CN102811729B - 钠/钾三磷酸腺苷酶及src相关的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明部分基于钠/钾三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新结构构象及功能的确证,尤其是对新的结合位点及相互作用的确证。本发明提供了Na/K ATPase及与Na/K ATPase相互作用的化合物之间的数种惊人的结构及功能关系的应用。这些结构和关系的公开提供了对在化学上影响Na/K ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的调节子的理解及解决方案。

Description

钠/钾三磷酸腺苷酶及SRC相关的材料和方法
发明人：Z.谢，Q.叶，Z.李 
相关申请的交叉引用 
本申请要求2011年1月13日提交的PCT申请号PCT/US2011/021130的权益，该PCT申请要求2010年1月13日提交的美国临时申请序列号61/294,665的优选权，其整个公开明确地通过引用并入本文。 
联邦资助研究声明 
本发明在政府支持下完成，得到国立卫生研究院授予的基金号HL-36573和HL-67963。政府对于本发明有特定的权利。 
序列表 
本申请包括序列表，其已经以ASCII格式通过EFS-Web提交并通过引用以其全文并入本文。创建于2011年1月13日的所述ASCII副本命名为420_52651_SEQ_LIST_D2010-28.txt，大小为527字节。 
发明领域
本发明涉及生物学、化学及医学领域。本发明具体涉及与心血管疾病相关的离子转运蛋白质、小的药物活性分子、研究工具、诊断方法、试剂盒及处理方法。影响胆固醇介导的心血管疾病的强心类固醇拮抗剂及组合物在本发明领域内。其他领域，如物理学及生物化学也为本发明提供了框架。 
发明背景 
本发明部分基于钠/钾三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新结构构象及功能的确证,尤其是对新的结合位点及相互作用的确证。本发明提供了Na/K ATPase及与Na/K ATPase相互作用的化合物之间的惊人的结构及功能关系的应用。本发明提供了解决方案，其化学上影响了Na/K ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的调节子。 
钠和钾穿过细胞膜的转运活性与许多细胞过程包括代谢、基因表达和细胞生长有内在的联系。Na/K-ATPase有高度的表达并代表了动物生理学中最基本、重要的蛋白质之一。此外，Na/K-ATPase的表达和活性对于调节细胞的总体转运活性非常重要。此种称为泵动/渗漏偶联的形式在几乎每种哺乳动物细胞中存在。因为蛋白质磷酸化构成了一种关键的机制，细胞过程通过这种机制得到协调，本发明人假设存在有能够将Na/K-ATPase的跨膜转运活性与蛋白质激酶的开/关相偶联的受体机制。 
已知大量的Na/K-ATPase在培养的细胞及体内与Src激酶直接相互作用。所述相互作用涉及至少两对蛋白质结构域。具体地，α1亚基的第二个胞质结构域（CD2）与Src SH2相互作用，且核苷酸结合（N）结构域与Src激酶结构域相结合。后一种相互作用使得Src保持失活状态并且强心类固醇如乌本苷对Na/K-ATPase/Src复合物的结合激活了相结合的Src，导致多种蛋白质激酶级联的激活。 
发明概述 
本发明提供了包含氨基酸化合物的实体组合物，所述氨基酸化合物包含序列STNCV EGTAR GIVVY TGD[SEQ ID NO:1]的至少十个连续氨基酸残基，或所述至少十个连续氨基酸残基的保守性置换，其中的化合物能够结合Src的SH2结构域。 
优选的是进一步包含治疗可接受赋形剂的那些组合物。其中氨基酸化合物包含序列STNCV EGTAR GIVVY TGD[SEQ ID NO:1]的那些组合物为最优选的。 
还优选的是以选自以下的IC50结合于Src的那些：低于大约90nM;低于大约75nM;50nM;低于大约40nM;低于大约30nM,低于大约20nM;低于大约10nM;及低于7nM。 
还提供了编码本文的组合物的核酸化合物，以及载体、细胞，具体 而言为大肠杆菌和哺乳动物细胞，尤其是肿瘤细胞。 
还提供了针对本文组合物所选的单克隆抗体，尤其是进一步包含选自以下的可检测标签的那些抗体：放射性标签；化学标签；荧光标签；抗体；及蛋白质。优选的是本文的那些组合物，其中组合物能够影响选自以下的细胞过程：拮抗CTS-诱导的蛋白质激酶级联；上调CTS诱导的蛋白质激酶级联；Src抑制；Src刺激；Na/K-ATPase模拟物；Na/K-ATPase竞争性抑制剂；Lyn抑制；Lyn刺激；乌本苷拮抗；乌本苷刺激；ERK1/2激活；ERK1/2抑制；钠离子介导的细胞膜通透；钾离子介导的细胞膜通透。 
还优选的是本文的那些组合物，其进一步包含至少一种另外的可用于治疗选自以下疾病的治疗组合物：癌症；脉管疾病；心血管疾病；心脏疾病；前列腺癌；乳腺癌；成神经细胞瘤；心肌肥大；组织纤维化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注损伤；以及Src相关疾病。 
还优选的是本文的那些化合物，其进一步包含与所述氨基酸化合物在SEQ ID NO:1之外的位点相结合的第二种化合物，其中第二种化合物选自：化疗药物；毒素；免疫应答调节剂；酶；以及放射性同位素。 
在其他广泛的实施方式中，提供了在体外将化合物结合于SH2结构域的方法，包括将本文的化合物与Src的至少一个SH2结构域相接触。优选的方法是将化合物在表达Src的细胞中与Src的SH2结构域相结合，包括将本文的化合物与至少一种表达Src的细胞相接触。更优选的是那些方法，其中表达Src的细胞为哺乳动物细胞，尤其是单核细胞，心脏细胞，肝细胞，脉管细胞；乳腺细胞；前列腺细胞；肾细胞；肌细胞；血细胞；以及脑细胞。优选的是体外和体内方法，尤其是动物模型，具体而言是小鼠和人类。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗Src相关疾病的方法，包括施用本文的治疗组合物。具体而言，优选的是那些方法，其中Src相关疾病选自：癌症；脉管疾病；心血管疾病；心脏疾病；前列腺癌；乳腺癌；成神经细胞瘤；心肌肥大；组织纤维化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注损伤。优选的是用于治疗哺乳动物的方法，尤其是其中哺乳动 物为人类的那些方法。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗癌症的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗脉管疾病的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供在需要这种治疗的哺乳动物中治疗心血管疾病的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗心脏疾病的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗前列腺癌的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗乳腺癌的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗成神经细胞瘤的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗心肌肥大的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗组织纤维化的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗充血性心力衰竭的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了在需要这种治疗的哺乳动物中治疗缺血/再灌注损伤的方法，包括施用本文的Src抑制性治疗组合物。 
还提供了用于在肿瘤细胞中降低增加的基础Src活性的方法，包括向表达Src的肿瘤细胞施用本文的Src抑制性组合物。 
还提供了用于在肿瘤细胞中影响FAK的方法，包括向表达Src的肿瘤细胞施用本文的Src抑制性组合物，尤其是其中的表达Src的细胞为TCN细胞。 
还提供了用于在肿瘤细胞测试模型中降低肿瘤细胞的迁移的方法， 包括向表达Src的肿瘤细胞施用权利要求1的Src抑制性组合物。 
还提供了用于在Na/K ATPase表达降低时杀死癌细胞的方法，包括向具有降低的Na/K ATPase表达的表达Src的肿瘤细胞施用本文的Src抑制性组合物。 
还提供了用于抑制肿瘤细胞系的细胞生长的方法，包括向表达Src的肿瘤细胞系施用本文的Src抑制性组合物，尤其是进一步包括比较本文的组合物抑制肿瘤细胞系的细胞生长的能力与测试化合物抑制相同的肿瘤细胞系的细胞生长的能力。 
还提供了用于抑制前列腺肿瘤系的前列腺肿瘤细胞生长的方法，包括向表达Src的前列腺肿瘤细胞系施用本文的Src抑制性组合物，尤其是进一步包括比较权利要求1的组合物抑制前列腺肿瘤细胞系的前列腺肿瘤细胞生长的能力与测试化合物抑制相同的前列腺肿瘤细胞系的细胞生长能力。 
还提供了用于抑制乳腺肿瘤系的乳腺肿瘤细胞生长的方法，包括向表达Src的乳腺肿瘤细胞系施用本文的Src抑制性组合物，尤其是进一步包括比较权利要求1的组合物抑制乳腺肿瘤细胞系的乳腺肿瘤细胞生长的能力与测试化合物抑制相同的乳腺肿瘤细胞系的细胞生长能力。 
还提供了用于抑制成神经细胞瘤肿瘤细胞系的神经细胞瘤细胞生长的方法，包括向表达Src的成神经细胞瘤肿瘤细胞系施用本文的Src抑制性组合物，尤其是进一步包括比较权利要求1的组合物抑制成神经细胞瘤肿瘤细胞系的成神经细胞瘤肿瘤细胞生长的能力与测试化合物抑制相同的成神经细胞瘤肿瘤细胞系的细胞生长能力。 
还提供了用于筛选至少一种测试组合物以确定所述至少一种组合物是否影响Src的方法，包括：向Src引入测试组合物，其包含具有STNCVEGTAR GIVVY TGD[SEQ ID NO:1]的修饰氨基酸化合物，其中的修饰为至少一种保守性氨基酸置换；以及确定测试组合物是否影响Src。 
优选的是上文描述的方法，其中的影响选自：Src结合；Src抑制；Src刺激；Src功能；Lyn结合；Lyn功能；Lyn抑制；乌本苷拮抗；Na/K-ATPase功能；ERK1/2功能；FAK抑制；通过钠离子的膜通透； 通过钾离子的膜通透。还优选的是如上文的那些方法，其中引入测试组合物是在体外完成的，在至少一种哺乳动物细胞和/或至少一种肿瘤细胞系中完成。还优选的是如上文的那些方法，其中确定组合物是否影响Src是通过与对照比较细胞生长、与对照比较肿瘤生长、与对照比较细胞迁移而测量的，优选地在动物模型中、最优选的是在NOD/SCID小鼠和/或人类中进行。 
还提供的是筛选能够抑制Na/K ATPase的CD2结构域与Src的SH2结构域之间结合的测试组合物的方法，包括步骤：a.将测试组合物与纯化的Src在容器中孵育至少5至45分钟；b.将Na/K ATPase加入容器，孵育至少5分钟至45分钟;c.将乌本苷加入容器，孵育至少1分钟至45分钟；d.将Mg2+/ATP加入容器，孵育至少0.5分钟至45分钟；e.进行western印迹分析以确定Src激活是否受到乌本苷的诱导。优选的方法是其中步骤a和b分别为12-17分钟，步骤c为2-7分钟，步骤d为至少一分钟。 
还提供了筛选能够抑制Na/K ATPase的CD2结构域与Src的SH2结构域之间结合的测试组合物的方法，包括步骤：a.将测试组合物与CD2结构域和SH2结构域的FRET对相接触；以及b.鉴定消除FRET能量的那些组合物，其能够抑制CD2/SH2相互作用。优选的方法是其中用Cy3标记CD2而用Cy5标记SH2，特别是通过在96孔板中孵育，最具体地，FRET能量是使用分光计测量的。 
本领域技术人员在参考附随的图并阅读以下优选实施方式的详细描述后，将清楚本发明的多个方面。 
附图简述 
本专利或申请文件可以包含一个或多个彩色图片及/或一张或多张照片。带有彩色图片及/或照片的本专利或专利申请出版物的副本将由美国专利商标局在收到请求及必要的支付费用时进行提供。 
图1A-1B.Na/K-ATPase和Src之间的相互作用 
图1A:GST下拉（pull-down）分析显示Src和α1亚基的两个结构 域之间的浓度依赖性相互作用。不同构建体的纯化及下拉分析如先前描述的进行。上图显示了代表性的western印迹结果。下图显示了对GST、GST-CD2以及GST-ND1的考马斯亮蓝染色。n=3。 
图1B：Na/K-ATPase/Src相互作用建模。E1和E2Na/K-ATPase的建模是基于SERCA1a结构文件1SU4以及Na/K-ATPase结构文件2zxe，使用SPDBView V3.7程序生成。α1亚基中的A结构域（N末端及CD2）以天蓝色标记，P结构域为绿色，N结构域为红色。Src的SH2结构域标记为紫色，激酶结构域为蓝色。 
图2A-2B.Na/K-ATPase对Src的E1和E2依赖性调控 
图2A和图2B：化学修饰剂对Na/K-ATPase结合的Src的调控。从猪肾纯化Na/K-ATPase，纯化的Src购自Upstate。为稳定以E2P构象的Na/K-ATPase，按所描述的方法用两种不同的氟化物（BeF和AIF）对纯化的Na/K-ATPase进行处理、洗涤并然后与Src一同孵育。将乌本苷处理的及对照的Na/K-ATPase/Src复合物分别用作实验的阳性和阴性对照。类似地，如所描述的方法用NEM/AMPPNP将Na/K-ATPase稳定化在E1P状态，然后进行分析。 
图2C.胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化对Na/K-ATPase介导的Src调控的影响。按所描述的方法对纯化的Na/K-ATPase进行胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化。洗涤经消化的酶并测定Na/K-ATPase活性。将具有低于25%活性的酶制备物与Src在150mM Na+基质中一同孵育，加入或不加10μΜ乌本苷。未消化的酶用作对照。测量Src的活性，并显示了各种实验条件下的代表性western印迹结果。定量数据表示为至少3次独立实验的平均值±S.E.。*，p<0.05；＊＊，p<0.01。 
图3A-3G.不同离子对Na/K-ATPase结合的Src的调控 
图3A、图3B和图3C：Na+和K+对Na/K-ATPase结合Src的影响。将纯化的Na/K-ATPase在不同配体存在下与纯化的Src孵育15min，并测定Tyr418磷酸化情况，如图2。显示了各种实验条件下的代表性western印迹结果。定量数据表示为至少3次独立实验的平均值±S.E.。 
图3D：细胞外K+对LLC-PK1细胞中Src的影响。将细胞暴露于正 常基质(K+5mM)或低K+(K+1mM)基质，然后按所描述的方法对Tyr(P)418Src进行染色。标尺为20μm。 
图3E、图3F和图3G：将细胞暴露于含有不同浓度K+或Na+的基质，然后裂解。如所示的，对细胞裂解物进行Src和ERK的western印迹分析。定量数据表示为至少3次独立实验的平均值±S.E.。*，p<0.05；**，p<0.01。 
图4.CD2C2肽作为潜在的乌本苷拮抗剂 
将CD2C2肽与纯化的Src在PBS溶液中孵育15分钟（所用量表示为Src/Cd2C2的摩尔比）。加入从猪肾纯化的Na/K ATPase，15分钟。此后，将乌本苷加入反应体系，5分钟，随后加入2mM Mg2+/ATP。Src活性通过western印迹而确定，其中使用抗-磷酸化Tyr418。显示了代表性的western印迹，定量数据表示为至少3次独立实验的平均值±S.E.。**，p<0.01。 
图5.YFP和YFP-CD2稳定细胞系的建立 
在克隆YFP Ctrl及CD2-2细胞系中显示YFP和YFP-CD2的表达。CD2来自猪的Na/K ATPase(Swiss Prot ID P05024)氨基酸——152-288（细胞质结构域2）。 
图6.CD2的表达对细胞生长的影响 
对照细胞系（LLC YFP和YFP Ctrl）以及YFP-CD2克隆（CD2-1、CD2-2和CD2-5）。将20,000个细胞铺板于12孔板并在24、48、72和96小时进行台盼蓝染色，使用血球计数仪对细胞数量进行计数。对数据进行作图，如上文所示（3次独立实验的组合，n=3）。 
图7.CD2C2肽作为新型的乌本苷拮抗剂 
图7A，CD2C2肽减弱了CD2对Src的结合。以所示的浓度,将CD2C2加入Src和GST-CD2的混合物。对下拉产物中的Src以抗-Src抗体进行western印迹分析。 
图7B，CD2C2对乌本苷诱导的Src激活的拮抗。将Src与所示量的CD2C2肽在PBS中预孵育15分钟。然后加入从猪肾纯化的Na/K-ATPase，15分钟。向混合物加入1μΜ乌本苷，5分钟。然后在2 mM ATP/Mg2+的存在下，检测Src的自磷酸化情况。显示了三次独立实验的代表性杂交结果。 
发明详述 
Na/K-ATPase在离子泵循环中经历了E1/E2构象转变。大量的细胞Na/K-ATPase也通过两对结构域与Src激酶相互作用。尽管Na/K-ATPase驱动子结构域结合Src SH2结构域的亲和力高于核苷酸结合结构域与Src激酶结构域之间的亲和力，后者的结合保持了Src处于失活状态。E1Na/K-ATPase可同时结合SH2及激酶结构域，并且E1到E2的转变会释放激酶结构域，导致Na/K-ATPase结合的Src的激活。事实上，本发明人使用纯化的酶制备物证明了Src的此种构象依赖的调节。与此一致，增加E2Na/K-ATPase形成的细胞条件在活细胞中刺激了细胞的Src活性及下游的蛋白质激酶级联。总之，这些发现现在显示了之前未认识到的信号传导机制，其可将Na/K-ATPase构象状态的变化与细胞内蛋白质激酶级联的激活/抑制相偶联。 
基于Na/K-ATPase的晶体结构，CD2组成了驱动子结构域（A）的一部分。如图1A中说明的，A和SH2结构域之间的相互作用显示的亲和力比N结构域/激酶结构域相互作用更高。此外，本发明人的体外结合数据表明Na/K-ATPase在没有乌本苷的存在下很可能与SH2以及激酶结构域同时相互作用。在泵循环中，Na/K-ATPase经历了E1到E2的构象转变，其中N结构域关闭，而A结构域翻转靠在N和P结构域上。结构模型表明A和N结构域在E2状态中的定位及它们之间的空间不大可能允许α亚基同时结合SH2及激酶结构域（图1B）。 
因为Src的结合甚至在摩尔比1:1时都未对Na/K-ATPase活性显示出显著的影响（图5），本发明人如今相信Na/K-ATPase可能对Src发挥了构象依赖性的调控。具体地，如图1B中所说明的，当E1Na/K-ATPase抑制Src时，E2Na/K-ATPase会释放激酶结构域，导致Na/K-ATPase结合的Src的激活。A结构域的翻转可能在Na/K-ATPase的E1到E2的转变过程中对将激酶结构域推下移动的N结构域是足够并必要的，导致 Src的激活。 
本发明人使用了不同的化学修饰剂来稳定化不同构象状态的Na/K-ATPase，然后评估Na/K-ATPase对Src的构象依赖性影响。氟化物如氟化铝和氟化铍能作为磷酸类似物与Na/K-ATPase相互作用，并稳定化该酶以及其他P型ATPase的E2P构象。因此，为了证明E2Na/K-ATPase对Src活性的刺激作用，本发明人制备了A1F-和BeF-Na/K-ATPase并测量其对Src的影响。 
如图2A中所描述的，与乌本苷一样，用氟化铝或氟化铍对Na/K-ATPase的处理足以刺激Na/K-ATPase结合的Src。在另一方面，当N-乙基顺丁烯二酰亚胺（NEM）及可慢性水解的ATP类似物腺苷-5’-基亚氨二磷酸盐（AMP-PNP）将Na/K-ATPase稳定化在E1P状态时，Na/K-ATPase结合的Src受到完全的抑制（图2B）。作为对照，本发明人还评估了这些化学修饰剂是否对Src有直接的影响。在相同实验条件下未观察到显著的影响（数据未显示）。 
在催化循环中Na/K-ATPase的E1和E2构象的存在首先被检测为Na+或K+基质中蛋白质水解性裂解的不同形式。在Na+的存在下，胰凝乳蛋白酶在A结构域的Leu-266处裂解E1Na/K-ATPase，产生83kDa的片段。而所述83kDa肽保留了形成磷酸酶中间物（EP）的能力，胰凝乳蛋白酶的裂解破坏了A和N结构域的协调运动，导致ATPase活性受到完全抑制。因此，如果A和N结构域的协调运动对于Na/K-ATPase结合的Src的构象依赖性激活是必须的，如图1B所示，则A结构域不能将Src激酶结构域从N结构域推下会导致Src的完全抑制。 
事实上，如图2C中所描述的，尽管Na+（1号泳道）和乌本苷（2号泳道）能够刺激Na/K-ATPase结合的Src，但它们在Na/K-ATPase受到胰凝乳蛋白酶消化后在Na+的存在下不能如此。为进一步确定A和N结构域的协调运动的重要性，E2Na/K-ATPase在K+存在下受到胰蛋白酶的消化，经过洗涤，然后进行相同的测定。不像胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶在N结构域的Arg-438处裂解E2Na/K-ATPase，产生48kDa的片段，其保留了形成EP的能力。然而，像胰凝乳蛋白酶一样，胰蛋白酶 造成的A和N结构域协调运动的破坏在抑制Na+和乌本苷诱导的Src激活上同等有效。 
以上的体外研究表明Na/K-ATPase能够通过E2/E1构象转变中的A和N结构域协调运动开启/关闭Src。为确认上述发现并评估此种对Na/K-ATPase结合的Src的构象依赖性调控的生理学相关性，本发明人将纯化的Na/K-ATPase/Src复合物在已知能改变E1/E2Na/K-ATPase形成的不同离子存在下进行孵育。与胆碱相比，Na+更能够将E2构象转变为E1。因此，向反应缓冲液中加入150mM Na+引起了Src的部分抑制（图3A）。此外，在Na+和K+二者的存在下，加入ATP-Mg2+会有助于E1Na/K-ATPase的形成并产生Src的进一步抑制（图3B）。然而，从此反应缓冲液中移除Na+会增加E2Na/K-ATPase的形成。与此一致，其刺激了Na/K-ATPase结合的Src（图3B）。生理学上，将细胞Na/K-ATPase与大约15mM Na+细胞内地和5mM K+细胞外地接触。在这些离子条件下，本发明人发现Na/K-ATPase结合的Src中大部分是失活的。将K+从5mM降低至1mM产生了对Na/K-ATPase结合的Src的强烈刺激（图3C）。总而言之，这些发现如今显示了Na/K-ATPase结合的Src可受到底物诱导的构象变化的调控。 
上文显示了Na/K-ATPase可通过底物诱导的E1/E2转变控制Src活性。因为E1/E2Na/K-ATPase在活细胞中的平衡可受到细胞外K+和细胞内Na+的调控，为进一步发现该E1/E2介导的Src调控的生理学重要性，本发明人在细胞与不同浓度细胞外K+接触后测量LLC-PK1细胞中Src活性。降低细胞外K+会在活细胞减慢E2P的去磷酸化并累积E2Na/K-ATPase。 
如图3D中所描述的，共聚焦成像分析显示了将细胞外K+从5mM降低至1mM显著增加了LLC-PK1细胞中活性Src的细胞含量，这与图3C中描述的发现相一致。为确认这些发现，本发明人还于正常或低K+基质中孵育细胞后对细胞裂解物进行western印迹分析。如图3E所示，将K+从5mM降低至1mM如加入乌本苷一样，不仅刺激细胞的Src活性，还刺激了ERK的下游激酶信号通路。 
为确认Na/K-ATPase/Src复合物是LLC-PK1细胞中低K+诱导的信号转导的受体，本发明人在Na/K-ATPase敲除的PY-17细胞中重复了上述实验。PY-17细胞来自转染了表达α1特异性siRNA的质粒的LLC-PK1细胞。与P-11细胞相比，PY-17细胞表达大约10%的α1并具有降低数量的Na/K-ATPase/Src复合物。 
如图3F所示，将细胞外K+从5mM降低至1mM不能增加PY-17细胞中的细胞Src活性，说明Na/K-ATPase/Src复合物的形成对低K+刺激细胞Src活性是必须的。此观念进一步得到如下事实的支持：通过敲入大鼠α1来修复PY-17细胞足以重建低K+诱导的Src激活。 
为进一步确认对Na/K-ATPase/Src复合物的离子诱导调控，本发明人还将细胞暴露于低的细胞外Na+。降低细胞外Na+有助于活细胞中E1Na/K-ATPase的形成。与此一致，本发明人观察到将Na+从150mM降低至15mM引起细胞Src活性的进一步抑制，如图3G中所描述的。 
这些发现如今显示了Na/K-ATPase/Src复合物的形成不仅使细胞外乌本苷，还使得泵底物调控Src和Src效应子。值得注意的是此新型细胞信号传导机制的数种独特的特性。 
此受体复合物的形成涉及一对独特的结构域相互作用。具体地，Na/K-ATPase的A和N结构域都参与与Src激酶的相互作用使得E2/E1Na/K-ATPase可能开启/关闭Src的转导活性。 
而且，E1/E2构象介导的信号传导机制表明Na/K-ATPase/Src复合物可起到Na/K-ATPase的细胞外和细胞内配体的受体功能。 
此外，受体Na/K-ATPase/Src复合物的离子介导调控还可以作为细胞以此协调穿过质膜的泵动及渗漏活性的主要机制，因为蛋白质激酶的激活/抑制对于调控许多膜运输子的活性和转运都至关重要。例如，低血钾在完好的动物中激活Src。此外，这种激活似乎造成了肾上皮细胞中ROMK的表面表达减少，有助于在K+限制条件下肾对K+的保留。 
最后，除了其底物之外，许多膜及结构蛋白质以及脂类与Na/K-ATPase相互作用并调控E1/E2Na/K-ATPase的形成。例如，γ亚基增加E1-Na/K-ATPase的形成。此外，数种天然发生的突变体将泵稳 定化在E1状态。因此，Na/K-ATPase/Src受体复合物的正常运作可为细胞提供感受细胞外和细胞内信号的重要机制，因此协调多种细胞过程。 
这些研究显示了Na/K ATPase和Src的结合涉及两对相互作用：一对是ATPase第二细胞质结构域（CD2）和Src SH2结构域之间。另一对是在ATPase核苷酸结合结构域（N结构域）和Src激酶结构域之间。两个结合对的同时结合保持Src失活，而乌本苷刺激可破坏后面的结合对并将Src激酶从N结构域释放，触发Src激活。衍生自N结构域的NaKtide显示了对Src活性的强烈抑制，其通过干扰激酶结构域构象进行所述抑制。 
然而，来自CD2结构域的新肽（氨基酸序列：STNCV EGTAR GIVVY TGD[SEQ ID NO:1]）破坏了ATPase CD2/Src SH2结构域的相互作用并消除了乌本苷诱导的Src刺激。因此，这些肽作为特异性的乌本苷拮抗剂更具有优势，其自身较少干扰细胞Src激酶活性。然而，这些组合物的组合也同样有益。 
本发明还提供了测定法，用于筛选竞争性抑制CD2和SH2之间结合并拮抗乌本苷刺激的新化学物。 
实施例： 
实施例1.CD2方法
本发明人显示Na/K-ATPase通过两个结构域结合Src。Na/K-ATPase的核苷酸结合结构域与Src激酶结构域之间的相互作用抑制了Src活性，而Na/K-ATPase的α亚基的第二细胞质结构域（CD2）和Src SH2SH3结构域之间的相互作用对受体Na/K-ATPase/Src复合物的形成起重要作用。为进一步测试后者相互作用的重要性，本发明人产生了表达YFP融合的CD2的稳定细胞系。图5显示了YFP和YFP-CD2在本发明人建立的两种稳定细胞系的表达。CD2的序列列于图例中。如图6中描述的，YFP-CD2的表达在功能上引起细胞生长的显著抑制，表明CD2在受体Na/K-ATPase形成中并因此也在细胞生长的调控中起重要作用。 
结构建模表明结合基序很可能在CD2的C末端。为支持这种观点， 本发明人检查了衍生自CD2的C末端的肽是否能够减弱CD2和Src之间的结合。将纯化的GST-CD2与Src在加入或不加肽时孵育15min。对下拉的沉淀用针对Src的抗体进行western印迹。如图7A所示，肽CD2C2能够竞争并阻断GST-CD2对Src SH2结构域的结合，而CD2C1不能。如果CD2C2肽破坏了SH2/CD2相互作用，本发明人预期CD2C2可能消除CTS诱导的Src激活。为对此进行测试，本发明人将Src与所示量的CD2肽在PBS中预孵育15min。然后加入纯化的猪肾Na/K-ATPase，15min。将1μΜ乌本苷加入混合物，5min。然后在2mM ATP/Mg2+存在下，检测Src自身磷酸化情况。如图7B所示，向纯化的Na/K-ATPase和Src的混合物中添加CD2C2以剂量依赖的形式消除了乌本苷诱导的Src激活，而不是CD2C1。因此，为寻找新的拮抗剂，本发明人进行以下四组实验。 
首先，本发明人会采用基于结构的方法寻找CD2C2模拟物。本发明人合成更小的肽并评估其作为CTS拮抗剂的潜能。CD2C2衍生物的结构信息将根据可得的Na/K-ATPase 3D结构（PDB ID:2ZXE）而产生。然后，使用DOCK程序搜索超过400,000种小分子的NCI 3D结构数据库。从NCI申请候选化合物。评估其作为CTS拮抗剂的活性。第二，本发明人开发使用ELISA的形式高通量测定法，搜索化学物库以寻找阻断乌本苷诱导的Src激活的化合物。第三，建立基于FRET测定法以确认拮抗剂（上述研究中的阳性命中）是否靶向CD2/SH2。简言之，表达并纯化CD2和His-SH2SH3。通过靶向存在于CD2和SH2中的可及的半胱氨酸残基，用FRET荧光素对纯化的蛋白质进行化学标记。为确认FRET测定，本发明人测试例如488-CD2和568-SH2SH3之间的FRET效率，并评估所述CD2C2肽能否降低FRED效率。CD2C1用作阴性对照。不用说，如果阳性命中的数量有限，本发明人简单地使用如图7A中的下拉测定法测试这些化合物对CD2/SH2相互作用的影响。第四，因为阳性命中还可以为Src抑制剂或靶向Src激酶结构域/N结构域相互作用或阻止乌本苷对受体Na/k-ATPase的结合，本发明人测试这些化合物不影响CD2和SH2结构域之间相互作用的可能性。 
实施例2.
本发明人将测试化学物与商业可得的纯化的Src在PBS溶液中孵育15分钟。然后，加入纯化的猪肾Na/KATPase，15分钟。此后，将乌本苷加入反应体系，5分钟，随后加入2mM Mg2+/ATP。通过使用抗-磷酸化的Tyr418杂交的western印迹确定Src活性。将乌本苷处理的Na/KATPase/Src复合物用作阳性对照。如果能在乌本苷诱导的条件下抑制Src激活，则鉴定为潜在的乌本苷拮抗剂。为进一步确定对CD2/SH2之间的结合的特异性抑制，设计了CD2和SH2的FRET对。用Cy3标记CD2，而用Cy5标记SH2。两种肽都在96孔板中孵育，使用分光计测量FRET能量转移。将消除了FRET能量转移的化学物鉴定为乌本苷拮抗剂/CD2/SH2相互作用的抑制剂。这些一般为强心类固醇拮抗剂。 
虽然本发明的描述中参考了多种的及优选的实施方式，然而本领域技术人员应当理解的是可以做出多种变化，而且等价物可以置换其中的成分而不偏离本发明的本质范围。此外，可作出许多修饰以使具体的情况或材料能适合于本发明的教导，而不偏离其本质范围。 
因此，不旨在将本发明限制在本文公开的用于实行本发明的具体实施方式中，而是本发明包括所有符合权利要求范围的实施方式。 
本文用来阐明本发明或提供关于本发明时间的其他细节的出版物和其他材料通过引用并入本文，简便起见，将其在下文的参考目录中提供。本文提到的任何文档的引用不旨在认可前述的任何项为相关的现有技术。关于这些文档日期的所有陈述或对其内容的表示都是基于申请人可得的信息，不包含任何对这些文档的日期或内容正确性的认可。 

Claims (2)

1.包含氨基酸化合物的实体组合物，所述氨基酸化合物由序列STNCV EGTAR GIVVY TGD[SEQ ID NO:1]组成，其中所述化合物能够结合Src的SH2结构域。
2.权利要求1的组合物，其进一步包含治疗可接受的佐剂。
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