JPH11500606A

JPH11500606A - 核タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ

Info

Publication number: JPH11500606A
Application number: JP8519509A
Authority: JP
Inventors: アーサーヘミングス，ブライアン; アンダースミルワード，トマス
Original assignee: ノバルティスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-12-22
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1999-01-19
Also published as: DE69534492D1; ES2249774T3; WO1996019579A1; EP0793725A1; EP0793725B1; ATE305514T1; CA2208237C; DE69534492T2; US6040164A; AU4388296A; CA2208237A1; US5981205A

Abstract

(57)【要約】本発明は、広く発現されるヒトおよびショウジョウバエ〔Ｄ．メラノガスター（D ．melanogaster）の新規セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（核Dbf2関連キナーゼ、またはNdrと命名；以前にPun キナーゼと呼ばれたもの）並びにアゴニストおよびアンタゴニストの同定へのこのキナーゼの利用に関する。このキナーゼは核タンパク質であり、核内蓄積の原因である短い塩基性ペプチドKRKAETWKRNRRを含む。

Description

【発明の詳細な説明】核タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ本発明は、広く発現されるヒトおよびキイロショウジョウバエ〔Ｄ．メラノガスター（D ．melanogaster）〕の新規セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（核Dbf2関連キナーゼ、またはNdr と命名；前はPun キナーゼと呼ばれたもの）およびそれのモジュレーターの同定へのこのキナーゼの利用に関する。このキナーゼは核タンパク質であり、核内蓄積の原因である短い塩基性ペプチドKRKAETWKRN RRを含む。可逆的なタンパク質リン酸化は、代謝、増殖および分化をはじめとする真核生物における多数の基本的な細胞機能を協調調節する主要機序である。特定の標的タンパク質のリン酸化状態および結果としてのその活性は、プロテインキナーゼとプロテインホスファターゼの正反対の作用によって調節される。一般に、それらの酵素はセリン／スレオニンまたはチロシンリン酸受容体のいずれかに特異的であるが、幾つかの二元特異性キナーゼおよびホスファターゼも記載されている。リン酸化カスケードの重要性は、多数のキナーゼ、ホスファターゼ、およびそれらが関与するシグナル変換経路が進化の過程で高度に保存されているという所見からわかる。近年、細胞周期の調節におけるタンパク質リン酸化の役割に関心が集中している。多数の細胞性プロトオンコジーン（癌原遺伝子）がセリン／スレオニンキナーゼ類のメンバーをコードし、或る種のセリン／スレオニンキナーゼが細胞周期調節網の重要な成分として機能することが次第に明らかになってきている。従って、それらの経路の完全な描写は発癌や腫瘍の進行の解明のための重要な目標である。Ｃ．エレガンス（C ．elegans）ＥＳＴ(expressed sequence tags)cm11b7およびcm11b8は、ヒトキナーゼRAC/Akt(RAC-PK)およびＳ．セレビシエ（S ．cerevisi ae ）細胞周期調節キナーゼDfb2の蠕虫同族体として最初に記載された重複するcD NAクローンである〔Waterston 他，(1992)Nat．Genet．1，114-123〕。それらのクローンの完全な配列決定により、この相同性指定が正しくないことが決定された。驚くべきことに、RAC-PKおよびDbf2とは異なる、cm11b8に高度に相同である新規キナーゼがヒトおよびキイロショウジョウバエ源から単離できることを発見した。このキナーゼNdr はカルシウム依存性方式でカルモジュリンに結合する。Nd r をコードする遺伝子はヒト染色体６上の、6p21.2と6p21.31 の間の、主要組織適合性複合体(MHC)クラス１遺伝子を含む染色体６の領域に位置する。適当な発現系に含めるとNdr をコードするＤＮＡを過剰発現させることができること、およびタンパク質配列が該タンパク質の核限局化（nuclear localisation）の原因となる短い断片を含有することも発見した。発明の要約本発明の第一の面では、Ndr プロテインキナーゼ、並びにそれの相同体および類似体を提供する。更に、本発明は、Ndr から誘導される核限局化配列およびカルシウム応答（signalling）の調節へのNdr の利用に関する。発明の詳細な説明Ｃ．エレガンスcm11b7とcm11b8を使って配列決定および相同性研究を行うことにより、それらがRAC-PKの蠕虫相同体というよりむしろ新規プロテインキナーゼを表すことを決定付けた。本発明は配列番号２および配列番号７に与えられるようなアミノ酸配列を含んで成る新規プロテインキナーゼ；またはそれの相同体に関する。本発明のキナーゼはNdr と命名される。 Ndr およびそれの相同体は、それらがヒトおよびショウジョウバエNdr により表されるようなNdr プロテインキナーゼと起源または機能に関して相同性を共有することを技術者が決定するのに十分な程の類似性を有するポリペプチドである。本発明は、Ndr の全ての種相同体を包含する。配列番号７と配列番号２に表されるヒトおよびショウジョウバエNdr は種相同体である。他の生物からの種相同体は本明細書中に記載する常用される方法に従って単離することができる。更に、適当な別法も当業者に知られており、それは文献中に見つけることができる。 Ndr の種相同体は本明細書中に記載されるポリペプチド配列の誘導体であると見なすことができる。しかしながら、本発明はＣ．エレガンスcm11b7およびcm11b8 の配列それ自体は包含しない。好ましい場合には、配列の同一性を指すのに相同性が本明細書中で使われる。相同体は本明細書中に記載の Ndrプロテインキナーゼと或る量の配列同一性を有するポリペプチドでもある。好ましくは、配列同一性が50％以上、より好ましくは60％以上、最も好ましくは75％以上である。ヒトとショウジョウバエ Ndr配列は68％の配列同一性を有する。他方、Dbf2はヒトNdr と32％しか総合アミノ酸同一性を持たず、これは、Dbf2はNdr に関連しているが、両者が種相同体ではないことを示唆する。 Ndr プロテインキナーゼ群のメンバーの中でアミノ酸残基が同一でない場合、それらは多分類似しており、存在する置換が好ましくはキナーゼの領域の構造／機能関係を変えないような保存的置換または変更であるだろう。ヒトとショウジョウバエ Ndr間の配列相同性は約80％である。本発明の部分を構成する前記ポリペプチドの誘導体は、Ndr の変異体および断片も含んで成る。変異体は、例えば１または複数のアミノ酸の欠失、付加または置換を有するポリペプチドであり、即ちある領域が欠けているかまたは別のポリペプチドに連結されている（例えば融合タンパク質の形で）ポリペプチドである。本発明の変異体は、例えば酵素活性または特異性に関して、生来のNdr と同等に反応し、よって、それの総合活性はわずかな形で変調または改変され得るけれども、Ndr とそれの変異体とは本質上は機能的に等価である。 Ndr の断片は、ポリペプチドの実質的部分が削除されているNdrポリペプチドまたはそれの変異体を含んで成る。Ndr の断片は生来のNdr と実質的に異なる活性を有してもよい。よって、Ndr 断片はそれの個々のキナーゼ領域、または生来のNdr のキナーゼ領域のサブセット、またはカルモジュリン結合領域、核限局化シグナルなどを含んで成ることができる。例えば、ヒトNdr のアミノ酸265〜276（KRKAETWKRNRR）は核限局化シグナルをコードすることがわかった。従って、本発明は核限局化シグナルとして働き且つアミノ酸配列 KRKAETWKRNRR を有するNdr の断片；同じ核限局化作用を有するそれの機能性誘導体；およびこの核限局化シグナルをコードするＤＮＡにも関する。また、主として核内に限局化されるポリペプチドの作製へのこのポリペプチドの利用も包含する。更に、Ndr は、Hanks およびQuinn 〔Meth．Enzymol.(1991)200,38-62〕により同定された12のプロテインキナーゼ触媒亜領域の全部を含んで成ることがわかる。それらのうち、亜領VIｂとVIIの存在はNdr がセリン／スレオニンキナーゼであることを暗示する。よって、本発明はNdr のキナーゼ領域の任意のサブセット、特にセリン／スレオニンキナーゼ領域を包含する。本発明のポリペプチドが融合タンパク質の形で発現されるならば、融合されるポリペプチドは直接またはスペーサーによって連結され得る。例えば、天然に存在しない場合、特異的に認識されそして化学的にまたは酵素的に開裂される領域を挿入することが可能である。選択的開裂試薬または酵素の例はCNBr、V8プロテアーゼ、トリプシン、トロンビン、第Ｘ因子、ペプチダーゼ yscαおよびyscFである。組換え技術または化学技術による融合タンパク質、変異体または断片の作製方法は当業界で既知である。単離本発明のポリペプチドは常用手段により天然源から、組織からまたは培養細胞から単離することができる。単離の最中に、常用の添加剤、例えばタンパク質安定剤、プロテイナーゼ阻害剤などを添加してもよい。例えば、ポリペプチドを組織培養物から単離する時、通常第一段階は細胞を溶解し、またはポリペプチドが培地中に分泌される場合には、遠心分離によって培養液から細胞を分離することにある。得られた上清を、追加のタンパク質および不純物の存在下で、例えば非タンパク様物質の大部分を除去するためのポリエチレンイミンでの処理、および溶液を硫酸アンモニウム等で飽和することによるタンパク質の沈澱により、本発明のポリペプチドについて濃縮することができる。存在するならば宿主タンパク質も、酢酸での酸性化および他の常用手段により沈澱させることができる。他の精製段階は、例えば、レクチンの除去、脱塩、クロマトグラフィー処理、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLCなどを含む。混合物の成分分離は、透析により、電荷に従ってゲル電気泳動もしくは無担体電気泳動の手段により、分子の大きさに従って適当なSephadexカラム、ゲル浸透もしくは限外濾過により、アフィニティークロマトグラフィーにより、または他の方法により、特に文献から既知であるものにより、達成される。ポリペプチド、および特にその誘導体は、天然源から得られるよりもむしろ合成手段により得ることができる。本明細書中に含まれる情報を利用して、市販のタンパク質合成装置を使って合成することができ、または商業的ペプチド合成サービスから注文してもよい。合成したNdr 誘導体は、変更されたアミノ酸残基の使用または該ポリペプチドへの非相同基もしくは側鎖の付加を含む、任意の所望の配列変更を含んでもよい。本発明のポリペプチドの使用 Ndr のようなキナーゼは細胞内でのシグナル変換に関与することが知られている。この関与は、キナーゼを通信経路の変更により生物学的効果を得ようとする剤の標的とする。典型的には、通信経路の変更は特定の刺激に対する細胞の応答を変更するだろう。例えば、ホルモンレセプターから生物学的エフェクター（典型的には遺伝子発現の調節因子である）へのシグナル変換に関与するキナーゼをターゲティングすることにより、ホルモンの作用を変更することができる。カルモジュリンは細胞の主要なカルシウムイオン結合タンパク質であり、カルシウム媒介作用に関与している。Ndr へのカルモジュリンの結合がカルシウムイオン封鎖により十分に可逆的であるようにカルシウム依存形式でNdr がカルモジュリンに結合することは決定されている。Ndr の活性はカルモジュリンにより調節される。従って、細胞に対するカルモジュリンの作用に影響を及ぼす方法であってそれに対するNdr の応答を変更することを含んで成る方法が提供される。好ましくは、該方法は、前記細胞をNdr の活性化剤または阻害剤と接触させることを含んで成る。Ndr 模倣物を含みそして集合的にモジュレーターと呼ばれる活性化剤と阻害剤は、カルモジュリン結合部位のところまたはその近くでNdr と相互作用し、それによりNdr 活性に対するカルモジュリンの作用に影響を与えることができる。あるいは、モジュレーターはカルモジュリン結合部位から離れた部位のところで作用し、他の手段によりNdr の活性を促進または抑制してもよい。例えば、モジュレーターは、おそらくNdr の三次元構造を変えることにより、例えばNdr とそれの基質との間の結合エネルギーに影響を及ぼすか、またはNdr の細胞レベル下の限局化、関連した細胞因子とNdr との相互作用、などに影響を及ぼすことにより、基質をリン酸化するNdr の能力に影響を及ぼすことができる。更に、モジュレーターは、Ndr それ自身よりもむしろNdr と相互作用する因子や基質をターゲッティングすることにより、Ndr の活性に影響を及ぼし得る。本発明は、カルモジュリン応答の異常に関連づけられる病気を治療する方法であって、患者に医薬上有効な量のNdr モジュレーターを投与することを含んで成る方法も提供する。そのような方法で使われるNdr モジュレーターは、モジュレーターの的確な性質に依存して従来の方法論に従って処方することができ、典型的には生物学的に許容される担体と共に該モジュレーターまたはそれの前駆体を含んで成るだろう。ある状況では、カルモジュリン応答の欠乏が、Ndr と直接関連づけられる異常によって引き起こされると確定できる場合、その状態が外因性Ndr を投与することにより処置されるように、Ndr モジュレーターはNdr それ自体の形態をとることができる。この場合、 Ndr をタンパク様物質の製剤投与に許容される剤と共に処方し、そして許容される経路により、例えばリポソームによって、患者に供給することができる。更に、Ndr またはそれのモジュレーターは、細胞中で翻訳されてその場でNdr またはそれのモジュレーターを与えることができる核酸の形態で、細胞に提供することができる。よって、本発明は、核酸が細胞内で発現されてNdr またはそれのモジュレーターを産生するように、Ndr またはそれのモジュレーターをコードする核酸を細胞に投与することを含んで成る遺伝子治療法を包含する。本発明は、それ自体Ndr 変調活性を有する核酸、例えばNdr それ自体をまたはNdr の活性に影響を及ぼす分子をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を包含する。 Ndr はそのまま結合研究におよび可能性あるNdr モジュレーターのスクリーニングにおいて利用することもできる。結合研究には、本発明のポリペプチドは、例えば、マイクロタイタープレートまたはビーズのような固形担体上に固定化することができ；あるいはビオチンまたは放射性、発光性もしくは化学発光性基のような１もしくは複数の識別可能なマーカーを有することができる。本発明の好ましい態様では、Ndr はNdr 活性の潜在的モジュレーターをスクリーニングする方法において使われる。そのような方法では、適当な手段により、例えばNdr のキナーゼ活性を測定する機能分析により、Ndr の活性をモニタリングする。キナーゼ活性アッセイは技術の現状で既知である。従って、本発明は、Ndr 活性の潜在的モジュレーターである化合物をスクリーニングする方法であって、次の段階：ａ）請求項１に記載のキナーゼを前記化合物と共にインキュベートし；ｂ）前記化合物により誘導されるキナーゼの活性の変化を測定し、前記化合物の存在下における該活性の変化が前記化合物と前記キナーゼとの機能的相互作用を表すを含んで成る方法を提供する。インキュベーション条件は、キナーゼとスクリーニングされる化合物との相互作用を検出するのに用いる正確な方法に従って異なるだろう。転写活性化検出系、例えば酵母二ハイブリッド系の場合、インキュベーション条件は遺伝子の転写に適切であり、例えば生存細胞の内側に普及しているものである。しかしながら、他の検出系は異なるインキュベーション条件を要求するだろう。例えば、相互作用の検出が例えばアフィニティークロマトグラフィーにおいて知られるようにクロマトグラフィーアッセイによる相対親和力に基づくならば、インキュベーション条件は結合を促進するように調整され、次いでスクリーニングされる化合物がもはやNdr に結合しなくなる点が決定されるように徐々に変更されるだろう。本発明に従ったインキュベーションは多くの手段により達成することができるが、基本的な要件は、キナーゼまたはそれの断片とスクリーニングされる化合物とが互いに接触することができることである。これは、Ndr またはその断片と化合物とを混合することにより、または例えばそれらをコードする核酸の発現によってそれらをその場で生産せしめることにより、達成することができる。Ndr もしくはNdr 断片および／または該化合物が別のポリペプチドとの融合体の形態である場合、それらはそういうものとしてその場で発現させてもよい。好ましくは、本発明の方法は二ハイブリッド系に基づく。そのような系は、分離可能なＤＮＡ結合領域と転写活性化領域を有する転写活性化因子、例えば酵母 GAL4活性化因子を利用することにより、特異的なタンパク質：タンパク質相互作用を検出する。使う予定である転写活性化因子に応答性である要素にレポーター遺伝子が作用可能に連結され、そしてNdr またはその断片とスクリーニングしようとする化合物とに暴露される。ここでそのうちの一方が転写活性化因子の転写活性化領域と複合体形成し他方が該因子のＤＮＡ結合領域に連結される。Ndr またはその断片と化合物との特異的相互作用が存在すれば、転写活性化因子のＤＮＡ結合領域と転写活性化領域は並列になり、レポーター遺伝子からの転写は活性化されるだろう。あるいは、検出は、Ndr またはその断片（例えばそれの核限局化シグナルまたはそれの触媒領域）とスクリーニングされる化合物またはその断片との間で観察される結合に基づいてもよい。例えば、モジュレーション現象に関係することが知られているモジュレーターの一部分とNdr との間の相互作用をモニタリングすることにより、Ndr と潜在的モジュレーターとの相互作用をアッセイすることができる。 Ndr またはその断片は、それをスクリーニングしようとする化合物と共にインキュベートし、続いてNdr 特異的抗体とのNdr 複合体を「取り壊す（pulling-do wn）」ことにより、それに結合する化合物についてスクリーニングするのに用いることができる。免疫沈澱または免疫アフィニティークロマトグラフィーに適当な抗体は、当業者に公知である常用技術に従って調製することができ、性質がモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。Ndr −化合物複合体を親和性により単離した後、該化合物をNdr 抗体から解離せしめ、そして常用技術により特徴づけることができる。 Ndr またはそれの断片とスクリーニングされる化合物との相互作用は間接的に観察することもできる。例えば、化合物の存在下または非存在下で基質に対する Ndr の作用を観察することにより、Ndr 機能の阻害剤または活性化剤を検出してもよい。 Ndr またはそれの触媒領域の活性は、キナーゼ基質を使ったキナーゼ活性アッセイにより評価することができる。例えば、確立されたアッセイ手順に従って自己リン酸化を測定することができる。外因性の生理学的基質を使ってもよい。本発明は更に、スクリーニング系におけるNdr またはその断片の使用を含んで成る。このスクリーニング系は、好ましくはカルモジュリン活性のモジュレーターである化合物、特にその活性が細胞増殖に関連する化合物についてスクリーニングするのに使われる。そのような化合物をスクリーニングするのに有用なキットを作製することができ、このキットは本質的にNdr とスクリーニングされる化合物との相互作用を検出するための手段と共にNdr またはその断片を含んで成るだろう。従って、好ましくは、スクリーニングキットは上述した検出系の１つを含んで成る。本発明のキットに使われるNdr は、タンパク質の形で、例えば溶液、懸濁液もしくは凍結乾燥物において、または発現系により所望によりその場でのNdr もしくはその断片の生産を可能にする核酸配列の形で、提供することができる。好ましくは、Ndr またはその断片をコードする核酸は、融合タンパク質、例えばGST 融合体の形でそれをコードする。更に別の態様では、本発明はNdr またはその断片と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物を提供する。そのような化合物は無機または有機化合物、例えば抗生物質であり、好ましくは細胞内通信（Signalling）に関与するタンパク様化合物である。本発明に係る化合物は、上述した技術を使ってスクリーニングすることにより同定することができ、そして確立された手順に従った天然源からの抽出により、または特に低分子量化学化合物の場合には合成により、調製することができる。タンパク様化合物は組換え発現系、例えばバキュロウイルス系、または細菌系における発現により調製することができる。タンパク様化合物は治療用途を有してもよいが主として通信経路の機能の研究に有用である。他方で、低分子量化合物は好ましくは確立された手順に従って化学合成により製造される。それらは主に治療薬として望ましい。低分子量化合物と有機化合物は一般に増殖抑制薬として有用であろう。好ましくは、Ndr 活性のモジュレーターは細胞内のカルシウム応答のモジュレーターである。よって本発明は、カルシウム応答の潜在的モジュレーターをスクリーニングする方法であって、Ndr の活性に対するそのようなモジュレーターの効果をアッセイし、ここで前記活性に対する効果がカルシウム応答モジュレーターとしての化合物の可能性を表すことを含んで成る方法を提供する。 Ndr 活性の理解を高めそしてNdr モジュレーターを潜在的に改良するために、単離されたポリペプチドを使って全タンパク質のまたは少なくとも酵素活性と調節の原因となる領域の三次元構造を同定することができる。三次元構造の同定のための常法は、例えば、Ｘ線解析またはＮＭＲ解析である。それらのまたは同等の方法を使って得られたデータは、Ndr モジュレーターの同定または改良に直接または間接的に使うことができる。この点で汎用される方法は例えばコンピューターを使った薬剤デザインまたは分子模型製作である。本発明の更なる態様は、本発明のポリペプチドを使ってまたはそれから得られる三次元構造の助けをかりて同定された、治療方法に使われるモジュレーターに関する。プラスミドおよびＤＮＡ本発明の他の態様はNdr をコードする核酸である。この核酸DNA は１または複数のイントロンを含んでもよい。 Ndr をコードする核酸は、本明細書中に開示されるようなNdr ポリペプチドの全体をコードしない核酸を包含する。よって、本発明は全Ndr コード配列の断片を提供する。そのような断片は好ましくは上記に明記したようなNdr の断片またはその誘導体をコードする。核酸の断片は、例えば、関連タンパク質をコードするＤＮＡを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使うことができ、またはある組織における本発明のタンパク質の転写産物についてスクリーニングするのに用いることができる。適当な断片は好ましくは20ヌクレオチドより大きいものである。上述したような本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、上記核酸におよび場合により転写終結シグナルに作用可能に連結されたプロモーターを含んで成る核酸発現カセットの中に含まれてもよい。プロモーターはほとんど全ての源のものであることができる。例えば、Ndr 遺伝子に本来隣接しているプロモーターまたは密着制御型プロモーターを使うことが可能である。好ましいのは、選ばれた宿主細胞において活性であるプロモーター、例えばSV40、tac 、β−アクチン、メタロチオネイン、Ｔ７、ポリヘドリンおよびシトメガロウイルスプロモーターである。転写終結シグナルを含むＤＮＡ配列は、好ましくは所望の宿主に適当な転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子の３′隣接配列である。適当なシグナルは例えばヒト成長ホルモンの、DHFR遺伝子の、およびウサギβ− グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルである。本発明のポリペプチドをコードする好ましいＤＮＡは配列番号１と配列番号６に記述される。産生されたタンパク質を培地中に分泌させるシグナル配列を更に含有するポリペプチド発現カセットを使うこともできる。適当なシグナル配列は既知である。従って、それらの種類の発現カセットでは、プロモーターがシグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列に作用可能に連結され、それに正しい読み枠において本発明のポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列、および転写終結シグナルを含むＤＮＡ配列が連結される。プロモーター、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列および転写終結シグナルを含むＤＮＡ配列は互いに作用可能に連結され、即ち、それらはそれらの正常機能が維持されるような形で並列される。この配置は、プロモーターが構造遺伝子の適切な発現を行い且つ転写終結シグナルが適切な転写の終結とポリアデニル化を行うような配置である。それらの配列の連結は、例えば、エンドヌクレアーゼの認識配列を含む合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーを使って達成することができる。本発明の発現カセットは、安定なプラスミドの形で所望の宿主に挿入してもよく、または染色体中に直接挿入してもよく、後者の方が好ましい。その上本発明に係る発現プラスミドは、１または複数の、特に１つまたは２つの、プラスミドの作製、増幅および試験に使われる宿主のための選択遺伝子マーカー、例えば細菌宿主、特にエシェリキア・コリ（Escherichia coli）のマーカーと複製開始点を含む。選択遺伝子マーカーについては、該マーカー遺伝子の表現型発現の結果形質転換体の選択を容易にする任意のマーカー遺伝子を使うことができる。適当なマーカーは例えば、抗生物質耐性を発現するもの、または栄養素要求性宿主変異体の場合、宿主の欠陥を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質テトラサイクリン、アンピシリン、G418、ヒグロマイシンもしくはブレオマイシンに対する耐性を付与するか、または例えばURA3，LEU2，LYS2，HIS3 もしくはTRP1遺伝子が欠損している栄養素要求変異体における原栄養性に備える。発現プラスミドの増幅は通常原核生物、例えばＥ．コリ中で行われるので、有利には複製開始点が含まれる。それらは対応する原核生物プラスミド、例えばＥ．コリプラスミド、例えばpBluescript はpUC19 から得ることができ、これらは原核生物（例えばＥ．コリ）の複製開始点と抗生物質（例えばアンピシリンおよびテトラサイクリン）に対する耐性を付与する遺伝子マーカーの両方を含有する。ポリペプチド発現カセット、１または複数の複製開始点および遺伝子マーカーの他に、本発明の発現プラスミドは所望により追加の発現カセット、例えば同一であっても異なってもよい１〜３個の追加のポリペプチド発現カセットを含有することができる。本発明の発現プラスミドは、当業界で既知の方法により、例えばポリペプチド発現カセット、試験に使う宿主および場合により細菌宿主のための選択遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片、１または複数の複製開始点、並びに場合により追加のポリペプチド発現カセットを、予め決められた順序で、通常の化学的または生物学的試験管内合成方法を使って連結せしめることにより調製される。好ましくは、プラスミドは組換えＤＮＡ技術を使って作製および調製される。組換えＤＮＡ技術による調製の場合、適当なＤＮＡ断片を通常のやり方で試験管内で連結せしめる。次いで連結混合物を用いて、使った調節因子の性質に応じて適当な原核または真核宿主を形質転換せしめ、そして通常のやり方で所望のベクターを含有する形質転換体を選択する。形質転換された宿主を使ってプラスミドを増殖させることができ、そして通常のやり方でプラスミドを単離することができる。宿主の選択はベクター上に置かれた調節配列に依存する。ベクターの作製および増幅には、原核宿主、例えばＥ．コリが好ましい。宿主、トランスフェクションおよび培養本発明のポリペプチドの生産に適当な宿主は真核または原核細胞、例えば哺乳動物、線虫、昆虫、酵母または細菌細胞である。上述したような適当な宿主は、遺伝子工学の標準法により、例えばウイルス、脂質小胞、粒子衝撃またはエレクトロポレーションの助けをかりて、トランスフェクションすることができる。生産されるタンパク質の量を増やすために、高コピー数プラスミドを使うことが有利であり、またはプラスミドＤＮＡを数コピーでゲノム中に組み込む。後者は、例えば、例えばメトトレキセートを使って選択応力を適用することから、達成することができる。トランスフェクションされた宿主細胞は標準法により細胞培養において培養することができる。従って、本発明の更なる態様は、上述したようなトランスフェクションされた宿主を培養し、そしてそれによって生産されたポリペプチドを単離することを含んで成る、本発明のポリペプチドの生産方法に関する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば生来のNdrの過剰発現または規制解除（deregulation）により引き起こされ得る作用に影響を与えるために、並びに自身がNdr に影響を与える因子をターゲティングするために、生物中でのNdr の翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡのデザインにも利用することができる。本発明の他の態様は、Ndr 、特にヒトNdr に特異的である抗体に関する。そのような抗体は例えば免疫染色または免疫分離によってNdr を同定または単離するのに、あるいは生体内または試験管内でNdr 活性を破壊するのに有用である。 Ndr 特異的抗体は当業界で既知の技術に従って調製することができる。ポリクローナル血清を調製するためには、Ndr 由来のペプチド（例えばＣ末端ペプチド）から成るNdr の抗原性部分、または完全なキナーゼを、所望によりアジュバントの存在下でまたは免疫刺激薬（例えばアオガイヘモシアニン）に接合させた状態で、哺乳類（例えばマウスまたはウサギ）に注射し、そして固相に結合したキナーゼまたはそれの抗原性部分を使ったアフィニティー精製によりそこから抗体を回収する。モノクローナル抗体も同様な確立された手法に従って調製することができる。例示目的でのみ、本発明を次の実施例において更に説明する。実施例ランダムプライミング、サブクローニング、配列決定、制限酵素での開裂、ゲル精製、連結、形質転換およびアニーリングといった遺伝子工学における標準法は、本質的にはSambrook他，Molecular Cloning: A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY，1989に記載された通りに実施する。略号： bp 塩基対Ｃ．エレガンスセノラディティス・エレガンス（C ．elegans）（Caenorhabditis elegans）Ｄ．メラノガスタードロソフィア・メラノガスター（D ．melanogaster）（Drosophia melanogaster） DMEM ダルベッコ改良イーグル培地 FCS ウシ胎児血清 IPTG イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド nt ヌクレオチド nts 複数のヌクレオチド PBS リン酸塩緩衝化塩溶液 pI 等電点 SDS ドデシル硫酸ナトリウム SSC 0.15 M NaCl/15 mM クエン酸Na，pH 7.0実施例１：ショウジョウバエ Ndrの同定Ｃ．エレガンス（C ．elegans）ＥＳＴクローン cm11b8〔Waterston 他，Natur e Genet(1992)，1，114-123〕をランダムプライミングにより放射性標識し、それを使ってλZAPII（Stratagene）中に作製したショウジョウバエ胚cDNAライブラリーを低緊縮性でスクリーニングする（Sambrook他）。この結果2.1 kbクローン SDEpunk-12（ＤＳＭに寄託した）が単離され、それを完全に配列決定する（配列番号１）。それは456 アミノ酸の完全転写解読枠（配列番号２）を含む。実施例２：ヒト Ndrの同定Ｃ．エレガンス cm11b8 （配列番号３）とショウジョウバエ Ndr（配列番号２、実施例１から）との間で保存されているアミノ酸配列に相当する縮重オリゴヌクレオチドをヒト相同体の増幅のためにデサインする。この増幅は、配列番号４（XbaI部位に下線が引かれている）および配列番号５（HindIII 部位に下線が引かれている）を有するプライマーを使って、Sambrook他に記載されたようなグアニジンイソチオシアネート法によりHeLa細胞から単離された逆転写した全ＲＮＡ上でＰＣＲを行うことにより実施した。最終反応混合物（50μｌ）は10 mM Tris-HCl，pH 8.3，50 mMKCl，２ mM MgCl₂ ，200μM の各dNTP，50ピコモルの各プライマー，５μｌのcDNAおよび2.5 単位のTaq ポリメラーゼを含有する。反応は95℃（１分）、55℃（２分）および72℃ （３分）までを30回繰り返す。この後、反応液５μｌを取り出し、上記と同様に再増幅させる。ングし、ランダムプライミングにより標識し、そして胎児の脳、胎児の網膜、胎盤および成人の心臓から誘導されたヒトcDNAライブラ（Stratagene，上記参照）中に作製した〕をスクリーニングするのに使う。それらのライブラリーの各々において部分長さのクローンが見つかる。製造業者（Stratagene）により推奨されるようにしてプラスミド救援を実施する。スクリーンにおいて陽性シグナルを示すＰＣＲ生成物およびライブラリークローンを、シークエナーゼ（ＵＳＢ）と注文合成したプライマーを使って両方の鎖に関して完全に配列決定する。イブラリーの２つのクローン BBZpunk-16b（ＤＳＭに寄託）とBBZpunK-3a（ＤＳＭに寄託）を使用して、それらの共通のXmnI部位のEcoRI 部位の中に全長ヒトNdr cDNAを構築する。クローンBBZpunk-16b の1.1 kb EcoRI／XmnI断片とクローンBBZpunk-3aの部位の間に連結せしめる。この中間体プラスミドをSacIで消化し、BBZpunk-3aの 1.3 Kb SacI／SacI断片と連結せしめる。得られたプラスミドをpBLM-punk と命名する。構築したcDNAをHindIIIとXbaIによりそこから切り出し、HindIII／XbaI で切断されたpECE〔SV40系発現ベクター；これはEllis 他，Cell(1986)，45，72 1-732に与えられた記載に従って作製する〕の中にサブクローニングし、プラスミドpECE-punk を得る。このクローンは、nt 566〜nt 1990 に及ぶ単一転写解読枠を有する計3018 bp を包含する。転写解読枠中の最初のメチオニンはnts596-598 位にある。このメチオニンからの翻訳は、7.2 のpIと54.2KDa の分子量を有する465 アミノ酸ポリペプチドを与える。ショウジョウバエのものとの推定アミノ酸配列の整列は多数の高度に保存された領域を示す；ヒト Ndrとショウジョウバエ Ndrとの総合アミノ酸同一性は68％である。完全なヒトNdr 配列は配列番号６および７に記載される。配列はウィスコンシン大学GCG ソフトウエアパッケージを使って分析した。実施例３：ヒト組織におけるNdr の発現 BBZpunk-3aの 1.7 kb EcoRI 断片（実施例２参照）をランダムプライミングにより約１×10⁹cpm/μg の比活性に³²Ｐ標識し、製造業者の推奨に従ってヒト組織ＲＮＡブロット（Clontech）を探査するのに使う。次の組織を試験する：心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓。ハイブリダイゼーション後、ブロットを60℃にて0.2 ×ＳＳＣ／0.1 ％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝0.15 M NaCl ／15 mM クエン酸Na，pH7.0）の最終緊縮性に洗浄し、次いで２枚の映像強化膜を使って−70℃にて３週間Kodak XAR フィルムに暴露する。定量のため、ブロこのノーザン分析を使って、分析した全ての組織において単一の3.9 Kb転写物が検出される。このmRNAは腎臓に最も豊富であるが、成人の脳においては微量しか検出できず、転写レベルは腎臓と脳で約30倍の差がある。3.9 kbの転写物サイズはcDNAライブラリースクリーニングの結果と一致する。スクリーニング中に、ヒト心筋ライブラリーから部分長さのcDNAが単離され、これはnt 1375 から始まりこれの2515 bp 下流のポリ（Ａ）末尾で終わる胎児脳配列と同焦点である、。よって、異なるライブラリーからクローンを集めることにより、計3890 bp のcD NAを回収する。RT-PCRにより試験した幾つかの細胞系（実施例２に記載したような）およびスクリーニングした全てのヒトcDNAライブラリーにおけるNdr転写物の存在は、Ndrが広く発現される（おそらく構成的に）という考えと一致する。分岐した真核生物を越えたそれの保存を合わせて考えると、これはNdr が本質的な細胞機能において重要であるということを一層暗示する。実施例４：細菌におけるNdr 酵素活性の発現 Ndr 活性の試験管内特徴付けのために、BBZpunk-16b（実施例２参照）からヒトcDNAを単離し、細菌発現ベクターpGEX2T〔Pharmacia，Smith およびJohnson， Gene(1988)，67，31-40〕中にクローニングしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)−Ndr 融合タンパク質を作製した。陰性対照として、リジン118 がアラニンに変わったNdr の変異形を作製した。リジン118 は、ＡＴＰのαおよびβホスフェートを接触させる全てのプロテインキナーゼの不変リジンに相当し、触媒作用に不可欠である。突然変異誘発のための増幅はPfu ポリメラーゼ（Stratagene）を全ての増幅領域を配列決定し、変異の存在と追加の変異の不在を確認する。次の変異原性プライマーを使用する：プラスミドpGEX2T-punkを作製するために、cDNAクローンBBZpunk-16bを配列番号８と配列番号10のプライマーを使って増幅させる。クローニングしたＰＣＲ生成物のBamHI/XmnI断片を、cDNAクローンBBZpunK-3aの５′XmnI/EcoRI断片と一緒に、BamHI/EcoRIで切断したpGEX2Tの中に連結せしめる。得られたプラスミドをE coRI で切断し、BBZpunK-3aの３′EcoRI 断片と連結せしめる。リジン118 をアルギニンに変更するために、２段階ＰＣＲ法を使う。配列番号８／配列番号11と配列番号９／配列番号12のプライマー対を使って、プラスミド pBLM-punk を増幅させる。２つの生成物をゲル精製し、変性させ、互いにアニーリングさせ、そして配列番号８と配列番号９のプライマーを使って再増幅させる。第二次ＰＣＲ生成物をNcoIとEcoRI で切断し、pGEX2T-punk 中の対応する部位の間にクローニングしてpGEX2T-punkK118Aを作製する。どちらの場合でも、グルタチオン−アガロース上での精製は約0.25mg／ｌ細菌の収率で期待のサイズ（約82 kDa）のタンパク質を与えた。精製したタンパク質の約50％が全長タンパク質であり；28〜35 kDaで移動する微量種は該融合タンパク質の分解産物であると推定される。というのは、同一条件下での遊離ＧＳＴの精製は事実上均一なタンパク質を与えたからである。活性を測定するために、適当なプラスミドにより形質転換されたＥ．コリ JM109細胞（Clontech）を標準条件下で対数中期まで増殖させ、次いで 0.1 mM IPTG で室温で一晩誘導する。この後、細菌を収得し、超音波処理により溶解し、そして本質的にSmith およびJohnson，Gnen(1988)，67，31-40 に記載された通りにグルタチオンアガロース（Sigma）上で融合タンパク質を精製する。組換えタンパク質を100 μM の[³²P]-γ-ATP（15〜25μCi）を含有する20〜35 μｌの50 mM Tris-HCl，pH 7.5／10 mM MgCl₂／1 mMジチオトレイトール中でキナーゼ活性についてアッセイする。30℃で30分後、Laemmli 試料緩衝液〔Laemml i 他，Nature（1970）227，680〕を添加し、10％SDS-PAGEの後、２枚の映像強化膜を使った−70℃での乾燥ゲルのオートラジオグラフィーにより反応を分析した。ヒストンＨＩ、ミエリン塩基性タンパク質、カゼインおよびホスビチンを含む非特異的キナーゼ基質のリン酸化は全く検出されない。しかしながら、GST-Ndr の自己リン酸化に由来する約82 kDaバンドのリン酸化は一貫して観察される。試験管内自己リン酸化Ndr のホスホアミノ酸分析〔Cooper他，Methods Enzymol．( 1983)，99，387-402に記載された通りに実施する〕は、ホスホセリンとホスホスレオニンの存在を明らかにした。よって、組換えNdr は活性なセリン／スレオニンプロテインキナーゼであり、少なくとも２つの部位で自己リン酸化を受けることができる。融合タンパク質は遊離のGSTをリン酸化することができなかったので、それらの２部位はNdr 自身の内部に位置しているらしい。実施例５：COS-1 細胞におけるヒトNdr の発現および限局化過剰発現されるタンパク質の検出のために、ヒトNdr の推定カルホキシ末端（配列番号７）由来の合成ペプチド（TARGAIPSYMKAAK）をHendrix 他，J．Biol．C hem．(1993)，268，7330-7337 に記載されたようにしてアオガイヘモシアニンに結合させたものに対してウサギ抗血清（Ab^452-465）を惹起せしめる。組換えNdr を発現するＥ．コリの溶解物（実施例４から）を含むウエスタンブロット上で抗体価を試験する〔Hendri x 他，J．Biol．Chem．(1993)，268，で製造業者の教示に従って免疫原性ペプチドをカップリングさせて体を精製する。６Ｍ尿素を含む50 mM Tris-HCl，pH 7.4を使って抗体を溶出させ、ＰＢＳに対して十分に透析する。 COS-1 細胞（ATCC CRL 1650）を10％FCS が補足されたDMEM中で37℃で維持する。トランスフェクションのために、pECE-punk（実施例２参照）からの0.7 μg /mlのプラスミドＤＮＡと７μg/mlのリ細胞をインキュベートする。５時間後、同容量のDMEM／20％FCS を加える。12時間後、培地を新鮮なDMEM／10％FCS と交換するか、または細胞をカバーガラス（免疫検査用）上を通過させることにより、トランスフェクションを終わらせる。 24時間後、免疫ブロッティングによりタンパク質発現を分析する。免疫ブロティングは、1:20の希釈度でAb^452-465を使って、HendriX 他，J．Bi ol．Chem．(1993)，268，7330-7337 に記載され検出する。 COS-1 細胞中へのヒトcDNAのトランスフェクションは、全細胞溶解物のウエスタンブロット上に約55 kDaの免疫反応性ポリペプチドの出現をもたらす。この種は、pECEベクターだけでトランスフェクションした細胞からの溶解物中には通常観察されない。実施例６：Ndr の細胞レベル下限局化の分析同じ抗体を使って、間接免疫蛍光法により細胞を分析してNdr の細胞レベル下（subcellular）の限局化を評価する。酸で洗浄し、ポリリジンでコーティングしたカバーガラス上にトランスフェクションの12時間後に接種したCOS-1 細胞に対して免疫細胞化学分折を実施する。細胞を3.7 ％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で20分間固定し、次いでアセトンで浸透性にする（−20℃、30秒間）。ＰＢＳ／３％ＢＳＡを使って37℃にて30分間、非特異的結合をブロックする。アフィニティー精製したAb^452-465（ＰＢＳ／0.2 ％ＢＳＡ中１：６）、ビオチン／ヤギ抗ウサギIgＧ（１：100 、Amersham ）およびストレプトアビジン／テキサスレッド（１：200 、Amersham）と共に全て37℃でカバーガラスを順次インキュベーションする。洗浄はＰＢＳ／0.2 ％ＢＳＡ中で３×５分である。染色した細胞は、アルゴン／クリプトンレーザーを装備したLeicaTCS 同焦点顕微鏡（40倍の倍率）を使って観察し、約１μｍの10の走査断片から投影を集成する。ヒトcDNAによりトランスフェクションした細胞は、強い核染色と弱い細胞質シグナルを示す。実施例７：核限局化シグナルの同定核限局化シグナルを同定するために、アミノ酸1-84，65-81 および265-276 をそれぞれ欠いている変異体を実施例４に記載のようにして作製し、実施例６に記載のようにして分析する。次のプライマーを使用する： pECE-punkΔ1-84を作製するために、配列番号16と配列番号９のプライマーを使ってPfu ポリメラーゼ（Stratagene）を用いてＰＣＲによりpBLM-punk のnts 848-1403を増幅せしめる。増幅生成物をNcoIとEcoRI で消化し、それをpECE-pun k の対応部位の間にクローニングする。 pECE-punkΔ65-81 は、配列番号８／配列番号13と配列番号９／配列番号14のプライマー対を使ってpBLM-punk（実施例４）から作製した２つのＰＣＲ生成物から得られる。ＰＣＲ増幅生成物をそれとEcoRI 部位の間に互いに平滑末端連結せしめる。連結生成物をそこからNcoI/E coRI断片として単離し、該断片を使ってpECE-punk 中の対応する野性型配列を置き換える。 pECE-punkΔ265-276 は、配列番号８と配列番号15のプライマーを使ってプラスミドpBLM-punk の一領域を増幅せしめることにより作製する。得られた生成物をNcoIとNheIで切断し、それをpBLM-punk 中の対応部位の間に連結せしめる。この後、HindIII−NheI断片を得、HindIII／NheIで切断したpECE-punk 中に該断片をクローニングする。アミノ酸65〜81の削除はNdr の核内蓄積に全く影響を与えない。同様に、アミノ末端領域全部の削除は核内取込みを減少させない。従って、それらの配列はNd r の核限局化に役割を果たすようには見えない。しかしながら、触媒領域挿入断片中のアミノ酸265 〜276の削除は発現されるタンパク質の有意な再分配を引き起こす。強い核シグナルの代わりに、細胞はもっと拡散した染色パターンを示す。多くの細胞では、核は細胞質に対してより暗い領域として見える。発現されるタンパク質は完全には核から排除されない（核からの排除がまだ見られる）が、これは欠失変異体のサイズが受動的な入核のためのカットオフサイズ（40〜60 k Da）に近いために核の中にゆっくりと分散できることにより説明することができる。よって、Ndr の核限局化シグナルはペプチドKRKAETWKRNRR（アミノ酸265 〜276）の中に含まれるらしい。寄託次の微生物株をＤＳＭ（the Deutsche Sammlung von Mikroorga-nismen），Ma scheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweigに寄託した（受入れ番号と寄託日を示す）：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 38/45 48/00 ＡＤＵ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＡ６１Ｋ 37/52 48/00 ＡＤＵ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号２または配列番号７に相同であるNdr プロテインキナーゼ。２．ヒト Ndrプロテインキナーゼであり且つ配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキナーゼ。３．ショウジョウバエ（D ．melanogaster）Ndrプロテインキナーゼであり且つ配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキナーゼ。４．配列番号２または配列番号７に少なくとも50％相同である、請求項１に記載のキナーゼ。５．核限局化、セリン／スレオニンキナーゼおよび他のプロテインキナーゼ活性から成る群より選ばれた活性を有する請求項１に記載のキナーゼの断片。６．請求項１に記載の Ndrプロテインキナーゼまたは請求項５に記載のその断片をコードする核酸。７．配列番号１または配列番号６に表される配列の全部または一部を有し且つ長さが20ヌクレオチド以上である、請求項６に記載の核酸。８．請求項６に記載の核酸およびそれに作用可能に連結されたプロモーターを含んで成る発現ベクター。９．前記核酸によりコードされるポリペプチドが融合タンパク質の形で発現される、請求項８に記載の発現ベクター。 10．請求項６に記載の核酸により形質転換された宿主細胞。 11．Ndr 活性の潜在的モジュレーターである化合物をスクリーニングする方法であって、次の段階：ａ）請求項１に記載のキナーゼを前記化合物と共にインキュベートし；そしてｂ）前記化合物により誘導される前記キナーゼの活性の変化を測定し、ここで前記化合物の存在下での前記活性の変化が前記化合物と前記キナーゼの間の機能的相互作用を表すを含んで成る方法。 12．前記化合物が細胞中のカルシウム応答の潜在的モジュレーターである、請求項11に記載の方法。 13．Ndr 活性のモジュレーターである化合物。 14．カルモジュリン応答に関連づけられる状態の治療に使われる、請求項13に記載の化合物。 15．細胞を Ndrモジュレーターと接触せしめることを含んで成る、カルモジュリンの作用に影響を与える方法。 16．Ndr モジュレーターの医薬上有効な量を患者に投与することを含んで成る、カルシウム応答の異常に関連づけられる病気の治療方法。 17．Ndr 特異的抗体。