MXPA05001364A - Proteinas de interaccion de mk2. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a usos de proteinas que se unen a MK2 para modular la inflamacion. Mas particularmente, la invencion se refiere a usos de proteinas que se unen a MK2 para tratar condiciones que estan relacionadas con la inflamacion. La invencion es util para el tratamiento de condiciones inflamatorias, particularmente aquellas en la que seria terapeuticamente beneficos disminuir la inflamacion.

Description

PROTEÍNAS DE INTERACCIÓN DE MK2 Campo de la Invención La presente invención se refiere a usos de proteínas que se unen a la quinasa 2 MAPKAP (MK2). Más particularmente, la invención se refiere a usos de proteínas que se unen a MK2 para el tratamiento de condiciones que están relacionadas con la inflamación. La invención es útil para el tratamiento de condiciones tales como la enfermedad de Crohn, enfermedad de intestino inflamado, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfisema, reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, asma, lupus sistémico eritematoso, e inflamación debida a traumatismo, daño o ataque súbito.

Antecedentes de la Invención Esta solicitud se basa en el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América con número de serie 60/400,044. Un gran número de condiciones en seres humanos y animales están asociados con la inflamación. Hasta la fecha, existen muy pocas terapias confiables o efectivas para estas condiciones. Sin embargo, los terribles síntomas asociados con estas condiciones pueden ser reducidos de manera importante mediante el empleo de terapias que disminuyan la inflamación en pacientes que padecen de esta condición. Si bien no curan las condiciones, tales terapias mejorarían de manera importante la calidad de vida de estos pacientes y podrían aliviar algunos de los efectos de estas condiciones. De esta manera, existe la necesidad en la técnica de identificar nuevas terapias que puedan contribuir a una disminución global de la inflamación en pacientes que padecen de estas condiciones. Las condiciones inflamatorias con frecuencia están asociadas con la regulación inapropiada de las citocinas (Han et al., 1 ature Cell Biol., E39-E40 (1999). Por esta razón, los inhibidores selectivos de la expresión de citocina inflamatoria son agentes potenciales para el tratamiento de condiciones relacionadas con la inflamación. Se cree que la quinasa 2 MAPKAP (MK2) contribuye a la regulación de varias citocinas y de esta forma puede ser un componente esencial de la respuesta inflamatoria.

Ratones con nula mutación para la MK2 muestran una resistencia incrementada al choque endotóxico inducido por lipopolisacárido (Kotlyrov et al, Nature Cell Biol., 1:94-97 (1999)). Se cree que esta resistencia a la tensión resulta de la disminución en la biosíntesis de varias citocinas inflamatorias que incluyen a TNF-a, II- 1ß, IL-6, IL-10 e IFN-?. Debido al papel de la MK2 en la regulación de las citocinas inflamatorias, las proteínas que se unen e inhiben la MK2 son agentes potenciales para la disminución de la inflamación. La M 2 ha mostrado que se asocia con un gran número de proteínas. La MK2 es fosforilada por la quinasa MAP de p38 en respuesta a ciertas tensiones ambientales o citocinas inflamatorias (Kotlyrov et al, Nature Cell Biol., 1:94-97 (1999)), como se muestra en la Figura 7. La MK2 fosforila factor de respuesta de suero (SRF) (Heidenreich et al, J. Biol. Chem., 274: 14434-14443 (1999)), CREB y ER81 (Janknecht, J. Biol Chem., 276:41856-41861 (2001)), proteína pequeña de choque térmico y proteína 1 específica de leucocito (revisada en Neininger et al, EMBO Reports, 2:703-708 (2001)). E47 (Neufeld et al, J. Biol. Chem., 275:20239-20242 (2000)), Akt (Rane et al, J. Biol Chem., 276:3517-3523 (2001)), hidroxilasa de tirosina, y TTP (Mahtani et al, Mol Cell Biol, 21 :6461-6469 (2001)). Además, la MK2 interactúa con la 5-lipoxigenasa, la cual cataliza etapas importantes en la síntesis de leucotrienos, los cuales son un grupo de mediadores de la inflamación (Janknecht, J. Biol. Chem., 276:41856-41861 (2001)). Una proteína, la hnRNP A0, sin embargo, ha mostrado ser regulada de manera diferencial en células MK2 +/+ y -/-. De esta manera, debido al involucramiento en las respuestas inflamatorias, puede ser un objetivo deseable para intervención terapéutica. En particular, los agentes terapéuticos que inhiben la actividad de la MK2 pueden ser utilizados para tratar condiciones en seres humanos y animales en las que sería terapéuticamente benéfica una disminución en la inflamación.

Compendio de la Invención En consecuencia, la invención se refiere a proteínas que interactúan con MK2. Proteínas que se unen a MK2, incluyendo variantes de empalme, truncaciones, fragmentos, sustituciones, mutaciones de adición y supresión, proteínas de fusión, mutantes de purga y secuencia de motivo, así como homólogos de tales proteínas son novedosos agentes farmacológicos potenciales contra la inflamación.

La presente invención además se relaciona con complejos de proteína que comprenden MK2 y una proteína de interacción con MK2 tal como, por ejemplo, STS, HPH2 y Shc y variantes de éstos. Ejemplos de proteínas de interacción de MK2 adicionales incluyen SRF, CREE-, ER81, hidroxilasa de tirosina, TTP, proteína 1 pequeña de choque térmico, E47, Akt y 5-lipoxigenasa. Una o más de estas proteínas también puede estar presente en un complejo de proteínas incluyendo MK2. La invención también provee métodos para la preparación y uso de tales complejos de proteínas para la identificación de compuestos potenciales para el tratamiento de condiciones y enfermedades en donde se desea la modulación de la inflamación. La presente invención provee métodos para la modulación de la actividad inflamatoria en células que expresan MK2. Tales métodos comprenden la administración de una cantidad efectiva de una proteína que se une a MK2. La presente invención también abarca métodos para la expresión de una proteína en una célula mediante la administración de una molécula de ADN que codifica para cuando menos una proteína que se une a MK2. La presente invención también incluye métodos de tamizaje de fármacos para identificar fármacos anti-inflamatorios. En algunas modalidades, un fármaco antiinflamatorio es identificado mediante un método que comprende, por ejemplo, el proveer un complejo que incluye MK2 y cuando menos una proteína de interacción con MK2, agregando una cantidad efectiva de un compuesto de prueba al complejo y determinando si el compuesto de prueba inhibe la interacción de MK2 con una proteína de interacción. Los fármacos anti-inflamatorios identificados mediante un método de acuerdo con la invención incluyen pequeñas moléculas, agentes químicos, proteínas, péptidos y anticuerpos que inhiben la interacción entre la MK2 y una proteína de interacción con MK2. Adicionalmente, la presente invención también provee métodos para la identificación fármacos anti-inflamatorios potenciales que permitan una interacción entre la MK2 y cuando menos una proteína de interacción con MK2 pero que bloquean la actividad de la MK2. Ejemplos de fármacos anti-inflamatorios incluyen pequeñas moléculas, agentes químicos, proteínas, péptidos y anticuerpos. De acuerdo con la invención, compuestos (tales como proteínas, péptidos, anticuerpos, agentes químicos y pequeñas moléculas) que interactúan con cuando menos uno de MK2 o un complejo de MK2 y modulan la actividad de la MK2 pueden ser administrados a un paciente, en una dosis terapéuticamente efectiva, con el fin de tratar o prevenir condiciones médicas en las que sería terapéuticamente benéfica una disminución de la inflamación. Las modalidades incluyen el tratamiento de condiciones que involucran células y tejidos que están asociados con un aumento de la inflamación. Los compuestos que interactúan con cuando menos una de MK2 o un complejo de MK2 pueden estar incluidos en una preparación farmacéutica. La preparación farmacéutica puede contener otros componentes, tales como agentes que ayuden en la unión del compuesto a MK2 o un complejo de MK2. Además, los compuestos que interactúan con cuando menos una de MK2 o un complejo de MK2 pueden ser utilizados como una herramienta de diagnóstico para detectar cualitativa o cuantitativamente la MK2. Por ejemplo, estos compuestos pueden ser marcados radiactivamente, el tejido puede ser incubado con la proteína marcada, y la proteína no unida, en exceso, puede ser eliminada mediante lavado. El tejido puede ser valorado para determinar la presencia de actividad radiactiva, lo cual indicaría la presencia de MK2. Los compuestos que interactúan con cuando menos una de MK2 o un complejo de MK2 pueden ser utilizados para detectar la presencia, ausencia o cantidad de MK2 en una célula, fluido corporal, tejido u organismo. La presencia o cantidad de MK2 detectada puede ser correlacionada con una o más de las condiciones médicas de la lista que aquí se ha proporcionado. La invención también incluye compuestos que promueven la interacción entre MK2 y una proteína de interacción con MK2, en donde la proteína de interacción con MK2 estimula la actividad de la MK2 que resulta en una respuesta inflamatoria. Tales agentes son particularmente útiles en el tratamiento de condiciones tales como, por ejemplo, infección de monocitogenes de Listeria, en donde es deseable la estimulación de la MK2 y un subsiguiente aumento en la producción de TNF- . En consecuencia, la invención también abarca un equipo (kit) para ser utilizado para la detección del nivel de MK2 en una muestra, el cual comprende cuando menos un compuesto que interactúa con MK2 o un complejo de MK2, sea que esté marcado o sin marcar, y cuando menos un agente que se una a este compuesto, tal como un anticuerpo marcado. El kit puede también incluir los estándares biológicos adecuados y las muestras de control contra las cuales uno podría comparar los resultados de la detección experimental. También pueden incluirse reguladores o soluciones de lavado así como instrucciones para el uso del kit. Pueden incluirse los componentes estructurales sobre los cuales uno puede llevar a cabo la experimentación, tales como puntas, perlas, papeles, columnas, frascos o geles.

Breve Descripción de los Dibujos Las Figuras 1A y IB muestran la secuencia de ADNc que codifica para proteína "similar a smoothelín" (STS), correspondiente a la SEQ ID NO: 1. Las Figuras 2A y 2B muestran la secuencia de ADNc que codifica para proteína polihomeótica 2 humana (HPH2), correspondiente a la SEQ ID NO: 2. Las Figuras 3A y 3B muestran la secuencia de ADNc que codifica para una proteína de homología src y colágeno (Shc), correspondiente a la SEQ ID NO: 3. La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos para proteína "similar a smoothelin" (STS), correspondiente a la SEQ ED NO: 4. La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos para proteína polihomeótica 2 humana (HPH2), correspondiente a la SEQ ID NO: 5. La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos para proteína de homología src y colágeno (Shc), correspondiente a la SEQ ID NO: 6. La Figura 7 muestra un diagrama de la vía de señalización de p38/MK2. Las rutas de señalización de quinasa MAP de P38 son activadas en respuesta a ciertas tensiones ambientales o citocinas pro-inflamatorias. La P38 es directamente fosforilada por quinasas de la quinasa MAP de MK 3/6. Los sustratos de p38 incluyen factores de trascripción así como también un número de quinasas que amplifican y diversifican la señalización de p38. La quinasa M 2 es un sustrato de p38 que puede fosforilar un número de proteínas que incluyen factores de trascripción, proteínas citoesqueléticas asociadas, y proteína de unión de ARN. La MK2 también regula la biosíntesis de la TNF a un nivel pos-trascripcional. La Figura 8 muestra los dominios estructurales así como también de interacción de MK2 de Shc A, HPH2 y STS. La totalidad de las tres isoformas: 46, 52 y 66-kDa de Shc contienen un dominio de homología 2 (SH2), un dominio de unión de fosfotirosina (PTB), y un dominio 1 de homología de colágeno, CHl. La isoforma de 66 kDa adicionalmente contiene un dominio 2 de homología de colágeno, CH2. La polihomeótica humana 2 tiene un dominio de interacción de proteína de motivo alfa estéril (SAM). La STS contiene dominio de unión de actina (ABD) y un dominio de homología de calponin (CH). La Figura 9A muestra el crecimiento y color de levadura en medio selectivo en ensayos de especificidad para la detección de la interacción de varias proteínas de interacción de MK2 con MK2 muíante en levadura. Las proteínas de interacción con MK2, Shc, HPH2 y STS se unen a muíante K93R de MK2 catalíticamente inactivo. Las proteínas de interacción con MK2 no se unen a Lamin (L) o vector (V) de BD vacío. La Figura 9B resume los datos obíenidos a partir de las pruebas de la Figura 9A, en donde cada una de Shc, HPH2 y STS se une a MK2 y K93R de MK2 con substancialmente la misma afinidad. La Figura 9C muestra dominios en MK2 que interactúan con Shc, HPH2 y STS. Se muestran los dominios de ubicación de la terminación C, catalítica, y de la terminación N, rica en prolina, de MK2. La Figura 10 describe la co-inmunoprecipitación (IP) de proíeínas con MK2 en células 293T según se detecto mediante transferencia de Western (WB, Western blotting) en la presencia o ausencia de anisomicina. Como se muestra en la Figura 10A, la transferencia de Western que utiliza anticuerpos contra V5 o Myc muestra que tanto las proteínas de Shc etiqueíadas con V5 como las de MK2 eíiqueíadas con Myc son expresadas en las células 293T. La co-inmunoprecipitación usando el anticuerpo de anti-V5 y el inmunomarcado subsiguiente con el anticuerpo de anti-Myc muestra que la MK2 se co-inmunoprecipita con Shc. La Figura 10B muestra que las FÍA-FTPH2, HA-p38 y Myc-MK2 fueron expresadas, según se detectó medianíe transferencia de Western. La co-inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo de anti-HA y el inmunomanchado subsiguiente con el anticuerpo de anti-Myc muestra que la MK2 se co-inmunoprecipita con HPH2 y p38. La Figura 11 describe niveles de proteína de TNF-a (pg/ml) en células de macrófago RAW264.7. Como se muestra, los niveles de TNF-a aumentaron en células de macrófago de RAW264.7 estimuladas con anisomicina co-expresando ya sea p38 y Shc o MK2 y Shc en comparación con niveles de TNF-a en células que contenían vector solo, p38 solo, MK2 sola o Shc sola. De esía manera, parece que la Shc es pro-inflamatoria debido a que aumenía la actividad de la MK2.

La Figura 12A describe una autoradiografía 2D que muestra proteínas marcadas con 33P procedentes de fibroblastos de embrión de ratón MK2 +/+ y MK2 -/- resueltas usando electroforesis de gel en dos dimensiones. Se muestra una proteína diferencialmente fosforilada (flecha) que tiene un punto de enfoque isoeléctrico de 5.4. La Figura 12B muestra el teñido con plata del mismo gel describiendo la abundancia relativa de las proteínas resueltas. La Figura 13 A muestra una prueba de transferencia de Western para la detección de Hsp 27 fosforilado (pHsp 27) en la presencia de MK2 o MK2 y Shc tanto en células HeLa estimuladas como no estimuladas con anisomicina. Como se describe, la MK2 y Shc A de V5-p66 se expresan en células HeLa y el inmunomarcado con un anti-pHsp 27 muestra un aumento en los niveles de proteína basal de pHsp 27 en células que expresan ya sea M 2 o MK2 y Shc. La Figura 13B describe niveles de proteína Hsp 27 fosforilada basal en células HeLa trasfectadas ya sea con vector solo (V), MK2 sola, Shc sola o MK2 y Shc en células HeLa tanto estimuladas como desestimuladas con anisomicina. Los niveles de proteína de Hsp 27 fosforilada son normalizados a niveles en células no estimuladas trasfectadas con vector solo. La Figura 13C describe niveles de Hsp 27 fosforilada basal normalizados a niveles de MK2 en células HeLa trasfectadas ya sea con MK2 y vector (V) o MK2 y Shc.

La Figura 14A describe una prueba transferencia de Western que muestra que la Shc y la MK2 son expresadas en células RAW264.7. Se utilizó un anticuerpo de anti-actina para mostrar que cantidades iguales de proteína total fueron cargadas en cada carril. La Figura 14B describe los niveles de proteína de TNF- secretada, según se determinó mediante ELISA, en células RAW264.7 tanto estimuladas como desestimuladas con LPS trasfectadas con vector (V) solo, MK2 solo, Shc solo o MK2 y Shc. La Figura 15 A describe una representación esquemática de la proteína p66Shc A incluyendo un dominio CH2, una dominio PTB, un dominio CH1 y un dominio SH2. También muestra el dominio de interacción de MK2 en la proteína, la secuencia de consenso de quinasa 2 de CAM y la secuencia de GSK3. La Figura 15B describe la fosforilación de p66Shc A en un ensayo de quinasa in vitro usando MK2 recombinante y V5-Shc A imunoprecipitada a partir de células 293T transfectadas. Como se describe, la Shc A fosforilada se detecta solo en inmunoprecipitados procedentes de células que expresan Shc. El teñido de Coomassie y la transferencia de Western usando un anticuerpo de anti-V5 se utilizaron para confirmar que la Shc A era expresada en células transfectadas con Shc A. La Figura 16 es una representación esquemática de vías activadas por tensión regulada mediante MK2 en respuesta a tensión celular y fosforilación de Shc en respuesta a la activación de MK2 por tensión celular. La Figura 17 describe pruebas de transferencia de Western para mostrar niveles de FKHR-Ll y AKT fosforilada en respuesta a peróxido de hidrógeno (H202) en fibroblastos de embrión de ratón (MEFs) MK2 -/- y MK2 +/+. Como se describe, los niveles tanto de AKT fosforilado como el de FKHR-Ll fosforilado fueron reducidos en MEFs MK2-/- en comparación con los niveles de MEFs MK2 +/+.

Breve Descripción de la Secuencias La siguiente tabla proporciona información acerca de las secuencias que se presentan en esta descripción: Definiciones El término "complejo" se refiere a una asociación de dos o más proteínas. Dicha asociación puede ser ya sea covalente o no covalente incluyendo, por ejemplo, interacciones iónicas, hidrofilicas e hidrofóbicas entre dos proteínas en un complejo. Típicamente, las proteínas que forman un complejo interactúan entre ellas de tal manera que la identificación o detección de una primera proteína en el complejo conduce a la identificación o detección de la otra proteína o proteínas que forman un complejo con la primera proteína. Un complejo de proteína puede ser identificado ya sea in vivo, en donde dos o más proteínas se asocian de manera natural con la(s) otra(s), por ejemplo, en una célula para forma un complejo. Alternativamente, puede formarse un complejo in vitro, en donde una interacción entre dos o más proteínas ocurre cuando estas proteínas se agregan a una misma mezcla de reacción. Los métodos que son empleados para la detección de proteínas en un complejo incluyen, pero no se limitan a, co-inmunoprecipitación, doble híbrido de levadura, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y ensayos pulido wn. Un complejo de MK2 es un complejo que contiene MK2 y cuando menos alguna otra proteína. El término "co-inmunoprecipitación" se refiere a un método para detectar una interacción entre dos proteínas. Por ejemplo, la interacción entre una proteína de interacción con MK2 etiquetada con HA, tal como Shc, y MK2 etiquetada con Myc coexpresada en células 293 T, puede ser detectada mediante inmunoprecipitación. Se preparan lisatos celulares a partir de células que co-expresan ambas proteínas que son subsecuentemente inmunoprecipitadas con un anticuerpo de anti-HA. Los inmunoprecipitados son resueltos mediante SDS-PAGE e inmunomanchados con anticuerpo de anti-MYC para detectar la MK2 inmunoprecipitada. El término "HPH2" se refiere al homólogo 2 de polihomeótica humana, la cual es un miembro del grupo de policomb (PcG) de proteínas y tiene un peso molecular de aproximadamente 51 kDa. La HPH2 interactúa con M 2 para forma un complejo, modulando de esta manera la actividad de la MK2. El término "HPH2" también incluye variantes de HPH2 que incluyen variantes de empalme, homólogos, proteínas de fusión que incluyen HPH2, imitantes de truncación y supresión, fragmentos, mutantes de sustitución, mutantes de adición, mutantes de purga y secuencia de motivo de HPH2 que interactúan con MK2. De esta manera el término "HPH2" además se refiere a variantes funcionales de HPH2, incluyendo fragmentos de HPH2, lo cuales interactúan con MK2. La HPH2 es homologa a la proteína "polihomeótica" PcG de melanogaster de Drosophila, así como también a la proteína Rae28/Mphl de ratón (Gunster et al., Molec. Cell. Bioh. 17:2326-2305 (1997)) En la Drosophila, los genes de PcG son parte de un sistema de memoria celular que es responsable de la herencia estable de la actividad genética. Las proteínas PcG forman un gran complejo de proteína asociado a cromatin, multimérico, y contiene un motivo de lámina de cinc y dos regiones designadas dominios I y ? de homología. Estos complejos mantienen activación silencio trascripcional durante el desarrollo y mantienen memoria transcripcional durante el ciclo celular, especialmente la división celular. Las mutaciones en los genes de PcG están asociadas con defectos de proliferación en células hematopoyéticas, implicando a estas células en la regulación de la hematopoyesis. La secuencia de ADNc para HPH2 se provee en las Figuras 2A y 2B (correspondiendo a la SEQ ID NO: 2) y la secuencia de aminoácidos de la proteína se proporciona en la Figura 5 (correspondiendo a la SEQ ID NO: 5). La Figura 8B muestra la estructura de HPII2 y el dominio de interacción de MK2 en HPH2, y la Figura 9C ilustra el dominio de interacción de HPH2 en MK2. La HPH2 tiene un dominio de interacción de proteína de motivo alfa estéril (SAM) de terminación C conservado, que se encuentra en un número de proteínas de señalización que incluyen a las quinasas, proteínas de andamiaje, proteínas adaptadoras y GTPAsas, así como también miembros de la familia de ETS de factores de transcripción. Se cree que la HPH2 es un regulador transcripcional. El término "inflamación" se refiere a un proceso patológico fundamental que consiste en un complejo dinámico de reacciones citológicas e histológicas que suceden en los vasos sanguíneos afectados y los tejidos circundantes en respuesta a un daño o estimulación anormal causada por un agente físico, químico o biológico. El término "condición inflamatoria" se refiere a condiciones en las que la inflamación es un síntoma. Tales condiciones incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Crohn, enfermedad de intestino inflamado, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfisema, reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, asma, lupus sistémico eritematoso, e inflamación debida a daño por traumatismo, o ataque súbito tal como daño cerebral por isquemia. Los términos "MK2" y "polipéptido de MK2" se refieren a quinasa 2 MAPKAP, una proteína descrita en Stokoe et al. (Biochem. J. 296: 843-849 (1993)). Esta proteína es una quinasa de Ser/Thr originalmente identificada como una quinasa hsp25/27. Esta quinasa de proteína ha demostrado que es activa después de la fosforilación por quinasa de proteína activada por mitógeno de p38 (quinasa MAP de p38). Se cree que la MK2 regula TNF pos-transcripcionalmente, y puede ser importante en la regulación de otras citocinas.

El análisis de la secuencia de ADNc para MK2 reveló las siguientes características (en orden 5' a 3'): una región rica en prolina que contiene 2 sitios de unión de SH3 putativos, un dominio catalítico de quinasa, un residuo de treonina fosforilado por quinasa MAP, y una señal de ubicación nuclear. Ratones desmayados MK2 -/- son viables, sin embargo existe una reducción del 90% en la biosíntesis de TNF-a inducida por LPS y estos ratones son resistentes a ataque inducido por LPS. El término "MK2" además incluye variantes de MK2 que incluyen variantes de empalme, homólogos, proteínas de fusión que incluyen MK2, mutantes por truncación y supresión, fragmentos, murantes de sustitución, mutantes de adición, mutantes de purga y secuencias motivo de MK2, en donde estas variantes tienen actividad de MK2. Este término abarca variantes funcionales de M 2, en donde una proteína de MK2 variante o un fragmento de ésta, tiene una actividad de MK2, según se determinó mediante uno o más ensayos descritos aquí mismo y aquellos que se conocen en la técnica. Los términos "proteína que se une a MK2" y "proteína de interacción con M 2" se refiere a proteínas que se adhieren o asocian con la MK2. El término abarca proteínas que se encuentran en un complejo con MK2. El término también se refiere a cualquier variante de tales proteínas (incluyendo variantes de empalme, truncaciones, fragmentos, sustituciones, mutantes de adición y supresión, proteínas de fusión, secuencias de purga y secuencias motivo, y homólogos) que tienen una o más de las actividades biológicas asociadas con proteínas naturales. Estas proteínas además incluyen secuencias de aminoácidos que han sido modificadas con cambios conservativos o no conservativos a las proteínas naturales. Estas proteínas pueden ser derivadas de cualquier fuente, natural o sintética. La proteína puede ser humana o derivada de fuentes animales, incluyendo bovino, pollo, murino, rata, porcino, ovino, pavo, mandril y pez. Una proteína que se une a MK2 puede estimular la MK2, inhibir la MK2, o no tener algún efecto sobre la actividad de la MK2. El término "Shc" se refiere a homología de src y colágeno (Migliaccio et al., Nature, 402:309-313 (1999)). El término "Shc" además incluye variantes de Shc que incluyen variantes de empalme, homólogos, proteínas de fusión que incluyen Shc, mutantes por truncación y supresión, fragmentos, mutantes por sustitución, mutantes de adición, mutantes de purga y secuencias motivo de Shc, las cuales interactúan con MK2. Este término abarca variantes funcionales de Shc, en donde una proteína de Shc variante interactúa con MK2, modulando de esta manera la actividad de la MK2. La secuencia de ADNc para una proteína de Shc (Shc A) se proporciona en las Figura 3A y 3B (correspondiente a la SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos de la proteína se proporciona en la Figura 6 (correspondiente a la SEQ ID NO: 6). Las Figuras 8A y 16A muestran varios dominios en una proteína de Shc, incluyendo CH2, PTB, CH1, SH2 y el dominio de interacción de MK2. La Figura 9C muestra el dominio en MK2 el cual interactúa con Shc. Tres isoformas de 46, 52 y 66 kDa de la proteína de Shc A son fosforiladas después del acoplamiento con receptores de superficie celular. Las dos isoformas más pequeñas son generadas a través de diferente iniciación de traducción en tanto que la isoforma de 66 kDa, la cual tiene un único dominio CH con terminación N (CH2), se genera a través de empalme alternativo. Los dominios de homología 2 de Src y de unión de fosfotirosina (PTB) se unen a fosfotirosina en receptores de superficie celular activados, resultando en fosforilación de tirosina del dominio de CH 1, el cual promueve el reclutamiento de Grb2 y SOS. Muchos receptores de superficie celular activados envían señales a través de las dos isoformas de Shc A más pequeñas para activar la vía de la quinasa MAP de Ras. En contraste, no se ha demostrado que la unión de p66 a estos receptores active esta vía mitogénica. El dominio de homología 2 de colágeno (CH2) es único para p66 y contiene serina 36, la cual es fosforilada con tensión oxidativa. Las isoformas de mamífero de Shc regulan funciones tan diversas como el crecimiento (p52/p46Shc), apoptosis (p66/Shc), y duración de vida (p66Shc) (Luzi et al., Curr Opin. Genetics and Development, 10:668-674 (2000)). Se cree que la Shc A es una fosfoproteína adaptadora de señalización. Las isoformas p46 y p52 de la proteína Shc A son expresadas en forma ubicua con la excepción del cerebro y las neuronas, en donde ellas son reguladas en cuanto a su desarrollo. La p66 es expresada en tipos de células y tejidos específicos. Debido a que la p66 no activa la vía MAPK de Ras, su unión, que se propone compite con aquel de las dos isoformas de Shc A más pequeñas, se cree que modula la activación de la vía de MAPK de Ras a través de su expresión diferencial. Se ha mostrado en células aisladas de ratón p66 -/- que la p66 actúa corriente abajo de p53 para mediar las respuestas celulares a tensión oxidativa incluyendo ROS intracelular y apoptosis. Para esta actividad se requiere de la fosforilación de un residuo serina en la posición 36 en la isoforma de p66 (S36). Dos quinasas de MAP: Erk y Jnk han sido implicadas en la fosforilación de esta serina. El término "similar a smoothelin" o "STS" se refiere a una proteína específica cercanamente relacionada a la smoothelin. El término "STS" además incluye variantes de STS incluyendo variantes de empalme, homólogos, proteínas de fusión que incluyen STS, mutantes por truncación y supresión, fragmentos, mutantes por sustitución, mutantes de adición, mutantes de purga y secuencias motivo de STS, las cuales interactúan con MK2. Este térrnino abarca variantes funcionales de STS, en donde una proteína de STS variante interactúa con MK2. La STS no ha sido totalmente caracterizada, sin embargo, el ADNc pronosticado para STS está documentado en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCB), National Institutes of Health, y su peso molecular pronosticado es de 100 kDa. La STS es 94% idéntica a la smoothelin y ambas proteínas tiene una homología de calponin y un dominio de unión de actina basados en homología de secuencia con proteínas conocidas que se encuentran en la base de datos del NCBI. Estas proteínas contienen un dominio de unión de actina (ABD) y un dominio de homología de calponin (CH). Van der Loop et al, J. Cell Biol., 134: 401-411 (1996) determinaron que la smoothelin tiene homología importante a una secuencia que flaquea los dominios de unión de actina de distrofm, utrofin, beta-espectrin y alfa-actinin. Estudios de fraccionamiento de célula sugerían a los autores que la smoothelin es una parte del citoesqueleto. Análisis de Northern blot revelaron que el gene es expresado en varios tejidos que contienen músculo vascular suave, pero no en cerebro, tejido adiposo, músculo cardiaco, o músculo esquelético. El patrón de expresión de STS tiene todavía que ser determinado. La secuencia de ADNc que codifica para STS se proporciona en las Figuras 1A-1B (correspondiente a la SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos de la proteína se proporciona en la Figura 4 (correspondiente a la SEQ ID NO: 4). La estructura de la proteína STS, incluyendo la región de unión de MK2 se muestra en la Figura 8C. Tiene un dominio de unión de actina (ABD) con terminación C y un dominio de homología de calponin (CH). La Figura 9C muestra el dominio en MK2 que interactúa con STS. Se cree que la STS es un proteína asociada del citoesqueleto. El término "beneficio terapéutico" se refiere a un mejoramiento en los síntomas de una condición, un retraso del avance de una condición, o una cesación en el avance de una condición. El beneficio terapéutico se determina comparando una aspecto de una condición, tal como el monto de la inflamación, antes y después de la administración de cuando menos una proteína se une a MK2. El beneficio terapéutico también puede ser determinado comparando un aspecto de una condición, tal como el monto de la inflamación, antes y después de la administración de cuando menos un agente que inhibe la interacción de MK2 con una proteína, en donde la interacción estimula la actividad de la MK2. Adicionalmente, el beneficio terapéutico también puede ser determinado comparando un aspecto de una condición, antes y después de la administración de cuando menos un agente que promueve la interacción entre MK2 y una proteína, en donde la interacción inhibe la actividad de la MK2. En el caso de ciertas condiciones, sin embargo, tales como ciertas infecciones bacterianas, por ejemplo, infección por monocitogenes de Listeria, es deseable tener una actividad mejorada de la MK2. En consecuencia, el beneficio terapéutico también puede ser determinado mediante una resistencia aumentada a dicha infección, antes y después de la administración de un agente que mejore la actividad de MK2 o que promueva la interacción entre MK2 y una proteína, en donde la interacción mejora la actividad de la MK2, resultando en, por ejemplo, resistencia incrementada a la infección bacteriana. El término "trato," "tratar" y "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como tratamiento profiláctico o preventivo. Aquellos que requieren de tratamiento pueden incluir individuos que ya tienen una condición médica particular así como también aquellos que pueden finalmente adquirir la condición (esto es, aquellos quienes son susceptibles a la condición y de esta manera requieren de medidas preventivas). Por ejemplo, estos términos abarcan cualquier tratamiento que conduzca a una reducción en la severidad de una enfermedad o condición, reducción en la duración del curso de la enfermedad, mejoramiento de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o condición; efectos benéficos para el paciente con una enfermedad o condición, sin curar necesariamente la enfermedad o condición y profilaxis de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o condición. El término "dominio" como se utiliza aquí significa una región de un polipéptido (incluyendo proteínas) que tienen alguna característica física distintiva o papel que incluye, por ejemplo, una estructura independiente o una función. Dominios se refiere a una porción de un polipéptido que puede ser ya sea natural o no natural para el polipéptido. Un dominio puede contener la secuencia de aminoácidos con una característica física distintiva o puede contener un fragmento de la secuencia. Un dominio puede interactuar con otros dominios dentro de un polipéptido o una proteína. En algunas modalidades de la invención, un polipéptido de MK2 y/o una proteína de interacción con MK2 incluye un dominio seleccionado de etiquetas de afinidad, radionucléotidos, enzimas y fluoroforos. Dicho dominio puede ser utilizado para aislamiento o purificación de un complejo incluyendo MK2 y una proteína de interacción o para el aislamiento de una proteína que incluye el dominio. Ejemplos de dominios incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, FLAG, Glu-Glu, transferasas de glutationina S (GST), tioredoxin, proteína A, proteína G, y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. El término "proteína de fusión" se refiere a una proteína en donde una primera secuencia de aminoácidos derivada de una primera fuente es ligada, de manera covalente o no covalente, a una segunda secuencia de aminoácidos derivada de una segunda fuente, en donde las secuencias de aminoácidos primera y segunda no son la misma. Una primera fuente y una segunda fuente que no son las mismas pueden incluir dos diferentes entidades biológicas, o dos diferentes proteínas procedentes de la misma entidad biológica, o una entidad biológica y una entidad no biológica. Una proteína de fusión puede incluir por ejemplo, una proteína derivada de cuando menos dos diferentes fuentes biológicas. Una fuente biológica puede incluir cualquier secuencia de aminoácidos o ácido nucleico producido de manera no sintética (por ejemplo, una secuencia genómica o de ADNc, un plásmido o un vector viral, un virion natural o un muíante o un análogo, como se describe más adelante aquí mismo, o cualquiera de los anteriormente referidos). Una fuente sintética puede incluir una proteína o una secuencia de ácido nucleico producida de manera química y no mediante un sistema biológico (por ejemplo, síntesis de fase sólida de secuencias de aminoácidos). Una proteína de fusión también puede incluir una proteína derivada de cuando menos dos diferentes fuentes sintéticas o una proteína derivada de cuando menos una fuente biológica y cuando menos una fuente sintética. El término "aislada" en referencia a una proteína o a un polipéptido se refiere a una proteína o polipéptido separado de su medio ambiente o fuente natural o nativa. De esta manera, una proteína o un polipéptido aislado procedente de un célula se prepara substancialmente libre de otros polipéptidos y componentes que se encuentran en la célula.

El término "recombinante" como se emplea aquí se refiere a un polipéptido, el cual en virtud de su origen o manipulación no está asociado con toda o una parte de un polipéptido con el cual está asociado de manera natural en la naturaleza o en donde dicho polipéptido no ocurre de manera natural en la naturaleza. El término "Y2H" se refiere al sistema de híbrido doble de levadura, de detección de interacciones entre dos proteínas. El doble híbrido utiliza el activador transcripcíonal de levadura: GALA, dividido en dos dominios funcionalmente distintos. El dominio de unión de ADN que cuando está fusionado a una proteína X heteróloga mantiene su actividad de unión de ADN, y el dominio de activación que mantiene sus propiedades de activación transcripcional cuando se fusiona a una proteína Y heteróloga. Las dos proteínas de fusión o híbridas son co-expresadas en levadura. Si existe una interacción entre la proteína X y la proteína Y, la asociación traerá el dominio de activación del activador transcripcional en asociación cercana con su dominio de unión, reconstituyendo de esta manera un activador transcripcional funcional. Este activador transcripcional reconstituido puede entonces impulsar la expresión de un número de genes reporteros, integrados en el genoma de la levadura, el cual contiene el sitio de unión para el dominio de unión de ADN. La expresión del gene reportero es indicativa de una interacción entre la proteína X y la protema Y.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas A. Proteína de Interacción con MK2 La presente invención se refiere a proteínas que interactúan con MK2. Los ejemplos de las proteínas que interactúan con la MK2 incluyen, pero no se limitan a SRF, CREB, ER81, proteína pequeña de choque térmico, protema 1 específica de leucocito, E47, Akt y 5-lipoxigenasa. La HPH2 ha demostrado previamente que se une a MK2 mediante una prueba de sistema de Y2H (B. Neufield, Neue Interaktionspartner der MAPKAP-Kinasen 3pk und MK2: die Polycomb-Proteine HPH2 und Bmil so ie der basische Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor E47 (2000) (Disertación de Doctorado no publicada, University of Würzburg). Este hallazgo fue confirmado en la presente invención (Figura 2 A y 2B, Figura 9B y Ejemplo 5). Además se ha demostrado que la STS (Figuras 1A y IB, Figura 9B y Ejemplo 5) y la Shc (Figuras 3A y 3B, Figura 9B y Ejemplo 5) se unen a MK2 usando el sistema Y2H en la presente invención. Pas proteínas que se unen a MK2 pueden ser aisladas usando una variedad de métodos. Por ejemplo, uno puede utilizar la co-precipitación, como se ejemplifica en el Ejemplo 7. Una proteína de interacción con MK2 etiquetada con V-5 o Ha, y MK2 etiquetada con MYC fueron co-expresadas en células. Se prepararon lisatos de las células e inmunoprecipitaron con un anticuerpo de anti-HA o antí-Y-5. Los inmunoprecipitados fueron resueltos mediante SDS-PAGE e inmunomanchados con un anticuerpo de anti-MYC para detectar M 2 inmunoprecipitada. Uno también podría utilizar el sistema de doble híbrido de levadura (Y2H), como se ejemplifica en los Ejemplos 1-5. Este método se describió por primera vez por Fields and Song. (Nature, 340:245-246 (1989)). El sistema de doble híbrido utiliza un activador transcripcional de levadura, tal como GAL4, dividido en 2 dominios funcionalmente distintos. El dominio de unión de ADN de GAL4 mantiene su actividad de unión de ADN cuando se fusiona a una proteína X heteróloga. El dominio de activación de GAL4 retiene sus propiedades de activación transcripcionales cuando está fusionado a una proteína Y heteróloga. Las dos proteínas de fusión o híbridas son co-expresadas en levadura. Si existe una interacción entre la proteína X y la proteína Y, la asociación llevará el dominio de activación de GAL4 en asociación cercana con su dominio de unión, reconstruyendo de esta manera un activador transcripcional funcional. Este activador transcripcional reconstituido puede entonces impulsar la expresión de un número de genes reporteros, integrados en el genoma de la levadura, el cual contiene el sitio de unión para el dominio de unión del ADN. De esta manera, la expresión del gene reportero es indicativo de una interacción entre la proteína X y la proteína Y. El sistema Y2H ofrece varias ventajas sobre métodos más tradicionales para el estudio de las interacciones proteína-proteína (Luban et al, Curr. Opin. Biotech., 6:59-64 (1995)). Primera, no se requiere de la manipulación detallada y laboriosa de las condiciones necesarias para los ensayos de unión bioquímica in vitro puesto que la interacción ocurre in vivo. Segunda, el sistema Y2H es altamente sensible, y puede detectar interacciones no reveladas por otros métodos (Fields et al, Trends in Genetics, 10:286-291 (1994)).

Finalmente, el sistema Y2H es particularmente poderoso cuando se utiliza para tamizar una biblioteca de ADNc para proteínas codificadas que interactúan con un proteína de interés.

Además del sistema Y2H, un sistema de dos híbridos de mamífero también puede ser utilizado para estudiar las interacciones entre MK2 y otra proteína. Por ejemplo, las células 293T pueden ser transfectadas con: un plásmido que contiene una secuencia de ADN que se une a GAL4 corriente arriba de un gene reportero tal como la luciferasa o la acetil transferasa de cloremfenicol (CAT); un plásmido que contiene ADNc que codifica para MK2 fusionado al dominio de unión de ADN de GAL4; y un plásmido que contiene ADNc que codifica para una proteína que interactúa con MK2, según se identifica a través de Y2H, o una proteína de interacción con MK2 putativa, fusionada al activador de VP16. Las células transfectadas son Usadas subsecuentemente a la co-expresión de MK2 y la proteína de interacción y los lisatos son probados en cuanto a la actividad del gene reportero, el cual sería detectado solo cuando la MK2 interactúa con la proteína. Mediante este ensayo, puede ser confirmada la interacción entre MK2 y una proteína en células de mamífero. El sistema de dos híbridos de mamífero también puede ser utilizado para validar la interacción entre MK2 y otra proteína, según se identifica a través del sistema Y2H. En adición al uso de los sistemas de co-inmunoprecipitación o de dos híbridos, uno puede utilizar un tamizaje de baja astringencia de una biblioteca de ADNc, o utilizar técnicas de PCR de degeneración empleando una sonda dirigida hacia una secuencia de codificación de un dominio de unión de MK2 de una proteína que se une a M 2. Conforme más información genómica se hace disponible, podrán ser utilizadas búsquedas por similitud utilizando un número de programas de análisis y perfilado de secuencias, tales como el MotifSearch (Genetics Computer Group, Madison, WI), ProfileSearch (GCG), y BLAST (NCB) para encontrar proteínas nuevas que contengan secuencias con homología importante con dominios de unión de MK2 de proteínas que se unen a MK2. Uno también puede utilizar planteamientos de proteómica para identificar proteínas de interacción con MK2, como se muestra en el Ejemplo 11, se colocaron en placa células de tipo silvestre (+/+) o deficientes MK2 (-/-) y se marcaron con 33P. Se activó la MK2 durante 30 minutos enseguida de los cuales se prepararon lisatos de célula entera y se analizaron usando electroforesis en gel en dos dimensiones. Los geles fueron comparados para identificar proteínas fosforiladas diferencialmente. La Figura 12 muestra una proteína fosforilada diferencialmente (flecha) usando este planteamiento. Las proteínas fosforiladas diferencialmente también pueden ser identificadas usando espectrometría de masa. Una proteína que se une a MK2 puede estimular la MK2, inhibir la MK2, o no tener ningún efectos sobre la actiyidad de la MK2. Existen varias formas de investigar si una proteína que se une a MK2 causa una inhibición o una estimulación de MK2, teniendo de esta manera actividad biológica. Las proteínas que se unen a MK2 y que producen un cambio en la actividad de la MK2, particularmente una disminución en la actividad de la MK2, son candidatos particularmente buenos para usarse como agentes terapéuticos y como inhibidores de la inflamación. Además, puede encontrarse que un fragmento o muíante de una proteína que estimula de manera natural la MK2 inhiba la MK2, y de esta manera sería un candidato como inhibidor de la inflamación. Por ejemplo, una vez que se identifica una proteína que se une a MK2 y que demuestra que estimula la MK2, pueden hacerse mutaciones de esa proteína, de forma tal que la proteína todavía interactúe con la MK2 pero que tenga un efecto inhibidor en la actividad de la MK2. Las formas mutantes de una proteína de interacción con MK2 pueden ser probadas en cuanto a un efecto sobre la actividad de la MK2 en uno o más de los ensayos que aquí mismo se proveen. Las proteínas que se unen a MK2 pero que no tienen ningún efecto sobre su actividad también pueden ser utilizadas como agentes terapéuticos. Tales proteínas pueden, por ejemplo, competir con proteínas endógenas que normalmente se unen a MK2 para estimular la actividad de la M 2. Para investigar si una proteína que se une a MK2 afecta su actividad, uno podría determinar el efecto de las proteínas de unión sobre la actividad de la MK2 tal como, por ejemplo, la actividad de la quinasa MK2. Por ejemplo, una proteína de interacción con MK2 etiquetada con HA (por ejemplo, Shc) y MK2 etiquetada con Myc pueden ser co-expresadas en células 293T. Se preparan lisatos de célula y se resuelven mediante SDS-PAGE. El inmunomanchado subsiguiente con un anticuerpo para detectar MK2 activada (por ejemplo, anti-treonina 334 de fosfo MK2) determinará el estado de activación de la MK2. Alternativamente, el efecto de la unión MK2 en la actividad de la quinasa de MK2 puede ser determinado cuantificando la cantidad de forma fosforilada de un sustrato conocido para MK2.

En adición, uno podría determinar el efecto de una proteína de interacción con M 2 en la biosíntesis de TNF-a, como se ejemplifica en el Ejemplo 9, Una proteína de interacción con MK2 etiquetada con HA (por ejemplo, S c) y MK2 etiquetada con Myc pueden ser co-transfectadas en células apropiadas tales como RAW, conjuntamente con un gen reportero de luciferasa de TNF. Las células son ya sea desestimuladas o estimuladas mediante anisomicina. Se recolecta medio para probar en cuanto a la producción de' TNF y se preparan lisatos de célula para determinar actividad de luciferasa. La biosíntesis de TNF en la presencia de una proteína de unión de MK2 se compara con aquella de una muestra de control. Como se ejemplifica en el Ejemplo 10, uno podría determinar también el efecto de MK2 en el estado de fosforilación de un proteína de interacción con MK2. Una proteína de interacción con MK2 etiquetada con HA (por ejemplo, Shc) es expresada en células 293T. Se preparan lisatos y se inmunoprecipitan con un anticuerpo de anti-HA. Los inmunuprecipitados son utilizados en un ensayo de quinasa in vitro con MK2 recombinante como la quinasa. El SDS-PAGE seguido de fosfo-imageología se utiliza para detectar la fosforilación de la proteína de interacción con MK2. B. Secuencias de Nucleótidos y Proteínas Si bien no siempre es necesario, si se quiere, alguien con conocimientos normales en la materia puede determinar las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico de nuevas proteínas que se unan a MK2. Por ejemplo, la presente invención provee las secuencias d ADNc que codifican para STS, HPH2 y Shc (Figuras 1 A y IB; 2A y 2B; 3A y 3B; y las SEQ ID NO: 1-3). La presente invención también proporciona las correspondientes secuencias de aminoácidos de estas proteínas (Figuras 4-6, SEQ ID NO: 4-6). La presente invención también incluye variantes de empalme, truncaciones, fragmentos, sustituciones, mutaciones de adición y supresión, proteínas de fusión, mutantes de purga, secuencias motivo, y homólogos de tales secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos puede comprender una secuencia de cuando menos 70 a 79% de identidad con la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de la proteína natural, o ser cuando menos de 80% a 89% idéntica, o cuando menos de 90% a 95% idéntica, o cuando menos de 96% a 100% idéntica. Alguien capacitado en la técnica reconocerá que la región que se une a M 2 puede tolerar menos variación de secuencia que las otras porciones de la proteína que no están involucradas en la unión. De esta manera, estas regiones de no-unión de una proteína de interacción con MK2 pueden contener variaciones substanciales sin alterar de manera importante la unión de la proteína a MK2. Sin embargo, alguien capacitado en la técnica también reconocerá que pueden hacerse muchos cambios para aumentar de manera específica la afinidad de la proteína por ese objetivo. Tales cambios que aumentan la afinidad se determinan típicamente en forma empírica mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, dentro de la región de unión de MK2, y probando la capacidad de la proteína para unirse a MK2 o determinando la fuerza de dicha unión. La totalidad de tales modificaciones, sea que estén dentro o fuera de la región de unión de M 2 dentro de una proteína, están incluidas en el alcance de la presente invención. Alguien capacitado en la técnica reconocerá que las proteínas que se unen a MK2 pueden contener cualquier número de cambios conservativos en sus respectivas secuencias de aminoácidos sin modificar sus propiedades biológicas. Tales modificaciones conservativas de aminoácidos están basadas en la relativa similitud de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilidad, carga, tamaño y similares. Sustituciones conservativas ejemplificativas de tales características bajo consideración se conocen bien por aquellos que están capacitados en la técnica e incluyen, por ejemplo, arginina a lisina o lisina a arginina; glutamato a aspartato o aspartato a glutamato; serina a treonina o treonina a serina; glutamina a asparragina o asparragina a glutamina; valina a leucina o isoluecina, leucina a valina o isoleucina, e isoleucina a valina o leucina. Adicionalmente, las proteínas que se unen a MK2 pueden se utilizadas para generar fragmentos funcionales que se unen e inhiben la actividad de la MK2. La similitud o identidad de secuencia relativa puede ser determinada usando los programas "Best Fit" o "Gap" del Sequence Analysis Software PackageMR (Versión 10; Genetics Computer Group, Inc. University of Wisconsin Biotecnology Center, Madison, WI). "Gap" utiliza el algoritmo de Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias que maximiza el número de empates y minimiza en número de grietas. "Best Fit" realiza un alineamiento óptimo del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Los alineamientos óptimos se encuentran insertando grietas para maximizar el número de empates usando el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (Smith and Waterman, J. Theor. Biol, 91(2):379-1981). El Sequence Analysis Software Package anteriormente mencionado contiene un número de herramientas útiles de análisis de secuencia para identificar homólogos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos que se describen en la presente. Por ejemplo, el programa "BLAST" (Altschul et al, J. Mol. Biol, 215(3):403-10 (1991)) investiga en cuanto a secuencias similares a una secuencia pregunta (ya sea de péptido o ácido nucleico) en una base de datos específica (por ejemplo, bases de datos de secuencias que se mantienen en el NCBI; "FastA" (Lipman and Pearson, Science, 227(4693): 1435-41 (1985); Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sel U.S.A. (8):2444-8 (1988)) lleva a cabo una búsqueda de Pearson and Lipman en cuanto a similitud entre una secuencia pregunta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína); "TfastA" realiza una búsqueda de Pearson and Lipman en cuanto a similitud entre una secuencia pregunta de una proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos (traduce las secuencias de nucleótidos en la totalidad de seis marcos de lectura antes de realizar la comparación); "FastX" lleva a cabo una búsqueda de Pearson and Lipman en cuanto a similitud entre una secuencia pregunta de nucleótido y un grupo de secuencias de proteína, tomando en cuenta desplazamientos de marco. "TfastX" lleva a cabo una búsqueda de Pearson and Lipman en cuanto a similitud entre una secuencia pregunta de proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótido, tomando en cuenta desplazamientos de marco (traduce ambas cadenas de la secuencia de ácido nucleico antes de llevar a cabo la comparación). La invención abarca fragmentos de proteínas que se unen a M 2. Tales f agmentos muy probablemente incluirán la totalidad o una parte de la región de unión de MK2 en la proteína. Los fragmentos pueden incluir toda, una parte o nada de las secuencias entre la región que se une a MK2 y las terminación N de la proteína y/o entre la región que se une a MK2 y la terminación C de la proteína. Es comprensible para alguien con conocimientos normales en la materia que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una proteína sin afectar de manera adversa la actividad de la proteína, por ejemplo, las características de unión de una proteína que se une a MK2. De esta manera, se contempla por los inventores que pueden hacerse varios cambios en las secuencias de aminoácidos de proteínas que se unen a MK2, o en las secuencias de ADN que codifican para las proteínas, sin pérdida apreciable de sus utilidades biológicas o su actividad. Tales cambios pueden incluir variantes de empalme, truncaciones, fragmentos, sustituciones, mutaciones de adición y supresión, proteínas de fusión, mutantes de purga y secuencia de motivo, así como homólogos, y similares. En la hechura de tales cambios el índice hidropático de los aminoácidos puede ser considerado. Generalmente se entiende en la técnica la importancia del índice de aminoácido hidropático en conferir una función biológica de una proteína (Kyle and Doolittle, J. Mol. BioL, 157: 105-132 (1982)). Se acepta que el carácter hidropático relativo de un aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, la cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se la ha asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga; y estos son isoleucina (+4.5), valina (+4.2), leucina (+3.8), fenilalanina (+2.8), cisteina/ cistina (+2.5), metionina (+1.9), alanina (+1.8), glicina (-0.4), treonina (-0.7), serina (-0.8), triptófano (-0.9), tirosina (-1.3), prolina (-1,6), histidina (-3.2), glutamato (-3.5), glutamina (-3.5), aspartato (-3.5), asparragina (-3.5), lisina (-3.9), y arginina (-4.5). En la hechura de tales cambios, los índices hidropáticos de aminoácido sustituidos pueden estar dentro de ±2, dentro de±l, y dentro de ±0.5 de los aminoácidos que son reemplazados. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede ser hecha de manera efectiva sobre la base de la hidrofilidad. La patente de los Estados Unidos de América No. 4,554,101 manifiesta que la hidrofilidad promedio local más grande de una proteína, según está gobernada por la hidrofilidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de los Estados Unidos de América No. 4,554,101, los siguientes valores de hidrofilidad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0), lisina (+3.0), aspartato (+3.0±1), glutamato (+3.0+1), serina (+3.0), asparragina (+0.2), glutamina (+0.2), glicina (0), treonina (-0.4), prolina (-0.5+1), alanina (-0.5), histidina (-0.5), cisteina (-1.0), metionina (-1.3), valina (-1.5), leucina (-1.8), isoleucina (-1.8), tirosina (-2.3), fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4). En la hechura de tales cambios, los índices hidropáticos de aminoácidos sustituidos pueden estar dentro de ±2, dentro de ±1, y dentro de±0.5 de los aminoácidos que fueron reemplazados. Las modificaciones pueden ser conservativas de forma tal que la estructura o la función biológica no sea afectada por el cambio. Tales modificaciones conservativas de los aminoácidos están basadas en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, la hidrofobicidad, hidroñlidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones conservativas ejemplificativas que toman en consideración varias de las características precedentes se conocen bien en la técnica por aquellos capacitados en la materia e incluyen por ejemplo, arginina a lisina o lisina a arginina; glutamato a aspartato o aspartato a glutamato; serina a treonina o treonina a serina; glutamina a asparragina o asparragina a glutamina; valina a leucina o isoluecina, leucina a valina o isoleucina, e isoleucina a valina o leucina. Las secuencias de aminoácidos de proteínas que se unen a MK2 pueden se modificadas para que tengan cualquier número de cambios conservativos, en tanto que la unión de la proteína a MK2 no sea afectada de manera adversa. Tales cambios pueden ser introducidos dentro o fuera de una porción de la proteína que se une al blanco. Por ejemplo, los cambios introducidos dentro de la porción de unión de la proteína pueden ser diseñados para aumentar la afinidad de la proteína a su blanco. C. Modificaciones de la Estabilidad Las modificaciones estabilizadoras son capaces de estabilizar una proteína, mejorando la vida media in vitro y/o in vivo de una proteína, aumentando la vida media de circulación de una proteína y/o reduciendo la degradación proteolítica de una proteína. Tales modificaciones de la estabilidad incluyen, pero no se limitan a proteínas de fusión, modificación de un sitio de glucosilación, y modificación de la fracción carbohidrato. Como se conoce bien en la técnica, las proteínas de fusión se preparan de forma tal que una segunda proteína se fusiona en marco con una primera proteína resultando en una proteína traducida que comprende tanto la primera como la segunda proteína. Por ejemplo, en la presente invención, una proteína de fusión puede ser preparada de tal manera que una proteína que se une a MK2 es fusionada a una segunda proteína (por ejemplo, un porción de proteína de estabilización). Como se reconocerá por alguien con conocimientos normales en la materia, dicha proteína de fusión puede comprender de manera opcional un péptido ligador entre la proteína que se une a MK2 y la porción de la proteína de estabilización. Una proteína de estabilización puede ser cualquier proteína que aumente la estabilidad global de la proteína que se une a MK2. Las proteínas que unen a MK2 puede ser glucosiladas o ser ligadas a albúmina o un polímero no proteináceo. Por ejemplo, las proteínas que se unen a MK2 pueden ser ligadas a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilen glicol, polipropilen glicol, o polioxialquilenolenos, en la forma que se establece en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,640,835; 4,791,192 o 5,414,135. Las proteínas son químicamente modificadas mediante conjugación covalente a un polímero para aumentar su vida media en circulación, por ejemplo. En las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,766,106 y 4,609,546 también se muestran polímeros y métodos para unirlas a dichos péptidos. Las proteínas que se unen a MK2 pueden ser estabilizadas preparando una proteína de fusión que comprende una proteína que se une a MK2 y una secuencia de inmunoglobulina, como se ejemplifica en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,864,020. La secuencia de inmunoglobulina preferiblemente, pero no de manera necesaria, en un dominio constante de inmunoglobulina. La fracción de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención pueden ser obtenidas a partir de los subtipos de IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferiblemente IgG-1 o IgG-3. En una modalidad, el fragmento Fe de IgG se fusiona a la proteína que se une a MK2. Las proteínas que se unen a MK2 pueden ser PEGiladas. La PEGilación es un proceso por medio del cual el polietilen glicol (PEG) es unido a una proteína con el fin de alargar la vida media de la proteína en el cuerpo. La PEGilación de proteínas que se unen a MK2 puede disminuir la dosis o frecuencia de administración de las proteínas que se necesitan para una disminución óptima de la inflamación. En Bhadra et al., Pharmazie, 57: 5-29 (2002), y en Harris et al, Clin. Pharmacokinet, 40: 539-551 (2001) se proveen revisiones de la técnica. Las proteínas que se unen a MK2 pueden ser modificadas para que tengan un patrón de glucosilación modificado (esto es, alterado del patrón de glucosilación original o natural). Como se emplea aquí, el término "alterado" significa que tiene una o más fracciones carbohidrato suprimidas y/o que tiene cuando menos un sitio de glucosilación agregado a la proteína original.

La glucosilación de proteínas es típicamente ya sea ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión de la tracción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias de tripéptido, asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción del hidrato de carbono a la cadena lateral de asparragina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede ser utilizada la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glucosilación a proteínas que se unen a MK2 es llevada a cabo de manera conveniente mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de forma tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también puede ser hecha mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos serina o treonina en la secuencia de la proteína original (para sitios de glucosilación ligados a O). La secuencia de aminoácidos de la proteína también puede ser alterada introduciendo cambios al nivel del ADN. Otros medios para incrementar en número de fracciones de hidratos de carbono en proteínas es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a los residuos aminoácido de la proteína. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, los azúcares pueden ser unidos a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisterna, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en la publicación WO 87/05330, y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306 (1981). La remoción de cualesquiera fracciones de hidrato de carbono presentes en las proteínas que se unen a MK2 puede ser llevada a cabo químicamente o en forma enzimática. La desglucosilación química requiere de la exposición de la proteína a ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la separación de la mayoría de la totalidad de los azúcares excepto el azúcar ligador (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacta la secuencia de aminoácidos.

La desglucosilación química se describe por Hakimuddin et al, Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987), y Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La separación enzimática de las fracciones de hidrato de carbono en proteínas puede ser lograda mediante el uso de una variedad de endo y exo-glucosidasas como se describe en Thotakura et al, Meth. Enzymol, 138: 350 (1987). Las proteínas que se unen a M 2 puede ser ligadas a la proteína albúmina o un derivado de albúmina. Los métodos para ligar proteínas y polipéptidos a albúmina o derivados de albúmina se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5, 116,944. D. Tamizaje de Compuestos que Modulan la Actividad de MK2 1. Uso del Sistema de Doble Híbrido de Levadura para Tamizaje de Fármacos La presente invención también provee métodos para el tamizaje de fármacos que modulan la actividad de la MK2, incluyendo pero no limitándose a, anticuerpos, agentes químicos, pequeñas moléculas, proteínas y péptidos. En algunas modalidades, una vez que se ha detectado una interacción de proteína-proteína entre MK2 y otra proteína mediante Y2H, la interacción proteína-proteína en Y2H puede ser utilizada para un tamizaje de fármacos de alto rendimiento. Por ejemplo, una vez que se ha detectado una interacción proteína-proteína, las colonias de levadura positivas (identificadas mediante color y crecimiento, como se describió) que albergan las dos proteínas tales como MK2 y una proteína de interacción, pueden ser tratadas con un fármaco que incluye anticuerpos, agentes químicos, péptidos, proteínas o pequeñas moléculas. Un cambio en el color o el crecimiento de las colonias de levadura positivas en la presencia del fármaco podría ser indicativo de un efecto en la interacción entre las dos proteínas. En algunas modalidades, una proteína de interacción con MK2 estimula la actividad de la MK2, lo cual tiene un efecto pro-inflamatorio en un hospedero incluyendo un célula, un tejido o un organismos completo. Por lo tanto, sería deseable identificar fármacos que destruyeran dicha interacción. En consecuencia, el sistema Y2H puede ser utilizado para identificar fármacos que destruirían la interacción entre MK2 y una proteína que estimula la actividad de la MK2, conduciendo de esta manera al uso de dichos fármacos en el tratamiento o prevención de la inflamación. En otras modalidades, una proteína de interacción con MK2 inhibe la actividad de la MK2, resultando en un efecto anti-inflamatorio en un hospedero que incluye una célula, un tejido o un organismo completo. En dicho caso, el sistema Y2H puede ser usado para identificar fármacos que fortalecen dicha interacción, lo cual puede ser monitoreado mediante cambios de color y crecimiento de células de levadura que albergan las dos proteínas, como se describe aquí mismo. Dicho fármaco puede ser usando posteriormente en el tratamiento o prevención de la inflamación. Como se describió anteriormente, en el caso de ciertas condiciones tales como ciertas infecciones bacterianas, es deseable tener actividad de M 2 aumentada. En consecuencia, el sistema Y2H puede ser usado también para el tamizaje de fármacos que fortalezcan la interacción entre MK2 y una proteína de interacción, resultando en una actividad de MK2 aumentada, y subsecuentemente una resistencia mejorada a la infección bacteriana. Tales fármacos pueden ser utilizados para el tratamiento o prevención de, por ejemplo, ciertas infecciones bacterianas tales como la infección de monocitogenes de Listeria. 2. Uso de un Sistema de Reconstitución In Vitro para Tamizaje de Fármacos También puede usarse un sistema de reconstitución in vitro para la identificación de fármacos que incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas, anticuerpos, péptidos y agentes químicos que modulan la actividad de la MK2. Por ejemplo, enseguida a la identificación de una interacción proteína-proteína por cualquiera de los ensayos que aquí se proporcionan, las proteínas pueden ser tratadas en vitro con fármacos que inhibirán la interacción entre las dos proteínas. Como se describió anteriormente, es deseable identificar fármacos que inhiban la interacción entre MK2 y otra proteína, en donde dicha interacción estimula la actividad de MK2. Además, un sistema de reconstitución in vitro puede ser usado para formar y aislar complejos de proteínas que incluyan MK2 y cuando menos una proteína de interacción con MK2. Estos complejos pueden posteriormente ser utilizados para la identificación de compuestos que inhiban o promuevan la formación de complejos, modulando de esta manera la inflamación y/o inhibiendo o estimulando la actividad de MK2 en el complejo, modulando de esta manera la inflamación.

La MK2 y una proteína de interacción son sintetizadas y marcadas con 35S en un sistema de traducción in vitro tal como el sistema de traducción por transcripción acoplado a lisato de reticulocito de conejo suministrado por Promega (Madison, WI), la interacción entre MK2 y la proteína es confirmada mediante co-inmunoprecipitación como se describió. Alternativamente, puede producirse MK2 recombinante y una proteína de interacción usando un sistema de expresión tal como células de insecto de baculovirus o E. coli. La interacción entre estas dos proteínas puede ser detectada mediante ensayos pull-down similares a la co-inmunoprecipitación, ELISA o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). Un compuesto de prueba es agregado a la mezcla de proteínas traducidas in vitro y se lleva a cabo la inmunoprecipitación como se describió. Un compuesto deseable es uno que inhibe la interacción entre MK2 y la proteína, según se determina por la carencia de interacción o la interacción reducida en un ensayo de inmunoprecipitación o un ensayo pull-down en el caso de proteínas producidas de manera recombinante. Dicho compuesto puede ser utilizado de manera subsiguiente para el tratamiento o prevención de la inflamación. Los ejemplos de los compuestos que pueden ser probados en cuanto a sus efectos sobre la inflamación en los ensayos de la invención incluyen a agentes químicos, pequeñas moléculas, péptidos, proteínas y anticuerpos. También puede usarse un sistema de reconstitución in vitro para la identificación de compuestos que se unen a MK2 y que inhiben la actividad de la MK2. Por ejemplo, MK2 traducida in vitro o M 2 purificada puede ser incubada con un compuesto y posteriormente probada en cuanto a su capacidad ya sea de fosforilar un sustrato conocido tal como Hsp 27 o de incrementar la biosíntesis del TNF-a, como se describe aquí mismo. Sin embargo, puede usarse cualquier ensayo que mida la actividad de la MK2. De esta manera, aquellos compuestos que inhiban la actividad de la MK2 son identificados como fármacos que pueden ser utilizados para la inhibición o prevención de la inflamación. Por lo tanto, los compuestos que aumentan la actividad de MK2 pueden ser usados para el Ixatamiento de ciertas condiciones en donde se desea un aumento en la actividad de la MK2. E. Composiciones Farmacéuticas La presente invención provee composiciones que incluyen proteínas que se unen a MK2. Tales composiciones pueden ser adecuadas para uso farmacéutico y para la administración a pacientes. Las composiciones típicamente contienen una o más proteínas que se unen a MK2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también incluyen complejos de proteínas que contienen MK2 y cuando menos una proteína de interacción con MK2. Como se emplea aquí, la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifimgi, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, que sean compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionen función terapéutica complementaria, adicional o mejorada. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar incluidas en un recipiente, paquete o despachador conjuntamente con las instrucciones para su administración. Las composiciones farmacéuticas de la invención también incluyen composiciones que comprenden compuestos que incluyen pequeñas moléculas, anticuerpos, agentes químicos, proteínas y péptidos que son identificados por uno o más métodos de los que se han descrito aquí mismo. Las dosis apropiadas para la administración de estos compuestos para el tratamiento o prevención de la inflamación pueden ser determinadas fácilmente por un médico. Los ejemplos de dosis incluyen, pero no se limitan a 5 mg a 500 mg, 50 mg a 250 mg, 100 mg a 200 mg, 50 mg a 100 mg, 15 mg a 85 mg, 30 mg a 70 mg, y 40 mg a 60 mg. Una composición farmacéutica de la invención está formulada para que sea compatible con la ruta de administración que se tiene pensada. Los métodos para llevar a cabo la administración se conocen por aquellos capacitados en la técnica. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación subcutánea típicamente incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como el alcohol de bencilo o parabenos de metilo; antioxidantes tales como el ácido ascórbico o el bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etilendiaminotetraacético; reguladores tales como los acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio. Tales preparaciones pueden estar encerradas en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacterioestática, Cremophor E ^ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina regulada de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe fluir al grado de que exista un fácil manejo con la jeringa. Debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador debe ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares), así como mezclas adecuadas de éstos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como la lecitina, mediante la conservación del tamaño de partícula requerida en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos o anti-hongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como el manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede fomentarse mediante la inclusión en la composición de una agente que demore la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. En ciertas modalidades, las proteínas que se unen a MK2 se preparan con portadores que protegerán la proteína contra de la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el vinil acetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Para aquellos capacitados en la técnica serán claros los métodos para la preparación de tales formulaciones. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente en Alza Corporation (Mountain View, CA) y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden utilizarse como portadores farmacéuticamente aceptables a las suspensiones liposomales que contengan proteínas que se unan a M 2. Estas pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos que se conocen por aquellos capacitados en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos de América número 4,522,811. Agentes terapéuticamente útiles y adicionales, que sean benéficos para la condición que está siendo tratada, pueden opcionalmente ser incluidos en o administrados simultáneamente o secuencialmente con las proteínas que se unen a MK2. Es especialmente ventajoso el formular composiciones en forma de dosis unitaria para una fácil administración y para uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que va a ser tratado; cada unidad contiene típicamente una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, así como de las limitaciones inherentes en la técnica de la formulación de combinados de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. F. Indicaciones de Tratamiento Los compuestos que interactúan con cuando menos uno de MK2 o un complejo de MK2 son útiles para prevenir, diagnosticar o tratar varios desórdenes médicos en seres humano o animales. En consecuencia, la presente invención provee un método para tratar condiciones relacionados con la inflamación, mediante la administración a un sujeto de una composición que comprende cuando menos un compuesto (tal como una proteína, péptido, anticuerpo, agente químico, y pequeña molécula) que interactúa con cuando menos una de MK2 o un complejo de MK2 en una cantidad suficiente para aliviar los síntomas de la condición. Tales desórdenes incluyen enfermedad de Crohn, enfermedad de intestino inflamado, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, enfisema, reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, asma, lupus sistémico eritematoso, e inflamación debida a traumatismo, daño o ataque súbito. G. Métodos de Tratamiento Usando Complejos que Interactúan con MK2 o un Complejo de MK2 Los compuestos que interactúan con MK2 o un complejo de MK2, y modulan la actividad de M 2 pueden ser utilizadas para inhibir o reducir uno más síntomas asociados con la inflamación. En una modalidad, la inflamación es inhibida en cuando menos 50%, o cuando menos 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 u 88%, o cuando menos 90, 91, 92, 93 o 94%, o cuando menos 95 a 100%. Los compuestos pueden ser utilizados en forma individual o en combinación. Las preparaciones farmacéuticas que comprenden compuestos como se describen aquí mismo, se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Un compuesto que modula la actividad de MK2 puede ser seleccionada de una proteína, un péptido, un anticuerpo, un agente químico o una pequeña molécula. Como se emplea aquí, una "cantidad efectiva" del compuesto es una dosis que es suficiente para reducir la inflamación para lograr una respuesta biológica deseada. Tales mejoras pueden ser medidas por una variedad de métodos que incluyen aquellos que miden los síntomas tales como el dolor, hinchazón, o enrojecimiento. Por ejemplo, una puntuación del American College of Rheumatology (ACR) se utiliza para medir la inflamación en artritis reumatoide. Una puntuación ACR se define como >20%, 50% o 70% de mejoramiento en la cuenta de articulación hinchada y articulación blanda más >20%, 50% o 70% de mejoramiento en cuando menos 3 de los siguientes criterios: evaluación del dolor del paciente, evaluación global del médico y el paciente, incapacidad de auto-evaluada del paciente, y fase reactante aguda (velocidad de sedimentación de eritrocitos y nivel de proteína reactiva C). Sin embargo, se entiende que un médico será capaz de diagnosticar y medir la inflamación en cualquier desorden y de determinar si se logra una disminución en la inflamación usando un fármaco anti-inflamatorio identificado usando los métodos de la invención. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad, peso, condición física y sexo del sujeto, así como también con la severidad de la condición médica en dicho sujeto. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según se requiera, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Las dosis apropiadas para la administración de cuando menos un compuesto que interactúa con MK2 o un complejo de MK2, y que modula la actividad de la MK2, pueden variar de 5 mg a 500 mg, 50 mg a 250 mg, 100 mg a 200 mg, 50 mg a 100 mg, 15 mg a 85 mg, 30 mg a 70 mg, y 40 mg a 60 mg. Estos compuestos pueden ser administrados en una dosis, o a intervalos tales como una vez al día, una vez a la semana, y una vez al mes. Los programas de dosificación pueden ser ajustados dependiendo de la capacidad de la proteína para disminuir la inflamación, la vida media de la proteína, o la severidad de la condición del paciente. Generalmente las composiciones se administran como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes de estos compuestos para la extensión de tiempo más grande después de la dosis. También puede ser utilizada la infusión continua después de la dosis de bolo. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales proteínas y compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células para determinar un efecto de las proteínas o compuestos en la expresión o actividad de la citosina. También podrían realizarse experimentos en animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y para la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Pueden usarse en los métodos de tratamiento de la presente invención compuestos que interactúan con la MK2 o un complejo de MK2, y que modulan la actividad de la MK2, incluyendo pero no limitándose a, péptidos, proteínas, anticuerpos, agentes químicos y pequeñas moléculas, y que presentan grandes índices terapéuticos. Pueden utilizarse los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos de células y estudios en animales, en la evaluación de un intervalo de dosis para uso en seres humanos. La dosificación de tales proteínas y compuestos puede caer dentro de un intervalo de concentraciones circulatorias que incluyen el valor de la ED50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto que interactúa con MK2 o un complejo de MK2, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos en cultivos de células como se describió anteriormente. Una dosis puede ser formulada en modelos de animal para lograr un intervalo de concentración de plasma circulatoria que incluya el valor del ICs0 (esto es, la concentración de la proteína de prueba que logra una inhibición media-máxima de los síntomas) según se determina en un cultivo de células. Los niveles en plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosis particular pueden ser monitoreados mediante un bioensayo adecuado. Métodos de Tratamiento Usando Células Otra forma de administrar proteínas, péptidos o anticuerpos que interactúan con MK2 o un complejo de MK2, y que modulan la actividad de la MK2, a un hospedero consiste en administrar células que expresan estos compuestos. Pueden utilizarse varios métodos para liberar células que expresan proteínas, péptidos o anticuerpos a un sitio para que se utilicen para modular la inflamación. En una modalidad de la invención, las células que expresan una proteína, péptido o anticuerpo puede ser administrada mediante liberación para blanco objetivo, por ejemplo, inyección directa de una muestra de dichas células dentro de un sitio específico en un tejido que tiene inflamación. Estas células pueden ser liberadas en un medio o matriz que impida parcialmente su movilidad de manera que localice las células hacia un sitio de interés. Dicho medio o matriz podría ser semi-sólida, tal como una pasta o gel, incluyendo un polímero similar a gel. Alternativamente, el medio o matriz podría estar en la forma de un sólido, un sólido poroso que permitirá la migración de células dentro de la matriz sólida, y las mantenga allí mientras permite la proliferación de las células. En algunas modalidades, una célula hospedera incluye un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido de MK2 recombinante y un segundo ácido nucleico que codifica para una proteína de interacción con MK2 tal como, por ejemplo, STS, HPH2 y Shc. Un complejo de MK2 que contiene MK2 y cuando menos alguna otra proteína puede de manera consecuente ser aislada de la célula hospedera. I. Métodos de Expresión de ADN en un Célula Puede introducirse en un célula ADN que codifica para proteínas, péptidos y anticuerpos que interactúan con MK2 o un complejo de MK2, y que modulan la actividad de la MK2. Las proteínas, péptidos y anticuerpos codificados por el ADN pueden entonces ser expresados en dicha célula. En algunas modalidades de la invención, una molécula de ADN que codifica para una proteína, péptido o anticuerpo que interactúa con MK2 o un complejo de MK2, modulando de esta manera la actividad de la MK2, podría ser introducida dentro de una célula con el fin de alterar la producción o actividad de las citocinas en la célula. Específicamente, una molécula de ADN que codifica para una proteína, péptido o anticuerpo podría ser introducida en una célula para reducir o inhibir la producción o actividad de citocinas. Puesto que los retrovirus recombinantes son defectuosos, estos requieren de líneas celulares auxiliadoras que contienen plásmidos que codifican para la totalidad de los genes estructurales de un retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro de las largas secuencias repetidas terminales de los virus. Estos plásmidos carecen de un secuencia de nucleótidos que haga posible que el mecanismo de empaque reconozca un transcripto de AJ N para encapsulación. Las líneas celulares auxiliadoras que tienen deleciones de la señal de empaque incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, PSI.2, PA317 y PA12. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, puesto que ningún genoma está empacado. Si un vector retroviral es introducido dentro de dichas células en la que la señal de empaque está intacta, pero los genes estructurales están reemplazados con otros genes de interés, el vector puede ser empacado y el virion del vector producido. Alternativamente, un segundo tipo de células en cultivo de tejido pueden ser transfectadas directamente con un plásmido que codifica para genes gag, pol ar y env estructurales retrovirales, mediante transfección convencional de fosfato de calcio. Estas células son entonces transfectadas con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral dentro del medio de cultivo, y los vectores son posteriormente introducidos dentro de células apropiadas. Otro sistema de liberación marcado como blanco para un polinucleótido que codifica para una proteína, péptido o anticuerpo es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas, y sistemas de base lípido que incluyen emulsiones aceite en agua, micelas, mácelas mezcladas y liposomas. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de liberación. Puede encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y ser liberados a las células en una forma biológicamente activa (Ver, por ejemplo, Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981). Se conocen bien en la técnica métodos para la transferencia eficiente de genes en una célula utilizando un vehículo de liposoma, (ver, por ejemplo, Mannino, et al., Biotechniqu.es, 6:682). La composición del liposoma usualmente incluye una combinación de fosfolípidos, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y de la presencia de cationes divalentes. Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen a los compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfíngolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen a la fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y a la diesteroilfosfatidilcolina. J. Métodos de Expresión de ADN en un Tejido, Órgano u Organismo Puede introducirse en un célula dentro de un tejido, órgano o un organismo, ADN que codifica para proteínas que se unen a MK2, incluyendo anticuerpos, y ADN que codifica para proteínas, péptidos y anticuerpos que modulan la actividad de la MK2 mediante la unión de un complejo de MK2. Las proteínas, péptidos y anticuerpos codificados por el ADN pueden entonces ser expresados en dicha célula del tejido, órgano u organismo. En una modalidad de la invención, ADN que codifica para proteínas, péptidos o anticuerpos podría ser introducido a una célula con el fin de alterar la producción o actividad de las citocinas en las células del tejido, órgano u organismo. Este método podría ser utilizado para disminuir la inflamación en tejidos, órganos u organismos. La Invención es útil para el tratamiento de condiciones tales como la enfermedad de Crohn, enfermedad de intestino inflamado, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfisema, reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, asma, lupus sistémico eritematoso, e inflamación debida a traumatismo, daño o ataque súbito. En una modalidad de la invención, ADN que codifica para proteínas, péptidos y anticuerpos que interactúan con MK2 o un complejo de MK2, y que modulan la actividad de la MK2, puede ser marcado como blanco para un tipo de célula específica de interés. El tipo de célula puede ser un componente de un tejido, órgano u organismo. Mediante la inserción de una secuencia de interés dentro del vector viral, conjuntamente con otro gene que codifica para el ligando para un receptor en una célula blanco específica, por ejemplo, el vector ahora es específico para un cierto tipo de célula y, de esta forma, puede ser específico para un cierto tejido, órgano u organismo. Los vectores retrovirales pueden hacerse específicos para el blanco mediante la unión, por ejemplo, de un azúcar, glucolípido, o una proteína. La marcación como blanco puede ser llevada a cabo utilizando un anticuerpo. Aquellos capacitados en la técnica reconocerán que pueden insertarse secuencias específicas de polinucleótido dentro del genoma retroviral o unidas a una envolvente viral para permitir la liberación específica de blanco del vector retroviral que contiene el polinucleótido de las proteínas, péptidos o anticuerpos. También es posible la marcación como blanco de liposomas sobre la base de la especificidad celular como se conoce en la técnica. En otra modalidad de la invención, pueden retirarse células de un tejido, órgano u organismo, puede introducirse dentro de las células ADN que codifica para una proteína, péptido o anticuerpo que interactúa con MK2 o un complejo de MK2, y que modula la actividad de la MK2, y las células pueden ser re-introducidas dentro del tejido, órgano u organismos. Estas células producirían entonces la proteína, péptido o anticuerpo cuando sean liberadas en un tejido, órgano u organismo de interés. Las células pueden ser reintroducidas al tejido, órgano u organismos mediante los métodos que se describieron anteriormente. K. Métodos para la Detección y Asilamiento de MK2 Los compuestos que interactúan con cuando menos una MK2 o un complejo de MK2 pueden ser utilizados para detectar la presencia o cantidad de MK2 in vivo o in vitro.

Estos incluyen proteínas, péptidos, anticuerpos, agentes químicos y pequeñas moléculas.

Mediante la correlación de la presencia o nivel de las proteínas de interacción con MK2 con una condición médica, alguien capacitado en la técnica puede diagnosticar la condición médica asociada. En la presente se establecen las condiciones médicas que pueden ser diagnosticadas mediante estos compuestos. Tales métodos de detección se conocen bien en la técnica e incluyen la prueba de ELISA, radioinmunoensayo, inmunomanchado, western blot, inmunoíluorescencia, inmunoprecipitación, y otras técnicas comparables. Estos compuestos pueden ser proveídos además en un equipo de diagnóstico que incorpore una o más de estas técnicas para detectar la MK2. Dicho equipo puede contener otros componentes, empaque, instrucciones u otros materiales para ayudar a la detección de la MK2 y el uso del equipo. En donde se tiene la intención de que los compuestos que interactúan con MK2 o un complejo de MK2, que modula la actividad de la MK2, se utilicen para propósitos de diagnóstico, puede ser deseable modificarlos, por ejemplo con un grupo ligando (tal como biotina) o un grupo marcador detectable (tal como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima). Si se desea, estos pueden ser marcados utilizando técnicas convencionales. Las etiquetas adecuadas incluyen fluorforos, cromóforos, átomos radiactivos, reactivos densos de electrón, enzimas, y ligandos que tengan socios de unión específica. Las enzimas son típicamente detectadas mediante su actividad. Por ejemplo la peroxidasa de raíz fuerte usualmente es detectada por su capacidad de convertir a la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azul, susceptible de ser cuantificado con un espectrofotómetro. Otras socios de unión adecuados incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de receptor-ligando que se conocen en la técnica. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente claras para aquellos capacitados en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención. Los compuestos que interactúan con cuando menos una de MK2 o un complejo de MK2 también pueden ser útiles para aislar la MK2 en un proceso de purificación. En un tipo de proceso, los compuestos pueden ser inmovilizados, por ejemplo, a través de la incorporación dentro de una columna o resina. Los compuestos son utilizados para unirse a MK2, y posteriormente sometidos a condiciones que resulten en la liberación de la MK2 unida. Tales procesos pueden ser usados para la producción comercial de la MK2. Los siguientes ejemplos proporcionan varias modalidades de la invención. Alguien con conocimientos normales en la técnica reconocerá que pueden llevarse a cabo numerosas modificaciones y variantes sin alterar el espíritu o alcance de la presente invención. Se cree que tales modificaciones y variaciones están abarcadas dentro del alcance de la invención. Los ejemplos no limitan de manera alguna la invención. Se entiende que la totalidad de los números que aparecen en la descripción y reivindicaciones son modificados por el término aproximadamente, ya que se considerarían como dentro del alcance de la invención pequeños cambios en las dosis, por ejemplo.

Ejemplos Ejemplo 1: Preparación de la Biblioteca de ADNc Se adaptaron métodos para llevar a cabo el tamizaje de doble híbrido de levadura, a partir del Pretransformed Matchmaker Librarles User Manual, publicado por Clontech (Palo Alto, California, Estados Unidos de América; versión PT3181-1; PR1X299).

Se adquirió en Clontech (# HY4053AH) una biblioteca de ADNc de médula ósea humana pre-transformada. Esta biblioteca de ADNc se pre-transformó en una cepa hospedera de Saccharomycess cerevisiae Y187 (Clontech). Las células de levadura se mantuvieron congeladas antes de su uso. Un constructo cebo de ADN en una cepa de reportero de levadura AH109 (Clontech) sirvió como socio de acoplamiento para la levadura Yl 87.

Ejemplo 2: Preparación del Constructo Cebo de MK2 Para preparar el constructo de MK2 comprendiendo un dominio de unión (BD), se generó un fragmento de gene de MK2 codificando para la quinasa de longitud completa en la que el aminoácido Usina 93, en la bolsa de unión de ATP había sido mutado a una arginia, mediante clonación direccional en el vector DNA-BD, pGBKT7 (Clontech) para generar MK K93R-pGBKT7. La lisina en la posición 93 fue convertida a una arginina para producir una forma catalíticamente inactiva de la quinasa. Específicamente, el vector pGBKT7 se digirió con Nde-Xho, y se purificó usando electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de MK2 se ligó al vector pGBKT7 mediante el uso de ligasa de ADN T4. Los plásmidos que contenían los insertos se identificaron mediante análisis de restricción. La levadura se transformó con el constructo de MK2 y la expresión de MK2 se confirmó de manera subsiguiente en la cepa de levadura AHI 09 transformada. La toxicidad de la proteína codificada por el constructo de MK2 en la célula hospedera se investigó comparando la velocidad de crecimiento de las células transformadas con el constructo de MK2 y las células transformadas con el vector vacío. Se determinó que el constructo de MK2 no era tóxico. Las células con el constructo cebo o con el vector vacío crecieron substancialmente a la misma velocidad y número de células. Para analizar la activación transcripcional, células transformadas con el constructo de MK2 se colocaron en placa en medios de SD/-Trp/X-a-Gal (Clontech), SD/-His/-Trp/X-a-Gal (Clontech), y SD/-Ade/-Trp/X-a-Gal (Clontech). Los resultados mostraron que la proteína de M 2 por si misma no activa la transcripción. La levadura que contenía el constructo cebo de MK2 produjo triptófano, sin embargo, estas levaduras no produjeron Adenina o Histidina. Crecieron clonas en el medio SD/-Trp/X- -Gal, pero no parecían de color azul, No crecieron clonas en los medios SD/-His/-Trp/X-a-Gal o SD/-Ade/-Trp/X-a-Gal, mostrando que no hubo activación transcripcional general de genes reporteros endógenos.

Ejemplo 3: Tamizaje de Biblioteca de Dos Híbridos de Levadura La MK2 utilizada en el tamizaje de la biblioteca fue de longitud completa y catalíticamente inactiva. Esta forma muíante inactiva que codifica para una sustitución de alanina en la lisina conservada en la bolsa de unión ATP de MK2 haciendo inactiva a la MK2 ( otlyarov et al, Mol. Cell Bio 22, 4827-4835 (2002)) se utilizó debido a que se conocen quinasa inactivas que se unen a proteínas de interacción más establemente, permitiendo de esta manera una activación transcripcional más fuerte de genes reporteros de dos híbridos. Una colonia de levadura transformada con el constructo de MK2 se inoculó en medio SD/-Trp (Clontech) a 30 °C durante toda la noche y con agitación a 250-270 rpm. El día siguiente, se midió que el OD600 era >0.8. Las células fueron centrifugadas a 1000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se decantó y el granulos de célula se re-suspendió en líquido residual mediante la formación de un vórtice. Una alícuota congelada (~1.0 mi) del cultivo de la biblioteca se descongeló en un baño de agua a temperatura ambiente. La células fueron arremolinadas suavemente. El cultivo completo de M 2 cebo y 1 mi de cultivo de la biblioteca se combinaron. Se agregaron 45 mi de 2X YPD A/Kan (una mezcla de extracto de levadura, peptona, dextrosa, adenina y canomicin; Clontech) al cultivo y se arremolinó suavemente, y el volumen fue llevado a 50 mi con 2X YPD A/Kan. Las células se incubaron durante toda la noche a 30 °C con remolineo suave (30-50 rpm). Las células fueron transferidas a una botella estéril de centrifugación y se revolvieron mediante centrifugaron a 1000 x g durante 10 minutos. El gránulo fue re-suspendido en 50 mi de 2X YPD/Kan, posteriormente las células fueron revueltas mediante centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos. Esta etapa de lavado se repitió. Posteriormente las células se re-suspendieron en 10 mi de medio de 0.5X YPD A/Kan. Doscientos µ? de la mezcla de acoplamiento se colocaron en placas aproximadamente 50 placas grandes (150 mm) de SD/-His/-Leu/-Trp (Clontech). Las placas fueron incubadas, con el costado de la colonia abajo, a 30 °C hasta que las colonias aparecieron sobre las placas. A las clonas se les asigno un puntaje en cuanto al crecimiento en placas de SD/-Leu (Clontech), SD/-Trp (Clontech) y SD/-Leu-Trp (Clontech). Crecieron células haploides y diploides en el medio de SD/-Leu o SD/-Trp. Solo las células diploides crecieron en el medio SD/-Leu/-Trp. Se determinó que la eficiencia de acoplamiento era de 5.4%. Las colonias que crecieron en placas que contenían medio SD/-His/-Leu/-Trp X-a-Gal se re-rayaron sobre placas de SD/-His/-Leu/-Trp ?-a-Gal para verificar el fenotipo. En seguida, las clonas fueron tamizadas en las placas de SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp más astringentes que contenían ?-a-Gal (Clontech). Las colonias positivas se re-rayaron en SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp en una forma de malla (Clontech) para generar placas maestras. Las preparaciones de ADN y los patrones de glicerol de la levadura se hicieron a partir de estas placas maestras.

Ejemplo 4: Análisis de Clonas Positivas Putativas El equipo de aislamiento de plásmido de levadura YEASTMAKERMR (Yeast Plasmid Isolation Kit) [Clontech; #K1611-1) proveyó los reactivos y las herramientas para el asilamiento del plásmido de la levadura. Las levaduras fueron obtenidas de positivos individuales que habían sido re-rayados sobre las placas maestras, y fueron re-suspendidas en 50 µ? de Tris EDTA en un formato de 96 pozos. Se agregaron 10 µ? de liticase a cada pozo. La placa se incubó a 37 °C durante 1 hora después de lo cual se agreagaron 20 µ? de SDS al 20%. El ADN fue purificado usando Quiagen turbo prep. (Quiagen, Valencia, California, Estados Unidos de América). Se amplificaron por PCR muestras usando una enzima Advantage 2 PCR (Clontech, #K1919-1). Se identificaron los insertos mediante secuenciación.

Ejemplo 6: Análisis de las Clonas Positivas Las secuencias independientes se transformaron en bacterias (DH5 a) a partir de las cuales se aisló ADN de manera subsiguiente. En seguida, el ADN se transformó en cepa de levadura AHI 09. Varios cebos: MK2; K93R de MK2 catalíticamente inactiva, vector pGBKT7 vacío, TPL2, p53, y Lamin (Clontech) se transformaron en cepa de levadura Y187. Cada cepa de secuencia independiente transformada en AH109 se acopló con levadura Y 187 transformada con cada uno de los tres cebos. Las clonas independientes que interactuaron con la MK2 y H93R de MK2, pero no con el vector pGBKT7 vacío, TPL2, p53, o Lamín, según se probaron mediante su crecimiento en SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp y color azul en SD/-Leu/-Trp ?- -Gal, se identificaron como clonas que incluían insertos de ADN que codificaban para proteína de interacción con MK2 específicas (Figura 9A). Las proteínas de interacción con MK2 se unieron a MK2 de tipo silvestre y K93R de MK2 con substancialmente la misma afinidad, ilustrando que la unión de MK2 no es un artefacto del muíante inactivo de quinasa K93R de MK2. Una proteína codificada por una secuencia de ADN independiente caracterizada fue "similar a smoothelin" (STS). La secuencia de codificación de ADNc que codifica para la proteína se provee en la Figura 1 y en la SEQ ED NO: 1; la secuencia de aminoácidos se proporciona en la Figura 4 y en la SEQ ID NO: 4. Otra proteína codificada por una clona independiente fue la polihomeótica 2 humana (HPH2). La secuencia de codificación de ADNc que codifica para la proteína se provee en la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos se proporciona en la Figura 5 y en la SEQ ID NO: 5. Las HPH2 tiene un dominio de interacción de proteína de motivo alfa estéril (SAM). Todavía otra proteína codificada por una secuencia de ADN independiente aislada fue homología src y colágeno (Shc). La secuencia de codificación de ADNc que codifica para la proteína se provee en la Figura 3 y en la SEQ ID NO: 3; la secuencia de aminoácidos se proporciona en la Figura 6 y en la SEQ ID NO: 6. La isoforma más grande de Shc (p66 Shc A) tiene un dominio CH2 con terminación N seguido de un PTB, CHl, y un dominio de SH2 en la terminación C de la proteína.

Ejemplo 6: Delineamiento de los Dominios de Interacción de MK2 Para delinear el dominio de MK2 requerido para la interacción con Shc A, HPH2 y STS se utilizaron varios mutantes de deleción de MK2. Los mutantes de MK2 probados incluían MK2VN (aminoácidos de MK2 41-400), MK2VC (aminoácidos de MK2 1-370) así como también MK2Cat (aminoácidos 41-330 del dominio catalítico de MK2). El MK2VN tiene la terminación N rica en prolina suprimida, MK2VC tiene la señal de localización nuclear de MK2 (NSL) y el sitio de unión de p38 suprimidos, y MK2Cat tiene el dominio rico en prolina con terminación N así como también el dominio de auto-inhibición de terminación C, la señal de exportación nuclear (NES) y LS suprimidos. El análisis de doble híbrido mostró que Shc A interactúa igualmente con MK2Cat, MK2VC y MK2 de longitud completa. La interacción con MK2VN, sin embargo, fue escasamente detectable. El perfil de interacción con Shc A indica que mínimamente, Shc A interactúa con el dominio catalítico de MK2 y que la deleción de la terminación N de MK2 podría inducir un cambio conformacional tal que Shc A ya no se una más con MK2 de manera eficiente. La HPH2 se une a MK2VC, MK2VN y MK2 de longitud completa substancialmente con la misma afinidad. La interacción con MK2Cat, no obstante, fue menos pronunciada. La HPH2, por lo tanto, parece requerir unión en las terminación N o C de MK2 en tanto que el dominio catalítico de MK2 cuando era expresado solo no promovía la unión de HPH2 con M 2 a un nivel comparable. De manera similar a smoothelin se une a MK2 con afinidad más elevada que ya sea Shc A o HPH2 según se probó mediante ensayos de crecimiento y color en levadura. Adicionalmente, igual a smoothelin se une a cada una de MK2, MK2VN, MK2VC y MK2Kat con substancialmente la misma afinidad indicando que sitios múltiples en la MK2 interactúan con esta proteína.

Ejemplo 7 : MK2 Co-Inmunoprecipita con Shc y HPH2 en células de Mamífero Se co-expresaron en células 293T Shc etiquetado con V5 y MK2 etiquetado con MYC, como se muestra en la Figura 10A. Las células fueron des-estimuladas o estimuladas con 10 µg/ml de anisomicina durante 30 minutos. La prueba de transferencia de Western de lisatos de células usando anticuerpos contra V5 o Myc mostró que tanto la proteína Shc etiquetada con V5 como la proteína MK2 etiquetada con MYC fueron expresadas. Lisatos de célula fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo de anti-V5. Los inmunoprecipitados se resolvieron mediante SDS-PAGE y se inmunomancharon con anticuerpo de anti-MYC. El anticuerpo de anti-MYC se une a la inmunomancha, indicando que la MK2 etiquetada con MYC co-inmunoprecipitó con Shc etiquetada con V-5. Esto indica una interacción entre MK2 y Shc. En un experimento similar, la co-inmunoprecipitación usando el anticuerpo de anti-HA y el inmunomanchado con anticue o de anti-Myc muestra que la MK2 co-inmunoprecipita con la HPH2 y p38 (Figura 10B). La p38 etiquetada con HA, HPH2 etiquetada con HA y MK2 etiquetada con Myc fueron expresadas en células 293T, como se muestra por la prueba de transferencia de Western. La co-inmunoprecipitación puede ser utilizada para detectar la unión de dos proteínas o para confirmar resultados de unión entre dos proteínas como se encontró en otros métodos, tal como en el sistema Y2H.

Ejemplo 8: Efecto de las Proteínas de Unión en la Activación de MK2 Una proteína de interacción con MK2 etiquetada con HA (por ejemplo, Shc) y MK2 etiquetada con MYC fueron co-expresadas en células 293T. Se prepararon lisatos de célula y se resolvieron mediante SDS-PAGE. El inmunomanchado subsiguiente con anticuerpos de Ha y Myc para detectar MK2 etiquetada con MYC y la proteína de interacción con HA confirmará que estas proteínas son expresadas. Puesto que la activación de MK2 comprende la fosforilación de MK2, el inmunomanchado con un anticuerpo para detectar MK2 fosforilada (por ejemplo, anti-treonina 334 de fosfo MK2)) determinará el estado de la activación de MK2. Una diferencia en el monto de MK2 334 cuando se co-expresa con un activador de MK2, en comparación con la cantidad de p334 de MK2 cuando la MK2 es expresada sola, indicará actividad alterada de MK2 en la presencia de la proteína de interacción con MK2.

Ejemplo 9: Efecto de Proteína de Interacción con MK2 en Biosíntesis de TNF Se co-expresaron dos constructos de vector vacíos en células de macrófago RAW 264.7 para establecer un nivel basal de biosíntesis de TNF-a, según se detectó mediante ELISA (Figura 11). Se estimularon o desestimularon células con lipopolisacárido (LPS) para estimular actividad catalítica de MK2. El nivel de expresión a de TNF fue detectado en células en las que MK2, p38 o Shc fueron co-expresadas con vector vacío y los niveles fueron comparables al nivel basal encontrado con el vector vacío. Cuando las células co- expresaron p38 y Shc, el nivel de expresión de TNF-a fue mayor que aquel detectado en los controles. De manera similar, la co-expresión de Shc y MK2 resultó en un aumento en los niveles de TNF-a.

Ejemplo 10: Efecto de MK2 en el Estado de Fosforilación de una Proteína de Interacción con MK2 Una proteína de interacción con MK2 etiquetada con HA es expresada en células 293T. Se prepararon lisatos de célula y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo de anti-HA. Los inmunoprecipitados se utilizaron en un ensayo de quinasa in vitro con MK2 recombinante agregada como quinasa. El SDS-PAGE seguido de la fosfoimageologia se utilizó para detectar la fosforilación de la pro teína de interacción con MK2. La fosforilación de la unión de MK2 o de la proteína de interacción en la presencia de MK2 y la fosforilación reducida o la no fosforilación de la proteína de interacción con MK2 en la ausencia de MK2 indicaría que la MK2 fosforila la proteína de interacción con MK2. Una proteína de interacción con MK2 puede o no ser un sustrato para la MK2.

Ejemplo 11: Detección de Proteínas de Interacción con MK2 Usando un Planteamiento de Proteómica Puede usarse un planteamiento de proteómica para identificar proteínas de interacción con M 2. Se colocaron en placas células de tipo silvestre (+/+) o deficientes en MK2 (-/-) y se etiquetaron con 33P. La MK2 fue activada durante 30 minutos enseguida de lo cual se prepararon lisatos de célula entera y se analizaron usando electroforesis en gel de dos dimensiones. Los geles se compararon para identificar proteínas diferencialmente fosforiladas. La Figura 12A muestra una proteína fosforilada diferencialmente (flecha) con un punto de enfoque isoeléctrico de 5.4. La ausencia de fosforilación en células MK2 +/+ puede deberse a cambios dependientes de la fosforilación en la migración de proteína. La Figura 12B muestra un teñido de plata de la misma región que muestra abundancia de proteínas resueltas.

Ejemplo 12: La MK2 es Activada cuando se Co-Expresa con Shc A en Células HeLa Se determinó el estado de activación de MK2 cuando se co-expresa con Shc A. El Hsp 27 es un sustrato fisiológico para MK2. La fosforilación de HSP 27 endógeno en células HeLa es susceptible de responder a MK2 y, por lo tanto, puede ser utilizada para determinar la actividad de MK2. Células HeLa fueron transfectadas ya sea con vector solo, o con vector y V5-Shc A o Myc-MK2 como controles. En paralelo, se co-transfectaron células tanto con V5-Shc como con Myc-MK2. Después de permitir la expresión, las células se dejaron estimuladas o desestimuladas durante 30 minutos con anisomicina para activar la MK2. El inmunomanchado subsiguiente con un anticuerpo específicos de anti-fosfo péptido contra Hsp 27 fosforilado (pHsp 27) muestra un aumento en pHsp 27 con la estimulación. Con la expresión exógena de Myc-MK2 hubo un incremento en los niveles básales de pHsp 27 en células sin estimular (Figura 13 A). Este aumento en la fosforilación basal no se observó en las células que expresaban Shc A o vector control. La cuantificación de estos resultados usando densitometría muestra que el aumento en pHsp 27 observado con la expresión de Myc-MK2, según se compara con vector vacío o V5-Shc A, es de 1.5 a dos veces. Los niveles básales de pHsp 27 aumentaron adicionalmente cuando la Myc-MK2 fue co-expresada con V5-Shc A. La cuantificación muestra que este aumento es del triple sobre los niveles detectados cuando la Myc-MK2 fue expresada sola (Figura 13B). Como se muestra en células 293T, los niveles de MK2 aumentaron con la co-expresión de Shc A, ilustrando adicionalmente la interacción entre MK2 y Shc A. El aumento observado en el pHsp 27 basal es probable que refleje actividad de M 2 aumentada así como también niveles incrementados de proteína de MK2. Se mostró que el pHsp 27 basal aumentó de 2 a tres veces cuando se normalizó con los niveles de MK2 (Figura 13C). Este aumento es propuesto para reflejar la activación de MK2 con la co-expresión de Shc A. Se observó actividad incrementada de MK2 con la co-expresión de p66 Shc A. La fosforilación de Hsp 27 endógeno es susceptible de responder a la actividad de MK2 en células HeLa. Se observó pHsp 27 incrementado con co-expresión de Shc A de MK2-p66 indicando que la MK2 es activada con la unión de Shc A de p66. El aumento observado en los niveles de T F-a con la co-expresión de Shc A de MK2-p66 en células RAW 264.7 confirma que la MK2 es activada con la co-expresión de Shc A. La activación de la MK2 con Shc A de p66 puede resultar en la localización de MK2 y la retención en el citosol a través de la unión de Shc A. La ubicación citosólica puede a su vez aumentar el acceso de MK2 a sustratos citoplásmicos tales como ARNm de TNF-a y Hsp 27. Alternativamente, la MK2 puede unirse a Shc citosólico promoviendo la localización citoplásmica de MK2 en donde se torna más activa.

Ejemplo 13: La MK2 es Activada cuando se Co-Expresa con Shc A en Células RAW 264.7 La MK2 se activó cuando se co-expresó con Shc A, según se probó mediante los niveles de pHsp 27 en células HeLa. Para confirmar adicionalmente que la MK2 es activada al asociarse con Shc A, proteína TNF secretada a partir de células RAW264.7 se ensayaron en la presencia tanto de MK2 como de Shc A. Los datos de células derivadas de ratones suprimidos en cuanto MK2 mostraron una disminución del 90% en la biosíntesis de TNF en respuesta a LPS. Los experimentos subsecuentes han mostrado que la MK2 catalíticamente activa se requiere para restaurar la biosíntesis de TNF en estas células, estableciendo de esta manera a la actividad enzimática de MK2 como necesaria para la biosíntesis del TNF-a. Fueron trasnfectadas células RAW264.7 ya sea con vector solo, o con vector y V5-Shc A o Myc-MK2 como controles. En paralelo, se co-transfectaron células tanto con V5-Shc A como con Myc-MK2. Después de permitir la expresión, las células se dejaron estimuladas o desestimuladas con LPS durante 30 minutos para activar la MK2. El análisis de transferencia de Western cuantitativo mostró que tanto Myc-MK2 como V5-Shc A fueron expresadas en células RAW264.7. En contraste a la co-expresión en células 293T y HeLa, los niveles tanto de MK2 como de Shc A disminuyeron cuando se coexpresaron en células RAW264.7. Esta disminución no refleja una disminución global en los niveles de proteína debido a que cantidades iguales de proteína fueron cargadas en cada carril como se muestra utilizando un anticuerpo específico de actina (Figura 14A). Las pruebas ELISA de TNF mostraron que la secreción de TNF-a aumentó ocho veces con la estimulación mediante LPS y que la expresión de Myc-MK2 o V5-Shc solas no potencializó la biosíntesis de TNF en estas células. En contraste, cuando la MK2 y Shc A fueron co-expresadas aumentó la biosíntesis de TNF-a 1.5 veces después de la estimulación (Figura 14B). Se propone que este aumento en la biosíntesis de TNF refleja un aumento en la actividad de MK2 y no en la expresión de MK2 puesto que los niveles de proteína de MK2 cuando se co-expresó con Shc A se encontraban por debajo de aquellos que se observaron en células que expresaban MK2 sola.

Ejemplo 14: La MK2 Fosforila Shc A in Vitro Shc de p66 es fosforilada en la serina 36 dentro del dominio de CH2 con tensión oxidativa. La terminación N para S36, una serina está ubicada en la posición 17 (SI 7) dentro de una secuencia de consenso Cam quinasa II: RXXS. La Figura 15A describe una representación esquemática de la proteína de Shc A, incluyendo varios sitios de fosforilación dentro de la proteína. El motivo RXXS ha mostrado que es útil como un sustrato para MK2 aunque no contiene un aminoácido hidrofóbico que con f ecuencia se encuentra a -2 desde la Arginia conservada en el motivo de consenso de MK2. Para determinar si Shc A es un sustrato para MK2, se expresó V5-Shc A en células 293T. Después de la expresión, la Shc A se inmunoprecipitó usando un anticuerpo de anti-V5. Los inmunoprecipitados fueron utilizados posteriormente en un ensayo de quinasa in vitro con MK2 recombinante activada de manera exógena, agregada. Las células de control transfectadas de vector mostraron niveles bajos de fosforilación a 66 kDa muy probablemente resultando del anticuerpo de anti-V5 inmunoprecipitando una proteína endógena para las células 293T que sirve como un sustrato débil para MK2. Solo las células transfectadas de Shc A mostraron fosforilación robusta a 66 kDa demostrando que la Shc A es un sustrato para MK2 in vitro. El teñido de Coomassie y el inmunomanchado usando un anticuerpo de anti-V5 mostraron que la Shc A era expresada en células trasnfectadas de Shc A (Figura 16B). Como se describe en la Figura 15B, la MK2 fosforila Shc A de p66 in vitro. La MK2 puede funcionar en vías activadas por tensión regulada con Shc A de p66. Si bien la isoforma de 66 kDa de Shc A no se une a receptores de superficie celular activados, su unión no conduce a la activación de la vía MAPK de Ras. Puesto que la Shc A de p66 no es expresada de manera ubicua, su expresión específica de tejido y tipo de célula se propone que regula de manera selectiva la activación de la vía de MAPK de Ras a través de su patrón de expresión selectiva. Adicionalmente, la isoforma de Shc A de p66 actúa corriente abajo de p53 para regular respuestas celulares a tensiones oxidativas (Trinei et al, Oncogene 21(24); 3872-8 "002)). La vía P38-MK2 es activada mediante tensión oxidativa para fosforilar proteínas pequeñas de choque térmico modulando de esta manera respuestas de microfilamento a tensión. (Huot et al, Circ. Res. 80(3): 383-92 (1997)). Tanto p38 como MK2 han sido implicadas en la fosforilación de p53 con tensión oxidativa. (She Q. B. et al, J. Biol. Chem. 7:275(27): 20444-9 (2000), She Q. B. et al, Oncogene 21(10): 1580-9 (2000)). JNK y ERN han sido implicados en la p66 de fosforilación de serina. Los datos presentados en esta descripción soportan un papel para la MK2 en la fosforilación activada por tensión de p66, como se representa en la Figura 16.

Ejemplo 15: Los Niveles de Fosfo Akt y Fosfo FKHR-L1 fueron Reducidos en Células MK2 +/+ Datos generados a partir de animales que habían sido desmayados para p66Shc A han mostrado que la p66 regula respuestas celulares a tensión oxidativa incluyendo la generación de ROS intracelular y apoptosis y que la fosforilación en S36 en la proteína es requerida para estas respuestas. Células derivadas de animales de p66Shc A -/- tienen niveles disminuidos de radicales libres intracelulares y son resistentes a apoptosis inducida por tensión en comparación con litermatos de tipo silvestre. Además, animales de p66Shc A -/- son resistentes al paraquot, un compuesto generador de oxidación y además muestran un lapso de vida extendido. La fosforilación tanto de AKT como de FKHR-L1 en respuesta a tensión oxidativa tal como luz ultravioleta o peróxido de hidrógeno se reduce en MEFs de p66Shc -/-. La reducción en la fosforilación de FKH -L1 se correlaciona con un aumento en la actividad de FKHR-L1, ya que este factor de transcripción se mantiene nuclear en su forma de-fosforilada. Células con FKHR-L1 activadas son resistentes a apoptosis consistente con el papel de este factor de transcripción en la regulación de la expresión de varias enzimas antioxidantes que incluyen la superoxido dismutasa y catalasa. Un papel para la MK2 en la p66Shc A de fosforilación y regulación en respuestas celulares a tensión sugiere que células suprimidas para MK2 deberían mostrar niveles reducidos tanto de fosfo (p)-AKT como de fosfo (p)-FKHR-Ll en respuesta a tensión oxidativa según se compara con células de tipo silvestre. Con el fin de probar este pronóstico, se ensayaron niveles de p-AKT y p-FKHAR-Ll inducidos con peróxido de hidrógeno en MEFs de MK2 -/- y +/+. Los análisis de transferencia western cuantitativos mostraron que ambos niveles de p-AKT y p-FKUR-Ll eran reducidos en MEFs de MK2 -/- según se compara con MEFs +/+ sugiriendo que niveles de ROS intracelular eran reducidos en células de MK2 -/- (Figura 17).

Ejemplo 16: Tamizaje para Fármacos Anti-Infiamatorios 1. Sistema de 2 Híbridos de Levadura para Tamizaje de Fármaco Se utilizaron proteínas que se unían a MK2 para la identificación de fármacos antiinflamatorios incluyendo pequeñas moléculas, péptidos, agentes químicos y anticuerpos que son útiles para el tratamiento o prevención de la inflamación. Las proteínas de interacción con MK2 son identificadas usando el sistema de 2 híbridos de levadura que se describe aquí mismo. Las proteínas de interacción con MK2 son entonces ensayadas en cuanto a su efecto sobre la actividad de la MK2 mediante uno o más de los ensayos que aquí mismo se proveen o aquellos que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, una proteína de interacción con MK2 aumentará la actividad de la MK2; por ejemplo, según se determina por la actividad de la quinasa de MK2 o la biosíntesis del TNF-a; inhibirá la actividad de la MK2; o no tendrá ningún efecto sobre la actividad de la MK2. Las proteínas de interacción con MK2 que aumentan la actividad de MK2 son deseables para ser utilizadas como candidatos para el tamizaje de fármacos antiinflamatorios. Una clona de levadura positiva que muestra una interacción entre MK2 y una proteína de interacción con MK2 que aumenta la actividad de la MK2, como se describe aquí mismo, se raya sobre la placa de selección apropiada tantas veces como el número de candidatos de fármaco o compuestos de prueba van a ser ensayados. Como se esperaba, cada colonia rayada será positiva para la interacción entre MK2 y la proteína de interacción, según se ensayó mediante pruebas de color y crecimiento. Cada colonia es puesta en contacto de manera subsiguiente con un diferente candidato a fármaco para probarlo en cuanto a su efecto sobre la interacción entre la MK2 y la proteína de interacción. Un candidato de fármaco que inhibe la interacción entre la MK2 y la proteína de interacción, según se prueba mediante una reducción en el color y/o el crecimiento de las colonias en los medios apropiados, será uno identificado como un candidato potencial para el tratamiento o prevención de la inflamación.

El mismo ensayo puede ser usado, por ejemplo, para la identificación de candidatos a fármaco que promuevan una interacción entre MK2 y una proteína de interacción, en donde la proteína de interacción inhibe la actividad de la MK2. Por ejemplo, una clona de levadura positiva que muestra una interacción entre MK2 y una proteína de interacción que inhibe la actividad de la M 2, cuando menos parcialmente, según se prueba mediante uno o más de los ensayos que aquí mismo se provee, puede ser rayada en los medios apropiados. Cada colonia de la clona positiva es puesta en contacto de manera subsiguiente con un candidato potencial a fármaco o un compuesto de prueba. Los candidatos a fármacos que conducen a un más fuerte crecimiento así como también color en ensayos de especificidad de levadura, como se describe aquí mismo, son candidatos potenciales para promover la interacción entre MK2 y una proteína de interacción con M 2, en donde la proteína de interacción inhibe la actividad de MK2. 2. Ensayos de Reconstitución In Vitro para Tamizaje de Fármacos Los ensayos de reconstitución in vitro pueden se usados para la identificación de fármacos anti-inflamatorios que bloquean la actividad de MK2 o que bloquean la interacción entre MK2 y una proteína de interacción, en donde la proteína aumenta la actividad de MK2. Adicionalmente, un sistema de reconstitución in vitro también puede ser utilizado para la formación de complejos de protema que incluyen MK2 y cuando menos una proteína de interacción con MK2, en donde tales complejos puede ser usados de manera subsiguiente para la identificación de compuestos de prueba que modulan la inflamación. El efecto de un compuesto de prueba en la inflamación puede ser ensayada ya sea determinando si el compuesto de prueba inhibe o promueve la formación de complejo o en cuanto a su efecto sobre la actividad de la MK2. Por ejemplo, una cantidad de un complejo de proteína que incluye MK2 y una proteína de interacción puede ser medida antes y después de poner en contacto el complejo de proteína con un compuesto de prueba. Un compuesto de prueba que conduce a una disminución en la cantidad de complejo de proteína con relación a la cantidad en la ausencia del compuesto de prueba será anti-inflamatorio. Mientras que, un compuesto de prueba que conduce a un aumento en la cantidad de complejo de proteína con relación a la cantidad en la ausencia del compuesto de prueba será pro-inflamatorio. Por ejemplo, la MK2 es sintetizada usando un sistema de traducción por transcripción in vitro, tal como el sistema de reticulocito de conejo suministrado por Promega. La MK2 traducida in vitro es ensayada primero en cuanto a su actividad en uno o más de los ensayos proveídos aquí mismo. Varios candidatos a fármaco son subsecuentemente agregados a la MK2 traducida bajo las condiciones adecuadas y por los periodos de tiempo apropiados, y se ensaya la actividad de MK2 otra vez enseguida al contacto con un candidato potencial a fármaco. Aquellos candidatos que conduzcan a la inhibición o reducción de la actividad de MK2 son identificados como fármacos antiinflamatorios potenciales, Estos fármacos puede ser validados adicionalmente en cuanto a su efecto sobre la inflamación y en varias vías involucradas en la inflamación en células in vivo y en modelos animales para la inflamación. De manera similar, también puede emplearse un sistema reconstituido in vitro para la identificación de fármacos que inhiban la interacción entre M 2 y un proteína de interacción, en donde la proteína de interacción estimula la actividad de MK2. Por ejemplo,, una composición que incluye MK2 traducida in vitro y una proteína de interacción, según se identificó mediante los ensayos del sistema Y2H o de co-inmunopreciptación, es tratada con candidatos potenciales a fármaco. Los candidatos que inhiban la interacción entre MK2 y la proteína de interacción son identificados como potenciales fármacos anti-inflamatorios. Estos fármacos puede ser subsecuentemente tratados in vivo en células y en modelos de animal. Además de las proteínas traducidas in vitro, también pueden utilizarse proteínas purificadas en ensayos de reconstitución in vitro para la identificación de fármacos anti-inflamatorios.

Ejemplo 17: Tratamiento de Condiciones Relacionadas con la Inflamación Los compuestos (tales como proteínas, péptidos, anticuerpos, agentes químicos y pequeñas moléculas) que interactúan con cuando menos uno de MK2 o un complejo de MK2 pueden ser administrados a pacientes que padecen de una condición relacionada con la inflamación de acuerdo con la Tabla 1. Los pacientes toman la composición una vez o a intervalos, tal como una vez al día, y los síntomas de su condición mejoran. Por ejemplo, se producirá una disminución de la inflamación. Esto demuestra que la composición de la presente invención es pronosticada para ser útil para el tratamiento de condiciones relacionadas con la inflamación.

Tabla 1: A<iministración de Compuestos que Interactúan con MK2 o un Complejo de MK2 La descripción se entiende más completamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de la especificación, las cuales se incorporan a la presente como referencias. Las modalidades señaladas dentro de la descripción proveen una ilustración de materializaciones de la invención y no deben ser interpretadas como limitativas del alcance de la invención. Un técnico capacitado en la materia fácilmente reconocerá que muchas otras modalidades están abarcadas por la invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas, así como las secuencias identificadas por su número de referencia de base de datos o de acceso en esta descripción se incorporan como referencias en su totalidad. En la medida que el material incorporado como referencia contradiga o sea inconsistente con la presente descripción, esta descripción estará por encima de cualquier material. Las citas de cualquier referencia aquí señalada no es una admisión de que tales referencias constituyen técnica anterior para la presente invención. Muchas modificaciones y variaciones de esta invención pueden llevarse a cabo sin apartarse de su espíritu y alcance, como resultará claro para aquellos capacitados en la técnica. Las modalidades específicas descritas aquí mismo son presentadas a manera de ejemplo únicamente y no significa que sea una limitación en forma alguna. A menos que se indique otra cosa, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivos celulares, condiciones de tratamiento, y así sucesivamente, que se utilizan en la descripción, incluyendo las reivindicaciones, se comprende que son modificados en toda instancia por el término "aproximadamente." En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invención. A menos que se indique otra cosa, el término "cuando menos" precediendo una serie de elementos debe ser entendido como que se refiere a cada elemento en la serie. Aquellos capacitados en la técnica reconocerán, o serán capaces de discernir, usando no más de experimentación rutinaria, muchas equivalencias de las modalidades específicas de la invención que se describe en la presente invención. Se tiene el propósito de que tales equivalencias estén comprendidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (57)

1. Reivindicaciones 1. Un complejo de proteína purificada o recombinante, aislada, el cual comprende: (i) un polipéptido de MK2, y (ii) una proteína de interacción con MK2, seleccionado de STS, HPH2 y Shc.
2. 2. El complejo de la reivindicación 1, el cual comprende un polipéptido de MK2 y cuando menos una proteína de interacción con MK2.
3. 3. El complejo de la reivindicación 2, en donde la proteína de interacción con MK2 se selecciona de entre STS, HPH2 y Shc.
4. 4. El complejo de la reivindicación 1, el cual comprende un polipéptido de MK2 y cuando menos dos proteínas de interacción con MK2.
5. 5. El complejo de la reivindicación 4, en donde las proteínas de interacción con MK2 se seleccionan de entre STS, HPH2 y Shc.
6. 6. El complejo de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de MK2 comprende una proteína de fusión.
7. 7. El complejo de la reivindicación 6, en donde la proteína de fusión comprende un dominio para la purificación, aislamiento o detección de la proteína de fusión.
8. 8. El complejo de la reivindicación 6, en donde la proteína de fusión comprende un dominio seleccionado del grupo formado por: etiquetas de afinidad, radionucléotidos, enzimas y fluoroforos.
9. 9. El complejo de la reivindicación 7, en donde el dominio se selecciona del grupo formado por: polihistidina, FLAG, Glu-Glu, glutation S transferasa (GST), tioredoxin, proteína A, proteína G, y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.
10. 10. Una célula hospedera que comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico codifica para un polipéptido de M 2 recombinante y el segundo ácido nucleico codifica para una proteína de interacción con MK2, seleccionada de STS, HPH2 y Shc.
11. 11. La célula hospedera de la reivindicación 10, la cual además comprende un tercer ácido nucleico que codifica para una segunda proteína de interacción con MK2 seleccionada de STS, HPH2 y Sha
12. 12. Una prueba para la determinación de si un primer compuesto inhibe o promueve la formación de un complejo de proteína, la cual comprende: (a) formación de una mezcla de reacción que incluye un polipéptido de MK2, cuando menos una proteína de interacción con MK2 y el compuesto de prueba; y (b) detectar la presencia del complejo de proteína entre MK2 y la proteína de interacción con MK2; en donde una diferencia en la cantidad del complejo en la presencia del compuesto de prueba, con relación a la cantidad del complejo en la ausencia del compuesto de prueba incida que el compuesto de prueba inhibe o promueve la formación del complejo.
13. 13. La prueba de la reivindicación 12, en donde un aumento en la cantidad del complejo en la presencia del compuesto de prueba incida que el compuesto de prueba promueve la formación del complej o .
14. 14. La prueba de la reivindicación 12, en donde una disminución en la cantidad del complejo en la presencia del compuesto de prueba incida que el compuesto de prueba inhibe la formación del complejo.
15. 15. Un método para la determinación de sí un compuesto de prueba afecta la actividad de MK2, el cual comprende: (a) formación de un complejo de proteína que comprende un polipéptido de MK2 y una proteína de interacción con MK2; (b) puesta en contacto del complejo de proteína con el compuesto de prueba; y (c) determinación del efecto del compuesto de prueba en una o más actividades seleccionadas de actividad de quinasa de MK2, una cantidad de MK2 en el complejo, producción de T F, una cantidad de forma fosforilada de un sustrato de MK2.
16. 16. Una prueba de tamizaje para la identificación de compuestos que inhiben o promueven la formación de un complejo de proteína, la cual comprende (i) proveer un sistema de ensayo de dos híbridos que incluye una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido de MK2, y una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido seleccionado de uno o más de STS, HPH2 y Shc, bajos condiciones en donde las dos proteínas interactúan en el sistema de dos híbridos; (ii) medir un nivel de interacción entre las proteínas de fusión en la presencia y en la ausencia de un compuesto de prueba; y (iii) comparar el nivel de interacción de las proteínas de fusión, en donde una disminución en el nivel de interacción es indicativa de un compuesto que inhibe la interacción entre el polipéptido de MK2 y un polipéptido seleccionado de uno o más de STS, HPH2 y Shc.
17. 17. Un anticuerpo que se une a una o más proteínas en un complejo de proteína, el cual comprende un polipéptido de MK2 y una proteína de interacción con MK2 seleccionada de STS, HPH2 y Shc.
18. 18. El anticuerpo de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo inhibe la interacción de MK2 con la proteína de interacción con MK2.
19. 19. Un método para regular la formación de un complejo de proteína en una célula, el cual comprende cuando menos una primera proteína y una segunda proteína, en donde la primera proteína es un polipéptido de MK2 y la segunda proteína es seleccionada de uno o más de STS , HPH2 y Shc, y en donde el método comprende la administración a la célula de un compuesto capaz de modular la formación del complejo.
20. 20. Un método para la producción de un complejo, el cual comprende la transfección de una célula con uno o más polinucleótidos que codifican para un polipéptido de MK2 y una proteína de interacción con MK2 seleccionada de uno o más de STS, HPH2 y Shc, por medio de lo cual el polipéptido forma un complejo.
21. 21. Un método para el tamizaje de fármacos para la identificación de fármacos anti-inflamatorios, el cual comprende: (a) proveer MK2 y cuando menos una proteína de interacción con MK2; (b) permitir que la MK2 y la proteína de interacción con MK2 interactúen para formar un complejo; (c) agregar una cantidad efectiva de un fármaco potencial para el complejo; y (d) determinar si el fármaco potencial inhibe la formación del complejo.
22. 22. El método de la reivindicación 21, en donde la MK2 y la proteína de interacción con MK2 interactúan in vivo en un sistema de doble híbrido de levadura.
23. 23. El método de la reivindicación 21, en donde la MK2 y la proteína de interacción con MK2 interactúan in vivo en un sistema de doble híbrido de mamífero.
24. 24. El método de la reivindicación 21, en donde la MK2 y la proteína de interacción con MK2 interactúan in vitro.
25. 25. El método de la reivindicación 21 , en donde la proteína es STS.
26. 26. El método de la reivindicación 21, en donde la proteína es Shc.
27. 27. El método de la reivindicación 21, en donde la proteína es HPH2.
28. 28. El método de la reivindicación 21, en donde el fármaco es una molécula pequeña.
29. 29. El método de la reivindicación 21, en donde el fármaco es un péptido o una proteína.
30. 30. El método de la reivindicación 21, en donde el fármaco es un anticuerpo.
31. 31. El método de la reivindicación 21, en donde el fármaco es un agente químico.
32. 32. Un método para la modulación de la inflamación en un tejido, el cual comprende las etapas de: (a) administrar un ácido nucleico al tejido, en donde el ácido nucleico codifica para una proteína de interacción con MK2, y (b) permitir que el ácido nucleico exprese la proteína de interacción con MK2, y de esta manera module la inflamación en el tejido.
33. 33. El método de la reivindicación 32, en donde el ácido nucleico expresa una proteína seleccionada de STS, HPH2 y Shc.
34. 34. Un método para el tratamiento o prevención de la inflamación en un tejido, el cual comprende el administrar al tejido una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos un agente, en donde el agente ya sea que (a) bloquea la interacción entre la MK2 y la proteína de interacción con MK2, o (b) que permite la interacción, pero que bloquee la actividad de la MK2.
35. 35. El método de la reivindicación 34, en donde el agente es un anticuerpo.
36. 36. El método de la reivindicación 35, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
37. 37. El método de la reivindicación 35, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 38. El método de las reivindicaciones 35 a 37, en donde el anticuerpo se une a
38. MK2.
39. 39. El método de las reivindicaciones 35 a 37, en donde el anticuerpo se une a una proteína de interacción con MK2.
40. 40. El método de la reivindicación 34, en donde el agente es un agente químico.
41. 41. El método de la reivindicación 34, en donde el agente es un péptido o una proteína.
42. 42. El método de la reivindicación 34, en donde el agente es una pequeña molécula.
43. 43. Un método para la modulación de la inflamación en un tejido, el cual comprende las etapas de: (a) poner en contacto el tejido con cuando menos una proteína que se une a MK2; y (b) permitir que la proteína module la inflamación en el tejido.
44. 44. Un método para el tratamiento de un paciente que padece de cuando menos una condición inflamatoria, el cual comprende las etapas de: (a) administrar una dosis terapéuticamente efectiva de cuando menos un compuesto seleccionado de un compuesto que interactúa con cuando menos una de MK2 o un complejo de MK2, en donde el compuesto es seleccionado de un anticuerpo, un agente químico, una pequeña molécula, una proteína y un péptido; y (b) permitir que el compuesto se una a cuando menos uno de MK2 o un complejo de MK2 y que module la inflamación.
45. 45. El método de la reivindicación 43, en donde la proteína o péptido es una forma muíante de un péptido o proteína de tipo silvestre que estimula la actividad de la MK2.
46. 46. El método de la reivindicación 43, en donde la proteína es seleccionada de STS, HPH2 y Sha
47. 47. El método de la reivindicación 43, en donde la condición se selecciona de enfermedad de Crohn, enfermedad de intestino inflamado, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfisema, reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, asma, lupus sistémico eritematoso, e inflamación debida a traumatismo o daño.
48. 48. Un método para la expresión de un ácido nucleico en un célula para inhibir la inflamación, el cual comprende las etapas de: (a) adicionar cuando menos un ácido nucleico que codifica para un compuesto seleccionado de un compuesto que interactúa con cuando menos uno de MK2 o un complejo de MK2, en donde el compuesto se selecciona de un anticuerpo, un agente químico, una pequeña molécula, una proteína y un péptido; y (b) permitir que la célula exprese el compuesto e inhiba la inflamación.
49. 49. El método de la reivindicación 47, en donde el ácido nucleico codifica para una proteína seleccionada de STS, HPH2 y Sha
50. 50. Un método para la detección de cuando menos una de la presencia, ausencia y cantidad de MK2 en una muestra, el cual comprende las etapas de: (a) administrar cuando menos un compuesto que interactúa con cuando menos una de MK2 o un complejo de MK2, en donde el compuesto es seleccionado de un anticuerpo, un agente químico, una pequeña molécula, una proteína y un péptido; y (b) correlacionar la ausencia, presencia o cantidad de proteína unida o compuesto con la ausencia, presencia o cantidad de MK2 en la muestra.
51. 51. El método de la reivindicación 49, en donde la proteína es seleccionada de STS, HPH2 y Shc.
52. 52. Un kit que hace posible la detección cualitativa de MK2 comprendiendo un compuesto que interactúa con cuando menos uno de MK2 o un complejo de MK2, en donde el compuesto es seleccionado de un anticuerpo, un agente químico, una pequeña molécula, una proteína y un péptido; y cuando menos otro componente del kit seleccionado de: (a) cuando menos uno de un regulador o una solución; (b) cuando menos un componente estructural.
53. 53. El kit de la reivindicación 52, el cual además comprende un agente que se une a la proteína o compuesto.
54. 54. El kit de la reivindicación 53, en donde el agente es un anticuerpo.
55. 55. El kit de la reivindicación 52, en donde la proteína se selecciona de STS, HPH2 y Sha
56. 56. Una composición farmacéutica, la cual comprende: (a) cuando menos una proteína que se une a MK2; y (b) cuando menos un portador farmacéuticamente aceptable.
57. 57. La composición de la reivindicación 56, en donde la proteína se selecciona de STS, HPH2 y Sha