JP2001514484A

JP2001514484A - タンパク質チロシンキナーゼの結晶構造

Info

Publication number: JP2001514484A
Application number: JP51103698A
Authority: JP
Inventors: モハマディ，ムーサ; サン，リ; リィアン，ツォンシァン; シュレシンガー，ジョゼフ; ハバード，スティーブン・アール; マクマホン，ジェラルド; タン，ペン・シー
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2001-09-11
Also published as: AU733890B2; CA2263838A1; WO1998007835A2; AU4160397A; EP0931152A2; WO1998007835A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、任意に１つまたはそれ以上の化合物と錯化していてもよい蛋白質チロシンキナーゼの三次元構造に関する。蛋白質チロシンキナーゼおよびそれに結合している化合物のいずれの構造も規定する原子配位は、未知の構造の蛋白質チロシンキナーゼの三次元構造を決定するための方法および蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定する方法に適切である。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質チロシンキナーゼの結晶構造関連出願本発明は、１９９６年８月２１日出願の、Mohammadi等の「非インシュリン受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインの結晶(Crystals of the Tyr osine Kinase Domain of Non-Insulin Receptor Tyrosine Kinases)」という名称の米国特許出願第８０／７０１，１９１号(LyonおよびLyon Docket第２２７／０８８号)、および１９９６年１２月１９日出願の、McMahon等の「オキシインドリノン／チオールインドリノン族化合物と複合体形成したタンパク質チロシンキナーゼの結晶構造(Crystal Structure of a Protein Tyrosine Kinase Complexe d with Compouds of the Oxindolinone/Thiolindolinone Family)」という名称の米国特許出願第６０／０３４，１６８号(LyonおよびLyon Docket第２２１／２８２号）に関連したものであり、それらの図面、表、および図を含むすべてを本文中に参考文献として取り入れた。序本発明は、プロテインキナーゼの三次元構造に関する。背景技術本発明の背景についての以下の説明は、単に本発明の理解の助けとして提供されているものであって、本発明に対し先行技術を記述または構成するために付け加えられたものではない。タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多くの異なる種類の酵素を含む( 総説としてSchlessingerおよびUllrich、1992、Neuron、9：383-391参照のこと) 。ＰＴＫファミリーは、多数のサブファミリーを含んでおり、そのうちの一つが繊維芽細胞増殖因子受容体(ＦＧＦ−Ｒ)のサブファミリーである(総説としてGiv olおよびYayon、1992、FASEB J.、(15)：3362-3369参照のこと)。全てのＰＴＫは、高エネルギーホスフェートをアデノシン三リン酸から標的タンパク質のチロシン残基へ酵素的に転移させる。これらのリン酸化反応の結果は、シグナルトランスダクションの過程における細胞現象を調節する。細胞のシグナルトランスダクションの過程は、細胞外のシグナルを細胞内シグナルに変換する多くの段階を含む。細胞内シグナルは、次いで細胞の応答に変換される。ＰＴＫは多くのシグナルトランスダクションの過程の構成要素である。ＰＴＫは、この過程の特定の段階において、下流の分子をリン酸化することによりシグナルの流れを調節する。ホスフェートの添加は、下流の分子を「オン」または「オフ」することによりその活性を調整することができる。従って、特定のＰＴＫ活性の異常は、そのシグナルのオーバーフローまたはアンダーフローのいずれかを引き起こすことが可能である。シグナルのオーバーフローは、制御されていない細胞増殖のような異常に導く可能性があり、それは癌および脈管形成のような疾患を代表するものである。生物医学界の科学者達は、シグナルトランスダクション経路のオーバーフローをダウンレギュレートするＰＴＫ阻害剤を捜している。特に、細胞膜を横切ることができ、かつ酸性の環境において加水分解されない低分子のＰＴＫ阻害剤が捜し求められている。これらの低分子のＰＴＫ阻害剤は、生物的利用能が高い可能性があり、さらに、経口的に患者に投与することができる。いくつかの低分子のＰＴＫ阻害剤がすでに発見されている。例えば、ビス(単環式)、二環式または複素環式アリール化合物(ＰＣＴＷＯ９２／２０６４２）、ビニレンアザインドール誘導体(ＰＣＴＷＯ９４／１４８０８)、１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン(米国特許第５，３３０，９９２号)、スチリル化合物(米国特許第５，２１７，９９９号)、スチリル置換ピリジル化合物 (米国特許第５，３０２，６０６号)、ある種のキナゾリン誘導体(欧州特許出願第０５５６２６６Ａ１)、セレオインドールおよびセレニド(ＰＣＴＷＯ９４／０３４２７)、三環の多価アルコール化合物(ＰＣＴＷＯ９２／２１６６０)、およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴＷＯ９１／１５４９５）がＰＴＫ阻害剤として記載されている。数多くのＰＴＫ阻害剤が知られているが、これらの多くはＰＴＫサブファミリーに特異的ではなく、従って治療法としては、さまざまな副作用を引き起こすだろう。しかしながら、インドリノンファミリーの化合物はＦＧＦＲサブファミリーに特異的であり、かつ加水分解されない。１９９６年１２月１９日に公開された、Tang等の「疾患の治療のためのインドリノン化合物（Indolinone Compounds for the Treatment of Disease)」という名称のＷＯ９６／４０１１６。X線結晶学の使用により他のＰＴＫの三次元構造が提供されたが、それらはＰＴＫサブファミリーに特異的な加水分解抵抗性の低分子と複合体を形成しない。最近の進歩にもかかわらず、この技術においては、改良された治療用分子が設計され合成されるような、プロテインキナーゼの結晶学的解析の必要性が残されている。発明の概要本発明はタンパク質チロシンキナーゼの三次元構造に関する。Ｘ線結晶学の使用により、タンパク質チロシンキナーゼの三次元構造を原子の解像力で明示することができる。本文中に記載した三次元構造は、タンパク質チロシンキナーゼとそれらに結合する化合物との間の特異的な相互作用を明らかにする。タンパク質チロシンキナーゼの三次元構造を明示する座標は、未知の構造をもつＰＴＫの三次元構造の決定に有用である。さらに、当該座標は、タンパク質チロシンキナーゼ機能のモジュレーターの設計および同定に有用である。これらのモジュレータは、癌、脈管形成、アテローム硬化症、および関節炎のような細胞増殖性の疾患を含めた（しかしこれらに限定されない）疾患に対する治療法として、潜在的に有用である。従って、第一の態様において、本発明はタンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインに相当するポリペプチドの結晶形を特色とする。本発明の情況においては、「結晶形」という用語は、ＰＴＫの触媒ドメインに相当する精製されたポリペプチドを含んでいる水溶液から形成された結晶をいう。タンパク質チロシンキナーゼの結晶形は、Blundel等、1976年、タンパク質結晶学 (Protein Crystallography)、アカデミックプレス、に描かれた結晶形の一つによって定義されるパターンでX線を回折することができるものとして特徴づけられる。プロテインキナーゼの結晶形は、例えば、主として塩または主として化合物から成る結晶形に類似のパターンでX線回折することができるものとしては特徴づけられない。「タンパク質チロシンキナーゼ」または「ＰＴＫ］という用語は、アデノシン三リン酸の高エネルギーホスフェートを標的タンパク質のチロシン残基へ転移する酵素をさす。本発明のタンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインは、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と結合する、受容体タンパク質チロシンキナーゼから生じることが可能である。これらのタンパク質チロシンキナーゼは本文においては「ＦＧＦＲ」として識別されており、ＦＧＦＲ１のようにＦＧＦＲファミリーの一員をさすことができる。「触媒ドメイン」という用語は、タンパク質から切り離れて存在することが可能なタンパク質の部位をさす。タンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインは、他のタンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインに対し、かなりのアミノ酸の同一性を有するものとして特徴づけられる。かなりのアミノ酸の同一性とは、好ましくは少なくとも３０％の同一性を、さらに好ましくは少なくとも３５％の同一性を、さらに、最も好ましくは４０％の同一性をさす。これらのアミノ酸の同一性の度合は、異なるタンパク質チロシンキナーゼファミリー間の同一性に関連する。所与のタンパク質チロシンキナーゼファミリーの構成員についてのアミノ酸の同一性は、５５から９０％に及ぶ。触媒ドメインは切り離された存在として機能的であってもよい。タンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインはまた、溶液中において可溶性であるポリペプチドとしても特徴づけられる。本文において用いた「同一性」という用語は、それらの類似性または関連性を測る配列の特性をさす。同一性は、二つの配列において同一な残基の数を全残基数で割り、その商を１００倍することによって測定される。従って、２コピーの全く同じ配列は１００％の同一性を有するか、高度には保存されていない、欠損、付加、または置換を有する配列は低い度合の同一性を有する。当業者には、配列の同一性の測定のためにいくつかのコンピュータープログラムが利用できることが認識されるであろう。「機能性の」という用語は、触媒ドメインが基質をリン酸化することにより、基質を産物に変える能力をさす。「機能性の」という用語はまた、触媒ドメインが天然の結合相手と結合する能力をさす。触媒領域は、Ｎ末端尾部、触媒中心、およびＣ末端尾部を含んでもよい。触媒中心は、触媒作用に関して機能性であることが可能なポリペプチドである。ＮおよびＣ末端尾部は、触媒作用の面では明らかな機能性を与えなくてよいが、モジュレーター特異性の面では機能性を与えてもよい。ポリペプチドは、もしそれが機能性でなくとも、触媒ドメインとして存在することが可能である。例えば、触媒ドメインに相当するポリペプチドは、もし鍵領域にホスフェートを収容しないなら、機能性でないといってよい。リン酸化の状態に依存した機能の数多くの例がこの技術においてよく記録されている。従って、触媒ドメインは、機能性であることをぬきにしても存在することが可能である。プロテインキナーゼの触媒ドメインの物差しは、他のプロテインキナーゼ触媒ドメインと相同なポリペプチドであるということである。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質を含む、アミノ酸配列の一部または全部に相当するアミノ酸の鎖をさす。本発明の好ましい態様は、受容体ＰＴＫであるＰＴＫの結晶形を含む。受容体は、細胞膜の内側および外側にまたがるタンパク質である。受容体ＰＴＫは、細胞外領域、膜を横切る領域、および触媒ドメインを含んでいる細胞内領域を含む。本発明のもう一つの好ましい態様は、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫから成る群より選択した受容体ＰＴＫの結晶形である。本発明のさらにもう一つの好ましい態様は、非受容体ＰＴＫであるＰＴＫの結晶形である。非受容体ＰＴＫは細胞の内側に局在し、触媒ドメインに相当するポリペプチドに結合している細胞外の、または膜にかかっているポリペプチドを収容しない。非受容体ＰＴＫは、脂肪酸または脂質を収容してもよく、それらはＰＴＫに膜と結合する性質を与えることができる。本発明の好ましい態様においては、非受容体ＰＴＫの結晶形は、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫから成る群より選択される。さらにもう一つの好ましい態様においては、本発明は重金属原子を含んでいるＰＴＫの結晶形を特色とする。これらのタイプの結晶を誘導体結晶（derivative crystals）と呼ぶことができる。「誘導体結晶」という用語は、ポリペプチドが１以上の重金属原子と結合している結晶をさす。「結合」という用語は、化学的実体または化合物か、あるいはそれらの部分またはフラグメントと、チロシンキナーゼドメインタンパク質か、あるいはそれらの部分またはフラグメントとの間の近接した状態をさす。結合は、非共有性でもよく(すなわち、例えば水素結合、ファンデルワールス、静電、または疎水性相互作用により、エネルギー的に並置が好ましい場合)、あるいは共有性であってもよい。「重金属原子」という用語は、遷移元素、ランタニド金属、またはアクチニド金属である原子をさす。ランタニド金属は、（５７と７１も含めて）５７と７１の間の原子番号を有する元素を含む。アクチニド金属は、（８９と１０３も含めて）８９と１０３の間の原子番号を有する元素を含む。好ましい態様においては、本発明はＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインタンパク質の結晶を特色とする。ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインタンパク質は、ＦＧＦＲ１をさすことができる。「ＦＧＦＲ１」という用語は、互いに相同でありかつＦＧＦと結合する数多くの受容体ＰＴＫの一員をさす。このような状況においては、「相同」という用語は、ＦＧＦＲファミリーの二つの構成員間の、少なくとも７０％のアミノ酸の同一性をさす。「ＦＧＦＲ１」という用語はまたＳＥＱＴＤＮＯ；２のアミノ酸配列によって特徴づけられる、ヒトＦＧＦＲ１の突然変異体をさすことができる。ヒトＦＧＦＲ１と比較して、ＦＧＦＲ１は以下のアミノ酸の置換：Ｃｙｓ−４８８→Ａｌａ、Ｃｙｓ−５８４→Ｓｅｒ、Ｌｅｕ−４５７→Ｖａｌ、を含み、さらにＮ末端に付加的な５個のアミノ酸残基(Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ)、を有する。「ヒトＦＧＦＲ１」という用語は、ＳＥＱＩＤＮＯ；１のアミノ酸配列を有する、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体１（「ＦＧＦＲ１」）の、チロシンキナーゼドメインをさす。一般的に、ヒトＦＧＦＲ１はヒトＦＧＦＲ１の３１０アミノ酸残基フラグメント（残基４５７ないし７６５）を含む。「突然変異体」という用語は、天然のチロシンキナーゼドメインにおける少なくとも１個のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基で置換することにより得られるポリペプチドをさす。突然変異は、天然のポリペプチド内か、または天然のチロシンキナーゼドメインに相当し、それが由来した天然のチロシンキナーゼドメインと実質的に同じ三次元構造を有しているポリペプチドの、Ｎおよび／またはＣ末端における、アミノ酸残基の付加および／または欠失によって達成される。実質的に同じ三次元構造を有するということは、天然のチロシンキナーゼのＣα 原子の少なくとも約５０％ないし１００％が重ね合せに含まれる場合に、突然変異体が由来した天然のチロシンキナーゼドメインの原子構造座標を重ね合せると、約２Å以下の根平均二乗速度（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ.）を有する一組の原子構造座標を有することを意味する。突然変異体はＰＴＫ活性を有してもよいが、有する必要はない。もう一つの好ましい態様においては、本発明は表１に説明した構造座標により定義される結晶形に関する。本文に用いた「原子構造座標」という用語は、分子または複数の分子の三次元構造を定める一組のデータをさす。構造座標はわずかに変更することができ、さらに、ほぼ同等な三次元構造を与えることができる。独特な一組の構造座標の物差は、結果として得られた構造の根平均二乗速度である。１．５より小さい根平均二乗速度によって互いに逸脱する三次元構造を与える構造座標は、普通の技術の熟練を有する人により同等と判断されてよい。従って、表１、表２、表３、および表４に説明した構造座標は、そこに定めた値に限定されるものではない。もう一つの好ましい態様においては、本発明は化合物と結合しているポリペプチドの結晶形を特色とする。これらのタイプの結晶形をコクリスタル(co-crysta l)と呼ぶことができる。この化合物は補因子、基質、基質類似体、阻害剤、またはアロステリックエフェクターでよい。「化合物」という用語は有機分子をさす。「有機分子」という用語、はその構造内に少なくとも一つの炭素原子を有する分子をさす。当該化合物は６ｋＤａより小さい分子量を有することができる。当該化合物の配置および、当該化合物とポリペプチドとの間に形成された相互作用の両者は、好ましくは当該二つの分子間の高親和性結合を決定する。高親和性結合は、好ましくは１０^-6Ｍ以下程度の解離平衡定数によって決定される。当該化合物は、好ましくはＰＴＫの機能を変えるモジュレーターである。「機能」という用語は、ＰＴＫ機能についてのモジュレーターの影響に関しては、ＰＴＫの触媒活性を促進または阻害するモジュレーターの能力をさす。「触媒活性」という用語は、本発明の情況においては、基質ポリペプチドをリン酸化するＰＴＫの能力をさす。触媒活性は、例えば、生成物に変えられた基質の量を、時間の関数として測定することによって測ることができる。生成物への基質の転換は、ＰＴＫの活性部位で起こる。「活性部位」という用語は、ＰＴＫ分子に局在するくぼみをさし、そこに１以上の基質分子が結合してもよい。ＰＴＫを発現している細胞へのモジュレーターの添加は、ＰＴＫの触媒活性を高める（活性化）か、または低め（阻害）てもよい。少数のＰＴＫの触媒活性阻害剤がこの技術においては周知である。低分子阻害剤は、基質の結合を妨げることによってＰＴＫの機能を調節してもよい。例えば、インドリノン化合物はＰＴＫの触媒ドメインの活性部位に結合してよく、１０^-6 Ｍまたはそれより小さい程度の阻害定数によって測定されるように、効果的にそれらを阻害する。ＰＴＫの細胞内領域の活性剤は、ＰＴＫ触媒ドメインおよび基質の両者と相互作用することによりＰＴＫの機能を高めることができる。活性剤はまたＰＴＫの二量化を促進してよく、従ってそれらを互いにきわめて接近するようにしむけることによりそれらを活性化させる。さらに活性剤は、ＰＴＫの細胞内領域において、触媒部位が活性剤の存在下に、より速い速度で基質を修飾するよう、立体配座の変化を促進することにより作用してもよい。「機能」という用語はまた、ＰＴＫと天然の結合相手との間の結合を促進または阻害するためのモジュレーターの能力をさす。「天然の結合相手」という用語は、細胞においてＰＴＫに普通に結合するポリペプチドをさす。これらの天然の結合相手は、ＰＴＫのシグナルトランスダクションの過程における信号の伝播に、役割を果たすことができる。天然の結合相手は、高い親和性を以ってＰＴＫに結合することができる。高い親和性は、１０^-6 Ｍまたはそれより小さい程度の平衡結合定数を示す。しかしながら、天然の結合相手はまたＰＴＫと一時的に結合し、それを化学的に修飾することができる。天然の結合相手は、ｓｒｃホモロジー(homology)２（ＳＨ２）または３（ＳＨ３）ドメイン、他のホスホリルチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン、ヌクレオチド交換因子、および他のプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼから成る群より選ばれるがこれに限定されない。「相互作用」という用語は、モジュレーターおよび酵素の活性部位における原子の間に形成される疎水性、芳香性、およびイオン性の力と、水素結合とをさす。「補因子」という用語は、基質に加えて、タンパク質に結合し化学反応を受けてもよい化合物をさす。多様な補因子は、アデノシンのホスフェートおよびニコチンアミド誘導体のような、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である。「基質」という用語は、酵素と反応する化合物をさす。酵素は、特異的な基質上で特異的な反応を触媒することかできる。例えば、ＰＴＫはチロシン部分の上で特異的なタンパク質ならびにペプチドの基質をリン酸化することができる。さらに、ヌクレオチドはプロテインキナーゼの基質として作用することができる。「基質類似体」という用語は、構造上基質に類似しているが、同等ではない化合物をさす。基質類似体はヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体の例は、以下に記述されている。「阻害剤」という用語は、プロテインキナーゼの細胞性の機能を減少させる化合物をさす。プロテインキナーゼ機能は、好ましくは天然の結合相手との相互作用であり、さらに好ましくは触媒活性である。「アロステリックエフェクター」という用語は、タンパク質においてアロステリック相互作用を引き起こす化合物をさす。「アロステリック相互作用」という用語は、タンパク質上の離れた部位の間の相互作用をさす。当該部位は活性部位と異なってもよい。アロステリックエフェクターは、活性部位と異なってもよい部位へ結合することにより、触媒活性を高めるかまたは阻害することができる。「コクリスタル」という用語は、ポリペプチドが１以上の化合物と結合している結晶をさす。好ましい態様においては、本発明のコクリスタルは重金属原子と結合していることが可能である。重金属原子の例は前文に記述した。もう一つの好ましい態様においては、本発明は、ＡＴＰの加水分解不能の類似体である化合物と結合している、結晶形のポリペプチドを含んでいるコクリスタルを特色とする。これらの類似体をヌクレオチド類似体と呼ぶことができる。「ＡＴＰ」という用語は、化合物アデノシン三リン酸をさす。「加水分解不能」という用語は、水と容易に反応しない共有結合を有する化合物をさす。加水分解不能のＡＴＰ類似体の例は、ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＡＭＰ− ＰＣＰであり、それらの構造は当業者には周知である。「ＡＭＰ−ＰＮＰ」という用語は、加水分解不能のＡＴＰ類似体である、アデニリルイミド二リン酸をさす。「ＡＭＰ−ＰＣＰ」という用語は、加水分解不能のＡＴＰ類似体である、アデニリル二リン酸をさす。もう一つの好ましい態様においては、本発明は、表２に明らかにした構造座標によって定義される結晶形に関する。好ましい態様においては、本発明は、ポリペプチドと結合している化合物がインドリノンである結晶形に関する。あるインドリノン類はＰＴＫ機能の特異的なモジュレーターである。本発明の好ましい態様は、式ＩまたはＩＩ：のインドリノンと複合体を形成しているＰＲＫの結晶形であるか：のインドリノンと複合体を形成しているＰＲＫの結晶形であるか、または製薬上許容される塩、異性体、代謝産物、エステル、アミド、またはそれらのプロドラッグであって：（ａ）Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃、およびＡ₄は独立して炭素または窒素であり；（ｂ）Ｒ₁は水素またはアルキルであり；（ｃ）Ｒ₂はオキシインドリノンの場合には酸素であるか、またはチオールインドリノンの場合には硫黄であり；（ｄ）Ｒ₃は水素であり；（ｅ）Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は任意に存在しており、さらにそれらは（ｉ）アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリル、アルカリルオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＲＲ’、ＳＯ₃Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_n、ＣＯ₂ＲおよびＣＯＮＲＲ’から成る群より独立して選択されるか、または（ｉｉ）隣接する二つのＲ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇が共同してインドリノンのインドールが基底を成す部位のアリール部位と共に融合した環を形成し；（ｆ）Ｒ₂’、Ｒ₃’、Ｒ₄’、Ｒ₅’、およびＲ₆’は、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリル、アルカリルオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ＮＲＲ’、ＳＯ₃Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂ ＲおよびＣＯＮＲＲ'から成る群よりそれそれ独立して選択され；（ｇ）ｎは０、１、２、または３であり；（ｈ）Ｒは水素、アルキル、またはアリールであり；（ｉ）Ｒ‘は水素、アルキル、またはアリールであり；さらに（ｊ）Ａはチオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フラン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール、１，２，３，５−オキサトリアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，２，３，４−チアトリアゾール、１，２，３，５−チアトリアゾール、およびテトラゾールから成る群より選ばれ、１以上の位置がアルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリル、アルカリルオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ＮＲＲ’、ＳＯ₃Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂ＲまたはＣＯＮＲＲ’により任意に置換されている五員環ヘテロアリールリングである、インドリノンと複合体を形成したＰＴＫの結晶形である。「製薬上許容される塩」という用語は、生物学的活性ならびに遊離塩基の性質を保持している塩類をさす。製薬上許容される塩類は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、その他のような無機酸との反応によって取得できる。「プロドラッグ」という用語は、インヴィヴォにおいて元の薬剤に変化する薬剤をさす。プロドラッグは、ある条件では元の薬剤よりも投与しやすといってもよい。例えば、プロドラッグは経口投与により生物学的利用が可能であってもよいが元のものはそうではないか、またはプロドラッグは静脈内投与ができるよう溶解度を改善してもよい。「アルキル」は、直鎖、分枝、または環状の飽和脂肪族炭化水素をさす。好ましくは、アルキル基は１ないし１２個の炭素を有する。さらに好ましくは、それは１ないし７個の炭素の、さらに好ましくは１ないし４個の炭素の低級アルキルである。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシル、その他を含む。アルキル基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂アミノ、およびＳＨから成る群より選ばれる１以上の置換基によって任意に置換されていてもよい。「アルケニル」は、少なくとも一つの炭素一炭素二重結合を含んでいる直鎖、分枝、または環状の飽和脂肪族炭化水素をさす。好ましくはアルケニル基は２ないし１２個の炭素を有する。さらに好ましくは、それは、２ないし７個の炭素の、さらに好ましくは２ないし４個の炭素の、より低級のアルケニルである。アルケニル基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂アミノ、およびＳＨから成る群より選ばれる１以上の置換基によって任意に置換されていてもよい。「アルキニル」は、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を含んでいる直鎖、分枝、または環状の飽和脂肪族炭化水素をさす。好ましくはアルキニル基は２ないし１２個の炭素を有する。さらに好ましくは、それは、２ないし７個の炭素の、さらに好ましくは２ないし４個の炭素の、より低級のアルキニルである。アルキニル基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂アミノ、およびＳＨから成る群より選ばれる１以上の置換基によって任意に置換されていてもよい。「アルコキシ」は、「Ｏ−アルキル」基をさす。「アリール」は、共役π電子系を有している少なくとも一つの環をもつ芳香族基をさし、炭素環アリール、複素環式アリール、およびビアリール基を含む。アリール基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、ＮＯ₂、アミン、チオエーテル、シアノ、アルコキシ、アルキル、およびアミノから成る群より選ばれる１以上の置換基によって任意に置換されていてもよい。「アルカリル」は、アリール基に共有結合により結合しているアルキルをさす。好ましくは、アルキルは低級アルキルである。「炭素環アリール」は、環原子が炭素であるアリール基をさす。「複素環アリール」は、環原子として１ないし３個の異種原子を有し、残りの環原子が炭素であるアリール基をさす。異種原子は、酸素、硫黄、および窒素を含む。従って、複素環式アリール基は、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾールその他を含む。「アミド」は、Ｒがアルキル、アリール、アルキルアリール、または水素である−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒをさす。「チオアミド」は、Ｒがアルキル、アリール、アルキルアリール、または水素である−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒをさす。「アミン」は、Ｒ’およびＲ”がアルキル、アリール、およびアルキルアリールから成る群より独立して選ばれる−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”基をさす。「チオエーテル」は、Ｒがアルキル、アリール、またはアルキルアリールである−Ｓ−Ｒをさす。「スルホニル」は、Ｒがアリール、Ｃ（ＣＮ）＝Ｃ−アリール、ＣＨ₂ＣＮ、アルキルアリール、スルホンアミド、ＮＨ−アルキル、ＮＨ−アルキルアリール、またはＮＨ−アリールである−Ｓ（Ｏ）₂−Ｒをさす。「アシル」という用語は、Ｒがホルミル、アセチル、プロピオニル、または、ブチリルのような、前文に定義したアルキルである、−Ｃ（Ｏ）Ｒ基を意味する。当業者には、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃、およびＡ₄が窒素または硫黄である場合には、Ｒ₄ 、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は対応する結合と同様に存在しないことが理解されるであろう。前文の(ｅ)(ｉｉ)に説明したような融合した環を有するインドール類は以下のものを含む：上記の六員環は、化合物ＩＩにおいて可能なＡ環を例示している。本発明の他の好ましい態様は、３−［(３−（２−カルボキシエチル）−４− メチルピロール−５−イル)メチレン］−２−インドリノン、ならびに３−［４ −（４−フォルミルピペラジン−１−イル−）ベンジリデニル］−２−インドリノンを含む結晶形である。これらの結晶形のポリペプチドは、ＦＧＦＲおよび特にＦＧＦＲ１であることが可能である。好ましい態様においては、本発明の結晶形は、表３または表４に明らかにした構造座標によって定義することができる。Ｘ線結晶学の使用は、本発明の結晶形の三次元構造の解明を可能にする。結晶形のＸ線結晶学による最初のキャラクタリゼーションで、単位格子形および結晶におけるその方向性を測定することができる。他の好ましい態様において、本発明は、単斜晶形の単位格子を有することによって特徴づけられる、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインタンパク質の結晶を特筆する。当該結晶はまた、空間群対称Ｃ２を有することによっても特性が規定される。「単位格子」という用語は、結晶の最も小さく最も単純な体積要素（すなわち平行六面体ブロック）をさし、それは結晶パターンの単位を完全に代表する。単位格子のディメンションは６個の数値により定義される；ディメンションａ、ｂ、およびｃと、角度α、β、およびγ。結晶は、数多くの単位格子が能率よく詰まった配列として見ることができる。結晶学用語の詳しい説明は、本文中に参考文献として取り入れた、図面、表、および図を含むすべてに記載されている。「単斜晶形の単位格子」という用語は、ａ≠ｂ≠ｃ；α＝γ＝９０°；β＞９０°である単位格子をさす。「空間群」という用語は、単位格子の対称性をさす。空間群の名称（例えばＣ２）においては、大文字は格子型を、その他の記号は、単位格子の外観を変えずにその上でおこなうことかできる対称操作を表す。結晶構造に関して「格子」という用語は、ぎっしり詰まった単位格子の頂点によって定まる点の配列をさす。「対称操作」という用語は、一つの単位格子の同等な部分を交換するか、または二つの異なる単位格子間の同等な分子を交換するための、幾何学的に定められた方法をさす。対称操作の例は、らせん軸、対称心、および鏡面である。好ましい態様において本発明は、単斜晶系の単位格子がおよそａ＝２０８．３ Å、ｂ＝５７．８Å、ｃ＝６５．５Åであり、β＝１０７．２°である結晶形を特色とする。好ましい態様において本発明は、単斜晶系の単位格子がおよそａ＝２１１．６ Å、ｂ＝５１．３Å、ｃ＝６６．１Åであり、β＝１０７．７°であるＦＧＦＲ１の結晶を特色とする。もう一つの態様において本発明は、触媒ドメインの、保存された、グリシンに富む領域における最初のグリシンから上流の少なくとも約２０アミノ酸残基と、当該触媒ドメインのＣ末端の境界に局在する保存されたアルギニンから下流の少なくとも約１７アミノ酸残基とを含んでいる、タンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインに相当するポリペプチドを特色とする。本発明のポリペプチドは、単離、濃縮、または精製することができる。さらに、本発明の結晶形は、単離、濃縮、または精製されたポリペプチドから形成することができる。ポリペプチドに関して「単離された」が意味するものは、互いに結合した６個、１２個、１８個またはそれ以上のアミノ酸のポリマーであって、天然の源から単離されたか、または合成されたポリペプチドを含む。本発明の単離されたポリペプチドは、それらが天然には純粋な、または分離された状態では見つからないという意味で独特である。「単離された」という用語は、天然に生じた配列がその正常な細胞環境から取り去られたことを意味する。したがって、当該配列は無細胞溶液中か、または異なる細胞環境に置かれてもよい。当該用語は、当該配列がアミノ酸鎖のみの存在であることを意味しないが、基本的には天然にはそれに結合していた物質がないこと（少なくとも約９０ないし９５％の純度）を意味する。ポリペプチドに関して「濃縮された」という用語を用いることにより、特定のアミノ酸配列が、正常または病気の細胞か、または当該配列を採取した細胞におけるよりも、細胞または興味のある溶液中に存在しる全アミノ酸が有意に高い分画（２ないし５倍）を構成することが意味される。このことは、存在する他のアミノ酸の量の選択的な減少によるか、または興味のある特定のアミノ酸配列の量の優先的な増加により、あるいはこの二つの組み合わせにより人為的に引き起こすことができた。しかしながら、「濃縮された」は、存在する他のアミノ酸配列がないことを意味するものではなく、興味のある配列の相対的な量が有意に増加したにすぎないということに注目すべきである。本文中では有意にという用語は、増加のレベルが、かかる増加を生じさせた人にとって有用であるということを意味するために用いられており、一般的には他のアミノ酸に対して約２倍、より好ましくは少なくとも５ないし１０倍またはそれ以上の増加を意味する。当該用語はまた、他の源からのアミノ酸がないことを意味するものではない。アミノ酸の他の源は、例えば酵母または細菌のゲノムか、またはｐＵＣ１９のようなクローニングベクターにコードされているアミノ酸を含む。当該用語は、所望の核酸の割合を高めるためにある人が介入させたような状況のみを網羅することを意味するものである。アミノ酸配列が精製された形であることは、ある目的にとっても好都合である。ポリペプチドに関して「精製された」という用語は、絶対的な純度（均一な標本のような）を必要とするのではなく；そのかわりに、当該配列が天然の環境におけるよりも相対的により純粋である（天然のレベルと比較して、このレベルは少なくとも２ないし５倍大きい(例えばｍｇ／ｍｌについて)）ことの指標を表している。少なくとも一桁分の、好ましくは二または三桁分の、さらに好ましくは四または五桁分の大きさの精製が特に期待される。基質は、好ましくは機能上有意なレベルの汚染物質がなく、例えば、９０％、９５％、または９９％純粋である。好ましい態様においては、本発明は受容体ＰＴＫの触媒ドメインに相当するポリペプチドを特色とする。受容体ＰＴＫは、たとえアミノ酸含有量が異なってもよいとしても、インシュリン受容体の三次元構造と実質的に類似した三次元構造を有してよい。好ましい態様においては、本発明は、非インシュリン受容体チロシンキナーゼが細胞質のチロシンキナーゼである、非受容体ＰＴＫの触媒ドメインに相当するポリペプチドを特色とする。好ましい態様においては、本発明は、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＫＤＲＮＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、またはＭＵＳＫから成る群より選ばれる、受容体ＰＴＫの触媒ドメインに相当するポリペプチドを特色とする。好ましい態様においては、本発明は、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、またはＡＣＫから成る群より選ばれる、非受容体ＰＴＫの触媒ドメインに相当するポリペプチドを特色とする。好ましい態様においては、本発明は、表１または表２に示したアミノ酸配列を有する、ＰＴＫの触媒ドメインに相当するポリペプチドを特色とする。もう一つの態様においては、本発明は本文中に記述した結晶形を作り出す方法を特色とする。この方法は、結晶を形成するために本文中に記述したポリペプチドを利用してもよい。当該方法は段階：（ａ）ある量のポリペプチド溶液を貯蔵溶液と混合すること；および（ｂ）段階（ａ）で得られた混合物を、結晶化に適した条件下において、密閉容器内の貯蔵溶液上でインキュベートすること、を含んでいる。これらの工程は、「発明の詳細な説明」と題した章において詳細に記述されている。もう一つの態様においては、本発明はＦＧＦ受容体チロシンキナーゼのドメインポリペプチドを結晶形で取得する方法であって、段階：（ａ）ある量のポリペプチド溶液を同量の貯蔵液と混合することであって、当該ポリペプチド溶液が１ｍｇ／ｍｌないし６０ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ型チロシンキナーゼドメインタンパク質、１０ｍＭないし２００ｍＭの緩衝剤、０ｍＭないし２０ｍＭのジチオスレイトールを含み、約５．５ないし約７．５のｐＨを有し、また貯蔵液が１０％ないし３０％（ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール、０．１Ｍないし０．５Ｍの硫酸アンモニウム、０％ないし２０％（Ｗ／Ｖ）のエチレングリコールまたはグリセロール、１０ｍＭないし２００ｍＭの緩衝剤を含み、約５．５ないし約７．５のｐＨを有すことを特徴とし；さらに（ｂ）段階（ａ）で得られた混合物を、密閉容器内の前記貯蔵液上で、０℃と２５℃の間の温度下で結晶が形成されるまでインキュベートすること、を含む・好ましい態様において本発明は、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインポリペプチドを結晶の形で取得する方法であって、ポリペプチド溶液が約１０ｍｇ／ｍＬのＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメイン、約１０ｍＭの塩化ナトリウム、約２ｍＭのジチオルスレイトール、約１０ｍＭのトリスーＨＣｌを含み、約８のｐＨを有しており；貯蔵緩衝液が約１６％（Ｗ／Ｖ）のポエチレングリコール( ＭＷ１００００)、約０．３Ｍの硫酸アンモニウム、約５％のエチレングリコールまたはグリセロール、約１００ｍＭのビス−トリスを含み、約６．５のｐＨを有しており；温度が約４℃である、方法を特色とする。もう一つの好ましい態様において本発明は、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインポリペプチドを結晶の形で取得する方法であって、ポリペプチド溶液が補因子、基質、基質類似体、阻害剤、またはアロステリックエフェクターを含む方法を特色とする。さらにもう一つの好ましい態様において本発明は、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインポリペプチドを結晶の形で取得する方法であって、化合物が加水分解不能のＡＴＰ類似体のようなヌクレオチド類似体か、またはインドリノンである方法を特色とする。インドリノン化合物は、本文中に記述したような一般構造式を有する。もう一つの態様において本発明は、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインタンパク質をコードしているｃＤＮＡであって、当該ｃＤＮＡのコード鎖が、ＳＥＱＩＤＮＯ：５のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを特色とする。もう一つの態様において本発明は、表１、表２、表３、および表４の構造座標を利用して、末知の構造のＰＴＫの三次元構造を決定する方法に関する。これらの方法は、ホモロジーモデリング(homology modeling)、分子置換、および核磁気共鳴法と関連させることができる。好ましい態様において本発明は、表１、表２、表３、および表４の構造座標をＰＴＫのアミノ酸配列と一緒に利用することにより、未知の構造のＰＲＫの三次元構造を決定する方法に関する。このホモロジーモデリング法は、段階：（ａ）未知の構造をもつＰＴＫのアミノ酸配列のコンピューター画像を、既知の構造をもつＰＴＫのそれと整列させることであって、アミノ酸配列の一致する領域を揃えることにより整列を行ない；（ｂ）既知の構造のＰＴＫ配列におけるアミノ酸構造のコンピューター画像を、未知の構造のＰＴＫ配列における対応するアミノ酸構造のコンピユーター画像に転送することと；さらに（ｃ）結果として得られるＰＴＫ構造の低エネルギーの立体配座を決定すること、を含む。「アミノ酸配列」という用語は、ＰＴＫの触媒ドメインに相当するポリペプチドを含んでいるアミノ酸鎖における、アミノ酸の順序をいう。「整列させること」という用語は、２以上のアミノ酸配列の最初と最後を揃えることをいう。整列の工程においては、対応するアミノ酸配列をお互いの上に置く。「相同」という用語は、二つの配列におけるアミノ酸が、同等かまたは同様の側鎖の化学基（例えば、脂肪族、芳香族、極性、負に帯電した、または正に帯電した）を有することをいう。「対応する」という用語は、前文に述べた配列の整列において、他のものと共に整列されたアミノ酸をさす。「低エネルギーの立体配座を決定すること」という用語は、PTK構造の立体配座を、当該構造の自由エネエルギーが低くなるように変える方法をいう。PTK構造は、それと結合するモジュレーターのような分子を有してもよく、有していなくてもよい。「低い自由エネルギー」という用語は、分子が当該方法によって測定される安定状態にある状態をいう。安定状態は、複合体内で都合のよい相互作用がおこなわれる場合に成就される。「都合のよい相互作用」という用語は、疎水性、芳香性、およびイオン性の力、ならびに水素結合をさす。もう一つの好ましい態様においては、本発明は未知の構造をもつＰＴＫの三次元構造を測定する方法に関する。この方法は、表１、表２、表３、および表４の構造座標を、ＰＴＫのための不完全なＸ線結晶学的データセットに適用することによっておこなわれる。当該方法は、段階：（ａ）一方のデータセットは完全であり他方は不完全であるという、二つの結晶からの電子回折データを突き合わせることにより単位格子における原子の位置を整列させること；および（ｂ）結果としてえられたＰＴＫ構造の低エネルギーの立体配置を測定すること、を含む。「不完全なデータセット」という用語は、三次元構造を生じるために十分な情報を有していないＸ線結晶学的データセットをさす。もう一つの好ましい態様においては、本発明は、表１、表２、表３、および表４の構造座標をＰＴＫの核磁気共鳴（ＮＭＲ）のデータに適用することにより、未知の構造をもつＰＴＫの三次元構造を決定する方法に関する。この方法は、段階：（ａ）ＮＭＲのデータを用いてＰＴＫ構造の二次構造を決定すること；および（ｂ）アミノ酸のスルースペース相互作用の割り当て(assignment)を簡単にすること、とを含む。当該ＰＴＫ構造は、化合物またはモジュレーターと複合体形成していなくてもよい。「二次構造」という用語は、三次元構造における、αヘリックスまたはβシート構成成分のようなアミノ酸の配置をいう。「スルースペース相互作用」という用語は、三次元構造における二次構造成分の方向性を定義し、アミノ酸配列上の異なる位置からのアミノ酸の間の距離を定義する。「割り当て(assignment)」という用語は、ＮＭＲのデータを分析し、かつＮＭＲスペクトルにおいてどのアミノ酸がシグナルを生じるかを同定する方法をさす。もう一つの態様においては、本発明はＰＴＫ機能の潜在的なモジュレーターを同定する方法を特色とする。これらのモジュレーターは、化合物の構造のコンピューター画像を、ＰＴＫの活性部位によって形成されるくぼみのコンピューター画像とドッキングさせることにより同定される。ＰＴＫの活性部位のコンピューター画像は、構造座標により定めることができる。「化学基」という用語は、水素結合、疎水性、芳香性、またはイオン性相互作用を形成することができる成分をさす。「ドッキング」という用語は、化合物をＰＴＫにきわめて接近して位置させる工程をさす。当該用語はまた、化合物／ＰＴＫ複合体の低いエネルギーの立体配座を見つける工程もさす。本発明の好ましい態様は、ＰＴＫ機能の潜在的なモジュレーターを同定する方法である。この方法は、構造座標またはＰＴＫの三次元構造の利用を含む。表１、表２、表３、および表４に明示した構造座標を利用することが可能である。当該方法は、段階（ａ）ＰＴＫ構造のコンピューター画像を移動し、コンピューターデータベースからの化合物のコンピューター画像を、ＰＴＫの活性部位のコンピューター画像とドッキングさせること；（ｂ）都合のよい幾何学的な合い具合と都合のよい補足的相互作用とをもつ当該複合体の立体配座を決定すること；および（ｃ）ＰＴＫ機能の潜在的モジュレーターとして、ＰＴＫの活性部位に最も合う化合物を同定すること、を含む。最初のＰＴＫ構造は、それに結合している化合物を有していてもよいし、あるいは有していなくてもよい。「都合のよい幾何学的な合い具合」という用語は、当該化合物の表面領域が、不都合な相互作用を形成することなく、当該活性部位の表面領域にきわめて接近している、化合物−ＰＴＫ複合体の立体配座をさす。不都合な相互作用は、化合物中の原子とＰＴＫの活性部位の原子との間の立体障害である可能性がある。「都合のよい補足的相互作用」という用語は、化合物とＰＴＫの活性部位との間に形成される、疎水性、芳香性、イオン性、および水素結合を与え、かつ水素結合を引き受ける力をさす。「潜在的」という用語は、「ＰＴＫ機能のモジュレーター」という用語を修飾するが、それはＰＴＫ機能の潜在的モジュレーターが、インヴィトロまたはインヴィヴォにおける活性についてまだ調べられていないからである。「最も合う」という用語は、複合体中の最も多くの表面領域が複合体を形成している化合物および／または所与の実験でのスクリーンにおけるＰＴＫと、最も多くの補足的な相互作用を形成する化合物をいう。本発明のもう一つの好ましい態様は、ＰＴＫ機能の潜在的モジュレーターを同定する方法である。この方法は、それに結合している化合物のある、またはないＰＴＫの三次元構造の利用を含む。この方法は、段階：（ａ）１以上の結合している化合物を有しているＰＴＫのコンピューター画像であって、化合物または複数の化合物とＰＴＫとのコンピューター画像が構造座標によって定められるコンピューター画像を修正すること；（ｂ）都合のよい幾何学的な合い具合と都合のよい補足的相互作用とをもつ当該複合体の立体配座を決定すること；および（ｃ）ＰＴＫ機能の潜在的モジュレーターとして、ＰＴＫの活性部位に最も合う化合物を同定すること、を含む。「修正すること」という用語は、化学基または複数の化学基の削除か、または化学基または複数の化学基の付加をさす。化学基のコンピューター画像は、コンピューターデータベースから選択することができる。本発明のさらにもう一つの態様は、モジュレーターコンストラクション(consr truction)を操作することによるか、またはＰＴＫと複合体を形成する化合物についてのモジュレーター検索コンピュータープログラムにより、ＰＴＫ機能の潜在的なモジュレーターを同定する方法である。この方法は、段階：（ａ）ＰＴＫと複合体を形成している１以上の化合物のコンピューター画像を移すこと；および（ｂ）化合物検索コンピュータープログラムを用いることにより、移した化合物と類似した化合物のデータベースを検索すること、または、当該化合物の画像が構造座標により定義されている、化合物コンストラクションコンピュータープログラムを用いてデータベースから、ＰＴＫと複合体を形成した化合物の部位を類似した化学構造で置換すること、を含む。本文において用いられているように、「操作すること」という用語は、種々のコンピュータープログラムにおいて、本文に記述した手順によって定義される分子の、三次元の立体配座を利用することをさす。「類似した化合物」という用語は、コンピューターデータベースにおいて、ＰＴＫに結合することができる化合物としての、類似した幾何学的構造を有する化合物をさす。類似した化合物はまた、ＰＴＫに結合しているかまたは一度ＰＴＫに結合した化合物と類似した化学基を有することが可能である。類似した化学基は、ＰＴＫと補足的な相互作用を形成することができる。「化合物検索コンピュータープログラム」という用語は、コンピューターデータベースから、興味のある化合物と類似した三次元構造および類似した化学基を有する化合物のコンピューター画像を検索するコンピュータープログラムをいう。興味のある化合物は、好ましくはインドリノン化合物である。「類似した化学構造」という用語は、ＰＴＫとの複合体における化合物か、またはＰＴＫ構造から除去された化合物の部分として、類似した幾何学的配置を共有している化学基をさす。類似した化学構造はまた、ＰＴＫとの複合体における化合物か、またはＰＴＫ構造から除去された化合物の部分として、補足的な相互作用を形成してもよい化学基をさすことができる。「構造を置換すること」という用語は、ＰＴＫとの複合体における化合物か、またはＰＴＫ構造から除去された化合物の部分を除去し、かつ切断された結合を、類似した化学構造物へ連結することをさす。「化合物コンストラクションコンピュータープログラム」という用語は、化合物中の化学基のコンピューター画像を、コンピューターデータベースからの基で置換するコンピュータプログラムをいう。当該化合物は好ましくはインドリノン化合物である。「類似した三次元構造」という用語は、ほとんど同等の形および体積をもつ二つの分子をいう。本発明のもう一つの好ましい態様においては、本発明のモジュレーターの設計または識別法に用いられるＰＴＫ構造は、表１、表２、表３、および表４の構造座標によって定められる。本発明の結晶形ならびに三次元構造を用いる方法は、広範囲のプロテインキナーゼに関連させることができる。従って、好ましい態様においては、本発明は受容体ＰＴＫに関する。受容体ＰＴＫは、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲＩ、およびＭＵＳＫから成る群より選択することができる。ＰＴＫはまた、非受容体ＰＴＫとして存在してもよい。非受容体ＰＴＫは、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫから成る群より選択することができる。もう一つの態様において本発明は、本発明に開示された方法によって同定されるＰＴＫ機能の潜在的なモジュレーターを特色とする。本発明の好ましい態様は、ＰＴＫ機能の潜在的なモジュレーターが、前文に開示した式ＩまたはＩＩの、オキシインドリノンまたはチオールインドリノンであることである。本発明のもう一つの態様は、この技術において周知の標準的な合成法により、ＰＴＫ機能の潜在的なモジュレーターか、または製薬上許容されるその塩、異性体、代謝産物、エステル、アミド、またはそれらのプロドラッグを合成する方法である。合成の手技は以下に議論する。もう一つの態様において本発明は、潜在的なＰＴＫ機能のモジュレーターを、ＰＴＫ機能のモジュレーターとして同定する方法を特色とする。この方法は、段階：（ａ）潜在的なＰＴＫ機能のモジュレーターを細胞に加えること；（ｂ）潜在的なモジュレーターを投与された細胞と、潜在的なモジュレーターを投与されなかった細胞との間で、ＰＴＫのリン酸化のレベルを比較すること；および（ｃ）ＰＴＫのリン酸化のレベルにおける差異に基づき、潜在的なモジュレーターをＰＴＫ機能のモジュレーターとして同定すること、を含む。「細胞」という用語は、初代または培養されたいかなるタイプの細胞もさす。初代細胞は器官から直接抽出することができ、一方培養細胞は速やかに分裂し、何度も継代を繰り返して培養することができる。細胞は、フラスコ、皿、およびウェルプレートを含むがこれに限定されない種々の容器内て成長することができる。「投与」という用語は、化合物を細胞に送達する方法をさす。当該化合物は、水溶液中のジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）のような担体を用いて調製することができる。化合物を含んでいる水溶液はまた「水性標本」とも呼ばれ、細胞層を浸している培地に単に混合するか、または細胞自体にマイクロインジェクトすることができる。当該化合物は、適当な緩衝溶液を用いて細胞に投与してもよい。「適当な緩衝溶液」という用語は、低濃度で溶液のｐＨを調整することができる塩を含む、化合物の水性標本をさす。この塩は低い濃度で存在しているため、好ましくは当該塩は細胞の機能を変えない。「ＰＴＫのリン酸化」という用語は、ＰＴＫ上のホスフェートの存在をさす。ＰＴＫ上のホスフェートは、高い親和性をもってそれらと特異的に結合する抗体により、同定することができる。もう一つの態様において本発明は、潜在的なＰＴＫ機能のモジュレーターを、ＰＴＫ機能のモジュレーターとして同定する方法を特色とする。この方法は、段階：（ａ）ＰＴＫ機能の潜在的なモジュレーターを細胞に加えること；（ｂ）潜在的なモジュレーターを投与された細胞と、潜在的なモジュレーターを投与されなかった細胞との間で、細胞の成長のレベルを比較すること；および（ｃ）細胞の成長における差異に基づき、潜在的なモジュレーターをＰＴＫ機能のモジュレーターとして同定すること、を含む。「細胞の成長」という用語は、細胞群が分裂する速度をさす。細胞分裂の速度は、当業者に用いられる方法により容易に測定することができる。本発明のもう一つの態様は、不適切な活性をもつＰＴＫを収容している細胞を同定することにより、病気を診断する方法を特色とする。この方法は、段階：( ａ)ＰＴＫ機能のモジュレーターを細胞に投与すること；（ｂ）モジュレーターを投与された細胞とモジュレーターを投与されなかった細胞との間で、細胞の成長速度を比較すること；および（ｃ）細胞の成長速度の差異についてのモジュレーターの効果から、不適切な活性をもつＰＴＫを収容している細胞の特質を規定することによって失病を診断すること、を含む。当該モジュレーターは、本発明の方法により同定することができる。「不適切な活性」という用語は、シグナルトランスダクションの過程における段階を、正常な細胞よりも高いかまたは低い速度に調節するＰＴＫをさす。シグナルトランスダクションの速度の異常は、成長因子による受容体ＰＴＫの刺激における変化、ＰＴＫに特異的なホスファターゼ活性における変化、細胞内におけるＰＴＫの過度の発現、またはＰＴＫ自身の触媒領域における突然変異によって引き起こすことができる。「シグナルトランスダクションの過程」という用語は、細胞外のシグナルが細胞内シグナルへ伝達される事象のカスケードにおける段階をいう。「ＰＴＫに特異的なホスファターゼ」という用語は、特定のＰＴＫを脱リン酸化し、それによりＰＴＫの活性を調節する酵素をいう。本発明のもう一つの態様は、細胞性の個体における不適切な活性をもつＰＴＫに関係している病気の治療法であって、段階：（ａ）製薬土許容される、ＰＴＫ機能のモジュレーターを当該個体に投与すること、および（ｂ）病気の治療のため、ＰＴＫ活性を活性化または阻害すること、を含む。「個体」という用語は、少なくとも１個の細胞を含んでいるいかなる生物もさす。個体は、１個の真核生物細胞のように単純か、または哺乳類のように複雑であることが可能である。個体に関して「投与すること」という用語は、化合物を個体に導入する方法をさす。化合物は、個体の細胞または組織が個体内または個体外に存在している場合に、投与することができる。個体の外に存在している細胞は、細胞培養皿において維持または成長させることができる。個体内に収容されている細胞については、化合物を投与するための、経口、消化管外からの、真皮からの、および注射による適用を含む（がこれらに限定されない）多くの技術がこの技術に存在する。患者の外の細胞については、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術、および担体技術を含む（がこれらに限定されない）多くの技術がこの技術に存在する。「製薬上許容される化合物」という用語は、ＰＴＫ活性のモジュレーターを含んでいる標品をさす。化合物は、当該化合物を投与された個体に明らかに刺激を生じない場合に許容される。本発明の好ましい態様は、ＰＴＫが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ−１、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲＩ、およびＭＵＳＫから成る群より選択される受容体ＰＴＫである。他の好ましい態様は、ＰＴＫが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫから成る群より選択される非受容体ＰＴＫである。前文に記述した本発明の概要は、何ら制限するものではなく、本発明の他の特徴および利益は、以下の詳細な記述および請求の範囲から明らかになるであろう。図面の簡単な説明第１図は、分子のチロシン側鎖Ｔｙｒ−６５３ならびにＴｙｒ−６５４と、α ヘリックス(αＣ、αＤ、αＥ、αＥＦ、αＦ−αＩ)、β鎖(β１−β５、β７、β８)、ヌクレオチド結合ループ、触媒ループ、活性化ループ、およびキナーゼ挿入部位を示しているＦＧＦＲ１の構造のリボンダイアグラム（ribbon diagr am）を提供する。末端は、ＮおよびＣで示してある。β２とβ３の間のループは、この領域での鎖の切断によって示したように乱れている。第２図は、第１図と同じ方向で示したＦＧＦＲＩのＣ_αトレースの空間図を提供しており、アミノ酸１０残基ごとに黒丸で印し、アミノ酸２０残基ごとに残基数を表示した。第３図は、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体１(ＦＧＦＲ１)、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体２(ＦＧＦＲ２)、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体３(ＦＧＦＲ３)、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体４(ＦＧＦＲ４)、およびキイロショウジョウバエ (D．melanogaster)の相同物(ＤＦＧＦＲ１)、Ｃ．エレガンス（C．elegance）の相同物(ＥＧＬ−１５)、およびインシュリン受容体チロシンキナーゼ(ＩＲＫ)の、構造を基に整列させた配列を提供する。第４図は、ＦＧＦＲ１およびＩＲＫのＮ末端の突出部（４Ａ）およびＣ末端の突出部（４Ｂ）のリボンダイアグラムを提供しており、二つのタンパク質のβシート（４Ａ）またはαヘリックス（４Ｂ）のＣ_α原子を重ねたものである。第５図は、ＦＧＦＲ１の主鎖の画像上の、ＦＧＦＲ１のチロシン自己リン酸化部位の側鎖の位置を示す。第６Ａおよび６Ｂ図は、受容体および非受容体型のＰＴＫを含めた、ＰＴＫの触媒ドメインのアミノ酸配列を整列させたものである。第６Ａ図は、受容体チロシンキナーゼの１８個のサブファミリーの各々からの代表的な一員を描いたものである。第６Ｂ図は、細胞質チロシンキナーゼのサブファミリーの各々からの代表的な一員を描いたものである。第６Ａおよび６Ｂ図において、高度に保存されている残基には囲みを入れてある。グリシンに富むドメイン、キナーゼ挿入、触媒ループ、および活性化ループが示されている。番号づけは、ヒトＦＧＦ受容体についてのものである。結晶学的原子構造座標の簡単な説明結晶学的構造座標は、「実施例」と題した章の終わり、かつ請求の範囲の前に置かれている。三つの座標のセットは、ＩＦＧＫ、１ＡＧＷ、および１ＦＧＩというアクセス名で、プロテインデータバンク(Protein Data Bank)に見い出される。１ＦＧＫ座標は、表１にリストしたものに対応し、１ＡＧＷ座標は表４にリストしたものに対応し、１ＦＧＩ座標は表３にリストしたものに対応する。１ＡＧＷおよび１ＦＧＩ座標のセットは、１９９８年３月に公に入手できるであろう。表１は、Ｘ線結晶学により測定した本発明の天然のＦＧＦＲ１結晶の原子構造座標を提供しており；表２は、Ｘ線結晶学により測定した本発明のＦＧＦＲ１：ＡＭＰ−ＰＣＰコクリスタルの原子構造座標を提供している。表３は、３−[(３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−５−イル)メチレン]−２−インドリノンと複合体を形成したＦＧＦＲ１の三次元構造を定義する結晶学的座標を列挙している。縦の列は(左から右へ)、原子の番号およびタイプによる記述、アミノ酸および当該原子の含有数、ｘ座標、ｙ座標、ｚ座標、結合の連結度、および温度因子である。これらのパラメーターは、この技術においては十分定義されている。表４は、３−［４−（４−ホルミルピペラジン−１−イル）ベンジリデニル］ − ２−インドリノンと複合体を形成したＦＧＦＲ１の三次元構造を定める結晶学的座標のファイルである。縦の列は、表３に記述されているものと同様である。発明の詳細な説明本発明はタンパク・チロシンキナーゼサブファミリー特異的であり、酸性条件下非水解性であり、かつ、高生物利用性であるPTK機能モジュレーターの設計と同定を目的とするものである。化合物と任意に複合体形成したPTKの三次元構造はPTK機能モジュレーターの設計と同定を容易にする。タンパク・チロシンキナーゼ（PTK）は多くの多様なクラスの酵素を包含する。シュレージンガー(Schlessinger)およびウルリッヒ(Ullrich)、1992、Neuron ９：383〜391。PTKファミリーはさらにレセプターの部分と非レセプターの部分に分けられる。PTKレセプターファミリーは複数のサブファミリーを含み、その一つは繊維芽細胞増殖因子レセプター(FGF-R)であり、血管形成ならびに細胞増殖・分化の調整に関係する分子である。ジボル(Givol)およびヤイオン(Yayon)、 1992、FASEB J．６（15）：336２〜3369。 FGF-R1は１またはそれ以上の細胞シグナル変換過程におけるその役割として細胞機能を仲介する。細胞シグナル変換過程は複数の工程からなり、細胞外シグナルを細胞内シグナルに変換する。レセプターPTK仲介シグナル変換は、特定の細胞外リガンドへの結合に始まり、レセプターの二量化、さらにレセプターPTKの自己リン酸化へと続く。リン酸エステル基は細胞内のシグナル変換分子に対する結合部位であり、細胞膜でのタンパク複合体形成に導く。これらの複合体は、事象のカスケードを開始するリガンドに応答して適切な細胞効果（例えば、細胞分裂、細胞外微小環境への代謝効果）を容易なものとする。レセプターPTKは数種の細胞内タンパクに対して結合部位として機能する。細胞内PTK結合タンパクは二つの主要な群に分けられる：（１）触媒ドメインを包含する群；および（２）そのようなドメインを欠くが、アダプターとして作用し、触媒活性分子と連携する群。ソンジャン（Songyang）ら、1993、Cell 72：767 〜778。SH2（src同族体）ドメインはレセプターPTKに直接結合するタンパクに見出される共通のアダプターである。SH2ドメインは上記の両群タンパクに結合するP TKに包含されている。ファントル（Fantl）ら、1992、Cell 69：413〜423；ソンジャン（Songyang）ら、1994、Mol.Cell.Biol．14：2777〜2785；ソンジャン（S ongyang）ら、1993、Cell72:767〜778;およびコッホ（Koch）ら、1991、Science 252：668〜678。レセプターPTKとそれら結合タンパクのSH２ドメイン間の特異性は、リン酸化チロシン残基を直接に取り囲むアミノ酸残基により決められる。SH２ドメインの結合親和性の差異は、シグナル変換過程における下流分子の基質リン酸化プロフィールにおいて観察される差異と関係づけられる。ソンジャン（Songyang）ら、 1993、Cell 72：767〜778。これらの観察結果は、各レセプターPTKの機能がその発現パターンとリガンドの利用能のみならず、特定のレセプターにより活性化される下流シグナル変換経路の配列により決定されることを示唆している。このように、PTKは自己リン酸化の結果としてシグナル変換過程において制御調整の役割を提供する。 PTK−仲介シグナル変換は細胞増殖、分化、および細胞における代謝応答を調整する。それ故、不適切なPTK活性は多様な多くの障害と疾患を惹起する。以下に記載するこれらの障害は、ここに開示する方法により設計し、同定されるPTK 機能モジュレーターにより治療することができる。本発明はまた、レセプターチロシンキナーゼの触媒ドメインに対応する結晶性ポリペプチドにも関する。そのようなチロシンキナーゼは、共有結合架橋ではなく、リガンド誘導二量化を受けると理解されるクラスのレセプターならびに細胞質チロシンキナーゼを包含する。好ましくは、結晶性触媒ドメインとは、三次元 X線回折構造の決定を約1.5Åないし約2.5Åの分解能で可能とするに十分な品質のものである。本発明はまた、該ポリペプチドを調製する方法および結晶化する方法にも関する。該ポリペプチドそれ自体は、その結晶構造から導かれる情報同様、チロシンキナーゼ活性の分析および修飾をするために、また、該触媒ドメインと相互作用する化合物を同定するために使用することができる。本発明ポリペプチドは、触媒ドメインを有するレセプターチロシンキナーゼの細胞質ドメイン領域の構造に基づき設計する。実例として、図６Aは１８種のヒトレセプターチロシンキナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列を示す；１８種のサブファミリーそれぞれからの一つの代表番号を示してある。図６Bは細胞質キナーゼの配列を示す。本出願人は生成したポリペプチドの結晶化に必要なドメインの境界域を見出し、決定した。驚くべきことに、これらの境界域は触媒活性に必要な境界域とは異なっている。例えば、図６Aについて言えば、触媒活性に必要なドメインは、一般に、N-末端グリシン富有領域の第一グリシン（図６Aの残基番号４８５）の上流約７アミノ酸残基から、C-末端保存アルギニン（図６Aの残基番号７４４）を越えた約１０残基に及ぶと信じられている。しかし、N-末端グリシン富有領域上流の付加的配列およびC-末端保存アルギニンの下流は、結晶化に必要である。特に、触媒ドメインの保存グリシン富有領域の第一グリシン（すなわち、図６Aの残基番号４８５）上流の少なくとも約２０アミノ酸残基(＋/− ５アミノ酸残基)、および触媒ドメインのC-末端境界域に位置する保存アルギニン（すなわち、図６Aの残基番号７４４）下流の少なくとも約１７アミノ酸残基( ＋/−５アミノ酸残基)が結晶化に適したポリペプチドを構築するのに必要である。得られたポリペプチドが結晶化を阻害するシステイン残基を含む状況下では( 例えば、図６Aに示したFGF-R1のシステイン残基番号４８８および５８４)、そのようなシステイン残基を、結晶化条件下、他のアミノ酸残基と容易には共有結合を形成しない適切なアミノ酸と置換することができる。例えば、該システインを Ala、SerまたはGlyと置換する。二次構造のアサインメントに基づき、非ラセンもしくは非β−鎖セグメントに位置するシステインはいずれも好ましい置換え候補である。例えば、グリシン富有ループ、キナーゼ挿入断片、膜近傍領域または活性化ループに相応する領域に位置するシステインは、最も重要な置換え候補である。しかし、キナーゼ内に保存されるシステイン（例えば、図６Aの第７２５および７３６位）の置換は、好ましくは、避ける。 I．PTK関連疾患血管増殖性障害とは、一般に、血管の異常増殖に至る血管形成性障害および脈管形成性障害をいう。血管の形成および拡散は種々の生理学的過程、例えば、胎児発育、黄体形成、創傷治癒、器官再生などにおいて重要な役割を果たしている。それらはまた、癌の発生においても重要な役割を演じている。血管増殖障害の他の例としては、関節炎であるが、この場合には新しい毛細血管が関節に浸入し、軟骨を破壊する。また、他の例として糖尿病性網膜症などの眼疾患があり、この場合には網膜中の新しい毛細管が硝子体に浸入し、出血させ、失明させる。逆に、血管の縮小、収縮または閉塞に関係する障害は再狭窄などの疾患に関係している。繊維形成障害とは細胞外マトリックスの異常形成をいう。繊維形成障害の例は肝硬変症およびメサンギウム細胞増殖障害を包含する。肝硬変症は肝臓瘢痕の形成に至る細胞外マトリックス成分の増加により特徴づけられる。肝硬変症は肝臓の硬変などの疾患を惹起する。肝臓瘢痕に至る増加細胞外マトリックスは、肝炎などのウイルス感染によってもまた、惹起される。メサンギウム細胞増殖障害は、メサンギウム細胞の異常増殖が引起こす障害をいう。メサンギウム増殖障害は、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管障害症候群、移植拒絶反応、および糸球体症などの種々のヒト腎臓疾患を包含する。PDGF-Rはメサンギウム細胞増殖の維持に関係している。フロージ（Floege）ら、1993、Kidney International 43：47S〜54S。 PTK類は上記の細胞増殖障害と直接関連がある。例えば、レセプターPTKファミリーのあるものは癌発生に関係する。EGFR(ツジ（Tuzi）ら、1991、Br.J.Cancer 63：227〜233；トープ（Torp）ら、1992、APMIS 100：713〜719)、HER2/neu(スラモン(Slamon)ら、1989、Science244:707〜712)およびPDGF-R(クマベ(Kumabe) ら、1992、Oncogene ７：627〜633)などのこれらレセプターのあるものは、多くの腫瘍中で過剰発現するか、および/またはオートクリン・ループにより絶えず活性化される。事実、PTK過剰発現（アクバサック（Akbasak）およびサナー−アクバサック（Suner-Akbasak）ら、1992、J.Neurol.Sci.111：119〜133；ディクソン（Dickson）ら、1992、Cancer Treatment Res．61：249〜273；コーク（Kor c）ら、1992、J.Clin．Invest．90：1352〜1360）およびオートクリン・ループ刺激（リー(Lee)およびドノグー(Donoghue)、1992、J.Cell.Biol.118：1057〜10 70；コーク（Korc）ら、上記；アクバサック（Akbasak）およびサナー−アクバサック（Suner-Akbasak）ら、上記）は最も一般的な重症の癌と見なされている。例えば、 EGFRは偏平上皮癌、星状細胞腫、グリア芽細胞腫、頭部および頚部癌、肺癌および膀胱癌などと関係がある。HER2は乳房、卵巣、胃、肺、膵臓および膀胱癌などと関係がある。PDGF-Rはグリア芽細胞腫、肺、卵巣、皮膚および前立腺癌などと関係がある。レセプターPTK c-metは一般に肝臓癌発生と関連し、従って、肝細胞癌と関係する。さらに、c-metは悪性腫瘍形成に関係している。さらに特定すると、c-metは他の癌の中でも、結腸直腸、甲状腺、膵臓および胃の癌、白血病およびリンパ腫に関係する。さらに、c-met遺伝子の過剰発現はホジキン病、バーキット病患者、およびリンパ腫細胞系に検出されている。 IGF-IレセプターPTKは、栄養の維持およびII型糖尿病に関連していることに加えて、数種の型の癌とも関係がある。例えば、IGF-Iは幾つかの腫瘍型に対してのオートクリン成長刺激剤として関連づけられており、例えば、ヒト乳癌細胞（アルテガ（Arteaga）ら、1989、J.Clin.Invest.84：1418〜1423）および小型肺腫瘍細胞（マッコウレイ（Macauley）ら、1990、Cancer Res.50：2511〜2517）などである。さらに、神経系の正常な増殖と分化に必須なものとして関与するIG F-Iは、ヒト・グリオーマのオートクリン刺激剤であると思われる。サンドバーグ−ノルドクビスト（Sandberg-Nordqvist）ら、1993、Cancer Res．53：2475〜 2478。IGF-IRおよびそのモジュレーターが細胞の増殖において重要なことは、培養中の多くの細胞型（繊維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、T-リンパ球、骨髄細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄の幹細胞）がIGF-Iにより刺激を受け増殖するという事実がさらに支持している。ゴールドリング（Goldring）およびゴールドリング(Goldring)、1991、Eukaryotic Gene Expression 1：301〜326。最近の一連の出版物でも、IGF-IRは癌化のメカニズムにおいて中心的な役割を担っており、従って、それ自体が広範なスペクトルのヒト悪性腫瘍に対する治療介入のための好適な標的であることを示唆している。バセルガ(Baserga)、1995、Cancer-Res ．55:249〜252;バセルガ(Baserga)、1994、Cell79:927〜930;コッポラ（Coppola ）ら、1994、Mol．Cell．Biol．14：4588〜4595。しかし、レセプターPTKの異常と疾患との間の関連性は癌に限定されるものではない。例えば、レセプターPTKは、乾癬などの代謝性疾患、糖尿病、創傷治癒、炎症、および神経変性疾患とも関連している。EGF-Rは角膜および皮膚創傷治癒に必要である。インシュリン-RおよびIGF-IRの欠損がII型糖尿病に必要である。特異レセプターPTKとその治療適用との間のより完全な相関がプローマン（Plowm an）ら、1994、Dy&P７：334〜339に述べられている。非レセプターPTKはsrc、abl、fps、yes、fyn、lyn、lck、blk、hck、fgr、yrk を包含し(総説：ボーレン（Bolen）ら、1992、FASEB J.6：3403〜3409)、レセプターPTKとも関連する増殖・代謝シグナル変換経路に関係している。それ故、本発明はこのクラスのPTKに対するモジュレーターを設計することをも目的とする。例えば、変異src（v-src）はニワトリの腫瘍タンパク（pp6^v-src）である。さらに、その細胞性同族体、プロト腫瘍遺伝子pp60^v-srcは多くのレセプターの腫瘍遺伝子シグナルを伝達する。例えば、腫瘍におけるEGF-RまたはHER2/neuの過剰発現はpp60^v-srcを構成的活性化に導くか、これは悪性腫瘍細胞の特徴であって、正常細胞には存在しない。他方、c-srcの発現を欠くマウスは骨化石症の表現型を示すが、このことは破骨細胞機能においてc-srcが重要な位置を占めること、従って、関連障害に関与する可能性を示している。同様に、Zap70はT-細胞のシグナリングに関係している。レセプターPTKおよび非レセプターPTK双方が高度免疫障害に結び付いている。本発明は、生命維持の源泉を断ち切ることにより腫瘍を間接的に死滅させることのできるPTK機能モジュレーターの設計を一部目的とする。正常な脈管形成および血管形成は種々の生理的過程、例えば、胚生育、創傷治癒、器官再生、また、メスの生殖過程、例えば、排卵時の黄体中卵胞発育および妊娠後の胎盤生育において重要な役割を演じている。フォークマン(Folkman)およびシン(Shing)、19 92、J.Biological Chem.267：10931〜34。しかしながら、多くの疾患が頑固な非制御または不適切血管形成により進行する。例えば、関節炎では新しい毛細血管が関節に浸入し、軟骨を破壊する。糖尿病では網膜中の新しい毛細管が硝子体に浸入し、出血させ、失明させる。フォークマン(Folkman)、1987、Congress of T hrombosi and Haemostasis(フェルストレート（Verstraete）ら、編纂)、ルーベン大学出版、ルーベン、583〜596頁。眼部血管新生は最も一般的な失明の原因であり、約２０種の眼疾患の首位を占める。さらに、脈管形成および/または血管形成は悪性固形腫瘍の成長および転移に関係している。腫瘍は腫瘍自体の成長のために、常に新しい毛細血管の成長を刺激し続けなければならない。さらに、腫瘍に取り込まれた新しい血管は、腫瘍細胞が循環系に入り込み、身体の遠隔部位に転移するための関門を提供する。フォークマン(Folkman)、1990、J.Natl.Cancer Inst．82：4〜6；クラグスブラン（Kla gsbrunn）およびソーカー(Soker)、1993、Current Biology 3：699〜702；フォークマン(Folkman)、1991、J.Natl.Cancer Inst．82：4〜6；ワイドナー（Weidn er）ら、1991、New Engl．J.Med．324：1〜5。インビトロで上皮細胞成長促進活性を有する数種のポリペプチドが同定されている。その例としては、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子(αFGF、βFGF)、血管上皮増殖因子（VEGF）および胎盤成長因子などである。αFGFおよびβFGFと違って、VEGFは上皮細胞特異分裂促進因子であることが最近報告されている。フェララ(Ferrara)およびヘンゼル(Henzel)、1989、Biochem.Biophys.Res.Comm.16 1:851〜858;バイスマン(Vaisman)ら、1990、J.Biol.Chem.265:19461〜19566。この様に、FGFまたはVEGFに結合する特異レセプターを同定することは、上皮細胞増殖制御を理解するために重要である。高い親和性によってVEGFと結合する２つの構造的に関連するレセプターPTKが確認されている:flt-1レセプター(シブヤ（Shibuya）ら、1990、Oncogene 5：519〜524；デ・ブリス（De Vries）ら、1 992、Science 255：989〜991)およびKDR/FLK-1レセプター(米国特許出願第08/19 3,829にて検討)。さらに、αFGFおよびβFGFと結合するレセプターが確認されている。ジェイ（Jaye）ら、1992、Biochem.Biophys.Acta 1135：185〜199。従って、これらのレセプターPTKは恐らく上皮細胞増殖を制御している。 FGFRは血管形成、創傷治癒、胚芽成長、および悪性腫瘍転換などにおいて重要な役割を果たしている。バシリコ（Basilico）およびモスカテリー(Moscatelli) 、1992、Adv.Cancer Res．59：115〜165。4種の哺乳動物FGFR(FGFR1〜4)が記載されており、さらなる多様性が細胞外ドメイン内での代替RNAスプライシングにより生じる。ジェイ（Jaye）ら、1992、Biochem.Biophys.Acta 1135：185〜199 。他のレセプターPTK同様に、FGFの二量化がその活性化にとって必須である。可溶性または細胞表面結合性硫酸ヘパリン・プロテオグリカンはFGFと協力して作用し、二量化を誘導して(シュレージンガー（Schlessinger）ら、1995、Cell83 ： 357〜360)、細胞質ドメインの特異チロシン残基を自己リン酸化に導く。モハマディ（Mohammadi）ら、1996、Mol.Cell Biol．16:977〜989。 3種のヒトFGFレセプター遺伝子、FGFR1、FGFR2およびFGFR３の変異は、多様なヒト遺伝性骨格障害に関係している。FGFR1およびFGFR2の変異は、頭骨偏平骨の未成熟融合に至り、アパート(Apert)(FGFR2)(ウイルキー(Wilkie)ら、1994、Nat .Oenet.8：269〜274)、ファイファー（Pfeiffer）(FGFR1およびFGFR2)(ミューンケ（Muenke）ら、1994、Nat.Genet．８：269〜274)、ジャクソン−ワイズ（Jack son-Weiss）(FGFR2)(ヤブス（Jabs）ら、1994、Nat.Genet．８：275〜279)およびクルーゾン（Crouzon）(FGFR2)(ヤブス（Jabs）ら、1994、Nat.Genet.8：275 〜279)症候群などの頭骸骨癒合症を惹起する。これに対し、FGFR3の変異は長骨障害に関係して、軟骨発育不全症(シアン（Shiang）ら、1994、Cell 78：335〜3 42)、軟骨形成不全（ベルース（Bellus）ら、1995、Nat.Genet.10:357〜359）および新生児致死性形成異常症（タボルミナ（Tavormina）ら、1995、Nat.Genet.9 :321〜328）などを含む数種の臨床的に関連する小人症形成の原因となる。これらの変異はFGFR3のチロシンキナーゼ活性を構成的活性化に導くことが示されている(ウエブスター（Webster）ら、1996、EMBO J．15：520〜527)。さらに、マウスの遺伝子標的実験によると、発育性骨形成におけるFGFR3の本質的な役割が明らかとなっている(デン（Deng）ら、1996、Cell 84：911〜921)。 FGFについて提案されているインビボでの他の主要な役割は血管形成の誘発である(フォークマン（Folkman）およびクラグスブルーン(Klagsbrun)、1987、Sci ence 236：442)。それ故、FGFもしくはそのレセプターの不適切な発現またはチロシンキナーゼ活性の異常な機能は、幾つかのヒト血管形成病理学、例えば、糖尿病性網膜症、慢性関節リューマチ、動脈硬化症および血管新生に寄与している (クラグスブルーン（Klagsbrun）およびエーデルマン(Edelman)、1989、Arteros clerosis 9：269)。さらに、FGFは悪性腫瘍の形質転換に関与すると考えられる。実際、3種のFGF類似体、int-2、FGF-5およびhst-1/K-fgfをコードする遺伝子は当初発癌遺伝子として単離された。さらに、FGFR1およびFGFR2をコード化する cDNAは乳癌の集団中で増幅される(アドナン（Adnane）ら、1991、Oncogene 6：6 59〜663)。FGFレセプターの過剰発現がヒトの膵臓癌、星状細胞腫、唾液腺肉腫、カボジ肉腫、卵巣癌および前立腺癌においても検出されている。係属中の米国出願番号第08/193,829号に記述の開示のように、VEGFは上皮細胞増殖に関わるのみならず、正常および病的血管形成の主要な調整剤であることを証拠が強く示唆している。参照総論：クラグスバーン（Klagsburn）およびソーカー(Soker)、1993、Current Biology 3：699〜702；フック（Houck）ら、1992 、J.Biol.Chem．267：26031〜26037。さらに、KDR/FLK-1およびflt-1は成長下の腫瘍の増殖上皮細胞中に大量に発現しているが、周囲の休止上皮細胞には発現しないことが示されている。プレート（Plate）ら、1992、Nature359：845〜848；シュバイキー（Shweiki）ら、1992、Nature 359：843〜845。本発明は臨床的障害に関与するPTKの不適切な活性を修飾すことのできるレセプターと非レセプターPTK機能のモジュレーターを設計し、同定することを目的とする。PTK機能モジュレーターの設計と同定は、PTKの三次元構造を規定する構造相関性を利用して実施し得る。 II．疾患治療剤としてのPTK機能モジュレーター上に検討した障害の結果として、生物医学界の化学者達は、不適切なPTK活性と関連するシグナル変換経路をダウンレギュレーションするPTK機能モジュレーターを探索しつつある。特に、小分子のPTK機能モジュレーターは、場合により細胞膜を透過し、酸性環境において水解されないので探索対象となる。ある種化合物がすでに発見されている。例えば、以下の化合物がPTKインヒビターとして記載されている：ビス単環性、二環性もしくはヘテロ環性アリール化合物(PCT WO 92/20642)、ビニレン−アザインドール誘導体(PCT WO 94/14808)、1-シクロプロピル−4−ピリジルキノロン(USP 5,330,992)、スチリル化合物(USP 5,217,999)、スチリル置換ピリジル化合物(USP 5,302,606)、ある種キナゾリン誘導体(EP出願番号0 566 266A1) 、セレノインドールおよびセレン化物(PCT WO 94/03427)、三環性ポリヒドロキシ化合物(PCT WO 92/21660)、およびベンジルホスホン酸化合物(PCT WO 91/1549 5)。幾種類かのPTK機能モジュレーターが知られているが、それらの多くはPTKサブファミリーに特異的でなく、それ故、治療薬として多様な副作用を引起こすと思われる。しかし、オキシインドリノン/チオールインドリノンファミリーの化合物はFGFレセプターサブファミリーに特異的である(米国出願番号S.N．08/702, 232；1996年８月23日出願；発明者：タン（Tang）ら；標題：インドリノン・コンビナトリアルライブラリーと関連生成物および疾患の治療法；代理人ファイル No．221/187)。さらに、このオキシインドリノン/チオールインドリノンファミリーの化合物は酸性条件下で非水解性であり、高生物利用性である。本発明はPTKとオキシインドリノン/チオールインドリノンファミリーの化合物との間の特異相互作用に関する情報を提供する。X線結晶学を使用すると他のPTK 類についての三次元構造が得られるが、これら構造のPTKは、PTKサブファミリーに特異的な、水解抵抗性、高生物利用性小分子と複合体を形成しない。本発明に用いられるX線結晶学技術は、PTKと原子レベルでPTKと複合体を形成する化合物との間の相互作用を解明し、有効なPTK機能モジュレーターを規定する化学基の配向に関し詳細な情報を提供する。 III．結晶性チロシンキナーゼ本発明の結晶性PTKは未変性結晶、誘導体結晶（derivative crystal）および共結晶（co-crystal；共晶）を包含する。本発明の未変性結晶は、一般に、結晶形中にチロシンキナーゼドメインに相当する実質的に純粋なポリペプチドを含む。本発明の結晶性チロシンキナーゼドメインは、天然産もしくは未変性チロシンキナーゼドメインに限定されるものではない。事実、本発明の結晶は未変性チロシンキナーゼドメインの変異体を包含する。未変性チロシンキナーゼドメインの変異体は、未変性チロシンキナーゼドメインの少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換えることにより、あるいは未変性ポリペプチド内で、または未変性ポリペプチドのN-もしくはC-末端で、アミノ酸残基を付加もしくは削除することにより得ることができるが、該変異体を誘導した未変性チロシンキナーゼドメインと同一の三次元構造を実質的に有するものである。同一の三次元構造を実質的に有することが意味することは、一組の原子構造座標が、該変異体を誘導した未変性チロシンキナーゼドメインの原子構造座標と重ね合わせたときに、未変性チロシンキナーゼドメインの少なくとも約５０％ないし１００％のCα原子が重なり内に含まれていて、約２Åよりも小さい、あるいはそれに等しい二乗平均偏差を有することである。未変性チロシンキナーゼドメインの三次元構造を有意に妨害しないアミノ酸の置換、削除および付加は、部分的に、該置換、削除および付加が生じたチロシンキナーゼドメイン領域に依存することになる。該分子の高次変換可能領域においては、図６に示すもののように、同類置換同様に非同類置換が分子の三次元構造を有意に乱すことなく許容される。高次保存領域または有意な二次構造を有する領域においては、図６に示す領域のように、同類アミノ酸置換が好ましい。同類アミノ酸置換は周知の技術であるが、これは関与するアミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性の類似性に基づいてなされる置換反応を意味する。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、同様親水性値の非電荷極性先端基を有するアミノ酸とは以下のものである：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシン。他の同類アミノ酸置換は周知の技術である。化学合成により全体としてまたは部分的に得られるチロシンキナーゼドメインに対して、置換もしくは付加のために利用可能なアミノ酸の選択は、遺伝子的にコード化されたアミノ酸に限定されるものではない。事実、ここに記載された変異体は非遺伝子的にコード化されたアミノ酸を包含する。通常既知の非遺伝子的にコード化されたアミノ酸の多くにとって、同類アミノ酸置換は周知の技術である。他のアミノ酸に対する同類置換は、その物理的性質に基づき、遺伝子的にコード化されたアミノ酸の性質と比べて決定することができる。ある場合には、未変性チロシンキナーゼドメインにおいて、該ポリペプチドをコード化するcDNAの便利なクローニング部位を提供するために、また、該ポリペプチドの精製を目的として、また、該ポリペプチドの結晶化のために、アミノ酸残基を置換、削除および/または付加することが特に有利であり、好都合である。そのような置換、削除および/または付加は、未変性チロシンキナーゼドメインの三次元構造を実質的に変化させるものではなく、当該分野において通常の技術を有する者にとって明白なものである。ここで考慮される変異体はPTK活性を示す必要がないことに注目すべきである。事実、チロシンキナーゼドメインのキナーゼ活性を阻害するが、該ドメインの三次元構造を有意に変化させないアミノ酸の置換、付加または削除が本発明により特に注目されるものである。そのような結晶性ポリペプチド、またはそこから得られる原子構造座標は、未変性ドメインに結合する化合物を同定するのに用いることができる。これらの化合物はその活性または未変性ドメインに影響する可能性がある。本発明の誘導体結晶は通常、１個またはそれ以上の重金属原子と共有結合で会合した結晶性チロシンキナーゼドメインポリペプチドを含む。該ポリペプチドは未変性または変異チロシンキナーゼドメインに相当する。誘導体結晶を提供するために有用な重金属は、例としては、金、水銀などであるが、これに限定されるものではない。本発明の共結晶は一般に、１個またはそれ以上の化合物と会合した結晶性チロシンキナーゼドメインポリペプチドを含む。該会合は共有結合であっても、非共有結合であってもよい。そのような化合物は、補助因子、基質、基質類似体、インヒビター、アロステリックエフェクターなどであるが、これらに限定されるものではない。 IV．X 線結晶学による三次元構造の決定 X線結晶学は分子の三次元構造を解明する方法である。分子の構造は回折格子として結晶を用い、X線回折パターンから計算される。タンパク分子の三次元構造は該タンパクの濃厚水溶液から成長させた結晶から生じる。X線結晶学の方法は以下の工程からなる。（a）ポリペプチドの合成と単離；（b）モジュレーターの存在または不存在下、該ポリペプチドを含む水溶液からの結晶の成長；および（c）該結晶からのX線回折パターン収集、単位セル次元と対称性の決定、電子密度の決定、ポリペプチドのアミノ酸配列を電子密度に適合させること、および構造の純化。ポリペプチドの製造ここに記載する未変性および変異化チロシンキナーゼドメインポリペプチドは、この分野で周知の技術を用い、その全部または一部を化学的に合成することができる(例えば、クレイトン（Creighton）1983参照)。あるいは、当該技術の熟練者が周知の方法を用い、未変性または変異化チロシンキナーゼドメインポリペプチドをコードする配列と適当な転写/翻訳制御シグナルを有する発現ベクターを構築することもできる。これらの方法としては、インビトロでの組換えDNA技術、合成技術、およびインビボでの組換え/遺伝子組換えを包含する。例えば、マニアティス（Maniais）ら、1989、およびオースベル（Ausubel）ら、1989に記載の技術を参照。種々の宿主発現ベクター系がチロシンキナーゼドメインをコードする配列の発現に利用することができる。その系としては以下の微生物類を含むが、これらに限定されるものではない：チロシンキナーゼドメイン・コード配列を有する組換えバクテリオファージDNA,プラスミドDNAまたはコスミドDNAの発現ベクターで形質転換したバクテリア；チロシンキナーゼドメイン・コード配列を有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母；チロシンキナーゼドメイン・コード配列を有する組換えウイルス発現ベクター（例：バキュロウイルス）を感染した昆虫細胞系；チロシンキナーゼドメイン・コード配列を有する組換えウイルス発現ベクター（例：カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(T MV)）を感染した植物細胞系または組換えプラスミド発現ベクター（例：Tiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系。これらの系の発現要素はその強度および特異性が異なる。利用する宿主/ベクター系により、構成および誘導プロモーターを含め、多くの転写・翻訳要素が発現ベクター中で使用し得る。例えば、バクテリア系にてクローニングする際は、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lac ハイブリツドプロモーター）などの誘導プロモーターが使用し得る；昆虫細胞系にてクローニングする際は、バキュロウイルス・ポリヘドリン・プロモーターなどのプロモーターが使用し得る；植物細胞系にてクローニングする際は、植物細胞ゲノムから誘導したプロモーター（例：熱ショックプロモーター；RUBISCOの小サブユニット用プロモーター；クロロフィルa/b結合タンパク用プロモーター）または植物ウイルスから誘導したプロモーター（例：CaMVの35S RNAプロモーター；TMVのコートタンパクプロモーター）が使用し得る；哺乳動物細胞系にてクローニングする際は、哺乳動物細胞ゲノムから誘導したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスから誘導したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター；ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター）が使用し得る；チロシンキナーゼドメインDNAの多重コピー含有細胞系を生成させる際は、SV40-、BPV-およびEBV-をベースとするベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。 DNAの取り扱い法の記載方法、ベクター、種々の型の使用細胞、ベクターを細胞に包含させる方法、発現技術、タンパクの精製・単離方法、およびタンパク濃縮方法については、タンパクPYK-2に関し、PCT公開WO 96/18738に詳細に開示されている。当該公開公報は、図面も含め、その全体を参照文献として本明細書に組み入れられる。当業者は、そのような記載が本発明に適用し得るものであり、かつ、容易に適合させ得ることを認めるであろう。結晶成長結晶は種々の技法により、精製・濃縮したポリペプチド含有水溶液から成長させる。これらの技法とは、バッチ法、液体法、ブリッジ法、透析法、蒸気拡散法、懸垂滴下法などである。マックファーソン(McPherson)、1982、John Wiley,ニューヨーク；マックファーソン(McPherson)、1990、Eur.J.Biochem.189：1〜23 ；ウエバー(Webber)、1991、Adv．Protein Chem．41：1〜36；これらの図形、表、図面のすべてを含め、その全体を参照文献として本明細書に組み入れる。一般に、本発明の未変性結晶は、PTK触媒ドメインに相当するポリペプチドの濃厚溶液に沈殿剤を添加することにより成長させる。沈殿剤は該タンパクを沈殿させるのに必要な濃度以下の濃度で添加する。水は沈殿条件を生じる制御下蒸発により除去し、その条件は結晶の成長が止まるまで維持する。本発明の結晶については、約2.0μLのチロシンキナーゼドメインポリペプチドを含有する懸垂滴（10mMトリス−HCl、pH8.0、10mM NaClおよび２mMジチオトレイトール中10mg/mL）および0.5mLの貯留バッファーに懸濁して、４℃で約３〜４週間保持した2.0μLの貯留溶液（16％w/vポリエチレングリコールMW10000、0.3M （NH₄）₂SO₄、5％v/vエチレングリコールもしくはグリセロール、および100mMビスートリス、pH6.5）が、高分解能X線構造決定に適した結晶を与えることが判明している。当業者は上記の結晶化条件が変更し得ることを認めるだろう。そのような変更は単独であっても組合わせであってもよく、以下のものを包含する：約１mg/mL と約60mg/mLの間のポリペプチド濃度、約10mMと約200mMの間のトリス−HCl濃度、約０mMと約20mMの間のジチオトレイトール濃度からなるポリペプチド溶液であって、pHが約5.5と約7.5の領域にある溶液；約10％と約30％(w/v)の間のポリエチレングリコール濃度、約1000と約20,000の間のポリエチレングリコール分子量、約0.1Mと約0.5Mの間の（NH₄）₂SO₄濃度、約０％と約20％(v/v)エチレングリコールまたはグリセロール濃度、約10mMと約200mMの間のビス−トリス濃度からなる貯留溶液であって、pHが約5.5と約7.5の領域にあり、温度が約０℃と約25℃の範囲にある溶液。他のバッファー溶液は、所望のpH範囲が維持される限り、HEPE Sバッファーをそのまま用いてもよい。本発明の誘導体結晶は、未変性結晶を重金属原子塩含有母液に浸漬することにより得られる。約0.1mMないし約５mMのチメロサール、4−クロロマーキュリー安息香酸またはKAu(CN)₂含有溶液に未変性結晶を約２時間ないし約72時間浸漬すると、チロシンキナーゼドメインポリペプチドのX線結晶構造決定において同型置換法に使用するのに適した誘導体結晶を与える。本発明の共結晶は、キナーゼドメインに結合する化合物含有母液に未変性結晶を浸漬することにより、または上記のように得ることができるか、あるいは１個またはそれ以上の結合化合物の存在下キナーゼドメインポリペプチドを共結晶化することにより得ることができる。 AMP-PCPとの共複合体状にあるチロシンキナーゼドメインポリペプチドの共結晶（co-crystal；共晶）については、未変性結晶を得るための上記結晶化条件を用い、さらに10mM ANP-PCPと20mM MgCl₂を含有するポリペプチド溶液によりAMP- PCPの存在下キナーゼドメインポリペプチドを共結晶化すると、X線結晶学による高分解能構造決定に適した共結晶を得る。勿論、当業者は該ポリペプチド溶液中のAMP-PCPおよびMgCl₂濃度が変更可能なものであり、未変性結晶について上に記したように、その変更は単独または組み合せて用いることができる。そのような変更は、0.1mMと50mMの間の濃度のAMP-PCPおよび０mMと50mMの間の濃度のMgCl₂ を含むポリペプチド溶液を包含する。１つの化合物と複合体を形成したPTK触媒ドメインに相当するポリペプチドからなる結晶は、２つの方法の１つにより成長させることができる。第一の方法では、結晶が成長する前に、PTK触媒ドメインに相当するポリペプチド含有水溶液にモジュラーを添加する。第二の方法では、PTK触媒ドメインに相当するポリペプチドのすでに存在する結晶にモジュラーを浸漬する。結晶性FGFR １つの具体例において、本発明はFGFR1の結晶を提供する。該結晶は実施例に示した方法により得られた。FGFR1結晶は、未変性結晶であっても、誘導体結晶であっても、または共結晶であってもよいが、単斜晶単位格子（例：a≠b≠c； α＝γ＝９０°；およびβ＞９０°）および空間群対称C2を有する。非対称単位には、略２つ折りの軸に関連して２つのFGFR1分子が存在する。２つの形状の結晶性FGFR1が得られた。一方の形状（“C2-A型”という）においては、該単位格子がａ＝208.3Å、ｂ＝57.2Å、ｃ＝65.5Å、およびβ＝107.2 °の次元を有する。他方の形状（“C2-B型”という）においては、該単位格子がａ＝211.6Å、ｂ＝51.3Å、ｃ＝66.1Å、およびβ＝107.7°の次元を有する。３つの異なる二折関連FGFR1二量体がFGFR1結晶のC2-AおよびC2-B型の双方に観察されるが、その１つは非結晶学関連二量体であり、２つは結晶学関連二量体である。非結晶学関連二量体は非対称単位の２分子からなる。二量体界面を形成する残基はC-末端ローブに位置している。この二量体では、該C-末端ローブがN-末端ローブと互いに末端同士で隣接している。表面に埋もれた表面領域の総面積は約950Å²である。界面での相互作用が非常に僅かなのはその特異性であって、例えば、水素結合または疎水性残基の近接パッキングなどである。 C2格子には２つの結晶学関連二量体がある。第一の二量体では、二量体界面を構成する残基は、N−末端ローブ（アミノ酸残基４７７、４７９、４９８、５０６、５０８および４９６）のβシート状のものに限定される。この界面に埋もれた総表面面積は約670Å²である。相互作用はむしろ特異的である。単量体中の部分的に溶媒露出している３つの疎水性残基、Val−479、Ile−498およびVal−508 はその二折関連残基と一緒になって緻密な疎水性プラグを形成する。このプラグはArg−477とGlu−496間の塩架橋により両側が被われる。さらに、２つの主鎖水素結合が２つの単量体のβシートをβ３の発端部（アミノ酸残基５０６および５０８）に結合している。この二量体界面の残基またはその残基の特性は、一般に、哺乳動物のFGFレセプターに保存されるが、無脊椎動物の同族体では保存されない。他の結晶学的に関係のある二量体は約1650Å²その界面に埋もれている。この二量体においては、２つの単量体のαCラセンが殆ど平行にあり、そのC−末端部で互いに接触している。Met−534とMet−537はその二折関連残基とファンデルワールス力で接触している。他の疎水性接触はPro−466とIle−648およびPro−469 とIle−676およびThr−678のものである。さらに、水素結合は（側鎖と主鎖で） Arg−470とLys−618の間、およびHis−649とGlu−464の間に造られ、そこでは幾つかの水分子が水素結合により２つの単量体を架橋している。結晶のC2−B型においては、この第二の結晶学的に関連する二量体の単量体が互いに僅かにシフト（６°の回転）しており、このことはこの界面が幾分流動的であること示している。結晶学的に関連する二量体の双方において、二量体からなる２つの分子のN− 末端は同じ方向に向いており、互いに適度に接近している。単位格子次元とポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造の決定成長した結晶はガラス毛細管に入れ、X線発生装置とX線検出装置に連結した保持装置に載せる。X線回折パターンの収集については当該技術における文献が揃っている。デュクロワ（Ducruix）およびゲイジ(Geige)、1992、IRLプレス、オックスフォード、英国、およびそこでの引用文献。X線のビームは結晶に入り、その結晶から回折する。X線検出装置は結晶から放出される回折パターンを記録するのに利用することができる。これら装置の古い型のX線検出装置は一片のフィルムであるが、最新型の装置ではX線回折散乱をデジタルで記録する。ペプチド分子または分子複合体の結晶形の三次元構造を得る方法は技術上周知である。デュクロワ（Ducruix）およびゲイジ(Geige)、1992、IRLプルス、オックスフォード、英国、およびそこでの引用文献。以下の工程はX線回折データから分子または複合体の三次元構造を決定する過程である。 X線回折パターンを該結晶から収集した後、該結晶の単位格子次元および配向を決定することができる。これらは回折放出間の間隙ならびにこれらの放出から作られるパターンから決定される。単位格子次元は三次元によりオングストローム単位（１Å＝１０^-10）で、また、各頂点の角度により特性づけられる。該結晶単位格子の対称性はまた、この段階で特性づけられる。該結晶単位格子の対称性は、収集したデータの複雑さを繰り返しパターンの同定により単純化する。単位格子の対称性と次元の応用について以下に記載する。各回折パターンの放出はベクトルとして特性づけられ、この方法のこの段階で収集したデータは各ベクトルの振幅を決定する。このベクトルの位相は種々の技法を用いて決定することができる。その１つの方法は、重金属を結晶に浸漬するもので、同型置換法と称されるが、該ベクトルの位相は、X線分析の基準点としてこれらの重原子を用いることにより決定することができる。オトウイノウスキー(Otwinowski)、ダレンスバリー、英国、80〜86。同型置換法は、通常、１個より多い重原子誘導体を必要とする。もう一つの方法において、すでに構造の決まった結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅および位相は、未知構造結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅に適応可能であり、その結果、これらベクトルの位相を決めることができる。この第二の方法は分子置換法として知られており、対照として用いるタンパク構造は、対象のタンパクと密接に関連した構造でなければならない。ナラザ(Naraza)、1994、Proteins 11：281〜296。このように、既知構造PTKからのベクトル情報は、ここに報告してあるように、他の未知構造PTKの分子置換分析に有用である。結晶の単位格子を表すベクトルの位相が決まると、ベクトル振幅と位相、単位格子次元、および単位格子対称性がフーリエ変換関数の項として使用することができる。フーリエ変換関数はこれらの測定値から単位格子の電子密度を計算する。単位格子中の分子の一つまたは分子複合体の一つを表す電子密度は、電子密度マツプとして参照することができる。結晶性ポリペプチドと複合体形成した化合物のアミノ酸配列構造または分子構造は、種々のコンピュータープログラムを用いて電子密度に適合させることかできる。この工程のこの段階はある場合にモデル構築物として参照し、TOM/FRODOなどのコンピュータープログラムを用いて実施することができる。ジョーンズ(Jones)、1985、Methods in Enzymology 115： 157〜171。理論的電子密度マップは実験的に決定した電子密度に適合するアミノ酸構造から計算することができる。理論的および実験的電子密度マップは互いに比較して２つのマップ間の一致点をR−因子と呼ぶパラメーターにより表すことができる。R−因子に対する低値は理論的および実験的電子密度マップ間の高度に重なり合った電子密度を表す。 R−因子は理論的電子密度マップを精密化するコンピュータープログラムを用いて最小化する。X−PLORなどのコンピュータープログラムは、当該技術の熟練者がモデル精密化のために使用することのできるものである。ブリュンゲルる。第一工程では、電子密度マップで限定された原子のコンホメーションを変化させる必要がある。原子のコンホメーションは、温度上昇をシミュレートし、結合の振動数を上げて構造中の原子の位置を加減することにより変化させることができる。原子振動工程の特定点で、許容し得る結合角と結合長による原子間の相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合、イオン相互作用、疎水性相互作用などを一般に規定する力の場が原子の系に加えられる。好ましい相互作用は自由エネルギーとして表され、原子は自由エネルギーが最小となるまで多くの相互作用に渡り移動する。精密化工程はR−因子が最小値に達するまで繰り返される。分子または分子複合体の三次元構造は、最小R−値により特徴づけられる理論上電子密度に適合する原子により表される。三次元座標により各原子を規定する三次元構造についてのファイルを作ることができる。そのような構造座標の例を表１、表２、表３および表４に定義してある。 V．FGFR1 の構造本発明は高分解能三次元構造およびX線結晶学により決定した結晶性FGFR1と結晶性FGFR1：AMP−PCP共複合体の原子構造座標を提供する。構造座標を得るために用いる特定方法は実施例中に提供してある。C2−A型結晶から2.0Åの分解能用に得られた結晶性FGFR1の原子構造座標を表３に掲げてある；C2−A型結晶から2. 3Åの分解能用に得られた結晶性FGFR1：AMP−PCP共複合体の座標を表４に掲げてある。当該技術の熟練者は、X線結晶学により決定される原子構造座標は誤りのないものではないことを認めるだろう。従って、理解されることは、FGFR1の結晶について得られたどの組の構造座標も、それが未変性結晶、誘導体結晶、あるいは共結晶であろうと、表３または表４に掲げた構造座標に関し、バックボーン原子（N、C_α、CおよびO）を用いてそれを重ね合わせたときに約1.5Åより小さいか、あるいはそれに等しい二乗平均偏差（“r.m.s.d.”）をもち、FGFR1のバックボーン原子の少なくとも約５０％ないし100％が重なり合うときに、表に掲げた構造座標と一致すると考えられることである。図１に示すFGFR1の全体構造は二重ローブ体（bi-lobate）である。FGFR1のN− 末端ローブ（lobe）はアミノ酸残基４５６〜５６７（図3）に渡っており、５個のアンチパラレル（anti-parallel）鎖の丸まったβシート（β１〜β５）および１個のα−ラセン（αC）からなる。C−末端ローブはアミノ酸残基５６８〜７６５（図３）に渡り、２つのβ鎖（β７、β８）と７つのαラセン（αD,αE、 αEF、αF−αI）からなる。二次構造の命名はIRKに用いるもの（ハッバード（H ubbard）ら、1994）に従うが、順次cAPKのアサインメントに基づく(ナイトン（K nighton）ら、1991)。図２はFGFR1のC_αトレースの立体図を図１と同じ配向で示す。ヒト線維芽細胞増殖因子レセプター１(ヒトFGFR1；標識FGFR1)、ヒト線維芽細胞増殖因子レセプター２、３および４(それぞれ標識FGFR2、FGFR3およびFGFR4) 、D．メラノガスター（D.melanogaster）同族体(標識DFDFR1)、C．エレガンス（ C．elegans）同族体（標識EGL−15）およびインスリン・レセプターキナーゼ（標識IRK）のチロシンキナーゼドメインの構造をベースとする配列を図３に示す。図３に示していないFGFR1の配列は、FGFR1が以下のアミノ酸の置換と付加を有する以外、FGFR1の配列と同一である：Cys−488→Ala、Cys-584→Ser、Leu-457 →Val、およびさらに付加する５個のN-末端アミノ酸(Ser-Ala-Ala-Gly-Thr)。FG FR1およびIRKについての二次構造アサインメントは、プロチェック（PROCHECK） (ラスコウスキー（Laskowski）ら、1993)において満足するカブシュ（Kabsch）とサンダー（Sander）の演算法（カブシュおよびサンダー、1983）を用いて得た。FGFレセプター配列において、ピリオドはFGFR1に一致する配列を表す。IRK配列においては、FGFR1と同一の残基が強調されて描かれている。ハイフンは挿入を意味する。 EGL−15配列の下部の数字は、FGFR1構造中の残基の分別溶媒接近性（FSA2）を表す。FSA比とは、Gly-X-Glyトリペプチド１残基の溶媒−接近可能表面域をFGFR 1構造のものに比較しての比である。０の値は0.00と0.09の間のFSAを表す；１は 0.10と0.19の間のFSAを表す。値が高いほど、残基はより溶媒に露出される。FSA ラインの星印またはボンド記号は、残基（星印）または側鎖（ボンド記号）が障害のために原子モデルに含まれていないことを意味する。FSAライン下の番号は、二量体の接点部分を形成するこれら残基に対するFSAである。図３に示したFGFR1およびその後のFGFR1、およびIRKに対するアミノ酸残基の番号は、以下の検討で用いる。IRKと比較したFGFR1のN-末端ローブにおける有意差が、β鎖間およびαCのループに見出される。β１の末端からβ２の始まりに至る残基（アミノ酸残基485〜490）は、ATP配位での役割の故にそう命名されたヌクレオチド結合ループを形成する。この残基の広がりはタンパクキナーゼ保存 GXGXXG配列モチーフを含む(ただし、Xはいずれかのアミノ酸である)。このループは非対称単位の一方のFGFR1分子においては余り整っておらず、非対称単位の他のFGFR1分子においては乱雑になっている(すなわち、原子モデルに含まれていない)。β１とβ３間のループは非対称単位からなるFGFR1分子の双方において乱れている。図４Aを参照すると、ここではFGFR1とIRKのN-末端ローブのリボン状図解を提示しているが、そのβシートのC_α原子が重なり合っており、そこで見られるのは、FGFR1のαCがIRKよりも１ラセン回転分だけ長いことと、タンパクキナーゼに保存されている残基Lys−514とGlu−531が塩の架橋（黒線で表現）を形成するように方向づけられていることである。理論に拘束されるつもりはないが、この塩架橋は保存リジン側鎖の適切な配置にとって重要であると信じられており、この側鎖はATPの２個のリン酸酸素に配位している。塩架橋はcAPK（ナイトン（Kni ghton）ら、1991）およびマイトジェン活性化タンパクキナーゼ（MAPK）(ツアン（Zhang）ら、1994)の構造に観察される。図４Bを参照すると、ここではFGFR1とIRKのC-末端ローブのリボン状図解を提示しているが、そのαラセンのC_α原子が重なり合っており、FGFR1のC−末端ラセンにはIRKに比較して有意差が認められる；FGFR1のラセンαIは、IRKの対応部分よりも７残基（ラセン２回転分）だけ長い。αIの伸長部分は、PLCγのSH2ドメインが結合するチロシン自己リン酸化部位がこのラセンに対してC-末端６残基であるので、FGFレセプターの生物学的機能発揮において恐らく重要である。 FGFR1の構造は、N-およびC-末端ローブにつき開放的な配置をとっている。非対称単位の２個のFGFR1分子は、異なる組み合わせの格子接触を有するにかかわらず、相対ローブ配向においてその差は僅か２°である。これは、活性化ループの始まり部分のタンパクキナーゼ保存DFG配列のPhe-642とGly-643をもつαC（Gl u-531およびMet-534）における残基間の立体的相互作用が、FGFR1の開放的コンホメーションの説明となっているかのように見える。 FGFR1の活性部位は、少なくともアミノ酸残基が触媒ループ、活性化ループおよびヌクレオチド結合ループに広がっていることにより特徴づけられる。Tyr-11 62が分子の活性部位を占拠しているIRKの構造とは違って、非対称単位のFGFR1分子双方の活性部位は占拠されていない。リン酸化を制御する活性化ループは少なくとも残基640〜663により特徴づけられる。全く驚くことに、FGFR1とIRKの活性化ループが同じ数のアミノ酸残基を含み、５０％以上の配列相同性を共有する一方、ポリペプチド鎖の方向が著しく異なり、Ala-640(IRKではGly-1149)で分岐し、Val−664(IRKではVal−1173)で再集中する。Tyr-653とTyr-564は活性部位に結合していない。代りに、これらの残基はそこから離れた方向に向いている。Tyr-653は幾つかの疎水性残基(Val−664 、Leu−672およびPhe−710)とファンデルワールスの接触状態にあり、そのヒドロキシ基を経てバックボーンカルボニル酸素（Leu-672）に水素結合している。T yr−654はTyr−653よりもより溶媒にさらされ、Val−706ではファンデルワールスの接触のみである。温度因子のデータは、活性化ループが比較的可動性であり、多様なコンホメーションを採ることを示唆している。タンパクキナーゼの触媒ループは二次構造要素αEとβ７の間にあるが、リン酸転移反応における触媒塩基として作用し、基質チロシン、セリンまたはスレオニンのヒドロキシ基からプロトンを抜き取る不変異アスパラギン酸残基（FGFR1 のAsp−623）を含む。FGFR1の触媒ループ配列は少なくとも残基His−621ないしA sn−628（アミノ酸配列：HRDLAARN）からなり、IRKと殆どのレセプターおよび非レセプターPTKのものと一致する。活性化ループ（Tyr−653およびTyr−654）の２つのチロシン自己リン酸化部位に加えて、本発明のFGFR1に存在する４つの他の自己リン酸化部位がある：その１つは膜近傍領域（Tyr−463）に、２つはキナーゼ挿入断片(Tyr−583およびTyr −585)に、他の１つはC-末端ローブ(Tyr−730)にある(モハンマディ(Mohammadi) ら、1996)。それらは哺乳動物FGFレセプターにおいて様々な度合いで保存されている：FGFR1および２におけるTyr−463およびTyr−585；FGFR1、２および３におけるTyr−583；およびFGFR1、２、３および４におけるTyr−730(図３)。図５を参照すると、自己リン酸化の位置はFGFR1構造上にマップ化してある。膜近傍部位(Tyr−463)およびそれに対してN-端となる残基は、非対称単位のFGFR 1分子の一つにおいて乱されている。非対称単位の他の分子において、Tyr−463 が格子接触に関与している。キナーゼ挿入断片領域（ラセンαDとαE間の領域）は自己リン酸化部位Tyr−5 83とTyr−585を含み、C2-A型結晶の非対称単位におけるFGFR1分子双方において乱されている。C2-B型においては、幾つかの格子接触が部分的に非対称単位における２つのFGFR1分子の一方においてこの領域を拘束し、微量のポリペプチド鎖が形成されるのを可能とする。これらの残基については、十分に解明された二次構造はない。C−末端ローブのαHに位置するTyr−730は殆ど埋もれていて、側鎖ヒドロキシ基が２つの水素結合を形成する。近傍Met−732およびMet−733の側鎖は両方とも埋もれている。それ故、Tyr−730のリン酸化がαHの変性に先立って多分必要となる。 Tyr−730を別として、５つの他の自己リン酸化部位（Tyr−653とTyr−654を含む）がFGFR1分子の比較的可動性の部分に見出される。理論に拘束されるつもりはないが、活性部位に関して自己リン酸化部位の空間位置は、自己リン酸化が２つのキナーゼドメイン間のトランス（trans）機構により起こることを示唆し、リガンドー誘導レセプター二量化が自己リン酸化事象の開始にとって重要であることを示唆している。結晶性FGFR1：AMP-PCP共複合体の構造は、結晶性FGFR1について観察される構造に実質的に類似している。AMP−PCP結合により誘導されるFGFR1の構造に有意な変化はない。特に、AMP−PCPの結合は、また、拡張ATPにより、用いる結晶化条件下ではそれ自体ローブの閉鎖を促進しない。さらに、複合体形成は活性化のコンホメーションおよびヌクレオチド結合ループに目立った変化をもたらさなかった。結晶性FGFR1：AMP−PCP共複合体は、アデニンのN1とAla−564のアミド窒素の間およびアデニンのN6とGlu−562のカルボニル酸素の間に水素結合を有している。アデニン環は一方の側がLeu−484およびVal−492（N−端ローブ）に、他方側がLeu−630（C−端ローブ）に置かれている。リボースのヒドロキシ基はタンパク原子と直接の水素結合を形成しない。Lys−514はβ−およびγ−リン酸エステルの酸素に水素結合されている。Mg²⁺イオンの位置を示すあいまいではない電子密度は存在しない。一般に、AMP−PCPは未リン酸化FGFR1にむしろゆるく配位しているように思われるが、２つのキナーゼローブ間にしっかりとサンドイッチされているよりもむしろ窪みの“頂部”に結合している。FGF −RとIRK間の構造の違い幾つかの特徴がFGF−レセプター構造をインシュリン−レセプターチロシンキナーゼの構造から区別している。これらの特徴は、FGF-レセプター、およびリガンド誘導二量化を受けると信じられている他の単量体レセプターによるシグナル伝達において重要であると思われる。 FGFR1およびIRKの構造間における最も有意な相違は活性化ループのコンホメーションである。FGFR1において、活性化ループは、基質ペプチドに対する結合部位が、IRKでのように活性化ループのチロシンによってではなく、Arg−661とPTK −非変異体Pro−663によりブロックされるように配置されており、一方ATP結合部位は接近し得るものである。このことはもう一つの分子機構を表しており、それによってレセプターPTKは自己抑制されている。FGFR1において観察される自己抑制は、FGFR1活性化ループの残基によりなされる特異的相互作用（比較的高いB −値において現われる）が僅かであり、それとATP部位の近づきやすさの故に、I RKのものよりも弱いように思われる。インシュリンおよびFGFレセプターファミリー間の一つの明らかな相違は、前者ではレセプターが共有結合によりヘテロ４量体（α₂β₂）に結合しているのに対し、後者ではレセプターの二量化がリガンド依存性であることである。キナーゼドメインが常に極めて接近した状態にあるようなレセプターでは、リガンドの結合にのみ関係しているレセプターよりもより強力な自己抑制機構を必要とする(テイラー（Taylor）ら、1995)。殆どの増殖因子レセプターがリガンド依存性二量化と活性化を受けるので、FGFレセプター自己抑制機構はより一般的なもののように思われる。 VI．結晶と原子構造座標の用途本発明の結晶、特にそこから得られる原子構造座標は多様な用途をもつ。例えば、ここに記載した結晶は、レセプターおよび非レセプターチロシンキナーゼの技術上既知の使用法において出発物質として使用することができる。そのような使用法は、例えば、チロシンキナーゼの未変性または変異触媒ドメインに結合する分子の同定である。該結晶と構造座標は、新しい治療剤開発の手段として、レセプターおよび非レセプターチロシンキナーゼを阻害する化合物を同定するためにとりわけ有用である(例えば、レビツキー（Levitzki）およびガジット(Gazit) 、1995)。ここに記載の構造座標はさらなる未変性または変異チロシンキナーゼドメインの結晶構造、ならびにインヒビター、アゴニスト、および他の分子などのリガンドをもつドメインの共結晶構造を決定するための段階的実施用のモデルとして用いることができる。構造座標、ならびにそこから得られる三次元構造のモデルは、NMRを介して得られるものなど、未変性または変異チロシンキナーゼドメインの溶液にもとづく構造の解明を目的としても使用することができる。このように、本発明の結晶および原子構造座標は、レセプターおよび非レセプターチロシンキナーゼの構造と機能を解明するための簡便な手段を提供する。解明と検討を目的として、本発明の結晶については特定FGFR1の典型的な結晶を参照して記載する。当該技術の熟練者は、ここに記載の原理がリガンド誘導二量化を受ける細胞質チロシンキナーゼまたはレセプターチロシンキナーゼのチロシンキナーゼドメインの結晶に一般に適用できるものであり、該チロシンキナーゼは図６のものに制限されるものではないことを認識するだろう。 VII．構造座標を用いる未知構造PTK類の構造決定表１、表２、表３、および表４に示したような構造座標は、未知構造PTK類の三次元構造を決めるのに用いることができる。下記方法は既知構造ポリペプチドの構造座標をもう一組のデータ、例えば、アミノ酸配列、X線結晶回折データ、または核磁気共鳴（NMR）データなどに適用することができる。本発明の好ましい態様はPTKおよび関連ポリペプチドの三次元構造を決定することに関連する。これらのものはレセプターPTK類、例えば、FGF−R、PDGF−R、KDR、CCK4、MET、 TRKA、AXL、TIE、EPH、RYK、DDR、ROS、RET、LTK、ROR1、およびMUSKなどである。非レセプターPTK類、例えば、SRC、BRK、BTK、CSK、ABL、ZAP70、FES、FAK、J AK、およびACKなどもここに記載の方法に用いることができる。アミノ酸相同性を用いる構造相同性モデル化とは、既知構造ポリペプチドの構造座標を未知構造ポリペプチドのアミノ酸配列に適用する方法である。この方法はポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造のコンピューター画像化、既知または未知構造ポリペプチドのアミノ酸配列のコンピューター画像化、およびアミノ酸構造の標準的コンピューター画像化を用いて実施する。相同性モデル化は：(a)既知構造をもつまたはもたないポリペプチドのアミノ酸配列を整列させる工程；(b)既知構造の保存アミノ酸の座標を対応する既知構造ポリペプチドのアミノ酸に移動させる工程；(c)続く三次元構造を明確化する工程；および(d)該ポリペプチドの残部構造を構築することからなる。当該技術の熟練者は、２種のタンパク間の保存アミノ酸を、工程(a)の配列整列工程から決定することができることを認識している。上記方法は当業者周知のものである。グリアー(Greer)、1985、Science228：1 055。ブルンデル（Blundell）ら、1988、Eur．J．Biochem．172：513。当業者が相同性モデル化に現在利用するコンピュータープログラムは、モレキュラー・シミュレーション・インク（Molecular Simulation Inc.）が拡販しているInsight IIモデル化パッケージ中のホモロジー・モジュールである。アミノ酸配列の整列は、既知構造ポリペプチドのアミノ酸配列のコンピューター画像を未知構造ポリペプチドのアミノ酸配列上に先ず重ねることにより実施する。次いで、配列内のアミノ酸を比較し、相同アミノ酸のグループ（例：化学的性質が類似のアミノ酸側鎖−脂肪族、芳香族、極性、または負荷）を一緒にして組み分ける。この方法はポリペプチドの保存領域を検出し、アミノ酸の挿入または切除を考慮する。既知または未知構造のポリペプチドアミノ酸配列を整列させた後、既知構造ポリペプチドのコンピューター画像中保存アミノ酸構造を、構造未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に転写する。例えば、既知構造アミノ酸配列のチロシンを、未知構造アミノ酸配列の対応する同族アミノ酸であるフェニルアラニンにより置換してもよい。非保存領域に位置するアミノ酸の構造は、標準的なペプチド幾何学または分子シミュレーション技術、例えば、分子動力学などを用いて手作業で決めてもよい。この工程の最終工程は分子動力学および/またはエネルギー最小化法を用い、全体構造を確実にすることにより実施する。相同性モデル化法は当該技術の熟練者に周知のものであり、異なったタンパク分子を用いて実施されている。セリン/スレオニンタンパクキナーゼ、ミオシン軽鎖タンパクキナーゼの触媒ドメインに対応するポリペプチドの三次元構造は、 cAMP-依存性タンパクキナーゼ触媒サブユニットから相同性モデル化された。ナイトン（Knighton）ら、1992、Science 258：130〜135。分子置換を用いる構造分子置換とは既知構造ポリペプチドのX線回折データを未知構造ポリペプチドのX線回折データに適合させる方法である。この方法は振幅のみが既知の未知構造ポリペプチドのX線回折データを描写する段階を限定するのに利用することができる。X−PLORは分子置換に使用された常用コンピューター・ソフトウエア・ AMOREは分子置換に使用される他のプログラムである。ナバザ(Navaza)、1994、A cta Crystallogr．A50：157〜163。好ましくは、得られる構造は３Å以上の二乗平均偏差を示さない。分子置換のゴールは、単位格子の原子位置を、２種の結晶からの電子回折データを調和させることにより整列させることである。X−PLORなどのプログラムは４つの工程を含んでいる。第一工程は単位格子中の分子数を決め、その間の角度を確定することである。第二工程は単位格子中の分子の配向を確定するために、回折データを回転させることでる。第三工程は単位格子の分子を正確に位置づけるために、電子密度を三次元に翻訳することである。X線回折データの振幅と位相が決まると、R−因子を参照データの組から実験的に計算した電子回折マップと新規データの組から計算したマップとを比較することにより計算する。30〜50 ％のR−因子は単位格子中の原子の配向がこの方法により合理的に決まることを示している。この方法の第４工程は、ここに記載した当業者周知の反復向土させた技術を用い、新しい電子密度マップの確度を上げて、R−因子をおおよそ20％低下させることである。NMR データを用いる構造 X線結晶学技術から誘導されるポリペプチドまたはポリペプチド複合体の構造座標は核磁気共鳴（NMR）データからのポリペプチド三次元構造の解明に応用することができる。この方法は当該技術の熟練者が使用するものである。ウスリッチ(Wuthrich)、1989、John Wiley and Sons、ニューヨーク：176〜199；ブルグラス（Pflugrath）ら、1986、J．Molecular Biology 189：383〜386；クライン（Kline）ら、1986、J．Molecular Biology 189：377〜382。ポリペプチドの二次構造は二次元NMRデータを利用することにより時に容易に決めることができるか、二次構造の個々の断片間の空間的つながりはそれ程簡単に決められない。X 線結晶学技術から誘導されるポリペプチドの三次元構造を規定する座標は、関連構造ペプチドの二次構造要素間の空間的相互作用をNMR測定者に理解させ得るものである。二次構造要素間の空間的相互作用の知識は、二次元NMR実験からの核オーバーハウザー効果（NOE）データを著しく単純化することができる。さらに、NMR技術による二次構造の決定後、結晶座標を応用することは、ポリペプチド配列の特定アミノ酸に関係するNOEのアサインメントを単純化するだけであって、ポリペプチド構造のNMR分析を著しく偏ったものとするわけではない。逆に、ポリペプチドの二次構造を決めながら、NOEデータを単純化するために結晶座標を使用することは、タンパク構造のNMR分析を偏ったものとする。ポリペプチド構造のNMR法による分析は比較的新しい技術なので、PTK構造を規定する構造座標の使用は、近い将来より頻繁に採用されるだろう。この方法が進歩するにつれ、PTK触媒ドメインと同一サイズのポリペプチド三次元構造の分析がより頻繁になるだろう。 VIII．構造座標を利用するPTK機能モジュレーターの構造ベース設計構造ベースモジュレーターの設計および同定法は、多様な可能性のあるモジュレーターおよび化学官能基を含むコンピューター・データベースの探索に関与する強力な技術である。モジユレーターのコンピユーター化設計および同定は、コンピューター・データベースが化学ライブラリーよりも時には桁違いの多さで、より多くの化合物を含むので有用である。構造ベース薬物設計と同定についての参照総説：クンツ（Kuntz）ら、1994、Acc．Chem．Res．27：117；ギダ(Guida) 、1994、Current Opinion in Struc．Biol．4;777；コールマン(Colman)、1994 、Current Opinion in Struc．Biol．4：868。構造座標により規定されるポリペプチドの三次元構造はこれらの設計法により利用することができる。表１、表２、表３、および表４の構造座標はこの方法により利用することができる。さらに、ここに記載した相同性、分子置換およびNM R技術により決定されるレセプターおよび非レセプターPTKの三次元構造もまた、モジユレーターの設計と同定法に応用することができる。従って、レセプターPT K類の構造、すなわち、FGF−R、PDGF−R、FLK、CCK4、MET、TRKA、AXL、TIE、EP H、RYK、DDR、ROS、RET、LTK、ROR1、およびMUSKなどがここに記載の方法に利用することができる。非レセプターPTK類、すなわち、SRC、BRK、BTK、CSK、ABL、 ZAP70、FES、FAK、JAK、およびACKなども合理的なモジュラー設計法に利用することができる。分子データベース検索による設計合理的なモジュレーター設計の１つの方法は、分子のデータベースから化合物のコンピューター画像をドッキングさせることによりモジュレーターを探索する。公的に入手可能なデータベースは以下のとおりである：（a）モレキュラー・デザイン・リミテッドからのACD （b）国立癌研究所からのNCI （c）ケンブリッジ結晶学・データ・センターからのCCDC （d）ケミカル・アブストラタト・サービスからのCAST （e）ダーウエント・インフォメーション・リミテッドからのDerwent （f）メイブリッジ・ケミカル株式会社からのMaybridge （g）アルドリッチ・ケミカル・カンパニーからのAldrich （h）チャップマン＆ホールからの天然物事典そのようなデータベースの一つ（モレキュラー・デザイン・リミテッド情報システム）は、例えば、合成的に誘導した化合物あるいは天然物を200,000種含んでいる。当該技術の熟練者に利用可能な方法は、二次元で表されるデータセットを三次元で表されるものに変換できる。これらの方法はトリポス・アソシエートの CONCORDまたはモレキュラー・シミュレーション・リミテッドのDB−コンバーターなどのコンピュータープログラムにより可能である。構造ベースモジュレーターの多くの設計方法が当業者既知である。クンツ（Ku ntz）ら、1982、J.Mol.Biol.162:269；クンツ（Kuntz）ら、1994、Acc.Chem.Res .27：117；メング（Meng）ら、1992、J.Compt.Chem.13：505；ボーム(Bohm)、19 94、J.Comp.Aided Molec.Design 8：623。合理的なモジュレーターの設計技術の熟練者により広く利用されているコンピュータープログラムは、カリフォルニア大学、サンフランシスコのDOCKである。このコンピュータープログラムおよび同様のプログラムにより利用される一般法は下記３つの応用例に記載される。これら技術の幾つかに関するより詳細な情報は、モレキュラー・シミュレーションのユーザーガイド（1995）に見ることができる。この目的に用いる代表的なコンピュータープログラムは以下の工程からなる：（a）タンパクから既存の化合物を除く；（b）コンピュータープログラム（DOCKなど）を用い一方の化合物の構造を活性部位にドッキングさせるか、あるいは該化合物を相互作用的に活性部位に移動させることによりドッキングさせる；（c）該化合物と活性部位原子の間の空間を特徴づける；（d）(i)該化合物と活性部位間の空の空間に適合し、(ii)該化合物に結合し得る分子フラグメントをライブラリーで探索する；次いで（e）上で見出したフラグメントを該化合物に結合し、新たに修飾した化合物を評価する。項目(c)は活性部位の原子と該化合物の間に形成される幾何学的および補足的相互作用を特徴づけることである。好適な幾何学的適合は、有意な表面積が不適切な立体相互作用を形成せずに該化合物と活性部位原子との間で共有するときに達成される。当該技術の熟練者は、この方法では項目(d)および(e)は飛ばして、多くの化合物のデータベースをスクリーニングすることにより実施可能なことに気づくだろう。 PTK機能モジュレーターの構造ベース設計および同定は、アッセイスクリーニングとの連携で使用することができる。化合物についての大型コンピューターデータベース（約10,000化合物）は時間の問題で検索できるので、コンピューターをベースとする方法は、PTK機能の可能なモジュレーターとして細胞アッセイによりテストすべき化合物を狭めることができる。構造ベースモジユレーター設計についての上の記述はすべてを包含するものではなく、他の方法も文献に報告されている：（１）CAVEAT：バートレット（Bartlett）ら、1989、「分子認識における化学的生物学的問題」、ロバート(Roberts,S.M.)、レイ(Ley,S.V.)、キャンプベル（C ampbell,M.M.）編集、ロイヤル・ソサイアティ・オブ・ケミストリー、ケンブリッジ、１8２〜196頁。（２）FLOG：ミラー（Miller）ら、J.Comp.Aided Molec.Design 8：153．（３）PROモジュレーター：クラーク（Clark）ら、1995、J.Comp.Aided Molec .Design 9：13。（４）MCSS：ミランカー（Miranker）およびカープラス(Karplus)、1991、Pro teins：Structure,Function,and Genetics 11：29。（５）AUTODOCK：グッドセル（Goodsell）およびオルソン(Olson)、1990、Pro teins：Structure，Function,and Genetics 9：195。（６）GRID：グッドフォード(Goodford)、1985、J．Med．Chem．28：849。PTK との複合体化合物を修飾することによる設計可能なモジュレーターとしての化合物を同定しるもう一つの方法は、ポリペプチドの既存モジュレーターを修飾することである。例えば、モジュレーターのコンピューター画像をPTK活性部位のコンピューター画像内で修飾することができる。この技術の詳細な指示は、モレキュラー・シミュレーションのユーザーガイド（1995、LUDI）により見ることができる。モジュレーターのコンピューター画像は１個または複数の化学基を削除するか、あるいは１個または複数の化学基を付加することにより修飾する。化合物に対する各修飾により、修飾化合物および活性部位の原子がコンホメーション内でシフトし、モジュラーと活性部位原子間の距離が２つの分子間に形成される補足的相互作用と共に評点される。評点付けは好適な幾何学的適合および好適な相互作用が得られるときに完了する。好適な評点をもつ化合物はPTK機能の潜在的モジュレーターである。PTK に結合する化合物の構造修飾による設計構造ベースモジュレーター設計の第三の方法は、モジュレーター構築またはモジュレーター検索コンピュータープログラムにより設計した化合物をスクリーニングすることである。この型のプログラムの例はモレキュラー・シミュレーション・パッケージ、キャタリストに見出すことができる。このプログラムの使用についての記述はモレキュラー・シミュレーションのユーザーガイド（1995）に詳細な説明がある。この応用に用いる他のコンピュータープログラムは、モレキュラーデザイン社のISIS/HOST、ISIS/BASE、ISIS/DRAWとトリポス・アソシエートのUNITYである。これらのプログラムは化合物−PTK複合体の三次元構造の活性部位から除去した化合物の構造にもとづき操作する。そのような化合物につきプログラムを操作するのは、それが生物学的に活性なコンホメーションである故に好ましい。モジュレーター構築コンピュータープログラムは、PTKとの複合体化合物中、化学基のコンピューター画像をコンピューターデータベースからの基と置換えるのに使用することの可能なコンピュータープログラムである。モジュレーター検索コンピュータープログラムは、PTKに結合した化合物と類似の三次元構造および類似の化学基を有するコンピューターデータベースからの化合物のコンピューター画像を検索するのに用いることのできるコンピュータープログラムである。代表的なプログラムは以下の一般工程を用いて操作することができる。（a）水素結合供与体または受容体、疎水性/親油性、正にイオン化し得る部位、または負にイオン化し得る部位によりなど、化学的特徴点により化合物をマップ化する；（b）幾何学的な拘束をマップ化した特徴点に加える；次いで（c）(b)で生成したモデルでデータベースを検索する。当業者は、インドリノンについては、重要な化学的特徴点として、それに限定されるものではないか、水素結合供与体、水素結合受容体、および２つの疎水性接触点をもつことを認める。当業者はまた、該化合物の可能な化学的特徴点のすべてではないが、それが(b)のモデルに存在することが必要である。データベース検索のためには異なるモデルを生成するモデルのサブセットを用いることもできる。 IX．有機合成技術コンピューターベースのモジュレーター設計および同定の汎用性は、コンピュータープログラムによりスクリーニングした構造の多様性にある。コンピュータープログラムは200,000分子を含むデータベースを検索することが可能で、多様な化学官能基をもつ酵素とすでに複合体を形成しているモジュレーターを修飾することができる。この化学的多様性の重要性は、PTK機能の潜在的モジュレーターが予測し得ない化学形状を採る可能性があるということである。広範な一連の有機合成技術は、PTK機能の潜在的モジュレーターを構築することの挑戦に適う技術にある。これら有機合成法の多くは当業者が利用する標準的な文献類に詳細に記載されている。そのような文献の一例は：アドバンスド・オルガニック・ケミストリー：反応、メカニズムおよび構造、1994年３月、ニューヨーク、マグロウヒル、である。このように、コンピューターベース法により同定されるPTK機能の潜在的モジュレーターを合成するのに必要な技術は、有機化学合成の当業者に容易に利用可能である。 X．シグナル変換経路におけるPTKモジュレーターの効果を測定する細胞アッセイ法細胞アッセイ法はPTK機能の潜在的モジュレーターの活性をテストならびに不適切なPTK活性と関連する疾患の診断に使用することができる。PTK機能の潜在的モジュレーターは、細胞系に過剰発現した特定PTKの自己リン酸化への潜在的モジュレーターの影響を測定するアッセイにより、インビトロ活性をテストすることができる。このように、PTKに相当する触媒ドメインの強いインヒピターとして作用するモジュレーターは、そのPTKにより触媒される自己リン酸化量を減少させる。潜在的モジュレーターはまた、インビトロでの細胞増殖アッセイならびにインビボでの動物モデルアッセイにおける活性もテストすることができる。インビボアッセイはまた、本発明法により設計した潜在的モジュレーターの生物活性をテストするのにも有用である。これらのアッセイのための材料、方法および実験データについては、「疾患治療用インドリノン化合物」(Indolinone Compounds for the Treatment of Disea se)と題する1996年12月19日発刊のWO 69/40116に詳細に記載されている。この出願はその図面、図形および表のすべてを含め、その全体を参照文献としてここに包含される。 XI．疾患治療薬としのPTK機能モジュレーターの投与疾患治療薬とし化合物を生物体に投与する方法については、「疾患治療用インドリノン化合物」(Indolinone Compounds for the Treatment of Disease)と題する1996年12月19日発刊のWO 69/40116に詳細に記載されている。この出願はその図面、図形および表のすべてを含め、その全体を参照文献としてここに包含される。実施例下記の例は非限定的であり、本発明の種々の態様と特徴の単に代表的なものである。これらの例は、蛋白キナーゼポリペプチドの結晶形態の製造方法、これら蛋白キナーゼポリペプチドの三次元構造の決定方法、および蛋白キナーゼの三次元構造を用いての蛋白キナーゼのモジュレーターの同定方法を説明するものである。実施例１：FGFR1 のX線結晶構造決定ポリペプチドの合成と単離組替えバキュロウイルスを処理（engineer）して、ヒトFGFR1の残基456-765 をコード化した。切断可能なN-末端ヒスチジンタッグを組み込んで、蛋白の精製を助けた。３つのアミノ酸置換が導入された。すなわち、AlaをCys-488へ、Ser をCys-584へ、そしてValをLeu-457へ導入した。２つのシステイン置換は、天然の蛋白において生起するジスルフィド結合したオリゴマーの形成を防ぐために行われた。ValへのLeu-457置換は、Met-456近傍へNcolクローニング部位を導入した。Tyr-766(TAC)のコドンは停止コドンに変わり、そしてHindIII-クローニング部位がこの停止コドンに次いで生成された。これらの置換は、メーカーのプロトコール(アマーシャム)に従い部位指向性の突然変異誘発によって、m13MPI9中のF GFR1のヒトcDNAの全長の中へ導入された。得られた構造は、NcolとHindIIIで消化され、そして適切に消化されたpBlueBa c HistagB（インビトロゲン）の中へ結合された。昆虫細胞(Sf9)のトランスフェクションが、メーカーのプロトコール（ファーミンゲン）に従いBaculo Goldトランスフェクション系で行われた。正のプラークの同定のあと、組替えバキュロウイルスは、高い力価(1ミリリットルあたり5×10⁷個のウイルス粒子)にまで増幅された。Sf9細胞は175cm³のフラスコ内で、フラスコあたり2-3×10⁷の密度まで成長させ、感染多重度(MOI)10で組替えバキュロウイルスに感染させた。 48時間後に、細胞を4℃で35分間3500gの遠心分離で集め、ついで25mMのHEPES( pH7.5)、150mMのNaCl、10％のグリセロール、1.5mMのMgCl₂、1％のトリトンX-10 0、10μg/mlのアプロトニン、１0μg/mlのロイペプチン、および1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)の中で溶菌した。溶菌液を4℃で１時間40, 000gでSorval RC 5C(デュポン)を用いて遠心分離し、ついで１時間100,000gでXL -80（ベックマン社）を用いて超遠心分離した。遠心分離の後、澄明となった溶菌液をNi²⁺キレート化したカラム（ファルマシア）を通過させ、結合したヒスチジンでラベルした融合蛋白を、100mMのイミダゾール(pH7.5)で溶離した。プールされた画分はモノQ陰イオン交換カラム（ファルマシア）の上へ負荷し、０から5 00mMの勾配のNaClで溶離した。融合蛋白を含む画分をCentricon-30（アミコン）で濃縮し、エンテロキナーゼ（バイオザイム）により20℃で一晩消化してヒスチジンタグを除去した。この消化は、アプロトニン、ロイペプチン、PMSF、TPCKおよびウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI)を加えることにより終了した。ついで、切断されたキナーゼ領域をスーパーローズ12サイズ排除カラム(ファルマシア)の上でヒスチジンタグから分離した。溶離されたキナーゼ領域はさらにモノQカラムで精製した。精製したキナーゼ領域はN-末端配列決定と質量分析によって分析した。５個のアミノ酸(S AAGT)がヒスチジンタグから残存していた。予測していた分子量が、質量分析で確認された。結晶成長精製したFGFR1を20-50mg/mlまで濃縮し、セントリコン-30を用いて10mMのトリスHCl(ｐＨ8.0)、10mMのNaCl、および2mMのDTTの中へ交換した。2.0μlの10mg/m lの蛋白溶液ならびに2.0μlの貯溜溶液（16％のポリエリレングリコール(PEF)10 000、0.3Mの(NH₄)₂SO₄、5％のエチレングリコール、および10mMのビス-トリス(p H6.5)）を含有する懸垂液滴のなかへ蒸気拡散させて４℃で結晶を成長させた。天然のFGFR1の結晶を、4℃で24.48時間、3-[(3-(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロール-5-イル)メチレン]-2-インドリノン(1-5mM)または3-[4-(4-ホルミルピペラジン-1-イル)-ベンジリデニル]-2-インドリノン(1mM)を含有する500mlの安定剤溶液[25％のPEG10000、0.3Mの硫酸アンモニウム、0.1Mのビス-トリス(pH6 .5)、5％のエチレングリコール]へ浸漬した。DMSOの最終浸漬濃度は1％から5％の間であった。結晶は、高濃度のDMSOで破損した。 FGFR1と阻害剤との共結晶もまた、1mMの3-[(3-(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロール-5-イル)メチレン]-2-インドリノンと3-[4-(4-ホルミルピペラジン-1 -イル)-ベンジリデニル]-2-インドリノンを含む2.0μｌの貯溜溶液および2.0μ ｌの１0mg/mlの蛋白溶液を含む懸垂液滴のなかへ蒸気拡散させて得られた。 FGFR1とAMP-PCPが複合した共結晶は、蛋白溶液がさらに10mMのAMP-PCPと20mM のMgC1₂を含んでいること以外は、天然の結晶作成で述べたのと同様にして得ることができた。重原子誘導体結晶の製造重原子誘導体結晶は、FGFR1天然結晶(C2-A型)を、上記の表１に示すようなエチルメルクリチオサリチル酸(チメロサール)、KAu(CN)₂もしくは4-クロロメルクリ安息香酸、並びに25％のPEG10000、0.3Mの硫酸アンモニウム、5％のエチレングリコールかグリセロール、及び100mMのビス-トリス(pH6.5)を含有する溶液に浸漬することにより得られ、そして直接に液体窒素中(シンクロトロン)か、または−175℃の乾燥窒素流（回転アノード）中でフラッシュ冷却した。データ収集と構造決定 50kVと100mA(CuKα)で作動し二重焦点鏡とR-AXIS IICイメージプレート検出器を備えたRigaku RU-200回転アノードか、又はブルックヘーブンナショナルラボラトリーのナショナルシンクロトロンライトソースのビームラインX-4Aにより、天然の結晶およびヌクレオチドアナログのAMP-PCPを含む結晶のデータを収集した。シンクロトロンのデータ(λ＝1.07Å)はフジのイメージプレートに収集しフジのスキャナーで読み取った。１つの低温冷却結晶を、データのセットの各々に対して用いた。低温冷却結晶を得るために、結晶を、25％のPEG10000、0. 3Mの硫酸アンモニウム、5％のエチレングリコールもしくはグリセロール、および100mMのビス-トリス(pH6.5)を含有する低温保護剤溶液に浸漬し、そして直接液体窒素の中で（シンクロトロンデータ）か−175℃の乾燥窒素気流の中で（回転アノードデータ）でフラッシュ冷却した。すべてのデータは、DENZOおよびSCA LEPACKを用いて処理した。Otwinowski,1933,“Oscillation Data Reduction Pro gram”,Proceedings of the CCP4 Study Weekend,Sawyer et al.,eds.(Daresbur y,イギリス、SERC Daresbury Laboratory),56-62. 天然の結晶や、ヌクレオチドアナログのAMP-PCPを含む結晶については、分子置換溶液が、1094-1105残基（キナーゼ挿入）および1153-1170(活性ループ)を除く993-1263残基(FGFR1残基475-754)に共通な側鎖をもつポリアラニンから成るIR K研究モデルを用いC2-B結晶型において最初に見出された。1.50と3.5Åの間の構造因子増幅の80％を用いてのAMORE（Navaza,1994,AmoRe:anautomated package f or molecular replacement,”Acta Crystallogr.A50;157-163）では、不斉単位の中の２分子の１つがあった。正確な1-分子溶液の補正係数（c.c.）は(もっとも不正確な溶液が0.20であるのに対して)0.23であった。こ Connectinut:The Howeared Hughes Medical Institute and Department of Mole cular Biophysics and Biochemistry,Yale University)で精製された硬質体であり、最初は１つの硬質体単位で、ついで各々がキナーゼのローブを含む２つの単位であった。硬質体精製（12.0-3.5Å、F>３σ）は、２つのローブの〜10°の相互回転と、c.c.の0.20から0.25への増加をもたらした。ついで硬質体精製分子は AMOREにおける新しい研究モデルとして用いられ、そしてこのとき不斉単位の中の両分子が存在していた。正確な２-分子溶液のc.c.は(もっとも不正確な溶液が 0.27であるのに対して)0.35であった。 6.0-2.4Åデータに対してのモデルの形成と精製の複合サイクルは、多くの側鎖および幾つかの欠損ポリペプチド鎖のモデルへの付加をもたらした。モデルの形成はTOM/FRODO（Jones，1985，“Diffraction Methods for Biological M acromolecules．Interactive Computer Graphics:FRODO,”Methods in Enzy mology 115:157-171)を用いて行われ、複合勾配最小化とシミュレーショ値は30％であった(遊離のR値は36％)。モデル形成と精製の促進を助けるために、実験的な相が得られた。エチレングリコールの存在下に成長した結晶はグリセリン中で成長したものに比べて操作が容易であるので、いくつもの重原子誘導体データのセットが、種々の重原子溶液へ浸漬されたC2-A結晶から集められた。C2 -B構造は引き続き、6.0-2.4Åデータに対して、0.008Åの結合距離および1.4Å の結合角のr.m.s.d.値で２3.8％のR値(遊離のR値は30.4％)へと精製された。分子置換を用いて、C2-A結晶型の不斉単位の２つのFGFR1分子（FLGK-AおよびF LGK-Bと称する）を配置した。15.0から3.5Åの構造因子振幅の80％とC2-BモデルでのAMOREを用いた場合、正確な2.分子溶液のc.c.は（もっとも不正確な溶液の0 .35に対して）0.62であった。重原子位置は、部分的モデルから計算した相を用いて差フーリエマップから決定した。重原子パラメーターの精製と相決定は、ML PHARE(Otwiinowski,1991,“Maximum Likelihood Refinement of Heavy Atom Par ameters,”Isomorphous Replacement and Anomolous Scattering,Evans and Les lie eds.(Darsnbury,イギリス，SERC Daresbury Laboratory),56-62))によって行われた。最初の分子同形置換（MIR）相の電子密度マップは、2.0から2.8Åの分解データに基づいて計算した。このマップは溶媒フラテニング、ヒストグラムマッチング及びDMを用いる非結晶学的対称(NCS) アベレージング（Cowtan，1994，“Protein Crystallography”，CCP4 and ESF- EACBM Newsletter(Joint)31:34-38）により改良された。 6.0-2.0Åデータに対するC2-AFGFR1構造の精製は、複合勾配最小化とX-PLORを用いるシミュレートしたアニーリングによって進められた。厳しいNCSの限定は、限定が上昇する点であるところの2.0Å分解のデータが精製に含まれるまで強いられた。全体の異方性B値はX-PLORを用いて計算され、観察された構造因子へ応用され、R値が〜３％減少した。B値が≧70Å²まで精製された水の分子は、これ以降の精製工程から省かれた。平均のB値は、すべての蛋白については37.5Å² であり、FLGK-Aの蛋白原子については35.4Å²であり、FLGK-Bの蛋白原子については39.7Å²であり、水分子については40.2Å²であった。FLGK-AとFLKG-BでのCy s-603及びFLGK-BでのMet-534の側鎖が、２つの異なるコンホメーションにおいてモデル化された。少ない支持の電子密度のため原子モデルに含まれない残基は、 FLGK-Aでは456-463、486-490、501-504、580-591、763-765であり、FLGK-Bでは4 56-460、501-504、578-593、646-651、657-659、762-765である。２つのAMP-PCP分子(FGFR1分子については１つ)の位置は、2F_{oba(co-complex)} −F_calc(FGFR1)差フーリエマップで容易に同定された。FLGK-Bに結合するAMP-PC P分子は弱く結合しており、0.5の占有率でモデル化されている。表５は、本発明の結晶性FGFR1と結晶性FGFR1:AMP-PCP共複合体の構造を決定するために用いたFGFR1誘導体結晶のX線結晶学的データを要約したものである。表５データ採取とMIR位相の要約 a:Thi-1,Thi-2:エチルメルクリチオサリチル酸（チメロサール）;PCMB:4−クロロメルクリ安息香酸 b:R_sym=100×Σ_hΣ_i｜I_i(h)-<I(h)>｜Σ_hΣ_iI_i(h) c:カッコの中の値は最高分解シェルに対するもの d:I(+h)およびI(-h)は独立した反射としてのもの。異常散乱の寄与も含まれる。 e:R_iso=100×Σ_h‖F_p(h)±F_p(h)｜−｜F_PH(h)‖/Σ_h｜F_p(h)｜、ここでF_pとF_PH はそれぞれ天然と誘導体の構造因子 f:位相力：r.m.s.重原子構造因子/r.m.s.閉鎖不足（20.0から2.8Åへの非中心的反射による） g:R_cullis=100×Σ_h‖F_PH(h)｜−FH_(calc)(h)｜/Σ_h｜F_PH(h)±F_p(h)｜（20.0から2.8Åへの非中心的反射による） h:性能係数:∫P(Φ)exp(iΦ)dΦ/∫P(Φ)d(Φ)、ここでPは位相角Φの確率分布化合物１及び２並びにFGFR1を含む結晶については、50kVと100mAで作動し、２重焦点鏡とR-AXIS IICイメージプレート検出器を備えたRigaku RU-200回転アノード(CuKα)を用いてデータを採取した。各データのセットについて１つの低温冷却結晶を用いた。結晶は低温保護剤[25％のPEG10000、0.3Mの硫酸アンモニウム、5％のエチレングリコール、100mMのビス-トリス(pH6.5)、および1mMの3-[(3 -(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロリル-5-イル)メチレン]-2-インドリノン（以下では化合物１と称する）または3-[4-(4-ホルミルピペラジン-1-イル-)ベンジリデニル]-2-インドリノン(以下では化合物２と称する)]に浸漬し、−175℃で乾燥窒素気流中でフラッシュ冷却した。データはDENSOおよびSCALEPACKを用いて処理した。Otwinowski，1993，Proceedings of the CCP4 Study Weekend（Dares bury，United Kingdom:SERC Daresbury Laboratory）pp.56-62。データ採取パラメータの要約を次の表６に示す。表６化合物１の構造:残基550、水分子252、化合物２分子１(4589原子) 化合物２の構造:残基550、水分子248、化合物２分子２(4646原子)構造分析原子重層をTOSS(Hendrickson,1979)を用いて行なった。残基については、溶媒アクセス可能表面計算をX-PLORで行なった。ダイマー界面に埋もれている表面面積は、1.4Åのプローブ半径を使ってGRASP（Nicholls et al.,1991）で計算した。原子モデルの立体化学的品質は、PROCHECK(Laskowski et al.，1993，PROCHEC K: 蛋白構造の立体化学的品質をチェックするための電算機プログラム、J．Appl．C ryst．26:283.291)を使ってモニターを行なった。PROCHECKで定義されているように、モデルの中の93％の残基が、ほとんどの好ましいRamachandran領域で主鎖ねじれ角をもっている。不許可領域には残基はなく、寛大な許可領域には３つの残基がある。すなわち、FLGK-AとFLGK-BにはArg622、そしてFLGK-AにはArg- 554がある。全体でのG因子スコアは0.42である。表７は、本発明の結晶性FGFR1:AMP-PCP共複合体と結晶性FGFR1の構造のX線結晶学的精製パラメータを要約したものである。表８は、FGFR1/化合物複合体のXx 線結晶学的精製パラメータを要約したものである。表７精製のパラメータ FGFR1:残基550、水分子252（4589原子） FGFR1:AMP-PCP:残基550、水分子238、AMP-PCP分子２(4638原子) a:R値=100×Σ_h‖F_obs(h)｜−｜F_calc(h)‖/Σ_h｜F_obs(h)｜、F_obs>2σの反射に対して b:結合蛋白原子に対して表８ a:R_sym=100×S_hS_i｜I_i(h)−I(h)⁰｜/S_hS_iI_i(h) c:カッコの中の値は最高分解シェルに対するもの i:R値=100×S_h‖F_o(h)｜−｜F_c(h)‖/S_h｜F_o(h)｜、ここにF_oとF_cはそれぞれ構造因子の理論値と実験値（F_o>2σ） j:結合蛋白原子に対して k:カッコの中の値は、5％のデータから定めた遊離のR値原子構造配位表１および表２はそれぞれ、非リン酸化FGFR1および非リン酸化FGFR1:AMP-PCP 共複合体の原子構造配位を示すものである。これらの表において、不斉単位を含むダイマーの両方のFGFR1分子の配位が示されている。アミノ酸残基数は、図３において用いたものと一致している。ダイマーの最初のFGFR1分子では、残基番号の前に”1”がつけられ、すなわちダイマーの最初のFGFR1分子の残基番号464 は、”1464”と表わされる。表３と４は、FGFR1機能を阻害することがわかったインドリノン化合物との複合体におけるFGFR1の原子構造配位を示す。表においては次の略語が用いられている。「原子タイプ」とは、配位が示されている元素を表わす。欄における最初の文字が元素を表わしている。「A.A.」はアミノ酸を表わす。「X、YおよびZ」は、元素の直交座標を表わす。「B」は、原子の中心の周辺の原子運動を測定する熱因子である。「OCC」は占有率であって、原子タイプが特定の配位を占有する時間の百分率を表わすものである。「PRT1」および「PRT2」は占有率に関するものであって、PRT1は最初のコンホメーションにある原子の配位を表わし、PRT２は２番目またはその他のコンホメーションにある原子の配位を表わす。 FGFR1の構造配位は、数学的操作によって修飾できる。そのような操作には、粗構造配位の結晶学的並べ替え、粗構造配位の分画、粗構造配位セットへの整数の追加または削除、粗構造配位の変換およびそれらの組み合わせなどが含まれるが、それらに限定されるものではない。さらには、構造配位はわずかな修飾も可能であり、ほとんど同等の三次元構造を尚も示している。そのために、特異な構造配位のセットは、得られる構造の２乗平均偏差である。1.5Åより少ない２乗平均偏差だけ互いに偏移する三次元構造を示す構造配位は、同等であるとみなされる。実施例２ PTK 機能のモジュレーターのコンピュータに基づく設計 PTK機能の潜在的なモジュレーターは、3-[(3-(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロール-5-イル)メチレン]-2-インドリノンでCatalystプログラムを作動させて設計し同定した。調査モデルを拘束する化学的特性としては、水素結合ドナー、水素結合アクセプター、および２つの疎水性接触点がある。この方法を用いることでおよそ40個の化合物かPTK機能の潜在的モジュレーターと同定された。この方法によりPTK機能の潜在的モジュレーターと同定された化合物は、商業的に入手可能である。ついでこれらの化合物は、固相酵素免疫検定法（ELISA）でFLK PTKを阻害する能力のテストを行なった。この検定法を行なう方法は、Tan gほかによって発明され、1996年12月19日に発行された「疾患治療用インドリノン化合物」という名称のWO96/40116に記載されている。この特許はその中のデータ、図面および表をも含め、そのすべてが参照によりここに包含される。Flk-1 特異性の抗体は、次のプロトコールで作成することができる。 1.トレシル活性化アガロース10mlを、重炭酸ソーダ緩衝液(pH9.6)100mM中の精製GST-Flk-1-D融合蛋白20mgと共に、4℃で一晩培養することにより、トレシル活性化アガロース/Flk-１-Dカラムを作成する。 2.そのカラムをPBSで一回洗浄する。 3.カラム上の余分な部位を、2Mグリシンにより4℃で２時間ブロックする。 4.カラムをPBSで洗浄する。 5.カラムを、ウサギの抗Flk-1D生産物出血で２時間４℃で培養する。 6.カラムをPBSで洗浄する。 7.100mMのクエン酸（pH3.0）で血清を溶出し、溶出液を直ちに2Mのトリス（pH 9.0）で中和する。 8.溶出液をPBSへ4℃で一晩透析する。ただし緩衝液は３回とりかえる(サンプルと緩衝液の比率は1:100である)。 9.透析した抗血清を5％グリセリンで調節し、少量のアリコートとして−80℃ で貯蔵する。 Flk-1 ELISAは、100mMのクエン酸(無水の)、250mMのリン酸水素ナトリウム(pH 4.0)、0.5mg/mlのABTS（シグマのカタログ番号A-1888）を含有し得るところの2, 2-アジノ-ビス(3-エチルベンズ-チアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）溶液を含むことができる。この溶液は、使用直前まで暗所に4℃で貯蔵するのが最も適当である。 FLK-1特異的抗体は、Santa Cruz Biotechnology(カタログ番号SC-504)から購入することもできる。 PTK機能の潜在的モジュレーターとして同定された40個の化合物のうち４つは、FLK機能の強力なモジュレーターであった。これらの分子は次の構造をもっている。これらのモジュレーターは、次の様なIC₅₀値でFLK蛋白を阻害する。表９以上において説明的に記載された本発明は、ここで具体的に開示されてない要素や限定がなくても実施可能である。用いられた用語や表現は説明のためのものであって、限定のためのものではなく、そのような用語や表現の使用は、記載され説明された態様のいかなる均等物をも排除する意図はなく、種々の変形は本発明の請求の範囲の中に入り得ると認識される。すなわち、本発明は好ましい実施態様ならびに任意的な態様によって具体的に開示してきたけれども、ここに開示した概念の変形および変化は当業者には実施可能であり、そのような変形や変化はここに添付された請求の範囲で定義される本発明の範囲内にあると考えられるのは言うまでもない。特許文献および非特許文献を含め、参照によりこれまでに包含されてない文献は、すべての目的に対してここにはっきりと包含されるものである。他の実施態様は以下の請求の範囲に含まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月２７日（１９９８．１０．２７）【補正内容】本発明の他の好ましい態様は、３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４− メチルピロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノン、ならびに３−［４ −（４−フォルミルピペラジン−１−イル−）ベンジリデニル］−２−インドリノンを含む結晶形である。これらの結晶形のポリペプチドは、ＦＧＦＲおよび特にＦＧＦＲ１であることが可能である。好ましい態様においては、本発明の結晶形は、表３または表４に明らかにした構造座標によって定義することができる。Ｘ線結晶学の使用は、本発明の結晶形の三次元構造の解明を可能にする。結晶形のＸ線結晶学による最初のキャラクタリゼーションで、単位格子形および結晶におけるその方向性を測定することができる。他の好ましい態様において、本発明は、単斜晶形の単位格子を有することによって特徴づけられる、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインタンパク質の結晶を特筆する。当該結晶はまた、空間群対称Ｃ２を有することによっても特性が規定される。「単位格子」という用語は、結晶の最も小さく最も単純な体積要素（すなわち平行六面体ブロック）をさし、それは結晶パターンの単位を完全に代表する。単位格子のディメンションは６個の数値により定義される；ディメンションａ、ｂ、およびｃと、角度α、β、およびγ。結晶は、数多くの単位格子が能率よく詰まった配列として見ることができる。結晶学用語の詳しい説明は、本文中に参考文献として取り入れた、図面、表、および図を含むすべてに記載されている。第６Ｂ図は、細胞質チロシンキナーゼのサブファミリーの各々からの代表的な一員を描いたものである。第６Ａおよび６Ｂ図において、高度に保存されている残基には囲みを入れてある。グリシンに富むドメイン、キナーゼ挿入、触媒ループ、および活性化ループが示されている。番号づけは、ヒトＦＧＦ受容体についてのものである。結晶学的原子構造座標の簡単な説明結晶学的構造座標は、「実施例」と題した章の終わり、かつ請求の範囲の前に置かれている。三つの座標のセットは、１ＦＧＫ、１ＡＧＷ、および１ＦＧＩというアクセス名で、プロテインデータバンク(Protein Data Bank)に見い出される。１ＦＧＫ座標は、表１にリストしたものに対応し、１ＡＧＷ座標は表４にリストしたものに対応し、１ＦＧＩ座標は表３にリストしたものに対応する。１ＡＧＷおよび１ＦＧＩ座標のセットは、１９９８年３月に公に入手できるであろう。表１は、Ｘ線結晶学により測定した本発明の天然のＦＧＦＲ１結晶の原子構造座標を提供しており；表２は、Ｘ線結晶学により測定した本発明のＦＧＦＲ１：ＡＭＰ−ＰＣＰコクリスタルの原子構造座標を提供している。表３は、３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２− イル）メチレン］−２−インドリノンと複合体を形成したＦＧＦＲ１の三次元構造を定義する結晶学的座標を列挙している。縦の列は（左から右へ）、原子の番号およびタイプによる記述、アミノ酸および当該原子の含有数、ｘ座標、ｙ座標、ｚ座標、結合の連結度、および温度因子である。これらのパラメーターは、この技術においては十分定義されている。 2.0μlの10mg/mlの蛋白溶液ならびに2.0μlの貯溜溶液（16%のポリエリレングリコール(PEF)10000、0.3Mの(NH₄)₂SO₄、5％のエチレングリコール、および10mMのビス-トリス(pH6.5)）を含有する懸垂液滴のなかへ蒸気拡散させて４℃で結晶を成長させた。天然のFGFR1の結晶を、4℃で24-48時間、3-[(3-(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロール-2-イル)メチレン]-2-インドリノン(1-5mM)または3-[4-(4-ホルミルピペラジン-1-イル)-ベンジリデニル]-2-インドリノン(1mM)を含有する500mlの安定剤溶液[25％のPEG10000、0.3Mの硫酸アンモニウム、0.1Mのビス-トリス(pH6 .5)、5％のエチレングリコール]へ浸漬した。DMSOの最終浸漬濃度は1％から5％の間であった。結晶は、高濃度のDMSOで破損した。 FGFR1と阻害剤との共結晶もまた、1mMの3-[(3-(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロール-2-イル)メチレン]-2-インドリノンと3-[4-(4-ホルミルピペラジン-1 -イル)-ベンジリデニル]-2-インドリノンを含む2.0μlの貯溜溶液および2.0μl の10mg/mlの蛋白溶液を含む懸垂液滴のなかへ蒸気拡散させて得られた。 FGFR1とAMP-PCPが複合した共結晶は、蛋白溶液がさらに10mMのAMP-PCPと20mM のMgCl₂を含んでいること以外は、天然の結晶作成で述べたのと同様にして得ることができた。重原子誘導体結晶の製造重原子誘導体結晶は、FGFR1天然結晶(C2-A型)を、上記の表１に示すようなエチルメルクリチオサリチル酸（チメロサール）、KAu(CN)₂もしくは4-クロロメルクリ安息香酸、並びに25％のPEG10000、0.3Mの硫酸アンモニウム、5％のエチレングリコールかグリセロール、及び100mMのビス-トリス(pH6.5)を含有する溶液に浸漬することにより得られ、そして直接に液体窒素中（シンクロトロン）か、または−175℃の乾燥窒素流（回転アノード）中でフラッシュ冷却した。 1.5Åより少ない２乗平均偏差だけ互いに偏移する三次元構造を示す構造配位は、同等であるとみなされる。実施例２ PTK 機能のモジュレーターのコンピュータに基づく設計 PTK機能の潜在的なモジュレーターは、3-[(3-(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロール-2-イル)メチレン]-2-インドリノンでCatalystプログラムを作動させて設計し同定した。調査モデルを拘束する化学的特性としては、水素結合ドナー、水素結合アクセプター、および２つの疎水性接触点がある。この方法を用いることでおよそ40個の化合物がPTK機能の潜在的モジュレーターと同定された。この方法によりPTK機能の潜在的モジュレーターと同定された化合物は、商業的に入手可能である。ついでこれらの化合物は、固相酵素免疫検定法（ELISA）でFLK PTKを阻害する能力のテストを行なった。この検定法を行なう方法は、Tan gほかによって発明され、1996年12月19日に発行された「疾患治療用インドリノン化合物」という名称のWO96/40116に記載されている。この特許はその中のデータ、図面および表をも含め、そのすべてが参照によりここに包含される。Flk-1 特異性の抗体は、次のプロトコールで作成することができる。 1.トレシル活性化アガロース10mlを、重炭酸ソーダ緩衝液(pH9.6)100mM中の精製GST-Flk-1-D融合蛋白20mgと共に、4℃で一晩培養することにより、トレシル活性化アガロース/Flk-1-Dカラムを作成する。請求の範囲１．ポリペプチドを含む結晶形であって、前記ポリペプチドは蛋白質チロシンキナーゼの触媒ドメインからなり、前記蛋白質チロシンキナーゼは非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼであることを特徴とする結晶形。２．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項１記載の結晶形。３．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＫＤＲ、およびＲＥＴからなる群より選択される、請求項１記載の結晶形。４．前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項１記載の結晶形。５．前記非レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項４記載の結晶形。６．１つまたはそれ以上の重金属原子を含む、請求項１記載の結晶形。７．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼがＦＧＦＲである、請求項１記載の結晶形。１６．前記インドリノン化合物が、３−［（３−（２−カルボキシエチル）− ４−メチルピロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノンである、請求項１５記載の結晶形。１７．前記インドリノン化合物が、３−［４−（４−ホルミルピペラジン−１ −イル）ベンジリデニル］−２−インドリノンである、請求項１５記載の結晶形。１８．表３の原子構造配位により規定される、請求項１６記載の結晶形。１９．表４の原子構造配位により規定される、請求項１７記載の結晶形。２０．単斜晶系単位格子を有する、請求項１記載の結晶形。２１．前記単斜晶系単位格子が、約ａ＝２０８．３Å、ｂ＝５７．８Å、ｃ＝６５．５Åおよびβ＝１０７．２°の寸法を有する、請求項２０記載の結晶形。２２．前記単斜晶系単位格子が、約ａ＝２１１．６Å、ｂ＝５１．３Å、ｃ＝６６．１Åおよびβ＝１０７．７°の寸法を有する、請求項２０記載の結晶形。２３．１つまたはそれ以上の重金属原子を含む、請求項１０記載の結晶形。２４．触媒ドメインの保存グリシンリッチ領域中の第１のグリシンの上流の約２０アミノ酸残基、および触媒ドメインのＣ−末端境界に位置する保存アルギニンの下流の約１７アミノ酸残基からなる境界を有する蛋白質チロシンキナーゼの触媒ドメインからなるポリペプチドであって、前記蛋白質チロシンキナーゼが非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼであることを特徴とするポリペプチド。２５．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＫＤＲ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項２４記載のポリペプチド。２６．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＫＤＲ、およびＲＥＴからなる群より選択される、請求項２５記載のポリペプチド。２７．前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項２４記載のポリペプチド。２８．前記非レセプターキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項２７記載のポリペプチド。２９．配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４記載のポリペプチド。３０．請求項２４記載のポリペプチドを使用して結晶を形成する方法であって、（ａ）ある容量のポリペプチド溶液を貯蔵溶液と混合し；そして（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を、閉鎖容器中で、結晶化に適する条件下で貯蔵溶液上でインキュベートする、の各工程を含む方法。５９．前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項５８記載の方法。６０．前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項５５、５６または５７のいずれかに記載の方法。６１．前記非レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項６０記載の方法。６２．前記触媒ドメインが、触媒ドメインの保存グリシンリッチ領域中の第１のグリシンの上流の約２０アミノ酸残基、および触媒ドメインのＣ−末端境界に位置する保存アルギニンの下流の約１７アミノ酸残基からなる境界を有する、請求項１記載の結晶形。６３．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼがＦＧＦ−Ｒである、請求項２６記載のポリペプチド。６４．前記貯蔵溶液が、１０％から３０％のポリエチレングリコール、０．１Ｍから０．５Ｍの硫酸アンモニウム、０％から２０％のエチレングリコールまたはグリセロール、１０ｍＭから２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ約５．５から約７．５のｐＨを有する、請求項３０記載の方法。６５．ポリペプチドを含む結晶形であって、前記ポリペプチドは蛋白質チロシンキナーゼの触媒ドメインからなり、前記蛋白質チロシンキナーゼは非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼであり、前記結晶形は、（ａ）ある容量のポリペプチド溶液を貯蔵溶液と混合し；そして（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を閉鎖容器内で結晶化に適当な条件下で貯蔵溶液上でインキュベートするの各工程を含む方法により調製されることを特徴とする結晶形。６６．前記貯蔵溶液が、１０％から３０％のポリエチレングリコール、０．１Ｍから０．５Ｍの硫酸アンモニウム、０％から２０％のエチレングリコールまたはグリセロール、１０ｍＭから２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ約５．５から約７．５のｐＨを有する、請求項６５記載の結晶形。６７．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項６５記載の結晶形。６８．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＫＤＲ、およびＲＥＴからなる群より選択される、請求項６５記載の結晶形。６９．前記非インスリンレセプター蛋白質チロシンキナーゼがＦＧＦ−Ｒである、請求項６８記載の結晶形。７０．前記触媒ドメインが、触媒ドメインの保存グリシンリッチ領域中の第１のグリシンの上流の約２０アミノ酸残基、および触媒ドメインのＣ−末端境界に位置する保存アルギニンの下流の約１７アミノ酸残基からなる境界を有する、請求項６５記載の結晶形。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者サン，リアメリカ合衆国カリフォルニア州94404, フォスター・シティ，ロックハーバー・レーン 64 (72)発明者リィアン，ツォンシァンアメリカ合衆国カリフォルニア州94087― 2242，サニーヴェイル，ウエスト・レミントン・ドライブ 726 (72)発明者シュレシンガー，ジョゼフアメリカ合衆国ニューヨーク州10011，ニューヨーク，ワシントン・スクエア・ウエスト 37 (72)発明者ハバード，スティーブン・アールアメリカ合衆国ニューヨーク州10471，リバーデイル，シルヴァン・アベニュー 5465 (72)発明者マクマホン，ジェラルドアメリカ合衆国カリフォルニア州95452, ケンウッド，シュルツ・ロード 1800 (72)発明者タン，ペン・シーアメリカ合衆国カリフォルニア州94556, モラガ，カミノ・リカルド 827

Claims

【特許請求の範囲】１．蛋白質チロシンキナーゼの触媒ドメインに対応するポリペプチドの結晶形。２．前記蛋白質チロシンキナーゼが、レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項１記載の結晶形。３．前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項２記載の結晶形。４．前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項１記載の結晶形。５．前記非レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項４記載の結晶形。６．１つまたはそれ以上の重金属原子を含む、請求項１記載の結晶形。７．前記蛋白質チロシンキナーゼがＦＧＦＲである、請求項１記載の結晶形。８．前記ＦＧＦＲがＦＧＦＲ１である、請求項７記載の結晶形。９．表１に記載される原子構造配位により規定される、請求項８記載の結晶形。１０．少なくとも１つの化合物を含む、請求項７記載の結晶形。１１．前記化合物がヌクレオチド類似体である、請求項１０記載の結晶形。１２．前記ヌクレオチド類似体がＡＭＰ−ＰＣＰである、請求項１１記載の結晶形。１３．表２に記載される原子構造配位により規定される、請求項１２記載の結晶形。１４．前記化合物がインドリノン化合物である、請求項１０記載の結晶形。１５．前記インドリノン化合物が式ＩまたはＩＩ：［式中、（ａ）Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃、およびＡ₄は、独立して、炭素または窒素であり；（ｂ）Ｒ₁は、水素またはアルキルであり；（ｃ）Ｒ₂は、オキシインドリノンの場合には酸素であり、またはチオールインドリノンの場合にはイオウであり；（ｄ）Ｒ₃は、水素であり；（ｅ）Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は、任意に存在し、（ｉ）独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ＮＲＲ’、ＳＯ₃Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群より選択される、または（ｉｉ）任意の２つの隣接するＲ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は、一緒になって、インドリノンのオキシインドール系部分のアリール部分とともに縮合環を形成し；（ｆ）Ｒ₂’、Ｒ₃’、Ｒ₄’、Ｒ₅’、およびＲ₆’は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ＮＲＲ’、ＳＯ₃ Ｒ，ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群より選択され；（ｇ）ｎは、０、１、２、または３であり；（ｈ）Ｒは、水素、アルキル、またはアリールであり；（ｉ）Ｒ’は、水素、アルキル、またはアリールであり；および（ｊ）Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３ −トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フラン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール、１，２，３，５−オキサトリアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，２，３，４−チアトリアゾール、１，２，３，５−チアトリアゾール、およびテトラゾールからなる群より選択される５員のヘテロアリール環であって、任意に１つまたはそれ以上の位置においてアルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ ＮＲＲ’、ＳＯ₃Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ、およびＣＯＮＲＲ’で置換されていてもよい］に記載される構造を有するか、またはその薬学的に許容しうる塩、異性体、代謝産物、エステル、アミド、またはプロドラッグである、請求項１４記載の結晶形。１６．前記インドリノン化合物が、３−［（３−（２−カルボキシエチル）− ４−メチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンである、請求項１５記載の結晶形。１７．前記インドリノン化合物が、３−［４−（４−ホルミルピペラジン−１ −イル）ベンジリデニル］−２−インドリノンである、請求項１５記載の結晶形。１８．表３の原子構造配位により規定される、請求項１６記載の結晶形。１９．表４の原子構造配位により規定される、請求項１７記載の結晶形。２０．単斜晶系単位格子を有する、請求項１記載の結晶形。２１．前記単斜晶系単位格子が、約ａ＝２０８．３Å、ｂ＝５７．８Å、ｃ＝６５．５Åおよびβ＝１０７．２°の寸法を有する、請求項２０記載の結晶形。２２．前記単斜晶系単位格子が、約ａ＝２１１．６Å、ｂ＝５１．３Å、ｃ＝６６．１Åおよびβ＝１０７．７°の寸法を有する、請求項２０記載の結晶形。２３．１つまたはそれ以上の重金属原子を含む、請求項１０記載の結晶形。２４．蛋白質チロシンキナーゼの触媒ドメインに対応するポリペプチドであって、触媒ドメインの保存グリシンリッチ領域中の第１のグリシンの上流に少なくとも約２０アミノ酸残基を含み、かつ触媒ドメインのＣ末端境界に位置する保存アルギニンの下流に少なくとも約１７アミノ酸残基を含むことを特徴とするポリペプチド。２５．前記蛋白質チロシンキナーゼがレセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項２４記載のポリペプチド。２６．前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項２４記載のポリペプチド。２７．前記レセプターチロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＫＤＲ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項２５記載のポリペプチド。２８．前記非レセプターキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項２６記載のポリペプチド。２９．配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２４記載のポリペプチド。３０．請求項２４記載のポリペプチドを使用して結晶を形成する方法であって、（ａ）ある容量のポリペプチド溶液を貯蔵溶液と混合し；そして（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を、閉鎖容器中で、結晶化に適する条件下で貯蔵溶液上でインキュベートする、の各工程を含む方法。３１．ＦＧＦレセプターチロシンキナーゼドメインポリペプチドを結晶形で得る方法であって、（ａ）ある容量のポリペプチド溶液を等量の貯蔵溶液と混合し、ここで前記ポリペプチド溶液は、１ｍｇ／ｍＬから６０ｍｇ／ｍＬのＦＧＦ型チロシンキナーゼドメイン蛋白質、１０ｍＭから２００ｍＭの緩衝剤、０ｍＭから２０ｍＭのジチオスレイトールを含み、かつ約５．５から約７．５のｐＨを有し、および前記貯蔵溶液は、１０％から３０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール、０．１Ｍから０．５Ｍの硫酸アンモニウム、０％から２０％（ｗ／ｖ）のエチレングリコールまたはグリセロール、１０ｍＭから２００ｍＭの緩衝剤を含み、かつ約５．５から約７．５のｐＨを有し；そして（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を、閉鎖容器中で、前記貯蔵溶液上で０℃ から２５℃の温度で、結晶が形成するまでインキュベートする、の各工程を含む方法。３２．前記ポリペプチド溶液は、約１０ｍｇ／ｍＬのＦＧＦレセプターチロシンキナーゼドメイン、約１０ｍＭの塩化ナトリウム、約２ｍＭのジチオスレイトール、約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含み、かつ約８のｐＨを有し；貯蔵緩衝液は、約１６％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＭＷ１００００）、約０．３Ｍの硫酸アンモニウム、約５％のエチレングリコールまたはグリセロール、約１００ｍＭのビス−Ｔｒｉｓを含み、かつ約６．５のｐＨを有し；および温度が約４℃である、請求項３１記載の方法。３３．前記ポリペプチド溶液が化合物を含む、請求項３１記載の方法。３４．ＦＧＦレセプターチロシンキナーゼドメイン蛋白質をコードするｃＤＮＡであって、ｃＤＮＡのコーディング鎖が配列番号５のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｃＤＮＡ。３５．未知の構造を有する蛋白質チロシンキナーゼの３次元構造を決定する方法であって、表１、表２、表３、または表４に記載される構造原子配位を適用する工程を含む方法。３６．以下の各工程：（ａ）未知の構造の蛋白質チロシンキナーゼのアミノ酸配列の第１のコンピュータ表示と、既知の構造の蛋白質チロシンキナーゼの第２のコンピュータ表示を、前記第１のコンピュータ表示のアミノ酸配列と前記第２のコンピュータ表示のアミノ酸配列の相同領域を合わせることにより並列させ；（ｂ）前記既知の構造の蛋白質チロシンキナーゼにおけるアミノ酸構造のコンピュータ表示を、前記未知の構造の蛋白質チロシンキナーゼにおける対応するアミノ酸構造のコンピュータ表示に移し；そして（ｃ）工程（ｂ）から得られる蛋白質チロシンキナーゼ構造の低エネルギー配座を決定する、を含む、請求項３５記載の方法。３７．以下の各工程：（ａ）２つの結晶からの電子回折データを合わせることにより、単位格子中の原子の位置を並列させ；そして（ｂ）得られる蛋白質チロシンキナーゼ構造の低エネルギー配座を決定する、を含む、請求項３５記載の方法。３８．以下の各工程：（ａ）ＮＭＲデータを用いて蛋白質チロシンキナーゼ構造の二次構造を決定し；そして（ｂ）アミノ酸のスルースペース相互作用の帰属を簡便化する、を含む、請求項３５記載の方法。３９．既知の構造を有するかまたは有しない前記蛋白質チロシンキナーゼが、レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項３５、３６、３７または３８のいずれかに記載の方法。４０．既知の構造を有するかまたは有しない前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項３９記載の方法。４１．既知の構造を有するかまたは有しない前記蛋白質チロシンキナーゼが、非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項３５、３６、３７または３８のいずれかに記載の方法。４２．既知の構造を有するかまたは有しない前記蛋白質チロシンキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項４１記載の方法。４３．化合物の構造のコンピュータ表示を、蛋白質チロシンキナーゼの活性部位により形成される空洞の構造のコンピュータ表示と合体させることにより、蛋白質チロシンキナーゼ機能の潜在的調節剤を同定する方法であって、前記蛋白質チロシンキナーゼの前記構造が、表１、表２、表３、または表４に記載される原子構造配位により規定されることを特徴とする方法。４４．以下の工程：（ａ）蛋白質チロシンキナーゼと錯化させた化合物のコンピュータ表示を除き、コンピュータデータベースからの化合物のコンピュータ表示を蛋白質チロシンキナーゼの活性部位のコンピュータ表示と合体させ；（ｂ）工程（ａ）から得られた錯体の好都合な幾何学的適合および好都合な相補的相互作用を有する配座を決定し；そして（ｃ）前記活性部位に最も良く適合する化合物を蛋白質チロシンキナーゼ機能の潜在的調節剤として同定する、を含む、請求項４３記載の方法。４５．以下の工程：（ａ）１つまたは複数の化学基の削除、または１つまたは複数の化学基の付加により、蛋白質チロシンキナーゼと錯化させた化合物のコンピュータ表示を改変し；（ｂ）工程（ａ）から得られた錯体の、好都合な幾何学的適合および好都合な相補的相互作用を有する配座を決定し；そして（ｃ）蛋白質チロシンキナーゼ活性部位に最も良く適合する化合物を蛋白質チロシンキナーゼ機能の潜在的調節剤として同定する、を含む、請求項４３記載の方法。４６．前記方法が以下の工程：（ａ）蛋白質チロシンキナーゼと錯化させた化合物のコンピュータ表示を除き；そして（ｂ）化合物検索コンピュータプログラムを用いて、前記化合物に類似するデータベース化合物についてデータベースを検索するか、または化合物構築コンピュータプログラムを用いて、前記化合物の一部をデータベースからの類似の化学構造で置き換える、を含む、請求項４３記載の方法。４７．前記蛋白質チロシンキナーゼがレセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項４３、４４、４５または４６のいずれかに記載の方法。４８．前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項４７記載の方法。４９．前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項４３、４４、４５または４６のいずれかに記載の方法。５０．前記蛋白質チロシンキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項４９記載の方法。５１．請求項４３、４４、４５または４６のいずれかに記載の方法により同定された蛋白質チロシンキナーゼ機能の潜在的調節剤。５２．前記調節剤がコンピュータデータベースから選択される、請求項５１記載の潜在的調節剤。５３．前記調節剤がコンピュータデータベースから選択される化学基から構築される、請求項５１記載の潜在的調節剤。５４．前記調節剤が、式Ｉ、またはＩＩ：［式中、（ａ）Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃、およびＡ₄は、独立して、炭素または窒素であり；（ｂ）Ｒ₁は、水素またはアルキルであり；（ｃ）Ｒ₂は、オキシインドリノンの場合には酸素であり、またはチオールインドリノンの場合にはイオウであり；（ｄ）Ｒ₃は、水素であり；（ｅ）Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は、任意に存在し、（ｉ）独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ＮＲＲ’、ＳＯ₃Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）任意の２つの隣接するＲ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は、一緒になって、インドリノンのオキシインドール系部分のアリール部分とともに縮合環を形成し；（ｆ）Ｒ₂’、Ｒ₃’、Ｒ₄’、Ｒ₅’、およびＲ₆’は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ＮＲＲ’、ＳＯ₃ Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群より選択され；（ｇ）ｎは、０、１、２、または３であり；（ｈ）Ｒは、水素、アルキル、またはアリールであり；（ｉ）Ｒ’は、水素、アルキル、またはアリールであり；および（ｊ）Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３ −トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、フラン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール、１，２，３，５−オキサトリアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，２，３，４−チアトリアゾール、１，２，３，５−チアトリアゾール、およびテトラゾールからなる群より選択される５員のヘテロアリール環であり、任意に１つまたはそれ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ₂ ＮＲＲ’、ＳＯ₃Ｒ、ＳＲ、ＮＯ₂、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ、およびＣＯＮＲＲ’で置換されていてもよい］のインドリノン化合物、またはその薬学的に許容される塩、異性体、代謝産物、エステル、アミド、またはプロドラッグである、請求項５１記載の蛋白質チロシンキナーゼ機能の潜在的調節剤。５５．蛋白質チロシンキナーゼ機能の潜在的調節剤を蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する方法であって、（ａ）前記潜在的調節剤を細胞に投与し；（ｂ）潜在的調節剤を投与されていない細胞と前記潜在的調節剤を投与された細胞との間の蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルを比較し；そして（ｃ）蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルの相違に基づいて、前記潜在的調節剤を蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する、の各工程を含む方法。５６．蛋白質チロシンキナーゼ機能の潜在的調節剤を蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する方法であって、前記方法は、（ａ）前記潜在的調節剤の製剤を細胞に投与し；（ｂ）調節剤を投与されていない細胞と調節剤を投与された細胞との間の細胞成長の速度を比較し；そして（ｃ）細胞成長の速度の相違に基づいて、前記潜在的調節剤を蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する、の各工程を含む方法。５７．細胞性生物において不適切な活性を有する蛋白質チロシンキナーゼに関連する疾患を治療する方法であって、前記方法は、（ａ）蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を生物に投与し、ここで前記調節剤は許容しうる薬学的製剤中にあり；そして（ｂ）蛋白質チロシンキナーゼ機能を活性化または阻害して疾患を治療する、の各工程を含む方法。５８．前記蛋白質チロシンキナーゼがレセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項５５、５６または５７のいずれかに記載の方法。５９．前記レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＬＫ、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、およびＭＵＳＫからなる群より選択される、請求項５８記載の方法。６０．前記蛋白質チロシンキナーゼが非レセプター蛋白質チロシンキナーゼである、請求項５５、５６または５７のいずれかに記載の方法。６１．前記非レセプター蛋白質チロシンキナーゼが、ＳＲＣ、ＢＲＫ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＡＢＬ、ＺＡＰ７０、ＦＥＳ、ＦＡＫ、ＪＡＫ、およびＡＣＫからなる群より選択される、請求項６０記載の方法。