CN1898260A - 具有抗肥胖活性的肽及其它相关应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型肽及其使用，包括多肽及相关分子在例如减肥和治疗肥胖方面以及与例如增加细胞脂肪质量相应疾病的应用。

Description

具有抗肥胖活性的肽及其它相关应用

发明领域

本发明涉及新型肽及其应用，包括多肽及相关分子在例如减肥和治疗肥胖和与如脂肪细胞质量增加相关的情况中的应用。

发明背景

下列说明包括可以用于理解本发明的信息。并不认为此处所提供的任何信息是现有技术或与本发明所述或所要求的内容相关，或是可以用于评估专利性的参考。

特征为在其靶向组织中减少胰岛素敏感性的胰岛素抗性是2型糖尿病病因的基本方面，并且通常与其它疾病，如高血脂、动脉粥样硬化和高血压(如X综合症)有关。胰岛素抗性的分子基础是复杂且多因素的。认为一个较近的关联是存在于肥胖质量和胰岛素敏感性之间的变化。在这个过程中脂肪细胞的改变的功能可能起到重要作用。已报道胰岛素抗性和高胰岛素血发生在肥胖或脂肪代谢障碍的个体中。两份最近的独立基因研究说明无脂小鼠具有严重的胰岛素抗性和高血糖症。

脂肪组织用作甘油三酯的能量存储库。还指出其是可以分泌出对细胞外信号有响应的大量生物活性分子的活性内分泌器官。脂肪细胞分泌的产物在系统能量体内平衡的调整中发挥作用，并且它们改变的表达和/或分泌物可能促成胰岛素抗性及其相关并发症。一种脂肪细胞分泌的产物是瘦素(leptin)，其是肥胖的中心调节器并且还影响葡萄糖的体内平衡。其它脂肪细胞分泌的分子包括TNFα、游离脂肪酸和最近表征的抵抗素。在胰岛素抗性状态中脂肪组织生产过多的TNFα。脂肪组织中的纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)和血管紧张肽原的增加的表达和分泌物可以在肥胖和血栓血管疾病以及高血压中起作用。

脂肪组织作为内分泌器官的角色还反应在最近的脂联素(一种仅由脂肪细胞分泌的激素)研究中。有报导认为在许多胰岛素抗性的动物模型和来自不同种族的肥胖人群和2型糖尿病患者中信使RNA(mRNA)表达和脂联素的分泌水平会降低。进一步，有报导认为脂联素(一种目的性的胰岛素敏化剂)的补充会降低高血糖、恢复胰岛素敏感性，并且会在不影响食物摄取的情况下引起小鼠持续的体重下降。

尽管已经确认了许多分泌因素，但是可以有其它的不确定因素在调整能量新陈代谢中起着重要的角色。此处公开并要求了一个我们发现的并且命名为“adipocyspin”的因素。

发明概述

此处所述并要求的本发明具有许多特性和具体实施方案，包括但不限于发明概述中所阐明或描述或提及的。此处所述并要求的本发明并不限于发明概述中所确定的特征或具体实施方案，发明概述仅仅为了说明而非限制。

在一方面，本发明提供一种编码adipocyspin多肽的分离的多核苷酸或一种与编码adipocyspin多肽序列的互补的分离的多核苷酸。

本发明包括，例如多核苷酸，所述多核苷酸包括编码具有减肥活性的多肽的序列，及其其活性或免疫活性片段，其包括，例如(a)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸：

MKCLLISLALWLGTVGTRGTEPELSETQRRSLQVALEEFHKHPPVQLA

FQEIGVDRAEEVLFSAGTFVRLEFKLQQTNCPKKDWKKPECTIKPNGR

RRKCLACIKMDPKGKILGRIVHCPILKQGPQDPQELQCIKIAQAGEDP

HGYFLPGQFAFSRALRTK                        [SEQ ID NO：1]；

(b)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸：

MRRLLIPLALWLGAVGVGVAELTEAQRRGLQVALEEFHKHPPVQW

AFQETSVESAVDTPEPAGIFVRLEFKLQQTSCRKRDWKKPECKVRPN

GRKRKCLACIKLGSEDKVLGRLVHCPIETQVLREAEEHQETQCLRVQ

RAGEDPHSFYFPGGFAFSKALPRS             [SEQ ID NO：2]；

(c)在严紧条件下与例如(a)或(b)或其任一的互补物杂交的多核苷酸；和(d)由于遗传密码能简并成如(a)、(b)或(c)所述的序列的多核苷酸序列。

在一些具体实施方案中，多核苷酸具有与(a)或(b)的多核苷酸相同或完全互补的至少约10、15、25、50或100连续碱基。

在其它具体实施方案中，多核苷酸是SEQ ID NO：5或6的完全序列，或者其编码具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其任一的片段的序列的adipocyspin多肽，其包括生物活性和免疫活性肽。

可以使多核苷酸与允许或增强细胞(如脂肪细胞或3T3 L1细胞)中多核苷酸表达的启动子或其它序列连接。

在另一具体实施方案中，提供一种重组载体(如表达载体)来表达adipocyspin多肽或其片段。

本发明还可以提供一种细胞(如细胞、真核生物、哺乳动物或人细胞)，其包括重组的adipocyspin多核苷酸或载体，还提供一种在多肽可以表达的条件下通过培养含有重组adipocyspin多核苷酸或编码adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白或其片段的载体来产生adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白或其片段的方法。

本发明还提供分离的基本上纯的或重组的adipocyspin多肽，或其生物活性或免疫片段，其包括，例如，由上述(a)-(c)编码的多肽。在一方面，多肽具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列。另一方面，多肽具有由保守性突变(其具有至少约60％、80％或90％或更多与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相同；)导致的与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2不同的氨基酸序列，和/或其与由SEQ ID NO：1或SEQID NO：2编码的全长多肽具有免疫性交叉反应的多肽。在另一方面，多肽具有一个、两个或三个分子内二硫键，例如其中连接至少两个半胱氨酸残基(例如与人类adipocyspin中半胱氨酸残基对应的或在小鼠adipocyspin的氨基酸位置62、72、83、86、101或116的半胱氨酸残基)以形成分子内二硫键的多肽。在一方面，多肽是融合蛋白。另一方面，例如，多肽具有天然的人类adipocyspin的活性，例如抑制前脂肪细胞形成脂肪细胞，和/或降低人体脂肪或脂肪组织质量。

在另一具体实施方案中，提供抗体或抗体片段(例如Fab片段或单链抗体)或与adipocyspin多肽特异结合的片段(如噬菌体呈现所产生的)。抗体可以是单克隆的并且使其以至少约10⁸M^-1、优选至少约10⁹M^-1或至少约10¹⁰M^-1的亲和力进行结合。本发明还提供分离的细胞或能分泌抗体、抗体片段或抗体-结合片段的杂交瘤细胞。抗体、抗体片段或抗体-结合片段可以是人类的或嵌合的或人源化的。

本发明还提供通过以下检测样品中adipocyspin基因产物和/或其片段的方法：(a)使样品与特异性结合基因产物和/或其片段的探针接触，其中探针与基因产物和/或其片段形成复合物，并且检测复合物的形成；或(b)在生物样品中特异性扩增基因产物和/或其片段，其中所述基因产物和/或其片段是多核苷酸，并且检测扩增产物；其中复合物的形成或扩增产物的存在与生物样品中adipocyspin基因产物和/或其片段的存在有关联。在一个具体实施方案中，基因产物和/或其片段是多肽，而探针是抗体。在另一不同的具体实施方案中，基因产物和/或其片段是RNA，而探针是多核苷酸。

在另一方面，本发明提供一种确定adipocyspin活性的调制子的方法，所述方法可以包括以下步骤：(a)在测试化合物存在的情况下使多肽，如adipocyspin多肽，和adipocyspin受体和/或adipocyspin受体制品接触，和(b)将(a)中adipocyspin受体和/或adipocyspin受体制品和多肽的结合水平与没有测试化合物的情况下的结合水平进行比较，其中结合降低表示测试化合物是结合的抑制剂或阻断剂，而结合增加表示测试化合物是结合的增强剂或激活剂。在一个具体实施方案中，细胞表达adipocyspin多肽。

在另一方面，本发明提供用于识别或筛选adipocyspin的激动剂或拮抗剂的方法，其包括将测试样品和adipocyspin受体制品放置在一起，其中测试样品包括一种或多种测试化合物，而adipocyspin受体制品包括能结合到adipocyspin的adipocyspin受体蛋白；在将adipocyspin结合到受体蛋白的条件下孵育测试样品和受体制品；然后，鉴别这些含有可检测到地结合到受体蛋白的一种或多种测试化合物的测试样品。在另一具体实施方案中，本发明进一步包括：为了体外或体内刺激或抑制adipocyspin受体介导的活性，筛选可检测到地结合到受体蛋白的测试样品的步骤；并且识别这些作为adipocyspin的激动剂或拮抗剂的测试样品。在优选的具体实施方案中，通过测定来自由测试样品产生的受体蛋白制品中的标记的第一配基的置换来确定可检测到地结合到受体蛋白的测试样品，并且将测定的来自由测试样品产生的受体蛋白制品中的标记的第一配基的置换与来自由一种或多种已知第二配基产生的受体蛋白制品中的标记的第一配基的置换相比较。标记的第一配基和第二配基包括adipocyspin、adipocyspin激动剂或adipocyspin拮抗剂。可用的受体制品包括，例如，载有adipocyspin受体的分离的细胞、载有adipocyspin受体的分离的膜制品和分离的adipocyspin受体蛋白。当使用分离的膜作为受体制品时，特别优选来自基底前脑区域的膜。可以将用于上述任一方法的包括一种以上测试化合物并且产生阳性结果的的测试样品分离并且如需要可以复试多次，并且根据情况来识别测试样品中对产生阳性结果有响应的化合物。

在另一方面，本发明提供一种评估一种或多种试图由已知或候选adipocyspin激动剂或拮抗剂化合物确定的受体结合特性的方法，其包括：评估或测量化合物对抗结合到adipocyspin受体制品的标记的配基的能力；并且确定试图由所述化合物确定的受体结合特性。可以确定的结合特性包括，例如，结合亲和力和结合特异性。

在又一方面，本发明提供确定测试样品中需要测定的adipocyspin受体结合化合物的存在或数量的方法，包括：将测试样品与adipocyspin受体制品放置在一起；测定测试样品对抗结合到adipocyspin受体制品的标记的配基的能力；然后，任选地，使测试样品中adipocyspin受体结合化合物的量与为负对照样品测定的adipocyspin受体结合化合物的量相关联，已知负对照样品为非任何adipocyspin受体结合化合物，和/或使测试样品中adipocyspin受体结合化合物的量与为正对照样品测定的adipocyspin受体结合化合物的量相关联，正对照样品包含已知量的adipocyspin受体结合化合物，来确定测试样品中存在的adipocyspin受体结合化合物的存在和量。在又一进一步的具体实施方案中，例如，可以利用这个测定方法来评估adipocyspin制品的稳定性；评估adipocyspin制品的效力和评估adipocyspin制品的可溶性。

在另一方面，可以利用本发明的受体制品使用公知方法来制备抗adipocyspin受体的抗体，包括多克隆抗血清和单克隆抗体。

在另一方法，使用本发明来筛选细胞系、由组织取消隔离(desegregate)的细胞和来自人或动物血液的细胞，例如来识别这些带有adipocyspin受体的细胞。本发明的adipocyspin受体制品还可以结合到固相中并且用于多种亲和色谱层析法，并且用于例如adipocyspin的纯化或对已知或可能含有adipocyspin、adipocyspin激动剂或adipocyspin拮抗剂的样品的评估。本发明还提供一种识别adipocyspin活性的调节子的方法，例如，包括使表达重组adipocyspin多肽的细胞与测试化合物接触并且测定在存在测试化合物的情况下发生的生物效应，其中将诱发生物反应的测试化合物识别为adipocyspin活性的调节子或激活子。例如，这样的测试化合物包括，但不限于含有作为反义或RNAi多核苷酸的多核苷酸，包括能结合或修饰adipocyspin的多肽的多肽，和包括能调整能够发挥生物效应(如结合adipocyspin受体)的adipocyspin的水平的化合物。在一个具体实施方案中，测定的生物效应是从前脂肪细胞到脂肪细胞的转化率。

在另一方面，本发明提供一种制备药用的药物组合物的方法，包括配制adipocyspin或其活性片段，或adipocyspin活性(如，结合)的调节子。

在另一方面，本发明提供一种包含或基本上包含例如adipocyspin或其活性片段的药物组合物。也可以包括其他的药物上可接受的载体、赋形剂等。

本发明还提供一种通过确定化合物是否与adipocyspin或adipocyspin受体反应来识别用于治疗以下各种疾病或病征的化合物的方法：例如，adipocyspin介导或涉及adipocyspin的疾病和病征。

本发明还提供一种通过降低或增加哺乳动物中细胞或组织内adipocyspin的活性或表达或者对哺乳动物施用adipocyspin或其活性片段或adipocyspin的调节子来治疗具有以下各种疾病或病征的病患的方法：例如，adipocyspin介导或涉及adipocyspin的疾病和病征。在各个具体实施方案中，病征或疾病是指肥胖或与增加的脂肪组织质量有关的病征。在其他的具体实施方案中，哺乳动物希望可以减重和/或避免重量的增加。

在另一方面，本发明提供通过降低或增加哺乳动物中的细胞或组织内adipocyspin的活性或表达使adipocyspin或其活性片段或adipocyspin调节子在制备用于治疗以下各种疾病或病征的药物中的应用：adipocyspin介导或涉及adipocyspin的疾病和病征。在一个具体实施方案中，病征或疾病是指肥胖或与增加的脂肪组织质量有关的病征，增加胰岛素的效果。在另一具体实施方案中，哺乳动物希望可以减重和/或避免重量的增加。

本发明还提供一种用于确定adipocyspin活性或其片段的活性的方法，其包括将测试样品和adipocyspin受体制品放置在一起，测试样品含有adipocyspin或其片段，而adipocyspin受体制品含有能结合adipocyspin的adipocyspin受体蛋白；在使adipocyspin或其片段能结合到受体蛋白的条件下孵育测试样品和受体制品；然后，测定测试样品诱发生物效果的能力。在各种实施例中，adipocyspin受体制品包括或包含前脂肪细胞(如3T3 L1细胞和/或表达adipocyspin受体的细胞，如由编码adipocyspin受体的多核苷酸瞬时转染的细胞)，生物效果是前脂肪细胞到脂肪细胞的转化率和/或脂类的聚积和/或脂肪细胞标记(如PPARγ或GLUT4)表达的增加或降低。

本发明还提供一种含有adipocyspin多肽的组合物，其中adipocyspin多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。在一个具体实施方案中，组合物对诱导1μg/mL到20μg/mL的血浆adipocyspin多肽浓度是有效的，在另一具体实施方案中，浓度为1.9μg/mL到17μg/mL。

在另一方面，本发明提供一种诊断疾病状态存在于个体中或在个体中有发展倾向的方法，包括确定个体中adipocyspin多肽的水平，然后将该水平与未有疾病的个体的水平特征比较，其中水平的差异说明疾病的存在或发展趋势。在一个具体实施方案中，疾病状态选自高血糖、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、高血压、动脉硬化、冠性心脏病、缺血性心脏病、多囊性卵巢症候群、或与抗胰岛素有关的代谢症候群。在进一步的具体实施方案中，该方法使用电泳、HLPC或质谱分析。

本发明还提供一种治疗与adipocyspin失调有关的疾病状态的方法，包括施用有效量的含有adipocyspin多肽的药物上可接受的化合物。

adipocyspin多肽在制备带有或未带有药物上可接受的赋形剂、助活性剂、稀释剂和包封容器的药物、在制备用于哺乳动物的药物组合物或药物或药剂中的应用：i)在治疗与adipocyspin多肽调控有关的疾病状态中；或ii)来增强胰岛素的作用；或iii)抑制与增加的肥胖质量有关的肥胖症或状态。

附图说明

图1表示在脂肪转化过程中诱发的低分子量的脂肪细胞分泌的蛋白分离的2维电泳(2-DE)，其中在分化诱发的8天后，用PBS洗涤未融合的3T3-L1前脂肪细胞或脂肪细胞3次，然后和不含血清的DMEM一起培养4小时。收集，浓缩培养基，并且通过2-DE分离来自每个样品的50μg蛋白，并且用银染色以清楚显现，用箭头表示在脂肪细胞中优先分泌出来的蛋白。

图2表示通过反相HPLC和氨基酸序列测定得到的新型脂肪细胞分泌的产物的微观特征。点对应于如图1的multiple考马斯亮蓝染色的凝胶中切除的脂肪细胞-特异的蛋白，并且用胰蛋白酶消化。由RPHPLC分离胰蛋白酶的肽混合物来分离肽，并且图表表示显示RP HPLC部分的氨基酸序列。

图3表示adipocyspin的序列分析，其中(A)是小鼠adipocyspin的氨基酸序列，(B)是小鼠adipocyspin的简图，(C)是小鼠adipocyspin和小鼠cystatin C的类似cystatin区域的比对。

图4表示转染COS 7细胞分泌的adipocyspin。COS 7由编码COOH端被FLAG标记的全长adipocyspin的质粒瞬时转染，然后在DMEM中生长48小时。然后收集细胞培养基并且使用Vivian浓缩器(分子量截至(MWCO)为5000Da)浓缩。用SDS-PAGE分离来自细胞沉淀或培养基的20μg蛋白，并且用抗FLAG单克隆抗体或抗-β微管蛋白单克隆抗体探测。在细胞介质中很容易地探测到adipocyspin，而β微管蛋白无法探测。

图5表示adipocyspin mRNA的分化依赖的表达。在激素分化后的指示时间点上从NIH 3T3细胞或从3T3 L1细胞中纯化总RNA。使用32P标记的adipocyspin DNA对来自每个样品的10μg总RNA进行RNA印迹分析。在adipocyspin边上的18S RNA杂交信号表示为RNA加载的对照。

图6表示肥胖小鼠(ob/ob)中adipocyspin基因表达的调节异常，通过RNA印迹分析对来自瘦肉(ob/+)或肥胖(ob/ob)颊脂垫的10μg总RNA进行分析。如所示，用对应于adipocyspin和脂联素的32P标记的cDNAs探测相同的膜。如图5，18S RNA杂交信号表示为RNA加载的对照。

图7显示出adipocyspin抑制3T3 L1前脂肪细胞的分化。如图4所示，从瞬时转染的COS 7细胞中纯化FLAG标记的adipocyspin。从没有20μg FLAG标记的adipocyspin下(结果显示于A)或从存在20μgFLAG标记的adipocyspin下(结果显示于B)诱发3T3 L1细胞进行分化，其中每一个载物片在分化后第6天取出。用油红O对细胞染色，在光学显微镜下目测。

图8表示出adipocyspin抑制脂肪细胞中脂肪细胞-特异性基因产物的表达，其中在没有(泳道1)或存在(泳道2)20μg FLAG标记的adipocyspin的情况下分化3T3 L1细胞。如图7所示，每一个载物片在分化后第6天取出，其中如图5，通过RNA印迹分析对来自这些细胞的10μg总RNA进行分析，并且用对用于PPARγ或GLUT4的32P标记的cDNAs进行探测。

图9显示小鼠，大鼠，人和鸡的adipocyspin的cDNA序列。

图10显示人和鸡的adipocyspin的蛋白序列。

发明详述

本发明不限于所述中的特定方法、方案、细胞系、载体、组合物和试剂，因为它们是可以变化的。还要知道此处所用的术语仅为了描述特定具体实施方案的目的，而并非限定权利要求所定义的本发明的范围。

I.普通技术

除非另外说明，本发明的实践可以使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、和免疫学的常规技术，其均在本领域的技术范围内。在如下文献中全部说明了这些技术：例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，second edition(Sambrook et al.，1989)和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，thirdedition(Sambrook和Russel，2001)，(此处联合作为“Sambrook”引用)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，including supplements through 2001)；PCR；The Polymerase ChainReaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；；Harlow和Lane(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，和Harlow和Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(此处联合作为“Harlow and Lane”引用)，Beaucage et al，eds.，Current Protocols inNucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York 2000)。

II.定义

此处所用的术语“等位基因”或“等位序列”是指编码adipocyspin多肽的基因(如编码adipocyspin多肽的多核苷酸)的天然的交替形式。等位基因得自突变(如核酸序列的变化)，且有时会产生变化的和/或不同调整的mRNAs或多肽，其结构和/或功能可以或不发生变化。会产生等位基因的普通突变归于可能或不影响编码的氨基酸的核苷酸的自然缺失、添加或取代。这些类型的变化的每一种可以单独发生、与其他的一起发生或在给定的基因、染色体或其他细胞多核苷酸中发生一次或多次。任何给定的基因可以没有、或有一个或多个等位基因形式。如此处所用，术语“等位基因”是指从基因转录过来的任一或全部基因或mRNA。

如此处所用，术语“氨基酸”是指天然或合成的氨基酸，以及氨基酸类似物，非天然的氨基酸，和以类似于天然的氨基酸的方式运作的氨基酸模拟物。天然的氨基酸是那些由遗传编码编码的氨基酸，和那些随后修饰的氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然的氨基酸相同的基础化学结构的化合物，如结合到氢、羧基、氨基和R基团的α-碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保持与天然的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸普通化学结构不同，但以类似于天然的氨基酸的方式运作的化学化合物。

术语“反义序列”是指具有序列互补或理想地或有用地与RNA序列互补的多核苷酸。这些术语特别表示结合到mRNA或其部分来通过核糖体阻断mRNA的翻译的核酸序列。反义方法通常是本领域公知的(见，如PCT出版物WO 94/12633和Nielsen等人，1991，Science254：1497；OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES，A PRACTICALAPPROACH，edited by F.Eckstein，IRL Press at Oxford University Press(1991)；ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS(1993，CRCPress))。

术语“组合物”是指包括特定的或其他含量的特定成分的产物，和任何直接或间接得自特定的或其他含量的特定成分的组合的产物。

当描述多肽时，术语“保守性取代”是指多肽的氨基酸组合物的变化，其基本上没有改变多肽的活性，如氨基酸被与其它具有相似性质的氨基酸取代，以使甚至主要(even critical)的氨基酸的取代基本上没有改变活性。提供功能相似的氨基酸的保守性取代图表是本领域公知的。下列六组的每一个都含有与另一个进行保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(1)；2)天门冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)，谷酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(1)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯基丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(见，Creighton，1984，Proteins，W.H.Freeman and Company)。

除了上述的保守性取代以外，氨基酸残基的其他修饰会导致“保守性修饰的变体”。例如，一个可以与所有的作为彼此置换的带电氨酸有关，无论其是阳性或是阴性。此外，保守性修饰的变体还可以得自单独的取代、缺失或添加，其改变、添加或去掉单独氨基酸或小部分氨基酸(如通常在编码序列中少于5％)。进一步地，保守性修饰的变体还可以通过用相同氨基酸的不同密码子来取代用于自然或野生类基因的氨基酸密码子来从重组多肽中制得。

术语“控制元件”或“调节序列”包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5′和3′非翻译区域，其中多肽或其它生物分子相互作用来进行转录或翻译。对于真核细胞，控制序列包括启动子和优选地增强子，如来自免疫球蛋白基因，SV40，巨细胞病毒，和多聚腺苷酸化序列，并且可以包括剪接供体和受体序列。根据所使用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的包括组成型的和可诱导的启动子的合适的转录和翻译元件。当涉及adipocyspin时，除自然与adipocyspin编码序列有关的启动子以外的启动子可以为“异源”启动子。

如此处所用，“衍生而得的”多核苷酸、寡核苷酸或核酸是指包括衍生取代基的寡-和多核苷酸。在一些具体实施方案中，取代基基本上不妨碍与互补多核苷酸的杂交。由附属的化学取代基修饰的(如通过已经合成的寡-或多核苷酸修饰，或通过在合成过程中加入修饰基或主链类似物)衍生而得的寡-或多核苷酸可以加入到代谢状态的活性真核细胞中来与adipocyspin DNA、RNA或蛋白杂交，其中它们会对现有(local)DNA、RNA或蛋白产生改变或化学修饰。或者，衍生而得的寡-或多核苷酸可以相互作用并且改变adipocyspin多肽，或者可以与adipocyspin DNA或adipocyspin基因产物相互作用，或者改变或调整adipocyspin DNA、RNA或蛋白的表达或功能的蛋白。示例性的附加化学取代基包括，例如德卟啉(texaphyrin)铕(III)，交联剂，补骨脂素，金属螯合物，(如用于铁催化分裂的铁/EDTA螯合物)，拓朴异构脢，核酸内切酶，核酸外切酶，连接酶，磷酸二酯酶，光力学卟啉，化学疗法药物(如阿霉素，doxirubicin)，嵌入剂，碱基修饰剂，免疫球蛋白链，和寡核苷酸。铁/EDTA是通常使用的化学取代基，其中核酸序列的现有分裂是理想的(Hertzberg等人，1982，J.Am.Chem.Soc.104：313；Hertzberg and Dervan，1984，Biochemistry 23：3934；Taylor et al.，1984，Tetrahedron 40：457；Dervan，1986，Science 232：464)。示例性的添加化学物包括：直系，如通过附属活性氨基(Corey and Schultz，1988，Science，238：1401)和其它直系化学物，尽管链霉抗生物素蛋白/生物素和异羟基洋地黄毒甙配基/抗异羟基洋地黄毒甙配基d抗体链方法也可以使用。连接化学取代基的方法描述于美国专利5,135,720，5,093,245，和5,055,556，其它连接的化学物可以由专业人员自行决定使用。

如此处所用，“可检测标记”具有本领域的常规含义，且表示检测或用于检测(如，由于物理或化学性质)的原子(如放射性核)、分子(如荧光素)或复合物，表示分子的存在或其能通过共价键或其它与另一分子连接。术语“标记”还表示共价键连或其它连接的分子(如酶的双分子)，其可以作为基质来产生可检测到的原子、分子或复合物。适用于此处的可检测标记包括，例如，通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学，化学仪器等可检测到的任何组合物。

术语“抗原决定部位”具有其在由抗体识别的抗原上的位置的传统含义。典型地，抗原决定部位是作为整个多肽的小部分的氨基酸片段。抗原决定部位可以是构象的(如不连续的)。也就是，它们可以从由通过蛋白折叠效应相邻的原始序列的不邻接部分编码的氨基酸中形成。

术语“融合蛋白”表示复合多肽，如单独邻近的氨基酸序列，由两个(或两个以上)在单一氨基酸序列中通常不会融合在一起的明显异源的多肽组成。因此，融合蛋白可以包括含有两个完全不同的氨基酸序列或两个相似或相同的多肽序列(条件是这些序列通常在自然界的单一氨基酸序列的相同构象中不能一起发现)的单一氨基酸序列。通常使用重组核酸的方法来制备融合蛋白，即从重组基因熔融产物的转录和翻译中获得，其熔融包括编码多肽的片段和编码异源多肽的片段，或通过本领域已知的化学合成方法来制备融合蛋白。

术语“基因产物”表示从基因或由基因编码的多肽中或从RNA翻译的RNA分子。

此处所用的用于如IgG抗体的术语“高亲和力”表示至少约10⁶M^-1，优选至少约10⁸M^-1，更优选至少约10⁹M^-1或更高，例如至多10¹²M^-1或更高的结合常数(Ka)。但是，“高亲和力”结合对其它抗体的同位型发生变化。

术语“免疫原”和“致免疫的”具有它们在本领域中的原始含义，即免疫原为能在对人体或动物进行注射后引起适应性免疫响应的分子，如多肽或其它抗原。

以其各种形式在此使用的前脂肪细胞到脂肪细胞的转化的术语“调节子”和“调整”表示与特定细胞表面受体、优选adipocyspin受体相关的活性的对抗作用、主动作用，部分对抗作用和/或部分主动作用。在各种具体实施方案中，“调节子”可以抑制或刺激adipocyspin表达或活性。这样的调节子包括与adipocyspin功能或表达促进或对抗的小分子；反义和核酶核酶的三联多核苷酸；基因疗法等。

术语“核酸”和“多核苷酸”可交互使用，表示脱氧核苷酸或核糖核酸及其单-或双链形式的聚合物。除非特别限定，多核苷酸序列的公开也表示互补的序列。如此处所用，术语“多核苷酸”包括寡核苷酸。

术语“寡核苷酸”或“低聚物”表示具有大约7个核苷酸或更多，多至大约100个核苷酸的核酸序列，例如其可以用作引物或探针。通常，寡核苷酸在长度上具有约10到约50个核苷酸，优选具有约12到约50核苷酸，经常在约15到约25核苷酸之间变化。

术语“可操作地连接”表示两个或两个以上多核苷酸(如DNA)片段之间的功能性关系：如启动子或增强子可操作地与编码序列链接，如果其能在合适的宿主细胞或其它表达系统中刺激序列的转录。通常，可操作链接的序列是邻近的，在单个序列的情况下，均是邻近的且在可读相中。但是，增强子并不需要处于接近其转录需要增强的编码序列。

术语“肽类似的”或“类似的”表示具有基本上与一个或多个adipocyspin多肽相同结构的或功能特征的合成化学化合物。通常，肽类似物用于药物工业中来作为非肽药物，其具有与三联肽类似的性质。这些类型的非肽化合物为“肽类似的”(Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and Fieidinger TINS p.392(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)，其均并入此处作为参考)。结构类似于治疗使用的肽的肽类似物可以用于产生相当或增加的治疗或预防性效果。通常，肽类似物与示例性多肽(即具有生物或药物活性的多肽)结构相似，如adipocyspin，但是具有任选有选自以下的键替代的一个或多个肽键：如，-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，和-CH2SO-。类似物可以全部由氨基酸的合成的非天然类似物组成，或者其是部分天然肽的氨基酸和氨基酸的部分非天然类似物的嵌合分子。类似物还可以与任何量的天然氨基酸的保守性取代基结合，只要这些取代基基本上不会改变类似物的结构和/或活性。例如，在本专利中可以确定类似的化合物，如果它具有进行结合或adipocyspin酶活性的能力。

通过“药物上可接受的”表示，例如，能与配方的其它成分相溶的载体、稀释液或赋形剂，并且对其的接受者不会有害或不理想地具有害处。

术语“多肽”在此处可与术语“蛋白”交互使用，并且表示由酰胺键连接的氨基酸残基组成的聚合物，包括合成的，天然的和非天然的它们的类似物(氨基酸和键)。肽是多肽的例子。

如此处所用，当用于描述多核苷酸和抗体时，“探针”表示特异性的或理想地结合其它分子的分子。探针的一个例子是“核酸探针”，其可以是DNA、RNA或其它多核苷酸。当给出核酸探针的特定序列时，已知也可以确定和包括互补的链股。互补的链股在靶向为特异性结合(如退火或杂交)到基本上互补的核酸上的双链核酸的位置上同样运行。探针的另一个例子是特异性结合到相应抗原或抗原决定部位的“抗体探针”。

术语“重组”表示体外合成或操作的多核苷酸(如“重组多核苷酸”)，表示使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法，或表示由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。因此，例如，可以通过其产生方法或其结构定义“重组”多核苷酸。当涉及产生方法时，过程为重组核酸技术的使用，如，包括核苷酸序列中的人为干涉，典型地选择或生产。或者，通过产生包括两个片段(其彼此是非天然相近的，但表示排除自然产物)的融合的序列来制得多核苷酸。因此，例如，当产物是含有通过任何合成寡核苷酸的方法衍生的序列的多核苷酸时，可以包括通过任何非天然的载体转换细胞得到的产物。类似地，“重组”多核苷酸是从重组多核苷酸表达的一种。

术语“选择性杂交”表示与特定靶向DNA或RNA序列杂交、双连或结合至理想程度的多核苷酸探针，当靶序列存在于总细胞DNA或RNA的制备中时。

当涉及抗体与蛋白或多核苷酸之间的相互作用时，术语“特异性免疫活性的”或“特异性结合”表示以相对高的亲和力特异性识别和结合到蛋白，如adipocyspin，以使得这样的结合可以确定在异种类群蛋白或其它生物体中蛋白的存在的抗体。因此，在指定的免疫测定条件下，特异性抗体与特定多肽结合并且不会以明显或特别不理想的量与其它存在于样品中的多肽结合。可以使用各种免疫测定形式来选择对特定多肽具有免疫活性或特异性免疫活性的抗体。例如，可以常规地使用固相ELISA免疫测定来选择对多肽具有特异性免疫活性的单克隆抗体。见，Harlow，1988，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York(此处为“Harlow”)，其是用于确定特异性免疫活性的免疫测定形式和条件的描述。

如此处所用，“基本上序列相同”或“基本上相同”(用于对比两个或两个以上多肽或多核苷酸的上下文中)表示具有至少60％，优选80％，最优选90％，95％，98％或99％核苷酸或氨基酸残基相同的两个或两个以上序列或子序列，当通过使用下列序列对比算法或通过目测来对比和排列最大对应程度时。可以根据全长(如，如果它们具有基本上不同的长度，全长为两个中稍短的长度)或根据子序列(如至少约50，约100，约200，约500或约1000邻近的核苷酸或至少约10，约20，约30，约50或约100邻近的氨基酸残基)来比较两个序列。如此处所用的基本上相同的多肽优选具有普通功能的活性(如生物活性)。

对于序列的比较，典型地，一个序列作为参考序列，测试序列与该序列相比。当使用序列对比算法时，将测试和参考序列输入计算机，指明子序列坐标，如果需要，指明序列算法程序参数。然后序列对比算法计算出测试序列相对于参考序列相同的序列百分数，以指明的程序参数计。

可以通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部相同算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的相同排列算法，通过Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)对类似方法的研究，通过这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)，或通过目测(见，Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(2001年的增刊))来进行最佳化排列的序列的对比。当使用上述任何算法时，使用“Window”长度、空隙罚分等默认参数。

适于确定序列相同百分率和序列相似度的算法的一个例子是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.BioI.215：403-410(1990)。进行BLAST分析的软件是公开的，来自National Center forBiotechnology Information(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这个算法包括通过确定询问序列中长度W的短字符来首先确定高分的序列对(HSPs)其当与数据库序列的相同长度的字符排列时匹配或满足一些正的阈值T。T表示邻域字符阈值(Altschun等人，supra)。这些最初的邻域字符的碰击作为发起搜索包含它们的较长HSPs的种子。然后沿着每个序列的两个方向延伸这些字符的碰击直至积累的排列分值有所增加。每个方向中字符碰击的延伸会停止：当通过从其最大的可达到值定量X来使积累排列分值下降时；由于一个或多个负值残基的排列的累积累积排列分值会达到0或更低；或到达任一序列的终端。BLAST算法参数W，T和X确定排列的敏感度和速度。BLAST程度使用11个的字符长度(W)，BLOSUM 62分值矩阵(见，Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))，50的排列(B)，10的预期(E)，M＝5，N＝4且两股的比较作为默认值。

除计算序列相同百分率以外，还可以使用BLAST算法进行两个序列之间相似度的统计分析(见，如Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似度的测量是最小的加合可能性(P(N))，其提供一种在两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生的匹配的可能性的指示。例如，如果测试核酸和参考核酸的对比中的最小加合可能性为小于约0.1，优选小于约0.01，最优选小于约0.001时，认为核酸与参考序列相似。

两种核酸序列或多肽基本上相同的进一步指示是第一多肽(如由第一核酸编码的多肽)与第二多肽(如由第二核酸编码的多肽)免疫性交叉反应。因此，典型地，多肽基本上与第二多肽相同，例如其中两种肽仅仅保守性取代不同。

两种核酸序列基本上相同的另一指示是在严格条件下两个分子互相杂交。当典型地，使用衍生自探针核苷酸序列的至少约50个邻近核苷酸，在严格杂交作用下使这些片段与链股或其互补物杂交时，存在基本上的相同。

典型地，如果偶然发生的观察到的不同的可能性(p值)小于一些预定水平时，确定为“统计学上明显的”不同。如此处所用的“统计学上明显的不同”表示小于0.05，优选小于0.01，最优选小于0.001的p值。

典型地，“严格的杂交条件”表示靶向序列的溶解温度(Tm)以及精确或接近精确补充靶向的探针以下的约5℃到约20℃或25℃的范围内。如此处所用，溶解温度是双链核酸分子群半分离成单链时的温度。计算核酸Tm的方法是本领域公知的(见，如Berger和Kimmel，1987，Methods In Enzymology，Vol.152：Guide To Molecular CloningTechniques)San Diego：Academic Press)Inc.和Sambrook等人，supra；(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd Ed.，Vols.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory)。如标准参考所示，可以通过以下方程式计算Tm值的简单评估：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，当核酸为1M NaCl的溶液时(见，如Anderson和Young，“Quantitative Filter Hybridization”inNucleic Acid Hybridization(1985))。其它参考包括需要考虑用于计算Tm结构和序列特征的更复杂计算。杂交的溶解温度(由此为严格杂交的条件)受各种因素影响，如探针的长度和性质(DNA，RNA，碱性组合物)和靶向的性质(DNA，RNA，碱性组合物，存在于溶液中或非流动的，等)，和盐和其它组分的浓度(如，存在或不存在甲酰胺，葡聚糖硫酸酯，聚乙二醇)。这些因素的影响是已知的，且在本领域的标准参考中有所讨论(见，如Sambrook，supra，和Ausubel，supra)。典型地，严格杂交条件为小于约1.0M钠离子，典型在7.0-8.3pH值时约0.01-1.0M钠离子的盐浓度，和对短探针(如10到50核苷酸)为至少约30℃和对长探针(如大于50核苷酸)为至少约60℃的温度。如所知，还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来达到严格条件，其中可以使用低温。

当涉及蛋白或多肽，如adipocyspin时，术语“基本上纯的”或“分离的”表示整个或部分从蛋白或其它与它们自然相关的内容物中分离出来的那些多肽。如，当含有蛋白的组合物中的蛋白占大于约50％总蛋白含量时，典型地大于约60％总蛋白含量时，认为蛋白或多肽是基本上纯的。更典型地，基本上纯的或分离的蛋白或多肽占总蛋白的至少75％，更优选至少90％。优选地，蛋白占组合物中总蛋白的大于约90％，更优选大于约95％。当涉及多核苷酸时，术语“基本上纯的”或“分离的”通常表示从一般与如脂类，蛋白或其它多核苷酸相关的内容物中分离出来的多核苷酸。基本上纯的或单独的多核苷酸大于约50％的纯度。典型地，这些多核苷酸大于约60％纯度，更典型地为约75％到约90％纯度，优选为约95％到约98％纯度。

术语“治疗有效量“表示由研究人员、兽医、医生或其它临床医师试图引出的组织、系统、动物或人体的生物或医学响应的目标化合物的量。

如此处所用，“生物效果”包括前脂肪细胞到脂肪细胞的转化。

我们发现并且描述了一种新型的脂肪细胞分泌的因子，称之为“adipocyspin”(具有17kDa的清楚分子量和9.4的pI值)。其优选从3T3 L1脂肪细胞中表达并分泌出来，但不会来自相应的前脂肪细胞。我们还发现下列氨基酸序列分析和cDNA克隆，其中这个蛋白含有假定的分泌作用的信号肽，随后是与半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有一些序列同源的区域。在3T3 L1前脂肪细胞中不能目测到adipocyspin mRNA，而在随后的激素引发的脂肪转化中明显增加。其在脂肪组织中的表达在肥胖状态下明显增加。

从瞬时转染COS 7细胞中纯化的FLAG标记的adipocyspin的处理后3T3 L1细胞对脂肪细胞的转化受到明显抑制。脂肪细胞上的调节表达模型和抑制效果支持我们的发现，即adipocyspin在脂肪形成的反馈调节中起作用。我们进一步发现adipocyspin可以下调前脂肪细胞到脂肪细胞的转化。该化合物的使用包括，例如在关于增加的或降低的或异常的或不理想的前脂肪细胞到脂肪细胞的转化率的情况下的施用或抑制，如与脂肪细胞增生有关的那些。使用还包括肥胖的治疗和用于减重和/或防止体重增加。

其它的应用包括脂联素或其活性片段的施用。施用可以在缺乏脂联素的状态，或在其中额外的或增加的脂联素活性是理想的状态或情况下。

在一方面，提供具有哺乳动物(如大鼠，小鼠或人)的adipocyspin基因或DNA或RNA的序列或子序列的多核苷酸。多核苷酸(如RNA，DNA，PNA或嵌合体)可以是单链的、双链的或混合的杂种。

多核苷酸可以具有编码SEQ ID NO：1(图1)或SEQ ID NO：2的序列或其任何子序列(如含有至少约15，至少约25，至少约50，至少约100，至少约200，或至少约500基的多核苷酸或其变体)的多肽的序列。也包括基本上与此处公开的adipocyspin多核苷酸的序列相同的多核苷酸。因此，还提供哺乳动物(如人)adipocyspin基因的天然的等位基因，如人的编码SEQ ID NO：2的分子的adipocyspin多核苷酸的等位基因变体。

如此处所述，在一些具体实施方案中，多核苷酸对具有与SEQ IDNO：1(图1)，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10类似的基本序列的多肽编码，或编码这种多肽(包括如融合蛋白)的生物活性或免疫活性片段；或衍生自该片断的嵌合、变异和/或进化形式。由于遗传编码的退化，还包括编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多肽或其生物活性或免疫活性片段的不同多核苷酸。在另一个具体实施方案中，提供不必需编码adipocyspin多肽而用于，如探针、引物、反义、三联、RNAi或核酶试剂等的adipocyspin多核苷酸。

还提供表达载体、细胞、细胞系和基因转录的生物体，其包括一种或多种编码adipocyspin的adipocyspin多核苷酸和/或一种或多种这种多肽的生物活性或免疫活性片段。在一些具体实施方案中，载体、细胞和生物体能够表达编码的adipocyspin多肽和片段。

可以通过重组的方式产生adipocyspin多核苷酸和多肽，或其任一的片段。见，如Sambrook等人，Berger和Kimmel，(1987)Methods InEnzymology，Vol.152：Guide To Molecular Cloning Techniques，SanDiego：Acadmic Press，Inc.；Ausubel等人，Current Protocols In MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(2001)。或者，可以使用本领域公知的常规方法化学合成adipocyspin多核苷酸、多肽或其任一的片段(见，如Narang等人，1979，Meth.Enzymol，68：90；Brown等人，1979，Meth.Enzymol.68：109；Beaucage等人，1981，Tetra.Lett.，22：1859)。在一些具体实施方案中，adipocyspin多核苷酸包括，如非天然产生的碱基，如脱氧肌苷(见，Batzer等人，1991，Nucleic AcidRes.19：5081；Ohtsuka等人，1985，J.Biol.Chem.260：2605-2608；Rosslini等人，1994，Mol.Cell.Probes 8：91-98)或修饰的主链残基或键，如肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯主链、硫代磷酸酯(phosphorothioate)主链等。

编码adipocyspin的多核苷酸可以适于各种突变或进化的方法来产生公开序列的变体。可以选择变体来保持所希望的生物活性，并且可以理想地在这样的活性中变化变体。在这样的变体产生之后或过程中发生该选择过程。可以使用化学或生物的突变方法，包括分离的核苷酸或宿主细胞的化学处理、定点突变技术、随机生物突变方法(包括在较差保真条件下的复制)、和定向的进化技术。多核苷酸可以适于使用此处所述的序列的DNA改组技术，如Stemmer所述那些(美国专利Nos.5,605,793；5,811,238；5,830,721)。多核苷酸可以适于体系的组合式突变方法，如Huse所述的那些。还可以使用在蛋白每一位置上的所有突变体的体系分析，并且可以使用一系列位置-特异性的退化核苷酸来完成分析(见，美国专利Nos.6,054,267；5,939,250；5,763,239；6,537,776；6,238,884；6,171,820；5,830,696；5,965,408和5,955,358)。还可以使用偏向的突变方法，包括基于取代矩阵的文库的使用(Schellenberger等的2002年10月24日公开的美国专利2020155460A1)。还提供这些方法的结合。提供产生这些突变体的方法，来作为此处所述的加入这些adipocyspin变体的adipocyspin的使用方法。

在一方面，提供编码adipocyspin多肽及其片段的多核苷酸，如具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的adipocyspin多肽，其生物活性或免疫活性(如抗原的)片段，其变体(如保守性的或等位变体)，或adipocyspin融合多肽。在一个具体实施方案中，多核苷酸包括、基本上由、或由编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、或SEQID NO：10序列的多核苷酸或其片段组成。在另一方面，多核苷酸编码具有不同序列(如由于种类序列的区别和/或遗传编码的退化)的天然的adipocyspin多肽或片段。在一些具体实施方案中，多核苷酸是除表达序列标记H67224、AI1131555、AA215577、AW190975或AI769466或编码牛PPR 1的多核苷酸(Matsuoka等人，1993，Biochem Biophys ResComm 194：540-11)以外的那些。

例如，多核苷酸可以用于调整adipocyspin多核苷酸(如正义或反义DNAs和RNAs)和多肽、或其任一的片段的表达。用于重组多核苷酸和多肽的表达的方法是本领域公知的。典型地，在用于制备adipocyspin多肽和多核苷酸及其片段的表达载体中使用多核苷酸。典型地，表达载体可以包括转录的和/或翻译的控制信号(如转录的调控元件、启动子、核糖体-结合位点，和ATG起始密码子)。此外，可以通过适于使用中的细胞体系的增强子来增强表达的效果。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。

因此，例如将编码adipocyspin多肽或片段的DNA插入能导入到体外宿主细胞中和在体外宿主细胞中表达的DNA构建子中，所述细胞例如细菌(如E.Coli，Bacillus subtilus)、酵母菌(如Saccharomyces)、昆虫(如Spodoprera frugiperda)、或哺乳动物细胞培养体系。用于多肽表达和产生的哺乳动物细胞培养体系的例子包括人胚肾细胞系(293；Graham et al.，1977，I：Gen.Virol.36：59)；CHO(ATCC CCL 61和CRL 9618)；人宫颈癌细胞(He La，ATCC CCL 2)；和本领域其它公知的。可用的人和非人类细胞系来源很广，例如来自American TypeCulture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108(见http：//www.atcc.org)。表达多肽的哺乳动物组织细胞培养物的使用通常描述于Winnacker，FROM GENES TO CLONES(VCH Publishers，N.Y.，1987)和Ausubel，supra。

在各个体系中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子可以用于哺乳动物细胞系中的表达。适合的启动子是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调整或可控制的(如通过如糖皮质激素的激素)。可用的启动子包括，但不限于金属硫蛋白启动子、组成型的腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导的MMTV启动子、SV40启动子和本领域公知的启动子-增强子结合物。

可以使用通过本领域公知方法能整合到宿主细胞染色体的适当表达载体来在基因转录的动物(小鼠、羊、牛等)和植物(烟草、拟南芥(Arabidopsis)等)中表达adipocyspin和多肽或其任一的片段。

还提供用于检测或扩增adipocyspin多核苷酸的寡核苷酸或多核苷酸探针和/或引物。多核苷酸(如探针和引物)可以包括，或基本上由，或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2多肽中的编码至少约5个氨基酸，通常至少约10-12个氨基酸，典型地至少约15个氨基酸，通常至少约18个氨基酸，普遍至少约25个氨基酸(尽管它们还可以是50-100个氨基酸或更多)的连续碱基组成。当使用adipocyspin多核苷酸来作为探针或引物时，它们通常在长度上少于约3000碱基；典型地，它们含有约12到约500个编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相同或精确互补的连续核苷酸，更普遍为约12到约50连续核苷酸，甚至更普遍为约15到约25连续核苷酸。

还可以通过将限制位点加入探针或引物来修饰探针和引物。引物或探针还可以包括额外的序列，例如连接子。此外，可以用可检测标记修饰引物或探针。例如，引物和探针可以是放射性标记的，可以进行化学修饰，如衍生，加入修饰核苷酸碱基、或可以含有能与抗配体(如生物素)结合的配体。

Adipocyspin探针和引物可以用于多个目的中，如用于检测或扩增生物样品中adipocyspin多核苷酸，如此处进一步所讨论的。例如根据此处的指导，本领域技术人员能选择特异性扩增样品中所有或一部分adipocyspin基因、mRNA或cDNA的引物对。优选地，选择引物对和扩增条件来不扩增其它多核苷酸序列，如样品中其它的信使RNAs(由于adipocyspin引物的3′端碱基和其它基因序列之间的互补性)。

还提供抑制性多核苷酸，如反义、三联、和核酶和RNAi试剂，其靶向或杂交adipocyspin多核苷酸。

在另一方面，提供可以用于抑制或下调adipocyspin基因的表达的反义寡核苷酸和多核苷酸。一些治疗方法可以包括在体内生物条件下施用用于抑制和/或刺激adipocyspin活性的寡核苷酸，并且在这些条件下在足以产生治疗效果的时间内相对稳定。使用本领域公知方法，可以修饰多核苷酸来赋予这样的稳定性并且有助于将寡核苷酸靶向传送至所需组织、器官或细胞中。

反义多核苷酸可以包括或基本上由与从至少约10个碱基、典型至少约12-14个，至多约800连续核苷酸中转录的序列或整个转录长度特异性杂交的反义序列组成。更普遍地，反义多核苷酸可以是约12到约50核苷酸的长度，或约15到约25核苷酸的长度。通常，反义多核苷酸应该足够长以形成稳定的双链，但根据传送模式要足够短以进行体内施用，如需要。需要与靶向序列特异性杂交的多核苷酸的最小长度取决于几个因素，如G/C含量，错配碱基的配置(如果有)，与靶向多核苷酸类群相比的序列的唯一性程度，和多核苷酸的化学性质(如甲基膦酸盐主链、肽核酸、硫代磷酸酯)；及其它因素。

通常，要确保特异性杂交，反义序列基本上与靶向adipocyspinmRNA序列互补。在特定具体实施方案中，反义序列与至少部分靶向序列完全互补。反义多核苷酸还可以包括核苷酸取代、插入、缺失、转移、转位或修饰，或其它核酸序列或非核酸部分，只要能保留特异性的或理想的结合到对应adipocyspin RNA或其基因的相关靶向序列作为多核苷酸的功能性质。

在一方面，反义序列与adipocyspin mRNA的相对易接近的序列(如相对缺少二级结构)互补。通过使用如MFOLD程序(Genetics ComputerGroup，Madison WI)分析预先的RNA二级结构并且根据本领域的公知进行体内或体外测试来确定该反义序列。另一个确定有效的反义组合物的可用方法使用寡核苷酸的合并排列(见，如Milner et al.，1997，Nature Biotechnology 15：537)。

还提供具有除反义序列以外的序列的反义多核苷酸(即除反-adipocyspin-义序列以外的)。在这种情况中，可以在较长序列的多核苷酸中包含反义序列。在另一具体实施方案中，多核苷酸的序列基本上由反义序列组成，或是反义序列。

可以使用任何适于产生核酸的方法(如此处公开的化学合成和重组方法)来制得反义核酸(DNA，RNA，PNA修饰的，类似物等)。在一个具体实施方案中，例如，可以通过重新(de novo)的化学合成或通过克隆来制备反义RNA分子。例如通过在可操作性连接至载体(如质体)中的启动子的相反方向插入(连接)adipocyspin DNA序列来制得与adipocyspin mRNA杂交的反义RNA。只要适当放置启动子和优选地终止子和多聚腺苷化信号，所插入的对应非编码的链的序列的链就可以转录并且其可以作为反义寡核苷酸。可以使用反义寡核苷酸来抑制非细胞浸出物、细胞和动物(包括哺乳动物和人)中的adipocyspin活性。

对于关于反义多核苷酸的常规方法，见ANTISENSE RNA ANDDNA，(1988)，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)和Dagle等人，1991，Nucleic Acids Research，19：1805。对于反义治疗，见Uhlmann等人，Chem，Reviews，90：543-584(1990)及其它。

还提供的是寡-和多核苷酸(如DNA，RNA，PNA，修饰的，类似物(或类似的)，其结合到双链或双链的adipocyspin核酸上(如在adipocyspin RNA的折叠区域或在adipocyspin基因中)，以形成含有三重螺旋、或“三联”核酸。三重螺旋形式会通过如防止adipocyspin基因的转录，由此降低或消除细胞中的adipocyspin活性来抑制或下调adipocyspin表达。不打算被任何特定的行为理论或机理限制，认为三重螺旋对损害了双重螺旋打开足以使聚合酶、转录因素或控制分子发生结合的能力。

使用三重螺旋形式的碱基配对原则(见，如Cheng等人，1988.J：Biol.Chem.263：15110；Felrin and Camerini-Otero，1991，Science354：1494；Ramdas等人，1989，J：Biol.Chem 264：17395；Strobel等人，1991，Science 254：1639；和Rigas等人，1986，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.83：9591)和adipocyspin mRNA和/或基因序列来构建三联寡-和多核苷酸。典型地，三联形式的寡核苷酸包括或基本上由或由与adipocyspinRNA或基因的特异性序列互补的约10到至少约25核苷酸或更长(即足够长以形成稳定的三重螺旋形式，但足够短，根据释放模式用于体内施用，如需要)的特异性序列组成。在本文中，“互补”意味着能形成稳定的三螺旋。在一个具体实施方案中，寡核苷酸特异性结合到adipocyspin基因(例如adipocyspin 5′旁侧序列、启动子和增强子)的控制区域中，或结合到转录起始位点(如在转录起始位点的约-10到约+10)。对于使用三联DNA的最近治疗发展，见Gee等人，in Huber andCarr，1994，MOLECULAR.AND IMMUNOLOGIC APPROACHES，Futura Publishing Co.Mt Kisco NY和Rininsland等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：5854。

还提供用于抑制或下调adipocyspin活性的核酶。核酶结合且特异性切割且失活adipocyspin mRNA。可用的核酶可以包括与adipocyspinmRNA互补的5′-和3′-端基序列，并且根据此处公开的adipocyspinmRNA序列由本领域技术人员进行操作(见，PCT公开WO 93/23572，supra)。核酶包括具有具有族I内含子核酶特征的那些(Cech，1995，Biotechnology 13：323)，和其他锤头核酶(Edgington，1992，Biotechnology 10：256)。

核酶包括具有分裂位点(如GUA，GUU和GUC)的那些。其它对adipocyspin活性具有核酶-介导抑制的最佳分裂位点包括描述于PCT公开WO 94/02595和WO93/23569中的那些。可以用为使寡核苷酸更理想化的二级结构特征来评估对应于靶向adipocyspin基因的含有分裂位点的长度在约15到约20核糖核苷酸的短RNA寡核苷酸。还可以通过使用核酶保护方法测定与互补寡核苷酸的杂交的可达性，或根据本领域公知的标准方法测定体外核酶活性，来评估分裂位点的适宜性。

如Hu等人于PCT公开WO 94/03596所述，可以在单个的寡核苷酸中结合反义和核酶的作用。而且，核酶可以包括或基本上由或由一种或多种修饰核苷酸或核苷酸之间的修饰连接组成，如上与示例性反义寡核苷酸结合所述。

在一个具体实施方案中，核酶通常在体外产生并且加入到细胞或病患体内。在另一个具体实施方案中，基因治疗方法用于体内或体外的靶向细胞中的核酶的表达。

还提供用于通过如RNA干扰(RNAi)的方法抑制adipocyspin活性的多核苷酸，其还可以包括协同抑制和压制。基因抑制的这种和其它技术是本领域公知的。这种技术描述于Science 288：1370-1372(2000)。RNAi在转录后水平上操作并且是序列特异性的。该方法包括将具有部分或全部双链特征的RNA，或该RNA的前体或能够编码这样的RNA加入到细胞或细胞外环境中。

如Fire等人在美国专利No.6,506,559中所述，RNA可以包括聚合的核糖核苷酸的一个或多个链。可以通过单个的自身互补的RNA链或两个互补的RNA链形成双链结构。RNA可以包括对磷酸盐-糖主链或核苷酸(如上与示例性反义寡核苷酸结合所述的)进行修饰。可以从细胞的里面或外面引发RNA双链体的形成。

研究标明一种或多种核糖核酸酶会特异性结合至双链RNA和将双链RNA分裂成短片段。核糖核酸酶与这些片段保持关联，其依次特异性结合至互补的mRNA上，即特异性结合至用于adipocyspin编码的转录mRNA上。Adipocyspin的mRNA还通过核糖核酸酶降解成短的片段，因此避免adipocyspin基因的翻译和表达，从而抑制或下调adipocyspin活性。此外，RNA聚合酶可以有助于大量重复的短片段的合成，其指数地增加系统的效率。这种基因抑制途径的独特的特征是沉默并不限于已经引发的细胞。基因沉默效果可以传送至生物体的其它部分，且甚至通过胚系遗传至几代。

还提供用于产生基因构建物的多核苷酸以沉默adipocyspin基因。多核苷酸还用于产生编码对adipocyspin基因特异性的单个自身互补的RNA序列的基因构建物。可以通过任何本领域公知或发现的方法传送基因构建物和/或adipocyspin特异性的自身互补的RNA序列。在基因构建物中，正义和反义序列中排列使用以适当的连接方向排列的供体和受体接合位点的内含子序列。另一方法可以使用各种长度的间隔序列，而不是离散的内含子序列来产生可操作且有效的构成物。在adipocyspin基因构成物产物的转录后过程中，剪切内含子序列，使正义和反义序列和接合连接序列结合形成双链RNA。选择核糖核酸酶与双链RNA结合并剪切该双链RNA，由此引发导致adipocyspin mRNA基因序列降解的级联(cascade of events)，和对adipocyspin基因的沉默。

或者，除了使用基因构建物来表达自身互补的RNA序列以外，可以将adipocyspin特异性双链RNA片段传送到一个或多个靶向面积上以使其在细胞质中内在化来产生基因沉默效果。以每细胞传送至少一个复制品的量加入RNA。较高剂量的双链材料可以产生更有效的抑制作用。抑制作用是序列-特异性的，这是由于对应于RNA的双向区域的核苷酸序列可以靶向基因的抑制或下调。含有与部分adipocyspin基因相同的核苷酸序列的RNA优选用于抑制或下调。还发现带有与靶向序列相关的插入、缺失和单点突变的RNA序列对抑制和下调有效。因此，通过本领域已知的比对算法来最佳化序列的一致性并且计算核苷酸序列之间的差别百分比。或者，可以将RNA的双向区域功能定义为能杂交部分靶向基因转录的核苷酸序列。

治疗方法包括施用能够在体内生物条件下抑制、下调或刺激adipocyspin活性的寡核苷酸，并且在这些条件下在足以产生治疗效果的时间中相对稳定。如上所述，修饰的核酸可以用于给出这样的稳定性，和用于靶向传送寡核苷酸到所需组织、器官或细胞中。

可以直接在适当的药物配方中以药品或间接地将核酸加入到细胞中(包括如脂类、免疫脂类、ballistics、对细胞的直接摄入等)来传送寡-和多核苷酸。对于疾病的治疗，将寡核苷酸以治疗有效量施用于病患。治疗有效量是足以改善疾病症状或调整靶向细胞中的adipocyspin活性的量。用于传送治疗目的的寡核苷酸的方法描述于，例如，美国专利5,272,065。其它施用药物有效的化合物和包含其的组合物的其他细节是公知或在此处有所提供的。在另一具体实施方案中，可以使用基因治疗或其它重组DNA表达策略传送寡-和多核苷酸。

基因治疗是指加入在其被转移入的(典型地)哺乳动物细胞上产生治疗上有用的表型效果的外源多核苷酸。在一方面，提供基因治疗方法和组合物来治疗与adipocyspin有关的情况。在示例性具体实施方案中，基因治疗包括向细胞中加入载体，该载体表达或诱导adipocyspin基因产物的表达(如基本上与具有SEQ ID NO：1或2序列的adipocyspin多肽相似的来增加adipocyspin活性的adipocyspin蛋白，或降低活性的抑制性adipocyspin多肽)，表达具有adipocyspin基因或mRNA序列的核酸(如降低adipocyspin活性的反义RNA)，表达影响adipocyspin基因产物的表达的多肽或多核苷酸(如指向adipocyspin mRNA来降低adipocyspin活性的核酶)或替代或分裂内源adipocyspin序列(如基因的替换和基因的敲除，控制序列的加入或缺失)。根据此处所公开的，大量具体实施方案对本领域技术人员是明显的。

在一个具体实施方案中，包括生理上可接受的载体和可操作编码adipocyspin多肽的裸露多核苷酸的制剂可以加入来产生其表达。加入包括裸露多核苷酸的配方的组合物描述于PCT公开No.WO 90/11092(Vical Inc.)，PCT公开No.WO 95/11307(Institut Pasteur，INSERM，Universit d’Ottawa)，和Tacson等人的Nature Medicine，2(8)：888-892(1996)和Huygen等人的Nature Medicine 2(8)：893-898(1996)。还可以使用Bolistic方法。

用于adipocyspin基因治疗的载体可以是病毒的或非病毒的，并且包括已知或此处所述关于adipocyspin表达系统的那些。本领域技术人员已知基因治疗载体可以包括启动子和其它控制或加工序列，如该公开所述。通常载体包括启动子和任选的，驱动寡-核糖核苷酸或多核苷酸转录的增强子(从包含在启动子序列中分离出来的)，以及如需要提供保持游离的基因或染色体的整合或高水平的转录的其它控制元件。用于基因治疗的质粒可以包括其它功能元件，如可选择的标记，识别区域和其它序列。其他的序列可以对细胞内外所给予稳定性，将adipocyspin核苷酸序列(正义或反义)靶向传送至特定器官、组织或细胞群、调整进入细胞的、调整进入细胞核和/或调整核DNA的整合起作用。例如，可以使用类似寡核苷酸配基(aptamer-like)的DNA构建或其它蛋白结合位点来将载体介导结合到细胞表面受体上或结合到连接受体的血清蛋白上，由此增加DNA转移进入细胞的效果。其它DNA位点和构建可以直接或间接结合到核膜中的受体上或结合到进入核的其它蛋白上，由此有助于载体的核摄入。其它DNA序列可以直接或间接影响整合的效果。

适合的基因治疗载体可以或不具有一个或多个复制原点。例如，在载体中包括一个复制原点用于在施用到病患以前的载体繁殖是有用的。但是，如果指明载体来整合入宿主染色体DNA或结合到宿主mRNA或DNA，那么在施用以前去除复制的原点。

如所述，还提供用于基因替换治疗的方法和试剂(即通过内源adipocyspin基因与重组基因同源重组进行的替换)。可以使用特别指明用于通过同源重组的整合的载体。最佳化同源重组的因素包括，例如，序列一致性的程度、与染色体序列同源的长度。介导同源重组的特异性序列也是重要的，因为在转录活性的DNA中整合更易发生。用于构成同源靶向构建物的方法和材料描述于Mansour等人，1988，Nature，336：348；Bradley等人，1992，Bio/Technology 10：534，还有美国专利Nos.5,627,059，5,487,992，5,631,153和5,464,764。在一个具体实施方案中，基因替换治疗还包括改变或替换所有或部分控制需要进行调整的基因的表达的控制序列。例如，可以通过插入或删除转录控制部位或插入外源启动子来降解adipocyspin启动子序列(如图5所示)以改变adipocyspin表达。

还提供用于体外或动物内的adipocyspin“基因敲除”的方法和试剂。使用重组产生的载体通过内源adipocyspin基因的同源重组进行的缺失或降解来进行。在基因敲除中，靶向序列是控制序列(如adipocyspin启动子)、或RNA或蛋白标记的序列。改变内源基因表达的同源重组的应用描述于美国专利No.5,272,071，WO 91/09955，WO93/09222，WO 96/29411，WO 95/31560和WO 91/12650。还见，Moynahan等人，1996，Hum.Mol.Genet，5：875。可以将基因治疗载体通过体内、体外的或回体(ex vivo)的方式加入细胞或组织中。对于回体治疗，可以将载体加入来自病患的细胞(如干细胞)中，且为了自身移植进行克隆繁殖在回到同一病患体内(见，美国专利Nos.5,399,493和5,437,994)。

还提供转基因非人类的多细胞生物体(如植物和非人类的动物)或单一细胞的生物体(如酵母菌)，其含有外源adipocyspin基因序列(其可以是编码序列或控制(如启动子)序列)。多细胞生物体的例子包括植物、昆虫和如大鼠、小鼠、兔子、猴子、猿、猪的非人类动物和其它非人类哺乳动物。单一细胞生物体的例子是酵母菌。在一个具体实施方案中，生物体表达具有人adipocyspin蛋白的序列的外源adipocyspin多肽。还提供单一细胞和多细胞生物体(或来自其的细胞)，其中编码adipocyspin的基因是变异或缺失的(如在编码区或控制区域)，以使得不表达天然adipocyspin，或当与野生类型的细胞或生物体相比，以降低的水平表达，或以不同的活性表达。这样的细胞和生物体通常是指“基因敲除”的细胞或生物体。

本专利进一步提供其中加入和表达外源adipocyspin基因或变体(如人adipocyspin)的细胞和生物体。外源adipocyspin基因或变体可以增加或替代内源adipocyspin基因。这种类型的细胞和生物体可以用作确定adipocyspin活性或表达的调节子或确定adipocyspin基因中突变效果的模型系统。

特异基因(如内源adipocyspin基因)的改变或分裂方法是本领域技术人员已知的，见，如Baudin等人，1993，Nucl.Acids Res.21：3329；Wach等人，1994，Yeast 10：1793；Rothstein，1991，Methods Enzymol，194：281；Anderson，1995，Methods Cell Biol，48：31；Pettitt等人，1996，Development 122：4149-4157；Ramirez-Soilis等人，1993，MethodEnzymol，225：855；和Thomas等人，1987，Cell 51：503。典型地，这些方法包括，如改变或替换所有或部分的控制将要被调整的特异基因的表达的控制序列。可以改变如天然启动子的控制序列。一个用于基因靶向突变的传统技术包括将含有感兴趣的基因的基因组DNA片段放置在载体中，然后克隆与在含有胸腺嘧啶脱氧核苷激酶的载体中的可选择的抗新霉素组合体周围的靶向基因有关的两个基因组臂。然后将“敲除”构成物转染到适当的宿主细胞(即小鼠的胚干(ES)细胞)，其随后进行正选择(使用G418，例如选择抗新霉素)和负选择(使用如FIAU来去除缺少胸腺嘧啶脱氧核苷激酶的细胞)，来选择与敲除载体进行同源重组的细胞。这种方法会使感兴趣的基因失活。见，例如美国专利5,464,764；5,631,153；5,487,992和5,627,059。

还可以通过同源重组进行内源基因的“敲除”表达来将异源核酸加入到感兴趣的基因的控制序列(如启动子)中。改变阅读框或破坏启动子的简单突变可以适用于防止功能酶或产物的表达。还可以使用“基因陷阱插入”降解宿主基因，小鼠ES细胞可以用于产生敲除的转基因动物，如Holzschu(1997)Transgenic Res 6：97-106中所述。其他方法是本领域公知的。

为了上调表达，可以用诱发更高水平转录的异源启动子取代天然启动子。

使用包括正被讨论的结构基因的核酸序列通过同源重组来改变内源基因的表达。上游序列可以用来靶向异源重组构建物。使用adipocyspin结构基因序列信息，如编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多肽的基因组多核苷酸序列，本领域的技术人员可以仅通过常规实验产生同源重组构建物。

改变内源基因的表达的同源重组描述于，如美国专利5,272,071，和WO 91/09955，WO 93/09222，WO 96/29411，WO 95/31560和WO91/12650。动物中同源重组描述于Moynahan(1996)Hum.Mol.Genet.5：875，而植物中的同源重组描述于Offringa(1990)EMBO J.9：3077。

还提供分离的基本上纯的或重组的adipocyspin多肽和adipocyspin多肽的免疫片段。在一个具体实施方案中，adipocyspin多肽或片段具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列或其子序列相同或基本相同的氨基酸序列。

还提供基本上纯的分离的或重组的adipocyspin多肽。在一些具体实施方案中，adipocyspin多肽具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。在其他具体实施方案中，adipocyspin多肽是由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸残基的保守性取代表征的变体和突变体。

多肽可以是如图3所示的物种的全长(如含有约150氨基酸)或可以编码全长蛋白的片段(如包括至少20、至少40、至少60或至少100残基的adipocyspin多肽或变体)。还提供相对于SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10的氨基酸序列以一些方式：例如切断、变异、衍生进行修饰的adipocyspin多肽；或融合到其他序列(如形成融合蛋白)的adipocyspin多肽。一些adipocyspin多肽包括相对于公开的序列的氨基酸残基的插入、缺失或置换。例如，可以进行保守性的氨基酸置换，即用具有相似结构特征(如净电荷、疏水性、极性、大小等)的不同氨基酸对选择的氨基酸进行置换。

Adipocyspin变体可以与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：9、或SEQ ID NO：10的adipocyspin多肽结构上或功能相似。通过如大量序列一致性(如上所述)或免疫交叉反应性表明结构相似性。功能相似性通过如抑制前脂肪细胞到脂肪细胞的转化来指明。

在一些具体实施方案中，adipocyspin变体可以包括在相当的氨基酸位点上图3B中所示的人adipocyspin氨基酸位点62、72、83、86、101和116上的至少两个半胱氨酸残基。可以将一个半胱氨基与另一个半胱氨酸相连以形成分子内双硫键，以使adipocyspin和/或adipocyspin异构体可以含有至多3个分子内双硫键。如上所述的相对于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列修饰的adipocyspin变体能形成其他分子内或分子间双硫键，例如，他们可以包括能形成分子内双硫键的其他半胱氨酸。可以通过突变或缺失一个或多个半胱氨酸将修饰Adipocyspin变体修饰来消除一个或多个双硫键，其可以改进稳定性、氧敏感性或药理性质。

在一些具体实施方案中，可以转录地、转录后地或翻译后地修饰adipocyspin多肽来产生各种adipocyspin变体和/或异构体。这样的修饰是本领域公知的，并且可以包括选择剪接、RNA编辑、蛋白水解、糖基化、磷酸化、聚乙二醇化(pegylation)、酰化、甲基化、硫酸化、异戊二烯化等。多肽可以具有通过基因的和/或化学方法加入能够糖基化或聚乙二醇化的位点，其可以改进adipocyspin的生物半衰期或其他药理性质。

在一些具体实施方案中，adipocyspin多肽或其片段可以用作免疫原(如产生抗adipocyspin的抗体)。典型地，致免疫的adipocyspin片段包括至少约6或更多SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10的连续残基，更普遍包括至少约8、至少约10、或至少约12、或约16个连续残基。

基本上纯的分离的或重组的adipocyspin多肽的特征在于它们与具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的序列的多肽具有特异性免疫反应的抗体的结合能力。特异性的免疫反应性的特征在于抗体与其配体(如adipocyspin)的特异性结合亲和力至少约10⁷、10⁸、10⁹、或10¹⁰M^-1。

对于许多应用，期望提供作为标记个体的adipocyspin多肽，即共价结合或键连到可检测的标记或基团，或可交叉链接的基团，来有助于给定环境中确定、检测或量化多肽。这些可检测的基团可以包括可检测的多肽基团，例如可测定的酶或抗体表位。或者，可检测的基团选自各种其他的可检测基团或标记，如放射性标记(如¹²⁵I，³²P，³⁵S)或致化学发光或荧光基团。类似地，可检测基团可以是底物、辅因子、抑制剂或亲和配体。

此外，通过用相同类型的D-氨基酸取代一个或多个氨基酸残基(如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)来产生具有额外稳定性的肽。类似地，还可以使用氨基或羧基端基的修饰来给予多肽稳定性，如羧基端基的酰胺化或氨基端基的胺化或聚乙二醇化的衍生物。

使用重组或合成方法制备adipocyspin多肽，或者从天然细胞源中分离adipocyspin多肽。

用于从adipocyspin多核苷酸中表达adipocyspin多肽的适合重组技术是公知的，或此处公开的。还见，Sambrook等人，1989，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，(2^nd ed.)Vols.1-3，Cold SpringHarbor Laboratory和Ausubel，supra。用于合成多肽(如adipocyspin多肽、变体或片段)的合成方法描述于Merrifield(1963)Amer.Chem.Soc.85：2149-2456，Atherton等人，1989，SOLID PHASE PEPTIDESYNTHESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press，和Merrifield，1986.Science 232：341-347。

通过本领域通常公知的方法进行adipocyspin多肽的分离和纯化。这些方法包括，但不限于离子交换、疏水性相互作用、HPLC、或亲和色谱法，来达到所需纯度。在一个具体实施方案中，可以使用免疫亲和色谱法纯化adipocyspin多肽。例如，将从adipocyspin多肽或其免疫片段(如具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列或子序列)中提出的抗体与适合的固体载体偶合并且在有助于将这种多肽与抗体结合的条件下与含有adipocyspin多肽(的多肽混合物如脂肪细胞的匀浆)接触。一旦adipocyspin多肽与免疫抗体结合，那么清洗固体载体来去除未结合的材料和/或非特异性结合的多肽。可以通过改变pH或缓冲液的盐浓度来以基本上纯的形式从固体载体中洗脱所需多肽。

尽管以上以“蛋白”或“多肽”进行描述，但是本领域技术人员知道上述多肽的结构类似物和衍生物(如肽类似物等)可以用作adipocyspin的取代物，如作为adipocyspin激动剂或作为adipocyspin拮抗剂。模拟肽(peptidomimetics)或肽拟态是通常在药物工业中用作非肽药物的肽类似物，其性质(如生物活性)与模板肽的相似(Fauchere，1986，Adv.Drug Res.15：29；Evans等人，1987，J.Med.Chem.30：1229)。例如，通常借助于电脑化分子模型来开发他们。与药物上可用的肽结构类似的肽拟态可以用于产生相当或基本相当的治疗效果。肽拟态可以在多肽具体实施方案中具有明显的优势，包括，如更经济的产率和更好的化学稳定性。

还提供抗体或抗体结合的片段，包括scFvs，其特异性或理想地与哺乳动物的adipocyspin多肽(如啮齿动物或人的adipocyspin)免疫反应。由此，抗体或结合片段可以特异性识别和结合具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其免疫片段的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的多肽。抗体通常显示至少约10⁷、10⁸、10⁹、或10¹⁰M^-1的adipocyspin的特异性结合亲和力。

抗adipocyspin抗体和片段具有许多用途，如adipocyspin多肽的分离(如通过免疫亲和色谱法)、adipocyspin多肽的检测和用于adipocyspin活性的抑制(如体内或体外)。

可以通过本领域技术人员公知的许多方法制得抗adipocyspin抗体，如supra所述。如所述，此处可以广泛定义抗体，并且包括片段、嵌合体和相似的结合剂(如噬菌体显示技术的产物)，该抗体可以特异性或理想地结合到adipocyspin多肽或表位。在一个具体实施方案中，抗体包括重组制备的单链或双链或多链多肽，其含有抗体轻和重链可变区(其足以进行抗原-特异性结合)和至少抗体轻和重链保守区的片段(如重链的CH1结构域)(其足以在双链多肽情况中保持两个多肽的关联)。在一个具体实施方案中，抗体是单链抗体(sFv)，如包括抗体轻和重链可变区，典型地，该抗体由适当的连接而适于结合adipocyspin或adipocyspin表位。

制备多克隆或单克隆抗体的方法是本领域公知的。见，如Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites等人，(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(7^thed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，及其参考(“Stites”)；Goding MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler and Milstein，1975t Nature 256：495-97；和Harlow and Lane。这些技术包括通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体库中选择抗体来制备抗体。见，Huse等，1989，Science 246：1275-81；和Ward等人，1989，Nature 341：544-46。

为了制备多克隆抗体，选择适合的靶向免疫系统，典型地小鼠或兔子，但还包括山羊、绵羊、牛、鸡、天竺鼠、猴子和大鼠。可以通过包括亲和纯化的常规方法对得自宿主的免疫球蛋白进行沉淀、分离和纯化。如需要，通过多克隆血浆的色谱纯化得到基本上单一特异性的抗体群。

对于单克隆抗体，将选择适当的动物且随后进行所需的免疫作用。抗体可以是任何同位型，如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，优选IgG、IgA和IgM，最优选IgG。优选的单克隆抗adipocyspin抗体中和(即抑制或阻断)adipocyspin的一种或多种生物活性。通过筛选所需的20抑制的活性的杂交瘤上层清液来得到这样的抗体。可以通过下述描述的方法产生具有10⁸升/摩尔，优选10⁹或10¹⁰或更强的亲和力的单克隆抗体。非人(如鼠科、兔科、马)的单克隆抗体的生产是公知的，并且通过如用包含adipocyspin或其片段的制剂对宿主动物进行免疫来完成。对得自免疫动物的产生抗体的细胞无限增殖和筛选，或对结合到adipocyspin多肽的抗体先筛选再无限增殖。

可以以本领域公知技术人源化或嵌合制得单克隆抗体。一些抗adipocyspin单克隆抗体是人源化的、人的或嵌合的，来减少它们潜在的抗原性，而不降低它们对其靶向的亲和力。人源化的抗体可以如本领域所述制得，见如，30 Queen等人，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86：10029；美国专利Nos.5,563,762；5,693,761；5,585,089和5,530,101。用于人类化的人抗体序列可以是天然的人抗体的序列或是几个人抗体的共有序列。见，Kettleborough等人，Protein Engineering 4：773(1991)；Kolbinger等人，Protein Engineering 6：971(1993)。抗adipocyspin的人源化单克隆抗体还可以使用具有人免疫系统的元件的转基因动物制得(见，如美国专利Nos.5,569,825；5,545,806；5,693,762；5,693,761；和5,7124,350)。

可用的抗adipocyspin抗体还可以使用噬菌体显示技术制得(见，如Dower等人，WO 91/17271和McCafferty等人，WO 92/01047)。在这些方法中，可以产生噬菌体库，其中成员在其外表面显示出不同的抗体。抗体通常显示为Fv或Fab片段。可以通过对adipocyspin多肽的亲和选择富集显示具有所需特异性的抗体的噬菌体。使用本领域公知的方法制得单链抗体(见，如Colcher等人，(1999)Ann.N Y Acad.Sci.880：263-80；Reiter)(1996)Clin.Cancer Res.2：245-52)；美国专利Nos.4,946,778；5,260,203；5,455,030；5,518,889；和5,534,621)。

一旦表达，可以根据本领域的标准方法(包括硫酸铵沉淀、亲和色谱法、凝胶电泳等)纯化整个抗体、其二聚物、单个的轻和重链或其它免疫形式(见，PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES ANDPRACTICE 3^RD EDITION(Springer-Verleg，N.Y.，1994))。

当存在于制剂中的至少约80％、更普遍至少约90％、甚至更普遍至少约95、，最普遍至少约99％或更高的多肽分子特异结合到相同抗原(如adipocyspin多肽)时，抗体(如抗adipocyspin抗体或其片段)是基本上纯的。对于药物上的使用，至少约90-95％同源性的抗adipocyspin免疫球蛋白是优选的，最优选98-99％或更高的同源性。

可以使用修饰或未修饰的抗体。通常，通过(共价或非共价)连接提供可检测信号的底物来标记抗体。这样的标记包括本领域公知的那些，如放射性标记、荧光或生物活性(如酶的)标记。作为标记的结合体，抗体可以特别地用于诊断应用中。

还提供杂交或“双特异性”抗体，其会具有抗adipocyspin多肽的抗体的特异性，但是还能特异性结合到第二部分。在杂交抗体中，一个重和轻链对来自一个抗体而另一对来自抗其它表位的抗体。这会导致多重功能效价的性质，如同时结合到至少两个不同表位的能力。可以通过产生各个组分抗体的杂交瘤的融合作用或通过重组技术来形成这样的杂交体。

在一些具体实施方案中，可以产生抗adipocyspin单克隆或多克隆抗血清，其特异性或理想地与adipocyspin免疫反应，并且对其进行选择来具有低的或所需水平的抗其它蛋白(如例如cystatin的同源蛋白)的交叉反应性；在用于免疫测定之前通过免疫吸收从多克隆抗血清中去除这样的交叉反应性。筛选和表征具有特异性的单克隆抗体的方法是本领域公知的，且描述于Harlow and Lane，supra。为了产生抗SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的蛋白的多克隆抗血清(如用于免疫测定)，使用本领域公知的方法制备多克隆抗血清，包括此处所述的方法。例如，在哺乳动物细胞系中制备重组蛋白。使用标准佐剂，如Freund’s佐剂和用SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的蛋白对小鼠近交系(如balb/c)进行免疫(见，Harlow and Lane，supra)。或者，衍生自一种或多种此处公开的序列并且与载体蛋白结合的合成肽可以用作免疫原。收集多克隆抗血清并在免疫测定中、如在具有固定在固体载体上的免疫原的固相免疫测定中对免疫原进行滴定。选择具有10⁴或更高滴定度的多克隆抗血清并且使用竞争性结合免疫测试测定其抗其它人半胱氨酸蛋白酶(如一种或多种cystatin或已知同系物)的交叉反应性，如Harlow andLane，supra，页570-573所描述。竞争性结合形式的免疫测定可以用于确定交叉反应性。例如将adipocyspin固定在固体载体上。加入到测定中的蛋白与抗血清和固定抗原的结合竞争。将上述蛋白与抗血清和固定抗原的结合竞争的能力与adipocyspin比较。使用合适的方法计算上述蛋白的交叉反应性的百分比。选择并汇集具有少于10％交叉反应性的这些抗血清，其每一个蛋白都列于以上。然后通过免疫吸收上述蛋白从富集的抗血清中去除交叉反应抗体。

在一方面，可以监测或确定adipocyspin的表达来对与adipocyspin控制有关的疾病状态或趋向于疾病状态的个体进行诊断或评估。在各种具体实施方案中，疾病状态是肥胖症和/或糖尿病，例如2型糖尿病，和/或已知为“综合症X”或“代谢综合症”的疾病(包括异常葡萄糖敏感性和/或葡萄糖非敏感性)。

可以从生物液体，如血浆、血清、尿、唾液或血液中得到adipocyspin，并且通过电泳、HPLC、质谱法、免疫法等分析adipocyspin。通过此处所述的或本领域公知的任何方法监测表达情况。

通过监测个体中adipocyspin的水平来完成监测。在一个具体实施方案中，将个体中的水平或表达情况与对照样比较，从统计上与对照样的显著对比关系是对疾病的诊断。

还提供包括筛选具有调整adipocyspin活性能力的分子的测定方法。包括评估推定的adipocyspin功能的特异性激动剂或拮抗剂的方法。特别感兴趣的是调整前脂肪细胞到脂肪细胞的转化的分子。因此，还考虑的是这些化合物在对调整adipocyspin防止前脂肪细胞到脂肪细胞的转化能力的化合物的筛选测定的制备和执行中的应用。可以通过这样的方法测定的示例性的分子包括有机分子、无机分子、聚合物、小分子、包括反义和siRNA分子的多核苷酸或对其的前体、adipocyspin的变体和变化形式、和抗体。

当至少一些已经识别的化合物是可能的adipocyspin调节子时，通过对能结合到adipocyspin受体或结合配体的化合物筛选来进行初步筛选。结合测定通常包括，例如使adipocyspin激动剂(如adipocyspin蛋白)与一种或多种测试化合物接触，然后进行足够的时间使蛋白和测试化合物形成结合的复合物。使用一些确定的分析技术之一来检测任何形成的结合的复合物。蛋白结合测定包括，但不限于，测量在非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的共沉淀、共迁移和Western印迹上的共迁移的方法。用于这些测定的adipocyspin蛋白可以是天然表达的、克隆的或合成的adipocyspin。在一个具体实施方案中，测定是基于细胞测定，并且使用稳定或瞬时与具有编码adipocyspin受体或结合配体的核酸序列的载体或表达盒进行转染的细胞。在适于adipocyspin受体表达的条件下保持细胞，并且使其在适于结合发生的条件下与推定试剂接触。使用标准技术检测结合。例如相对于适合的对照物来确定结合的程度(如相对于缺少推定试剂的背景，或相对于已知配体)。任选地，含有受体的细胞成份(如膜成份)可以用于整个细胞的环境中。

可以直接或间接检测到结合或络合的形成。例如，用合适的标记(如荧光标记、化学发光标记、同位素标记、酶标记等)来标记推定试剂，并且通过检测标记来确定结合。可以使用如配体的竞争剂的非标记试剂进行竞争或置换来估定特异性和/或抗结合。

在其它具体实施方案中，可以使用结合抑制测定来评估化合物。在这些测定中，使用如在NIH 3T3 L1细胞中表达的adipocyspin受体来评估作为配体结合的抑制剂的化合物。在这个具体实施方案中，adipocyspin受体与配体(如adipocyspin)接触并且测定配体的结合。然后在配体(如重组adipocyspin)存在的情况下使受体与测试试剂接触并且第二次测量结合。配体结合程度的降低是表示测试试剂对结合的抑制。使用表达adipocyspin受体的整个细胞，或来自表达adipocyspin受体的细胞的膜部分进行结合抑制测定。

某些筛选方法包括对上调(或抑制或下调)adipocyspin的表达或活性的化合物进行筛选。这样的方法通常包括进行基于细胞测定(其中使测试化合物与一种或多种表达adipocyspin的细胞接触)，然后检测adipocyspin表达(转录或翻译产物)的变化(如升高或降低)或活性。与表达内源adipocyspin(如脂肪细胞或NIH 3T3 L1细胞)的细胞一起进行一些测定。可以与表达由适当表达载体编码的adipocyspin的重组细胞一起进行其它的表达测定。在任一情况中，可以通过如此处所述的许多不同方法检测adipocyspin表达。例如，通过用与编码adipocyspin的转录本(或衍生自其的互补核酸)特异性杂交的探针对表达于细胞内的mRNA探测来确定细胞内adipocyspin的表达水平。通过裂解细胞并进行RNA印迹或使用原位杂交技术(如上述)无需裂解细胞，来进行探测。或者使用免疫学方法检测adipocyspin蛋白，其中用特异性结合adipocyspin的抗体探测细胞裂解产物。类似地，通过确定细胞脂肪前体到细胞脂肪(如预NIH 3T3 L1细胞到NIH 3T3 L1脂肪细胞)的转化率来测定adipocyspin活性。药物筛选的一个方法是使用稳定的表达adipocyspin的重组DNA分子的真核细胞或原核宿主细胞，其中重组DNA分子如具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列的蛋白。这样的细胞(以变化的或固定的形式)可以用于筛选。可以测定测试化合物用于结合或用于与另一结合用配体的竞争。

在适当测定的一个例子中，使用adipocyspin蛋白(分离的或重组的)，该蛋白具有人adipocyspin蛋白的至少一个性质、活性或功能特征。性质可以是对前脂肪细胞到脂肪细胞转化的抑制。

在一个具体实施方案中，可以在适于结合的条件下保持含有adipocyspin蛋白或其变体的组合物。Adipocyspin受体与要测试的推定试剂(或含有至少一个推定试剂的第二组合物)接触，检测或测量结合。

将表达或活性的水平与基线值比较。还可以确定不表达adipocyspin的细胞的表达水平作为负对照。这样的细胞通常从基因上基本上与测试细胞相同。

还可以使用炎症模型来评估此处所提供的测试细胞、adipocyspin活性调节剂或推定调节剂和其它化合物来测定化合物在体内施用效果的能力。适当的模型包括，例如以下：

近几年来发展的几个主动测定的方法，来在短时间中进行成千上万化合物的筛选。见，如Fodor等人，1991，Science 251：767-73和其它化学多样性库的描述，其描述了大量化合物的测试结合亲和力的方法。本发明提供的大量纯的adipocyspin和/或表达重组adipocyspin的细胞极大地有助于开发合适的测定方法。

当用于描述如基因的核酸的表达时，术语“上调”或“活化”表示任何导致基因产物的产率增加的方法。基因产物是RNA(包括，但不限于mRNA)或蛋白。因此基因上调或活化包括提高基因的转录和/或mRNA的翻译的方法。

提高转录的基因上调或活化的方法例子包括，但不限于有助于转录起始复合物的形成的那些、提高转录起始率的那些、提高转录延长率的那些、提高转录处理率的那些和减缓转录阻遏的那些(通过阻断转录阻遏物的结合)。基因上调或活化可以组成性的阻遏和现有水平以上的表达的激活。提高翻译的基因上调或活化的方法例子包括提高翻译起始的那些、提高翻译延伸的那些、提高翻译终止的那些、提高核糖体循环的那些和提高mRNA稳定性的那些。可以使用已有的技术量化包括基因活化或上调的水平的基因表达水平，现有的技术包括，但不限于RNA印迹、核糖核酸酶保护分析(RPA)、核酸探针分析、定量PCR(如也叫作TaqMan分析)、斑点印迹分析和原位杂交。通常，基因上调或活化包括基因产物的生产中任何可检测到的提高，优选基因产物的生产中至少50-100％的提高。在其它情况中为约2到约5倍或任何其中的整数倍，在一些情况下为约5到约10倍或任何其中的整数倍，有时为约10到约20倍或任何其中的整数倍，一些情况中为约20到约50倍或任何其中的整数倍，其它情况中为约50到约100倍或任何其中的整数倍，且在一些情况中为100倍或更高。术语上调和基因活化可以表示为相对于基线水平的可观察到的活性从统计学上是明显不同的(如升高)。

如此处所用的“基线值”表示相对于进行比较的试验或测定值(如对作为部分诊断或预测测试的病患样品所测定的一个)的值(或值的范围)。因此在上调情况中，基线值是在不同时间点从相同个体中得到的样品的活性或表达值。在一些情况中，基线值是对对照细胞或个体测定的值，或为对照细胞或个体群建立的统计值(如平均值)。在上调中，对照物是预计其水平不会上调的细胞、个体或其群体。因此，例如对照个体或对照群体可以包括健康的个体。作为对照的群体在大小上可以变化，其几乎没有单独个体，但潜在地包括数十、数百、数千、成千上万或更多的个体。当对照物是大群体时，基线值可以是由每个成员的个体值确定的统计值或是由作为聚集物的对照群体确定的值(如在孔中的细胞群体中测定的值)。

在另一方面，提供通过对具有这种疾病或病征的个体施用治疗有效量的adipocyspin功能调节剂(如adipocyspin功能或基因表达的激动剂(刺激剂)和拮抗剂(抑制剂))来治疗adipocyspin-介导的病征或疾病的方法。

与改变的adipocyspin表达或活性相关的疾病或病症包括肥胖症和与增加脂肪细胞质量或脂肪质量有关的情况。可以用adipocyspin功能的调节剂治疗包括慢性疾病的疾病或病症。疾病或病症包括，如肥胖症和与增加的肥胖质量有关的情况，其均可以由adipocyspin和adipocyspin激动剂治疗。这样的调节剂包括adipocyspin功能或表达的小分子激动剂和拮抗剂、反义和核酶三联多核苷酸、基因治疗等。此处所述的方法和试剂可以用于动物、如哺乳动物(如人、非人灵长类、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等)或在动物中或体外的人类疾病(如细胞培养物)模型的治疗。

进一步提供治疗组合物，包括激动剂、拮抗剂、或adipocyspin配体，和治疗adipocyspin介导的生理或病理情况的方法(包括降低adipocyspin活性)。

可以在无菌或其它适合或理想的条件下对要治疗的宿主直接施用Adipocyspin多肽、其片段、正义和反义多肽、抗adipocyspin的抗体或其结合片段和adipocyspin活性的拮抗剂或激动剂(如小分子调节剂)。但是，当可能单独施用有效成分时，通常优选使其作为药物制剂。典型地，制剂包括与一种或多种其可接受载体一起的至少一种活性成分。每个载体应该是药物上和生理上均可接受的，可与其它成分相容并且对病患无害或没有不所需的毒性。例如，生物活性剂在施用之前可与如卵白蛋白或血清白蛋白的载体蛋白复合，来增加稳定性或药物性质(如半衰期)。而且，治疗制剂可以与其它化学治疗的或化学阻止试剂结合或一起使用。

通过药物领域已知的方法制得治疗制剂。见，如Gilman等人(eds.)(1990)Goodman and Gilman’s：The Pharmacological Bases ofTherapeutics(8^th ed.)Pergamon Press；和Remington，The Science ofPractice and Pharmacy，20th Edition.(2001)Mack Publishing Co.，Easton，P.a.；Avis等人(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：ParenteralMedications Dekker，N.Y.；Liebennan等人(eds.)(1990)PharmaceuticalDosage Forms：Tablets Dekker，N.Y.；和Liebennan等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems Dekker N.Y.。

根据要处理的疾病和病人情况，可以通过口服、非肠道(如肌内、腹膜内、静脉内、ICV)、脑池内注射或融合、皮下注射、植入)，通过吸入喷雾、鼻吸、阴道、直肠、舌下或局部的施用路径施用此处所述的化合物，并且可以单独或与适当剂量单位的制剂一起进行配制，该的制剂含有适于每一施用路径的常规非毒性药物上可接受的载体、佐剂和赋形剂。

治疗的药物组合物和方法可以进一步包括其他治疗性的活性化合物(如此处所述)，其经常或可以用于上述病理情况的治疗中。

在需要adipocyspin调整的治疗或预防情况中，适当的剂量水平通常为约0.001到约100毫克每千克病患体重每天，其可以以单次或多次剂量施用。优选地，剂量水平通常为约0.01到约25毫克每千克每天；更优选地，剂量水平通常为约0.05到约10毫克每千克每天。适当的剂量水平可以为约0.01到约25毫克每千克每天，约0.05到约10毫克每千克每天或约0.1到约5毫克每千克每天。在这个范围内，剂量可以为约0.005到约0.05，0.05到约0.5或0.5到约5毫克每千克每天。对于口服施用，优选以片剂形式提供组合物来对要治疗的病患进行一定剂量的症状调节，其含有约1到约1000或更高毫克有效成分，特别约1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900或1000毫克有效成分。可以以约1到约4次每天，优选每天一次或两次的形式施用化合物。

但是，可以理解的是对任何特定病患的特定剂量水平和使用频率是可以变化的并且取决于各种因素，包括所用的特定化合物的活性、化合物代谢的稳定性和作用的时间长短、年龄、体重、平时健康、性别、食物、施用的模式和时间、排泄率、药物组合、特点情况的严重性和经受治疗的宿主。

专利中的化合物可以和其他具有用于防止和治疗炎症的和免疫控制的病症和疾病(包括哮喘和过敏疾病和如类风湿性关节炎和动脉粥样硬化和上述的那些病变的自身免疫病变)的其他化合物结合。

还提供检测和量化生物样品中的adipocyspin多肽和多核苷酸的方法。在一个具体实施方案中，adipocyspin基因产物(如多肽或mRNA)的表达或过分表达与adipocyspin介导或与adipocyspin有关的疾病或病症相关。

生物样品包括，但不限于血液样品、血清、细胞(包括整个细胞，细胞成份、细胞提取物、细胞培养物或细胞系)、组织(包括得自活组织检查的组织)、体液(如尿、唾液、羊水、滑液)或来自介质(来自培养的细胞或细胞系)等。检测或量化adipocyspin多核苷酸的方法包括，但不限于带有信号基于扩增信号扩增的分析、基于杂交的分析和合并的扩增-杂交分析。为了检测和量化adipocyspin多肽，示例性方法是利用抗体或其他特异性结合adipocyspin多肽或表位的结合剂的免疫测定，例如ELISA或RIA测定。

聚合酶链反应(PCR)或其变体是示例性的基于扩增的测定。体外扩增方法技术的例子描述于PCR TECHNOLOGY：PRINCIPLESAND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION，H.Erlich，Ed.Freeman Press，New York.NY(1992)；PCR PROTOCOLS：A GUIDE TOMETHODS AND APPLICATIONS，eds.Innis，Gelfland，Snisky，和White，Acidemic Press，San Diego，CA(1990)。其他适合的靶向扩增方法包括，如连接酶链反应(LCR；如Wu和Wallace，1989，Genomics 4：560)；链置换扩增(SDA；如Walker等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：392-396)；基于核算序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario；如Compton，1991，Nature 350：91)等。一种有用的PCR的变体是PCR ELISA(如Boehringer Mannhein Cat.No.1 636 111)，其中将地高辛标记的dUTP加入到PCR产物中。PCR反应混合物变性并且与用来与PCR产物的内序列退火的生物素标记的寡核苷酸杂交。杂交产物固定在链霉抗生物素包覆的板上并且使用抗地高辛配体的抗体进行检测。

使用多核苷酸杂交技术进行特异性DNA和RNA测量的一些技术对本领域技术人员是公知的(见Sambrook，supra)。基于杂交的测定通常涉及其中多核苷酸探针与靶向多核苷酸杂交的测定。那些所述的或此处涉及的多核苷酸杂交探针全部或基本上与adipocyspin核酸序列的连续序列相同。优选地，多核苷酸探针的长度为至少约10碱基，普遍至少约20碱基，有时至少约200碱基或更多。选择多核苷酸探针序列来用于多核苷酸杂交的方法描述于Sambrook，supra。

多核苷酸杂交的形式是本领域技术人员公知的。在一些形式中，至少一个目标和探针是固定的。固定的多核苷酸可以是DNA、RNA或另一个寡或多核苷酸，并且可以包括天然或非天然的核苷酸、核苷酸类似物或主链。这样的测定可以以几个形式的任一个，包括DNA杂交，RNA杂交、斑点和狭线印迹、高密度多核苷酸或寡核苷酸阵列(如GeneChips TM Affymetrix)、测杆(dip stick)、钉、碎片或珠。所有这些技术是本领域公知的并且是许多商用诊断试剂盒的基础。杂交技术通常描述于Hames等人，ed.，NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，APRACTICAL APPROACH IRL Press，(1985)；Gall and Pardue Proc.Nat’l.Acad.Sci.，USA.，63：378-383(1969)；和John等人，Nature，223：582-587(1969)。

在一个具体实施方案中，使用原位杂交来检测样品中的adipocyspin序列。原位杂交测定是公知的且描述于Angerer等人，METHODS ENZYMOL，152：649-660(1987)和Ausubel，supra。

在一个具体实施方案中，使用抗adipocyspin的抗体或结合分子检测adipocyspin多核苷酸。许多已有的免疫结合测定适于测定和量化adipocyspin。见，如美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168，还参考METHODS IN CELL BIOLOGY VOLUME 37：ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY，Asai，ed.Academic Press，Inc.NewYork(1993)；BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7^th Edition，Stites& terr，eds.(1991)；Harlow，supra[如第四章]，和Ausubel，supra，[如第11章]，其每一个以全部加入本文作为参考并为所有目的。

检测adipocyspin的免疫测定可以是竞争性或非竞争性的。使用可检测到的标记直接或间接检测需要测定的adipocyspin基因产物。用于测定的特定标记或可检测到的基团通常不是关键的一面，只要是没有明显干扰用于测定的抗体的特异性结合。标记可以共价连接捕获剂(如抗adipocyspin的抗体)，或可以与第三部分，如另一抗体(其特异性结合到不是捕获剂识别的adipocyspin多肽的不同表位上)连接。

非竞争性免疫测定直接测量捕获的分析物(此处，例如adipocyspin多肽)的量。一个该测定是，例如使用对捕获的分析物上的两个非干扰表位有反应性的单克隆抗体的二个位点的基于单克隆免疫测定。见，例如用于背景信息的Maddox等人，1983，J：Exp.Med.，158：1211。在这样的测定中，直接测量样品中的adipocyspin量。例如使用称为“三明治”的测定，将捕获剂(此处如抗adipocyspin的抗体)直接结合到其固定的固体基质上。

固定的抗体捕获存在于测试样品中的多肽。固定的adipocyspin或其他目标分子用标记试剂(如含标记的第二adipocyspin抗体)结合。或者，例如第二adipocyspin抗体可以没有标记，但其可以用对衍生第二抗体的种类的抗体特异的标记的第三抗体结合。可以用如生物素的可检测到的部分(第三标记的分子可以与其特异性结合，如酶标记的链霉抗生物素)修饰第二部分。

在竞争性测定中，可以测量由样品(如adipocyspin多肽)中存在的分析物从捕获剂(如抗adipocyspin的抗体)中置换(或对竞争)来的加入的(外源的)adipocyspin的量来间接测量样品中存在的adipocyspin多肽的量。在一个竞争性测定中，例如向样品中加入已知量的adipocyspin，然后使样品与特异性结合到adipocyspin的捕获剂(如抗adipocyspin的抗体)接触。结合到抗体的adipocyspin的量与样品中存在的adipocyspin的浓度成反比。

优选的，将抗体固定在固体底物上。结合到抗体的adipocyspin的量可以通过测量存在于adipocyspin/抗体复合物中的adipocyspin的量，或测量剩下的未复合的adipocyspin的量进行确定。通过提供标记的adipocyspin分子来检测adipocyspin的量。例如，使用半抗原抑制测定，将分析物(此处为adipocyspin)固定在固体底物上。将已知量的抗adipocyspin的抗体加入到样品中，然后使样品与固定的adipocyspin接触。在这种情况中，结合到固定adipocyspin的抗adipocyspin的抗体的量与存在于样品中adipocyspin的量成反比。再次通过检测抗体的固定部分或保留在溶液中的抗体的片段检测固定抗体的量。检测可以是直接的(抗体是标记的)或间接的(通过随后加入特异性结合到上述抗体的标记部分)。

除了竞争性和非竞争性adipocyspin多肽免疫测定以外，还可以提供其他用于检测和量化adipocyspin多肽的其他测定。例如可以使用蛋白印迹(免疫印迹)分析来检测和量化样品中adipocyspin的存在。技术通常包括通过以分子量为基础的凝胶色谱法分离样品多肽，将分离的多肽转移至适合的固体载体(如硝基纤维膜、尼龙膜或衍生的尼龙膜)，然后和特异性结合adipocyspin的抗体一起孵化样品。抗adipocyspin的抗体特异性结合到固体载体上的adipocyspin。这些载体可以直接被标记或者可以使用特异性结合到抗adipocyspin的标记的抗体(如标记的羊抗鼠抗体)随后进行检测。

而且，如脂质体免疫测定(LIA)的测定也可以包括在本专利中。LIA使用用于结合特异性的分子(如抗体)并且释放被囊的试剂或标记的脂类。然后根据标准技术检测释放的化学物质(见，Monroe等人，1986，Amer.Clin.Prod.Rev.5：34-41)。

用于治疗和诊断(检测)方法的试剂以试剂盒形式提供，包括含有多肽、抗体和多核苷酸的试剂盒形式。

在一个具体实施方案中，试剂盒形式包括一种或多种下列内容物：(1)一种或多种adipocyspin多核苷酸(如，对应于adipocyspin cDNA序列并且能扩增靶向多核苷酸的寡核苷酸引物或探针)；(2)一种或多种抗adipocyspin的抗体(或其他结合的分子)；(3)一种或多种adipocyspin多肽或片段，其任选包覆在固体表面上(如载物片、多孔板、或测试试管)；(4)一种或多种adipocyspin多核苷酸和/或多肽(如用作测定中的正对照)；(5)和试管。进行适当检测方法和校准曲线的方法也可以包括在其中。

在以下说明中，我们说明了新型的脂肪细胞分泌的产物的确定，该产物与半胱氨酸蛋白酶抑制剂的家族成员具有相同的序列。在3T3-L1细胞的脂肪转化过程中明显诱发了adipocyspin的表达。肥胖状态下中大量mRNA也明显增加。而且用重组adipocyspin处理3T3 L1细胞会明显抑制脂肪的转化，表明adipocyspin是脂肪形成的负调整剂。。

通过参考下列实验部分来加深进一步的理解。下列实验是示例性的并且不会以任何方式限制本发明。

实施例1

设定用于分化3T3-L1细胞和随后所得到的来自细胞培养物的蛋白浓度的实验程序。

维持DMEM中的未融合的3T3-L1细胞，其用DMEM中补充10％胎牛血清。对于要发生的分化，将细胞接种到150mm的板上，并且达到100％融合，且在融合一天后用含有0.25μM地塞米松、0.5mM IBMX和10μg/mL胰岛素的上述介质诱发2天。然后用10μg/mL胰岛素孵育2天。在带有10％胎牛血清的DMEM中保持细胞4天。

为了得到分泌自脂肪细胞的蛋白，用PBS清洗分化8天后的细胞3次，然后用不含血清的培养基再孵化4小时。对培养基进行收集，以3,000×g离心10分钟，通过0.20μm过滤器过滤，然后使用5000DaMWCO(Vivascience Ltd，Gloucestershire，UK)的浓缩器浓缩并去盐。然后使用BCA试剂量化蛋白，并且在-80℃储存直到使用。

使用Immobiline DryStrips，在pH值为6-11的范围内，用以上所述的二维凝胶电泳分离脂肪细胞或3T3 L1前脂肪细胞分泌的蛋白。用银或考司马亮蓝R250(CBB)染分离的蛋白。用Melanine2软件确定分化分泌的蛋白。

切割2-DE凝胶分离的感兴趣的蛋白，且使凝胶片经过上述的凝胶内胰蛋白酶消化作用。通过RP HPLC在Jupiter 5μC18柱(250×2.00mm，Phenomenex)上分馏提取的胰蛋白酶肽混合物。用0.1％三氟醋酸(v/v)清洗预热柱(37℃)7分钟，然后以每分钟200uL的流速，在50min内，乙腈从8％到36％进行线性梯度洗脱。使用Edman降解方法，用Perkin-Elmer蛋白序列分析仪(Procise，Model 492)选择分离好的片段进行氨基酸的排序。

Adipocyspin的克隆和哺乳动物表达。使用TRIZOL试剂，根据制造者的方法，从小鼠3T3-L1脂肪细胞或人脂肪垫中纯化总RNA。来自总RNA的寡-dT-引物的cDNA用作PCR克隆的模板。将小鼠(SEQID NO：5)和人(SEQ ID NO：6)adipocyspin的全长cDNA插入到pGEMT-easy载体(Promega)中进行DNA序列验证。

使用5’GCCCGCGGATCCATGCTACTGTTGCAAGCTCT3’[SEQ IDNO：3]作为正义引物，且5’GGCCGCGAATTCTCACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTTGGTATCATGGTAGAG3’[SEQ ID NO：4]作为反义引物，通过cDNA扩增来产生用于小鼠adipocyspin的哺乳动物表达的载体。用BamHI/EcoRI消化后，将片段插入到pcDNA3.1载体中以产生pcDNA-adipocyspin-F，其编码C端由FLAG表位标记的以全长adipocyspin。使用FuGENE 6转染试剂将这种哺乳动物表达载体转染入COS-7细胞中，并且使细胞分泌adipocyspin进入非血清培养基48小时。然后得到培养基，并且通过3,000×g离心10分钟，通过0.20μm过滤器过滤来去除细胞碎片。使用5000Da MWCO的浓缩器浓缩过滤的培养基，如上所述。根据制造者的方法，使用抗FLAG M2亲和凝胶纯化FLAG标记的adipocyspin，然后用150μg/mL的FLAG肽洗脱。

RNA印迹和蛋白质印迹分析。在1.2％甲醛-变性的琼脂糖凝胶上分离10μg从3T3 L1细胞或小鼠脂肪组织中纯化的总RNA，然后转入尼龙薄膜。如上所述，使用³²P标记的全长adipocyspin、脂联素、PPARγ、或GLUT4 cDNA作为探针来进行杂交。目测并使用磷屏分析膜。如上所述进行蛋白质印迹分析。

实施例2

下列实验说明adipocyspin的性质。

用二维凝胶电泳分离来自3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞的培养培养基的蛋白。分析显示出具有16kDa的表观MW和9.3pI值的蛋白主要存在于脂肪细胞中，而不存在于前脂肪细胞中(图1)。为了确定这些蛋白的性质，从多重预备凝胶中切出蛋白“点”(见图1)，然后进行凝胶内胰蛋白酶消化作用。通过RP HPLC分馏胰蛋白酶肽混合物，并使分离好的片段进行氨基酸的测序(图2)。来自4个胰蛋白酶的肽的氨基酸序列不能被认为是任何已知蛋白。在National Center forBiotechnology Information的核酸数据库中tBLASTn搜索表明了与假定蛋白的匹配，其是从RIKEN全长的富含成鼠cDNA库(基因接收号码：AK002298)中的表达序列标记(EST)的序列中电子翻译的RT PCR分析证明了在3T3L1细胞中该基因的表达。

这个cDNA的假定读码框编码162氨基酸残基的推定蛋白(图3A)。预测的氨基酸序列在氨基酸位点62、72、83、86、101和116含有半胱氨酸残基，如图3A所示。将一个半胱氨酸残基与另一个办胱氨酸残基连接形成分子内双硫键，以使adipocyspin和/或adipocyspin异构体可以含有至多3个分子内双硫键。在Kyte-Doolittleplot分析之后预计的一个疏水性伸展位于头17个氨基端的残基中并且是信号序列的特征。同源搜寻显示这种蛋白N端的一半和具有类似cystatin结构域(如cystatin C)的蛋白族之间的一些相似性(图3B)。Cystatin是半胱氨酸蛋白酶抑制剂的家族并且其中许多是分泌蛋白。Adipocyspin的COOH端的一半显示出与与任何已知蛋白没有同源性。Adipocyspin的预测的分子质量和pI值(除了推定的分泌信号)是16548.23Da和9.36，其特别与在2DE分离中所观察到的值相匹配(图2)。

实施例3

这个实验确定adipocyspin作为分泌蛋白。通过将FLAG表位标记的adipocyspin构建瞬时转染到COS 7细胞，并且通过免疫印迹在条件培养基中检测蛋白。

分析显示出adipocyspin在培养物培养基中易于检测到(图4)。在另一方面，很难检测到β微管蛋白，其是一种细胞质蛋白，并且得知细胞培养培养基中的adipocyspin并不是由于细胞溶解。

实施例4

这个实施例用于评估通过RNA印迹分析得到的adipocyspinmRNA的依赖于分化的表达，其通过测定3T3 L1预细胞脂肪的脂肪转化过程中的adipocyspin mRNA表达的时间谱。如图5所示，adipocyspinmRNA表达与细胞分化，并且和细胞形态的变化有关(圆形和分子内脂滴的出现)。具有约800bp的adipocyspin mRNA在诱使脂肪转化的第二天时开始显示出来，并且在第8天达到最大值。Adipocyspin的表达动力学与aP2的那些相似，并且稍微领先于脂联素，脂联素是完全在脂肪细胞中表达的蛋白。

结果显示出同时出现adipocyspin mRNA表达和脂肪细胞的显型。

实施例5

这个实施例评估肥胖症中adipocyspin的改变的表达。肥胖中基因表达的调整提供用于新陈代谢疾病状态中感兴趣蛋白的功能关联性的有用信息。

我们发现相对于肥胖(ob/ob)小鼠的共基因瘦肉对照，其中的adipocyspin mRNA持续增加3到4倍(图6)。这个结果与ob/ob小鼠中的脂联素基因中的降低表达是明显相反的。肥胖中adipocyspin的改变的表达表明了这种病症的一种或多种病理生理特征涉及该蛋白。通过对这种模型(如leptin)特异性的基因缺陷来控制adipocyspin mRNA的水平。

实施例6

这个实施例评估脂肪细胞分化蛋白水解的adipocyspin抑制及其在脂肪转化中的角色。测定在脂肪细胞分化中adipocyspin的涉及情况。

从瞬时转染COS 7细胞的培养基中纯化COOH端FLAG标记的adipocyspin，然后加入到3T3 L1细胞中。在没有adipocyspin的情况下，超过80％的3T3 L1细胞分化入负载脂类的脂肪细胞，如在油红O染色中所示(见图7的A)。在用20μg/ml adipocyspin处理的细胞中，观察到仅偶尔出现的负载脂类的细胞(50中少于1的几率)。类似地，当细胞用adipocyspin处理后，脂肪细胞标记、PPARγ和GLUT4的表达也降低超过70％(图8)。这些结果显示adipocyspin可以阻断脂肪转化。

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根据法律来解释权利要求。但是且虽然，所谓的或轻松认识到或困难的解释任何权利要求或其部分，不可能在执行本发明或本申请过程中对权利要求或其任何部分的调整或修改会使本专利以丧失对任何和全部没有形成已有技术的一部分的同等部分的权利进行解释。

本说明书中公开的所有特征以任何合并方式进行结合。因此，除非另有说明，公开的每个特征仅是同等或相似基因系列的例子。

知道当将本发明与其详细描述结合描述时，前述描述试图说明而非限制本发明的范围，该范围是由所属权力要求的范围定义的。因此，从上述表明，即使特定具体实施方案描述于此出来作为说明目的，但是可以在不违背本发明的精神和范围的情况下使用各种变体。另一方面，除了由所属权利要求限定以外，权利要求和本发明的范围内的优点和变体是不受限制的。

描述于此的特定方法和组合物是优选具体实施方案的代表，并且作为示例且不会限制本发明的范围。在本说明书的考虑下对本领域的技术人员来说其他的目的、方面和具体实施方案是会发生的并且包括在由权利要求的范围定义的本发明的精神以内。对本发明的技术人员来说在不违背本发明的范围和精神下对此处所公开的本发明所作的取代和改变是明显的。可以在没有任何元素或限定(并非此处作为必要公开的)下实施此处所述的本发明。因此，例如，在每种情况和本发明的具体实施方案或实施例的描述下，术语“包括”，“含有”，“包含”等可以扩张性理解并且没有限制。可以以分步步骤此处所述的方法和过程，并且他们对此处所说明的或权利要求中的步骤是并非严格要求的。

所用的术语和表达用作描述的术语且无限制，并且不试图使用这样的术语和表达来排除任何等同的所示特定和描述或其部分，但是可以认为在所要求的本发明的范围内各种变化是可能的。因此，已知尽管本发明可以通过各种具体实施方案和/或优选具体实施方案和任选特征来进行公开，但是任何或所有本领域技术人员可理解的概念的改变或变化都认为是在由所属权利要求定义的本发明的范围内。

此处广泛并一般地描述本发明。落入一般公开的每个较窄物类和分支类群类也属于本发明。无论所述材料或条件是否在此处有所描述，这包括条件或负面限定为从物类中去除任何目标物质的本发明的类别描述。

还知道用于此处和所述权利要求中的单数形式“a”，“an”和“the”包括复数，除非有明确说明，而字母“s”在名词后面来表示名词的单复数。术语“或”当用于此处作为联合意思“和/或”，除非明确说明。术语“包括”或相关术语是非限定的并且除了特别说明而包括元素的存在。此外，特征或方面是根据Markush类群进行描述，因此本领域技术人员认识到本发明还可以根据Markush类群的任何单独成员或子群来进行描述。

其它具体实施方案也在权利要求中。在任何情况下专利都不能解释为对此处特别和/或明确公开的特定实施例或具体实施方案或方法进行限制。在任何情况下本发明都不能解释为是通过任何审查员或任何其他专利和商标的官方或雇员所作的任何陈述进行限定，除非这样的陈述是特定的并且并未在申请人的回复中明确限定或保留权益。

Claims (30)

1.一种重组的表达载体，包括选自以下的多核苷酸：

(a)编码SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸；

(b)编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸；

(c)在严紧条件下与(a)和/或(b)的多核苷酸或其互补杂交的多核苷酸；或

(d)由于遗传码降解成(a)、(b)或(c)定义的序列的多核苷酸序列。

2.一种由权利要求1所述的载体转染的细胞。

3.根据权利要求2所述的细胞，其是真核细胞或哺乳类细胞。

4.一种制备adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白的方法，包括培养已经被遗传制造来产生增量的adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白的重组细胞。

5.一种分离的或重组的多肽，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其任一的生物活性或免疫原的片段。

6.根据权利要求5所述的adipocyspin多肽，其抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的转化。

7.根据权利要求5所述的多肽或片段，其中多肽具有至少90％与SEQID NOS：1或2相同的30个氨基酸序列。

8.一种融合蛋白，包括权利要求5所述的多肽。

9.一种多核苷酸引物、探针、反义寡核苷酸或核酶，包括至少15个与编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2互补的邻近的碱基。

10.一种抗体或其结合片段，其中抗体或抗体片段与权利要求5所述的多肽特异性结合。

11.一种分泌权利要求10所述的抗体的分离的细胞。

12.一种在样品中检测adipocyspin基因产物的方法，包括：

(a)使样品与结合基因产物的探针接触，其中探针与基因产物形成复合物，并且检测复合物的形成；或

(b)在生物样品中特别扩增基因产物，其中所述基因产物是多核苷酸，并且检测扩增的产物；其中复合物的形成或扩增产物的存在与生物样品中脂联素基因产物的存在有关联。

13.一种确定adipocyspin活性调制子的方法，包括在adipocyspin存在的情况下使细胞与测试化合物接触并且测定在测试化合物存在而非没有的情况下发生的生物效应，其中诱发生物效应的测试化合物确定为adipocyspin活性的调制剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物效应是前脂肪细胞向脂肪细胞转化的抑制。

15.一种治疗哺乳动物中adipocyspin介导的病症的方法，包括对哺乳动物体内的细胞或组织中施用调节adipocyspin的活性或表达的试剂。

16.一种药物组合物，包括如权利要求5所述的adipocyspin多肽和一种或多种选自药物上可接受的赋形剂、载体、助活性剂或稀释剂的材料。

17.一种组合物，包括adipocyspin多肽，其中adipocyspin多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。

18.根据权利要求16所述的组合物，其能诱发1μg/mL至20μg/mL的血浆adipocyspin多肽浓度。

19.根据权利要求16所述的组合物，其能诱发1.9μg/mL至17μg/mL的血浆adipocyspin多肽浓度。

20.一种诊断个体中疾病状态的存在或疾病的发展倾向的方法，包括确定个体中adipocyspin多肽的水平，并且将该水平与未处于疾病状态的个体的水平特征比较，其中水平的差别显示为疾病的存在或向疾病发展的倾向。

21.根据权利要求20所述的方法，其中疾病状态选自高血糖、胰岛素抗性、2型糖尿病、肥胖症、高血压、动脉硬化、冠性心脏病、缺血性心脏病、多囊性卵巢症候群、或与胰岛素抗性有关的代谢症候群。

22.根据权利要求20所述的方法，其中评估方法使用电泳、HLPC或质谱分析。

23.一种治疗与adipocyspin失调有关的疾病状态的方法，包括施用有效量的含有adipocyspin多肽的药物上可接受的组合物。

24.带有或未带有药物上可接受的赋形剂、助活性剂、稀释剂和包封容器的adipocyspin多肽在制备用于哺乳动物病患中的药物组合物或药物或药剂的应用：i)在治疗与adipocyspin多肽调节有关的疾病状态中；或ii)来增强胰岛素的作用；或iii)抑制与增加的脂肪质量有关的肥胖症或病症。

25.一种当施用或单独施用与人类或其它哺乳动物时能够传输有效量adipocyspin多肽来有效降低脂肪组织的量或体重的制剂或药剂。

26.根据权利要求25所述的制剂或药剂，其中adipocyspin多肽是人类adipocyspin。

27.一种治疗哺乳动物来防止和/或逆转肥胖或增加的脂肪组织质量和/或任何肥胖或增加的脂肪组织质量的特征的方法，其包括或包含对病患施用adipocyspin和/或其激动剂。

28.一种制品，包括或包含含有adipocyspin多肽和/或adipocyspin激动剂的容器；和使用其来治疗、防止或逆转肥胖或增加的脂肪组织质量和/或任何肥胖或增加的脂肪组织质量的特征的指导方法。

29.一种测定哺乳动物体内adipocyspin的方法，其包括或包含测定血液或组织中adipocyspin的浓度。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述浓度通过如放射免疫测定法(RIA)和/或ELISA的免疫学方法确定。

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