JP2006515159A - Ｍｋ２相互作用タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、炎症を調節するためのＭＫ２に結合するタンパク質の使用に関する。より詳細には、本発明は炎症に関連する状態を処置するための、ＭＫ２に結合するタンパク質の使用に関する。本発明は、炎症状態（特に、炎症の低減が治療的に有益である炎症状態）を処置するのに有用である。本発明のＭＫ２結合タンパク質は、このようなタンパク質のスプライス改変体、短縮型、フラグメント、置換変異体、付加変異体、および欠失変異体、融合タンパク質、シャッフル変異体、ならびにモチーフ配列、ならびにホモログを含む。

Description

（関連出願）
本願は、米国仮特許出願番号６０／４００，０４４の優先権の利益に基づく。

（発明の分野）
本発明は、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２（ＭＫ２）に結合するタンパク質の使用に関する。より詳細には、本発明は、炎症に関連する状態を処置するための、ＭＫ２に結合するタンパク質の使用に関する。本発明は、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、急性呼吸窮迫症候群、気腫、遅延型過敏症、ぜん息、全身性エリテマトーデス、および外傷、損傷または卒中に起因する炎症のような状態を処置するのに有用である。

（発明の背景）
多くのヒトおよび動物の状態は、炎症に関連している。今日までに、これらの状態に対する信頼性があるか有効である治療はほとんど存在しない。しかし、これらの状態に関連するひどい症候は、この状態に罹患した患者において炎症を低減する治療を用いることにより実質的に低減され得る。このような治療は、これらの状態を治癒しないが、患者の生活水準を大きく改善し、これらの状態のいくつかの影響を改善し得る。従って、これらの状態に罹患した患者における炎症の全体的な低減に寄与し得る新規の治療法を同定する必要性が、当該分野に存在する。

炎症状態は、しばしば、サイトカインの不適切な調節に関連する（Ｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｅ３９−Ｅ４０（１９９９））。この理由から、炎症性サイトカイン発現の選択的インヒビターは、炎症に関連する状態の処置のための潜在的因子である。

ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２（ＭＫ２）は、いくつかのサイトカインの調節に寄与していると考えられており、従って、炎症応答の必須要素であり得る。ＭＫ２についてヌル変異を有するマウスは、リポ多糖により誘導される内毒素ショックに対する増加した耐性を示す（Ｋｏｔｌｙｒｏｖら，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１：９４−９７（１９９９））。このストレス耐性は、いくつかの炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γを含む）の生合成の減少から生じると考えられている。ＭＫ２は、炎症性サイトカインの調節において役割を果たすので、ＭＫ２に結合し、その活性を阻害するタンパク質は、炎症を低減する潜在的因子である。

ＭＫ２は、多くのタンパク質と会合することが示されている。ＭＫ２は、図７に示されるように、特定の環境ストレスまたは炎症性サイトカインに応答して、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼによりリン酸化される（Ｋｏｔｌｙａｒｏｖら，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１：９４−９７（１９９９））。ＭＫ２は、血清応答因子（ＳＲＦ）（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１４４３４−１４４４３（１９９９））、ＣＲＥＢおよびＥＲ８１（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：４１８５６−４１８６１（２００１））、熱ショック小タンパク質および白血球特異的タンパク質１（Ｎｅｉｎｉｎｇｅｒら，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２：７０３−７０８（２００１）で概説されている）、Ｅ４７（Ｎｅｕｆｅｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２０２３９−２０２４２（２０００））、Ａｋｔ（Ｒａｎｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３５１７−３５２３（２００１））、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＴＴＰ（Ｍａｈｔａｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１：６４６１−６４６９（２００１））をリン酸化する。さらに、ＭＫ２は、炎症メディエーターの一群であるロイコトリエンの合成における重要な工程を触媒する５−リポキシゲナーゼと相互作用する（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４１８５６−４１８６１（２００１））。しかし、１つのタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａ０は、ＭＫ２＋／＋および−／−細胞において差次的に調節されることが示されている。

従って、ＭＫ２は、その炎症応答への関与に起因して、望ましい治療的介入の標的であり得る。特に、ＭＫ２の活性を阻害する治療因子は、炎症の低減が治療的に有益であるヒトまたは動物の状態を処置するのに使用され得る。

（発明の要旨）
従って、本発明は、ＭＫ２と相互作用するタンパク質に関する。ＭＫ２に結合するタンパク質（このようなタンパク質のスプライス改変体、短縮型、フラグメント、置換変異体、付加変異体、および欠失変異体、融合タンパク質、シャッフル変異体、ならびにモチーフ配列、ならびにホモログを含む）は、潜在的な新規抗炎症薬因子である。

本発明はさらに、ＭＫ２およびＭＫ２相互作用タンパク質（例えば、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃ、ならびにそれらの改変体を含む）を含むタンパク質複合体に関する。さらなるＭＫ２相互作用タンパク質の例としては、ＳＲＦ、ＣＲＥＢ、ＥＲ８１、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＴＰ、熱ショック小タンパク質１、Ｅ４７、Ａｋｔ、および５−リポキシゲナーゼが挙げられる。これらのタンパク質の１つ以上がまた、ＭＫ２を含むタンパク質複合体中に存在し得る。本発明はまた、炎症の調節が望まれる状態および疾患を処置するための潜在的化合物を同定するための、このようなタンパク質複合体の生成方法および使用方法を提供する。

本発明は、ＭＫ２を発現する細胞における炎症性活性を調節するための方法を提供する。このような方法は、ＭＫ２に結合する有効量のタンパク質を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＭＫ２に結合する少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡ分子を投与することにより、細胞中でこのタンパク質を発現させるための方法を包含する。

本発明はまた、抗炎症薬を同定するための薬物スクリーニング方法を包含する。いくつかの実施形態において、抗炎症薬は、例えば、ＭＫ２および少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質を含む複合体を提供する工程、該複合体に有効量の試験化合物を添加する工程、および該試験化合物がＭＫ２と相互作用タンパク質との相互作用を阻害するか否かを決定する工程を包含する方法により同定される。本発明に従う方法により同定される抗炎症薬としては、ＭＫ２とＭＫ２相互作用タンパク質との間の相互作用を阻害する低分子、化学因子、タンパク質、ペプチド、および抗体が挙げられる。さらに、本発明はまた、ＭＫ２と少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質との間の相互作用を許容するがＭＫ２活性をブロックする潜在的な抗炎症薬を同定する方法を提供する。抗炎症薬の例としては、低分子、化学因子、タンパク質、ペプチド、および抗体が挙げられる。

本発明に従って、ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用し、ＭＫ２活性を調節する化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、化学因子、および低分子）は、炎症の低減が治療的に有益である医学的状態を処置または予防するために、治療有効用量で患者に投与され得る。その実施形態としては、炎症の増加に関連する細胞および組織が関与する状態の処置が挙げられる。

ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物は、薬学的調製物中に含まれ得る。この薬学的調製物は、他の成分（例えば、化合物がＭＫ２またはＭＫ２複合体に結合するのを補助する因子）を含み得る。

さらに、ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物は、ＭＫ２を定量的または定性的に検出するための診断ツールとして使用され得る。例えば、これらの化合物は放射標識され得、組織は標識タンパク質と共にインキュベートされ得、そして過剰な未結合タンパク質は洗い流され得る。次いで、この組織は、放射活性の存在について評価され得る。放射活性の存在は、ＭＫ２の存在を示す。ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物は、細胞、体液、組織、または器官におけるＭＫ２の存在、非存在、または量を検出するのに使用され得る。検出されるＭＫ２の存在または量は、本明細書中に列挙される医学的状態の１つ以上と関連付けられ得る。

本発明はまた、ＭＫ２とＭＫ２相互作用タンパク質（ここで、ＭＫ２相互作用タンパク質は、炎症応答を生じるＭＫ２活性を刺激する）との間の相互作用を促進する化合物を包含する。このような因子は、ＭＫ２の刺激およびそれに続くＴＮＦ−α産生の増加が望まれる状態（例えば、リステリア菌感染）の処置に特に有用である。

従って、本発明はまた、サンプル中のＭＫ２レベルの検出のために使用されるキットもまた包含する。このキットは、ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用する少なくとも１つの化合物（標識されている場合もされていない場合もある）、およびこの化合物に結合する少なくとも１つの因子（例えば、標識抗体）を備える。このキットはまた、実験的検出の結果を比較することが可能な、適切な生物学的標準およびコントロールサンプルもまた備え得る。このキットはまた、緩衝液または洗浄溶液およびこのキットを使用するための指示書を備え得る。当業者が実験を行い得る構造要素（例えば、スティック、ビーズ、ペーパー、カラム、バイアル、またはゲル）が備えられ得る。使用者は、これらを用いて実験を実施し得る。

（配列の簡単な説明）
以下の表は、本願に含まれる配列に関する情報を提供する。

（配列番号） （図） （配列の説明）
配列番号１ １Ａおよび１Ｂ ＳＴＳをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２ ２Ａおよび２Ｂ ＨＰＨ２をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号３ ３Ａおよび３Ｂ ＳｈｃをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号４ ４ 配列番号１のｃＤＮＡ配列によってコードされる
ＳＴＳのアミノ酸配列
配列番号５ ５ 配列番号２のｃＤＮＡ配列によってコードされる
ＨＰＨ２のアミノ酸配列
配列番号６ ６ 配列番号３のｃＤＮＡ配列によってコードされる
Ｓｈｃのアミノ酸配列。

（定義）
用語「複合体」は、２つ以上のタンパク質の会合をいう。このような会合は、共有結合性または非共有結合性（例えば、複合体中の２つのタンパク質の間のイオン性、親水性、および疎水性相互作用を含む）のいずれかであり得る。代表的には、複合体を形成するタンパク質は、この複合体中の第１タンパク質の同定または検出により、この第１タンパク質と複合体を形成するほかのタンパク質の同定または検出をもたらすように、互いに相互作用する。タンパク質複合体は、インビボで同定され得る（この場合、２つ以上のタンパク質が互いに天然で会合して（例えば、細胞中で）複合体を形成する）。あるいは、複合体は、インビトロで形成され得る（この場合、２つ以上のタンパク質間の相互作用は、これらのタンパク質が同じ反応混合物中に添加される場合に起こる）。複合体中のタンパク質の検出のために使用される方法としては、同時免疫沈降アッセイ、酵母ツーハイブリッドアッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ、およびプルダウンアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。ＭＫ２複合体は、ＭＫ２および少なくとも１つの他のタンパク質を含む複合体である。

用語「同時免疫沈降」は、２つのタンパク質間の相互作用を検出する方法をいう。例えば、２９３Ｔ細胞中で同時に発現されるＨＡタグ−ＭＫ２相互作用タンパク質（例えば、Ｓｈｃ）とＭＹＣタグ−ＭＫ２との間の相互作用は、免疫沈降により検出され得る。両方のタンパク質を同時発現する細胞から細胞溶解物が調製され、その後、抗ＨＡ抗体で免疫沈降される。免疫沈降物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離され、同時免疫沈降したＭＫ２を検出するため、抗ＭＹＣ抗体で免疫ブロットされる。

用語「ＨＰＨ２」は、ポリコーム群（ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｇｒｏｕｐ：ＰｃＧ）タンパク質の一種であり、約５１ｋＤａの分子量を有する、ヒトポリホメオティックホモログ２をいう。ＨＰＨ２は、ＭＫ２と相互作用して複合体を形成し、それによって、ＭＫ２活性を調節する。用語「ＨＰＨ２」はまた、ＭＫ２と相互作用するＨＰＨ２の改変体（スプライス改変体、ホモログ、ＨＰＨ２を含む融合タンパク質、短縮変異体および欠失変異体、フラグメント、置換変異体、付加変異体、シャッフル変異体、ならびにＨＰＨ２のモチーフ配列が挙げられる）を含む。従って、用語「ＨＰＨ２」はさらに、ＭＫ２と相互作用するＨＰＨ２の機能的改変体（ＨＰＨ２のフラグメントが挙げられる）をいう。ＨＰＨ２は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＰｃＧタンパク質「ポリホメオティック」およびマウスＲａｅ２８／Ｍｐｈ１タンパク質に相同である（Ｇｕｎｓｔｅｒら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７：２３２６−２３３５（１９９７））。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、ＰｃＧ遺伝子は、遺伝子活性の安定な遺伝を担う細胞メモリー系の一部である。ＰｃＧタンパク質は、大きな多量体のクロマチン結合タンパク質複合体を形成し、ジンクフィンガーモチーフならびにホモロジーＩおよびホモロジーＩＩという名の２つの領域を含む。これらの複合体は、発生の間、転写サイレンシング／活性化を維持し、細胞周期（特に、細胞分裂）の間は転写メモリーを維持する。ＰｃＧ遺伝子における変異は、造血細胞における増殖欠損に関連する。ＨＰＨ２のｃＤＮＡ配列は、図２Ａおよび２Ｂに提供され（配列番号２に対応する）、このタンパク質のアミノ酸配列は、図５に提供される（配列番号５に対応する）。図８Ｂは、ＨＰＨ２およびＨＰＨ２中のＭＫ２相互作用ドメインの構造を示し、図９Ｃは、ＭＫ２にけるＨＰＨ２相互作用ドメインを示している。ＨＰＨ２は、多くのシグナル伝達タンパク質（キナーゼ、足場タンパク質（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、アダプタータンパク質、およびＧＴＰＡｓｅ）および多くのＥＴＳファミリーの転写因子において見出される保存されたＣ末端ステライルアルファモチーフ（ＳＡＭ）タンパク質相互作用ドメインを有する。ＨＰＨ２は、転写レギュレーターであると考えられている。

用語「炎症」は、物理的因子、化学的因子、または生物学的因子により引き起こされる損傷または異常な刺激に応答して、影響される血管および周囲組織において起こる細胞学的および組織学的反応の動的な複合体からなる基本的な病理学的プロセスをいう。

用語「炎症状態」は、炎症が症候である状態をいう。このような状態としては、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、急性呼吸窮迫症候群、気腫、遅延型過敏症、ぜん息、全身性エリテマトーデス、および外傷または損傷に起因する炎症（例えば、虚血性脳損傷）が挙げられるがこれらに限定されない。

用語「ＭＫ２」および「ＭＫ２ポリペプチド」は、Ｓｔｏｋｏｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９６：８４３−８４９（１９９３））に記載されるタンパク質である、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２をいう。このタンパク質は、当初、ｈｓｐ２５／２７キナーゼとして同定された、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである。このタンパク質キナーゼは、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ）によるリン酸化後に活性であることが示されている。ＭＫ２は、ＴＮＦを転写後調節すると考えられており、かつ他のサイトカインの調節において重要であり得る。ＭＫ２についてのｃＤＮＡの分析は、以下の特徴を明らかにした（５’から３’への方向）：２つの推定ＳＨ３結合部位を含むプロリンリッチ領域、キナーゼ触媒ドメイン、ＭＡＰキナーゼによりリン酸化されたスレオニン残基、および核局在化シグナル。ＭＫ２−／−ノックアウトマウスは生存可能であるが、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−αの生合成が９０％減少しており、かつこれらのマウスはＬＰＳにより誘導されるショックに対して耐性である。用語「ＭＫ２」はさらに、ＭＫ２の改変体（スプライス改変体、ホモログ、ＭＫ２を含む融合タンパク質、短縮変異体および欠失変異体、フラグメント、置換変異体、付加変異体、シャッフル変異体、ならびにＭＫ２のモチーフ配列が挙げられる）を含む（ただし、これらの改変体は、ＭＫ２活性を有する）。この用語は、ＭＫ２の機能的改変体（本明細書中に記載される１つ以上のアッセイおよび当該分野で公知のアッセイにより測定される場合、改変型ＭＫ２タンパク質またはそのフラグメントがＭＫ２活性を有する）を含む。

用語「ＭＫ２に結合するタンパク質」および「ＭＫ２相互作用タンパク質」は、ＭＫ２と結合または会合するタンパク質をいう。この用語は、ＭＫ２との複合体において見出されるタンパク質を包含する。この用語はまた、ネイティブタンパク質と関連する１つ以上の生物学的活性を有するこのようなタンパク質の任意の改変体（スプライス改変体、短縮型、フラグメント、置換変異体、付加変異体、および欠失変異体、融合タンパク質、シャッフル配列、ならびにモチーフ配列、ならびにホモログが挙げられる）をいう。これらのタンパク質はさらに、ネイティブタンパク質に対して保存的変更または非保存的変更により改変されたアミノ酸配列を包含する。これらのタンパク質は、任意の供給源（天然源または合成源）から取得され得る。このタンパク質は、ヒトタンパク質であるか、または動物供給源（ウシ、鳥類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚類が挙げらる）から取得され得る。ＭＫ２に結合するタンパク質は、ＭＫ２を刺激し得るか、ＭＫ２を阻害し得るか、またはＭＫ２活性に対する影響を有さない。

用語「Ｓｈｃ」は、ｓｒｃホモロジーアンドコラーゲン（ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ）をいう（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら，Ｎａｔｕｒｅ，４０２：３０９−３１３（１９９９））。用語「Ｓｈｃ」はさらに、ＭＫ２と相互作用する、スプライス改変体、ホモログ、Ｓｈｃを含む融合タンパク質、短縮変異体および欠失変異体、フラグメント、置換変異体、付加変異体、シャッフル変異体、ならびにＳｈｃのモチーフ配列を包含する。この用語は、Ｓｈｃの機能的改変体（ただし、改変Ｓｈｃタンパク質はＭＫ２と相互作用し、ＭＫ２活性を調節する）を包含する。Ｓｈｃタンパク質（Ｓｈｃ Ａ）についてのｃＤＮＡ配列は、図３Ａおよび３Ｂに提供され（配列番号３に対応する）、このタンパク質のアミノ酸配列は、図６に提供される（配列番号６に対応する）。図８Ａおよび１６Ｂは、Ｓｈｃタンパク質における種々のドメイン（ＣＨ２、ＰＴＢ、ＣＨ１、ＳＨ２、およびＭＫ２相互作用ドメイン）を示す。図９Ｃは、Ｓｈｃと相互作用する、ＭＫ２中のドメインを示す。Ｓｈｃ Ａタンパク質の３つのイソ型：４６ｋＤａ、５２ｋＤａ、および６６ｋＤａは、細胞表面レセプターとの係合後にリン酸化される。小さい方の２つのイソ型は、異なる翻訳開始を通じて生成され、６６ｋＤａイソ型（固有のＮ末端ＣＨドメイン（ＣＨ２）を有する）は、選択的スプライシングを通じて生成される。Ｓｈｃホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインは、活性化された細胞表面レセプターのホスホチロシンに結合し、ＣＨ１ドメインのチロシンをリン酸化し、Ｇｒｂ２およびＳＯＳの動員を促進する。多くの活性化された細胞表面は、小さい方の２つのＳｈｃ Ａイソ型を通じてシグナルを伝達し、Ｒａｓ ＭＡＰキナーゼ経路を活性化する。対照的に、これらのレセプターに結合するｐ６６は、この有糸分裂経路における活性化を示す。コラーゲンホモロジー２（ＣＨ２）ドメインは、ｐ６６に特有であり、酸化ストレスを受けた際にリン酸化されるセリン３６を含む。Ｓｈｃの哺乳動物イソ型は、増殖（ｐ５２／ｐ４６Ｓｈｃ）、アポトーシス（ｐ６６Ｓｈｃ）、および生存期間（ｐ６６Ｓｈｃ）のような多様な機能を調節する（Ｌｕｚｉら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０：６６８−６７４（２０００））。

Ｓｈｃ Ａは、シグナル伝達アダプターホスホタンパク質であると考えられている。Ｓｈｃ Ａタンパク質のｐ４６およびｐ５２イソ型は、普遍的に発現される（それらが、発生的に調節される、脳および神経を除く）。ｐ６６は、特定の細胞型および組織において発現される。ｐ６６は、Ｒａｓ ＭＡＰＫ経路を活性化しないので、その結合（小さい方の２つのＳｈｃ Ａイソ型の結合と競合すると考えられる）は、その異なる発現を通じてＲａｓ ＭＡＰＫ経路の活性化を調節すると考えられる。ｐ６６−／−マウスから単離した細胞において、ｐ６６は、ｐ５３の下流に作用し、酸化ストレスに対する細胞応答（ＲＯＳおよびアポトーシスが挙げられる）を媒介することが示されている。ｐ６６イソ型の３６位のセリン残基（Ｓ３６）は、この活性に必要とされる。２つのＭＡＰキナーゼ：ＥｒｋおよびＪｎｋは、このセリンのリン酸化と関係付けられている。

用語「スムーセリン類似（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）」または「ＳＴＳ」は、スムーセリンと関係の近い特定のタンパク質をいう。用語「ＳＴＳ」はさらに、ＭＫ２と相互作用する、ＳＴＳの改変体（スプライス改変体、ホモログ、ＳＴＳを含む融合タンパク質、短縮変異体および欠失変異体、フラグメント、置換変異体、付加変異体、シャッフル変異体、ならびにＳＴＳのモチーフ配列が挙げられる）を包含する。この用語は、ＳＴＳの機能的改変体（ただし、改変ＳＴＳタンパク質はＭＫ２と相互作用する）を包含する。ＳＴＳは、完全に特徴付けられていないが、ＳＴＳの推定ｃＤＮＡが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）に蓄積されており、その推定分子量は１００ｋＤａである。ＳＴＳは、スムーセリンと９４％同一であり、両方のタンパク質は、ＮＣＢＩデータベースの既知タンパク質との配列相同性に基づきカルポニンホモロジードメインおよびアクチン結合ドメインを有する。これらのタンパク質は、アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）およびカルポニンホモロジードメイン（ＣＨ）を有する。ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏｐら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３４：４０１−４１１（１９９６）は、スムーセリンが、ジストロフィン、ウトロフィン、β−スペクトリン、およびα−アクチニンのアクチン結合ドメインに隣接する配列と有意な相同性を有することを決定した。細胞分画研究は、著者らに、スムーセリンが細胞骨格の一部であることを示唆した。ノザンブロット分析は、この遺伝子が、血管平滑筋を含むいくつかの組織で発現されるが、脳、脂肪組織、心筋、または骨格筋では発現されないことを明らかにした。ＳＴＳの発現パターンは、未だ決定されていない。ＳＴＳをコードするｃＤＮＡ配列は、図１Ａ〜１Ｂに提供されており（配列番号１に対応する）、このタンパク質のアミノ酸配列は、図４に提供されている（配列番号４に対応する）。ＳＴＳタンパク質の構造（ＭＫ２結合領域を含む）は、図８Ｃに示されている。このタンパク質は、Ｃ末端アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）およびカルポニンホモロジードメイン（ＣＨ）を有する。図９Ｃは、ＳＴＳと相互作用するＭＫ２のドメインを示している。ＳＴＳは、細胞骨格関連タンパク質であると考えられる。

用語「治療的利益」は、状態の病候の改善、状態の進行の遅延化、または状態の進行の休止をいう。治療的利益は、炎症の量のような状態の局面を、ＭＫ２に結合する少なくとも１つのタンパク質の投与の前後で比較することにより決定される。治療的利益はまた、炎症の量のような状態の局面を、ＭＫ２とタンパク質との相互作用（ここで、この相互作用は、ＭＫ２活性を刺激する）を阻害する少なくとも１つの因子の投与の前後で比較することにより決定される。さらに、治療的利益はまた、状態の局面を、ＭＫ２とタンパク質との間の相互作用（ここで、この相互作用は、ＭＫ２活性を阻害する）を促進する少なくとも１つの因子の投与の前後で比較することにより決定される。

しかし、特定の細菌感染（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染）のような特定の状態の場合、増強されたＭＫ２活性を有することが望ましい。従って、治療的利益はまた、ＭＫ２活性を増強するかまたはＭＫ２とタンパク質との相互作用（ここで、この相互作用は、ＭＫ２活性を増強し、例えば、最近感染に対する増加した耐性を生じる）を促進する因子の投与の前後に、このような感染に対する増加した耐性により決定され得る。

用語「処置する（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ、ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方をいう。処置が必要な者は、特定の医学的疾患をすでに有する個体および最終的にこの状態を取得し得る者（すなわち、この状態に対して感受性であり、従って、予防的測定が必要な者）を含み得る。例えば、これらの用語は、疾患または状態の重篤度の減少、疾患課程の期間の減少、疾患または状態に関連する１つ以上の症候の改善、疾患または状態に患った患者に対する有益な効果（必ずしも疾患または状態を治癒する必要はない）、および疾患または状態に関連する１つ以上の症候の予防を導く任意の処置を包含する。

本明細書中で使用される場合、用語「ドメイン」は、いくつかの独特の物理的特長または役割（例えば、独立した構造または機能）を有するポリペプチドの領域（タンパク質を含む）を意味する。ドメインは、そのポリペプチドに対してネイティブまたは非ネイティブであり得るポリペプチドの部分をいう。ドメインは、独特の物理的特長を有するアミノ酸配列を含み得るか、またはその配列のフラグメントを含み得る。ドメインは、ポリペプチドまたはタンパク質内の他のドメインと相互作用し得る。本発明のいくつかの実施形態において、ＭＫ２ポリペプチドおよび／またはＭＫ２相互作用タンパク質は、アフィニティータグ、放射性核種、酵素、およびフルオロフォアから選択されるドメインから選択される。このようなドメインは、ＭＫ２および相互作用タンパク質を含む複合体の単離または精製のため、またはこのドメインを含むタンパク質の単離のための使用され得る。ドメインの例としては、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域が挙げられるがこれらに限定されない。

用語「融合タンパク質」は、第１供給源由来の第１アミノ酸が、第２供給源由来の第２アミノ酸に共有結合または非共有結合により連結されているタンパク質をいう。ここで、第１アミノ酸配列および第２アミノ酸配列は同じではない。同じではない第１供給源および第２供給源としては、２つの異なる生物学的実体、または同じ生物学的実体由来の２つの異なるタンパク質、または生物学的実体および非生物学的実体が挙げられる。融合タンパク質としては、例えば、少なくとも２つの異なる生物学的供給源由来のタンパク質が挙げられる。生物学的供給源としては、任意の非合成核酸またはアミノ酸配列が挙げられる（例えば、本明細書中にさらに記載されるように、上記いずれかのゲノム配列またはｃＤＮＡ配列、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、ネイティブビリオンまたは変異体またはアナログ）。合成性供給源としては、生物学的系によってではなく、化学的に製造されたタンパク質配列または核酸が挙げられ得る（例えば、アミノ酸配列の固相合成）。融合タンパク質はまた、少なくとも２つの異なる合成性供給源由来のタンパク質または少なくとも１つの生物学的供給源および少なくとも１つの合成性供給源由来のタンパク質が挙げられる。

タンパク質またはポリペプチドを参照していう用語「単離された」は、その自然（またはネイティブ）環境（または供給源）から分離されたタンパク質またはポリペプチドをいう。従って、細胞から単離されたタンパク質またはポリペプチドは、細胞中の他のポリペプチドおよび成分を実質的に含まないように調製される。

本明細書中で使用される場合、用語「組み換え」は、その起源または操作によって、天然の状態では関連するポリペプチドの全てまたは一部と関連していないポリペプチドまたは天然には生じないポリペプチドをいう。

用語「Ｙ２Ｈ」は、２つのタンパク質間の相互作用を検出する酵母ツーハイブリッドシステムをいう。ツーハイブリッドは、２つの機能的に別個のドメインに分割された、酵母転写アクチベーター：ＧＡＬ４を用いる。異種タンパク質Ｘに融合された場合にそのＤＮＡ結合活性を保持するＤＮＡ結合ドメイン、および異種タンパク質Ｙに融合された場合にその転写活性化特性を保持する活性化ドメイン。２つの融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質は、酵母中で同時発現される。タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの間の相互作用が存在する場合、その会合は、転写アクチベーターの活性化ドメインをその結合ドメインの近くに持って行き、それによって、機能的な転写アクチベーターを再構成する。次いで、この再構成された転写アクチベーターは、酵母ゲノムに組み込まれた、ＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を含む多くのレポーター遺伝子の発現を駆動し得る。レポーター遺伝子の発現は、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの間の相互作用の指標となる。

（発明の詳細な説明）
（Ａ．ＭＫ２相互作用タンパク質）
本発明は、ＭＫ２と相互作用するタンパク質に関する。ＭＫ２と相互作用することが公知のタンパク質の例としては、ＳＲＦ、ＣＲＥＢ、ＥＲ８１、熱ショック低タンパク質、白血球特異的タンパク質１、Ｅ４７、Ａｋｔ、および５−リポキシゲナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。

ＨＰＨ２は、Ｙ２Ｈ系アッセイによってＭＫ２に結合することが以前から知られている（Ｂ．Ｎｅｕｆｉｅｌｄ，Ｎｅｕｅ Ｉｎｔｅｒａｋｔｉｏｎｓｐａｒｔｎｅｒ ｄｅｒ ＭＡＰＫＡＰ−Ｋｉｎａｓｅｎ ３ｐＫ ｕｎｄ ＭＫ２：ｄｉｅ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ−Ｐｒｏｔｅｉｎｅ ＨＰＨ２ ｕｎｄ Ｂｍｉ１ ｓｏｗｉｅ ｄｅｒ ｂａｓｉｓｃｈｅ Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ−Ｔｒａｎｓｋｒｉｐｔｉｏｎｓｆａｋｔｏｒ Ｅ４７（２０００）（未発行のＰｈ．Ｄ学術論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｚｂｕｒｇ）。この発見は、本発明において確認された（図２Ａおよび２Ｂ、図９Ｂおよび実施例５）。さらに、ＳＴＳ（図１Ａ〜１Ｂ、図９Ｂおよび実施例５）およびＳｈｃ（図３Ａおよび２Ｂ、図９Ｂおよび実施例５）は、本発明において、Ｙ２Ｈ系を用いてＭＫ２に結合することが示されている。

ＭＫ２に結合するタンパク質は、種々の方法を用いて単離され得る。例えば、実施例７に例示されるように、同時免疫沈降法が使用され得、ＭＹＣタグ−ＭＫ２が細胞中で同時発現される。細胞の溶解物を調製し、抗ＨＡ抗体または抗Ｖ５抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、抗ＭＹＣ抗体を用いて同時免疫沈降したＭＫ２を検出した。

実施例１〜５に例示されるように、酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系もまた使用可能である。この方法は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇによって初めて公式に記載された（Ｎａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９）。このツーハイブリッドシステムは、２つの機能的に異なるドメインに分割される、酵母転写アクチベーター（例えば、ＧＡＬ４）を使用する。ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインは、異種タンパク質Ｘに融合された場合にそのＤＮＡ結合活性を保持する。ＧＡＬ４活性化ドメインは、異種タンパク質Ｙに融合された場合にその転写活性化特性を保持する。この２つの融合またはハイブリッドタンパク質は、酵母において同時発現される。タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの間に相互作用が存在する場合、この関連は、ＧＡＬ４の活性化ドメインをその結合ドメインの近位に運び、それによって、機能的な転写アクチベーターを再構成する。この再構成された転写アクチベーターは次いで、酵母ゲノムに組み込まれた、ＤＮＡ結合ドメインへの結合部位を含む多くのレポーター遺伝子の発現を駆動し得る。従って、レポーター遺伝子の発現は、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの間の相互作用の指標となる。

Ｙ２Ｈ系は、タンパク質−タンパク質相互作用を研究する上で、それより以前の従来法を上回るいくつかの利点を提供する（Ｌｕｂａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６：５９−６４（１９９５））。第１に、この相互作用はインビボで生じるので、インビトロ生化学的結合アッセイに必要とされる条件の細かい労力のいる操作が必要とされない。第２に、Ｙ２Ｈ系は感度が高く、他の方法によって明らかにされない相互作用を検出し得る（Ｆｉｅｌｄｓら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９１（１９９４））。最後に、Ｙ２Ｈ系は、目的のタンパク質と相互作用するコードされるタンパク質についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする際に特に強力である。

Ｙ２Ｈ系に加えて、哺乳動物２ハイブリッドシステムもまた、ＭＫ２タンパク質と別のタンパク質との間の相互作用を研究するために使用され得る。例えば、２９３Ｔ細胞は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））の上流にＧＡＬ４に結合するＤＮＡ配列を含むプラスミド；ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合されたＭＫ２をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド；およびＶＰ１６アクチベーターに融合された、ＭＫ２と相互作用するタンパク質（Ｙ２Ｈを通じて同定されたようなもの）または推定ＭＫ２相互作用タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを用いてトランスフェクトされ得る。トランスフェクト細胞は、ＭＫ２および相互作用タンパク質の同時発現の後に溶解され、その溶解物は、レポーター遺伝子活性についてアッセイされる。レポーター遺伝子活性は、ＭＫ２がそのタンパク質と相互作用した場合のみに検出される。このアッセイによって、ＭＫ２とタンパク質との間の相互作用が、哺乳動物細胞において確認され得る。この哺乳動物ツーハイブリッドシステムはまた、Ｙ２Ｈ系を通じて同定されたような、ＭＫ２と別のタンパク質との間の相互作用を確認するのにも使用され得る。

同時免疫沈降またはツーハイブリッドシステムの使用に加えて、ｃＤＮＡライブラリーの低ストリンジェンシースクリーニングが使用され得、また、ＭＫ２に結合するタンパク質のＭＫ２結合ドメインをコードする配列に対するプローブを用いる縮重ＰＣＲ技術が使用され得る。より多くのゲノムデータが入手可能な場合、多くの配列プロファイリングおよび分析プログラム（例えば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＰｒｏｆｉｌｅＳｅａｒｃｈ（ＧＣＧ）、およびＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いる類似性検索が、ＭＫ２に結合するタンパク質のＭＫ２結合ドメインと有意な相同性を有する配列を含む新規タンパク質を発見するのに使用され得る。

実施例１１に示されるように、プロテオミクスアプローチもまた、ＭＫ２相互作用タンパク質を同定するのに使用され得る。野生型（＋／＋）細胞またはＭＫ２欠損（−／−）細胞をプレーティングし、^３３Ｐで標識した。ＭＫ２を３０分間活性化した後、その細胞溶解物を調製し、二次元ゲル電気泳動を用いて分析した。ゲルを比較して、差次的にリン酸化したタンパク質を同定した。図１２は、このアプローチを用いて差次的にリン酸化されたタンパク質（矢印）を示している。差次的にリン酸化されたタンパク質はまた、質量分析法を用いて同定され得る。

ＭＫ２に結合するタンパク質は、ＭＫ２を刺激するか、ＭＫ２を阻害するか、またはＭＫ２活性に対して効果を有さない。ＭＫ２に結合するタンパク質がＭＫ２の阻害または刺激の原因となる（従って、生物学的活性を有する）か否かを調査するためにいくつかの方法が存在する。ＭＫ２活性に変化を与える（特に、ＭＫ２活性を減少させる）、ＭＫ２に結合するタンパク質は特に、治療因子および炎症インヒビターとして使用するために好ましい候補である。さらに、天然ではＭＫ２を刺激するタンパク質のフラグメントまたは変異体は、ＭＫ２を阻害することが見出だされ得、従って、炎症インヒビターとしての候補である。例えば、一旦ＭＫ２に結合するタンパク質が同定され、ＭＫ２を刺激することが示されれば、そのタンパク質がなおもＭＫ２と相互作用するがＭＫ２活性に対して阻害効果を有するように、そのタンパク質において変異が作製され得る。ＭＫ２相互作用タンパク質の変異型は、本明細書中に提供される１つ以上のアッセイにおいて、ＭＫ２活性に対する効果について試験され得る。ＭＫ２に結合するがその活性に対する効果を有さないタンパク質もまた、治療因子として使用され得る。このようなタンパク質は、例えば、天然ではＭＫ２に結合しＭＫ２活性を刺激する内因性タンパク質と競合し得る。

ＭＫ２に結合するタンパク質がその活性に影響を及ぼすか否かを調査するため、ＭＫ２活性に対する結合タンパク質の効果（例えば、ＭＫ２キナーゼ活性）が決定され得る。例えば、ＨＡタグ−ＭＫ２相互作用タンパク質（例えば、Ｓｈｃ）およびＭｙｃタグ−ＭＫ２が、２９３Ｔ細胞において同時発現され得る。細胞溶解物が調製され、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離され得る。活性化ＭＫ２を検出するための抗体（例えば、抗ホスホＭＫ２スレオニン３３４）を用いたその後の免疫ブロッティングにより、ＭＫ２の活性化状態が決定される。あるいは、ＭＫ２キナーゼ活性に対するＭＫ２結合の効果は、ＭＫ２に対する既知の基質のリン酸化型の量を定量することによって決定され得る。

さらに、実施例９に例示されるように、ＴＮＦ−α生合成に対するＭＫ２相互作用タンパク質の効果が決定され得る。ＨＡタグ−ＭＫ２相互作用タンパク質（例えば、Ｓｈｃ）およびＭＹＣタグ−ＭＫ２が、ＴＮＦルシフェラーゼレポーター遺伝子と共に、適切な細胞（例えば、ＲＡＷ）に同時トランスフェクトされ得る。細胞は、未刺激であるか、またはアニソマイシンにより刺激されるかのいずれかである。ＴＮＦ産生についてのアッセイのために培地が回収され、細胞溶解物が調製されて、ルシフェラーゼ活性が決定される。ＭＫ２結合タンパク質の存在下でのＴＮＦの生合成は、コントロール細胞におけるそれと比較される。

実施例１０に例示されるように、ＭＫ２相互作用タンパク質のリン酸化状態に対するＭＫ２の効果もまた決定され得る。ＨＡタグ−ＭＫ２相互作用タンパク質（例えば、Ｓｈｃ）が、２９３Ｔ細胞において発現される。溶解物が調製され、そして抗ＨＡ抗体により免疫沈降される。この免疫沈降物は、キナーゼとして組換えＭＫ２を用いたインビトロキナーゼアッセイにおいて使用される。ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびその後のホスホイメージ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｅｒｙ）が、ＭＫ２相互作用タンパク質のリン酸化を検出するために使用される。

（Ｂ．ヌクレオチド配列およびタンパク質配列）
必ずしも必要ではないが、所望の場合、当業者は、ＭＫ２に結合する新規タンパク質のアミノ酸配列または核酸配列を決定し得る。例えば、本発明は、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃをコードするｃＤＮＡ配列を提供する（図１Ａおよび１Ｂ；２Ａおよび２Ｂ；３Ａおよび３Ｂ；ならびに配列番号１〜３）。本発明はまた、対応するこれらのタンパク質のアミノ酸配列を提供する（図４〜６；配列番号４〜６）。

本発明はまた、このような核酸配列およびアミノ酸配列のスプライス改変体、短縮型、フラグメント、置換変異体、付加変異体、または欠失変異体、融合タンパク質、シャッフル変異体、モチーフ配列、およびホモログを含む。例えば、その核酸配列またはアミノ酸配列は、ネイティブタンパク質の核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも７０〜７９％同一、または少なくとも８０〜８９％同一、または少なくとも９０〜９５％同一、または少なくとも９６〜１００％同一の配列を含み得る。当業者は、ＭＫ２に結合する領域が、結合に関与しないタンパク質の他の部分よりも、配列の変動を許容しないことを認識している。従って、これらのＭＫ２相互作用タンパク質の非結合領域は、このタンパク質がＭＫ２に結合するのを有意に変化させることのない、実質的な変動を含み得る。しかし、当業者はまた、その標的に対するタンパク質の親和性を有意に増加させるために多くの変更がなされ得ることを認識している。このような親和性を増大させる変更は、代表的に、例えば、ＭＫ２結合領域内のアミノ酸配列を変更し、そのタンパク質がＭＫ２に結合する能力を試験するかまたはこのような結合の強度を決定することによって経験的に決定される。全てのこのような変更（タンパク質のＭＫ２結合領域内であろうがその外側であろうが）は、本発明の範囲内に含まれる。

当業者は、ＭＫ２に結合するタンパク質が、それらの生物学的特性を変更することなく、それらのそれぞれのアミノ酸配列に対して任意の数の保存的変更を含み得ることを認識している。このような保存的アミノ酸改変は、アミノ酸側鎖の置換基（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等）の相対的な類似性に基づく。このような特徴を考慮した例示的な保存的置換は、当業者に周知であり、例えば、リジンからアルギニンまたはアルギニンからリジン；グルタミン酸からアルパルギン酸またはアスパルギン酸からグルタミン酸；セリンからスレオニンまたはスレオニンからセリン；グルタミンからアスパルギンまたはアスパルギンからグルタミン；バリンからロイシンもしくはイソロイシン、ロイシンからバリンもしくはイソロイシン、およびイソロイシンからバリンもしくはロイシンが挙げられる。さらに、ＭＫ２に結合するタンパク質は、ＭＫ２に結合しその活性を阻害する機能的フラグメントを作製するのに使用され得る。

相対的な配列類似性または同一性は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ^ＴＭ（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ．Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを用いて決定され得る。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０）を利用して、一致の数を最大にしギャップの数を最小にする２つの配列の整列を見出す。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、２つの配列の間での類似性の最良のセグメントの最適な整列を実施する。最適な配列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ．，９１（２）：３７９−８０（１９８１））を使用して、ギャップを挿入し、一致の数を最大にすることによって見出される。

上記の配列分析ソフトウェアパッケージは、本発明により開示されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の相同性を同定するための、多数の他の有用な配列分析ツールを備える。例えば、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−１０（１９９０））は、特定のデータベース（例えば、ＮＣＢＩで管理される配列データベース）中の問い合わせ配列（ペプチドまたは核酸のいずれか）に対する配列類似性について検索する；「ＦａｓｔＡ」（ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７（４６９３）：１４３５−４１（１９８５）；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（８）：２４４４−８（１９８８）もまた参照のこと）は、問い合わせ配列と同じタイプの配列のグループ（核酸またはタンパク質）との間の類似性についてのＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ検索を実行する；「ＴｆａｓｔＡ」は、タンパク質問い合わせ配列と任意のヌクレオチド配列グループとの間の類似性についてのＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ検索を実行する（これは、比較を実行する前に、６つ全てのリーディングフレームでヌクレオチド配列を翻訳する）；「ＦａｓｔＸ」は、フレームシフトを考慮して、ヌクレオチド問い合わせ配列とタンパク質配列グループとの間の類似性についてＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ検索を実施する。「ＴｆａｓｔＸ」は、フレームシフトを考慮して、タンパク質問い合わせ配列と任意のヌクレオチド配列のグループとの間の類似性についてＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ検索を実施する（これは、比較を実行する前に、核酸配列の両方の鎖を翻訳する）。

本発明は、ＭＫ２に結合するタンパク質のフラグメントを包含する。このようなフラグメントは、このタンパク質のＭＫ２結合領域の全てまたは一部を含む可能性がある。フラグメントとしては、このタンパク質のＭＫ２結合領域とＮ末端との間の配列および／またはこのタンパク質のＭＫ２結合領域とＣ末端との間の配列の全てを含むか、一部を含むか、またはそれらを含まない。

特定のアミノ酸は、タンパク質の活性（例えば、ＭＫ２に結合するタンパク質の結合特徴）に対して有害な影響を及ぼさずに、タンパク質において他のアミノ酸で置換され得ることが、当業者に理解される。従って、種々の変化が、それらの生物学的有用性または生物学的活性を認識できる程度に損失せずに、ＭＫ２に結合するタンパク質のアミノ酸配列、またはこのタンパク質をコードするＤＮＡ配列において作製され得ることが、本発明者らによって企図されうる。このような変化としては、スプライス改変体、短縮型、フラグメント、置換変異体、付加変異体、または欠失変異体、シャッフル変異体、モチーフ配列、融合タンパク質、ホモログ等が挙げられる。

このような変化を作製する上で、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質の生物学的機能を与える上でのヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野で一般的に理解される（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２（１９８２））。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、これは、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのタンパク質の相互作用を規定することが、認識されている
各アミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられている；これらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。このような変化を作製する上で、置換されるアミノ酸のヒドロパシー指数は、置換されるアミノ酸の±２以内、±１以内、および±０．５以内であり得る。

類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効率的になされ得ることもまた、当該分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるような、タンパク質の最も高い局所的平均親水性が、タンパク質の生物学的特性に相関することを記載している。

米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。このような変化を作製する上で、置換されたアミノ酸のヒドロパシー値は、置換されるアミノ酸の±２以内、±１以内、そして±０．５以内であり得る。

これらの改変は、保存的であり得、このタンパク質の構造または生物学的機能は、この変化によって影響を受けない。このような保存的アミノ酸改変は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等）に基づく。種々の上述の特徴を考慮する例示的な保存的置換は、当業者に周知であり、これらとしては、例えば、アルギニンからリジンまたはリジンからアルギニン；グルタミン酸からアルパルギン酸またはアスパルギン酸からグルタミン酸；セリンからスレオニンまたはスレオニンからセリン；グルタミンからアスパルギンまたはアスパルギンからグルタミン；バリンからロイシンまたはイソロイシン、ロイシンからバリンまたはイソロイシン、およびイソロイシンからバリンまたはロイシンが挙げられる。ＭＫ２に結合するタンパク質のアミノ酸配列は、このタンパク質のＭＫ２への結合に有害な影響を及ぼさない限り、任意の数の保存的変化を有するように改変され得る。このような変化は、標的に結合するタンパク質の部分の内側または外側に導入され得る。例えば、タンパク質の結合部分の内側に導入された変化は、その標的に対するタンパク質の親和性を増大させるように設計され得る。

（Ｃ．安定化改変）
安定化改変は、タンパク質を安定化し得、タンパク質のインビトロおよび／またはインビボの半減期を増強し得、タンパク質の循環半減期を増強し得、かつ／またはタンパク質のタンパク質分解性の分解を減少し得る。このような安定化改変としては、融合タンパク質、グリコシル化部位の改変、および炭水化物部分の改変が挙げられるがこれらに限定されない。当該分野で周知のように、第二のタンパク質が第一のタンパク質とインフレームで融合され、第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を含む翻訳されたタンパク質を生じるよう、融合タンパク質が調製される。例えば、本発明において、融合タンパク質は、ＭＫ２に結合するタンパク質が、第二のタンパク質（例えば、安定化タンパク質部分）と融合されるように、調製され得る。当業者に認識されているように、このような融合タンパク質は、必要に応じて、ＭＫ２に結合するタンパク質と安定化タンパク質部分との間にリンカーを含み得る。安定化タンパク質は、ＭＫ２に結合するタンパク質の全体的な安定性を増強する任意のタンパク質をであり得る。

ＭＫ２に結合するタンパク質は、グリコシル化され得るか、またはアルブミンもしくは非タンパク質ポリマーに連結され得る。例えば、ＭＫ２に結合するタンパク質は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，７９１，１９２号；または同第５，４１４，１３５号に示される様式で、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）の１つに連結され得る。タンパク質は、例えば、その循環半減期を増大するために、ポリマーに対する共有結合体化によって化学的に改変される。ポリマーおよびこれらをペプチドに結合させるための方法もまた、米国特許第４，７６６，１０６号および同第４，６０９，５４６号に示されている。

ＭＫ２に結合するタンパク質は、米国特許第５，８６４，０２０号に例示されるように、ＭＫ２に結合するタンパク質および免疫グロブリン配列を含む融合タンパク質を調製することによって安定化され得る。好ましくは（しかし、必ずしもそうとは限らないが）、免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ−１サブタイプ、ＩｇＧ−２サブタイプ、ＩｇＧ−３サブタイプ、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから取得され得るが、好ましくは、ＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３から取得される。１つの実施形態において、ＩｇＧのＦｃフラグメントが、ＭＫ２に結合するタンパク質に融合される。

ＭＫ２に結合するタンパク質は、ペグ化され得る。ペグ化は、身体中でのタンパク質の半減期を延長するために、そのタンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合するプロセスである。ＭＫ２に結合するタンパク質のペグ化は、炎症の最適な低減のために必要なタンパク質の投与の用量または頻度を減少させ得る。この技術の概説は、Ｂｈａｄｒａら，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７：５−２９（２００２）およびＨａｒｒｉｓら，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，４０：５３９−５５１（２００１）に提供される。

ＭＫ２に結合するタンパク質は、変更された（すなわち、元のまたはネイティブのグリコシル化パターンから変更された）グリコシル化パターンを有するように改変され得る。本明細書中で使用する場合、「変更された」とは、１つ以上の炭化水素部分が欠失していること、および／または少なくとも１つのグリコシル化部位が元のタンパク質に付加されていることを意味する。

タンパク質のグリコシル化は、代表的に、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の結合をいう。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはスレオニン）への結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた、使用され得る。

ＭＫ２に結合するタンパク質へのグリコシル化部位の付加は、このタンパク質が１つ以上の上記トリペプチド配列を含むようにこのタンパク質のアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。この変更はまた、元のタンパク質の配列への、１つ以上のセリン残基もしくはスレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によって、作製され得る（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。タンパク質のアミノ酸配列はまた、ＤＮＡレベルでの変化の導入によって変更され得る。

タンパク質の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的または酵素的連結による。使用される連結様式に依存して、糖は、以下に結合され得る：（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインの遊離スルフヒドリル基）、（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基）、（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの芳香族残基）、または（ｆ）グルタミンのアミド基。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６（１９８１）に記載されている。

ＭＫ２に結合するタンパク質上に存在する任意の炭化水素部分の除去は、化学的にかまたは酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物に対するタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖の切断を生じ、アミノ酸配列をインタクトなまま残す。

化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）；およびＥｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載される。タンパク質上の炭化水素部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）に記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。

ＭＫ２に結合するタンパク質は、タンパク質アルブミンまたはアルブミンの誘導体に連結され得る。タンパク質およびポリペプチドをアルブミンまたはアルブミン誘導体に連結するための方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，１１６，９４４号を参照のこと。

（Ｄ．ＭＫ２活性を調節する化合物のスクリーニング）
（１．薬物スクリーニングのための酵母ツーハイブリッドシステムの使用）
本発明はまた、ＭＫ２活性を調節する薬物（抗体、化学因子、低分子、タンパク質、およびペプチドを含む）をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態において、一旦Ｙ２ＨによりＭＫ２と別のタンパク質との間でタンパク質−タンパク質相互作用が検出されれば、Ｙ２Ｈにおけるそのタンパク質−タンパク質相互作用は、高スループット薬物スクリーニングのために使用され得る。例えば、一旦タンパク質−タンパク質相互作用が検出されれば、ＭＫ２および相互作用タンパク質のような２つのタンパク質を保持するポジティブ酵母コロニー（記載されるように、色および増殖によって同定される）は、抗体、化学因子、ペプチド、タンパク質、または低分子を含む薬物で処理され得る。薬物の存在下でのポジティブ酵母コロニーの色または増殖の変化は、この２つのタンパク質間の相互作用に対する効果を示す。

いくつかの実施形態において、ＭＫ２相互作用タンパク質は、細胞、組織、または生物全体を含む宿主における炎症誘発効果を有するＭＫ２活性を刺激する。従って、このような相互作用を破壊する薬物を同定することが望ましい。従って、Ｙ２Ｈ系は、ＭＫ２とＭＫ２活性を刺激するタンパク質との間の相互作用を破壊する薬物を同定するために使用され得、それによって、炎症の処置または予防におけるこのような薬物の使用を導く。

他の実施形態において、ＭＫ２相互作用タンパク質は、ＭＫ２活性を阻害し、細胞、組織、または生物全体を含む宿主における抗炎症効果を生じる。このような場合、Ｙ２Ｈ系は、本明細書中に記載されるように、２つのタンパク質を保有する酵母細胞の色および増殖の変化によりモニタリングされ得る、このような相互作用を強化する薬物を同定するために使用され得る。このような薬物は、続いて、炎症の処置または予防において使用され得る。

上述のように、特定の状態（例えば、特定の細菌感染）の場合、増強されたＭＫ２活性を有することが望ましい。従って、Ｙ２Ｈ系はまた、ＭＫ２と相互作用タンパク質との間の相互作用を強化し、続いて細菌感染に対する耐性を強化する薬物をスクリーニングするために使用され得る。このような薬物は、例えば、特定の細菌感染（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染）の処置または予防のために使用され得る。

（２．薬物スクリーニングのためのインビトロ再構成系の使用）
インビトロ再構成系もまた、薬物（ＭＫ２活性を調節する低分子、抗体、ペプチド、および化学因子が挙げられるがこれらに限定されない）の同定のために使用され得る。例えば、本明細書中に提供される任意のアッセイによるタンパク質−タンパク質相互作用の同定に続いて、このタンパク質は、２つのタンパク質間の相互作用を阻害する薬物を用いてインビトロで処理され得る。上述のように、ＭＫ２と別のタンパク質との間の相互作用を阻害する薬物を同定することが望ましい（このような相互作用がＭＫ２活性を刺激する場合）。さらに、インビトロ再構成系は、ＭＫ２および少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質を含むタンパク質複合体の形成および単離のために使用され得る。これらの複合体は、続いて、複合体形成を阻害または促進し、それによって炎症を調節しかつ／またはこの複合体中のＭＫ２の活性を阻害もしくは刺激することで炎症を調節する化合物の同定のために使用され得る。

ＭＫ２および相互作用タンパク質は、インビトロ翻訳系（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により提供される、ウサギ網状赤血球溶解物結合転写−翻訳系）で合成され、そして^３５Ｓ標識される。ＭＫ２とタンパク質との間の相互作用は、記載されるような同時免疫沈降によって確認される。あるいは、組換えＭＫ２および相互作用タンパク質が、発現系（Ｅ．ｃｏｌｉまたはバキュロウイルス昆虫細胞）を用いて産生され得る。これらの２つのタンパク質間の相互作用は次いで、同時免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と同様、プルダウンアッセイによって検出され得る。試験化合物が、インビトロ翻訳されたタンパク質の混合物に添加され、記載されるように同時免疫沈降が実施される。望ましい化合物は、ＭＫ２とタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物である（組換え産生タンパク質の場合、免疫沈降アッセイまたはプルダウンアッセイにおける相互作用の欠損または相互作用の減少によって決定される）。このような化合物は、続いて、炎症の処置または予防のために使用され得る。本発明のアッセイにおいて、それらの炎症に対する効果を試験され得る化合物の例としては、化学因子、低分子、ペプチド、タンパク質、および抗体が挙げられる。

インビトロ再構成系はまた、ＭＫ２に結合しＭＫ２活性を阻害する化合物を同定するために使用され得る。例えば、インビトロ翻訳されたＭＫ２または精製されたＭＫ２は、化合物と共にインキュベートされ得、続いて、本明細書中に記載されるように、既知の基質（例えば、Ｈｓｐ２７）をリン酸化する能力またはＴＮＦ−αの生合成を増加させる能力のいずれかについて試験される。しかし、ＭＫ２活性を測定する任意のアッセイが使用され得る。従って、ＭＫ２活性を阻害する化合物は、炎症の阻害または予防のために使用され得る薬物として同定される。しかし、ＭＫ２活性の増加が望まれる場合、ＭＫ２活性を増大する化合物は、特定の状態の処置に使用され得る。

（Ｅ．薬学的組成物）
本発明は、ＭＫ２に結合するタンパク質を含む組成物を提供する。このような組成物は、薬学的用途および患者への投与に適するものであり得る。この組成物は代表的に、ＭＫ２に結合する１つ以上のタンパク質および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。この組成物はまた、ＭＫ２および少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質を含むタンパク質複合体を含む。本明細書中で使用される場合、フレーズ「薬学的に受容可能な賦形剤」は、薬学的投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌因子、等張因子および吸収遅延因子等を含む。薬学的活性物質に対するこのような媒体および因子の使用が、当該分野で周知である。この組成物はまた、補助的な機能、追加の機能、または治療的機能の増強を提供する他の活性な化合物を含み得る。薬学的組成物はまた、投与のための指示書と共に、容器、パック、またはディスペンサに含まれ得る。

本発明の薬学的組成物として、本明細書中に記載される１つ以上の方法により同定される低分子、抗体、化学因子、タンパク質、およびペプチドを含む化合物を含む組成物もまた挙げられる。炎症を処置または予防するためのこれらの化合物の投与のための適切な用量は、医師により容易に決定され得る。用量の例としては、５ｍｇ〜５００ｍｇ、５０ｍｇ〜２５０ｍｇ、１００ｍｇ〜２００ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、１５ｍｇ〜８５ｍｇ、３０ｍｇ〜７０ｍｇ、および４０ｍｇ〜６０ｍｇが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の薬学的組成物は、意図された投与経路と適合するように処方される。投与を達成するための方法は、当業者に公知である。例えば、投与は、静脈内投与、筋内投与、直腸投与、または皮下投与であり得る。

皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、代表的に、以下の成分のうち１つ以上を含む：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート）：および張度調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調節され得る。このような調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアル中に封入され得る。

注射に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液または分散物、および滅菌性注射用溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与については、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ^ＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は滅菌性でなければならず、そして容易な注入可能性が存在する程度まで流体であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用から守られなければならない。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム））が含まれ得る。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびセラチン）を組成物中に含むことによって、もたらされ得る。

いくつかの実施形態において、ＭＫ２に結合するタンパク質は、身体からの迅速な排出に対してタンパク質を保護するキャリア（例えば、制御放出処方（移植片および微小カプセル化送達系を含む））を用いて調製される。生体分解性、生体適合性のポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販で入手され得る。ＭＫ２に結合するタンパク質を含有するリポソーム懸濁物もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って、調製され得る。

処置される状態に対して有益な治療的に有用なさらなる薬剤が、必要に応じてＭＫ２に結合するタンパク質を含まれ得るか、または、ＭＫ２に結合するタンパク質と同時もしくは連続的に投与され得る。

投与の容易さのためおよび投薬の均一性のために、単位投薬形態で組成物を処方することが、特に有利である。本明細書中で使用する場合、単位投薬形態は、処置される被験体に対する単一な投薬として適した、物理的に別個の単位をいう。各単位は代表的に、必要とされる薬学的キャリアに関して、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位投薬形態についての仕様は、活性化合物特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにこのような活性化合物を調合する分野における特有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。

（Ｆ．処置の徴候）
ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物は、ヒトまたは動物における種々の医学的状態を予防、診断、または処置するのに有用である。従って、本発明は、ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する少なくとも１つの化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、化学因子、および低分子）を、状態の症候を改善するのに十分な量で含む組成物を被験体に投与することにより、炎症に関連する状態を処置するための方法を提供する。このような状態としては、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、急性呼吸窮迫症候群、気腫、遅延型過敏症、ぜん息、全身性エリテマトーデス、および外傷または損傷または発作に起因する炎症が挙げられる。

（Ｇ．ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用する化合物を用いる処置方法）
ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用し、ＭＫ２活性を調節する化合物は、炎症に関連する１つ以上の症状を阻害または低減するために使用され得る。１つの実施形態において、炎症は、少なくとも５０％、または少なくとも６０、６２、６４、６４、６６、６８、７０、７２、７２、７６、７８、８０、８２、８４、８６、もしくは８８％、または少なくとも９０、９１、９２、９３、もしくは９４％、または少なくとも９５％〜１００％阻害される。化合物は、個々にまたは組み合わせて使用され得る。

本明細書中に記載されるような化合物を含む薬学的調製物は、治療有効量で投与され得る。ＭＫ２活性を調節する化合物は、タンパク質、ペプチド、抗体、化学因子、または低分子から選択され得る。本明細書中で使用される場合、化合物の「有効量」は、炎症を軽減して所望の生物学的結果を達成するのに十分な用量である。このような改善は、種々の方法（疼痛、腫れ、または赤みのような症状を測定する方法が挙げられる）により測定され得る。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡＣＲ）スコアが、慢性関節リウマチにおける炎症を測定するために使用される。ＡＣＲスコアは、圧痛関節（ｔｅｎｄｅｒ ｊｏｉｎｔ）および腫脹関節（ｓｗｏｌｌｅｎ ｊｏｉｎｔ）計数における２０％以上、５０％以上、または７０％以上の改善および以下の５つの基準のうちの少なくとも３つにおける２０％以上、５０％以上、または７０％以上の改善として規定される：患者の疼痛評価、医師および患者の全体的な評価、患者の自己評価による障害、および急性期反応物質（赤血球沈降率およびＣ反応性タンパク質レベル）。しかし、医師は、任意の障害における炎症を診断および測定し、本発明の方法を用いて同定される抗炎症薬を用いて炎症の低減を達成できることが理解される。

一般に、治療有効量は、被験体の年齢、状態、および性別、ならびに被験体における医学的状態の重篤度によって変動し得る。投薬量は、必要に応じて、観察される処置効果に適するよう医師によって決定さ得れ、調節され得る。ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用しＭＫ２活性を調節する少なくとも１つの化合物を投与するために適切な投薬量は、５ｍｇ〜５００ｍｇ、５０ｍｇ〜２５０ｍｇ、１００ｍｇ〜２００ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、１５ｍｇ〜８５ｍｇ、３０ｍｇ〜７０ｍｇ、および４０ｍｇ〜６０ｍｇの範囲であり得る。これらの化合物は、１用量で、または間隔を空けて（例えば、一日一回、週に一回および月に一回）投与され得る。投薬スケジュールは、炎症を低減するタンパク質の能力、タンパク質の半減期、または患者の状態の重篤度に依存して、調節され得る。一般に、これらの組成物は、投与後の最も長い時間にわたって、これらの化合物の循環レベルを最大化するよう、ボーラス用量として投与される。連続注入もまた、ボーラス投与後に使用され得る。

このようなタンパク質または化合物の毒性および治療効力は、標準的な薬学的手順によって決定され得る。サイトカインの発現または活性に対するタンパク質または化合物の効果を決定するための実験が、細胞培養物において実施され得る。また、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療的な有効用量）を決定するために、実験動物において実験が実施され得る。化合物の毒性と治療効果との間の用量比は、その治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表され得る。ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用し、ＭＫ２活性を調節する化合物（ペプチド、タンパク質、抗体、化学因子、および低分子）、および大きな治療指数を示す化合物が、本発明の処置方法において使用され得る。

細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲の評価に用いられ得る。このようなタンパク質および化合物の用量は、毒性がほとんどないかまたは毒性が全くないＥＤ_５０値を有する循環濃度の範囲内であり得る。用量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に依存してこの範囲内で変化され得る。ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用する任意の化合物について、治療的有効用量は、記載されるような細胞培養物アッセイから最初に推定され得る。細胞培養物において決定されたＩＣ_５０値を含む循環血漿濃度（すなわち、症状の最大半分の阻害を達成する試験タンパク質の濃度）範囲を達成するための用量が、動物モデルにおいて処方され得る。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定の用量の効果は、適切なバイオアッセイによってモニタリングされ得る。

（Ｈ．細胞を用いた処置方法）
ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用しＭＫ２活性を調節するタンパク質、ペプチド、または抗体を宿主に投与するための別の方法は、これらの化合物を発現する細胞を投与することである。タンパク質、ペプチド、または抗体を発現する細胞を、炎症を調節するのに使用するための部位に送達するために、種々の方法が使用され得る。本発明の１つの実施形態において、タンパク質、ペプチド、または抗体を発現する細胞は、標的化送達（例えば、炎症を有する組織の特定の部位へのこのような細胞のサンプルの直接注入）によって投与され得る。細胞を目的の部位に局在化するため、細胞は、それらの移動度を部分的に妨害する媒体またはマトリクス中で送達され得る。このような媒体またはマトリクスは、半固体（例えば、ペーストまたはゲル（ゲル様ポリマーが挙げられる））であり得る。あるいは、媒体またはマトリクスは、固体、多孔性固体（細胞が固体マトリクスに移動することを可能にし、かつ細胞が増殖する間そこにそれあを保持するもの）の形態であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、組換えＭＫ２ポリペプチドをコードする第１核酸およびＭＫ２相互作用タンパク質（例えば、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃ）をコードする第２核酸を含む。ＭＫ２および少なくとも１つの他のタンパク質を含有するＭＫ２複合体は、その後、宿主細胞から単離され得る。

（Ｉ．細胞中でＤＮＡを発現する方法）
ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用しＭＫ２活性を調節するタンパク質、ペプチド、および抗体をコードするＤＮＡは、細胞に導入され得る。次いで、このＤＮＡによってコードされるタンパク質、ペプチド、および抗体は、このような細胞中で発現され得る。本発明のいくつかの実施形態において、ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用し、それによってＭＫ２活性を調節するタンパク質、ペプチド、または抗体をコードするＤＮＡ分子は、細胞中のサイトカインの産生または活性を変更するために細胞に導入され得る。詳細には、タンパク質、ペプチド、または抗体をコードするＤＮＡ分子は、サイトカインの産生または活性を減少または阻害するため、細胞に導入され得る。

タンパク質、ペプチド、または抗体のポリヌクレオチド配列の送達は、組換え発現ベクター（例えば、キメラウイルスまたはコロイド状分散系）を用いて達成され得る。ポリヌクレオチド配列の治療的送達のために、標的リポソームが使用され得る。ＤＮＡを細胞に導入するために使用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスまたは鳥類レトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。多くのさらなるレトロウイルスベクター（例えば、多シストロンメッセージをコードし得るベクターまたは複数のプロモーターを含むベクター）は、複数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーの遺伝子を移入または組み込み得る。

組換えレトロウイルスは欠損性であるので、これらは、ウイルスの長末端反復配列中の調節配列の制御下で、レトロウイルスの全ての構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を必要とする。これらのプラスミドは、パッケージング機構がキャプシド形成のためのＲＮＡ転写物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列を有さない。パッケージングシグナルが欠失したヘルパー細胞株としては、例えば、ＰＳＩ．２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が挙げられるがこれらに限定されない。これらの細胞株は、ゲノムがパッケージングされていないので、空のビリオンを産生する。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナルがインタクトであるが、構造遺伝子が目的の他の遺伝子によって置き換えられている細胞に導入される場合、ベクターは、パッケージングされ得、ベクタービリオンが産生される。

あるいは、組織培養物中の第２のタイプの細胞が、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドで直接的にトランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られる細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出し、そしてこのベクターはその後、適切な細胞に導入される。

タンパク質、ペプチド、抗体をコードするポリヌクレオチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソーム）が挙げられる。リポソームは、送達ビヒクルとして有用な、人工的な膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性内部内にカプセル化され得、生物学的に活性な形態で細胞を送達し得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７（１９８１）を参照のこと）。リポソームビヒクルを使用する細胞への効率的な遺伝子移入のための方法が、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）を参照のこと）。リポソームの組成物は、通常、リン脂質と、代表的には、ステロイド（特に、コレステロール）との組み合わせを含む。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。

リポソーム産物において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシドおよびガングリオシドのようなホスファチジル化合物が挙げられる。例示的なリン脂質としては、タマゴホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。

（Ｊ．組織、器官、または生物においてＤＮＡを発現する方法）
ＭＫ２に結合するタンパク質（抗体を含む）をコードするＤＮＡ、ならびにＭＫ２複合体に結合することによりＭＫ２活性を調節するタンパク質、ペプチド、および抗体をコードするＤＮＡは、組織、器官、または生物内の細胞に導入され得る。次いで、ＤＮＡによりコードされるタンパク質、ペプチド、または抗体は、組織、器官、または生物の細胞において発現され得る。本発明の１つの実施形態において、タンパク質、ペプチド、または抗体をコードするＤＮＡは、組織、器官、または生物の細胞におけるサイトカインの産生または活性を変更するため、細胞に導入され得る。この方法は、組織、器官、または生物における減少を低減するのに使用され得る。本発明は、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、急性呼吸窮迫症候群、気腫、遅延型過敏症、ぜん息、全身性エリテマトーデス、および外傷または損傷に起因する炎症のような状態を処置するのに有用である。

本発明の１つの実施形態において、ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用しＭＫ２活性を調節するタンパク質、ペプチド、または抗体をコードするＤＮＡは、目的の特定の細胞型に標的化され得る。この細胞型は、組織、器官、または生物の成分であり得る。目的の配列を、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする別の遺伝子と共にウイルスベクターに挿入することによって、例えば、このベクターは、ここで、特定の細胞型に対して特異的となり、従って、特定の組織、器官、または生物に対して特異的であり得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を付着することによって標的特異的となり得る。標的化は、抗体を使用することによって達成され得る。当業者は、特定のポリヌクレオチド配列が、レトロウイルスゲノムに挿入され得るかまたはウイルスエンベロープに付着され得、タンパク質、ペプチド、または抗体のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達が可能となることを認識している。リポソームの標的化はまた、当該分野で公知のように、細胞特異性に基づき可能となる。

本発明の別の実施形態において、細胞は、組織、器官、または生物から除去され得、ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用しＭＫ２活性を調節するタンパク質、ペプチド、または抗体をコードするＤＮＡが細胞に導入され得、そしてこの細胞は、組織、器官、または生物に再導入され得る。次いで、これらの細胞は、目的の組織、器官、または生物に送達される場合、タンパク質、ペプチド、または抗体を産生する。細胞は、上記方法により組織、器官、または生物に再導入され得る。

（Ｋ．ＭＫ２の検出および単離方法）
ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物は、インビボまたはインビトロでＭＫ２の存在または量を検出するために使用され得る。これらとしては、タンパク質、ペプチド、抗体、化学因子、および低分子が挙げられる。ＭＫ２相互作用タンパク質の存在またはレベルと医学的状態を関連付けることによって、当業者は、付随する医学的状態を診断し得る。これらの化合物によって診断され得る医学的状態は、本明細書中に示されている。

このような検出方法は、当該分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、および他の適合する技術が挙げられる。これらの化合物はさらに、ＭＫ２を検出するためのこれらの技術のうちの１つ以上を組み込んだ診断キットとして提供され得る。このようなキットは、他の成分、パッケージ、指示書、またはＭＫ２の検出およびこのキットの使用を補助する他の材料を含み得る。

ＭＫ２またはＭＫ２複合体と相互作用しＭＫ２活性を調節する化合物が診断目的で意図される場合、例えば、リガンド基（例えば、ビオチン）または検出可能なマーカー基（たとえば、蛍光基、放射性同位体、または酵素）でそれらを改変することが望ましくあり得る。所望の場合、それらは、従来技術を用いて標識され得る。適切な標識としては、フルオロフォア、クロモフォア、放射活性原子、電子密集試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、代表的に、それらの活性により検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計によって定量可能な青色色素に変換する能力によって検出される。他の適切な結合パートナーとしては、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野で公知の多くのレセプター−リガンド対が挙げられる。他の順列および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そしてこれは本発明の範囲内の等価物としてみなされる。

ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物もまた、精製プロセスにおいてＭＫ２を単離するために有用である。１つのタイプのプロセスにおいて、化合物は、例えば、カラムまたは樹脂への組み込みによって固定化され得る。この化合物は、ＭＫ２を結合するために使用され、次いで結合したＭＫ２の放出を生じる状態に供される。このようなプロセスは、ＭＫ２の商業的製造のために使用され得る。

以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を提供する。当業者は、本発明の意図または範囲を変更することなくなされ得る多くの改変および変更を認識する。このような改変および変更は、本発明の範囲内に包含されると考えられる。実施例は、いかなる方法によっても、本発明を限定しない。本明細書および特許請求の範囲における数は全て、用語「約」によって修飾されることが理解される（例えば、用量における小さな変化は本発明の範囲内で考慮されるため）。

（実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの調製）
酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施する方法を、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；バージョンＰＴ３１８３−１；ＰＲ１Ｘ２９９）により発行されたＰｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌから適用させた。

プレトランスフォームヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリーを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した（＃ＨＹ４０５３ＡＨ）。このｃＤＮＡライブラリーを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主株Ｙ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にプレトランスフォームした。使用前、この酵母細胞を凍結して維持した。

酵母レポーター株ＡＨ１０９中のＤＮＡ−ベイト構築物を、Ｙ１８７酵母の接合パートナーとして使用した。

（実施例２：ＭＫ２−ベイト構築物の調製）
結合ドメイン（ＢＤ）を含むＭＫ２構築物を調製するため、全長キナーゼ（ＡＴＰ結合ポケット中のアミノ酸リジン９３がアルギニンに変異している）をコードするＭＫ２遺伝子フラグメントを、ＤＮＡ−ＢＤベクターｐＧＢＫＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）への指向性クローニングにより作製し、ＭＫ Ｋ９３Ｒ−ｐＧＢＫＴ７を作製した。９３位のリジンをアルギニンに変換し、触媒不活性形態のキナーゼを作製した。詳細には、ｐＧＢＫＴ７ベクターをＮｄｅ−Ｘｈｏで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動を用いて精製した。ＭＫ２フラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりｐＧＢＫＴ７ベクターにライゲートした。インサートを含むプラスミドを、制限分析により同定した。酵母を、このＭＫ２構築物で形質転換し、そしてその後、ＭＫ２発現を、形質転換したＡＨ１０９酵母株において確認した。

ＭＫ２構築物によりコードされるタンパク質の、宿主細胞に対する毒性を、ＭＫ２構築物で形質転換した細胞の増殖率と、空ベクターで形質転換した細胞の増殖率を比較することによって調査した。ＭＫ２構築物は、毒性でないと決定された。ベイト構築物または空ベクターを含む細胞は、実質的に同じ速度および細胞数で増殖した。

転写活性化を分析するため、ＭＫ２構築物で形質転換した細胞を、ＳＤ／−Ｔｒｐ／Ｘ−α−Ｇａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｔｒｐ／Ｘ−α−Ｇａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびＳＤ／−Ａｄｅ／−Ｔｒｐ／Ｘ−α−Ｇａｌ培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上に置いた。結果は、ＭＫ２タンパク質自体は転写を活性化しないことを示した。ＭＫ２ベイト構築物を含む酵母は、トリプトファンを産生したが、これらの酵母は、アデニンまたはヒスチジンを産生しなかった。クローンは、ＳＤ／−Ｔｒｐ／Ｘ−α−Ｇａｌ培地上で増殖したが、青色を生じなかった。クローンは、ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｔｒｐ／Ｘ−α−Ｇａｌ培地またはＳＤ／−Ａｄｅ／−Ｔｒｐ／Ｘ−α−Ｇａｌ培地上で増殖しなかった。このことは、内因性レポーター遺伝子の全般的な転写活性化がなかったことを示している。

（実施例３：酵母ツーハイブリッドライブラリーのスクリーニング）
ライブラリーをスクリーニングするのに使用したＭＫ２は、全長でありかつ触媒不活性であった。この不活性変異体は、ＭＫ２ ＡＴＰ結合ポケット中の保存されたリジンにおいてアラニン置換をコードし、ＭＫ２を不活性化する（Ｋｏｔｌｙａｒｏｖら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ２２，４８２７−４８３５（２００２））。不活性化キナーゼは、相互作用タンパク質により安定に結合し、それによって２ハイブリッドレポーター遺伝子のより強力な転写活性化を可能にすることが知られているので、この形態を使用した。

ＭＫ２構築物で形質転換した酵母のコロニーを、２５０〜２７０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で一晩ＳＤ／−Ｔｒｐ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）培地中に接種した。次の日、ＯＤ_６００が＞０．８でることを測定した。この細胞を、１０００×ｇ、５分間の遠心分離によりスピンダウンした。上清をデカントし、そして細胞ペレットを、ボルテックスにより残留液に再懸濁した。

ライブラリー培養物のうちの１つの凍結アリコート（約１．０ｍｌ）を室温の水槽で解凍した。この細胞を穏やかにボルテックスした。全ＭＫ２ベイト培養物および１ｍｌライブラリー培養物を合わせた。４５ｍｌの２×ＹＰＤＡ／Ｋａｎ（酵母エキス、ペプトン、デキストロース、アデニン、およびカナマイシンのブレンド；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を培養物に添加し、穏やかにかき混ぜ、そして容量を、２×ＹＰＤＡ／Ｋａｎで５０ｍｌにした。この細胞を、穏やかにかき混ぜながら（３０〜５０ｒｐｍ）、３０℃で一晩インキュベートした。

細胞を滅菌遠心分離ボトルに移し、そして１０００×ｇ、１０分間遠心分離することによりスピンダウンした。ペレットを、５０ｍｌの２×ＹＰＤＡ／Ｋａｎに再懸濁し、次いで、細胞を、１０００×ｇ、１０分間スピンダウンした。この洗浄工程を繰り返した。その後、細胞を、１０ｍｌの０．５×ＹＰＤＡ／Ｋａｎ培地に再懸濁した。

２００μｌの接合混合物を、約５０個の大きな（１５０ｍｍ）ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上に置いた。このプレートをインキュベートし、コロニーがプレート上で見えるまでコロニーを３０℃でコロニー側を下にした。クローンを、ＳＤ／−Ｌｅｕ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＳＤ／−Ｔｒｐ、およびＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プレート上での増殖についてスコア付けした。一倍体細胞および二倍体細胞は、ＳＤ／−ＬｅｕまたはＳＤ／−Ｔｒｐ培地上で増殖した。ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ培地上では、二倍体細胞のみが増殖した。接合効率は、５．４％であることが決定された。

ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ Ｘ−α−Ｇａｌ培地を含むプレート上で増殖したコロニーを、ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ Ｘ−α−Ｇａｌプレートに再度ストリークし、表現型を確認した。次に、クローンをＸ−α−ＧＡＬ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有するよりストリンジェントなＳＤ／−Ａｄｅ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐプレート上でスクリーニングした。ポジティブなクローンを、グリッド式（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、ＳＤ／−Ａｄｅ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ上に再度ストリークし、マスタープレートを作製した。酵母のＤＮＡプレップおよびグリセロールストックを、これらのマスタープレートから作製した。

（実施例４：推定ポジティブクローンの分析）
ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ^ＴＭ酵母プラスミド単離キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；＃Ｋ１６１１−１）は、酵母からプラスミドを単離するための試薬およびツールを提供した。酵母を、マスタープレート上にストリークした個々のポジティブ体から取得し、そして９０ウェルプレート形式で５０μｌ Ｔｒｉｓ ＥＤＴＡに再懸濁した。１０μｌのリチカーゼを各ウェルに添加した。このプレートを、３７℃で１時間インキュベートし、その後、２０μｌの２０％ＳＤＳを添加した。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎターボプレップ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて精製した。サンプルを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；＃Ｋ１９１０−１）を用いてＰＣＲ増幅した。インサートを配列決定により同定した。

（実施例５：ポジティブクローンの分析）
独立した配列を、細菌（ＤＨ５α）に形質転換し、その後、その細菌からＤＮＡを単離した。次に、ＤＮＡを酵母株ＡＨ１０９に形質転換した。いくつかのベイト：ＭＫ２、触媒不活性ＭＫ２ Ｋ９３Ｒ、空ベクターｐＧＢＫＴ７、ＴＰＬ２、ｐ５３、およびＬａｍｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、酵母株Ｙ１８７に形質転換した。ＡＨ１０９において形質転換した各々の独立した配列の株を、３つのベイトの各々で形質転換したＹ１８７酵母と接合した。ＳＤ／−Ａｄｅ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ上での増殖およびＳＤ／−Ｌｅｕ／− Ｔｒｐ Ｘ−α−ＧＡＬ上での青色によりアッセイした場合に、ＭＫ２およびＭＫ２ Ｋ９３Ｒと相互作用したが、空ベクターｐＧＢＫＴ７、ＴＰＬ２、ｐ５３、またはＬａｍｉｎと相互作用しなかった独立クローンを、特定のＭＫ２相互作用タンパク質をコードするＤＮＡインサートを含むクローンとして同定した（図９Ａ）。ＭＫ２相互作用タンパク質は、野生型ＭＫ２およびＭＫ２ Ｋ９３Ｒと実質的に同じ親和性で結合した。このことは、ＭＫ２の結合が、キナーゼ不活性化変異体ＭＫ２ Ｋ９３Ｒの結果ではないことを示している。特徴付けられた独立ＤＮＡ配列によりコードされる１つのタンパク質は、「スムーセリン類似」（ＳＴＳ）であった。このタンパク質をコードするｃＤＮＡを図１および配列番号１に提供し；そのアミノ酸配列を、図４および配列番号４に提供する。

独立クローンによりコードされる別のタンパク質は、ヒトポリホメオティック２（ＨＰＨ２）であった。このタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、図２および配列番号２に提供され；そのアミノ酸配列は、図５および配列番号５に提供される。ＨＰＨ２は、ステライルアルファモチーフ（ＳＡＭ）タンパク質相互作用ドメインを有する。

単離された独立ＤＮＡ配列によってコードされるさらに別のタンパク質は、ｓｒｃホモロジーアンドコラーゲン（Ｓｈｃ）であった。このタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は図３および配列番号３に提供され；そのアミノ酸配列は、図６および配列番号６に提供される。Ｓｈｃの最長のイソ型（ｐ６６ Ｓｈｃ Ａ）は、Ｎ末端ＣＨ２ドメイン、それに続き、このタンパク質のＣ末端にＰＴＢ、ＣＨ１、およびＳＨ２ドメインを有する。

（実施例６：ＭＫ２相互作用ドメインの描写）
Ｓｈｃ Ａ、ＨＰＨ２、およびＳＴＳとの相互作用に必要とされるＭＫ２ドメインを描写するために、いくつかのＭｋ２欠失変異体を使用した。試験したＭＫ２変異体は、ＭＫ２▽Ｎ（ＭＫ２アミノ酸４１〜４００）、ＭＫ２▽Ｃ（ＭＫ２アミノ酸１〜３７０）、およびＭＫ２Ｃａｔ（ＭＫ２触媒ドメインアミノ酸４１〜３３８）を含んだ。ＭＫ２▽Ｎは、プロリンリッチなＮ末端が欠失されており、ＭＫ２▽Ｃは、ＭＫ２核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびｐ３８結合部位が欠失されており、そしてＭＫ２Ｃａｔは、Ｎ末端プロリンリッチドメインならびにＣ末端自己阻害ドメイン、核輸送シグナル（ＮＥＳ）、およびＮＬＳが欠失されていた。２ハイブリッド分析は、Ｓｈｃ Ａが、全長ＭＫ２、ＭＫ２▽Ｃ、およびＭＫ２Ｃａｔと等しく十分に相互作用することを示した。しかし、ＭＫ２▽Ｎとの相互作用は、ほとんど検出できなかった。Ｓｈｃ Ａとの相互作用プロフィールは、最低、Ｓｈｃ ＡはＭＫ２触媒ドメインと相互作用すること、およびＭＫ２のＮ末端の欠失は紺補メーション変化を誘導し得、その結果Ｓｈｃ ＡはＭＫ２と効果的に結合しなくなることを示している。

ＨＰＨ２は、全長ＭＫ２、ＭＫ２▽Ｎ、およびＭＫ２▽Ｃと実質的に同じ親和性で結合する。しかし、ＭＫ２Ｃａｔとの相互作用は、ほとんどなかった。従って、ＨＰＨ２は、ＭＫ２のＮ末端またはＣ末端での結合を必要とするようであり、一方、ＭＫ２触媒ドメインは、単独で発現された場合、匹敵するレベルまでＨＰＨ２のＭＫ２との結合を促進しない。

スムーセリン類似は、酵母における増殖および着色アッセイによってアッセイした場合、Ｓｈｃ ＡまたはＨＰＨ２のいずれよりも高い親和性でＭＫ２と結合する。さらに、スムーセリン類似は、ＭＫ２、ＭＫ２▽Ｎ、ＭＫ２▽Ｃ、およびＭＫ２Ｃａｔと実質的に同じ親和性で結合する。これは、ＭＫ２における複数の部位がこのタンパク質と相互作用することを示している。

（実施例７：哺乳動物細胞におけるＳｈｃ ＡおよびＨＰＨ２によるＭＫ２の同時免疫沈降）
図１０Ａに示されるように、Ｖ５タグ−ＳｈｃおよびＭＹＣタグ−ＭＫ２を、２９３Ｔ細胞において同時発現した。細胞を刺激しなかったか、または１０μｇ／ｍｌのアニソマイシンで３０分間刺激した。Ｖ５またはＭｙｃに対する抗体を用いた細胞溶解物のウェスタンブロッティングは、Ｖ５タグ−ＳｈｃおよびＭＹＣタグ−ＭＫ２タンパク質の両方が発現されていたことを示している。細胞溶解物を、抗Ｖ５抗体で免疫沈降した。免疫沈降物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、そして抗ＭＹＣ抗体を用いて免疫ブロットした。抗ＭＹＣ抗体は、免疫ブロットに結合している。これは、ＭＹＣタグ−ＭＫ２がＶ５タグ−Ｓｈｃと同時免疫沈降したことを示している。このことは、ＭＫ２とＳｈｃとの間の相互作用を示している。

類似の実験において、抗ＨＡ抗体を用いた同時免疫沈降およびその後の抗Ｍｙｃ抗体を用いた免疫ブロッティングは、ＭＫ２が、ＨＰＨ２およびｐ３８と同時免疫沈降することを示している（図１０Ｂ）。ＨＡタグ−ｐ３８、ＨＡタグ−ＨＰＨ２、およびＭｙｃタグ−ＭＫ２は、ウェスタンブロッティングによって示されるように、２９３Ｔ細胞において発現した。

同時免疫沈降は、２つのタンパク質の結合を検出するため、または他の方法（例えば、Ｙ２Ｈ系）において見出された２つのタンパク質間の結合の結果を確認するために使用され得る。

（実施例８：ＭＫ２活性化に対する結合タンパク質の効果）
ＨＡタグ−ＭＫ２相互作用タンパク質（例えば、Ｓｈｃ）およびＭＹＣタグ−ＭＫ２を、２９３Ｔ細胞において同時発現させる。細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離する。ＭＹＣタグ−ＭＫ２およびＨＡ−相互作用タンパク質を検出するためのＭｙｃおよびＨＡ抗体を用いたその後の免疫ブロッティングにより、これらのタンパク質が発現されることを確認する。ＭＫ２の活性化は、ＭＫ２のリン酸化を含むので、リン酸化されたＭＫ２を検出するための抗体（例えば、抗ホスホＭＫ２スレオニン３３４（ｐ３３４）を用いた免疫ブロッティングにより、ＭＫ２の活性化状態を決定する。ＭＫ２が単独で発現された場合のＭＫ２ ｐ３３４の量との比較における、ＭＫ２アクチベーターと同時発現された場合のＭＫ２ ３３４の量の差は、ＭＫ２相互作用タンパク質の存在下での変更されたＭＫ２活性を示す。

（実施例９：ＴＮＦ生合成に対するＭＫ２相互作用タンパク質の効果）
２つの空のベクター構築物を、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞において同時発現し、ＥＬＩＳＡによって検出される場合のＴＮＦ−α生合成の基底レベルを確立した（図１１）。細胞を刺激しないか、またはリポポリサッカリド（ＬＰＳ）で刺激し、ＭＫ２触媒活性を刺激した。ＴＮＦ−αの発現レベルを、ＭＫ２、ｐ３８、またはＳｈｃを空ベクターと共に同時発現させた細胞において検出した。そのレベルは、ベクターのみにより見出される基底レベルと同等であった。ｐ３８およびＳｈｃを同時発現させた細胞の場合、ＴＮＦ−αの発現レベルは、コントロールにおいて検出されたレベルよりも高かった。同様に、ＳｈｃおよびＭＫ２の同時発現は、ＴＮＦ−αレベルを増大した。

（実施例１０：ＭＫ２相互作用タンパク質のリン酸化状態に対するＭＫ２の効果）
ＨＡタグ−ＭＫ２相互作用タンパク質を、２９３Ｔ細胞において発現する。細胞溶解物を調製し、抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降する。免疫沈降物を、組換えＭＫ２をキナーゼとして添加したインビトロキナーゼアッセイにおいて使用する。ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびその後のホスホイメージ化を用いて、ＭＫ２相互作用タンパク質のリン酸化を検出する。ＭＫ２の存在下でのＭＫ２結合タンパク質またはＭＫ２相互作用タンパク質のリン酸化、およびＭＫ２の非存在下でのＭＫ２相互作用タンパク質の減少したリン酸化または非リン酸化は、ＭＫ２がＭＫ２相互作用タンパク質をリン酸化することを示す。ＭＫ２相互作用タンパク質は、ＭＫ２の基質であっても、そうでなくともよい。

（実施例１１：プロテオミクスアプローチを用いたＭＫ２相互作用タンパク質の検出）
プロテオミクスアプローチを用いて、ＭＫ２相互作用タンパク質を同定することが可能である。野生型（＋／＋）細胞またはＭＫ２欠損（−／−）細胞をプレーティングし、^３３Ｐ標識した。ＭＫ２を３０分間活性化し、その後、全細胞溶解物を調製し、二次元ゲル電気泳動を用いて分析した。ゲルを比較し、差次的にリン酸化したタンパク質を同定した。図１２Ａは、等電点が５．４の差次的にリン酸化したタンパク質（矢印）を示している。ＭＫ２＋／＋細胞におけるリン酸化の不在は、タンパク質移動におけるリン酸化依存性の変化に起因し得る。図１２Ｂは、同じ領域の銀染色を示しており、分離したタンパク質の量を示す。

（実施例１２：ＨｅＬａ細胞においてＳｈｃ Ａと同時発現した場合、ＭＫ２は活性化される）
Ｓｈｃ Ａと同時発現した場合のＭＫ２の活性化状態を決定した。Ｈｓｐ２７は、ＭＫ２の生理学的基質である。ＨｅＬａ細胞における内因性ＨＳＰ２７のリン酸化はＭＫ２応答性であり、従って、ＭＫ２活性を決定するのに使用され得る。ＨｅＬａ細胞を、ベクターのみまたはベクターおよびＶ５−Ｓｈｃ ＡまたはＭｙｃ−ＭＫ２（コントロールとして）のいずれかでトランスフェクトした。並行して、細胞を、Ｖ５−Ｓｈｃ ＡおよびＭｙｃ−ＭＫ２の両方で同時トランスフェクトした。発現させた後、細胞を未刺激のままにするか、またはアニソマイシンで３０分間刺激しＭＫ２を活性化した。リン酸化Ｈｓｐ２７（ｐＨｓｐ２７）に対する抗ホスホペプチド特異的抗体を用いたその後の免疫ブロッティングは、刺激した場合のｐＨｓｐ２７の増加を示している。内因性Ｍｙｃ−ＭＫ２の発現により、未刺激細胞における基底ｐＨｓｐ２７レベルが増加した（図１３Ａ）。この基底リン酸化の増加は、Ｓｈｃ Ａまたはベクターコントロール発現細胞においては観察されない。デンシトメトリーを用いたこれらの結果の定量は、空ベクターまたはＶ５−Ｓｈｃ Ａと比較した場合にＭｙｃ−ＭＫ２発現で見られる基底ｐＨｓｐ２７の増加が、１．５〜２倍であることを示している。基底ｐＨｓｐ２７レベルは、Ｍｙｃ−ＭＫ２がＶ５−Ｓｈｃ Ａと同時発現された場合にさらに増加した。定量は、この増加が、Ｍｙｃ−ＭＫ２を単独で発現させた場合の３倍のレベルであることを示している（図３Ｂ）。２９３Ｔ細胞において示されるように、ＭＫ２レベルは、Ｓｈｃ Ａの同時発現によって増加し、このことは、ＭＫ２とＳｈｃ Ａとの間の相互作用をさらに説明するものである。観察された基底ｐＨｓｐ２７の増加は、増加したＭＫ２活性および増加したＭＫ２タンパク質レベルを反映している可能性がある。基底ｐＨｓｐ２７は、ＭＫ２レベルにより正規化した場合、２〜３倍増加することを示した（図１３Ｃ）。この増加は、Ｓｈｃ Ａの同時発現によるＭＫ２の活性化を反映していると考えられる。

増加したＭＫ２活性は、ｐ６６ Ｓｈｃ Ａの同時発現によって観察される。内因性Ｈｓｐ２７のリン酸化は、ＨｅＬａ細胞におけるＭＫ２活性に応答性である。増加したｐＨｓｐ２７は、ＭＫ２−ｐ６６ Ｓｈｃ Ａの同時発現の場合に観察され、このことは、ＭＫ２がｐ６６ Ｓｈｃ Ａの結合により活性化されることを示している。ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＭＫ２−ｐ６６ Ｓｈｃ Ａの同時発現によるＴＮＦ−αレベルにおいて観察される増加は、ＭＫ２がＳｈｃ Ａの同時発現により活性化されることを確認するものである。ｐ６６ Ｓｈｃ ＡによるＭＫ２の活性化は、Ｓｈｃ Ａの結合を通じて、細胞質におけるＭＫ２の局在化および保持を生じ得る。細胞質局在化は、次いで、細胞質基質（例えば、Ｈｓｐ２７およびＴＮＦ−α ｍＲＮＡ）へのＭＫ２のアクセスを増加させ得る。あるいは、ＭＫ２は、細胞質Ｓｈｃに結合し、ＭＫ２がさらに活性化される細胞質へとＭＫ２を局在化することを促進し得る。

（実施例１３：ＲＡＷ２６４．７細胞においてＳｈｃ Ａと同時発現された場合、ＭＫ２は活性化される）
ＭＫ２は、Ｓｈｃ Ａと同時発現された場合に活性化された（ＨｅＬａ細胞におけるｐＨｓｐ２７のレベルによりアッセイした）。ＭＫ２が、Ｓｈｃ Ａと会合して活性化されることをさらに確認するために、ＲＡＷ２６４．７細胞から分泌したＴＮＦタンパク質を、ＭＫ２およびＳｈｃ Ａの両方の存在下でアッセイした。ＭＫ２を欠失させたマウス由来の細胞からのデータは、ＬＰＳに応答し、ＴＮＦ−α生合成が９０％減少したことを示している。その後の実験は、触媒活性を有するＭＫ２が、これらの細胞においてＴＮＦ生合成を回復し、それによってＴＮＦ−αの生合成に必要なＭＫ２酵素活性を確立するのに必要とされることを示した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、ベクターのみでトランスフェクトするか、またはベクターおよびＶ５−Ｓｈｃ ＡまたはＭｙｃ−ＭＫ２（コントロール）で同時トランスフェクトした。並行して、細胞を、Ｖ５−Ｓｈｃ ＡおよびＭｙｃ−ＭＫ２の両方で同時トランスフェクトした。発現させた後、細胞を未刺激のまま維持するか、またはＬＰＳで３０分間刺激しＭＫ２を活性化した。定量ウェスタンブロット分析は、Ｍｙｃ−ＭＫ２およびＶ５−Ｓｈｃ Ａの両方が、ＲＡＷ２６４．７細胞において発現されることを示している。２９３Ｔ細胞およびＨｅＬａ細胞における同時発現とは対照的に、ＭＫ２およびＳｈｃ Ａの両方のレベルが、ＲＡＷ２６４．７細胞において同時発現させた場合に減少した。この減少は、タンパク質レベルの全体的な減少を反映していない。なぜならば、アクチン特異的抗体を用いて示されるように、各レーンにて等量のタンパク質が充填されたからである（図１４Ａ）
ＴＮＦ ＥＬＩＳＡは、ＴＦＮ−αの分泌が、ＬＰＳ刺激によって８倍増加したこと、およびＭｙｃ−ＭＫ２またはＶ５−Ｓｈｃ Ａのみの発現がこれらの細胞におけるＴＮＦ生合成を強化しないことを示した。対照的に、ＭＫ２およびＳｈｃ Ａを同時発現させた場合、ＴＮＦ−αの生合成は、刺激後に１．５倍増加した（図１４Ｂ）。ＴＦＮ生合成におけるこの増加は、ＭＫ２活性の増加を反映しており、ＭＫ２発現を反映するものではないと考えられる。なぜならば、Ｓｈｃ Ａと同時発現された場合のＭＫ２タンパク質レベルは、ＭＫ２のみを発現する細胞において観察されたレベルよりも下であるからである。

（実施例１４：ＭＫ２はインビトロでＳｈｃ Ａをリン酸化する）
ｐ６６ Ｓｈｃは、酸化ストレスを受けた際に、ＣＨ２ドメイン内のセリン３６でリン酸化される。Ｓ３６よりＮ末端側では、セリンは、ＣａｍキナーゼＩＩコンセンサス配列：ＲＸＸＳ内の１７位に位置する（Ｓ１７）。図１５Ａは、Ｓｈｃ Ａタンパク質（このタンパク質内の種々のリン酸化部位を含む）の概略図を示す。ＲＸＸＳモチーフは、ＭＫ２コンセンサスモチーフにおいて保存されたアルギニンから−２の位置でしばしば見出される疎水性アミノ酸を含まないが、ＭＫ２の基質として作用することが示されている。Ｓｈｃ ＡがＭＫ２の基質であるかどうかを決定するため、Ｖ５−Ｓｈｃ Ａを、２９３Ｔ細胞中で発現させた。発現後、Ｓｈｃ Ａを、抗Ｖ５抗体を用いて免疫沈降した。その後、免疫沈降物を、活性化された組換えＭＫ２を外因的に添加するインビトロキナーゼアッセイにおいて使用した。ベクターをトランスフェクトしたコントロール細胞は、ＭＫ２の弱い基質として作用する２９３Ｔ細胞に内因性のタンパク質を免疫沈降した抗Ｖ５抗体から生じた可能性が最も高い６６ｋＤａで低レベルのリン酸化を示した。Ｓｈｃ Ａのみをトランスフェクトした細胞は、６６ｋＤａの強いリン酸化を示した。このことは、Ｓｈｃ ＡがインビトロでＭＫ２の基質であることを実証している。クマシー染色および抗Ｖ５抗体を用いた免疫ブロッティングは、Ｓｈｃ Ａが、Ｓｈｃ Ａトランスフェクト細胞において発現されたことを示した（図１６Ｂ）。

図１５Ｂにおいて示されるように、ＭＫ２は、インビトロでｐ６６ Ｓｈｃ Ａをリン酸化する。ＭＫ２は、ｐ６６ Ｓｈｃ Ａにより調節されるストレス活性化経路において機能し得る。Ｓｈｃ Ａの６６ｋＤａイソ型は、活性化された細胞表面レセプターに結合するが、その結合は、Ｒａｓ ＭＡＰＫ経路の活性化を導かない。ｐ６６ Ｓｈｃ Ａは、普遍的に発現されないので、その細胞型および組織特異的発現は、その選択的な発現パターンを通じて、Ｒａｓ ＭＰＫ経路の活性化を選択的に調節すると考えられる。さらに、ｐ６６ Ｓｈｃ Ａイソ型は、ｐ５３の下流で作用し、酸化ストレスに対する細胞応答を調節する（Ｔｒｉｎｅｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１（２４）：３８７２−８（２００２））。ｐ３８−ＭＫ２経路は、酸化ストレスによって活性化され、熱ショック小タンパク質をリン酸化し、それによって、ストレスに対するミクロフィラメント応答を調節する（Ｈｕｏｔら，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８０（３）：３８３−９２（１９９７））。ｐ３８およびＭＫ２の両方は、酸化ストレスによるｐ５３のリン酸化に関係する（Ｓｈｅ Ｑ．Ｂ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７；２７５（２７）：２０４４４−９（２０００）；Ｓｈｅ Ｑ．Ｂ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１（１０）：１５８０−９（２００２））。ＪＮＫおよびＥＲＫは、セリンリン酸化ｐ６６に関係する。本願において示されたデータは、図１６に示されるように、ｐ６６のストレスにより活性化されるリン酸化におけるＭＫ２の役割を支持している。

（実施例１５：ホスホＡｋｔおよびホスホＦＫＨＲ−Ｌ１レベルは、ＭＫ２−／−細胞において減少した）
ｐ６６Ｓｈｃ Ａをノックアウトした動物から得たデータは、ｐ６６が、酸化ストレスに対する細胞応答（細胞内ＲＯＳの生成およびアポトーシスを含む）を調節すること、およびこのタンパク質におけるＳ３６でのリン酸化がこれらの応答に必要であることを示した。ｐ６６ＳｈｃＡ−／−動物由来の細胞は、野生型同腹子と比較して、細胞内遊離ラジカルのレベルを低下させ、ストレスにより誘導されるアポトーシスに対して耐性であった。さらに、ｐ６６ＳｈｃＡ−／−動物は、酸素生成化合物であるパラコット（ｐａｒａｑｕｏｔ）に対して耐性であり、これは、延長された生存期間をさらに示している。酸化ストレス（ＵＶ光またはＨ_２Ｏ_２）に応答したＡＫＴおよびＦＫＨＲ−Ｌ１の両方のリン酸化は、ｐ６６Ｓｈｃ−／−ＭＥＦにおいて減少する。ＦＫＨＲ−Ｌ１のリン酸化の減少は、ＦＫＨＲ−Ｌ１活性の増加に関連する。というのも、この転写因子は、その脱リン酸化形態で核にとどまるからである。活性化されたＦＫＨＲ−Ｌ１を含む細胞は、アポトーシスに耐性であり、これは、いくつかの抗酸化酵素（スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼを含む）の発現調節におけるこの転写因子の役割と一致する。

ストレスに対する細胞応答においてｐ６６Ｓｈｃ Ａをリン酸化および調節する上でのＭＫ２の役割は、野生型細胞と比較した場合に、ＭＫ２を欠失した細胞が、酸化ストレスに応答して、ホスホ（ｐ）−ＡＫＴおよびホスホ（ｐ）−ＦＫＨＲ−Ｌ１の両方の減少したレベルを示すことを示唆している。この予測を試験するために、ＭＫ２−／−および＋／＋ＭＥＦにおけるＨ_２Ｏ_２誘導性ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＦＫＨＲ−Ｌ１レベルをアッセイした。定量ウェスタンブロット分析は、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＦＫＨＲ−Ｌ１の両方のレベルが、＋／＋ＭＥＦと比較して、ＭＫ２−／−ＭＥＦにおいて減少したことを示した。このことは、細胞内ＲＯＳレベルが、ＭＫ２−／−細胞において減少することを示唆している（図１７）。

（実施例１６：抗炎症薬のスクリーニング）
（１．薬物スクリーニングのための酵母２ハイブリッドシステム）
ＭＫ２に結合するタンパク質を、炎症の処置または予防に有用な抗炎症薬（低分子、ペプチド、化学因子、および抗体が挙げられる）を同定するために使用する。

ＭＫ２相互作用タンパク質を、本明細書中に記載される酵母２ハイブリッドシステムを用いて同定する。次いでＭＫ２相互作用タンパク質を、本明細書中に提供される１つ以上のアッセイまたは当該分野で周知のアッセイによって、ＭＫ２活性に対するそれらの効果をアッセイする。例えば、ＭＫ２相互作用タンパク質は、例えば、ＭＫ２キナーゼ活性またはＴＮＦ−α生合成により決定される場合、ＭＫ２活性を増加するか；ＭＫ２活性を阻害するか；またはＭＫ２活性に対する効果を有さないかのいずれかである。ＭＫ２活性を増加させるＭＫ２相互作用タンパク質は、抗炎症薬をスクリーニングするための候補として使用するのに望ましい。

上記のように、ＭＫ２と、ＭＫ２活性を増加させるＭＫ２相互作用タンパク質との間の相互作用を示すポジティブ酵母クローンは、試験される薬物候補または試験化合物の数だけ適切な選択プレート上にストリークされる。予想される通り、各々のストリークしたコロニーは、着色および増殖アッセイによってアッセイされる場合、ＭＫ２と相互作用タンパク質との間の相互作用についてポジティブである。各コロニーは、その後、ＭＫ２と相互作用タンパク質との間の相互作用に対する効果をアッセイするため、異なる薬物候補と接触される。適切な培地上でのコロニーの着色および／または増殖における減少によりアッセイされる場合、ＭＫ２と相互作用タンパク質との間の相互作用を阻害する薬物候補は、炎症の処置または予防のための潜在的な候補として同定される。

同じアッセイを、例えば、Ｍｋ２と相互作用タンパク質（この相互作用タンパク質はＭＫ２活性を阻害する）との間の相互作用を促進する薬物候補の同定のために使用し得る。例えば、ＭＫ２と、本明細書中に提供される１つ以上のアッセイによってアッセイされる場合、少なくとも部分的にＭＫ２活性を阻害する相互作用タンパク質との相互作用を示すポジティブ酵母クローンを、適切な培地上にストリークし得る。ポジティブクローンの各コロニーはその後、潜在的な薬物候補または試験化合物と接触される。本明細書中に記載される酵母特異性アッセイにおいてより強力な増殖および着色を導く薬物候補は、ＭＫ２とＭＫ２相互作用タンパク質（この相互作用タンパク質はＭＫ２活性を阻害する）との間の相互作用を促進するための潜在的な候補である。

（２．薬物スクリーニングのためのインビトロ再構成アッセイ）
インビトロ再構成アッセイを、Ｍｋ２活性をブロックする抗炎症薬の同定またはＭＫ２と相互作用タンパク質（このタンパク質はＭＫ２活性を増加させる）との間の相互作用をブロックする抗炎症薬の同定の両方のために使用し得る。

さらに、インビトロ再構成系はまた、ＭＫ２および少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質を含むタンパク質複合体の形成のために使用し得る（このような複合体はその後、炎症を調節する試験化合物の同定のために使用し得る）。炎症に対する試験化合物の効果を、試験化合物が複合体形成を阻害もしくは促進するか決定するか、ＭＫ２活性に対する効果について決定するかのいずれかによりアッセイし得る。例えば、ＭＫ２および相互作用タンパク質を含むタンパク質複合体の量を、タンパク質複合体と試験化合物を接触させる前および後に測定し得る。試験化合物の非存在下での量と比較してのタンパク質複合体の量の減少を導く試験化合物は、抗炎症性である。一方、試験化合物の非存在下での量と比較しての、タンパク質複合体の量における増加を導く試験化合物は、プロ炎症性である。

例えば、ＭＫ２を、インビトロ転写−翻訳系（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のウサギ網状赤血球系）を用いて合成する。インビトロで翻訳されたＭＫ２は、最初に、本明細書中に提供される１つ以上のアッセイにおいて活性についてアッセイされる。その後、種々の薬物候補を、適切な条件下および適切な期間の間、翻訳されたＭＫ２に添加し、潜在的な薬物候補と接触した後に、ＭＫ２活性を再度アッセイする。ＭＫ２活性の阻害または減少を導く候補を、潜在的な抗炎症薬として同定する。これらの薬物をさらに、それらの炎症に対する効果、ならびに細胞および動物炎症モデルにおけるインビボでの炎症に関与する種々の経路について確認する。

同様に、インビトロ再構成系はまた、ＭＫ２と相互作用タンパク質（この相互作用タンパク質は、ＭＫ２活性を刺激する）との間の相互作用を阻害する薬物を同定するための使用し得る。例えば、Ｙ２Ｈ系または同時免疫沈降アッセイによって同定される、インビトロで翻訳されたＭＫ２および相互作用タンパク質を含む組成物を、潜在的な薬物候補で処理する。ＭＫ２と相互作用タンパク質との間の相互作用を阻害する候補を、潜在的な抗炎症薬として同定する。その後、これらの薬物を、細胞および動物モデルにおいてインビボで試験し得る。インビトロで翻訳されたタンパク質に加えて、精製されたタンパク質をもた、抗炎症薬の同定のためのインビトロ再構成アッセイにおいて使用し得る。

（実施例１７：炎症に関連する状態の処置）
ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、化学因子、および低分子）を、表１に従って、炎症に関連する状態を患った患者に投与し得る。患者は、この組成物を一度に、または間隔を開けて（例えば、一日毎）に摂取し、彼らの状態の症候を改善する。例えば、炎症が減少する。このことは、本発明の組成物が、炎症に関連する状態の処置に有用であると予測されることを示す。

本明細書は、本明細書中で引用されている参考文献（これらは、本明細書中に参考として援用される）の教示を参照することで最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例証を提供するが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明により包含されることを容易に認識する。本開示において引用される全ての刊行物、特許出願、および特許、ならびに登録番号またはデータベース参照番号により識別される配列は、その全体が参考として援用される。参考として援用される文献等（ｍａｔｅｒｉａｌ）が本明細書と矛盾するかまたは一貫しない程度まで、本明細書は、全てのこのような文献等に取って代わる。本明細書中のいかなる参考文献の引用も、このような参考文献が本発明に対する先行技術であるとの承認ではない。

当業者に明らかなように、本発明の多くの改変および変更が、その意図および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示目的のみのために提供され、いかなる方法によっても限定であることを意味しない。そうでないことが示されない限り、本明細書中で使用される成分、細胞培養物、処理条件等の量を表す全ての数値は、全ての例において、用語「約」によって修飾されることが理解されるはずである。従って、そうでないことが示されない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明により得られると考えられる所望の特性に大きく依存し得る。そうでないことが示されない限り、一連の要素の前につく用語「少なくとも」は、その一連における各々の要素について言及していることが理解されるはずである。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識または確認することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲により包含されることを意図している。

図１Ａ〜１Ｂは、「スムーセリン類似（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）」（ＳＴＳ）タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１に対応）を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、ヒトポリホメオティック２（ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｈｏｍｅｏｔｉｃ ２：ＨＰＨ２）タンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号２に対応）を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、ｓｒｃホモロジーアンドコラーゲン（ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ：Ｓｈｃ）タンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号３に対応）を示す。 図４は、「スムーセリン類似（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）」（ＳＴＳ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４に対応）を示す。 図５は、ヒトポリホメオティック２（ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｈｏｍｅｏｔｉｃ ２：ＨＰＨ２）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５に対応）を示す。 図６は、ｓｒｃホモロジーアンドコラーゲン（ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ：Ｓｈｃ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６に対応）を示す。 図７は、ｐ３８／ＭＫ２シグナル伝達経路のダイアグラムを示す。ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、特定の環境ストレスまたはプロ炎症性サイトカインに応答して活性化される。ｐ３８は、ＭＫＫ３／６ＭＡＰキナーゼキナーゼによって直接リン酸化される。ｐ３８の基質としては、転写因子および、ｐ３８のシグナル伝達を増幅および多様化する多くのキナーゼが挙げられる。ＭＫ２キナーゼは、転写因子、細胞骨格関連タンパク質、およびＲＮＡ結合タンパク質を含む多くのタンパク質をリン酸化し得るｐ３８の基質である。ＭＫ２はまた、転写後レベルでＴＮＦの生合成を調節する。 図８は、Ｓｈｃ Ａ、ＨＰＨ２、およびＳＴＳの構造およびＭＫ２相互作用ドメインを示す。Ｓｈｃの３つのイソ型：４６ｋＤａ、５２ｋＤａ、および６６ｋＤａは全て、ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン、およびコラーゲンホモロジードメイン１、ＣＨ１を含む。６６ｋＤａイソ型はさらに、コラーゲンホモロジードメイン２、ＣＨ２を含む。ヒトポリホメオティック２は、ステライルアルファモチーフ（ｓｔｅｒｉｌｅ ａｌｐｈａ ｍｏｔｉｆ：ＳＡＭ）タンパク質相互作用ドメインを有する。ＳＴＳは、アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）およびカルポニンホモロジードメイン（ＣＨ）を含む。 図９Ａは、酵母における種々のＭＫ２相互作用タンパク質と変異ＭＫ２との相互作用を検出する特異性アッセイにおける、選択培地中での酵母の増殖および色を示す。ＭＫ２相互作用タンパク質、Ｓｈｃ、ＨＰＨ２、およびＳＴＳは、触媒機能が不活性なＭＫ２ Ｋ９３Ｒ変異体と結合する。ＭＫ２相互作用タンパク質は、空のＢＤベクター（Ｖ）またはラミニン（Ｌ）に結合しない。図９Ｂは、図９Ａのアッセイから得られたデータを要約している。Ｓｈｃ、ＨＰＨ２、およびＳＴＳは各々、実質的に同じ親和性でＭＫ２およびＭＫ２ Ｋ９３Ｒと結合する。図９Ｃは、Ｓｈｃ、ＨＰＨ２、およびＳＴＳと相互作用する、ＭＫ２中のドメインを示す。ＭＫ２のＮ末端プロリンリッチドメイン、触媒性ドメイン、およびＣ末端局在化ドメインが示されている。 図１０は、アニソマイシンの存在下または非存在下でのウェスタンブロット（ＷＢ）により検出された、２９３Ｔ細胞におけるＭＫ２とタンパク質の同時免疫沈降（ＩＰ）を示す。図１０Ａに示されるように、Ｖ５またはＭｙｃに対する抗体を用いるウェスタンブロットは、Ｖ５タグ−Ｓｈｃタンパク質およびＭｙｃタグ−ＭＫ２タンパク質の両方が２９３Ｔ細胞において発現されることを示している。抗Ｖ５抗体を用いた同時免疫沈降および抗Ｍｙｃ抗体を用いたその後の免疫ブロッティングは、ＭＫ２が、Ｓｈｃと同時免疫沈降することを示している。図１０Ｂは、ＨＡ−ＨＰＨ２、ＨＡ−ｐ３８、およびＭｙｃ−ＭＫ２が発現された（ウェスタンブロットにより検出）ことを示す。抗ＨＡ抗体を用いた同時免疫沈降および抗Ｍｙｃ抗体を用いたその後の免疫ブロッティングは、ＭＫ２が、ＨＰＨ２およびｐ３８と同時免疫沈降することを示す。 図１１は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞におけるＴＮＦ−αタンパク質（ｐｇ／ｍｌ）のレベルを示す。示されるように、ＴＮＦ−αレベルは、ｐ３８とＳｈｃ、または、ＭＫ２とＳｈｃのいずれかを同時発現するアニソマイシン刺激したＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞において、ベクターのみ、ｐ３８のみ、ＭＫ２のみ、またはＳｈｃのみを含む細胞中のＴＮＦ−αレベルと比較して増加している。従って、Ｓｈｃは、ＭＫ２活性を増強しており、プロ炎症性であるようだ。 図１２Ａは、ＭＫ２＋／＋およびＭＫ２−／−マウス胚線維芽細胞由来の^３３Ｐ標識タンパク質が、二次元ゲル電気泳動を用いて分離されたことを示す２Ｄオートラジオグラフィーを示す。等電点５．４を有する差次的にリン酸化されたタンパク質が示されている（矢印）。図１２Ｂは、同じゲルの銀染色であり、分離したタンパク質の相対量を示している。 図１３Ａは、アニソマイシン刺激および未刺激の両方のＨｅＬａ細胞において、ＭＫ２、または、ＭＫ２とＳｈｃの存在下でリン酸化Ｈｓｐ２７（ｐＨｓｐ２７）を検出するためのウェスタンブロットを示す。示されるように、Ｖｐ−ｐ６６ Ｓｈｃ ＡおよびＭＫ２はＨｅＬａ細胞中で発現され、抗ｐＨｓｐ２７による免疫ブロッティングは、ＭＫ２、または、ＭＫ２とＳｈｃのいずれかを発現する細胞中のｐＨｓｐ２７タンパク質基底レベルの上昇を示している。図１３Ｂは、ベクターのみ（Ｖ）、ＭＫ２のみ、Ｓｈｃのみ、またはＭＫ２とＳｈｃのいずれかをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞（アニソマイシン刺激および未刺激の両方のＨｅＬａ細胞）におけるリン酸化Ｈｓｐ２７の基底レベルを示す。リン酸化Ｈｓｐ２７タンパク質のレベルを、ベクターのみでトランスフェクトした未刺激細胞におけるレベルに対して正規化している。図１３Ｃは、ＭＫ２とベクター（Ｖ）、または、ＭＫ２とＳｈｃのいずれかでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞にけるＭＫ２レベルに対して正規化したリン酸化Ｈｓｐ２７基底レベルを示す。 図１４Ａは、ＳｈｃおよびＭＫ２がＲＡＷ２６４．７細胞において発現されることを示すウェスタンブロットを示す。抗アクチン抗体は、等量の総タンパク質を各レーンに充填したことを示すのに使用される。図１４Ｂは、ベクターのみ（Ｖ）、ＭＫ２のみ、Ｓｈｃのみ、または、ＭＫ２とＳｈｃをトランスフェクトした、ＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞および未刺激の同細胞の両方における、分泌ＴＮＦ−αタンパク質レベルを示す（ＥＬＩＳＡにより測定）。 図１５Ａは、ＣＨ２ドメイン、ＰＴＢドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＳＨ２ドメインを含むｐ６６Ｓｈｃ Ａタンパク質の概略図を示す。このタンパク質中のＭＫ２相互作用ドメイン、ＣＡＭキナーゼ２コンセンサス配列、およびＧＳＫ２配列もまた示されている。図１５Ｂは、トランスフェクト２９３Ｔ細胞から免疫沈降した組み換えＭＫ２およびＶ５−Ｓｈｃ Ａを用いるインビトロキナーゼアッセイにおけるｐ６６Ｓｈｃ Ａのリン酸化を示す。示されるように、リン酸化Ｓｈｃ Ａは、Ｓｈｃ発現細胞由来の免疫沈降物においてのみ検出されている。クマシー染色および抗Ｖ５抗体を用いるウェスタンブロッティングは、ＳｈｃＡが、ＳｈｃＡトランスフェクト細胞において発現されていたことを確認するために用いている。 図１６は、細胞ストレスに応答してＭＫ２により調節されるストレス活性化経路および細胞ストレスによるＭＫ２の活性化に応答するＳｈｃのリン酸化の概略図である。 図１７は、ＭＫ２＋／＋マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）およびＭＫ２−／−同細胞における過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）に応答したリン酸化ＡＫＴおよびＦＫＨＲ−Ｌ１のレベルを示すウェスタンブロットを示す。示されるように、リン酸化ＡＫＴレベルおよびリン酸化ＦＫＨＲ−Ｌ１レベルの両方が、ＭＫ２＋／＋ＭＥＦのレベルと比較して、ＭＫ２−／−ＭＥＦにおいて減少した。

Claims (57)

1. 単離された、精製された、または組み換えタンパク質複合体であって以下：
   （ｉ）ＭＫ２ポリペプチド；および
   （ｉｉ）ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択されるＭＫ２相互作用タンパク質、
   を含む、複合体。
2. ＭＫ２ポリペプチドおよび少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質を含む、請求項１に記載の複合体。
3. 前記ＭＫ２相互作用タンパク質が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択される、請求項２に記載の複合体。
4. ＭＫ２ポリペプチドおよび少なくとも２つのＭＫ２相互作用タンパク質を含む、請求項１に記載の複合体。
5. 前記ＭＫ２相互作用タンパク質が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択される、請求項４に記載の複合体。
6. 前記ＭＫ２ポリペプチドが、融合タンパク質を含む、請求項１に記載の複合体。
7. 前記融合タンパク質が、該融合タンパク質を精製、単離、または検出するためのドメインを含む、請求項６に記載の複合体。
8. 前記融合タンパク質が、アフィニティータグ、放射性核種、酵素、およびフルオロフォアからなる群より選択されるドメインを含む、請求項６に記載の複合体。
9. 前記ドメインが、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域からなる群より選択される、請求項７に記載の複合体。
10. 第１核酸および第２核酸を含む宿主細胞であって、該第１核酸は、組み換えＭＫ２ポリペプチドをコードし、かつ該第２核酸は、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択されるＭＫ２相互作用タンパク質をコードする、宿主細胞。
11. ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択される第２のＭＫ２相互作用タンパク質をコードする第３核酸をさらに含む、請求項１０に記載の宿主細胞。
12. 試験化合物が、タンパク質複合体の形成を阻害するかまたは促進するかを決定するアッセイであって：
    （ａ）ＭＫ２ポリペプチド、少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質、および試験化合物を含む反応混合物を形成する工程；ならびに
    （ｂ）ＭＫ２とＭＫ２相互作用タンパク質との間のタンパク質複合体の存在を検出する工程、
    を包含し、ここで、該試験化合物の非存在下での複合体の量と比較した場合の、該試験化合物の存在下での該複合体の量の差は、該試験化合物が、複合体形成を阻害または促進することを示す、アッセイ。
13. 前記試験化合物の存在下での前記複合体量の増加は、該試験化合物が、複合体形成を促進することを示している、請求項１２に記載のアッセイ。
14. 前記試験化合物の存在下での前記複合体量の減少は、該試験化合物が、複合体形成を阻害することを示している、請求項１２に記載のアッセイ。
15. 試験化合物が、ＭＫ２活性に影響を及ぼすか否かを決定する方法であって：
    （ａ）ＭＫ２ポリペプチドおよびＭＫ相互作用タンパク質を含むタンパク質複合体を形成する工程；
    （ｂ）該タンパク質複合体と試験化合物とを接触させる工程；および
    （ｃ）ＭＫ２キナーゼ活性、該複合体中のＭＫ２の量、ＴＮＦ産生、およびＭＫ２の基質のリン酸化形態の量から選択される１つ以上の活性に対する該試験化合物の効果を決定する工程、
    を包含する、方法。
16. タンパク質複合体の形成を阻害または促進する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイであって：
    （ｉ）ＭＫ２ポリペプチドを含む第１融合タンパク質ならびにＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃのうちの１つ以上から選択されるポリペプチドを含む第２融合タンパク質を含むツーハイブリッドアッセイシステムを、これらの２つのタンパク質が、該ツーハイブリッドアッセイシステムにおいて相互作用する条件下で提供する工程；
    （ｉｉ）試験化合物の存在下および非存在下で該融合タンパク質間の相互作用レベルを測定する工程；
    （ｉｉｉ）該融合タンパク質の相互作用のレベルを比較する工程、
    を包含し、ここで、該相互作用レベルにおける減少は、ＭＫ２ポリペプチドと、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃのうちの１つ以上から選択されるポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物の指標である、アッセイ。
17. ＭＫ２ポリペプチド、ならびに、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択されるＭＫ２相互作用タンパク質を含む複合体における１つ以上のタンパク質と結合する抗体。
18. ＭＫ２と前記ＭＫ２相互作用タンパク質の相互作用を阻害する、請求項１７に記載の抗体。
19. 少なくとも第１のタンパク質および第２のタンパク質を含む細胞におけるタンパク質複合体の形成を調節する方法であって、該第１タンパク質はＭＫ２ポリペプチドであり、該第２タンパク質はＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃのうちの１つ以上から選択され、該方法は、該複合体の形成を調節し得る化合物を該細胞に投与する工程を包含する、方法。
20. 複合体を生成する方法であって、ＭＫ２ポリペプチドならびにＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃの１つ以上から選択されるＭＫ２相互作用タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトする工程を包含し、これによって、該ポリペプチドが複合体を形成する、方法。
21. 抗炎症薬を同定するための薬物スクリーニング方法であって：
    ａ）ＭＫ２および少なくとも１つのＭＫ２相互作用タンパク質を提供する工程；
    ｂ）ＭＫ２と該タンパク質とを相互作用させて複合体を形成させる工程；
    ｃ）該複合体に、有効量の潜在的薬物を添加する工程；および
    ｄ）該潜在的薬物が複合体形成を阻害するか否かを決定する工程、
    を包含する、方法。
22. ＭＫ２および前記タンパク質が、インビボでの酵母ツーハイブリッドシステムにおいて相互作用する、請求項２１に記載の方法。
23. ＭＫ２および前記タンパク質が、インビボでの哺乳動物ツーハイブリッドシステムにおいて相互作用する、請求項２１に記載の方法。
24. ＭＫ２および前記タンパク質がインビトロで相互作用する、請求項２１に記載の方法。
25. 前記タンパク質がＳＴＳである、請求項２１に記載の方法。
26. 前記タンパク質がＳｈｃである、請求項２１に記載の方法。
27. 前記タンパク質がＨＰＨ２である、請求項２１に記載の方法。
28. 前記薬物が低分子である、請求項２１に記載の方法。
29. 前記薬物がペプチドまたはタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
30. 前記薬物が抗体である、請求項２１に記載の方法。
31. 前記薬物が化学因子である、請求項２１に記載の方法。
32. 組織における炎症を調節する方法であって：
    ａ）該組織に核酸を投与する工程であって、該核酸はＭＫ２相互作用タンパク質をコードする、工程；および
    ｂ）該核酸に該ＭＫ２相互作用タンパク質を発現させて、該組織における炎症を調節する工程、
    を包含する、方法。
33. 前記核酸が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択されるタンパク質を発現する、請求項３２に記載の方法。
34. 組織における炎症を処置または予防する方法であって、治療有効量の少なくとも１つの因子を該組織に投与する工程を包含し、該因子は、以下：
    ａ）ＭＫ２とＭＫ２相互作用タンパク質との間の相互作用をブロックするか；または
    ｂ）該相互作用を許容するが、ＭＫ２活性をブロックするか、
    のいずれかである、方法。
35. 前記因子が抗体である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３５に記載の方法。
38. 前記抗体がＭＫ２に結合する、請求項３５〜３７に記載の方法。
39. 前記抗体がＭＫ２相互作用タンパク質に結合する、請求項３５〜３７に記載の方法。
40. 前記因子が化学因子である、請求項３４に記載の方法。
41. 前記因子がペプチドまたはタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
42. 前記因子が低分子である、請求項３４に記載の方法。
43. 組織における炎症を調節する方法であって：
    ａ）ＭＫ２に結合する少なくとも１つのタンパク質と該組織とを接触させる工程；および
    ｂ）該タンパク質に、該組織における炎症を調節させる工程、
    を包含する、方法。
44. 少なくとも１つの炎症状態を患っている患者を処置する方法であって：
    ａ）ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物から選択される、治療有効量の少なくとも１つの化合物を投与する工程であって、該化合物は、抗体、化学因子、低分子、タンパク質、およびペプチドから選択される、工程；および
    ｂ）該化合物を、ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと結合させて、炎症を調節する工程、
    を包含する、方法。
45. 前記タンパク質またはペプチドが、ＭＫ２活性を刺激する野生型タンパク質またはペプチドの変異形態である、請求項４３に記載の方法。
46. 前記タンパク質が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択される、請求項４３に記載の方法。
47. 前記状態が、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、急性呼吸窮迫症候群、気腫、遅延型過敏症、ぜん息、全身性エリテマトーデス、および外傷または損傷に起因する炎症から選択される、請求項４３に記載の方法。
48. 細胞中で核酸を発現し炎症を阻害する方法であって：
    ａ）ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物から選択される化合物をコードする少なくとも１つの核酸を添加する工程であって、該化合物は、抗体、化学因子、低分子、タンパク質、およびペプチドから選択される、工程；および
    ｂ）該細胞に該化合物を発現させて炎症を阻害する工程、
    を包含する、方法。
49. 前記核酸が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択されるタンパク質をコードする、請求項４７に記載の方法。
50. サンプル中のＭＫ２の非存在、存在、および量のうちの少なくとも１つを検出する方法であって：
    ａ）ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する少なくとも１つの化合物を投与する工程であって、該化合物は、抗体、化学因子、低分子、タンパク質、およびペプチドから選択される、工程；ならびに
    ｂ）該サンプル中のＭＫ２の非存在、存在、および量と、結合したタンパク質または化合物の非存在、存在、および量とを関連付ける工程、
    を包含する、方法。
51. 前記タンパク質が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択される、請求項４９に記載の方法。
52. ＭＫ２の定性的検出を可能にするキットであって：
    ＭＫ２またはＭＫ２複合体のうちの少なくとも１つと相互作用する化合物であって、該化合物は、抗体、化学因子、低分子、タンパク質、およびペプチドから選択される、化合物；ならびに
    以下から選択される少なくとも１つの他のキット要素：
    ａ）緩衝液および溶液のうちの少なくとも１つ；
    ｂ）少なくとも１つの構造的要素、
    を含む、キット。
53. 前記タンパク質または化合物に結合する因子をさらに含む、請求項５１に記載のキット。
54. 前記因子が抗体である、請求項５２に記載のキット。
55. 前記タンパク質が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択される、請求項５１に記載のキット。
56. 薬学的組成物であって：
    ａ）ＭＫ２に結合する少なくとも１つのタンパク質、および
    ｂ）少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリア、
    を含む、組成物。
57. 前記タンパク質が、ＳＴＳ、ＨＰＨ２、およびＳｈｃから選択される、請求項５５に記載の組成物。

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