CN107249614A

CN107249614A - 肥胖症治疗方法

Info

Publication number: CN107249614A
Application number: CN201680008158.0A
Authority: CN
Inventors: 谢子建; 约瑟夫·I·夏皮罗; 纳德·G·亚伯拉罕; 科玛尔·索德希
Original assignee: Marshall University Research Corp
Current assignee: Marshall University Research Corp
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: EP3250218A1; EP3250218B1; US11311600B2; US20180353569A1; PT3250218T; EP3250218A4; CN107249614B; DK3250218T3; WO2016123493A1; ES2868354T3

Abstract

本发明提供了肥胖症治疗方法，并且所述方法包括向有需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。本发明还提供了减轻肥胖和减少脂肪生成的方法，并且所述方法向对象使用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。

Description

肥胖症治疗方法

相关申请

本申请要求2015年1月30日提交的美国临时申请序号62/109,816的优先权，所述申请的全部公开内容通过这种引用并入本文中。

政府支持

本发明在美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的基金号HL109015、HL071556、HL105649、HL55601、和HL34300下，由政府支持完成。美国政府在本发明中具有一定权利。

技术领域

本发明涉及肥胖症治疗方法。具体地，本发明涉及利用抑制Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能的多肽来治疗肥胖症的方法。

背景技术

全世界的超重人数明显增长，导致肥胖症相关的健康问题以及相关的发病率和死亡率增加。脂肪组织中的氧化应激是导致肥胖症表型相关代谢综合征持续的重要致病机制。近来已经观察到，肥胖症的发展可受到全身氧化还原态或单独的脂肪细胞的氧化还原态的操纵的明显影响。具体而言，通过将抗氧化基因靶向转染到脂肪细胞来操纵脂肪细胞的氧化还原态改变了它们的表型以及降低了总的身体脂肪储存并缓解了代谢异常。

功能失常的脂肪生成实际上是慢性肥胖症的标志之一并且以脂肪组织的脂质积累增加和内分泌功能改变为特征。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是脂肪生成的主要调节剂并且激活基因例如脂肪酸合酶(FAS)的表达，以触发脂肪酸和甘油三酯的合成。中胚层特异性转录物(MEST)，当被上调时，导致在脂肪组织扩张期间脂肪细胞增大，这与炎性脂肪细胞因子释放增加和胰岛素抵抗增强有关。脂肪组织经由可溶性因子例如脂联素和肿瘤坏死因子α(TNFα)的分泌来调节能量代谢。这些脂肪细胞因子的产生失调参与了肥胖症相关代谢综合征的发病机制。

因此，治疗肥胖症的组合物和方法，包括治疗肥胖症的根本原因的组合物和方法，将既是高度希望的又是有益的。

发明内容

本申请公开的主题满足了一些或全部上述需求，这在本领域普通技术人员研究本文件中提供的信息之后将变得明显。

该发明内容描述了本申请公开的主题的若干实施方式，并且在很多情况下列出了这些实施方式的变化和排列。该发明内容仅仅是众多并且变化的实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征也是示例性的。这样的实施方式通常可在有或没有所提到的特征下存在；同样地，那些特征可应用于本申请公开的主题的其他实施方式，不管在该发明内容中是否列出。为了避免过度重复，该发明内容没有列出或提出这样的特征的所有可能的组合。

本申请公开的主题包括肥胖症治疗方法。具体地，本申请公开的主题包括利用抑制Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能的多肽来治疗肥胖症的方法。

在一些实施方式中，提供了肥胖症治疗方法，所述方法包括向有需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。在一些实施方式中，所述多肽拮抗剂包含SEQID NO：1的序列、或其片段和/或变体。在一些实施方式中，所述多肽拮抗剂还包括由选自SEQ ID NO：2-3的氨基酸序列编码的细胞穿透多肽。在一些实施方式中，施用步骤包括口服施用、透皮施用、吸入施用、经鼻施用、局部施用、耳内施用、直肠施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、和/或玻璃体内施用。

此外，关于所述多肽拮抗剂的施用，在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂(例如SEQ ID NO：1的多肽)减轻了一个或多个与肥胖症相关的症状和/或特征。例如，在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少了对象的细胞中的脂质积累。在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少脂肪生成的量、减少脂肪细胞分化的量、和/或增加小脂肪细胞的量。另外，在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少炎性细胞因子例如肿瘤坏死因子α(TNFα)的量。在其他实施方式中，施用所述多肽增加脂联素的量和/或降低成脂标志物例如FAS、MEST和PPARγ的表达水平。

在本申请公开的主题的一些实施方式中，进一步提供了减轻对象肥胖的程度的方法，所述方法包括向有需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂(例如SEQID NO：1的多肽)。在这些附加实施方式的一部分中，施用所述多肽降低了对象的内脏脂肪量和/或皮下脂肪量。

在本申请公开的主题的一些实施方式中，更进一步提供了减少脂肪生成的方法。在一些实施方式中，提供了减少脂肪生成的方法，所述方法包含将细胞与Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂(例如SEQ ID NO：1的多肽)接触。在一些实施方式中，所述细胞是前脂肪细胞。

在研究本文件中的描述、图和非限制性实施例之后，本发明的其他特征和优点对本领域普通技术人员而言将变得明显。

附图说明

图1A-1D包括的图像和图形显示了pNaKtide浓度增加对小鼠前脂肪细胞中脂肪生成的影响。脂肪生成按诱导脂肪生成后第7天时油红O的相对吸光度来测量。图1A显示了小鼠前脂肪细胞的代表性图像。图1B的图形显示了来自油红染色的定量数据，表示为均值±SE，n＝7，*与对照相比p<0.05。图1C-1D包括的图形显示了在pNaKtide施用之后小脂滴的剂量依赖性增加和大脂滴的剂量依赖性减少。

图2A-2D包括的图像和图形显示了pNaKtide增加3T3L1脂肪细胞中的脂联素水平并减少成脂标志物，所述图像和图形包括：(图2A)显示了在用pNaKtide处理7天后从3T3L1细胞得到的条件培养基中测定的脂联素水平的图像和图形，其中细胞用浓度不等的pNaKtide处理并且测得0.7μM的pNaKtide是增加脂联素水平的最佳浓度(结果是均值±SE，n＝4，*与对照相比p<0.05)；和显示了在用pNaKtide(0.7μM)处理7天后的3T3L1细胞中通过Western印迹分析测定的(图2B)FAS、(图2C)MEST和(图2D)PPARγ表达的图形，其中确定了蛋白质比率的定量密度计量评价(数据表示为均值±SE，n＝6，*与对照相比p<0.05)。

图3包括的图像和图形显示了剂量增加的pNaKtide对高脂肪食料喂养的小鼠的体重的影响，其中每8天一次，为期8周，分别注射1毫克/千克和5毫克/千克体重的pNaKtide剂量的C57Bl6小鼠在高脂肪食料喂养的小鼠中体重没有显著降低，其中与高脂肪食料喂养的动物相比，在高脂肪食料喂养的小鼠中施用25毫克/千克体重的pNaKtide显著降低了体重，并且其中食物摄入在组之间没有显著变化(结果是均值±SE，n＝7-14/组，*与对照相比、#与高脂肪(HF)食料相比p<0.05)。

图4A-4B包括的图像和图形显示了剂量增加的pNaKtide对高脂肪食料喂养的小鼠的内脏和皮下脂肪含量的影响，其中C57Bl6小鼠分别每8天在高脂肪食料喂养的小鼠中注射1毫克/千克、5毫克/千克、和25毫克/千克体重的pNaKtide剂量，为期8周，并且其中与高脂肪食料喂养的动物相比，在高脂肪食料喂养的小鼠中施用25毫克/千克体重的pNaKtide显著降低内脏(图4A)和皮下(图4B)脂肪含量(结果是均值±SE，n＝7-14/组，*与对照相比、#与HF相比p<0.05)。

图5A-5C包括的图像和图形显示了剂量增加的pNaKtide对高脂肪食料喂养的小鼠的内脏脂肪组织中成脂标志物和脂联素表达的影响，所述图像和图形包括：内脏脂肪组织中成脂标志物(图5A)FAS和(图5B)MEST的Western印迹和密度计量分析(结果是均值±SE，n＝7/组，*与对照相比、#与HF相比p<0.05；数据显示为相对于β-肌动蛋白归一化的平均条带密度)；和(图5C)脂联素表达的Western印迹和密度计量分析(结果是均值±SE，n＝7/组，*与对照相比、#与HF相比p<0.05；数据显示为相对于β-肌动蛋白归一化的平均条带密度)。

图6A-6G包括的图形和图像显示了剂量增加的pNaKtide对高脂肪食料喂养的小鼠中代谢情况的影响。这些图包括的图形显示：(图6A)HOMA-IR；(图6B)葡萄糖耐量试验；(图6C)硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)，这是一种在内脏脂肪组织中测量的氧化损伤标志物；和(图6D)血浆脂联素水平，其中结果是均值±SE，n＝7-14/组，*与对照相比、#与HF相比p<0.05。还包括显示了pNaKtide在高脂肪食料喂养的小鼠的脂肪组织中的影响的图形，包括的图形显示：(图6E)蛋白质羰基化，(图6F)c-Src的磷酸化；和(图6G)ERK1/2的磷酸化，其中结果是均值±SE，n＝4-7/组，**与对照(CTR)相比p<0.01，#与高脂肪食料(HF)相比p<0.01。

序列表的简单说明

SEQ ID NO：1是本申请公开的主题的多肽(NaKtide)的实施方式的氨基酸序列；

SEQ ID NO：2是编码TAT细胞穿透肽的氨基酸序列；

SEQ ID NO：3是编码penetratin(AP)细胞穿透肽的氨基酸序列；和

SEQ ID NO：4是编码Na/K-ATP酶的α1亚基的N端聚赖氨酸结构域(A1N)的氨基酸序列；和

SEQ ID NO：5是本申请公开的主题的多肽(pNaKtide)的实施方式的另一种氨基酸序列。

具体实施方式

本文件中阐述了本申请公开的主题的一种或多种实施方式的细节。在研究本文件中提供的信息之后，对本文件中描述的实施方式的修改以及其他实施方式对本领域普通技术人员而言将是明显的。提供本文件中提供的信息以及特别是所描述的示例性实施方式的具体细节主要是为了清楚了解，并且没有从中了解到不必要的限制。

要理解，在不背离本文中公开的主题的范围下，可改变本申请公开的主题的各种细节。此外，本文中提供的描述只是出于说明的目的，而不是出于限制的目的。

另外，虽然本文中使用的术语被认为是本领域普通技术人员充分了解的，但阐明定义以便于解释本申请公开的主题。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有的含义与本申请公开的主题所属领域的普通技术人员通常的理解相同。虽然在本申请公开的主题的实践或测试中可使用许多与本文中所述的相似或等效的方法、装置和材料，但现在描述代表性的方法、装置和材料。

此外，遵循长期以来的专利法惯例，不带数量说明的指称物在用于本申请(包括权利要求)中时是指“一或多”。因此，例如，对“多肽”的指称包括多个这样的多肽，等等。除非另有说明，否则用于说明书和权利要求中表示成分的量、性质例如反应条件等的所有数值应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有与此相反的指示，否则本说明书和权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可根据试图通过本申请公开的主题获得的期望性质而变化。

当指称质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，本文中使用的术语“约”意味着在一些实施方式中包括指定量的±20％、在一些实施方式中±10％、在一些实施方式中±5％、在一些实施方式中±1％、在一些实施方式中±0.5％、和在一些实施方式中±0.1％的变动，因为这样的变动适合于执行所公开的方法。还要理解，本文中公开了许多值，并且每个值在本文中除了公开所述值本身之外，也作为“约”该特定特值公开。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。还要理解，两个具体单位之间的每个单位也被公开。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。

Na/K-ATP酶是P-型ATP酶的成员。它存在于质膜中并通过水解ATP来跨细胞膜转运Na+和K+离子。功能性Na/K-ATP酶由α和β亚基组成，并且已经鉴定到每个亚基的若干同工型。已经观察到，除了离子泵送功能之外，α1亚基还起到肉瘤相关激酶(Src)的支架功能，让Na/K-ATP酶中的构象变化来影响信号级联。已经鉴定了来自该α亚基的核苷酸结合(N)结构域的拮抗性多肽序列，其结合Src的激酶结构域，强力抑制它的功能。然而，当通过结合强心类固醇改变所述α1亚基的构象时，可以解除这种抑制，导致Src激活。因此，Na/K-ATP酶通过调节Src以及对上皮生长因子受体(EGFR)和最终的活性氧物质(ROS)的下游调制来控制信号转导。此外，已经进一步观察到，Na/K-ATP酶的α1亚基也可以充当一些ROS的受体并有潜力充当前馈放大器。在这方面，以前已经设计了细胞穿透性NaKtide(pNaKtide)，并且发现其特异性抑制强心类固醇诱导的Src激活。然而，现在已经意外发现，pNaKtide可显著减弱脂肪细胞内Na/K-ATP酶-调制的ROS放大并削弱肥胖症表型和肥胖的发展。更具体地，已经观察到pNaKtide以剂量依赖性方式减弱氧化应激和脂质积累，减少体重增加，和改善胰岛素敏感性。

术语“肥胖症”，用在本文中时，是指其中多余的体脂肪已经积累到它可能对健康有负面影响的程度的状况，该状况继而可导致预期寿命降低和/或健康问题增加。在某些情况下，当体重指数(BMI)大于20kg/m²、21kg/m²、22kg/m²、23kg/m²、24kg/m²、25kg/m²、26kg/m²、27kg/m²、28kg/m²、29kg/m²、或30kg/m²时，对象可被认为是肥胖的，体重指数是将对象的体重除以人的身高的平方而得到的量度。肥胖症也可并发诸如但不限于高胰岛素血症、胰岛素抵抗、糖尿病、高血压和血脂异常的状况。肥胖症可进一步是心血管疾病的风险因素。在一些情况下，肥胖症的特征也可在于以下一种或多种：空腹葡萄糖水平为至少100mg/dl，血浆甘油三酯水平为至少150mg/dl，HDL胆固醇在男性中低于40mg/dl以及在女性中低于50mg/dl，血压为至少130/85mm Hg，以及腹部腰围对于男性而言大于40英寸以及对于女性而言大于35英寸。

正如所述，本申请公开的主题的实施方式利用多肽来治疗肥胖症。在一些实施方式中，所述多肽可包括抑制所述Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能的多肽。在一些实施方式中，所述多肽是所述Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能的拮抗剂。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换地用来指称氨基酸的聚合物，不管它的尺寸或功能如何。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中还可互换地用来指称氨基酸聚合物的基因产物、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段、任何蛋白酶衍生的肽(片段)、和其他等效物、变体和类似物。

在一些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO：1(SATWLALSRIAGLCNRAVFQ；NaKtide)的序列，或其片段和/或变体。当在指称这样的多肽中使用时，术语“多肽片段”或“片段”是指其中与参比多肽本身相比氨基酸残基缺失、但其中剩余的氨基酸序列通常与所述参比多肽中的对应位置一致的多肽。这样的缺失可能出现在所述参比多肽的氨基端、所述参比多肽的羧基端、或二者。多肽片段也可以包括“功能性片段”，在这样的情况下所述片段保留所述参比多肽的一些或全部活性。

术语“变体”，用在本文中时，是指与所述参比多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方式中，变体多肽可以与参比多肽相差一个或多个氨基酸取代。例如，NaKtide多肽变体可与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽相差一个或多个氨基酸取代，即突变。在这方面，包含两个或更多个突变的组合的多肽变体可分别被称为双重突变体、三重突变体等。要认识到，某些突变可引起多肽功能的显著改变，而其他突变在所述多肽的功能上将引起很少乃至没有显著的改变。

在一些实施方式中，本申请的多肽包括与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少75％同源性的多肽。在一些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少85％的同源性。在一些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少90％的同源性。在一些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少95％的同源性。

“同一性百分比”或“同源性百分比”当在本文中用于相对于参比序列描述氨基酸序列或核酸序列时，可利用Karlin和Altschul描述的公式来确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990，按Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877，1993修改)。这样的公式被结合在Altschul等的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。[用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，分值+100，字长＝12，以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，分值＝50，字长＝3，以得到与参比多肽同源的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：X)。为了得到空位比对以用于比较目的，利用Altschul等所述的Gapped BLAST(Nucleic AcidsRes.25：3389-3402，1997)。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。在这方面，参考在2012年7月19日时可用的所述程序的最新版本。

本申请的多肽的实施方式可进一步包含一个或多个前导序列，并且在一些实施方式中，所述前导序列包括但不限于细胞穿透肽(CPP)。术语“细胞穿透肽”(CPP)在本文中用于泛指在细胞中发现的能够或帮助促进分子货物跨质膜转运的短肽。在一些情况下，所述分子货物包括另一种多肽，例如本文中描述的多肽。当然，所述细胞穿透肽可以经由任意数量的手段(包括共价键和/或非共价键)与所述分子货物(例如多肽)接合。然而，在许多情况下，这样的细胞穿透肽往往包括相对高浓度的带正电荷的氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸，并且具有含有带电荷(极性)和不带电荷的氨基酸的交替模式的序列。

在本申请公开的主题的一些实施方式中，示例性的前导序列或细胞穿透肽可包括反式激活转录激活因子(TAT)细胞穿透肽，其由SEQ ID NO：2(GRKKRRQRRRPPQ)的序列表示。另一个示例性的前导序列包括penetratin(AP)，其由SEQ ID NO：3(RQIKIWFQNRRMKWKK)的序列表示。又一个示例性的前导序列包括编码Na/K-ATP酶的α1亚基的N端聚赖氨酸结构域(A1N)的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：4(KKGKKGKK)的序列表示。可是，普通技术人员将领会，其他前导序列(包括其他细胞穿透肽)也可以与本申请公开的多肽一起使用。在一些实施方式中，包括与SEQ ID NO：1的NaKtide序列相连的前导序列例如细胞穿透肽的多肽在本文中被称为pNaKtide(例如，SEQ ID NO：5；GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ，其包括与SEQ ID NO：1的NaKtide序列融合的SEQ ID NO：2的TAT细胞穿透肽)。

本申请公开的主题进一步包括和使用包含本文中描述的多肽以及可药用载体的药物组合物。实际上，当在本文中提到某些实施方式时，术语“多肽”和/或“组合物”可以用于或不用于指称包括所述多肽的药物组合物。

术语“可药用载体”用在本文中时是指无菌水性或非水性溶液、分散体、悬液或乳液，以及用于在临用之前重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。适当的流动性可例如通过使用涂层材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需要的粒度和通过使用表面活性剂来维持。这些组合物也可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物作用。包括等渗剂例如糖、氯化钠等，也可能是可取的。

可注射的药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。可注射的储库形式是通过形成所述药物在可生物降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中的微囊基质而制成的。取决于多肽与可生物降解的聚合物的比率和所使用的具体的可生物降解的聚合物的性质，可控制多肽释放速率。可注射的储库制剂也可以通过将所述多肽夹带在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可注射制剂可例如通过经细菌截留型过滤器过滤或通过并入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可在临用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载体可包括糖例如乳糖。

合适的制剂还可包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌性抗生素、和使所述制剂与目标接受者的体液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂。

所述组合物也可以采取例如在油性或水性介质中的悬液、溶液或乳液的形式，并可含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述多肽可以是粉末形式，在使用前用合适的介质例如无菌无热原水进行构造。

所述制剂可以在单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中呈现，并可以在冷冻或冷冻-干燥(冻干)条件下储存，在临用之前只需要添加无菌液体载体。

对于口服施用，所述组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，所述片剂或胶囊通过常规技术用可药用的赋形剂例如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素、或无明胶粘合剂)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)、或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)制备。所述片剂可通过本领域中已知的方法进行包衣。

用于口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆或悬液的形式，或者它们可呈现为在使用之前用水或其他合适的介质构造的干产物。这样的液体制剂可通过常规技术用可药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)、和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或者山梨酸)制备。所述制剂也可以酌情含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可适当配制用于口服施用的制剂以产生活性化合物的受控释放。对于经颊施用，所述组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

所述组合物也可以配制为用于植入或注射的制剂。因此，例如，所述化合物可用合适的聚合或疏水材料配制(例如，作为在可接受的油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物(例如，作为微溶性盐)。所述化合物也可以配制在直肠组合物、霜剂或洗液、或透皮贴片中。

正如所述，本申请公开的主题包括用多肽治疗肥胖症的方法。方法的一些实施方式包括向有需要的对象施用本申请公开的多肽之一。在一些实施方式中，所述多肽可通过抑制所述Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能来治疗肥胖症，而在一些实施方式中，所述多肽通过充当所述Na/K-ATP酶和Src复合物的拮抗剂来抑制所述受体功能。

术语“抑制”在所有情况下不一定是指完全使全部靶生物活性失活的能力。相反，技术人员将理解，术语“抑制”以及术语“降低”是指降低靶的生物活性，例如在以下情况下可以发生的：配体结合所述靶的位点；所述靶的生化路径中的蛋白质被阻断或这种蛋白质的表达减少；形成靶的非天然复合物，等等。生物活性的这种降低可相对于对照来确定，其中所述对照可以代表其中没有施用本申请公开的主题的多肽的环境。例如，在一些实施方式中，相对于对照的活性降低可以是降低约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100％。

在这方面，术语“治疗”是指有治愈、缓解、稳定或预防疾病、病理性状况、或紊乱的意向的对象的医疗管控。该术语包括主动治疗，即，特异性针对疾病、病理性状况、或紊乱的改善的治疗，并也包括病因治疗，即，针对相关的疾病、病理性状况、或紊乱的病因的去除的治疗。另外，该术语包括：姑息治疗，或被设计成减轻症状而不是治愈疾病、病理性状况、或紊乱的治疗；预防性治疗，或旨在最小化或者部分或完全抑制所述相关的疾病、病理性状况、或紊乱的发展的治疗；和支持性治疗，或用于补充针对所述相关的疾病、病理性状况、或紊乱的改善的另一种疗法的治疗。

肥胖症的治疗可用几种不同的方式并考虑肥胖症的若干特征来度量和量化。在一些实施方式中，肥胖症的治疗可通过尤其减少超氧化物、脂肪生成、脂肪细胞分化、或其组合来度量和量化。替代地或附加地，肥胖症的治疗可以以小脂肪细胞增加为特征。肥胖症的治疗也可以以脂质积累减少、炎性细胞因子水平减少和/或脂联素水平增加为特征。这样的度量和量化可通过本领域技术人员已知的任意数量的方法来进行。在一些实施方式中，在此描述的增加和/或减少可以是参考患有肥胖症并且没有用本申请公开的多肽之一治疗的对照对象。

在一些情况下，肥胖症的治疗可包括消除肥胖症的特有性质。例如，在一些实施方式中，肥胖症的治疗可造成对象达到以下一种或多种：空腹葡萄糖水平低于100mg/dl，血浆甘油三酯水平低于150mg/dl，HDL胆固醇在男性中高于40mg/dl以及在女性中高于50mg/dl，血压低于130/85mm Hg，腹部腰围对于男性而言低于40英寸以及对于女性而言低于35英寸，和体重指数小于30kg/m²。

此外，关于本文中描述的方法，在一些实施方式中，施用本申请公开的主题的多肽拮抗剂降低了对象中成脂标志物的量，或者换言之，可用作前脂肪细胞分化成脂肪细胞(即脂肪生成)的指示物的分子例如多肽或mRNA的量。在一些实施方式中，这样的成脂标志物选自脂肪酸合酶(FAS)、中胚层特异性转录物(MEST)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、及其组合。在本申请公开的方法的一些实施方式中，通过将细胞与本申请公开的主题的多肽拮抗剂接触来减少脂肪生成。在一些实施方式中，所述细胞是前脂肪细胞。

在本文所述的方法的一些实施方式中，施用所述多肽降低了肥胖的程度，或换句话说，对象身体中脂肪和脂质的积累。在一些实施方式中，施用所述多肽降低了对象的内脏脂肪量和/或皮下脂肪量。

在这方面，术语“施用”没有特别的限制并且是指向对象提供多肽和/或其药物组合物的任何方法。这样的方法是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于口服施用、透皮施用、吸入施用、经鼻施用、局部施用、阴道内施用、经眼施用、耳内施用、脑内施用、直肠施用、和胃肠外施用，包括注射例如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮下施用、玻璃体内施用、前房内(前房中)施用、视网膜下施用、Tenon囊下施用、眼球周施用、经由局部滴眼剂施用等等。施用可以是连续的或间歇性的。在各个方面中，制剂可以被治疗性施用；也就是说，为了治疗已有的疾病或状况而施用。在另外的各个方面中，制剂可以被预防性施用；也就是说，为了预防疾病或状况而施用。

本申请的方法可以在各式各样的对象上进行。实际上，术语“对象”用在本文中时也没有特别的限制。术语“对象”包括脊椎动物，例如哺乳动物，并且术语“对象”可以包括人类和兽医对象。因此，本文中公开的方法的对象可以是人类、非人类的灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠、啮齿类动物等。所述术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年和初生对象，以及胎儿，不管是雄性或雌性，都打算被覆盖在内。

本申请公开的主题通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明。

实施例

实施例1–4的材料和方法

体外实验的实验设计。将冷冻的小鼠前脂肪细胞(3T3L1)重悬浮在补充有10％热灭活胎牛血清和1％抗生素/抗真菌素溶液的α-最低必需培养基中。将培养物在5％CO₂培养箱中维持在37℃下并在48h后以及此后每3～4天更换所述培养基。当所述3T3L1细胞汇合时，通过添加胰蛋白酶回收所述细胞。将3T3L1细胞(第2–3代)在96和24孔板中以10,000细胞/cm²的密度铺板并在α-MEM中培养直到达到80％汇合。将所述培养基用成脂培养基代替，并将细胞再培养7天。每天分别用0.1、0.3、0.5、0.7、1、2和4μM的pNaKtide处理细胞。7天后，如以前所述用油红O溶液对细胞进行染色以研究脂肪生成。

脂滴尺寸的测量。利用ImagePro分析仪测量细胞尺寸。如以前所述，脂滴尺寸的分类是基于单位面积的尺寸(像素)。

体外实验的超氧化物水平测量。3T3L1脂肪细胞在96-孔板上培养直到它们达到大约70％汇合。用0.1、0.3、0.5、0.7、1、2和4μM的pNaKtide处理72小时后，将所述细胞与10μM二氢乙啶(DHE)一起在37℃温育30min。利用Perkin-Elmer发光光度计在530/620nm的激发/发射滤波器下测量荧光强度。

体内实验的实验设计。所有动物研究都由Marshall大学动物护理和使用委员会(Marshall University Animal Care and Use Committee)根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用准则(National Institutes of Health Guidelines for Care and Useof Laboratory Animals)批准。C57BL6小鼠(6-8周龄，雄性)购自Jackson实验室。在到达Byrd生物技术中心(Byrd Biotechnology Center)，ARF，动物研究机构(Animal ResearchFacility)后，小鼠被放入笼中并喂给正常饲料和自由饮水。高脂肪(HF)食料从Bio-SERV，Frenchtown，NJ商购。高脂肪食料含有58％来自猪油的脂肪、25.6％糖类和16.4％蛋白质，提供23.4KJ/g。4周的HF食料后，动物被分成4组并如下进行8周的处理：pNaKtide(溶解在盐水中并I.P注射)以0、1、5和25mg/kg的剂量，每8天一次。每周测量体重。在12周时期结束时，使小鼠禁食8小时，用戊巴比妥钠(65mg/kg，I.P.)麻醉并从尾静脉获得血液，利用糖度计测量葡萄糖并利用ELISA分析试剂盒(Abcam，Cambridge，MA)测量胰岛素。在处死时，测量所有小鼠的体重、内脏、皮下脂肪含量和肝脏重量。收集血液样品以获得脂联素水平。将内脏脂肪组织在液氮中快速冷冻并维持在-80℃直到分析。

还研究了一个附加组，其中pNaKtide以25mg/kg每2天I.P.施用(N＝7)。这些动物比25mg/kg I.P.每8天组有更小的体重增加减弱，但在处死时，明显这些动物潴留了显著的体液。它们的皮下(0.63+0.06g，与HF相比p<0.01)和内脏脂肪含量(1.60+0.08g，与HF相比p<0.01)与所述25mg/kg I.P.每8天组中所见的几乎相同。鉴于由每2天一次给予所述介质引起的可观钠载量以及Na/K-ATP酶信号转导在对盐载量的适应性尿钠排泄中的作用，体液潴留并不令人惊讶。

脂联素的血液测量。利用ELISA分析按照制造商的方案测定血清中高分子量(HMW)形式的脂联素。

Western印迹分析。将内脏脂肪在液氮下粉碎并放入匀浆缓冲液中。将匀浆物离心，分离上清液，并进行免疫印迹。上清液用于测定FAS、脂联素、PPARγ和MEST。如以前所述，β肌动蛋白用于确保所有Western印迹的足够的样品载量。

C-Src和ERK1/2磷酸化的测量。用Nonidet P-40缓冲液制备从3T3L1脂肪细胞得到的内脏脂肪和全细胞裂解物，并如以前所述测定c-Src和ERK1/2的激活。对磷酸-c-Src和磷酸-ERK1/2进行免疫印迹后，相同的膜被剥离并针对总c-Src和总ERK1/2进行免疫印迹。c-Src和ERK1/2的激活分别表示为磷酸-c-Src/总-Src和磷酸-ERK1/2/总-ERK1/2的比率，这两种测量结果相对于对照样品的1.0进行归一化。

蛋白质羰基化的评估。用Nonidet P-40缓冲液制备内脏脂肪和全细胞裂解物并进行western印迹以分析蛋白质羰基化。对照样品的信号密度值被归一化到1.0，其中丽春红S染色作为载荷对照。

葡萄糖耐量试验。在实验结束之前，利用腹膜内葡萄糖耐量试验测定葡萄糖清除率。使小鼠禁食8h，然后在腹膜腔内注射葡萄糖溶液(2g/kg体重，作为10％溶液注射)。在葡萄糖注射后0、30、60和120min，从尾静脉取样。使用Accutrend Sensor糖度计测量血糖。

胰岛素抵抗的稳态模型评估的确定。利用在撤销食物8h后得到的葡萄糖和胰岛素浓度，利用下式从小鼠血液计算胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA-IR)：HOMA-IR＝[空腹胰岛素(ng/ml)×空腹葡萄糖(mmol/L)]/22.5。

脂质过氧化测量。内脏脂肪脂质过氧化利用分析试剂盒按照制造商的方案按硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)测量。将内脏脂肪样品在含有50mM Tris-HCl(pH 7.4)和1.15％KCl的缓冲溶液中匀浆，然后离心。上清液用于分析。将数据相对于总蛋白进行归一化并表示为微摩尔/毫克蛋白质。

罗丹明B标记的pNaKtide的分布。对于体外研究，将鼠前脂肪细胞(3T3L1)在玻璃盖玻片上生长并用或不用罗丹明B标记的pNaKtide(2μM)处理。在指定的时间点，将所述细胞用冷的无水甲醇固定并用DAPI封固介质(Vector Labs)封固。用配备有coherentchameleon multiphoton vision II(IR)激光器的Leica SP5TCS II获取图像(DAPI和罗丹明B的发射读数分别是415-475nm和580-650nm)并通过Leica LAS/AF软件分析。对于体内研究，不用(作为对照)或用罗丹明B标记的pNaKtide(25mg/Kg体重)对小鼠进行注射(通过i.p.)。注射后三小时，处死小鼠并如上所述对脂肪组织进行成像和分析。

统计分析。实验组之间的统计显著性通过Fisher多重比较分析方法来确定(p<0.05)。为了在处理组之间比较，通过用于多个组的双因素ANOVA或用于两个组的未配对t检验来检验无效假设。数据表示为均值±SE。

实施例1–pNaKtide对鼠前脂肪细胞中脂肪生成的影响

将3T3L1细胞暴露于成脂培养基并用剂量增加的pNaKtide处理。结果显示，pNaKtide以剂量依赖性方式降低3T3L1细胞中的脂质积累(图1A)。作为对照，将这些细胞暴露于罗丹明标记的pNaKtide并且发现pNaKtide容易穿过细胞膜并居留在细胞内膜室中(图1B)。除了减少脂质的净积累之外，pNaKtide还增加小滴中脂质的量同时减少大滴中的比例，也是以剂量依赖性方式(分别是图1C和1D)。氧化应激是Na/K-ATP酶激活的后果之一。超氧化物水平是氧化应激的标志物，其在3T3L1细胞中被pNaKtide显著降低(图1E；p<0.05)。在研究剂量(最高4μmol/l)下没有观察到pNaKtide的细胞毒性效应。

实施例2-pNaKtide对鼠前脂肪细胞中脂联素水平和成脂标志物的影响

施用pNaKtide增加了脂联素水平(图2A；p<0.05)，脂联素是小的胰岛素敏感和健康脂肪细胞的已知标志物。此外，结果显示，pNaKtide处理显著降低成脂标志物(包括FAS、MEST和PPARγ)的表达(分别为图2B-2D)。因此，pNaKtide预防脂肪细胞功能失常，该效应在不希望受任何特定理论约束的情况下可能由于pNaKtide通过Na/K-ATP酶信号级联对细胞氧化还原的作用而产生。

果糖已被证明在暴露于成脂培养基的脂肪细胞中诱导氧化应激和增加脂肪生成。在本研究中，在3T3L1细胞中通过用pNaKtide处理，防止了果糖诱导的脂肪生成增加。类似地，向成脂培养基添加葡萄糖氧化酶也增加3T3L1细胞中的脂质积累和成脂标志物FAS和MEST，并且这通过同时用pNaKtide处理而显著减弱。在暴露于葡萄糖氧化酶的3T3L1细胞中，用pNaKtide处理还减少蛋白质羰基化并还阻断Na/K-ATP酶调节的Src和细胞外信号调节的激酶(ERK)1和2的激活。

实施例3-pNaKtide对高脂肪食料喂养的小鼠中体重以及内脏和皮下脂肪含量的影响

对于体内研究，将C57Bl6小鼠暴露于高脂肪食料4周，然后在另外的8周中，在继续高脂肪食料的同时通过IP注射给予不同剂量的pNaKtide。在平行实验中，罗丹明标记的肽被证实在脂肪组织中积累。每8天IP施用25mg/kg的pNaKtide在这些小鼠中大幅降低肥胖，其中较低的剂量具有较小的影响(图3和4A-4B)。然而，更频繁(每2天25mg/kg IP)施用pNaKtide诱导一些体液潴留，因此随后的研究集中在当每8天给予时，pNaKtide对成脂标志物和代谢情况的影响。

实施例4-pNaKtide对高脂肪食料喂养的小鼠中成脂标志物和脂联素表达的影响

高脂肪食料喂养的小鼠与对照组相比表现出内脏脂肪组织中FAS(图5A)和MEST(图5B)基因表达增加。与高脂肪食料喂养的小鼠相比，用pNaKtide(每8天25毫克/千克体重)处理显著减少FAS和MEST水平。另外，结果显示，与高脂肪食料喂养的小鼠相比，pNaKtide处理增加内脏脂肪组织中的脂联素水平(图5C)。这些观察结果支持以下假设：pNaKtide不仅降低脂肪组织质量，而且促进更健康的脂肪细胞的发育，并且脂联素水平与用常规食料所见到的水平相当。

实施例5–pNaKtide对高脂肪食料喂养的小鼠中代谢情况的影响

施用pNaKtide逆转了高脂肪食料喂养的小鼠中的胰岛素抵抗表型。这以下述为特征：在同时用所述肽处理的小鼠中，HOMA-IR分值显著改善(图6A)、葡萄糖耐量改善(图6B)、内脏脂肪组织中氧化应激减弱(图6C)、并且循环脂联素水平显著升高(图6D)。在高脂肪食料喂养的小鼠中，施用pNaKtide还显著减弱内脏脂肪组织中高脂肪食料诱导的蛋白羰基化(图6E)以及c-Src和ERK1/2的激活(图6F和6G)。

实施例1-5的讨论

前述研究表征了pNaKtide对于与肥胖症和代谢失衡相关的状况的治疗潜力。氧化应激是慢性病理的常见伴发情况，久已牵涉在肥胖的发病机制中。过量的抗氧化剂在体外研究中已经显示出逆转该效应的希望，但在体内很少成功。前述研究证明了pNaKtide通过拮抗Na/K-ATP酶介导的ROS信号转导放大来有效降低肥胖和恢复代谢稳态。

还观察到，在鼠前脂肪细胞中，暴露于pNaKtide以剂量依赖性方式减弱对成脂培养基或外源施用氧化应激介导剂——果糖或葡萄糖氧化酶做出响应而产生的氧化应激以及脂质积累和肥胖症表型的显现。用pNaKtide处理的鼠前脂肪细胞中这种脂肪生成减少与成脂调节剂(包括PPARγ和FAS)的表达显著减少以及脂联素生产水平增加有关。因此，Na/K-ATP酶抑制剂防止功能失常的脂肪生成，该效应可能是由于所述抑制剂对细胞氧化还原的影响而产生的。转向通过高脂肪食料诱导的体内肥胖症模型，再次观察到腹膜内施用pNaKtide减弱了肥胖症发展和代谢综合征发展。在高脂肪食料喂养的小鼠中，pNaKtide处理导致体重增加显著减少，并伴有内脏和皮下脂肪含量减少。功能失常的脂肪细胞与胰岛素抵抗和高血糖发展有关，并且它们促成促炎症状态。严重的胰岛素抵抗、全身炎症、和保护性脂肪因子的失调是代谢综合征的特征。上述结果显示，pNaKtide减少氧化应激和胰岛素抵抗并增加脂联素水平。进一步证明了，肥胖症减轻与成脂蛋白质的变化有关。高脂肪食料喂养并用pNaKtide处理的小鼠表现出MEST和FAS表达水平降低，这进一步证明了pNaKtide介导的对肥胖和代谢失衡的消除。

这些观察结果由于几个原因是潜在令人感兴趣的。首先，所述研究明确证明了Na/K-ATP酶信号级联放大参与脂肪生成的ROS的能力，脂肪生成过程以前没有与强心类固醇或Na/K-ATP酶信号级联关联起来。然而，也许更重要的是，ROS放大可通过该路径来进行这一概念表明Na/K-ATP酶可以在以最终变得适应不良的氧化应激为特征的许多状况中充当潜在的治疗靶。也许因为pNaKtide靶向氧化剂的放大而不是初级信号级联，它可提供治疗肥胖症和代谢综合征的新途径。

在整个本文件中，提到各种参考文献。所有这样的参考文献通过引用并入本文中，包括在下面清单中列出的参考文献：

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45.美国专利号8,283,441.

46.美国专利号8,691,947.

47.美国专利申请序号13/166,252.

48.美国专利申请序号14/045,269.

49.美国专利申请序号14/399,625..

序列表

<110> 马歇尔大学科研协会

<120> 肥胖症治疗方法

<130> MA408/0MA39

<150> 62/109,816

<151> 2015-01-30

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Ala Thr Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile Ala Gly Leu Cys Asn Arg

1 5 10 15

Ala Val Phe Gln

20

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus

<400> 2

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

<400> 3

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys

1 5

<210> 5

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TAT NaKtide Fusion Polypeptide

<400> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ser Ala Thr

1 5 10 15

Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe

20 25 30

Gln

Claims

1.一种肥胖症治疗方法，所述方法包含向有需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。

2.权利要求1的方法，其中所述多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：1的序列、或其片段和/或变体。

3.权利要求1的方法，其中所述多肽拮抗剂还包括由选自SEQ ID NO：2-3的氨基酸序列编码的细胞穿透多肽。

4.权利要求1的方法，其中所述施用步骤包括口服施用、透皮施用、吸入施用、经鼻施用、局部施用、耳内施用、直肠施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、玻璃体内施用、或其组合。

5.权利要求1的方法，其中施用所述多肽拮抗剂减少对象的细胞中的脂质积累。

6.权利要求5的方法，其中施用所述多肽拮抗剂减少脂肪生成的量、减少脂肪细胞分化的量、和/或增加小脂肪细胞的量。

7.权利要求1的方法，其中施用所述多肽拮抗剂减少炎性细胞因子的量。

8.权利要求7的方法，其中所述炎性细胞因子是TNFα。

9.权利要求1的方法，其中施用所述多肽增加脂联素的量。

10.权利要求1的方法，其中施用所述多肽降低成脂标志物的表达水平。

11.权利要求10的方法，其中所述成脂标志物选自FAS、MEST和PPARγ。

12.权利要求1的方法，其中施用所述多肽减轻对象肥胖的程度。

13.权利要求12的方法，其中施用所述多肽降低对象的内脏脂肪量和/或皮下脂肪量。

14.一种减轻肥胖的方法，所述方法包含向有需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。

15.权利要求11的方法，其中所述多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：1的序列、或其片段和/或变体。

16.一种减少脂肪生成的方法，所述方法包含将细胞与Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂接触。

17.权利要求16的方法，其中所述多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：1的序列、或其片段和/或变体。

18.权利要求16的方法，其中所述细胞是前脂肪细胞。