ES2868354T3 - Péptido Naktide para el tratamiento de la obesidad - Google Patents

Abstract

Antagonista polipeptídico de un complejo receptor de Na/K ATPasa/Src para su utilización en un procedimiento de tratamiento de la obesidad, en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido Naktide para el tratamiento de la obesidad

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a procedimientos para el tratamiento de la obesidad. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para el tratamiento de la obesidad que utilizan un polipéptido que inhibe la función receptora del complejo de Na/K ATPasa y Src.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El número de personas con sobrepeso en todo el mundo ha aumentado notablemente, lo que ha provocado un aumento de los problemas de salud relacionados con la obesidad y la morbilidad y mortalidad asociadas. El estrés oxidativo en el tejido adiposo es un mecanismo patogénico importante que conduce al mantenimiento del síndrome metabólico asociado al fenotipo de obesidad. Recientemente, se ha observado que el desarrollo de la obesidad puede verse afectado notablemente por la manipulación del estado redox sistémico o del estado redox de los adipocitos solos. Específicamente, la manipulación del estado redox de los adipocitos mediante la transfección dirigida de genes antioxidantes a adipocitos altera su fenotipo y reduce las reservas de grasa corporal total y mejora las anomalías metabólicas.

La adipogénesis disfuncional es, de hecho, una de las características distintivas de la obesidad crónica y se caracteriza por una mayor acumulación de lípidos y una función endocrina alterada del tejido adiposo. El receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (PPARy, del inglés peroxisome proliferator - activated receptor gamma) es un regulador maestro de la adipogénesis y activa la expresión de genes, tales como la sintasa de ácidos grasos (FAS, del inglés fatty acid synthase), para desencadenar la síntesis de ácidos grasos y triglicéridos. El transcrito específico de mesodermo, (MEST, del inglés mesoderm specific transcript), cuando se regula al alza, da como resultado el agrandamiento de los adipocitos durante la expansión del tejido adiposo, que está asociado con una mayor liberación de adipocitocinas inflamatorias y una mayor resistencia a la insulina. El tejido adiposo regula el metabolismo energético mediante la secreción de factores solubles, tales como la adiponectina y el factor de necrosis tumoral a (TNFa, del inglés tumoral necrosis factor a). La producción no regulada de estas adipocitocinas participa en la patogenia del síndrome metabólico asociado a la obesidad.

Por consiguiente, serían muy deseables y beneficiosos composiciones y procedimientos para el tratamiento de la obesidad, que incluyan las composiciones y los procedimientos que tratan las causas subyacentes de la obesidad.

CARACTERÍSTICAS

El objeto dado a conocer en la presente invención satisface algunas o todas las necesidades identificadas anteriormente, como resultará evidente para los expertos en la materia después de un estudio de la información dada a conocer en la presente memoria descriptiva.

El presente resumen describe varias realizaciones del objeto dado a conocer en la presente invención y, en muchos casos, enumera variaciones y permutaciones de estas realizaciones. Este resumen es simplemente un ejemplo de las numerosas y variadas realizaciones. La mención de una o más características representativas de una realización dada es igualmente de ejemplo.

La presente invención da a conocer un antagonista polipeptídico de un complejo receptor de Na/K ATPasa/Src para su utilización en un procedimiento de tratamiento de la obesidad, en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional de la misma. En algunas realizaciones, el antagonista polipeptídico incluye además un polipéptido de penetración celular codificado por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-3. En algunas realizaciones, la etapa de administración incluye administración oral, administración transdérmica, administración por inhalación, administración nasal, administración tópica, administración intraaural, administración rectal, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea y/o administración intravítrea.

La administración del antagonista polipeptídico (por ejemplo, el polipéptido de la SEQ ID NO: 1) puede reducir uno o más síntomas y/o características asociados con la obesidad. Por ejemplo, la administración del antagonista polipeptídico puede disminuir la acumulación de lípidos en una célula del individuo. La administración del antagonista polipeptídico puede disminuir una cantidad de adipogénesis, disminuir una cantidad de diferenciación de adipocitos y/o aumentar una cantidad de adipocitos pequeños. Además, en algunas realizaciones, la administración del antagonista polipeptídico disminuye una cantidad de citocinas inflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral a (TNFa). En otras realizaciones, la administración del polipéptido aumenta una cantidad de adiponectina y/o reduce un nivel de expresión de un marcador adipogénico, tal como FAS, MEST y PPARy.

Además, en algunas realizaciones del objeto dado a conocer en la presente invención, se da a conocer un antagonista polipeptídico de un complejo receptor de Na/K ATPasa/Src para su utilización en un procedimiento para reducir la adiposidad en pacientes obesos, en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID. NO: 1, o un fragmento funcional de la misma. La administración del polipéptido puede reducir una cantidad de grasa visceral y/o una cantidad de grasa subcutánea en el individuo.

Se da a conocer adicionalmente, en algunas realizaciones del objeto dado a conocer en la presente invención, un antagonista polipeptídico de un complejo receptor de Na/K ATPasa/Src para su utilización en la reducción de la adipogénesis en pacientes obesos, en el que el antagonista polipeptídico se debe poner en contacto con una célula y en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional de la misma. En algunas realizaciones, la célula es un preadipocito.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A-1D incluyen imágenes y gráficos que muestran el efecto del aumento de las concentraciones de pNaKtide sobre la adipogénesis en preadipocitos de ratón. La adipogénesis se midió como la absorbancia relativa de Rojo Aceite O el 7° día después de inducir la adipogénesis. La figura 1A muestra imágenes representativas de los preadipocitos de ratón. La figura 1B es un gráfico que muestra datos cuantitativos de la tinción con rojo aceite expresados como promedios ± EE, n = 7, *p<0,05 frente al control. Las figuras 1C-1D incluyen gráficos que muestran aumentos dependientes de la dosis en gotitas de lípidos pequeñas y disminuciones dependientes de la dosis en gotitas de lípidos grandes después de la administración de pNaKtide.

Las figuras 2A-2D incluyen imágenes y gráficos que muestran que el pNaKtide aumentó los niveles de adiponectina y disminuyó los marcadores adipogénicos en los adipocitos 3T3L1, incluyendo: (figura 2A) una imagen y un gráfico que muestran los niveles de adiponectina determinados en medios acondicionados obtenidos a partir de células 3T3L1 después de tratar con pNaKtide durante 7 días, en los que las células se trataron con concentraciones variables de pNaKtide y se determinó que 0,7 /M de pNaKtide era la concentración óptima para aumentar los niveles de adiponectina (los resultados son promedios ± EE, n = 4, *p<0,05 frente al control); y gráficos que muestran la expresión de FAS (figura 2B), MEST (figura 2C) y PPARy (figura 2D) según se determina mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western en células 3T3L1 después de tratar con pNaKtide (0,7 /M ) durante 7 días, en las que se determinó la evaluación densitométrica cuantitativa de la proporción de proteínas (los datos se expresan como promedios ± EE, n = 6, *p<0,05 frente al control).

La figura 3 incluye imágenes y un gráfico que muestra el efecto de dosis crecientes de pNaKtide sobre el peso corporal en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, en los que ratones C57B16 a los que se habían inyectado dosis de 1 mg/kg y 5 mg/kg de peso corporal de pNaKtide, respectivamente, no tuvieron una reducción significativa en el peso corporal en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, en los que la administración de 25 mg/kg de peso corporal de pNaKtide cada 8 días en ratones alimentados con una dieta rica en grasas durante 8 semanas redujo significativamente el peso corporal en comparación con animales alimentados con dieta la rica en grasas, y en los que no hubo cambios significativos en la ingesta de alimentos entre los grupos (los resultados son promedios ± EE, n = 7-14/grupo, *p<0,05 frente al control, # frente a la dieta rica en grasas (HF, del inglés high fat)). Las figuras 4A-4B incluyen imágenes y gráficos que muestran el efecto de dosis crecientes de pNaKtide sobre el contenido de grasa visceral y subcutánea en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, en los que se inyectó a ratones C57B16 dosis de pNaKtide de 1 mg/kg, 5 mg/kg y 25 mg/kg de peso corporal cada 8 días respectivamente a ratones alimentados con una dieta rica en grasas durante 8 semanas, y en los que la administración de 25 mg/kg de peso corporal de pNaKtide en ratones alimentados con una dieta rica en grasas redujo significativamente el contenido de grasa visceral (figura 4A) y subcutánea (figura 4B) en comparación con animales alimentados con una dieta rica en grasas (los resultados son promedios ± EE, n = 7-14/grupo, *p<0,05 frente a control, # frente a HF). Las figuras 5A-5C incluyen imágenes y gráficos que muestran el efecto de dosis crecientes de pNaKtide sobre los marcadores adipogénicos y la expresión de adiponectina en tejido adiposo visceral en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, incluyendo: inmunotransferencia de tipo Western y análisis de densitometría de marcadores adipogénicos en tejido adiposo visceral FAS (figura 5A) y MEST (figura 5B) (los resultados son promedios ± EE, n = 7/grupo, *p<0,05 frente a control, # frente a HF; los datos se muestran como densidad de banda promedio normalizada respecto a p-actina); y (figura 5C) análisis de densitometría e inmunotransferencia de tipo Western de la expresión de adiponectina (los resultados son promedios ± EE, n = 7/grupo, *p<0,05 frente a control, # frente a HF; los datos se muestran como densidad de banda promedio normalizada respecto a p-actina).

Las figuras 6A-6G incluyen gráficos e imágenes que muestran el efecto de dosis crecientes de pNaKtide sobre el perfil metabólico en ratones alimentados con una dieta rica en grasas. Estas figuras incluyen gráficos que muestran: HOMA-IR (figura 6A); ensayo de tolerancia a la glucosa (figura 6B); sustancia reactiva con ácido tiobarbitúrico (TBARS, del inglés thiobarbituric acid reactive substance) (figura 6C), un marcador de lesión oxidativa que se midió en tejido adiposo visceral; y niveles de adiponectina en plasma (figura 6D), en los que los resultados son promedios ± EE, n = 7-14/grupo, *p<0,05 frente a control, # frente a HF. Se incluyen además gráficos que muestran el efecto de pNaKtide en tejido graso en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, incluyendo gráficos que muestran: carbonilación de proteínas (figura 6E), fosforilación de c-Src (figura 6F); y fosforilación de ERK1/2 (figura 6G), en los que los resultados son promedios ± EE, n = 4-7/grupo, **p<0,01 frente a control (CTR), # p<0,01 frente a dieta rica en grasas (HF).

DESCRIPCIÓN BREVE DEL LISTADO DE SECUENCIAS

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos de una realización de un polipéptido, según el objeto dado a conocer en la presente invención (NaKtide);

La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos que codifica un péptido de penetración celular TAT;

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos que codifica un péptido de penetración celular de penetratina (AP); y

La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos que codifica el dominio de polilisina N-terminal de la subunidad a1 de Na/K-ATPasa (AIN); y

La SEQ ID NO: 5 es otra secuencia de aminoácidos de una realización de un polipéptido, según el objeto dado a conocer en la presente invención (pNaKtide).

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES DE EJEMPLO

En la presente memoria descriptiva se exponen los detalles de una o más realizaciones del objeto dado a conocer en la presente invención. Las modificaciones de las realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva, y otras realizaciones, serán evidentes para los expertos en la materia después de un estudio de la información dada a conocer en la presente memoria descriptiva. La información dada a conocer en la presente memoria descriptiva, y en particular los detalles específicos de las realizaciones de ejemplo descritas, se da a conocer principalmente para claridad de comprensión.

Si bien se cree que los términos utilizados en la presente memoria descriptiva son bien entendidos por un experto en la materia, se establecen definiciones para facilitar la explicación del objeto dado a conocer en la presente invención. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que el entendido de manera común por un experto en la materia a la que pertenece el objeto dado a conocer en la presente invención. Aunque se pueden utilizar muchos procedimientos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria descriptiva en la práctica o ensayo del objeto dado a conocer en la presente invención, se describen ahora procedimientos, dispositivos y materiales representativos.

Además, siguiendo una convención de derecho de patentes largamente establecida, los términos "un", "una" y "el/la" se refieren a "uno o más" cuando se utilizan en la presente solicitud, incluidas las reivindicaciones. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una pluralidad de dichos polipéptidos, etc. A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como condiciones de reacción, etc., utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones se deben entender como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretendan obtener mediante el objeto dado a conocer en la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor o a una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración o porcentaje, pretende abarcar variaciones en algunas realizaciones del ±20 %, en algunas realizaciones del ±10 %, en algunas realizaciones del ±5 %, en algunas realizaciones del ±1 %, en algunas realizaciones del ±0,5 % y en algunas realizaciones del ±0,1 % de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar el procedimiento dado a conocer. También se entiende que hay una serie de valores dados a conocer en la presente memoria descriptiva, y que cada valor también se da a conocer en la presente memoria descriptiva como "aproximadamente" ese valor particular además del valor en sí. Por ejemplo, si se da a conocer el valor "10", entonces también se da a conocer "aproximadamente, 10". Además, se entiende que se da a conocer también cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se dan a conocer 10 y 15, también se dan a conocer 11, 12, 13 y 14.

El objeto dado a conocer en la presente invención incluye un polipéptido que inhibe la función receptora del complejo de Na/K-ATPasa y Src para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de la obesidad, en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma.

La Na/K-ATPasa es un miembro de la ATPasa de tipo P. Reside en la membrana plasmática y transporta iones Na+ y K+ a través de la membrana celular hidrolizando ATP. La Na/K-ATPasa funcional comprende las subunidades a y P, y se han identificado varias isoformas para cada subunidad. Se ha observado que, además de la función de bombeo de iones, la subunidad a1 también cumple una función estructural con la cinasa relacionada con el sarcoma (Src, del inglés sarcoma related kinase), lo que permite que los cambios conformacionales en la Na/K-ATPasa afecten una cascada de señalización. Se ha identificado una secuencia polipeptídica antagonista del dominio de unión a nucleótidos (N) de esa subunidad a, que se une al dominio cinasa de Src, inhibiendo tónicamente su función. Sin embargo, cuando la conformación de la subunidad a1 cambia por la unión de esteroides cardiotónicos, esta inhibición puede liberarse, dando como resultado la activación de la Src. Por lo tanto, la Na/K-ATPasa controla la señalización mediante la regulación de Src con modulación aguas abajo del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR, del inglés epithelial growth factor recepto/) y, en última instancia, de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés reactive oxygen species). Además, se ha observado además que la subunidad a1 de la Na/K-ATPasa también puede actuar como un receptor para algunas ROS y potencialmente servir como un amplificador de proalimentación. A este respecto, se ha diseñado previamente un NaKtide que permea las células (pNaKtide) y se ha descubierto que inhibe específicamente la activación de Src inducida por esteroides cardiotónicos. Sin embargo, ahora se ha descubierto que, sorprendentemente, pNaKtide puede atenuar significativamente la amplificación de ROS modulada por Na/K-ATPasa dentro del adipocito y atenuar el desarrollo de adiposidad y un fenotipo de obesidad. Más particularmente, se ha observado que el pNaKtide atenúa el estrés oxidativo y la acumulación de lípidos de una manera dependiente de la dosis, reduce el aumento de peso corporal y mejora la sensibilidad a la insulina.

El término "obesidad", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere a condiciones en las que el exceso de grasa corporal se ha acumulado en la medida en que puede tener un efecto negativo sobre la salud, lo que, a su vez, puede conducir a una reducción de la esperanza de vida y/o mayores problemas de salud. En determinados casos, un individuo puede considerarse obeso cuando su índice de masa corporal (IMC), una medida obtenida al dividir el peso de un individuo por el cuadrado de la altura de la persona es mayor que 20 kg/m2, 21 kg/m2, 22 kg/m2, 23 kg/m2, 24 kg/m2, 25 kg/m2, 26 kg/m2, 27 kg/m2, 28 kg/m2, 29 kg/m2 o 30 kg/m2. La obesidad también puede coincidir con afecciones tales como, sin constituir limitación, hiperinsulinemia, resistencia a la insulina, diabetes, hipertensión y dislipidemia. Además, la obesidad puede ser un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular. En algunos casos, la obesidad también se puede caracterizar por uno o más de los siguientes factores, niveles de glucosa en ayunas de, como mínimo, 100 mg/dl, niveles plasmáticos de triglicéridos de, como mínimo, 150 mg/dl, colesterol H^dL por debajo de 40 mg/dl en hombres y por debajo de 50 mg/dl en mujeres, presión arterial de, como mínimo, 130/85 mm Hg y circunferencia de la cintura abdominal mayor de 40 pulgadas (101,6 cm) para hombres y mayor de 35 pulgadas (89 cm) para mujeres.

Los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido" se utilizan indistintamente en la presente memoria descriptiva para referirse a un polímero de aminoácidos independientemente de su tamaño o función. Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se utilizan indistintamente en la presente memoria descriptiva para referirse también a un producto génico, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos, cualquier péptido (fragmento) derivado de proteasa y otros equivalentes, variantes y análogos de un polímero de aminoácidos.

Los polipéptidos están compuestos por la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (SATWLALSRIAGLCNRAVFQ; NaKtide), o fragmentos funcionales de la misma. Los términos "fragmento de polipéptido" o "fragmento" cuando se utilizan en referencia a dicho polipéptido, se refieren a un polipéptido en el que los residuos de aminoácidos se delecionan en comparación con el polipéptido de referencia en sí, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es habitualmente idéntica a las posiciones correspondientes en el polipéptido de referencia. Estas deleciones pueden tener lugar en el extremo amino del polipéptido de referencia, en el extremo carboxilo del polipéptido de referencia o en ambos. Los fragmentos de polipéptidos incluyen "fragmentos funcionales", en los que el fragmento conserva parte o toda la actividad del polipéptido de referencia.

Los polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva pueden incluir polipéptidos que comparten, como mínimo, un 75 % de homología con el polipéptido NaKtide de la SEQ ID NO: 1. Los polipéptidos pueden compartir, como mínimo, un 85 % de homología con el polipéptido NaKtide de la SEQ ID NO: 1. Los polipéptidos pueden compartir, como mínimo, un 90 % de homología con el polipéptido NaKtide de la SEQ ID NO: 1. Los polipéptidos pueden compartir, como mínimo, un 95 % de homología con el polipéptido NaKtide de la SEQ ID NO: 1.

En la presente memoria descriptiva, cuando se utiliza "porcentaje de identidad" u "porcentaje de homología" para describir una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico, con respecto a una secuencia de referencia, se puede determinar utilizando la fórmula dada a conocer por Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, modificada como en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Dicha fórmula se incorpora en los programas de la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, del inglés basic local alignment search tool) de Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). [Las búsquedas de nucleótidos BLAST se realizan con el programa NBLAST, puntuación 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se realizan con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a un polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: X). Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se utiliza Gapped BLAST, tal como se da a conocer en Altschul, et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). A este respecto, se hace referencia a la versión más reciente de los programas que se encuentran disponibles a 19 de julio de 2012.

Los polipéptidos pueden comprender además una o más secuencias líder, y entre las secuencias líder se pueden incluir, sin constituir limitación, péptidos de penetración celular (CPP, del inglés cell penetrating peptides). En la presente memoria descriptiva la expresión "péptido de penetración celular" (CPP) se utiliza para referirse generalmente a péptidos cortos que ayudan o que pueden ayudar a facilitar el transporte de carga molecular a través de las membranas plasmáticas que se encuentran en una célula. En algunos casos, la carga molecular incluye otro polipéptido, tal como los polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva. Por supuesto, los péptidos de penetración celular se pueden conjugar con la carga molecular (por ejemplo, polipéptido) a través de cualquier número de medios, entre los que se incluyen enlaces covalentes y/o enlaces no covalentes. En varios casos, sin embargo, estos péptidos de penetración celular a menudo incluirán una concentración relativamente elevada de aminoácidos cargados positivamente, tales como lisina y arginina, y tendrán una secuencia que contiene un patrón alterno de aminoácidos cargados (polares) y no cargados.

Una secuencia líder o péptido de penetración celular de ejemplo puede incluir el péptido de penetración celular activador transcripcional transactivador (TAT, del inglés trans-activating transcriptional activator), que está representado por la secuencia de la SEQ ID NO: 2 (GRKKRRQRRRPPQ). Otro secuencia líder de ejemplo incluye penetratina (Ap), que está representada por la secuencia de la SEQ ID NO: 3 (RQIKIWFQNRRMKWKK). Otra secuencia líder de ejemplo más incluye una secuencia de aminoácidos que codifica el dominio de polilisina N-terminal de la subunidad a1 de Na/K-ATPasa (A1N), que está representada por la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (KKGKKGKK). Los expertos en la materia apreciarán que, sin embargo, también se pueden utilizar otras secuencias líder, incluidos otros péptidos de penetración celular, conjuntamente con los polipéptidos dados a conocer en la presente memoria descriptiva. En algunos casos, un polipéptido que incluye una secuencia líder, tal como un péptido de penetración celular, unido a la secuencia de NaKtide de la SEQ ID NO: 1 se denomina en la presente memoria descriptiva pNaKtide (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5; GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ, que incluye el péptido de penetración celular TAT de la SEQ ID NO: 2 fusionado con la secuencia NaKtide de la SEQ ID NO: 1). También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable. De hecho, cuando se hace referencia a ciertas realizaciones en la presente memoria descriptiva, los términos "polipéptido" y/o "composición" se pueden utilizar o no para referirse a una composición farmacéutica que incluye el polipéptido.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión "vehículo aceptable farmacéuticamente" se refiere a soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles, así como polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su utilización. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante la utilización de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante la utilización de surfactantes. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede garantizar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, tales como parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares.

La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede producir mediante la inclusión de agentes, tales como monoestearato de aluminio y gelatina, que retrasan la absorción. Las formas inyectables de liberación prolongada o “depot” se preparan formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables, tales como polilactida-poliglicólido, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Dependiendo de la proporción de polipéptido respecto a polímero biodegradable y la naturaleza del polímero biodegradable particular utilizado, se puede controlar la velocidad de liberación de polipéptido. Las formulaciones inyectables depot también se pueden preparar atrapando el polipéptido en liposomas o microemulsiones, que son compatibles con los tejidos corporales. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otros medios inyectables estériles justo antes de su utilización. Entre los vehículos inertes adecuados se pueden incluir azúcares, tales como lactosa.

Entre las formulaciones adecuadas se pueden incluir además soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, agentes reguladores de pH, bacteriostáticos, antibióticos bactericidas y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con los fluidos corporales del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.

Las composiciones también pueden asumir formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. De manera alternativa, los polipéptidos pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su utilización.

Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en un estado congelado o liofilizado (liofilizado) requiriendo solo la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su utilización.

Para la administración oral, las composiciones pueden asumir la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas mediante una técnica convencional con excipientes aceptables farmacéuticamente, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, o aglutinantes sin gelatina); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos se pueden revestir mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Las preparaciones líquidas para administración oral pueden asumir la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de su utilización. Estas preparaciones líquidas se pueden preparar mediante técnicas convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras de pH, aromatizantes, colorantes y edulcorantes, según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral se pueden formular de forma adecuada para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las composiciones pueden asumir la forma de comprimidos o grageas formuladas de manera convencional.

Las composiciones también se pueden formular como preparación para implantación o inyección. De este modo, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, como una sal poco soluble). Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales, cremas o lociones o parches transdérmicos.

Tal como se ha señalado, el polipéptido se puede utilizar para tratar la obesidad inhibiendo la función receptora del complejo de Na/K-ATPasa y Src, y en algunas realizaciones, los polipéptidos inhiben la función receptora actuando como antagonista del complejo de Na/K-ATPasa y Src.

El término "inhibir" o "inhibición" no se refiere necesariamente a la capacidad de inactivar completamente toda la actividad biológica diana en todos los casos. Más bien, el experto en la materia comprenderá que el término "inhibir" así como el término "reducción" se refieren a la disminución de la actividad biológica de una diana, tal como puede ocurrir cuando un ligando se une a un sitio de la diana, se bloquea una proteína en una ruta bioquímica de la diana o se reduce la expresión de dicha proteína, un complejo no nativo con una diana, o similares. Dichas disminuciones en la actividad biológica se pueden determinar en relación con un control, en el que el control puede ser representativo de un entorno en el que no se administra un polipéptido del objeto dado a conocer en la presente invención. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una disminución en la actividad en relación con un control puede ser, aproximadamente, una disminución del 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.

A este respecto, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren al tratamiento médico de un individuo con la intención de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejoría de una enfermedad, afección patológica o trastorno, y también incluye el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido a la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociado. Además, este término incluye: tratamiento paliativo o tratamiento diseñado para aliviar los síntomas en lugar de curar la enfermedad, afección patológica o trastorno; tratamiento preventivo, o tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, condición patológica o trastorno asociado; y tratamiento de apoyo, o tratamiento utilizado para complementar otra terapia dirigida hacia la mejoría de la enfermedad, condición patológica o trastorno asociado.

El tratamiento de la obesidad se puede medir y cuantificar de varias formas diferentes y teniendo en cuenta varias características de la obesidad. En algunas realizaciones, el tratamiento de la obesidad puede medirse y cuantificarse, entre otras maneras, mediante disminución de superóxido, lipogénesis, diferenciación de adipocitos o una combinación de las mismas. De manera alternativa o adicional, el tratamiento de la obesidad se puede caracterizar mediante un aumento de adipocitos pequeños. El tratamiento de la obesidad también se puede caracterizar mediante una disminución en la acumulación de lípidos, una disminución en el nivel de citocinas inflamatorias y/o un aumento en los niveles de adiponectina. Estas mediciones y cuantificaciones se pueden realizar mediante varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, los aumentos y/o las disminuciones descritos en la presente memoria descriptiva pueden ser en referencia a un individuo de control que padece obesidad y que no ha sido tratado con uno de los polipéptidos dados a conocer en la presente invención.

En algunos casos, el tratamiento de la obesidad puede incluir la eliminación de las cualidades características de la obesidad. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tratamiento de la obesidad puede hacer que un individuo alcance uno o más de los siguiente factores, niveles de glucosa en ayunas por debajo de 100 mg/dl, niveles plasmáticos de triglicéridos por debajo de 150 mg/dl, colesterol HDL por encima de 40 mg/dl en hombres y por encima de 50 mg/dl en mujeres, presión arterial por debajo de 130/85 mm Hg, circunferencia de la cintura abdominal por debajo de 40 pulgadas (101,6 cm) para hombres y por debajo de 35 pulgadas (82 cm) para mujeres, e índice de masa corporal por debajo de 30 kg/m2.

La administración de un antagonista polipeptídico, tal como se describe en la presente memoria descriptiva puede reducir una cantidad de un marcador adipogénico en un individuo o, en otras palabras, una molécula, tal como un polipéptido o ARNm, que es útil como indicador de la diferenciación de preadipocitos en adipocitos (es decir, adipogénesis). Dicho marcador adipogénico se puede seleccionar entre sintasa de ácidos grasos (FAS), transcrito específico de mesodermo (MEST), receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (PPARy) y combinaciones de los mismos. La adipogénesis se puede reducir poniendo en contacto una célula con un antagonista polipeptídico del objeto dado a conocer en la presente invención. La célula puede ser un preadipocito. La administración del polipéptido puede reducir una cantidad de adiposidad o, en otras palabras, la acumulación de grasa y lípidos en el cuerpo de un individuo. La administración del polipéptido puede reducir una cantidad de grasa visceral y/o una cantidad de grasa subcutánea en un individuo.

A este respecto, el término "administrar" no está particularmente limitado y se refiere a cualquier procedimiento para proporcionar un polipéptido y/o composición farmacéutica del mismo a un individuo. Dichos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, sin constituir limitación, administración oral, administración transdérmica, administración por inhalación, administración nasal, administración tópica, administración intravaginal, administración oftálmica, administración intraaural, administración intracerebral, administración rectal y administración parenteral, que incluye inyectables tales como administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intravítrea, administración intracameral (en la cámara anterior), administración subretiniana, administración de sub-Tenon, administración peribulbar, administración a través de colirio tópico y similares. La administración puede ser continua o intermitente. Una preparación se puede administrar de forma terapéutica; es decir, administrar para el tratamiento de una enfermedad o afección existente. De manera alternativa, una preparación se puede administrar de forma profiláctica; es decir, administrar para la prevención de una enfermedad o afección.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "individuo" tampoco está particularmente limitado. El término "individuo" incluye vertebrados, tales como mamíferos, y el término "individuo" puede incluir individuos humanos y veterinarios. De este modo, el individuo puede ser un ser humano, un primate no humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, una vaca, un gato, un conejillo de indias, un roedor o similares. El término no denota una edad o sexo en particular. De este modo, se pretende cubrir individuos adultos y recién nacidos, así como fetos, ya sean masculinos o femeninos.

El objeto dado a conocer en la presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos específicos, que no constituyen limitación.

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos para los ejemplos 1-4.

Diseño experimental para experimentos in vitro. Se resuspendieron preadipocitos de ratón congelados (3T3L1) en un medio esencial mínimo a complementado con el 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor y el 1 % de solución antibiótica/antimicótica. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una incubadora de CO² al 5 % y el medio se cambió después de 48 horas y cada 3-4 días a partir de entonces. Cuando las células 3T3L1 confluyeron, las células se recuperaron mediante la adición de tripsina. Se sembraron las células 3T3L1 (pase 2-3) en placas de 96 y 24 pocillos a una densidad de 10.000 células/cm2 y se cultivaron en a-MEM hasta que se consiguió una confluencia del 80 %. El medio se sustituyó con medio adipogénico y las células se cultivaron durante 7 días más. Las células se trataron todos los días con 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1, 2 y 4 pMI de pNaKtide respectivamente. Después de 7 días, las células se tiñeron con una solución de Rojo Aceite O para estudiar la adipogénesis, tal como se ha descrito anteriormente.

Medición del tamaño de las gotitas lipídicas. El tamaño de la celda se midió utilizando un analizador de ImagePro. La clasificación del tamaño de las gotitas lipídicas se basó en el tamaño por área (píxeles) tal como se ha descrito anteriormente.

Medición de niveles de superóxido para experimentos in vitro. Se cultivaron adipocitos 3T3L1 en placas de 96 pocillos hasta que alcanzaron aproximadamente el 70 % de confluencia. Después del tratamiento con 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1, 2 y 4 pMI de pNaKtide durante 72 horas, las células se incubaron con dihidroetidio (DHE) 10 pMI durante 30 min a 37 °C. La intensidad de la fluorescencia se midió utilizando un espectrómetro de luminiscencia Perkin-Elmer en filtros de excitación/emisión de 530/620 nm.

Diseño experimental para experimentos in vivo. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Utilización y Cuidado de Animales de la Universidad de Marshall según las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y utilización de Animales de Laboratorio. Se adquirieron ratones C57BL6 (machos de 6-8 semanas de edad) de Jackson Laboratory. A su llegada al Centro de Biotecnología Byrd, ARF, Instalación de Investigación Animal, los ratones se colocaron en jaulas y se alimentaron con una dieta normal y tuvieron acceso a agua ad libitum. La dieta rica en grasas (HF) se adquirió comercialmente de Bio-SERV, Frenchtown, Nueva Jersey. La dieta rica en grasas contenía el 58 % de grasa de manteca, el 25,6 % de carbohidratos y el 16,4 % de proteína, lo que proporcionaba 23,4 KJ/g. Después de 4 semanas de dieta HF, los animales se dividieron en 4 grupos y el tratamiento se realizó durante 8 semanas de la siguiente manera: pNaKtide (disuelto en solución salina e inyectado IP) a una dosis de 0, 1,5 y 25 mg/kg cada 8 días. El peso corporal se midió cada semana. Al final del período de 12 semanas, los ratones se colocaron en un ayuno de 8 horas, se anestesiaron con pentobarbital sódico (65 mg/kg, IP) y se extrajo sangre de la vena de la cola para la medición de glucosa utilizando un glucómetro y la medición de insulina utilizando un kit de ensayo ELISA (Abcam, Cambridge, Massachussets). En el momento del sacrificio se midió el peso corporal, el contenido de grasa visceral y subcutánea y el peso del hígado de todos los ratones. Se recogieron muestras de sangre para determinar los niveles de adiponectina. El tejido adiposo visceral se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se mantuvo a -80 °C hasta que se ensayó.

Un grupo adicional en el que se administró pNaKtide a 25 mg/kg IP se estudió también cada 2 días (N = 7). Estos animales tuvieron menos atenuación del aumento de peso que los del grupo de 25 mg/kg IP cada de 8 días, pero en el momento del sacrificio, estaba claro que estos animales habían retenido una cantidad significativa de líquido. Su contenido de grasa subcutánea (0,63 0,06 g, p <0,01 frente a HF) y visceral (1,60 0,08 g, p <0,01 frente a HF) fueron virtualmente idénticos a los observados en el grupo de 25 mg/kg IP cada 8 días. La retención de líquidos no fue sorprendente dada la sustancial carga de sodio del vehículo cada 2 días junto con el papel de la señalización de Na/K-ATPasa en la natriuresis adaptativa con la carga de sal.

Mediciones sanguíneas de adiponectina. La forma de adiponectina de alto peso molecular (HMW, del inglés high molécula weight) se determinó en suero utilizando un ensayo ELISA según el protocolo del fabricante.

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La grasa visceral se pulverizó en nitrógeno líquido y se colocó en un tampón de homogeneización. Se centrifugaron los homogeneizados, se aisló el sobrenadante y se realizó la inmunoinmunotransferencia. El sobrenadante se utilizó para la determinación de FAS, adiponectina, PPARy y MEST. Se utilizó p-actina para garantizar una carga de muestra adecuada para todas las inmunotransferencias de tipo Western, tal como se ha descrito anteriormente.

Medición de la fosforilación de c-Src y ERK1/2. Se prepararon lisados de grasa visceral y de células enteras obtenidas a partir de adipocitos 3T3L1 con tampón Nonidet P-40 y se determinó la activación de c-Src y ERK1/2 tal como se ha descrito anteriormente. Después de la inmunotransferencia para fosfo-c-Src y fosfo-ERK1/2, la misma membrana se desmanteló e inmunotransfirió para c-Src total y ERK1/2 total. La activación de c-Src y ERK1/2 se expresó como la proporción de fosfo-c-Src/Src total y fosfo-ERK1/2/ERK1/2 total, respectivamente, con ambas mediciones normalizadas a 1,0 para las muestras de control.

Evaluación de la carbonilación de proteínas. Se prepararon lisados de grasa visceral y de células enteras con tampón Nonidet P-40 y se realizó una inmunotransferencia de tipo Western para el ensayo de carbonilación de proteínas. Los valores de densidad de señal de las muestras de control se normalizaron a 1,0 con tinción Ponceau S como control de carga.

Ensayo de tolerancia a la glucosa. La depuración de glucosa se determinó utilizando un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal antes de la finalización del experimento. Se hizo ayunar a los ratones durante 8 h, después de lo cual se inyectó una solución de glucosa (2 g/kg de peso corporal, inyectada como una solución al 10 %) en la cavidad peritoneal. Se tomaron muestras de la vena de la cola a los 0, 30, 60 y 120 minutos después de la inyección de glucosa. La glucosa en sangre se midió utilizando el glucómetro Accutrend Sensor.

Determinación de la evaluación del modelo de homeostasis de la resistencia a la insulina. La evaluación del modelo de homeostasis de la resistencia a la insulina (HOMA-IR, del inglés homeostasis model assessment of insulin resistance) se calculó a partir de sangre de ratones utilizando concentraciones de glucosa e insulina obtenidas después de 8 h de abstinencia de alimentos, utilizando la siguiente fórmula: HOMA-IR = [insulina en ayunas (ng/ml) x glucosa en ayunas (mmol/l)]/22,5.

Medición de la peroxidación lipídica. La peroxidación de lípidos de grasa visceral se midió como sustancia reactiva con ácido tiobarbitúrico (TBARS) utilizando un kit de ensayo según el protocolo del fabricante. Las muestras de grasa visceral se homogeneizaron en una solución tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) y KCl al 1,15 %, y posteriormente se centrifugaron. El sobrenadante se utilizó para el ensayo. Los datos se normalizaron respecto a la proteína total y se presentaron como micromoles/mg de proteína.

Distribución de pNaKtide marcado con rodamina B. Para el estudio in vitro, se cultivaron preadipocitos murinos (3T3L1) en cubreobjetos de vidrio y se trataron con o sin pNaKtide marcado con rodamina B (2 |j.M). En los puntos temporales indicados, las células se fijaron con metanol absoluto frío y se montaron con medio de montaje DAPI (Vector Labs). Se tomaron imágenes (las lecturas de emisión para DAPI y rodamina B son 415-475 nm y 580-650 nm, respectivamente) con un SP5 TCS II de Leica equipado con láser de visión multifotónica II (IR) de camaleón coherente y se analizaron mediante el software LAS/AF de Leica. Para el estudio in vivo, se inyectaron ratones (por vía i.p.) sin pNaKtide (como control) o con pNaKtide marcado con rodamina B (25 mg/kg de peso corporal). Tres horas después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se tomaron imágenes de los tejidos adiposos y se analizaron tal como se ha descrito anteriormente.

Análisis estadísticos. La significación estadística entre los grupos experimentales se determinó mediante el procedimiento de análisis de Fisher de comparaciones múltiples (p<0,05). Para las comparaciones entre los grupos de tratamiento, la hipótesis nula se probó mediante un ANOVA de dos factores para grupos múltiples o una prueba de la t para datos independientes para dos grupos. Los datos se presentan como promedio ± EE.

Ejemplo 1 - Efecto de pNaKtide sobre la adipogénesis en preadipocitos murinos

Se expusieron células 3T3L1 a medios adipogénicos y se trataron con dosis crecientes de pNaKtide. Los resultados mostraron que pNaKtide redujo la acumulación de lípidos (figura 1A) en células 3T3L1 de una manera dependiente de la dosis. Como control, estas células se expusieron a pNaKtide marcado con rodamina y se encontró que pNaKtide atravesó fácilmente la membrana celular y residió en los compartimentos de la membrana intracelular (figura 1B). Además de disminuir la acumulación neta de lípidos, pNaKtide también aumentó la cantidad de lípidos en gotitas pequeñas mientras que disminuyó la proporción en gotitas grandes, también de una manera dependiente de la dosis (figuras 1C y 1D, respectivamente). El estrés oxidativo es una de las consecuencias de la activación de Na/K-ATPasa. Los niveles de superóxido, un marcador del estrés oxidativo, se redujeron significativamente con pNaKtide en las células 3T3L1 (figura 1E; p<0,05). No se observaron efectos citotóxicos de pNaKtide a las dosis estudiadas (hasta 4 pmol/l).

Ejemplo 2 - Efecto de pNaKtide sobre los niveles de adiponectina y marcadores adipogénicos en preadipocitos murinos.

La administración de pNaKtide aumentó los niveles de adiponectina (figura 2A; p<0,05), un marcador conocido de adipocitos pequeños sensibles a la insulina y sanos. Además, los resultados mostraron que el tratamiento con pNaKtide redujo significativamente la expresión de marcadores adipogénicos, entre los que se incluían FAS, MEST y PPARy (figuras 2B-2D, respectivamente). De este modo, pNaKtide previno la disfunción de los adipocitos, un efecto que se podría atribuir, y sin desear quedar limitado por ninguna teoría en particular, a su papel en la redox celular a través de la cascada de señales de la Na/K-ATPasa.

Se ha demostrado que la fructosa induce estrés oxidativo y aumenta la adipogénesis en adipocitos expuestos a medios adipogénicos. En los estudios de la presente invención, el aumento de la adipogénesis inducido por la fructosa se evitó mediante el tratamiento con pNaKtide en las células 3T3L1. De manera similar, la adición de glucosa oxidasa al medio adipogénico también aumentó la acumulación de lípidos y los marcadores adipogénicos, FAS y MEST en las células 3T3L1, y esto fue significativamente atenuado por el tratamiento coincidente con pNaKtide. El tratamiento con pNaKtide también disminuyó la carbonilación de proteínas y también bloqueó la activación de Src regulada por Na/K-ATPasa y cinasas reguladas por señal extracelular (ERK) 1 y 2 en células 3T3L1 expuestas a glucosa oxidasa.

Ejemplo 3 - Efecto de pNaKtide sobre el peso corporal y el contenido de grasa visceral y subcutánea en ratones alimentados con una dieta rica en grasas.

Para los estudios in vivo, los ratones C57B16 se expusieron a una dieta rica en grasas durante 4 semanas y posteriormente se les administró pNaKtide a diferentes dosis mediante inyección IP, mientras que la dieta rica en grasas continuó durante otras 8 semanas. En experimentos paralelos, se demostró que el péptido marcado con rodamina se acumula en el tejido adiposo. La administración de pNaKtide a 25 mg/kg IP cada 8 días redujo drásticamente la adiposidad en estos ratones, con dosis más bajas teniendo menos efectos (figuras 3 y 4A-4B). Sin embargo, pNaKtide administrado con mayor frecuencia (25 mg/kg IP cada 2 días) indujo cierta retención de líquidos y, por lo tanto, los estudios posteriores se centraron en los efectos de pNaKtide sobre los marcadores adipogénicos y el perfil metabólico cuando se administró cada 8 días.

Ejemplo 4 - Efecto de pNaKtide sobre marcadores adipogénicos y expresión de adiponectina en ratones alimentados con una dieta rica en grasas.

Los ratones alimentados con una dieta rica en grasas mostraron un aumento en la expresión génica de FAS (figura 5A) y MEST (figura 5B) en tejido adiposo visceral en comparación con el grupo de control. El tratamiento con pNaKtide (25 mg/kg de peso corporal cada 8 días) redujo significativamente los niveles de FAS y MEST en comparación con los ratones alimentados con una dieta rica en grasas. Además, los resultados mostraron que el tratamiento con pNaKtide aumentó los niveles de adiponectina en el tejido adiposo visceral en comparación con los ratones alimentados con una dieta rica en grasas (figura 5C). Estas observaciones sostienen la hipótesis de que pNaKtide no solo redujo la masa de tejido adiposo, sino que también promovió el desarrollo de adipocitos más saludables, con niveles de adiponectina comparables a los observados con una dieta normal.

Ejemplo 5 - Efecto de pNaKtide sobre el perfil metabólico en ratones alimentados con una dieta rica en grasas. El fenotipo de resistencia a la insulina en ratones alimentados con una dieta rica en grasas se revirtió con la administración de pNaKtide. Esto se caracterizó por mejoras significativas en la puntuación HOMA-IR (figura 6A), mejor tolerancia a la glucosa (figura 6B), atenuación del estrés oxidativo en el tejido adiposo visceral (figura 6C), y niveles significativamente elevados de adiponectina circulante en ratones tratados simultáneamente con el péptido (figura 6D). La administración de pNaKtide también atenuó significativamente la carbonilación de proteínas inducida por una dieta rica en grasas en el tejido adiposo visceral (figura 6E) y la activación de c-Src y ERK1/2 en ratones alimentados con una dieta rica en grasas (figuras 6F y 6G).

Discusión de los ejemplos 1-5.

Los estudios anteriores caracterizaron el potencial terapéutico de pNaKtide para las afecciones asociadas con la obesidad y el desequilibrio metabólico. El estrés oxidativo, un acompañante frecuente de patologías crónicas, ha estado implicado desde hace mucho tiempo en la patogenia de la adiposidad. Una multitud de antioxidantes se ha mostrado prometedora para revertir este efecto en estudios in vitro, con pocos éxitos in vivo. Los estudios anteriores demuestran que pNaKtide reduce eficazmente la adiposidad y restaura la homeostasis metabólica antagonizando la amplificación de la señalización de ROS mediada por Na/K-ATPasa.

También se observó que en preadipocitos murinos, la exposición a pNaKtide atenuó el estrés oxidativo, así como la acumulación de lípidos y las manifestaciones de un fenotipo de obesidad de manera dependiente de la dosis en respuesta a medios adipogénicos o a la administración exógena de mediadores del estrés oxidativo, fructosa o glucosa oxidasa. Esa disminución en la adipogénesis en preadipocitos murinos tratados con pNaKtide se asoció con una expresión significativamente disminuida de reguladores adipogénicos, incluidos PPARy y FAS, junto con una mayor producción de niveles de adiponectina. De este modo, el inhibidor de Na/K-ATPasa previene la adipogénesis disfuncional, efecto que se podría atribuir a sus efectos sobre la redox celular. Pasando a un modelo in vivo de obesidad inducida por una dieta rica en grasas, se observó nuevamente que la administración intraperitoneal de pNaKtide atenuó el desarrollo de obesidad y el desarrollo del síndrome metabólico. El tratamiento con pNaKtide dio como resultado una reducción significativa en el aumento de peso complementada por la atenuación del contenido de grasa visceral y subcutánea en ratones alimentados con una dieta rica en grasas. Los adipocitos disfuncionales se asocian al desarrollo de resistencia a la insulina e hiperglucemia y favorecen un estado proinflamatorio. La resistencia a la insulina severa, la inflamación sistémica y la desregulación de las adipocinas protectoras caracterizan el síndrome metabólico. Los resultados descritos anteriormente mostraron que pNaKtide disminuyó el estrés oxidativo y la resistencia a la insulina con un aumento en los niveles de adiponectina. Además, se demostró que una disminución de la obesidad se asoció con cambios en las proteínas adipogénicas. Los ratones alimentados con una dieta rica en grasas y tratados con pNaKtide mostraron niveles reducidos de expresión de MEST y FAS, lo que demuestra adicionalmente la anulación mediada por pNaKtide de la adiposidad y el desequilibrio metabólico. Estas observaciones fueron de interés potencial por varias razones. En primer lugar, los estudios demostraron claramente la capacidad de la cascada de señales de Na/K-ATPasa para amplificar las ROS implicadas en la adipogénesis, un proceso no vinculado previamente a los esteroides cardiotónicos o la cascada de señales de Na/K-ATPasa. Sin embargo, quizás de mayor importancia, el concepto de que la amplificación de ROS puede tener lugar a través de esta vía indica que la Na/K-ATPasa puede servir como una diana terapéutica potencial en una serie de afecciones caracterizadas por estrés oxidativo, que finalmente se vuelve desadaptativo. Quizás porque pNaKtide se dirige a la amplificación de oxidantes en lugar de una cascada de señales primarias, puede proporcionar nuevos enfoques para el tratamiento de la obesidad y el síndrome metabólico.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, se mencionan diversas referencias como se establece en la siguiente lista:

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Antagonista polipeptídico de un complejo receptor de Na/K ATPasa/Src para su utilización en un procedimiento de tratamiento de la obesidad, en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional de la misma.

2. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 1, en el que antagonista polipeptídico incluye además un polipéptido de penetración celular codificado por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-3.

3. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 1, en el que la etapa de administración incluye administración oral, administración transdérmica, administración por inhalación, administración nasal, administración tópica, administración intraaural, administración rectal, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intravítrea o combinaciones de las mismas, y/o en el que la administración del antagonista polipeptídico disminuye la acumulación de lípidos en una célula del individuo, tal como en la que la administración del antagonista polipeptídico disminuye una cantidad de adipogénesis, disminuye una cantidad de diferenciación de adipocitos y/o aumenta una cantidad de adipocitos pequeños.

4. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 1, en el que la administración del antagonista polipeptídico disminuye una cantidad de citocinas inflamatorias, en el que la citocina inflamatoria es opcionalmente el TNFa.

5. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 1, en el que la administración del polipéptido aumenta una cantidad de adiponectina.

6. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 1, en el que la administración del polipéptido reduce un nivel de expresión de un marcador adipogénico.

7. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 6, en el que el marcador adipogénico se selecciona entre fAs , MEST y PPARy.

8. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 1, en el que la administración del polipéptido reduce una cantidad de adiposidad en el individuo.

9. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 8, en el que la administración del polipéptido reduce una cantidad de grasa visceral y/o una cantidad de grasa subcutánea en el individuo.

10. Antagonista polipeptídico de un complejo receptor de Na/K ATPasa/Src, para su utilización en un procedimiento para reducir la adiposidad en pacientes obesos, en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional de la misma.

11. Antagonista polipeptídico de un complejo receptor de Na/K ATPasa/Src para su utilización en la reducción de la adipogénesis en pacientes obesos, en el que el antagonista polipeptídico se debe poner en contacto con una célula y en el que el antagonista polipeptídico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional de la misma.

12. Antagonista polipeptídico para su utilización, según la reivindicación 11, en el que la célula es un preadipocito.