡ構造物がＩＲにより産生されることが知られており、そしてＤＮ
Ａ修復プロセスの間に存在するので、種々の型のＤＮＡ構造物に結合するＡＴＭ
の能力を評価した。こうして、ニック、一本鎖から二本鎖への移行、３５ｂｐの
ギャップ、または１０ｂｐのループを有するｄｓ１００マーのオリゴヌクレオチ
ドにカップリングした粒子を使用して、アッセイを実施した。顕著には、使用し
たアッセイ条件下に、ＡＴＭは完全にｄｓＤＮＡのオリゴヌクレオチドに対して
と等しい効率および見掛けのアフィニティーで、これらのＤＮＡ分子に結合する
（図１Ｃ）。追加の研究において、ＡＴＭはまたｓｓＤＮＡに効果的に結合する
こと（図１Ｃ）そして、ｄｓＤＮＡを使用するときのように、この結合はオリゴ
ヌクレオチドの長さに依存することが示された（データは示されていない）。さ
らに、このような実験におけるＡＴＭの結合は線状または環状プラスミドＤＮＡ
により効果的に完結され、ＤＮＡの末端がＡＴＭの結合に要求されないことが示
唆される（ＮＤＬ、未発表のデータ）。総合すると、このデータが示すように、
ＡＴＭ、またはこの因子を含有する複合体は、明らかに非配列特異的方法におい
て、種々の異なる構造物を含有するＤＮＡ分子と相互作用することができる。ま
た、我々の結果が示すように、ＡＴＭは線状ＤＮＡに対する結合を好み、ＤＮＡ
の末端に優先的に結合する。
【０１４０】 ＡＴＭの精製 ＡＴＭの我々の理解をさらに深めるために、このタンパク質を本質的に均質に
精製し、こうしてそれから他のＤＮＡ結合性タンパク質、ＤＮＡ修復因子、タン
パク質キナーゼおよび脂質キナーゼを分離することを試みた。我々が開発した精
製戦略は図２Ａに概略的に示されている。ＡＴＭは偏在的に発現されそして主と
して細胞核の中に位置するので、ＨｅＬａ細胞核抽出物を出発物質として使用し
た。生化学的アッセイをＡＴＭタンパク質機能のために利用できなかったので、
我々はタンパク質の２つの異なる部分に対する抗体を使用してウェスタンブロッ
トアッセイによりその精製をモニターした（Ｌａｋｉｎ他、１９９６）。このア
プローチはＡＴＭの分画を明らかにしたばかりでなく、かつまたＤＮＡ−ＰＫcs およびＫｕの存在を同時に試験することによって豊富なＤＮＡ−ＰＫ酵素を欠く
画分をプールすることができた。ＡＴＭのＤＮＡ結合特性に照らして、我々は精
製スキームにおいて最終のＤＮＡアフィニティー工程を用いた（図２Ｂ、レーン
４）。
【０１４１】 銀染色はこれが約３５０ｋＤａのポリペプチドの本質的に均質な製造に導くこ
とを証明し、そしてウェスタンブロッティングの研究はこれがＡＴＭ抗血清ＡＴ
Ｍ．Ｂにより強く認識されることを明らかにした（図２Ｂ）。このタンパク質は
またＡＴＭポリペプチドの独特な領域に対して発生させた２つの他の抗体により
認識される（データは示されていない）ので、我々は精製されたタンパク質が事
実ＡＴＭであると結論する。図２Ｂにおいて明らかにされるように、ＡＴＭが精
製手順により濃縮される間、Ｋｕ、ＤＮＡ−ＰＫcs、および豊富なｓｓＤＮＡ結
合性タンパク質の複製プロテインＡ（ＲＰＡ）のすべては効率よく除去される。
定量的ウェスタンブロッティングおよび銀染色において、ＡＴＭの最終収率はほ
ぼ２５％であることが明らかにされ、そしてＡＴＭは比較的低い存在量であり、
約０．００２質量％の総核タンパク質を含むことを示された。
【０１４２】 精製ＡＴＭは関連ｐ５３キナーゼ活性を有する 顕著には、ＤＮＡ−ＰＫについて（Ｈａｒｔｌｅｙ他、１９９５）、精製され
たＡＴＭ調製物はＰＩに対する検出可能なキナーゼ活性および種々のリン酸化さ
れたＰＩ誘導体を欠くことが見出された。ＡＴＭがある種の条件下にまたは追加
の成分の存在においてこれらのまたは関係するリン脂質をリン酸化することを排
除することができないが、ＡＴＭは脂質キナーゼでなはないと我々は結論する。
可能なＡＴＭ−関連ｐ５３キナーゼ活性についてアッセイするために、ＡＴＭで
ありうると推測された、等しい量の種々の組換えタンパク質または精製されたタ
ンパク質を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを我々は実施した。あ
る種の候補の基質、例えば、ＤＮＡ−ＰＫcs、Ｋｕ、増殖性細胞核抗原（ＰＮＣ
Ａ）、およびＲＰＡの３４ｋＤａのサブユニット（ＲＰＡ−ｐ３４）を、ＤＮＡ
損傷検出および／またはＤＮＡ修復に関連する効力により、選択した。また、Ｓ
ｐ１およびｐ５３を試験した。なぜなら、これらの双方はＤＮＡ−ＰＫのすぐれ
た基質であり、そしてＡ−Ｔ細胞はＩＲに応答してｐ５３の異常な誘導を表すか
らである。試験した最終のタンパク質はＩk Ｂl であった。なぜなら、最近のデ
ータはこれがＡＴＭターゲットであると関係づけたからである（Ｊｕｎｇ他、１
９９５；Ｊｕｎｇ他、１９９７）。ＡＴＭがＤＮＡに結合することを我々が見出
したことが与えられると、すべての初期のキナーゼ反応においてＤＮＡ−ＰＫを
活性化することが知られているＤＮＡオリゴヌクレオチドを我々は含めた。
【０１４３】 顕著には、ＤＮＡ−ＰＫcs、ＲＰＡ−ｐ４５およびＰＣＮＡのいずれも精製さ
れたＡＴＭにより効率よくリン酸化されなかった（図３Ａ）。しかしながら、オ
ートラジオグラムのより長い暴露はＡＴＭ調製物によるＫｕの７０ｋＤａのサブ
ユニット（Ｋｕ７０）およびＳｐ１の双方の弱いリン酸化を明らかにした（デー
タは示されていない）。さらに、延長した暴露は、また、ＡＴＭが自己リン酸化
することができることを明らかにし（データは示されていない）、これは粗製の
細胞抽出物から直接的に免疫沈降されたＡＴＭを使用する、以前のおおざっぱな
研究と一致する（Ｋｅｅｇａｎ他、１９９６）（すべての種類の不純物をを含有
するようである）。しかしながら、最も意味あることには、いくつかの独立に精
製されたＡＴＭ調製物はｐ５３を高い効率でリン酸化することが終始一貫して見
出された（図３Ａ）（前述のＫｅｅｇａｎ他の結果と反対に）。
【０１４４】 総合すると、これらのデータから明らかなように、我々のアッセイ条件下に、
タンパク質キナーゼ活性はｐ５３を効率よくリン酸化し、Ｓｐ１およびＫｕ７０
を弱くリン酸化するＡＴＭと共精製される。重要なことには、ＤＮＡ−ＰＫはｐ
５３、Ｓｐ１、Ｋｕ７０およびＲＰＡ−ｐ３４を効率よくｉｎ ｖｉｔｒｏリン
酸化し、ＡＴＭ−関連キナーゼ活性がＤＮＡ−ＰＫのそれと異なる基質特異性を
示すを明らかにする。これを我々のＡＴＭ調製物の中の検出可能なＤＮＡ−ＰＫ cs またはＫｕの不存在と組合わせると、ＡＴＭ−関連ｐ５３キナーゼ活性がＤＮ
Ａ−ＰＫの汚染により付与されるという可能性に対して強く反論される。
【０１４５】 前述の結果はｐ５３キナーゼ活性がＡＴＭと共精製されることを明らかにする
が、延長された銀染色は我々のＡＴＭ調製物中の追加のポリペプチドを明らかに
する（データは示されていない）。したがって、我々が検出したｐ５３キナーゼ
活性がＡＴＭにより仲介されず、汚染するタンパク質により仲介されるという可
能性が存在した。この問題を扱うために、ＡＴＭポリペプチドのＮ末端領域（Ａ
ＴＭ．Ｎ）または内部の領域（ＡＴＭ．Ｂ）に対して発生させたポリクローナル
抗体を使用して、精製されたＡＴＭ調製物からＡＴＭを免疫沈降させた（Ｌａｋ
ｉｎ他、１９９６）。免疫沈降させた物質を５００ｍＭのＫＣｌおよび０．１％
のＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０中でよく洗浄した後、基質としてｐ５３を使用するキ
ナーゼ反応において、それを使用した。免疫沈降させた物質の純度を確立するた
めに、キナーゼ反応において使用したＡＴＭと平行に、精製されたＡＴＭをビオ
チン化し、免疫沈降させた。次いで、ビオチン化された沈降タンパク質をウェス
タン転移により可視化し、ストレプトアビジン結合セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼでプロービングした。
【０１４６】 図３Ｂに図解するように、ＡＴＭの予測された分子量である、大きさほぼ３５
０ｋＤａのビオチン化タンパク質は、これらの研究において、抗ＡＴＭ抗血清に
より沈降するが、前免疫血清により沈降しない。顕著には、他のタンパク質はこ
れらのアッセイにおいて双方のＡＴＭにより終始一貫して沈降しない（約１００
ｋＤａのポリペプチドは図３ＢにおけるＡＴＭ．Ｎ沈降において明らかであるが
、ＡＴＭ．Ｂ免疫沈降物の中に存在せず、そしてＡＴＭ．Ｎを使用する引き続く
実験において終始一貫して観察されなかった）。
【０１４７】 最も重要なことには、これらの実験において、ｐ５３キナーゼ活性は２つのＡ
ＴＭ抗血清により免疫沈降されることが明らかされた。わずかにより多い量のＡ
ＴＭがＡＴＭ．Ｎにより沈降されるにかかわらず、ＡＴＭ．ＢよりもＡＴＭ．Ｎ
を使用して、より大きいＡＴＭ関連キナーゼ活性が観測される（図３Ｃ）。これ
についての１つの可能な説明は、ＡＴＭキナーゼドメインに近接するエピトープ
を認識するＡＴＭ．ＢがＡＴＭタンパク質キナーゼ活性を損なうということであ
る。これらの研究が示すように、我々のＡＴＭ調製物の中に存在するｐ５３キナ
ーゼ活性は、それ以上の高度にストリンジェントなイムノアフィニティー沈降工
程を通してＡＴＭに従い、そしてＡＴＭがｐ５３のリン酸化を直接的に仲介する
ことを強く示唆する。我々の意見ではあり得ないが、我々の検出法から逃れかつ
使用したストリンジェント精製および免疫沈降プロトコールを通してＡＴＭと会
合して止まる、独特なポリペプチドにより、ｐ５３がリン酸化されるという可能
性が残っている。
【０１４８】 ＡＴＭ関連キナーゼ活性はＤＮＡにより刺激される ＡＴＭがＤＮＡと相互作用することができることが与えられると、ＡＴＭ関連
タンパク質キナーゼ活性が核酸コファクターにより刺激されるかどうかを研究し
た。これを達成するために、増加する量のＤＮＡの不存在または存在においてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した。以前の研究において、同一ＤＮＡ
分子へのＤＮＡ−ＰＫおよびＳｐ１の共局在化がリン酸化効率を増加することが
明らかにされた（Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ他、１９９２；Ｇｏｌｌｉｅｂおよび
Ｊａｃｋｓｏｎ、１９９３）ので、多重ｐ５３結合部位を有する線状プラスミド
分子を使用した。これらの研究において、ＤＮＡの添加はＤＮＡ−ＰＫによるｐ
５３のリン酸化の顕著な刺激に導くことが明らかにされた（図４Ａ、中央）。顕
著には、ＤＮＡはまたＡＴＭを含有する反応におけるｐ５３のリン酸化の顕著な
刺激を生ずることが見出された（図４Ａ、上部）。
【０１４９】 こうして、精製されたＡＴＭ調製物はＤＮＡ刺激ｐ５３キナーゼ活性を含有す
る。オートラジオグラムのより長い暴露は、ＡＴＭポリペプチドがまたこのよう
なアッセイにおいてリン酸化に付されること、およびこのリン酸化はＤＮＡによ
り刺激されることが明らかにされた（データは示されていない）。等しい量のＤ
ＮＡ−ＰＫおよびＡＴＭを使用する実験において、ＤＮＡによるｐ５３キナーゼ
活性の刺激はＡＴＭおよびＤＮＡ−ＰＫについて類似すること、およびＡＴＭに
よるｐ５３のリン酸化の化学量論はＤＮＡ−ＰＫにより触媒されるのと少なくと
も同程度に高いことが明らかにされた（データは示されていない）。ＤＮＡ依存
的キナーゼ活性はＡＴＭ調製物において終始一貫して観察されたが、活性化の程
度は可変であった。これに関して、高いレベルのＤＮＡ活性化可能性を表した、
いくつかの調製物において、追加のポリペプチドは明らかであった。
【０１５０】 こうして、共精製されるポリペプチドは高いレベルのＡＴＭのＤＮＡ依存的キ
ナーゼ活性に関係することができる。顕著には、ＤＮＡの不存在において、ＤＮ
Ａ−ＰＫおよびＡＴＭ調製物の双方は有意であるが、低いレベルのｐ５３キナー
ゼ活性を表した。しかしながら、これが真正なＤＮＡ独立的リン酸化を反映する
かどうか、あるいはタンパク質調製物中の少量のＤＮＡから生ずるかどうかは現
在未知である。サイクリンＡ／ｃｄｋ２を使用する平行実験は、ＤＮＡ添加のと
き、ｐ５３のリン酸化の増加を示さず（図４Ａ）、そして我々が試験した種々の
他のタンパク質キナーゼはＤＮＡにより刺激されない。したがって、これらの結
果はタンパク質のリン酸化の増加はｐ５３キナーゼアッセイへのＤＮＡの添加の
一般的効果ではないことを示し、そしてＡＴＭはＤＮＡにより刺激されるその能
力において高度に異常であることを明らかにする。
【０１５１】 ＡＴＭは種々の型の線状ＤＮＡ分子に結合することを我々は確立した（図１参
照）。我々の結合競合アッセイにおいて、ＡＴＭはまたスーパーコイルのＤＮＡ
およびニックＤＮＡと相互作用することが示された（データは示されていない）
。ＡＴＭ関連キナーゼ活性が種々のＤＮＡ構造物により示差的に影響を受けるか
どうかを試験した。ＤＮＡの不存在において、あるいは増加する量のスーパーコ
イルのプラスミドＤＮＡまたは制限酵素で線状化されたプラスミドＤＮＡの存在
において、ｐ５３キナーゼアッセイを実施した。
【０１５２】 顕著には、ＡＴＭはスーパーコイルのＤＮＡまたは線状ＤＮＡにより活性化さ
れ（図４Ｂ）、そして追加の研究において、ニックプラスミドＤＮＡ分子を使用
して、また、すぐれた活性化が起こることが明らかにされた（データは示されて
いない）。対照的に、ＤＮＡ−ＰＫは線状プラスミドＤＮＡにより強く刺激され
るが、スーパーコイルのプラスミドＤＮＡにより弱く刺激されるだけである（図
４Ｂ；前の研究に基づいて、後者による弱い活性化は多分スーパーコイルのプラ
スミド調製物中の少量のニックおよび／または線状ＤＮＡを反映する）。したが
って、これらの結果は、ＡＴＭが多数の異なる型のＤＮＡ構造物と相互作用する
ことができることを示すデータと一致する。さらに、ＡＴＭはその関連キナーゼ
活性がＤＮＡにより刺激されることにおいてＤＮＡ−ＰＫに類似するが、２つの
酵素のＤＮＡコファクターの要件は異なることが示される。
【０１５３】 ＡＴＭ関連キナーゼ活性はｐ５３を２つの部位においてリン酸化する ＡＴＭによりリン酸化されるｐ５３の部位を決定するために、細菌的に発現さ
れたｐ５３をＤＮＡの存在または不存在においてＡＴＭで放射能リン酸化した。
標識化ｐ５３を電気泳動により精製し、トリプシンで消化し、生ずる生成物を逆
相ＨＰＬＣにより分離した。生ずる放射能プロフィルを解析すると、１１〜１２
％のアセトニトリルにおいて溶離される主要なピークが示された。新規な組の放
射性ｐ５３はＨＰＬＣポリペプチドのピークを誘導し、２８〜２９％のアセトニ
トリルにおける溶出物はＤＮＡの存在において実質的に誘導された。
【０１５４】 ホスホアミノ酸分析は、ＤＮＡが誘導したピークがセリンおよびスレオニンの
双方の残基において標識化されたペプチドを含有することを明らかにし、２つの
独特に標識化された共溶出するペプチド、または単一のペプチドがホスホセリン
残基およびホスホスレオニン残基を含有することを示唆する（データは示されて
いない）。ＤＮＡ−ＰＫ（図５Ｂ）またはカゼインキナーゼＩ（データは示され
ていない）によるｐ５３のリン酸化後、同様な溶出特性を有する放射性ピークが
同定された。前の研究において、ＤＮＡ−ＰＫおよびカゼインキナーゼＩの双方
はｐ５３のＮ末端領域をリン酸化することが明らかにされた（Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌ
ｌｅｒ他、１９９２；Ｍｉｌｎｅ他、１９９２）。ｐ５３誘導ピークを配列決定
する初期の試みは、多分それらのピークがアミノ末端をブロックしたために、不
成功に終わった。
【０１５５】 しかしながら、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを使用する切断は各々の配列
決定を可能とした。顕著には、ペプチド２ａのエドマン分解法のサイクル９およ
び１２における計数の解放は、リン酸化部位がｐ５３の残基Ｓｅｒ−１５および
Ｔｈｒ−１８に相当することを明らかにした。以前においてＳｅｒ−１５ｈａは
ＤＮＡ−ＰＫのリン酸化部位であることが証明された（Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ
他、１９９２）。しかしながら、我々のＡＴＭ調製物の中に検出可能なＤＮＡ−
ＰＫは存在しない（上を参照）。
【０１５６】 したがって、新規なＤＮＡ依存的キナーゼ活性はｐ５３のＳｅｒ−１５および
Ｔｈｒ−１８をターゲットとするＡＴＭに関連づけられると我々は結論する。 ＤＮＡ−ＰＫ ＡＴＭはｐ５３をＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８においてリン酸
化する関連キナーゼ活性を有する 我々のＡＴＭ調製物における活性がｐ５３残基Ｔｈｒ１８をリン酸化すること
が見出されたという事実が与えられると、ＤＮＡ−ＰＫもまたこの部位をリン酸
化することができるかどうかを試験することを我々は決定した。この目的で、ｐ
５３を放射能標識化［α32Ｐ］ＡＴＰの存在において精製されたヒトＤＮＡ−Ｐ
Ｋ（酵素のＫｕおよびＤＮＡ−ＰＫcs成分から成る調製物；Ｈａｒｔｌｅｙ他、
１９９５に記載されているように調製した）と線状化プラスミドＤＮＡの不存在
または存在においてインキュベートし、次いで、ＡＴＭ仲介リン酸化事象の分析
について記載したように、ｐ５３をプロテアーゼで処理してホスホペプチドを発
生させ、そしてこれらを逆相ＨＰＬＣにより分析した。
【０１５７】 これらの研究において、ＡＴＭの研究におけるように、約２８〜２９％のアセ
トニトリルにおいて溶出する１組の関係するペプチド（ＡＴＭ誘導ペプチド、２
ａ、ｂ、およびｃと共分画される；図５Ｂおよび図５Ｄを比較せよ）はＤＮＡ−
ＰＫ関連キナーゼ活性によりＤＮＡ誘導可能な方法においてリン酸化されること
が明らかにされた。さらに、これらを分析すると、それらは残基Ｓｅｒ１５およ
びＴｈｒ１８上のリン酸化を含有するｐ５３ペプチドに相当することが明らかに
された（図５Ｂ）。Ｓｅｒ１５またはＴｈｒ１８上でリン酸化されるｐ５３を特
異的に認識する抗体を使用する引き続く研究（抗体の製造の詳細については、下
文参照）において、ＤＮＡ−ＰＫ関連キナーゼ活性はｐ５３のこれらの双方の残
基をリン酸化することが確証された。したがって、期待とは反対に、ＤＮＡ−Ｐ
Ｋ関連キナーゼ活性はｐ５３をＳｅｒ１５と同様にＴｈｒ１８上においてリン酸
化する。
【０１５８】 ＡＴＲはｐ５３をＳｅｒ１５においてリン酸化する関連キナーゼ活性を有する
ＤＮＡ−ＰＫ関連キナーゼ活性およびＡＴＭ関連キナーゼ活性の双方がｐ５３
をＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８上でリン酸化することが与えられると、これらの
残基をターゲッティングする他のキナーゼが存在するかどうかを知ることを我々
は決定した。このアプローチを促進するために、Ｔｈｒ１８上でリン酸化される
ｐ５３を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体を発生させた（これらの抗
体はリン酸化されないｐ５３あるいはＳｅｒ１５上でのみリン酸化されるか、あ
るいはそのほかの残基においてリン酸化されるｐ５３を認識しない）。同様に、
Ｓｅｒ１５上でリン酸化されるｐ５３を特異的に認識するウサギポリクローナル
抗体を発生させた。これらの抗体は次のようにして発生させた。ウサギを特異的
ｐ５３をベースとするホスホペプチド（リン酸化されたＴｈｒ１８またはＳｅｒ
１５を含有する）で免疫化し、次いで固定化されたペプチドを支持するカラムお
よび特異的リン酸化ペプチドを支持するカラム上のクロマトグラフィーにより、
所望の認識特性を有する抗体（特異的リン酸化ペプチドを認識するが、それらの
ペプチドの非リン酸化バージョンを認識しない）を調製した。
【０１５９】 ｐ５３をＳｅｒ１５上でリン酸化することができるヒト細胞抽出物中の活性化
されたキナーゼを評価するために、ＨｅＬａ核抽出物をクロマトグラフィーによ
り分画し（下文参照）、次いで得られる画分を全長のｐ５３タンパク質および非
放射能的に標識化されたＡＴＭと、ＤＮＡの不存在または存在において、インキ
ュベートした。次いで、試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動およ
びウェスタンイムノブロッティングに付すことによって、ｐ５３のリン酸化を評
価した。図１０に示すように、Ｑ−セファローズ上でクロマトグラフィーにかけ
たＨｅＬａ核抽出物の画分において、Ｓｅｒ１５（Ｓ１５）をターゲッティング
することができるキナーゼ活性の２つの主ピーク（「活性１」および「活性２」
と命名する）が検出された。これらの画分をさらに分析すると、双方の活性はＤ
ＮＡにより刺激されることが明らかにされた。さらに、ウェスタンブロッティン
グにおいて、「活性１」を含有する画分はＡＴＭに関係するタンパク質ＡＴＭを
含有するが、「活性２」を含有する画分はＤＮＡ−ＰＫcsを含有することが明ら
かにされた（図１０）。
【０１６０】 さらに、他の実験において、活性１からなるピークと活性２を含むピークとの
間に、第３の弱い、活性ピークを明らかにされ、これはＡＴＭに相当した。活性
ピーク２をさらに精製すると、それはＤＮＡ−ＰＫに相当することが明らかにさ
れた。活性１をさらに分画すると、利用したすべてのクロマトグラフィーの分離
技術下に、ＤＮＡ活性化されたｐ５３のＳｅｒ１５キナーゼ活性はＡＴＲと共溶
出することが明らかにされた。事実、このキナーゼ活性後に、ＡＴＲをほぼ均質
に精製することができた（例えば、図１１；ＡＴＲはその溶離がキナーゼ活性の
溶離と終始一貫して平行であることが見出された、唯一のポリペプチドであった
）。こうして、ＤＮＡ−ＰＫおよびＡＴＭがターゲッティングするｐ５３のＳ１
５に加えて、この残基はＡＴＭに関連するキナーゼ活性によりリン酸化されるこ
とも我々は驚くべきことには発見した。
【０１６１】 Ｍｄｍ２との相互作用に対するｐ５３のリン酸化の効果 ｐ５３のＳｅｒ１５またはＴｈｒ１８上のリン酸化がＭｄｍ−２とのｐ５３の
相互作用に影響を与えるかどうかを試験するために、リン酸化されたｐ５３およ
び非リン酸化ｐ５３から誘導されたペプチドを発生させ、ＥＬＩＳＡ分析により
Ｍｄｍ−２の結合について評価した。使用した４つのペプチドはｐ５３の残基１
１〜２５を含有し（配列ＮＨ２−ＳＧＳＧＥＰＰＬＳＯＥＴＦＳＤＬＷＫＬ−Ｃ
ＯＯＨ；ここで下線が引かれている配列はｐ５３から誘導された配列である）こ
れらは次の通りであった：非リン酸化（１）；ｐ５３残基Ｓｅｒ１５に等しい残
基上でリン酸化された（２）；ｐ５３残基Ｔｈｒ１８に等しい残基上でリン酸化
された（３）；またはｐ５３残基Ｓｅｒ１５およびＴｈｒ１８に等しい、２つの
残基上でリン酸化された（４）。Ｍｄｍ−２誘導体の結合は非リン酸化ペプチド
１で効果的に起こったが、リン酸化されたＴｈｒ１８を含有する、ペプチド３お
よび４の場合において劇的に阻害されることが見出された。対照的に、結合はＳ
ｅｒ１５上のリン酸化により、ほんのわずかに損なわれた（ペプチド２）。した
がって、ｐ５３のＴｈｒ１８上のリン酸化はＭｄｍ−２とのその相互作用に対し
て劇的な効果を有し、そしてこの部位におけるリン酸化はｉｎ ｖｉｖｏにおけ
るｐ５３の応答の調節において主要な役割を演ずるようであると、我々は結論す
る。
【０１６２】 ＡＴＭの追加の精製方法 ＨｅＬａ核抽出物をＮｉ2+−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）に適用した。
ＡＴＭはこのマトリックスに非常に堅固に結合が、Ｎｉ2+−ＩＤＡマトリックス
に非常によくは結合しないことが見出された。 ５ｍｌの核抽出物を下記の緩衝液中のＮｉ2+−ＮＴＡアガロースの１×２．５
ｃｍのカラム上に負荷した（緩衝液Ｄ；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７
．６、１００ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、２０
ｍＭのイミダゾール）。このカラムをよく洗浄した（１０カラム体積）後、緩衝
液Ｄ中の２０ｍＭ〜５００ｍＭの直線勾配を適用した。イミダゾール勾配の終わ
り付近において、事実上純粋なＡＴＭ（８％のポリアクリルアミドゲルの銀染色
分析により判定して）が溶出した。勾配の開始において、これより低い純度のＡ
ＴＭの画分が溶出した。
【０１６３】 これはＡＴＭまたはＡＴＲの精製方法を提供し、この精製方法は単独で使用す
るか、あるいは種々の他のクロマトグラフィーの工程、例えば、既に前述したＤ
ＮＡアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて使用することができる。 論考 ＡＴＭはＤＮＡ分子を支持する固定化粒子上に保持されることを我々は証明し
た。顕著には、ＡＴＭはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ
の双方に結合し、そして種々の無関係のオリゴヌクレオチドを使用する研究はこ
の相互作用が配列依存性でないという指示を提供する。ＡＴＭのこれらおよび他
の生化学的性質を利用することによって、このポリペプチドをＨｅＬａ核抽出物
からほぼ均質に精製する戦略を開発した。我々の最終ＡＴＭ調製物の高い純度お
よびこのような調製物中の抗生物質耐性マーカーがＤＮＡに再結合することがで
きるという事実は、ＡＴＭがＤＮＡと直接的に結合するという指示を提供する。
これは、我々のアッセイ条件下ににＤＮＡと安定に会合するためにＫｕを必要と
する、ＤＮＡ−ＰＫcsを使用する状況と多少異なるが、ＵＶタンパク質−ＤＮＡ
架橋は、ＤＮＡ−ＰＫcs／Ｋｕホロ酵素の関係において、ＤＮＡ−ＰＫcsがＤＮ
Ａと密接に接触することが明らかにされた（ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＪａｃｋｓ
ｏｎ、１９９３）。ＤＮＡ−ＰＫcsおよびＡＴＭは同様なメカニズムによりＤＮ
Ａと相互作用することができる。
【０１６４】 ＡＴＭのＣ末端領域は哺乳動物ＰＩ３−キナーゼの触媒ドメインに対する相同
性を有するので、ＡＴＭはイノシトールリン脂質をリン酸化できると推測された
。しかしながら、種々の条件下にかつ種々の潜在的基質を使用して脂質のリン酸
化アッセイを実施したにもかかわらず、ＡＴＭ関連脂質キナーゼ活性は我々のＡ
ＴＭ調製物において検出されなかった。こうして、これらのデータは、ＡＴＭを
含有する免疫沈降物が検出可能な脂質キナーゼ活性をもたないことを証明する最
近の研究と一致する（Ｊｕｎｇ他、１９９７）。ある種の条件下に、あるいは追
加のコファクターに関連して、ＡＴＭが特定のＰＩ誘導体を修飾する可能性を無
視することはできないが、ＤＮＡ−ＰＫcs（Ｈａｒｔｌｅｙ他、１９９５）およ
びＦＲＡＰ（Ｂｒｏｗｎ他、１９９５）について報告されたように、ＡＴＭは脂
質キナーゼではないと我々は仮に結論する。
【０１６５】 対照的に、我々の精製したＡＴＭ調製物は終始一貫してタンパク質のセリン／
スレオニンキナーゼ活性を有する。 最近（Ｋｅｅｇａｎ他、１９９６）ＡＴＭを含有する免疫沈降物は約３５０ｋ
Ｄａのポリペプチドをリン酸化することを示唆しうるおおざっぱな実験が実施さ
れ、ＡＴＭがそれ自体を修飾できることを示唆した（しかし調製物は、キナーゼ
を含む、すべての種類の不純物を含有するしたであろう）。精製されたＡＴＭ調
製物はある程度のＡＴＭの自己リン酸化を行うことができることを我々は観測し
た。
【０１６６】 さらに、ＡＴＭを種々の他のポリペプチドを修飾する能力について試験した。
顕著には、ＩｋＢはｉｎ ｖｉｖｏの機能的研究（Ｊｕｎｇ他、１９９５）によ
りＡＴＭのターゲットとして関係づけられ、そしてＡＴＭを含有する免疫沈降物
によりリン酸化されると最近報告された（Ｊｕｎｇ他、１９９７）が、我々のア
ッセイ条件下では、ＡＴＭによるＩｋＢの有意なリン酸化は検出されなかった。
別法が存在するが、この不一致についての１つの説明は、研究（Ｊｕｎｇ他、１
９９７）において検出されたＩｋＢのリン酸化が、我々の精製スキームの間にＡ
ＴＭから分離される共免疫沈降因子により仲介されるということである。
【０１６７】 Ａ−Ｔ細胞における欠陥のある調節により、可能なＡＴＭターゲットとして関
係づけられた他のタンパク質はＲＰＡである（ＬｉｕおよびＷｅａｖｅｒ、１９
９３；Ｃｈｅｎｇ他、１９９６）。しかしながら、我々はＡＴＭによるＲＰＡの
有意なリン酸化を検出することができず、ＡＴＭはＲＰＡを間接的に調節するこ
とが示唆された。上とは対照的に、我々はＡＴＭによるＳｐ１およびＫｕの７０
ｋＤａのサブユニットの低いが、検出可能なリン酸化を観測した。これらのリン
酸化事象の意味は不確実であるが、これらの発見はＡＴＭがＳｐ１依存的転写の
調節およびＫｕ／ＤＮＡ−ＰＫcsホロ酵素の活性のコントロールにおいてある役
割を演ずるという、興味ある可能性発生させる。
【０１６８】 しかしながら、これまでに、我々が同定した、ＡＴＭの最も効率よい基質はｐ
５３である。重要なことには、我々が検出したｐ５３キナーゼ活性はＡＴＭと終
始一貫して共精製され、最終のＤＮＡアフィニティー精製工程から溶出し、ＡＴ
Ｍポリペプチドそれ自体と同一のプロフィルを有し、さらに追加のストリンジェ
ント免疫沈降手順によりＡＴＭと共精製される。これらのデータは、ｐ５３キナ
ーゼ活性がＡＴＭポリペプチドの固有性質であるという強い指示を提供する。
【０１６９】 ＤＮＡ鎖の切断およびｄｓからｓｓＤＮＡへの移行によりＤＮＡ−ＰＫの活性
化の顕著に暗示的な方法において、ＡＴＭおよびＡＴＲ関連ｐ５３キナーゼ活性
はＤＮＡコファクターの添加により著しく刺激されることを我々は見出した。こ
のＤＮＡ刺激されたタンパク質キナーゼ活性が、汚染するＤＮＡ−ＰＫにより仲
介されない可能性がある理由がいくつか存在する。第１に、滴定の研究において
、ｐ５３のリン酸化の観測されたレベルを提供するために、ＡＴＭおよびＡＴＲ
調製物のＤＮＡ−ＰＫcsの含量をＡＴＭそれ自体のそれと本質的に同じ大きさに
しなくてはならないであろう。
【０１７０】 明らかなように、これは当てはまらない−銀染色およびウェスタンブロッティ
ングにおいて、残留ＤＮＡ−ＰＫが我々の最も精製されたＡＴＭおよびＡＴＲ調
製物の中に事実存在する場合、それはこの研究において使用された方法により検
出できないレベルで存在することが明らかにされた。第２に、ＡＴＭおよびＡＴ
Ｒ調製物において特異的に観測された基質はＤＮＡ−ＰＫのそれと区別される。
第３に、ＡＴＭおよびＡＴＲ関連キナーゼ活性はスーパーコイルおよび線状のプ
ラスミド分子により同様に刺激されるが、ＤＮＡ−ＰＫは後者によってのみ強く
活性化される。
【０１７１】 ＡＴＭおよびＡＴＲがＤＮＡにより刺激されうる、いくつかの可能な方法が存
在し、そしてこれらの各々は我々が観測した効果に寄与することがある。（作用
のメカニズムは本発明の本質および範囲を限定しない。） １つの可能性は、ＡＴＭおよびＡＴＲによるＤＮＡの結合がタンパク質の触媒
的潜在的能力を直接的に活性化することである。他の可能性は、ＡＴＭおよびＡ
ＴＲおよびそのターゲットＤＮＡ結合性タンパク質が同一ＤＮＡ分子上に共局在
化することが、キナーゼとそのターゲットとの間の相互作用を増強する働きをす
ることである。前述のモデルの一方または双方と一直線に、ｐ５３を使用すると
き観測されるよりも低い程度であるが、ＡＴＭの自己リン酸化もまたＤＮＡによ
り増強されることを我々は観測した。
【０１７２】 あるいは、ＤＮＡを添加したときのｐ５３リン酸化の劇的刺激の少なくとも一
部分は、ＤＮＡへのｐ５３の結合がｐ５３のコンフォメーションの変化を誘導し
、これによりｐ５３をＡＴＭまたはＡＴＲのためのいっそう有効な基質とするこ
とによって、説明することができるであろう。こうして、Ｓｅｒ−１５およびＴ
ｈｒ−１８は、ｐ５３がＤＮＡに結合した後、はじめてＡＴＭにアクセス可能と
なるであろう。このようなモデルに従い、ｐ５３のコンフォメーションはＤＮＡ
への結合のときに変化することが知られており（Ｈａｌａｚｏｎｅｔｉｓ他、１
９９３）、そして配列特異的ＤＮＡの結合を欠如する、いくつかの天然に存在す
るｐ５３の突然変異体がＳｅｒ−１５におけるリン酸化の減少を示すことが観察
された（Ｕｌｌｒｉｃｈ他、１９９３）。
【０１７３】 ＤＮＡ−ＰＫのパラダイムが与えられると、ＤＮＡ損傷のシグナリングにおけ
るＡＴＭの前に記載された役割のために、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＴＭまたは
ＡＴＲタンパク質キナーゼ活性は、ＩＲに応答して起こる特異的型のＤＮＡ損傷
または立ち往生した（ｓｔａｌｌｅｄ）ＤＮＡ複製分岐点（ｆｏｒｋ）により誘
発されると推測することができるであろう。しかしながら、ＤＮＡ二本鎖ヘリッ
クスの中に混乱を支持するＤＮＡ分子によってのみ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて
強く活性化されるＤＮＡ−ＰＫと異なり、ＡＴＭは我々が試験した、すべての型
のＤＮＡ構造物と相互作用することを我々は見出した。したがって、ＡＴＭが哺
乳動物細胞において構成的に活性であることができる。我々が現在好む別のモデ
ルは、ＡＴＭおよびＡＴＲがＫｕと相互作用する同様なＤＮＡ−ＰＫcsよりむし
ろ他のポリペプチドと会合するモデルであり、そして正常の環境下にＡＴＭまた
はＡＴＲ活性を制限し、ＤＮＡ損傷因子への暴露後にそれらの活性化をはじめて
可能とするのは、これらの追加の成分の機能である。これに関して、酵母の遺伝
的データが、ＡＴＭまたはＡＴＲのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）の相同体
が、ＤＮＡ損傷のシグナリングにおいて、他のポリペプチドと共同して機能する
ことを示すこと、および生化学的研究において、ＡＴＭが粗製の細胞抽出物の中
に約２ＭＤａの大きい複合体として存在することが明らかにされた（ＧＣＭＳ、
未発表のデータ）ことに注目してみることは興味深いことである。
【０１７４】 ＡＴＭがＩＲ誘導ＤＮＡ損傷をシグナリングする経路においてｐ５３の上流で
機能することを示す遺伝的データと一緒に、我々の発見は、ゲノムの障害後、Ａ
ＴＭおよびＡＴＲはｐ５３直接的にリン酸化するという指示を提供する。このよ
うなモデルはＡ−Ｔ細胞におけるＩＲに応答するｐ５３のアップレギュレーショ
ンの欠如の説明を促進し、引き続いて、これはＡ−Ｔ細胞における細胞周期のチ
ェックポイントのコントロールの欠陥の少なくともいくつかを説明するであろう
。興味深いことには、最近の研究において、ＡＴＭは直接的にｐ５３と相互作用
することが示され（Ｗａｔｔｅｒｓ他、１９９７）細胞の関係においてＡＴＭ仲
介ｐ５３リン酸化の効率を最適化するメカニズムを提供する。事実、ｐ５３それ
自体はＤＮＡ鎖の切断部およびＤＮＡ挿入ループに結合する（Ｂａｌｋａｌｋｉ
ｎ他、１９９４；Ｌｅｅ他、１９９５；Ｒｅｅｄ他、１９９５）ので、ｐ５３は
ＤＮＡ損傷部位にＡＴＭまたはＡＴＲをターゲッティングすることにおいて実際
ある役割を演ずることができるであろう。
【０１７５】 Ｓｅｒ−１５およびＴｈｒ−１８がｐ５３ポリペプチドの保存されかつ機能的
重要な領域に存在するとき、このようなモデルは特に魅力的である。そのうえ、
ｐ５３のＳｅｒ−１５はｉｎ ｖｉｖｏにおいてリン酸化されることが示された
（ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＬｅｅ−Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２；Ｓｅｅｇｅｎｇａ
他、１９９６、において概観されている）。さらに、Ｔｈｒ−１８はｐ５３の修
飾のためのリン酸化部位としてまだ同定されてきていないが、この残基はｐ５３
において高度に保存されること、およびｉｎ ｖｉｖｏにおいて約８％のｐ５３
のリン酸化がＴｈｒ残基において起こることことは注目に値する（Ｓａｍａｄ他
、１９８６）。これらの点に照らして、野生型細胞およびＡ−Ｔ細胞におけるｐ
５３のＳｅｒ−１５およびＴｈｒ−１８のリン酸化状態を分析し、そしてＩＲに
応答するリン酸化の程度を測定することは明らかに極めて重要であろう。
【０１７６】 興味深いことには、ｐ５３の安定性および転写活性化の可能性双方を実現する
ために、ｐ５３のＮ末端領域のリン酸化が提案された（ＫｏおよびＰｒｉｖｅｓ
、１９９６；Ｓｔｅｅｇｅｎｇａ他、１９９６、において概観されている）。事
実、Ｓｅｒ−１５の突然変異はＳ相の進行を防止するｐ５３の能力を損ない、そ
してｐ５３の安定性に影響を与える（Ｆｉｓｃｅｌｌａ他、１９９３）。さらに
、転写を活性化することができないｐ５３突然変異体はこの部位におけるリン酸
化を減少させる（Ｕｌｌｒｉｃｈ他、１９９３）。ｐ５３の機能におけるＴｈｒ
−１８の役割を直接的に研究する実験は実施されなかったが、ｐ５３の機能の負
のレギュレーターとして機能するＭｄｍ２のための、最小のｐ５３結合部位の一
部分をＴｈｒ−１８が形成することは注目に値する（Ｏｌｉｎｅｒ他、１９９３
）。
【０１７７】 意味あることには、Ｍｄｍ−２の結合はｐ５３依存的転写の活性化の抑制およ
び細胞内の分解のためのｐ５３のターゲッティングの双方に関係づけられた（Ｍ
ｏｍａｎｄ他、１９９２；Ｏｌｉｎｅｒ他、１９９３；Ｋｕｂｂｕｔａｔ他、１
９９７）。したがって、魅力的な別のシナリオは、ＡＴＭまたはＡＴＲによるｐ
５３のリン酸化がＭｄｍ２の相互作用を阻害することができ、こうしてｐ５３を
安定化しかつその転写活性を脱抑制するということである。これと一致して、Ｍ
ｄｍ２へのｐ５３誘導ペプチドの結合はＴｈｒ１８のリン酸化により強く阻害さ
れることを我々は見出した。
【０１７８】 前述のＡＴＭおよびｐ５３の作用のメカニズムおよび機能のモデルは、本発明
の本質および範囲を限定しないで、提示されたことが強調される。 実験および手順 ＤＮＡの相互作用の研究 オリゴヌクレオチド： ５’ビオチン基を含有する１つのＤＮＡ鎖（下に「Ｂ
」で示す）を１以上の相補的オリゴヌクレオチドとアニールし、ストレプトアビ
ジンコーテッド酸化鉄粒子に結合させた（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ；Ｄｙｎａｌ、ノ
ールウェイ国オスロ）。ＨｅＬａ核抽出物、またはＡＴＭ濃縮抽出物（Ｑ−セフ
ァローズ；下文参照）を氷上で３０分間ＤＮＡ−酸化鉄粒子とインキュベートし
た。５０ｍＭのＫＣｌを含有するＤ* 緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、
ｐＨ７．６、２０％のグリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．２ｍＭのＥＤＴ
Ａ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウム
）の５×０．５ｍｌで洗浄した後、５００ｍＭのＫＣｌ Ｄ* 緩衝液または段階
的方法において緩衝液Ｄ* 中の１００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭのＫＣ
ｌ濃度でタンパク質を溶離した。ＡＴＭのアミノ酸残基１９８０〜２３３７に対
して発生させた前述のウサギポリクローナル抗血清を使用するウェスタンブロッ
ティングにより、画分をＡＴＭタンパク質含量について分析した（Ｌａｋｉｎ他
、１９９６）。
【０１７９】
【化１】
【０１８０】 下記について、ビオチン化された１００マーのオリゴヌクレオチド（ＤＹＮＯ
）を「バックボーン」として使用し、これに他のオリゴヌクレオチドをアニール
した。
【０１８１】
【化２】
【０１８２】 ニックオリゴＤＹＮＯ＋ＤＡＭ２＋ＤＡＭ３：ｄｓ／ｓｓ移行，ＤＹＮＯ＋Ｄ
ＡＭ３；ギャップｄｓオリゴ、ＤＹＮＯ＋ＤＡＭ３＋ＤＡＭ５；１０ｂｐの挿入
、ＤＹＮＯ＋ＤＡＭ６。
【０１８３】
【化３】
【０１８４】 ＡＴＭの精製 すべての工程を４℃において実施した。５０ｍＭのＫＣｌを含有するＤ* 緩衝
液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、２０％のグリセロール、２ｍ
ＭのＭｇＣｌ2 、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳ
Ｆ、１ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウム）中で平衡化したＱ−セファローズカラム
（３５ｍｌ、１．５×２０ｃｍ）にＨｅＬａ核抽出物（２０ｍｌ）を適用した。
２カラム体積の５０ｍＭのＤ* で洗浄した後、タンパク質をＤ* 緩衝液中の５０
ｍＭ〜５００ｍＭのＫＣｌの連続的勾配で溶離した。ＡＴＭは１６０〜２００ｍ
ＭのＫＣｌにおいて溶出した。ＡＴＭを含有しかつＤＮＡ−ＰＫを欠く画分（ウ
ェスタンブロットアッセイで判定する）をプールし、Ｄ* 緩衝液中で１００ｍＭ
のＫＣｌに希釈した後、１００ｍＭのＫＣｌ Ｄ* 緩衝液中で前平衡化したヘパ
リンアガロースカラム（１．５×６ｃｍ）上に負荷した。
【０１８５】 このカラムを２カラム体積の１００ｍＭのＫＣｌ Ｄ* 緩衝液で洗浄した後、
Ｄ* 緩衝液中の５０ｍＭ〜５００ｍＭのＫＣｌの連続的勾配で溶離した。ＡＴＭ
を再びウェスタンブロットアッセイで追跡し、そしてＡＴＭは２００〜２２０ｍ
ＭのＫＣｌにおいて溶出した。ピークの画分をプールし、５０ｍＭの緩衝液Ｄ* に対して透析した。次いでピークのＡＴＭ画分をおだやかに混合しながら１時間
ストレプトアビジン酸化鉄粒子に結合された２００μｇのビオチン化された５０
ｂｐのｄｓＤＮＡとインキュベートした。非結合タンパク質を新鮮なＤＮＡ−酸
化鉄粒子に再結合させた。粒子を磁石により収集し、５×０．５ｍｌの５０ｍＭ
のＫＣｌ Ｄ* 緩衝液で洗浄した後、ＡＴＭを２×７５μｌの５００ｍＭのＫＣ
ｌ緩衝液Ｄ* で溶離した。精製されたＡＴＭをスナップ凍結し、−７０℃におい
て貯蔵した。
【０１８６】 ＡＴＲの精製 ＡＴＲの精製を本明細書において記載するように実施した。 免疫学的方法 ウェスタンイムノブロット分析を以前に記載されているように実施した（Ｌａ
ｋｉｎ他、１９９６）。Ｓｐ１抗血清をセロテク・リミテッド（Ｓｅｒｏｔｅｃ
Ｌｔｄ．）（英国オックスフォード）から購入した。ＲＰＡ−ｐ７０およびＲ
ＮＡポリメラーゼＩＩ抗血清をまた利用した。本明細書において記載するように
、ホスホ特異的抗血清を発生させた。
【０１８７】 ビオチン化または未処理の精製されたＡＴＭを平行に血清と１時間氷上で５０
ｍＭのＫＣｌを含有するＤ* 緩衝液中でインキュベートすることによって、免疫
沈降を実施した。プロテインＡセファローズを添加し、反応物をゆっくり回転し
ながらさらに１時間４℃においてインキュベートした。高いストリンジェンシイ
において５００μｌの５００ｍＭのＫＣｌおよび０．１％のＮＰ−４０を含有す
るＤ* 緩衝液中で、ビーズを７回洗浄した。ビオチン化免疫沈降タンパク質を７
％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化し、次いでウェスタンブロッティングし、ストレ
プトアビジン結合セイヨウワサビペルオキシダーゼでプロービングした。非ビオ
チン化免疫沈降タンパク質をさらに５００μｌの１×Ｚ’緩衝液中で２回洗浄し
た後、キナーゼ反応に添加した（下文参照）。
【０１８８】 リン酸化のアッセイ 下記の成分を含有する２０μｌ中のキナーゼ反応を実施した：１０μｌのＺ’
緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、５０ｍＭのＫＣｌ、１０
ｍＭのＭｇＣｌ2 、２０％のグリセロール、０．１％のＮＰ−４０、１ｍＭのＤ
ＴＴ）；１１ｆｍｏｌのＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫまたはサイクリンＡ／ｃｄｋ２；
５０〜１００ｎｇの基質および０〜３０ｆｍｏｌのＤＮＡ。反応物を組合わせ、
３分間氷上でインキュベートし、次いで１０μＣｉ［［γ−32Ｐ］ＡＴＰを添加
し、３０℃において１５分間インキュベートした。リン酸化されたタンパク質を
７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１８９】 ｐ５３リン酸化部位のマッピング 組換えｐ５３（１０〜２０ｐｍｏｌ；前のように精製された（Ｈｕｐｐ他、１
９９２））を１２〜２４ｎｇの精製されたＡＴＭまたはＤＮＡ−ＰＫと、１０6 〜１０7 ｃｐｍ／ｎｍｏｌの［32Ｐ］−γＡＴＰを含有する１００μＭのＡＴＰ
の存在において、前述の条件下にインキュベートした。線状化（ｐＧ13−ＣＡＴ
）またはスーパーコイル（ｐＢＳ−ＳＫ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）ＤＮ
Ａを、それぞれ、ＤＮＡ−ＰＫおよびＡＴＭの反応において含めた（示す場合）
。３０℃において３０分後、氷水浴に移すことによって、反応を停止させた。Ｔ
ＣＡ沈降後、標識化されたｐ５３を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、オ
ートラジオグラフィーにより可視化した。記載されているように、標識化ｐ５３
を含有するゲルの区画を切除し、タンパク質を溶離し、ＴＣＡ沈降させた（Ａｌ
ｅｓｓｉ他、１９９６）。
【０１９０】 洗浄したＴＣＡペレットをアルキル化トリプシンで直接的に消化する（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ、英国サウサンプトン）か、あるいはＡｓｐ−Ｎ消化については、まず
０．２％ｖ／ｖのトリトン−Ｘ１００中で可溶化し、１：５ｗ：ｗのＡｓｐ−Ｎ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で一夜消化し、示す場合、トリプ
シンで一夜消化した。消化されたタンパク質を含有する上清を０．１％ｖ／ｖの
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と平衡化したＶｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４ Ｃ１８
カラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ、カリフォルニア州ヘスペリア）上
のクロマトグラフィーにかけ、直線のアセトニトリル勾配で溶離した。流速は０
．８ｍｌ／分であり、０．４ｍｌの画分を収集した。ピークの画分をセクエロン
（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）アクリルアミド膜に共有結合させ、記載されたプログラム
（Ｓｔｏｋｏｅ他、１９９２）を使用してアプライド・バイオシステムス（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７０Ａ配列決定装置で分析して、放射能
の解放に対応するエドマン分解サイクル数を決定した。
【０１９１】 ＡＴＭの追加の精製 ＮＴＡを使用する精製は前述した通りであった。 参考文献 これらの参考文献および本明細書において記載するすべての他の参考文献は、
引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１９２】 Ａｌｅｓｓｉ他、（１９９６）、ＥＭＢＯ Ｊ．１５、６５４１−６５５１。 Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、（１９９２）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、２、２８３
−３１４。 Ａｒｔｕｓｏ他、（１９９５）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１、１４２７−１４３
５。
【０１９３】 Ｂａｌｋａｌｋｉｎ他、（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１、４１３−４１７。 Ｂａｒｌｏｗ他、（１９９６）、Ｃｅｌｌ ８６、１５９−１７１。 Ｂｅａｍｉｓｈ他、（１９９４）、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１３８、Ｓ１３０
−１３３。
【０１９４】 Ｂｅａｍｉｓｈ、Ｈ．およびＬａｖｉｎ、Ｍ．Ｆ．（１９９４）、Ｉｎｔ．Ｊ
．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．６５、１７５−１８４。 Ｂｒｏｗｎ他、（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ ３７７、４４１−４４６。 Ｂｒｏｗｎ、Ｅ．Ｊ．およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓ．Ｌ．（１９９６）、Ｃ
ｅｌｌ ８６、５１７−５２０。
【０１９５】 Ｂｒｏｗｎ他、（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９４、１８４０−１８４５。 Ｃａｒｒ、Ａ．Ｍ．（１９９７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７、９３−９８。 Ｃｈｅｎ他、（１９９３）、Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３
（７）４１０７−４１４４。
【０１９６】 Ｃｈｅｎ、ＧおよびＬｅｅ、Ｅ．Ｙ．−Ｈ Ｐ．（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７１、３３６９３−３３６９７。 Ｃｈｅｎｇ他、（１９９６）、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．３９、４３
−５２。 Ｃｉｍｐｒｉｃｈ他、（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９３、２８５０−２８５５。
【０１９７】 Ｄｕｔｔａ他、（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ ７９−８２。 Ｅａｓｔｏｎ、Ｄ．Ｆ．（１９９４）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６、Ｓ１７７−Ｓ１
８２。 Ｅｌｌｅｄｇｅ、Ｓ．Ｊ．（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、１６６４
−１６７２。
【０１９８】 Ｆｉｓｃｅｌｌａ他、（１９９３）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８、１５１９−１５
２８。 Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ他、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１５、３０７−３１０。 Ｇｏｆｆｅａｕ他、（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、５４６。
【０１９９】 Ｇｏｔｔｌｅｉｂ、Ｔ．Ｍ．およびＪａｃｋｓｏｎ、Ｓ．Ｐ．（１９９３）、
Ｃｅｌｌ ７２、１３１−１４２。 Ｇｕ他、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３８７、９１９−８２２。 Ｈａｒｔｌｅｙ他、（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８２、８４９−８５６。 Ｈａｕｐｔ他、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３８７、２９６−２９９。
【０２００】 Ｈｕｎｔｅｒ、Ｔ．（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８３、１−４。 Ｈｕｐｐ他、（１９９２）、Ｃｅｌｌ ７１、８７５−８８６。 Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｓ．Ｐ．（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ
５、１２１０−１２１２。 Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｓ．Ｐ．（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ２
８；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ、２６１−
２７９。
【０２０１】 Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｓ．Ｐ．（１９９６）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６、１６−２５。 Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｓ．Ｐ．およびＪｅｐｐｏ、Ｐ．Ａ．（１９９５）、Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０、４１２−４１５。 Ｊｕｎｇ他、（１９９７）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７、２４−２７。
【０２０２】 Ｊｕｎｇ他、（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８、１６１９−１６２１。 Ｋａｏ他、（１９９０）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９、８０６−８１４。 Ｋａｐｅｌｌｅｒ、Ｒ．およびＣａｎｔｌｅｙ、Ｌ．Ｃ．（１９９４）、Ｂｉ
ｏｅｓｓａｙｓ １６、５６５−５７６。 Ｋａｓｔａｎ他、（１９９２）、Ｃｅｌｌ ７１、５８７−５７９。
【０２０３】 Ｋｅｅｇａｎ他、（１９９６）、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１０、２４２３−
２４３７。 Ｋｅｉｔｈ、Ｃ．Ｔ．およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓ．Ｌ．（１９９５）、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２７０、５０−５１。 Ｋｈａｎｎａ、Ｋ．およびＬａｖｉｎ、Ｍ．Ｆ．（１９９３）、Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ ８、３３０７−３３１２。
【０２０４】 Ｋｈａｎｎａ他、（１９９５）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１、６０９−６１８。 Ｋｏ、Ｌ．Ｊ．およびＰｒｉｖｅｓ、Ｃ．（１９９６）、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄ
ｅｖ．１０、１０５４−１０７２。 Ｋｕｂｂｕｔａｔ他、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３８７、２９９−３０３
。
【０２０５】 Ｋｕｓｓｉ他、（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、９４８−９５３。 Ｌａｋｉｎ他、（１９９６）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３、２７０７−２７１６
。 Ｌｅｅ他、（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８１、１０１３−１０２０。 Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ他、（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
２、５０４１−５０４９。
【０２０６】 ＬｉおよびＢｏｔｃｈａｎ、（１９９３）、Ｃｅｌｌ ７３、１２０７−１２
２１。 Ｌｉｅｂｅｒ他、（１９９７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７、９９−１０４。 Ｌｉｌｌ他、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３８７、８２３−８２７。
【０２０７】 Ｌｉｎ他、（１９９４）、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８、１
２３５−１２４６。 Ｌｉｕ、Ｖ．Ｆ．およびＷｅａｖｅｒ、Ｄ．Ｔ．（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、７２２２−７２３１。 Ｌｕ、Ｘ．およびＬａｎｅ、Ｄ．Ｐ．（１９９３）、Ｃｅｌｌ ７５、７６５
−７７８。
【０２０８】 Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ他、（１９９３）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０、５１００
−５１０４。 Ｍａｒｔｉｎ他、（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１８）、
１３０６２−１３０６７。 Ｍｅｉｊｅｒ（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６、３９３
−３９７。
【０２０９】 Ｍｅｙｎ、Ｍ．Ｓ．（１９９５）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５、５９９１−
６００１。 Ｍｉｌｎｅ他、（１９９２）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７、１３６１−１３６９。 Ｍｏｍａｎｄ他、（１９９２）、Ｃｅｌｌ ６９、１２３７−１２４５。 Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ他、（１９９５）、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．１４（２４）、
６１８４−６１９２。
【０２１０】 Ｏｋａｄａ他、（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、３５６３−
３５６７。 Ｏｌｉｎｅｒ他、（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ ３６２、８５７−８６０。 Ｐｉｃｋｓｌｅｙ他、（１９９４）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９、２５２３−２５
２９。
【０２１１】 Ｐｏｌｔｏｒａｔｓｋｙ他、（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５、４
５２９−４５３３。 Ｒｅｅｄ他、（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２、９４５５−９４５９。 Ｓａｍａｄ他、（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３、８９７−９０１。
【０２１２】 Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、（１９９５ａ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８、１７４９−
１７５３。 Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、（１９９５ｂ）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４、２
０２５−２０２３。 Ｓｅｔｏ他、（１９９２）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９、１２０２８−１２０３
２。
【０２１３】 Ｓｈｉｌｏｈ、Ｙ．（１９９５）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３、１
１６−１３８。 Ｓｏｕｓｓｉ他、（１９９０）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５、９４５−９５２。 Ｓｔｅｅｇｅｎｇａ他、（１９９６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３、１０
３−１１３。
【０２１４】 Ｓｔｏｋｏｅ他、（１９９２）、ＥＭＢＯ Ｊ．１１、３９８５−３９９４。 Ｔｈｕｔ他、（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７（５１９４）、１００−
１０４。 Ｔｒｕａｎｔ他、（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（４）、２
２８４。
【０２１５】 Ｕｌｌｒｉｃｈ他、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９０、５９５４−５９５８。 Ｖｌａｈｏｓ他、（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、５２４１
−５２４８。 Ｗａｎｇ他、（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０、１８８
−１９５。
【０２１６】 Ｗａｎｇ、Ｙ．およびＰｒｉｖｅｓ、Ｃ．（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ ３７
６、８８−９１。 Ｗａｔｔｅｒｓ他、（１９９７）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４、１９１１−１９
２１。 Ｘｉａｏ他、（１９９４）、Ｍｏｌｅｃ．＆ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４（１
０）、７０１３−７０２４。
【０２１７】 Ｘｕ、Ｙ．およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ．（１９９６）、Ｇｅｎｅｓ ＆
Ｄｅｖ．１０、２４０１−２４１０。 Ｚａｋｉａｎ、Ｖ．Ａ．（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８２、６８５−６８７。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＡＴＭはＤＮＡに結合する。（Ａ）ＡＴＭはｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドに
結合する。ＨｅＬａ核抽出物は、ストレプトアビジン鉄酸化物ビーズ（−ＤＮＡ
）または５０マーのｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを有するストレプトアビジン
鉄酸化物ビーズ（＋ＤＮＡ）に結合した。広範な洗浄後、ＡＴＭは５００ｍＭの
ＫＣｌの中にＤＮＡから溶離された。溶離されたタンパク質は７％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ、そしてＡＴＭ．Ｂ抗血清を使用するウェスタンブロッティングによ
りＡＴＭを可視化した。（Ｂ）ＡＴＭの結合はＤＮＡの長さに依存する。ＡＴＭ
に富んだ抽出物は、種々のサイズ（１５、２５、５０または７５ｂｐ）のｄｓＤ
ＮＡに取付けたストレプトアビジン鉄酸化物ビーズに結合した。広範な洗浄後、
ＡＴＭは１００、２５０および５００ｍＭのＫＣｌの順次の洗浄により溶離され
た。溶出物を（Ａ）におけるように分析した。（Ｃ）ＡＴＭは種々の異なる構築
物を含有するＤＮＡに結合する。ＡＴＭに富んだ抽出物は、ニック、ｄｓ／ｓｓ
移行、ギャップまたは１０ｂｐの挿入を含有するｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの
いずれかに結合したストレプトアビジン鉄酸化物ビーズに結合した。洗浄、溶離
およびＡＴＭの検出は（Ｂ）におけるように実施した。
【図２】 ＨｅＬａ細胞核抽出物からのＡＴＭの精製。（Ａ）ＡＴＭ精製戦略。ＨｅＬａ
核抽出物をＱ−セファローズを使用するイオン交換クロマトグラフィーにかけ、
１６０〜２００ｍＭのＫＣｌの間で溶離する画分をヘパリン−アガロースイオン
交換樹脂上に通した。２００〜２２０ｍＭのＫＣｌの間でヘパリン−アガロース
から溶離されるＡＴＭ画分をプールし、ＤＮＡアフィニティー精製にかけ、ＤＮ
Ａを有するビーズから５００ｍＭのＫＣｌにおいて溶離して、ＡＴＭの均質な調
製物を得た。（Ｂ）本質的に均質までのＡＴＭの精製。同等の体積（５μｌ）の
ＨｅＬａ細胞核抽出物（５０μｇのタンパク質）、またはＱ−セファローズ、ヘ
パリン−アガロースまたはＤＮＡアフィニティークロマトグラフィー後にプール
した画分を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色によりタンパク質を可視化した
（上のパネル）。画分を、また、示すように、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫcs、Ｋｕ７
０＋Ｋｕ８０またはＲＰＡの７０ｋＤａのサブユニットに対して発生させた抗体
を使用するウェスタンブロット分析に付した。
【図３】 精製されたＡＴＭは関連ｐ５３キナーゼ活性を有する。（Ａ）推定上のＡＴＭ
基質の分析。ＤＮＡ−ＰＫcs（６０ｎｇ）、Ｋｕ（１００ｎｇ）、Ｓｐ１（１０
０ｎｇ）、ｐ５３（１００ｎｇ）、ＲＰＡ−ｐ３４（１００ｎｇ）またはＰＣＮ
Ａ（１００ｎｇ）をキナーゼ反応においてほぼ１１ｆｍｏｌｅの精製されたＡＴ
Ｍと組み合わせて使用した（実験手順参照）。タンパク質を７％（左のパネル）
または１０％（右のパネル）のポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてリン
酸化されたタンパク質をオートラジオグラフィーにより検出した。（Ｂ）精製さ
れたＡＴＭ調製物から免疫沈降させた総タンパク質の分析。精製されたＡＴＭを
ビオチン化し、そして前免疫血清、またはＡＴＭのアミノ酸残基１９８０−２３
３７（ＡＴＭ．Ｂ）またはＮ末端（ＡＴＭ．Ｎ）に対して発生させたＡＴＭ抗血
清を使用して免疫沈降させた。沈降したタンパク質を７．８％のポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、ニトロセルロースに移した後、ストレプトアビジン結合セ
イヨウワサビペルオキシダーゼでフィルターをプロービングすることによって、
全体の沈降したタンパク質を検出した。（Ｃ）免疫沈降したＡＴＭはｐ５３キナ
ーゼ活性を有する。前免疫血清、または抗ＡＴＭ抗血清ＡＴＭ．ＢまたはＡＴＭ
．Ｎを使用して、精製されたＡＴＭを免疫沈降させた。免疫沈降後、示すように
、ｐ５３の存在または不存在においてキナーゼ反応を実施した。リン酸化された
タンパク質を１０％のポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフ
ィーにより検出した。
【図４】 ＤＮＡ刺激タンパク質キナーゼ活性をＡＴＭと共精製した。（Ａ）多重ｐ５３
結合部位を含有する線状ＤＮＡにより、ＡＴＭ関連キナーゼ活性を刺激する。示
すように、多重ｐ５３結合部位を有するＤＮＡ（ｐＧ13ＣＡＴ）の不存在（−）
または０．０３、０．３または３ｆｍｏｌｅの存在において、ｐ５３を含有する
キナーゼ反応において、精製されたＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫまたはサイクリンＡ／
ｃｄｋ２（１１ｆｍｏｌｅ）を使用した。タンパク質を１０％のポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、リン酸化されたタンパク質をオートラジオグラフィーによ
り可視化した。（Ｂ）ＡＴＭ関連キナーゼ活性はＤＮＡ末端を必要としない。線
状またはスーパーコイルドｐＧ13ＣＡＴＤＮＡの不存在（−）または０．０３、
０．３または３ｆｍｏｌｅの存在において、ｐ５３と組み合わせて１１ｆｍｏｌ
ｅの精製されたＡＴＭを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ反応を実施した。タ
ンパク質を（Ａ）に示すように検出した。
【図５】 ＡＴＭはＤＮＡの存在下にｐ５３をＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８においてリン
酸化する。ＡＴＭおよびｐ５３を使用するキナーゼ反応をＤＮＡの存在および不
存在において実施した。これらの研究において、ｐ５３のリン酸化はＤＮＡの存
在において増加することが明らかにされた。（Ａ、Ｂ）32Ｐ標識化ｐ５３に対応
するバンドをゲルから切除し、トリプシンで消化し、Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５
４ Ｃ１８カラム上のクロマトグラフィーにかけた（実験手順参照）。精製され
たｐ５３画分はＤＮＡ（ペプチド２ａ、２ｂおよび２ｃ）の存在においてリン酸
化されたが、不存在においてはリン酸化されず、実験手順に記載されているよう
にペプチド配列の分析に付した；エドマン分解の各サイクル後に放射能を測定し
た。32Ｐの組込みを示すｐ５３ペプチドの推定上のアミノ酸配列をパネルＣに示
す。（Ｄ）ＤＮＡの存在におけるＤＮＡ−ＰＫによりリン酸化されたｐ５３のト
リプシンペプチド地図。ＤＮＡ−ＰＫおよびｐ５３を含有するキナーゼ反応を線
状ＤＮＡの存在において実施し、そして32Ｐ標識化ｐ５３を（Ａ、Ｂ）における
ように分析し、再びＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８におけるリン酸化を明らかにす
る。
【図６ａ】 ヒトＡＴＭのアミノ酸配列を示し、キナーゼドメインは下線でマークされてい
る。
【図６ｂ】 ＡＴＭ核酸配列を示し、開始コドンに下線が引かれている。
【図７ａ】 ヒトｐ５３のアミノ酸配列を示し、ＡＴＭによりリン酸化された残基は下線で
マークされている。
【図７ｂ】 ｐ５３核酸配列を示し、開始コドンに下線が引かれている。
【図８ａ】 ヒトＡＴＲ（ＦＲＰ−１）のアミノ酸配列を示す。
【図８ｂ】 ＡＴＲ核酸配列を示し、開始コドンに下線が引かれている。
【図９ａ】 ＤＮＡ−ＰＫcsのアミノ酸配列を示す。
【図９ｂ】 ＤＮＡ−ＰＫ核酸配列を示し、開始コドンに下線が引かれている。
【図１０】 ｐ５３のＳｅｒ１５をリン酸化することができるＨｅＬａ核細胞抽出物中の２
つのＤＮＡ活性化キナーゼ活性の分画を示す。上のパネル：ＨｅＬａ細胞核抽出
物をＱ−セファローズ上で分画したときに発生した画分を、超音波処理した仔ウ
シ胸腺ＤＮＡの存在においてｐ５３およびＡＴＰとインキュベートした反応によ
る、Ｓｅｒ１５上のリン酸化されたｐ５３を特異的に認識する抗体を使用して、
ウェスタンイムノブロットを実施した。中央のパネル：ウェスタンイムノブロッ
ト分析において抗ＤＮＡ−ＰＫcs抗血清を使用することによって、同一組の画分
をＤＮＡ−ＰＫcsについて試験した。下のパネル：ウェスタンイムノブロット分
析において抗ＤＮＡ−ＰＫcs抗血清を使用することによって、同一組の画分をＡ
ＴＲの存在について試験した。追加の研究において、検出された双方の活性はＤ
ＮＡにより刺激されることが明らかにされた。
【図１１】 ＡＴＲと共精製されたＤＮＡ活性化キナーゼ活性（活性１）を示す。活性ピー
ク１をＤＮＡ−セルロース上でさらに分画し、次いでヘパリン−アガロース上の
クロマトグラフィーにかけた。下のパネル：最後の組の画分を、ｐ５３、ＡＴＰ
およびＤＮＡとのインキュベーション、次いでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動およびｐ５３のＳｅｒ１５特異的抗体を使用するウェスタンイムノブ
ロッティングによる分析により、ｐ５３キナーゼ活性について試験した。上のパ
ネル：同一組の画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの銀染色物をｐ５３キナ
ーゼ活性について試験した。ＡＴＭは矢印で示されている。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月３１日（２０００．８．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】 ＡＴＭタンパク質の完全なアミノ酸配列は解明され、そしてＳａｖｉｔｓｋｙ
他、１９９５ａ、１９９５ｂおよび図６ａ（配列番号：１）に記載されており、
それらのうちのアミノ酸残基のナンバリングが使用されている。キナーゼドメイ
ンは図６ａにおいてマークされている。ｐ５３のアミノ酸配列は図７ａ（配列番
号：３）に示されており、それらのうちのアミノ酸残基のナンバリングが使用さ
れている。これらの配列はヒト配列である。ＡＴＭおよびｐ５３は脊椎動物、特
に哺乳動物の間で保存されている−例えば、Ｓｏｕｓｓｉ他の図２を参照のこと
。ＡＴＭによりリン酸化されることが本明細書において示されている残基の領域
におけるｐ５３の保存について−したがって、本発明は、その面の任意のものに
おいて、他の脊椎動物、特に哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、サル、齧歯類
、例えば、マウスまたはラット、ブタ、ウマ、雌牛、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ
、およびその他の、ｐ５３および／またはＡＴＭの使用に拡張される。ＡＴＲ（
また、ＦＲＰ１として知られている）のアミノ酸配列および核酸配列は、Ｃｉｍ
ｐｉｃｈ他、１９９６に記載されている。アミノ酸配列は図８ａ（配列番号：５
）として再現されている。ＤＮＡ−ＰＫのアミノ酸配列はＨａｒｔｌｅｙ他、１
９９５において提供されており、そして図９ａ（配列番号：７）に記載されてい
る。これらのタンパク質の核酸配列は、図６ｂ（配列番号：２）、図７ｂ（配列
番号：４）、図８ｂ（配列番号：６）および図９ｂ（配列番号：８）としても含
まれている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１６１】 Ｍｄｍ２との相互作用に対するｐ５３のリン酸化の効果 ｐ５３のＳｅｒ１５またはＴｈｒ１８上のリン酸化がＭｄｍ−２とのｐ５３の
相互作用に影響を与えるかどうかを試験するために、リン酸化されたｐ５３およ
び非リン酸化ｐ５３から誘導されたペプチドを発生させ、ＥＬＩＳＡ分析により
Ｍｄｍ−２の結合について評価した。使用した４つのペプチドはｐ５３の残基１
１〜２５を含有し（配列ＮＨ２−ＳＧＳＧＥＰＰＬＳＯＥＴＦＳＤＬＷＫＬ−Ｃ
ＯＯＨ（配列番号：１１）；ここで下線が引かれている配列はｐ５３から誘導さ
れた配列である）これらは次の通りであった：非リン酸化（１）；ｐ５３残基Ｓ
ｅｒ１５に等しい残基上でリン酸化された（２）；ｐ５３残基Ｔｈｒ１８に等し
い残基上でリン酸化された（３）；またはｐ５３残基Ｓｅｒ１５およびＴｈｒ１
８に等しい、２つの残基上でリン酸化された（４）。Ｍｄｍ−２誘導体の結合は
非リン酸化ペプチド１で効果的に起こったが、リン酸化されたＴｈｒ１８を含有
する、ペプチド３および４の場合において劇的に阻害されることが見出された。
対照的に、結合はＳｅｒ１５上のリン酸化により、ほんのわずかに損なわれた（
ペプチド２）。したがって、ｐ５３のＴｈｒ１８上のリン酸化はＭｄｍ−２との
その相互作用に対して劇的な効果を有し、そしてこの部位におけるリン酸化はｉ
ｎ ｖｉｖｏにおけるｐ５３の応答の調節において主要な役割を演ずるようであ
ると、我々は結論する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７９】
【化１】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８１】
【化２】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８３】
【化３】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１７】 Ｘｕ、Ｙ．およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ．（１９９６）、Ｇｅｎｅｓ ＆
Ｄｅｖ．１０、２４０１−２４１０。 Ｚａｋｉａｎ、Ｖ．Ａ．（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８２、６８５−６８７。配列表 SEQUENCE LISTING <110> KuDOS Pharmaceuticals Limited <120> Assays, Therapeutic Methods and Means <130> <140> PCT/GB98/02115 <141> 1998-07-16 <150> GB 9714971.0 <151> 1997-07-16 <160> 26 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 3056 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Leu Val Leu Asn Asp Leu Leu Ile Cys Cys Arg Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Asp Arg Ala Thr Glu Arg Lys Lys Glu Val Glu Lys Phe Lys Arg 20 25 30 Leu Ile Arg Asp Pro Glu Thr Ile Lys His Leu Asp Arg His Ser Asp 35 40 45 Ser Lys Gln Gly Lys Tyr Leu Asn Trp Asp Ala Val Phe Arg Phe Leu 50 55 60 Gln Lys Tyr Ile Gln Lys Glu Thr Glu Cys Leu Arg Ile Ala Lys Pro 65 70 75 80 Asn Val Ser Ala Ser Thr Gln Ala Ser Arg Gln Lys Lys Met Gln Glu 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Val Lys Tyr Phe Ile Lys Cys Ala Asn Arg Arg Ala 100 105 110 Pro Arg Leu Lys Cys Gln Glu Leu Leu Asn Tyr Ile Met Asp Thr Val 115 120 125 Lys Asp Ser Ser Asn Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Asp Cys Ser Asn Ile 130 135 140 Leu Leu Lys Asp Ile Leu Ser Val Arg Lys Tyr Trp Cys Glu Ile Ser 145 150 155 160 Gln Gln Gln Trp Leu Glu Leu Phe Ser Val Tyr Phe Arg Leu Tyr Leu 165 170 175 Lys Pro Ser Gln Asp Val His Arg Val Leu Val Ala Arg Ile Ile His 180 185 190 Ala Val Thr Lys Gly Cys Cys Ser Gln Thr Asp Gly Leu Asn Ser Lys 195 200 205 Phe Leu Asp Phe Phe Ser Lys Ala Ile Gln Cys Ala Arg Gln Glu Lys 210 215 220 Ser Ser Ser Gly Leu Asn His Ile Leu Ala Ala Leu Thr Ile Phe Leu 225 230 235 240 Lys Thr Leu Ala Val Asn Phe Arg Ile Arg Val Cys Glu Leu Gly Asp 245 250 255 Glu Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Ile Trp Thr Gln His Arg Leu Asn 260 265 270 Asp Ser Leu Lys Glu Val Ile Ile Glu Leu Phe Gln Leu Gln Ile Tyr 275 280 285 Ile His His Pro Lys Gly Ala Lys Thr Gln Glu Lys Gly Ala Tyr Glu 290 295 300 Ser Thr Lys Trp Arg Ser Ile Leu Tyr Asn Leu Tyr Asp Leu Leu Val 305 310 315 320 Asn Glu Ile Ser His Ile Gly Ser Arg Gly Lys Tyr Ser Ser Gly Phe 325 330 335 Arg Asn Ile Ala Val Lys Glu Asn Leu Ile Glu Leu Met Ala Asp Ile 340 345 350 Cys His 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gaccatctca cacagtgggc aaggcacaaa tttcaggcac tgaaagctga gaaatgtcca 4920 cacagcaaat caaacagaaa taaggtagac tcaatggtat ctactgtgga ttatgaagac 4980 tatcagagtg taacccgttt tctagacctc ataccccagg atactctggc agtagcttcc 5040 tttcgctcca aagcatacac acgagctgta atgcactttg aatcatttat tacagaaaag 5100 aagcaaaata ttcaggaaca tcttggattt ttacagaaat tgtatgctgc tatgcatgaa 5160 cctgatggag tggccggagt cagtgcaatt agaaaggcag aaccatctct aaaagaacag 5220 atccttgaac atgaaagcct tggcttgctg agggatgcca ctgcttgtta tgacagggct 5280 attcagctag aaccagacca gatcattcat tatcatggtg tagtaaagtc catgttaggt 5340 cttggtcagc tgtctactgt tatcactcag gtgaatggag tgcatgctaa caggtccgag 5400 tggacagatg aattaaacac gtacagagtg gaagcagctt ggaaattgtc acagtgggat 5460 ttggtggaaa actatttggc agcagatgga aaatctacaa catggagtgt cagactggga 5520 cagctattat tatcagccaa aaaaagagat atcacagctt tttatgactc actgaaacta 5580 gtgagagcag aacaaattgt acctctttca gctgcaagct ttgaaagagg ctcctaccaa 5640 cgaggatatg aatatattgt gagattgcac atgttatgtg agttggagca tagcatcaaa 5700 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atctctcgaa tttgtcattc tcacgatgaa gtttttgttg tcttgatgga aataatagcc 6600 aaagtatttc tagcctatcc tcaacaagca atgtggatga tgacagctgt gtcaaagtca 6660 tcttatccca tgcgtgtgaa cagatgcaag gaaatcctca ataaagctat tcatatgaaa 6720 aaatccttag agaagtttgt tggagatgca actcgcctaa cagataagct tctagaattg 6780 tgcaataaac cggttgatgg aagtagttcc acattaagca tgagcactca ttttaaaatg 6840 cttaaaaagc tggtagaaga agcaacattt agtgaaatcc tcattcctct acaatcagtc 6900 atgataccta cacttccatc aattctgggt acccatgcta accatgctag ccatgaacca 6960 tttcctggac attgggccta tattgcaggg tttgatgata tggtggaaat tcttgcttct 7020 cttcagaaac caaagaagat ttctttaaaa ggctcagatg gaaagttcta catcatgatg 7080 tgtaagccaa aagatgacct gagaaaggat tgtagactaa tggaattcaa ttccttgatt 7140 aataagtgct taagaaaaga tgcagagtct cgtagaagag aacttcatat tcgaacatat 7200 gcagttattc cactaaatga tgaatgtggg attattgaat gggtgaacaa cactgctggt 7260 ttgagaccta ttctgaccaa actatataaa gaaaagggag tgtatatgac aggaaaagaa 7320 cttcgccagt gtatgctacc aaagtcagca gctttatctg aaaaactcaa agtattccga 7380 gaatttctcc tgcccaggca tcctcctatt tttcatgagt ggtttctgag aacattccct 7440 gatcctacat catggtacag tagtagatca gcttactgcc gttccactgc agtaatgtca 7500 atggttggtt atattctggg gcttggagac cgtcatggtg aaaatattct ctttgattct 7560 ttgactggtg aatgcgtaca tgtagatttc aattgtcttt tcaataaggg agaaaccttt 7620 gaagttccag aaattgtgcc atttcgcctg actcataata tggttaatgg aatgggtcct 7680 atgggaacag agggtctttt tcgaagagca tgtgaagtta caatgaggct gatgcgtgat 7740 cagcgagagc ctttaatgag tgtcttaaag acttttctac atgatcctct tgtggaatgg 7800 agtaaaccag tgaaagggca ttccaaagcg ccactgaatg aaactggaga agttgtcaat 7860 gaaaaggcca agacccatgt tcttgacatt gagcagcgac tacaaggtgt aatcaagact 7920 cgaaatagag tgacaggact gccgttatct attgaaggac atgtgcatta ccttatacag 7980 gaagctactg atgaaaactt actatgccag atgtatcttg gttggactcc atatatgtga 8040 aatgaaatta tgtaaaagaa tatgttaata atctaaaagt aatgcatttg gtatgaatct 8100 gtggttgtat ctgttcaatt ctaaagtaca acataaattt acgttctcag caactgttat 8160 ttctctctga tcattaatta tatgtaaaat aatatacatt cactcgtgcc 8210 <210> 7 <211> 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10610 tcactgataa ctacccgcag gctattgttt atcccttcat cataagcagc 10660 gaaagctatt ccttcaagga tacttctact ggtcataaga ataaggagtt 10710 tgtggcaagg attaaaagta agttggatca aggaggagtg attcaagatt 10760 ttattaatgc cttagatcag ctctctaatc ctgaactgct ctttaaggat 10810 tggagcaatg atgtaagagc tgaactagca aaaacccctg taaataaaaa 10860 aaacattgaa aaaatgtatg aaagaatgta tgcagccttg ggtgacccaa 10910 aggctccagg cctgggggcc tttagaagga agtttattca gacttttgga 10960 aaagaatttg ataaacattt tgggaaagga ggttctaaac tactgagaat 11010 gaagctcagt gacttcaacg acattaccaa catgctactt ttaaaaatga 11060 acaaagactc aaagccccct gggaatctga aagaatgttc accctggatg 11110 agcgacttca aagtggagtt cctgagaaat gagctggaga ttcccggtca 11160 gtatgacggt aggggaaagc cattgccaga gtaccacgtg cgaatcgccg 11210 ggtttgatga gcgggtgaca gtcatggcgt ctctgcgaag gcccaagcgc 11260 atcatcatcc gtggccatga cgagagggaa caccctttcc tggtgaaggg 11310 tggcgaggac ctgcggcagg accagcgcgt ggagcagctc ttccaggtca 11360 tgaatgggat cctggcccaa gactccgcct gcagccagag ggccctgcag 11410 ctgaggacct 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gagtgggctt tcagaagaga 12260 ctcaagtgaa gtgcctgatg gaccaggcaa cagaccccaa catccttggc 12310 agaacctggg aaggatggga gccctggatg tgaggtctgt gggagtctgc 12360 agatagaaag cattacattg tttaaagaat ctactatact tggttggcag 12410 cattccatga gctgattttc ctgaaacact aaagagaaat gtcttttgtg 12460 ctacagtttc gtagcatgag tttaaatcaa gattatgatg agtaaatgtg 12510 tatgggttaa atcaaagata aggttatagt aacatcaaag attaggtgag 12560 gtttatagaa agatagatat ccaggcttac caaagtatta agtcaagaat 12610 ataatatgtg atcagctttc aaagcattta caagtgctgc aagttagtga 12660 aacagctgtc tccgtaaatg gaggaaatgt ggggaagcct tggaatgccc 12710 ttctggttct ggcacattgg aaagcacact cagaaggctt catcaccaag 12760 attttgggag agtaaagcta 12780 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp 1 5 10 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa is any amino acid <400> 10 Ser Xaa Xaa Thr 1 <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (10) <223> Xaa is uncertain <400> 11 Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Leu Ser Xaa Glu Thr Phe Ser Asp Leu 1 5 10 15 Trp Lys Leu <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 12 cctgcccttg cctga 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 13 tcaggcaagg gcagg 15 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 14 cctgcccttg cctgacgcta ttagt 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 15 actaatagcg tcaggcaagg gcagg 25 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 16 ttgtaaaacg acggccagtg aattcatcat caataatata ccttattttg 50 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 17 caaaataagg tatattattg atgatgaatt cactggccgt cgttttacaa 50 <210> 18 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 18 gatcgaatcc gatagagtat agatagagta aagtttaaat acttatatag atagagtata 60 gatagagggt tcaaa 75 <210> 19 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 19 tttgaaccct ctatctatac tctatctata taagtattta aactttactc tatctatact 60 ctatcggatt cgatc 75 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 20 ttgtaaaacg acggccagtg aattcatcat caataatata ccttattttg 50 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 21 cctgcccttg cctgacgcta ttagttcatc tatttgtttt gctaattcga ttggaatcga 60 aacggtcaca tattcttttt tgactgattt cctcggcata 100 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 22 tatgccgagg aaatcagtca aaaaagaata tgtgaccgtt tcgattccaa 50 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 23 tcgaattagc aaaacaaata gatgaactaa tagcgtcagg caagggcagg 50 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 24 tatgccgagg aaatc 15 <210> 25 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 25 tatgccgagg aaatcagtca aaaaagaata tgtgaccgtt tcgaattagc aaaacaaata 60 gatgaactaa tagcgtcagg caagggcagg 90 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser 1 5 10
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】 ＡＴＭはＤＮＡの存在下にｐ５３をＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８においてリン
酸化する。ＡＴＭおよびｐ５３を使用するキナーゼ反応をＤＮＡの存在および不
存在において実施した。これらの研究において、ｐ５３のリン酸化はＤＮＡの存
在において増加することが明らかにされた。（Ａ、Ｂ）32Ｐ標識化ｐ５３に対応
するバンドをゲルから切除し、トリプシンで消化し、Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５
４ Ｃ１８カラム上のクロマトグラフィーにかけた（実験手順参照）。精製され
たｐ５３画分はＤＮＡ（ペプチド２ａ、２ｂおよび２ｃ）の存在においてリン酸
化されたが、不存在においてはリン酸化されず、実験手順に記載されているよう
にペプチド配列の分析に付した；エドマン分解の各サイクル後に放射能を測定し
た。32Ｐの組込みを示すｐ５３ペプチドの推定上のアミノ酸配列をパネルＣ（配
列番号：２６）に示す。（Ｄ）ＤＮＡの存在におけるＤＮＡ−ＰＫによりリン酸
化されたｐ５３のトリプシンペプチド地図。ＤＮＡ−ＰＫおよびｐ５３を含有す
るキナーゼ反応を線状ＤＮＡの存在において実施し、そして32Ｐ標識化ｐ５３を
（Ａ、Ｂ）におけるように分析し、再びＳｅｒ１５およびＴｈｒ１８におけるリ
ン酸化を明らかにする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６ａ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６ａ】 ヒトＡＴＭのアミノ酸配列（配列番号：１）を示し、キナーゼドメインは下線
でマークされている。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６ｂ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６ｂ】 ＡＴＭ核酸配列（配列番号：２）を示し、開始コドンに下線が引かれている。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７ａ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７ａ】 ヒトｐ５３のアミノ酸配列（配列番号：３）を示し、ＡＴＭによりリン酸化さ
れた残基は下線でマークされている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７ｂ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７ｂ】 ｐ５３核酸配列（配列番号：４）を示し、開始コドンに下線が引かれている。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図８ａ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８ａ】 ヒトＡＴＲ（ＦＲＰ−１）のアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図８ｂ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８ｂ】 ＡＴＲ核酸配列（配列番号：６）を示し、開始コドンに下線が引かれている。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９ａ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９ａ】 ＤＮＡ−ＰＫcsのアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９ｂ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９ｂ】 ＤＮＡ−ＰＫ核酸配列（配列番号：８）を示し、開始コドンに下線が引かれて
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジャクソン，スティーブン フィリップ イギリス国，ケンブリッジ シービー３ ０エヌピー，ガートン，ソーントン ロー ド 45 (72)発明者 レイキン，ニコラス デビット イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ３ピーユー，ホバーツ ロード 27 (72)発明者 スミス，グレアム キャメロン マーレイ イギリス国，ケンブリッジ シービー４ ２ゼットキュー，ミルトン，ジ エルムス 29

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質と
    、（ｉｉ）ｐ５３またはｐ５３のそれらに対して相同のＡＴＭリン酸化部位を有
    する任意のタンパク質との間の相互作用をモジュレートすることができる化合物
    をアッセイする方法であって、工程： （ａ） （ｉ）のペプチドフラグメントを含む物質またはその誘導体、変異型
    またはアナログ、ｐ５３またはｐ５３に対して相同のリン酸化部位を有する任意
    のタンパク質の関係するフラグメントを包含する物質、またはその変異型、誘導
    体またはアナログ、および被検化合物を接触させ、そして （ｂ） 前記物質と被検化合物との間の相互作用または結合を測定する、 ことを含む方法。
  2. 【請求項２】 （ｉ）ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質と
    、（ｉｉ）ｐ５３またはｐ５３のそれらに対して相同のＡＴＭリン酸化部位を有
    する任意のタンパク質との間の相互作用をモジュレートすることができる化合物
    をアッセイする方法であって、工程： （ａ） ｐ５３またはｐ５３のそれらに対して相同のリン酸化部位を有する任
    意のタンパク質をリン酸化する（ｉ）のフラグメントを少なくとも含む物質、ｐ
    ５３または（ｉ）によりリン酸化される部位を含む任意のタンパク質のフラグメ
    ントを少なくとも含む物質、および被検化合物を接触させ、そして （ｂ） 前記部位におけるリン酸化を測定する、 ことを含む方法。
  3. 【請求項３】 （ｉ）ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質と
    、（ｉｉ）ｐ５３との間の相互作用のモジュレーションによりｐ５３の活性に影
    響を与えることができる化合物をアッセイする方法であって、工程： （ａ） ｐ５３またはそのフラグメント、誘導体、変異型またはアナログであ
    る物質、および被検化合物を接触させ、そして （ｂ） （ｉ）の存在および不存在におけるｐ５３の活性を測定する、 ことを含む方法。
  4. 【請求項４】 関連キナーゼ活性を有するタンパク質がＤＮＡ−ＰＫまたは
    ＡＴＲである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により得られた（
    ｉ）ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｉｉ）ｐ５３また
    はｐ５３に対して相同のＡＴＭリン酸化部位を有する任意のタンパク質との間の
    相互作用をモジュレートすることができる因子。
  6. 【請求項６】 ｐ５３または前記相同部位に対するＡＴＭ仲介リン酸化をモ
    ジュレートすることができる請求項５に記載の因子。
  7. 【請求項７】 ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質とｐ５３
    との間の相互作用をモジュレートすることができるｐ５３のペプチドフラグメン
    ト。
  8. 【請求項８】 ＡＴＭによるか、あるいは関連キナーゼ活性を有するタンパ
    ク質によるリン酸化をモジュレートすることができる請求項７に記載のペプチド
    。
  9. 【請求項９】 Ｔｈｒ１８を含むヒトｐ５３の中に見出される配列を有する
    、請求項７または８に記載のペプチド。
  10. 【請求項１０】 Ｓｅｒ１５を含むヒトｐ５３の中に見出される配列を有す
    る、請求項７または８に記載のペプチド。
  11. 【請求項１１】 関連キナーゼ活性を有するタンパク質がＤＮＡ−ＰＫまた
    はＡＴＲである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
  12. 【請求項１２】 請求項７〜１１のいずれか一項に記載のペプチドをコード
    する核酸単離物。
  13. 【請求項１３】 ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質とｐ５
    ３との間の相互作用をモジュレートすることができる、ＡＴＭまたは前記タンパ
    ク質のペプチドフラグメント。
  14. 【請求項１４】 ＡＴＭによるか、あるいは関連キナーゼ活性を有するタン
    パク質によるリン酸化をモジュレートすることができる請求項１３に記載のペプ
    チド。
  15. 【請求項１５】 関連キナーゼ活性を有するタンパク質がＤＮＡ−ＰＫまた
    はＡＴＲである、請求項１３または１４に記載のペプチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のペプチドをコー
    ドする核酸単離物。
  17. 【請求項１７】 ＡＴＭの作用のモジュレーションを包含する療法による治
    療法において使用するための、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の因子また
    はペプチドフラグメントまたは核酸分離物。
  18. 【請求項１８】 ＡＴＭの作用をモジュレートする薬剤の製造における、請
    求項５〜１７のいずれか一項に記載の因子またはペプチドフラグメントまたは核
    酸分離物の使用。
  19. 【請求項１９】 工程： （ａ） ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質によるＤＮＡの結
    合のインヒビターである被検化合物の不存在において、下記物質が前記ＤＮＡに
    結合する条件下に、ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質、または
    ＤＮＡに結合できるそれらのフラグメント、変異型または誘導体である物質、Ｄ
    ＮＡ、および被検化合物を接触させ、そして （ｂ） 前記物質と前記ＤＮＡとの間の結合を測定する、 ことを含む、ＡＴＭまたは関連キナーゼ活性を有するタンパク質によるＤＮＡの
    結合に影響を与えることができる化合物をアッセイする方法。
  20. 【請求項２０】 関連キナーゼ活性を有するタンパク質がＤＮＡ−ＰＫまた
    はＡＴＲである、請求項１９に記載のアッセイ法。
  21. 【請求項２１】 請求項１９または２０に記載の方法を使用して得られたＡ
    ＴＭによるＤＮＡの結合に影響を与えることができる因子。
  22. 【請求項２２】 ＡＴＭの作用のモジュレーションを包含する療法による治
    療法において使用するための、請求項２１に記載の因子。
  23. 【請求項２３】 ＡＴＭの作用をモジュレートする薬剤の製造における、請
    求項２１に記載の因子の使用。
  24. 【請求項２４】 ＡＴＭまたはＡＴＲを含む分子の混合物をＤＮＡと接触さ
    せ、ＤＮＡと結合しない分子を洗浄除去し、そしてＤＮＡ結合画分からＡＴＭま
    たはＡＴＲを回収することを含む、ＡＴＭまたはＡＴＲを精製する方法。
  25. 【請求項２５】 ＡＴＭまたはＡＴＲを精製するためのＤＮＡの使用。
  26. 【請求項２６】 ＡＴＭまたはＡＴＲを含む分子の混合物をＮＴＡと接触さ
    せ、ＮＴＡと結合しない分子を洗浄除去し、そしてＮＴＡ結合画分からＡＴＭま
    たはＡＴＲを回収することを含む、ＡＴＭまたはＡＴＲを精製する方法。
  27. 【請求項２７】 前記混合物をＮｉ2+の存在においてＮＴＡと接触させる、
    請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 実質的に純粋なＡＴＭ。
  29. 【請求項２９】 実質的に純粋なＡＴＲ。
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