CN1473854A - 用于治疗il4介导疾病的重组il4抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了源自高度亲合的单克隆抗体的嵌合和人源化IL4单克隆抗体，含有该抗体的药物组合物及治疗方法。

Description

用于治疗IL4介导疾病的重组IL4抗体
本申请系1994年09月07日提交的，申请号为94193929.4，发明名称与本申请相同的申请的分案申请。后一申请是
1993年10月14日递交的美国申请号No.08/136，783的部分接续申请，No.08/136,783又是1993年9月7日递交的美国申请号No.08/117,366的接续申请，两份申请在此均作为参考文献。
发明领域
总体而言本发明涉及融合蛋白领域，涉及用于治疗和诊断IL-4介导和过量IgE产生的疾病的蛋白质，特别涉及嵌合和人源化IL4抗体。
发明背景
异位变应性疾病包括相对小的疾病如季节性鼻炎和结膜炎，及至较为严重的疾病如特应性皮炎和异位性哮喘，以及威胁生命的疾病如过敏性休克。机体对过敏原的免疫反应将这些疾病相关联在一起，该反应包括在遗传上易感染个体(特应性)中免疫球蛋白E(IgE)抗体的产生。在变应性疾病的特定免疫疗法中使用具脱敏作用的疫苗以抑制IgE的产生已成为一个长久间目标。然而，近年来人们已怀疑疫苗疗法的安全性和有效性，但要降低IgE水平的希望仍未减弱。
白细胞介素4(IL4)是淋巴系统中的蛋白质介体。对来自特应性个体的淋巴细胞的研究表明，在对刺激产生的反应中存在着高于正常数目的T淋巴细胞，其具有分泌IL4的能力，且刺激之后分泌出较大量的IL4。
人们已发现抗-IL4抗体能抑制IgE，但不能抑制IgG1或IgG2[Finkelman等，Ann.Rev.Immunol.8：303(1990)]，及能抑制IL5分泌T细胞的产生[Maggi等，J.Immunol.148：2142(1992)]。并且，最近的数据显示出IL4可能会影响组织中嗜曙红细胞的积累。参见如Tepper等Cell.62：457(1990)；Tepper等，Cell，57：503(1989)。
本领域仍需求一种高度亲合性IL4拮抗剂，其通过减少IL5分泌细胞的繁殖和抑制嗜曙红细胞可能在组织中累积的贴壁机制，从而减少嗜曙红细胞的发炎，并且能用于治疗、预防和诊断特应性反应。
发明概述
首先，本发明提供了一种具有与人白细胞介素-4的结合亲合性的融合蛋白，其含有源自非人类的中和单克隆抗体(MAb)的互补决定区(CDRs)和第一融合配体，所述单克隆抗体的特征在于与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M；所述第一融合配体的至少一个并优选所有互补决定区(CDRs)被非人类单克隆抗体(MAb)的CDRs取代。非人类中和单克隆抗体可选自3B9和6A1，其更详细地描述于《详细说明》部分。优选地，该融合蛋白还可操纵地与第二融合蛋白相连，其含有所有的或部分的免疫球蛋白不变链。
相关方面，本发明提供了源自非人类中和单克隆抗体(MAb)的CDRs，该单克隆抗体与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M，并且本发明提供了编码该CDRs的核酸分子。
在另一方面，本发明提供了人源化抗体，其具有至少一种且优选六种源自非人类中和单克隆抗体(MAb)的互补决定区，该单克隆抗体的特征在于与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M。
在另一方面，本发明提供了一种嵌合抗体，其含有人重链和轻链恒定区及源自非人类中和单克隆抗体(MAb)的重链和轻链可变区，该单克隆抗体的特征在于与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有上述一种(或多种)融合蛋白或MAbs(如人源化，嵌合等等)及一种药物上可接受的载体。
进一步地，本发明提供了一种通过给药于人有效量的本发明药物组合物对人类进行治疗和/或预防变应性疾病的方法。
还有一方面，本发明提供了融合蛋白，MAbs(如人源化的，嵌合的等等)，其CDRs、Fab或F(ab)2或其类似物的重组生产的方法及用于此重组生产中的成份，其中所述类似物源自非人类中和单克隆抗体(MAb)，该单克隆抗体特征在于与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M。其中所述的这些成份包括分离出的编码相同蛋白的核酸序列，含有在选择性调节序列控制下的该核酸序列的重组质粒，此调节序列能指导其在宿主细胞中的表达，以及用该重组质粒转染的宿主细胞(优选哺乳动物的)。生产方法包括在一定条件下培养本发明的转染宿主细胞系以使抗体，优选人源化抗体在所述细胞中被表达，以及从中分离出被表达的产品。
本发明的另一方面是诊断变应性和其它与人体中过量免疫球蛋白E产生相关的疾病的方法，其包括将生物液体样品与融合蛋白，MAbs(如人源化的嵌合抗体等)及本发明的Fabs接触，并分析所述融合蛋白，MAb或Fab与人白细胞介素4间的结合是否存在。
在本发明另一相关方面是提供了一种筛选对人白细胞介素4具有高滴度的单克隆抗体的方法，筛选方法包括：(a)制备以人白细胞介素4的单克隆抗体的分泌作用为特征的杂交瘤细胞系；(b)用醛偶联的人白细胞介素-4或生物素化的人白细胞介素-4筛选所述的杂交瘤细胞系。优选地，以生物素化的人白细胞介素-4筛选杂交瘤细胞系。
本发明还提供了与IL4具有高度亲和性的中和MAb，其Fab片断或F(ab′)2片断，其通过以醛偶联的人白细胞介素-4或生物素化的人IL4筛选杂交瘤产品库而制得。
在另一方面，本发明提供了对人白细胞介素-4具有特异性且具有以解离常数等于或小于约2×10-10M的结合亲和力的啮齿动物中和单克隆抗体。这类单抗的例子有鼠MAb，3B9和大鼠MAb，6A1和其它具有相同识别性质的MAbs(即以特异性地与人IL4结合于3B9或6A1的相同表位，解离常数等于或小于约2×10-10M)。本发明的另一方面是杂交瘤3426A11C1B9 。
本发明的其它方面及优点均在下面优选实施方案中被进一步详细地进行了描述。
附图的简要说明
图1[SEQ ID NOS：1和2]表明了鼠IL4抗体3B9的轻链可变区(氨基酸21-132)，和人/鼠3B9嵌合抗体以及天然信号序列(氨基酸1-20)。下划线部分表示CDRs[SEQ ID NOS：15和16；SEQ ID NOS：17和18和SEQ ID NOS：19和20]。
图2[SEQ ID NOS：3和4]表明了鼠3B9的重链可变区(氨基酸20-140)，和天然信号序列(氨基酸1-19)。下划线部分表示CDRs[SEQ ID NOS：21和22；SEQ ID NOS：23和24；和SEQ ID NOS：25和26]。
图3[SEQ ID NOS：9和10]表明了人/鼠3B9嵌合抗体的重链可变区(氨基酸21-141)及其信号序列(氨基酸1-19：SEQ ID NOS：5和6)。下划线部分表示源自3B9的CDRs[SEQ IDNOS：21和22；SEQ ID NOS：23和24；SEQ ID NOS：25和26]。
图4[SEQ ID NOS：11和12]表明了人源化3B9抗体的重链可变区(氨基酸20-141)及信号序列(氨基酸1-19：SEQ IDNOS：5和6)。下划线部分表示源自3B9的CDRs[SEQ ID NOS：54和22；SEQ ID NOS：55和24；SEQ ID NOS：56和26]。
图5[SEQ ID NOS：13和14]表明了人源化3B9抗体的轻链可变区(氨基酸21-131)及信号序列(氨基酸1-20：SEQ IDNOS：7和8)。下划线部分表示源自3B9的CDRs[SEQ ID NOS：53和16；SEQ ID NOS：17和18；和SEQ ID NOS：27和28]。
图6A[SEQ ID NOS：5和6]是用于下述实施例4的重链信号序列。
图6B[SEQ ID NOS：7和8]是用于下述实施例4的轻链信号序列。
图7是在哺乳动物细胞中用来表达嵌合IL4重链的质粒pIL4chhc3-pcd的示图。该质粒含有β-内酰胺酶基因(BETA LAC)，SV-40的复制起点(SV40)，巨细胞病毒启动子序列(CMV)，信号序列，SEQ ID NOS：9和10的嵌合可变重链，人重链恒定区，来自牛生长激素(BGH)的聚腺苷酸信号，β珠蛋白启动子(beta glopro)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，和背景pUC19中的另一BGH序列聚腺苷酸信号。
图8是在哺乳动物细胞中用来表达SEQ ID NOS：1和2的嵌合IL4轻链可变区质粒pIL4chlc-pcdn的示图。该质粒不同于图7所示的质粒，其含有嵌合轻链可变区而不是嵌合重链可变区，人轻链可变区和新霉素基因(Neo)及DHFR。
图9是在哺乳动物细胞中用来表达SEQ ID NOS：11和12的合成IL4重链可变区质粒pIL4hzhc-l-pcd的示图。该质粒不同于图7所示的质粒，其含有人源化重链可变区，而不是嵌合重链的可变区。
图10是在哺乳动物细胞中用来表达SEQ ID NOS：13和14的人源化IL4轻链可变区质粒pIL4hzlc-0-Pcn的示图。该质粒不同于图8所示的质粒，其含有人源化轻链可变区，而不是嵌合轻链的可变区，并且没有编码DHFR基因。
本发明的详细说明
本发明提供了各种抗体，抗体片断和融合蛋白，特别是人源化抗体，其特征在于具有人IL4结合特异性，中和活性及与人IL4的高度亲和性，正如鼠MAb 3B9或大鼠MAb 6A1所例示一样。这些产品可用于治疗和药物组合物中，以治疗IL-4介导的和IgE-介导的变应性反应。这些产品也可用于IL-4介导的症状的诊断中，通过在人体内测量循环的内源性IL4水平来诊断(如酶联免疫吸附分析(ELISA))。
I.定义
“融合蛋白”是指被融合分子编码的蛋白质，可通过在所选择宿主细胞中的表达而获得。这种融合蛋白为基因工程抗体，如嵌合或人源化抗体，或是缺少全部或部分免疫球蛋白恒定区的抗体片断，如Fv、Fab或F(ab)2等等。
“融合分子”是指编码源于非人类免疫球蛋白的互补决定区(CDRs)的核酸序列，该CDRs被插在含有人可变构架序列的第一融合配体中。可选择地，该第一融合配体可操纵地与第二融合配体相连接。
“第一融合配体”是指编码人的构架或人免疫球蛋白可变区的核酸序列，其中天然的(或天然产生的)CDRs被供体抗体的CDRs代替。该人可变区可以是免疫球蛋白重链、轻链(或两条链均有)，其类似物或功能片断。该位于抗体(免疫球蛋白)可变区内的CDRs或CDR区可以通过本领域熟知的方法来确定。例如Kabat等人，[ Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，NationalInstitutes of Health(1987)]，描述的确定CDRs位置的规则。此外，用于辩认CDR区/结构的计算机程序是熟知的。
术语“高滴度”是指具有结合亲合性的抗体，其特征在于与人IL4的Kd等于或小于2×10-10M 。
“与人IL4的结合特异性”是指与人IL4而不是牛或鼠IL4的高滴度(或亲合性)。
“第二融合配体”是指编码蛋白或肽的另一核苷酸序列，第一融合配体在构架中或通过一可任意选择的常规连接序列(即可操纵地连接)与其融合优选第二融合配体为免疫球蛋白。第二融合配体可包括编码相同抗体(即同源的-得自同一来源的第一、第二融合蛋白)整个恒定区或附加的(即异源的)感兴趣的抗体。它可以是免疫球蛋白重链或轻链(或两条链作为信号多肽部分)。第二融合配体不限定于特别的免疫球蛋白类或同种型。此外，第二融合配体可包括免疫球蛋白恒定区部分，如发现于Fab或F(ab)2中的恒定区(即适当的人恒定区或构架区的分离部分)。此第二融合配体也可包括编码暴露于宿主细胞外层的膜内在蛋白质的序列，如噬菌体展示库部分，或编码用于分析或诊断检测的蛋白质的序列，如辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶等等。
术语“Fv、Fc、Fab，或F(ab)2均为其标准含义(参见，如Harlow等， Antibodies A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，(1988))。
正如此处所用的“基因工程抗体”描述了一类融合蛋白，即合成抗体(如嵌合的或人源化抗体)，其中所选择的受体抗体的轻链和/或重链可变区部分被来自一个或多个供体抗体的类似部分所取代，所述供体抗体与所选表位具有特异性。例如，这类分子可包括抗体，其特征在于人源化重链与非修饰的轻链(或嵌合轻链)相关，或反之也是如此。基因工程抗体也可被编码受体抗体轻链和/或重链可变区域构架区的核酸序列改变，以获得供体抗体结合特异性。这些抗体可包括以此处所描述的供体抗体的CDRs置换受体抗体的一种或多种CDRs(优选全部)。
“嵌合抗体”指一种基因工程抗体，其含有来自供体抗体的天然产生的可变区(轻链或重链)，所述供体抗体与来自受体抗体的轻链和重链恒定区相关联。
“人源化抗体”是指一类基因工程抗体，具有源自非人类供体免疫球蛋白的CDRs，存留的由免疫球蛋白衍生的分子部分源自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，构架支撑残基可被更换为保持结合亲合性(参见，如Queen等， Proc.Natl.Acad.Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson等， Bio/Technology，9：421(1991))。
术语“供体抗体”是指一种抗体(多克隆，单克隆或重组)，其为第一融合配体提供可变区，CDRs或其它功能片断或其类似物的核酸序列，如此以提供融合分子和最终被表达的具有抗原特异性和中和活性供体抗体特征的融合蛋白。适用于本发明的一种供体抗体是非人类中和单克隆抗体(即鼠的)指定为3B9。抗体3B9被定义为一种高滴度，人-IL4特异的(即不识别牛或鼠IL4)，同型IgG1的中和抗体，其在适当的鼠IgG恒定区具有SEQ ID NOS：1和2的可变轻链DNA和氨基酸序列，和SEQ ID NOS：3和4的可变重链DNA和氨基酸序列。
术语“受体抗体”是指一种与供体抗体异源的抗体(多克隆、单克隆或重组抗体)，其为第二融合配体提供了编码其重和/或轻链构架区和/或重和/或轻链恒定区的核酸序列。优选人抗体是受体抗体。
“CDRs”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重和轻链的高变区，参见，如Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第4版，U.S.Department ofHealth and Human Services，National Institues of Health(1987)。在免疫球蛋白可变部分有三条重链和三条轻链CDRs(或CDR区)。因此，这里用的“CDRs”指所有的三条重链CDRs，或所有三条轻链CDRs(或如果适当的话，所有的重链和所有的轻链CDRs)。
CDRs为抗体与抗原或表位的结合提供了大部分的接触残基。本发明中感兴趣的CDRs源于供体抗体的可变重链和轻链序列，并包括天然产生CDRs的类似物，此类似物也与所来源的供体抗体共有或保持同样的抗原结合特异性和/或中和能力。
“共同抗原特异性或中和能力”是指如虽然Mab 3B9特征在于有某一水平的抗原亲和性，且在一适当的结构环境中以核酸序列3B9编码的CDR可具有低一些或高一些的亲和性，但无论怎样均认为该环境中的3B9的CDRs能识别与3B9同样的表位。3B9重链CDRs的例子包括SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26；3B9轻链CDRs的例子包括SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：18；和SEQ IDNO：20。
“功能片断”是指部分重链或轻链可变序列(如免疫球蛋白可变区在氨基或羧基末端的最小缺失)，其保持有片断所源自的抗体的相同抗原结合特异性和/或中和能力。
“类似物”是指被至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所说的修饰可以是化学修饰或取代或是几个氨基酸(即不多于10个)的重排，这种修饰允许氨基酸序列保持未修饰序列的生物学性质，如抗原特异性和高滴度或亲合性。例如，通过置换(Substition)，可构建沉默突变，以在CDR区内或周围建立内切核酸酶限制酶切位点。
类似物也可由等位变异产生。“等位变异或修饰”是指在编码本发明氨基酸或肽序列的核酸序列中的改变。这种变异或修饰或是由于遗传密码的简并性或是被有目的地基因工程改造以提供所需的性质。这些变异或修饰可以导致或不导致任一被编码的氨基酸序列中的改变。例如，轻链CDR SEQ ID NO：16的氨基酸序列与天然鼠或人源化3B9抗体是相同的。然而，该CDRs序列是被SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：53共同编码的。相似地，CDR SEQ ID NO：22是被SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：54共同编码；CDR SEQ ID NO：24是被SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：55共同编码的；且CDR SEQID NO：26是被SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：56共同编码的。
术语“效应子”指非蛋白载体分子，通过常规手段将融合蛋白，和/或供体抗体天然的或合成的轻链或重链或其它供体抗体片段与效应子结合。这种非蛋白载体可包括用于诊断领域的常规载体，如聚苯乙烯或其它塑料珠、多糖，如用于BIA core[Pharmacia]体系中的，或其它用于医学领域中的且给人和动物施用具有安全性的其它非蛋白物质，其它效应子可包括能螯合一重金属原子的大环或放射性同位素。这种效应子也可用来延长融合蛋白的半衰期，如聚乙二醇。
II高度亲合性IL4单克隆抗体
为用于构建本发明的抗体、片断和融合蛋白，非人类的种(如牛、马、灵长类、啮齿类(如鼠和大鼠)等)可在天然人IL4或源于人IL4的肽表位存在时用来产生一种所需的免疫球蛋白。采用常规杂交瘤技术以提供分泌非人类MAb至IL4的杂交瘤细胞系。然后使用共价吸附于96-孔板的IL4或可选择地使用用于筛选分析中的生物素化IL4一起来筛选这种杂交瘤，如下面实施例2中的详细描述。因此，本发明的一个特点是一种检测人IL4 MAbs的方法，其中该分析体系避免IL4的变性。以这种方式，我们发现可以检测出高滴度(或高亲合性)的人IL4的MAbs。
作为一个实例，第一次公开了来自鼠供体的高滴度，中和MAb的生产。MAb3B9为用于开发嵌合的或人源化抗体的所需鼠(供体)抗体，被详细描述于下述实施例1中。3B9MAb特征在于与人IL4具有抗原结合特异性，与IL4的Kd小于2.0×10-10M(约1.8×10-10M)。此3B9的Fab片断与IL4的Kd小于3×10-10M。该抗体的表位不能与线性肽一起在IL4形成图谱，由此该表位被认为非邻接表位结合。结合方式表明结合位点在B-C环(残基60-69)→C螺旋(残基70-93)区。这些区图谱指定，由Cook等人， J.Mol.Biol， 218：675-678(1991)，Walter等人， J.Biol.Chem. 267：20371-20376(1992)，Wlodaver等人， FEBS  Lett.， 309：59-64(1992)，Redfield等人， Biochem.， 30：11029-11035(1991)，Smith等人，J.Mol.Biol.， 224：899-904(1992)，Garrett等人(1992)和Powers等人， Biochem.， 31：4334-4346(1992)和 Science， 256：1673-1677(1992)提供，这些在此均作为参考文献。
另一所需的供体抗体是大鼠MAb 6A1。该MAb的生产描述于下述实施例7。该抗体的特征为同种型IgG2a，与hIL4的解离常数小于2.0×10-10M(约1.6×10-10M)。与3B9一样，该6A1的靶表位不与IL4线性肽成图，因此此表位被认为是非邻接的、三维的。与IL4突变蛋白质的结合方式和其生物学活性表明在人IL4 D螺旋区(氨基酸残基109-127)的结合基本上围绕着氨基酸残基#124的酪氨酸。
本发明不限于使用3B9MAb、6A1MAb或其高变(即CDR)序列。任一其它合适的特征为与人IL4的解离常数等于或小于2.0×10-10M的高滴度IL4抗体和相对应的抗-IL4 CDRs在此可代替。无论在下述说明中供体抗体被识别为3B9或6A1，这种指定用作为说明和仅为简单描述。
III.抗体片断
本发明还包括来自指导抗人IL4的MAbs的Fab片断或F(ab′)2片断的应用。这些片断作为有用的试剂在体内是保护性的防止IL4和IgE介导的疾病或在体外作为IL4诊断部分。Fab片断包含整个轻链和重链的氨基末端部分；F(ab′)2片断是由通过二硫键连接的两个Fab片断形成的MAbs 3B9，6A1和其它类似的高度亲合性IL4结合抗体提供Fab片断和F(ab′)2片断的来源，可通过常规方法得到这些片断，如用适合的蛋白酶，木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶切割MAb或通过重组的方法获得。这些Fab和F(ab′)2片断可用作治疗剂、预防剂或诊断剂。并作为序列供体，包括用于这里所描述的重组或人源化抗体生成的可变区和CDR序列。
IV.目的抗IL4氨基酸和核苷酸序列
上述的MAb 3B9或其它抗体均可提供这些序列，如可变重链和/或轻链肽序列，构架序列，CDR序列，功能片断和其类似物，以及编码它们的核酸序列，用于设计和获得各种融合蛋白(包括基因工程抗体)，这些融合蛋白的特征为具有供体抗体的抗原结合特异性。
作为一个实例，本发明由此提供了源自IL4鼠抗体3B9的可变轻链和可变重链序列及这些序列衍生的序列。3B9重链可变区以SEQ IDNO：4的20至140氨基酸残基为特征。CDR区为图2下划线部分所表明，且由SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26提供。3B9的轻链克隆可变区以图1[SEQ ID NO：2]的21至132氨基酸残基为特征。CDR区来自44-58[SEQ ID NO：16]；74-80[SEQ ID NO：18]和113-121氨基酸残基[SEQ IDNO：20]。
本发明提供了嵌合重链可变区和信号核苷酸及氨基酸序列。除信号序列不同外这些序列与3B9重链是相同的。嵌合重链信号序列由SEQID NOS：5和6提供。CDR区在图3中以下划线表明，且与天然鼠CDRs的氨基酸序列相同[SEQ ID NOS：21-26]，嵌合轻链可变区核苷酸和氨基酸序列与未修饰的3B9序列(SEQ ID NO：2的21-132氨基酸残基)相同，利用了天然鼠信号序列(SEQ ID NO：2的1-20氨基酸残基)。
人源化重链可变区和信号序列示于图4[SEQ ID NO：11和12]。信号序列也可由SEQ ID NO：5和6提供。其它适宜的本领域熟知的信号序列可代替这里所例证的信号序列。该构建物的CDR氨基酸序列与天然鼠和嵌合重链CDRs相同，且由SEQ ID NO：22(由SEQ IDNO：54编码)，SEQ ID NO：24(由SEQ ID NO：55编码)和SEQ ID NO：56(由SEQ ID NO：26编码)提供。
一例(合成)人源化轻链可变序列示于图5[SEQ ID NOS：13和14]。信号序列跨越SEQ ID NO：8的1-19氨基酸残基。该图的CDR序列由下划线部分所示，信号氨基酸为SEQ ID NO：20不同于天然鼠CDR。因此，人源化轻链CDRs由SEQ ID NO：53和16，SEQ ID NO：17和18和SEQ ID NO：27和28提供。区别之处详细描述于实施例3。
本发明编码可变轻链和重链肽序列的核酸序列或其片断以未被修饰的形式使用，或是被合成以引导所需的修饰，如限制酶切位点，由MAb 3B9或其它所需的高滴度IL4抗体衍生的被分离出的天然产生或换个方法合成的核酸序列，可选择性地含有限制酶切位点，以便于插入或连接一合适的核酸序列，如编码所需抗体构架区的序列，便于与诱变的CDRs的连接或与编码所选第二融合配体的核酸序列的融合。
考虑到遗传密码的简并性，可构建各种编码序列，其编码本发明的可变重链和轻链氨基酸序列，和CDR序列以及其功能片断和类似物，这些功能片断和类似物共享有供体抗体的抗原特异性。本发明分离出编码可变链肽序列或CDRs的核酸序列或其片断，当可操纵地与第二融合配体结合时可被用来生产本发明的融合蛋白，嵌合的或人源化抗体，或其它基因工程抗体。
这些序列也可用来在编码CDRs或构架区的核酸序列中诱变导入特定的改变，及用来在表达质粒中插入最终修饰的或融合核酸序列，例如，在构架区和CDR-编码区的核苷酸序列的沉默取代被用来形成限制酶切位点，其便于诱变的CDR(和/或构架)区的插入，这些CDR区用于本发明人源化抗体的构建。
应注意到，除这里所描述的编码融合蛋白和抗体部分的分离出的核酸序列外，也可使用其它这类核酸序列，如那些天然序列的互补序列。有用的DNA序列包括那些在严格杂交条件[参见T.Maniatis等，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory(1982)，387至389页]下与该DNA序列杂交的序列。这种杂交条件的一个实例为在65℃ 4×SSC杂交，然后在65℃0.1×SSC中洗涤1小时。另一例严格的杂交条件是在50％甲酰胺中42℃ 4×SSC。优选这些杂交DNA序列长度至少为18个核苷酸，即约为一个CDR的大小。
V.融合分子和融合蛋白
融合分子可编码融合蛋白，该融合蛋白包括基因工程抗体如嵌合抗体和人源化抗体，所需的融合分子含有CDR序列，其编码具有IL4抗体抗原特异性的肽，优选-高度亲合性抗体，如本发明所提供的插入第一融合配体(人构架或人免疫球蛋白可变区)的抗体。
优选第一融合配体可操纵地与第二融合配体相连接，在前面定义了第二融合配体，其可包含一个编码感兴趣的第二抗体区序列，如Fc区。第二融合配体也可包含编码另一免疫球蛋白的序列，其轻链或重链恒定区与该免疫球蛋白在构架中融合或通过一连接序列融合。指导作用于IL4功能片断或类似物的基因工程抗体可以被设计引出与相同抗体增强的结合。
第二融合配体也可与上述的效应子联合使用，该效应子包括非蛋白载体分子，该第二融合配体与效应子通过常规方法可操纵地进行连接。
可通过任一合适的方式如常规的共价键或离子键、蛋白融合或杂-双功能交联剂如碳二亚胺，戊二醛等在第二融合配体如抗体序列和效应子间进行融合或连接。这些技术在本领域是公知的并且描述于传统的化学和生物化学课本中。
此外，常规的仅在第二融合配体和效应子间提供所需的空间的接头序列也可被构建入融合分子。该接头的设计在本领域也是所熟知的。
此外，可对本发明分子的信号序列进行修饰以增强表达。例如，具有鼠重链序列氨基酸序列的所需融合蛋白，与图2[SEQ ID NO：4]的嵌合可变重链(VH)相同，其具有被另一信号序列(氨基酸残基1-20)(SEQ ID NO：6)取代的起始信号肽。
一例融合蛋白含有一可变重链和/或轻链肽或蛋白序列，该序列具有MAb 3B9的抗原特异性，如VH[SEQ ID NO：9和10的氨基酸残基21-141]和VL链[SEQ ID NOS：1和2的氨基酸残基21-132]。还有本发明的另一所需的融合蛋白其特征为氨基酸序列含有鼠抗体分子3B9的重链和/或轻链可变区的至少一个并优选所有的CDRs，3B9保持有来源于人的序列或其功能片断或类似物。参见如SEQID NO：11和12及SEQ ID NOS：13和14(图4和5)的人源化VH和VL区。
在另一实例中，本发明的基因工程抗体可附带一种添加剂。例如，重组DNA技术的步骤可用来生产一种本发明基因工程抗体，其中完整抗体分子的Fc片断或CH3区被酶或其它可检测分子(即多肽效应因子或报道分子)取代。
第二融合配体也可操纵地与非免疫球蛋白肽、蛋白或其片断连接，这些肽或蛋白或其片段与含有CDR的具有鼠3B9抗原特异性的序列是异源的。表达时所得结果蛋白可呈抗-IL4抗原特异性和非免疫球蛋白的特点。融合配体的特点可以是例如功能特征如另一结合或受体区域，或者融合配体本身是治疗蛋白时为治疗特征，或者是附带的抗原特征。
本发明另一合乎需要的蛋白质可包括具有全部长度重链和轻链的完整抗体分子或其任意分离的片断如Fab或F(ab′)2片断，重链二聚体，或其任意最小的重组片断如Fv或单链抗体(SCA)或任意其它与所选供体MAb例如MAb3B9或6A1具有同样特异性的分子。这种蛋白质可以其融合蛋白的形式或其非融合形式使用。
每当第二融合配体由另一抗体产生，该抗体如任一同种型或类的免疫球蛋白构架或恒定区，就会产生基因工程抗体。工程抗体可包括得自一个种来源如受体抗体的免疫球蛋白(Ig)恒定区和可变构架区及自供体抗体如此处所述的抗IL-4抗体的一个或多个(优选全部)CDRs。此外，为了保持供体抗体抗原结合特异性，可以进行核酸或氨基酸水平的受体MAb轻链和/或重链可变区域构架区或供体CDR区的改变，如缺失、取代或添加。
设计这种工程抗体，采用IL4MAb(根据所描述的方式可选择地进行修饰)的一种(或两种)可变重链和/或轻链，或一个或多个下部相同的重链或轻链CDRs(参见实施例3)。本发明的工程抗体是中和的，即它们适当地阻断与IL4蛋白受体的结合。例如，源于MAb 3B9的工程抗体直接作用于人IL-4特异的三级蛋白质表位，认为是在B-C环→C螺旋区，正如上所述。
这种工程抗体可包括含有所选人免疫球蛋白或亚型构架区的人源化抗体，或含有与IL4抗体功能片断融合的人重链和轻链恒定区的嵌合抗体。适宜的人(或其它动物)受体抗体同源于供体抗体核苷酸和氨基酸序列，可选自常规数据库，如KABAT数据库，Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。以与供体抗体(在氨基酸基础上)构架区同源为特点的人抗体可适于提供重链恒定区和/或重链可变构架区，以插入供体CDRs。能提供轻链恒定区和可变构架区的适宜的受体抗体可以相似的方法选取，应注意的是，供体抗体重链和轻链不必源于同样的受体抗体。
合乎需要的异源构架和恒定区选自人免疫球蛋白类和同种型，如IgG(亚型1至4)，IgM、IgA和IgE。然而，受体抗体不必仅含有人免疫球蛋白序列。例如可以构建一个基因，其中编码部分人免疫球蛋白链的DNA序列与编码如多肽效应因子或报道分子这样的非免疫球蛋白氨基酸序列的DNA序列融合。
一例特别合乎需要的人源化抗体含有3B9的CDRs，其插入在所选人抗体序列的构架区。为中和人源化抗体，一个、两个或优选三个来自IL4抗体重链和/或轻链可变区的CDRs被插入在所选人抗体序列的构架区，取代人抗体中天然的CDRs。
优选地，在人源化抗体中，通过一个或多个CDR置换建立人重链和轻链的可变区域。可使用全部6个CDRs或少于6个CDRs的不同组合。优选全部六个CDRs均被置换，可仅在人重链中置换CDRs，使用轻链为来自人受体抗体的未修饰轻链。还可选择地，匹配轻链可选自常规抗体数据库中的另一人抗体。该工程抗体的剩余部分可来自任意合适的受体人免疫球蛋白。
由此优选工程人源化抗体具有天然人抗体或其片断的结构，并且具有有效治疗如人IL4开导的炎症的)治疗或诊断应用所需的结合性质。
作为另一实例，工程抗体可含有3B9可变轻链区[SEQ ID NO：16、18、20和28]的三个CDRs和3B9可变重链区[SEQ ID NO：22、24和26]的三个CDRs。得到的人源化抗体以抗原结合特异性和MAb 3B9的高度亲合性为特征。
基因工程抗体可通过多样化区域氨基酸的变化被进一步修饰，而不会必然地影响特异性和供体抗体(即类似物)高度亲合性，这对本领域技术人员是明了的。例如，人源化单克隆抗体已被构建，其轻链氨基酸残基在第120位是精氨酸[SEQ ID NO：13和14]或苏氨酸[SEQ ID NOS：57和58]我们预期重链和轻链氨基酸在多样化区域构架区或CDRs或这两个区可被其它氨基酸取代。
此外，可改变恒定区以增强或减弱本发明分子的选择性质，例如，二聚作用，与Fc受体结合，或结合和活化补体的能力(参见，如Angal等， Mol.Immunnol， 30：105-108(1993)，Xu等， J.Biol. Chem， 269：3469-3474(1994)，Winter等，EP 307，434-B)。
作为嵌合抗体的融合蛋白不同于上述的人源化抗体，其提供了与两链人免疫球蛋白恒定区相联的包括构架区的整个非人类供体抗体的重链和轻链可变区。我们期望保持附加的与本发明人源化抗体相关的非人类序列嵌合抗体可在人体引起明显的免疫应答。
这类抗体可用于预防和治疗IL4介导的变应性紊乱，如下所述。
VI.融合蛋白和工程抗体的生产
优选地，MAb 3B9的可变区轻链和/或重链序列及CDRs[SEQ IDNO：16、18、20、22、24和26]或其它适合的供体MAbs(如6A1)，及它们的编码核酸序列均被用于以下述方法构建本发明融合蛋白和工程抗体，优选人源化抗体。也可采用相同或相似的技术完成本发明的其它实例。
用常规手段克隆生产所选供体MAb如鼠抗体3B9的杂交瘤，且以本领域技术人员已知技术获得其重链和轻链可变区的DNA，如描述于Sambrook等， Molecular Cloning(A laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中的技术。以聚核苷酸引物和逆转录酶来得到3B9的可变重链和轻链区，该区至少包含为保持供体MAb结合特异性所需的CDRs和受体MAb轻链和/或重链可变区域构架区的那些部分，以及存留的源自人免疫球蛋白的抗体链的免疫球蛋白衍生部分。采用已知数据库和通过与其它抗体比较来鉴别CDRs。
然后可制备鼠/人嵌合抗体，并分析其结合能力。这种嵌合抗体含有整个非人供体抗体VH和VL区，与两链中人Ig恒定区相联。
利用计算机化数据库如KABAT鉴别来自人抗体的重链可变区的同源构架区，选择与3B9同源的人抗体为受体抗体，在人抗体构架内含有3B9 CDRs的合成的重链可变区序列用可选择的核苷酸在构架区中取代以结合限制酶切位点。然后通过重叠寡核苷酸合成所设计的序列，以聚合酶链反应(PCR)扩增，并改正错误之处。
以相似的方式设计合适的轻链可变构架区。
人源化抗体可由嵌合抗体衍生，或优选地通过在所选重链和轻链构架中适当地插入来自重链和轻链的供体MAb CDRs来合成制备人源化抗体。可选择地，可使用标准诱变技术制备本发明的人源化抗体。因此，结果得到的人源化抗体含有人构架区和供体MAb CDRs。可随后对构架残基进行操作。所得到的人源化抗体能在如COS或CHO细胞这样的重组宿主细胞中表达。该方法的另外的细节描述于实施例4中。将此技术用于其它合适的IL-4特异的中和的高滴度的非人类抗体，可制备其它人源化抗体。
通过设置可操纵地与常规调控序列相连的融合蛋白的编码序列来生产传统的表达载体或重组质粒，该调控序列能在宿主细胞中控制复制和表达和/或从宿主细胞分泌。调节序列包括启动子序列如CMV启动子和信号序列，其可由其它已知抗体衍生而得。相似地，生产出第二种表达载体具有编码互补抗体轻链或重链的DNA序列。优选此第二表达载体与第一载体相同，除了考虑编码序列和可选择的标记，以保证尽可能地每一多肽链被功能地表达出。
通过常规技术以第一和第二载体共同转染所选择的宿主细胞或以单一载体简单转染所选择的宿主细胞，产生本发明含有两种重组的或合成的轻链和重链的转染的宿主细胞。然后以常规技术培养转染细胞生产本发明的工程抗体。用适当的分析手段如ELISA或RIA从培养物中筛选出此人源化抗体，其包含相联的重组重链和/或轻链两者。可采用相似的常规技术构建本发明的其它融合蛋白和分子。
本领域技术人员可选择合适的载体用于克隆和亚克隆步骤，这些步骤是在本发明方法中和组合物构建中所采用的。例如，可采用常规的pUC系列克隆载体，所用的一个载体是pUC19，可从供应商店购买，如Amersham(Buckinghamshire，英国)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。此外，任意一个能迅速复制，具有丰富的克隆位点和标记基因及容易进行操作的载体都可用于克隆。因此，克隆载体的选择不是本发明限制因素。
相似地，用于表达本发明基因工程抗体的载体可由本领域技术人员从任一常规载体中选择，该载体也含有所选的调节序列，其操纵地伴随免疫球蛋白区的DNA编码序列的产生，且能在所选宿主细胞如CMV启动子中指导异源DNA序列的复制和表达。这些载体含有上述编码基因工程抗体或融合分子的DNA序列。可选择地，载体可结合所选的免疫球蛋白序列，该序列通过插入有合乎需要的便于操作的限制酶切位点而被修饰。
表达载体也可以标记基因为特征，该标记基因适于异源DNA序列如哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)或新霉素抗性基因(neoR)的扩增表达。其它优选的载体序列包括poly A信号序列，如来自牛生长激素(BGH)和β珠蛋白启动序列(betaglopro)。此处所用的表达载体可用本领域技术人员熟知的技术合成。
这些载体的成份，如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等等可从天然来源或合成方法以所知技术而获得，以用于指导重组DNA产品在所选宿主中的表达和/或分泌。也可根据此目的选择其它适合的各种类型本领域所熟知的用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的表达载体。
本发明还包括以重组质粒转染的细胞系，该质粒含有工程抗体或融合分子的编码序列。用于这些克隆载体的克隆和其它操作的宿主细胞也是常规的。然而，最合乎需要的是来自E.coli不同株的细胞被用于克隆载体的复制和构建本发明融合蛋白的其它步骤。
表达本发明工程抗体或融合蛋白的适宜的宿主细胞或细胞系优选真核细胞，如CHO，COS，成纤维细胞(如3T3)和其它细胞中的骨髓细胞，最为优选的是哺乳动物细胞，如CHO细胞或骨髓细胞。可使用人的细胞，由此能使分子以人糖基化模式被修饰。可选择地，可采用其它真核细胞。对合适的哺乳动物宿主细胞的选择，转化方法、培养、扩增、筛选和产品生产及纯化均为本领域已知技术。参见如上述引用的Sambrook等。
细菌细胞证明可用作适于本发明重组MAbs的表达的宿主细胞。然而，由于在细菌细胞中表达的蛋白倾向于呈末折叠形式或不恰当折叠形式或未被糖基化形式，所以任一产生于细菌细胞中的重组MAb必须根据保留的抗原结合能力进行筛选，如果由细菌细胞表达的分子以合适的折叠形式生产，则该细菌细胞是合乎需要的宿主。例如，用于表达的E.coli的各种株是生物技术领域熟知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、链霉菌(Streptomyces)的各种株、其它杆菌等也均可在此方法中采用。
当需要时，本领域熟知的酵母细胞的株以及昆虫细胞如果蝇属(Drosophila)和鳞翘目(Lepidoptera)及病毒表达系统也可用作宿主细胞。参见如Miller等， Genetic Engineering， 8：277-298，Plenum Press(1986)及其所引用的参考文献。
构建本发明载体的一般方法，生产本发明宿主细胞所需的转染方法以及从该宿主细胞中生产本发明融合蛋白或工程抗体所必需的培养方法均为常规技术。同样地，一旦进行生产，本发明的融合蛋白或工程抗体可根据本领域的标准技术从细胞培养物中纯化，包括硫酸铵沉淀、亲合柱、柱层析、凝胶电泳等等。这些技术均为本技术领域熟知技术且不限制本发明。
表达人源化抗体的另一方法是利用在转基因动物中的表达，如描述于U.S.专利4,873,316。这涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，当酪蛋白启动子被转基因掺入哺乳动物中时使雌性动物在奶中产生所需的重组蛋白。
当用所需的方法进行表达后，便使用合适的分析方法检测工程抗体的体外活性。现在采用常规的ELISA分析形式来评估工程抗体与IL4表位的定性和定量结合。此外，其它体外分析，如BIAcore[Pharmacia]也可在随后的人临床研究前验证中和效能，所进行的人临床研究以评估体内的工程抗体的存在，不管通常的清除机理。
根据源自3B9的人源化抗体描述步骤，本领域技术人员也可从这里描述的其它供体IL4抗体，可变区序列和CDR肽构建人源化抗体。用被工程抗体的受体默认为“自身”的可变区构架可生产工程抗体。对可变区构架能进行小的修饰，以大大提高抗原结合性，而不会明显增强受体的免疫原性。这种工程抗体能有效地治疗人IL4介导的疾病。这种抗体也用于诊断这类疾病。
VII.治疗/预防应用
本发明也涉及一种治疗人变应性紊乱的方法，其包含给与有效剂量的抗体，抗体包括这里所描述的一种或多种工程抗体或融合蛋白或其片断。
由本发明分子诱导的治疗应答是通过与人IL4结合并由此随后阻断IgE的释放而产生。因此，本发明分子当用在适于治疗用途的制剂和配方中时，对那些经受变应性反应如变应性鼻炎、结膜炎、特应性皮炎、异位性哮喘和过敏性休克的人来说是非常合乎需要的。
本发明的融合蛋白、抗体、工程抗体或其片断也可与其它抗体结合使用，特别是能与疾病其它相关标记(表位)反应的人MAbs，这里本发明的工程抗体是治疗该疾病的。类似地，能与所选动物疾病相关表位反应的MAbs也可用于兽药组合物中，这里本发明的工程抗体是治疗该疾病的。
本发明治疗剂在治疗变应性疾病约2天至约3周或所需要的时间中被认为是令人满意的。例如，当治疗季节性鼻炎或类似的疾病时较长时间的治疗可满足需要。这表明比当前所使用的现有技术治疗IL4介导紊乱的注射方法相比具有显著的进步。剂量和治疗持续时间与本发明分子在人体循环中相对的持续时间有关，其能由本领域技术人员依据所治疗的疾病和病人平时的健康状况进行调整。
本发明治疗剂的给药方式可以是给宿主递送药剂的任意合适途径。本发明的融合蛋白、抗体、工程抗体、其片断和药物组合物特别用于非肠道形式给药、即皮下、肌内、静脉内或鼻内方式。
本发明的治疗剂可制备成药物组合物，其含有本发明有效量的工程(如人源化)抗体，该抗体作为药物上可接受载体中的活性成份。本发明的预防剂，优选呈即时注射形式的含工程抗体的水悬浮液或溶液，特别是缓冲至生理pH的溶液。非肠道给药的组合物通常包括一种本发明工程抗体的溶液或一种其溶解于药物上可接受载体特别是水溶液载体的混合液。可采用各种水溶液载体，如0.4％盐水、0.3％甘氨酸等等。这些溶液是无菌的且通常不含特别物质。这些溶液可用常规的熟知的灭菌技术(如过滤)进行灭菌。为了按近生理条件如pH调节和缓冲剂等的要求，组合物可包含药物上可接受的辅助物质。这种药物制剂中本发明抗体的浓度根据所选择的特定的给药方式变化范围很宽，即从低于0.5％，通常为或至少为大约1％至多至15或20％(重量百分比)，并且主要根据液体体积、粘度等进行选择。
因此，可制备用于肌内注射的本发明药物组合物，其含1mL无菌缓冲水和约1ng至约100mg间的如约50ng至约30mg或更为优选地约5mg至约25mg的本发明工程抗体。相类似地，可制备用于静脉内输注的本发明药物组合物，其含约250ml的无菌林格溶液(Ringer′sSolution)和约1至30优选5mg至约25mg的本发明工程抗体。制备可用非肠道形式给药的组合物的实际方法是熟知的或对本领域技术人员而言是显而易见的，且更详细描述于如Remington′sPharmaceutical Science，15th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania。
优选本发明治疗剂当用为药物制剂时以单位剂量形式存在。本领域技术人员可很易确定适当的治疗有效剂量。为有效治疗人体或其它动物的炎症疾病，应以非肠道方式优选肌内方式(intramuscularly)给药一剂本发明蛋白或抗体，一剂量为每70kg体重近0.1mg至近20mg。如果必要的话，可在炎症反应期间医生所选择的适当的时间间隔重复该剂量。
本发明也包括将本发明IL4融合蛋白与其它抗体或融合蛋白一同给药或连续给药，这些其它抗体和融合蛋白的特征为具有抗-IL4活性，如抗肿瘤坏死因子活性或其它与本发明融合蛋白的IL4受体结合活性相容的药物活性。这些抗体可购买得到或用此处描述的相似方法设计。
本发明融合蛋白和工程抗体也可用于诊断治疗方案，如确定IL4介导的疾病或跟踪这种疾病的治疗进程。作为诊断试剂，这些融合蛋白可以常规方式标记用于ELISA′s和其它常规分析形式，用于测量血清中，血浆中或其它合适组织中的IL4水平。使用融合蛋白的分析，其性质是常规的，且不限制本公开内容。
这里所描述的抗体、工程抗体或其片断可被冷冻干燥用于贮存且在使用之前以适当的载体重新配制。已证明这一技术对常用的免疫球蛋白是有效的，并且已知的冷冻干燥和重配制技术可被采用。
下述实施例描述本发明的各个方面，包括例证的工程抗体的构建，其在合适的载体和宿主细胞中的表达，这些实例并不构成本发明的限制范围。所有的氨基酸以常规的三字母或单字母表示。所有必需的限制酶、质粒、其它试剂和材料除非另有说明，均是通过购买得到，所有通常的克隆连接和其它重组DNA技术见上面引用的T.Maniatis等，或其第二版(1989)，由Sambrook等编，同样出版商(Sambrook等)出版。实施例1-MAb 3B9的生产
A.免疫方法
以弗氏完全佐剂中50μg重组大肠杆菌(E.coli)人IL4皮下免疫4只鼠(Balb/c和c57BL/6杂交的F1)，4周后以弗氏不完全佐剂中的50μg IL4腹膜内(i.p.)增强免疫。在对IL4具良好的血清抗体滴度的基础上，一只鼠在8周时以200μg IL4(i.p.盐水中)，两天后100μg IL4(i.p.盐水中)及两天后以50μg IL4(i.p.盐水中)进一步进行免疫。最终免疫后两天进行脾切除术。
B.融合方法和筛选系统
鼠脾细胞用于制备杂交瘤(通过标准方法，如描述于Kohler等，Nature， 256：495(1975)，采用可购买的BIAcore系统及下述的ELISA分析从该杂交瘤中筛选多于250个细胞克隆，其分泌对于IL4的抗体以与IL4结合。5个小孔得出阳性反应。只有1个来自鼠3B9的克隆呈强烈的阳性。所有源于3B9的二次克隆均呈阳性。实施例2-ELISA分析和亲和常数
A.ELISA
设计下述的筛选分析以测定与天然人IL4的亲合性。实验1用1μg/ml，100μl/孔，0.1M硼酸缓冲液中pH 8.5的IL4涂布醛活化的96-孔板，并在RT保温过夜。hIL4共价附着在板上。抽吸IL4溶液，并以含1％的牛血清白蛋白(BSA)的TBS缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，1mM MgCl2，0.02NaN3，pH 7.4)37℃下阻断非特异性结合(NSB)位点60分钟。这步以及下面的每一步之后，将板在洗涤缓冲液(10mM Tris，150mM NaCl，0.05％Tween 20，0.02％NaN3，pH 7.4)中洗涤4次。之后，加入50μl杂交瘤培养基(或纯化的3B9或Fab片断)和50μl分析缓冲液(TBS缓冲液中的0.5％牛γ球蛋白)。平板在37℃保温60分钟。向每孔分析缓冲液中加入100μl生物素化的抗鼠抗体并如上述方法保温。向每孔加入100μl与链霉抗生物素蛋白结合的碱性磷酸酶并保温(30分钟，37℃)。每孔加入100μL PNP底物并于37℃保温30分钟。在光密度405nm处读数。
实验2，链霉抗生物素蛋白涂布的板(100μL/孔，磷酸缓冲盐水(PBS)中1μg/ml)于4℃保温过夜并根据下述方法分析。抽吸链霉抗生物素蛋白溶液，以含1％BSA的TBS缓冲液阻断NSB位点(60分钟37℃)。这一步及下面每步之后，将板在洗涤缓冲液中洗4次。将50μl生物素化的IL4与50μl分析缓冲液一起加入并于37℃保温30分钟。之后，加入50μl纯化的3B9 IgG或Fab片断(或杂交瘤培养基)和50μl分析缓冲液，37℃保温60分钟。加入100μl抗鼠IgG碱性磷酸酶结合物并于37℃保温60分钟。加入100μl PNP底物并于37℃保温30分钟，如上述方法读取数据。
B.计算3B9与IL4亲合力
利用上述实验和下面的简化结果，按Beatty等， J. Immunol.Methods， 100：173-179(1987)描述的方法计算3B9的Kd： K aff = 1 2 ( 2 [ Ab * ] - [ Ab ] ) Ab*＝结合于150ng/ml生物素化hIL4上的Ab的浓度Ab＝结合于300ng/ml生物素化hIL4上的Ab的浓度根据关系 K d = 1 K aff 计算解离常数Kd。
实验1：在链霉抗生物素蛋白涂布的96孔板(100ng/孔)上的ELISA分析。 Kd＝2.2×10-10M(3B9 Fab)
实验2：在链霉抗生物素蛋白涂布的96孔板(100ng/孔)上的ELISA分析。Kd＝1.4×10-10M(3B9 IgG)
C.特异性
MAb 3B9识别人IL4，但不识别牛或鼠IL4，一种确定这一点的方法描述如下。进行ELISA时使用-抗鼠IgG涂布的96孔板，随后用牛血清白蛋白阻断，板上50μl 3B9(100ng/ml)，25μL非人类IL4和25μL生物素-IL4被保温于37℃ 60分钟，随后进行洗涤，加入链霉抗生物素蛋白结合的碱性磷酸酶和PNP。
类似地发现MAb 6A1不能识别牛或鼠IL4。实施例3-人源化抗体
设计人源化抗体，在一人抗体构架中含有鼠CDRs。通过下列操作进行IL4特异的鼠抗体3B9的人源化转变：
A.cDNA克隆
cDNA克隆是利用Boehrihger Mannbeim试剂盒从提取于3B9杂交瘤细胞系[实施例1]的mRNA得到的3B9重链和轻链制备的。对鼠枢纽区或Kappa恒定区特异的引物用于第一链的合成。Kappa链引物是[SEQ ID NO：29]：
5′-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3′重链引物是[SEQ ID NO：30]：
5′GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC3′.
双链cDNA被直接克隆入质粒pGEM7f+[Promega]，然后其被转化入大肠杆菌E.coli DH5-α[Bethesda Research Labs]。
B.DNA排序
从上述A部分得到的8条重链和一条轻链鼠cDNA克隆被排序。这些克隆可变区的排序结果示于SEQ ID NO：1和2和3和4。每一克隆含有已知为保持在鼠重链可变区或轻链可变区的氨基酸和鼠信号序列。CDR氨基酸序列如下。
CDR区重链为SEQ ID NO：22、24和26，(SEQ ID NO：4的氨基酸50-56、71-86和119-129)。见图2。这些序列分别由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25编码。CDR区轻链为SEQ ID NO：16、18和20(SEQ ID NO：2的氨基酸45-58、74-80和113-121)。见图1。这些序列分别由SEQ ID NO：15、17和19编码。
C.人构架的选择
3B9克隆之后，利用KABAT和SWISS数据库将不同区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸21至132和SEQ ID NO：4的氨基酸20至140)与人免疫球蛋白序列数据库相对比，以鉴定重链和轻链两者的人构架，其在序列同源性上非常匹配于鼠母链。除这些序列同源性探查之外，还评估重链和轻链对位置数据库的作用，此数据库由Fab区域的结构模型产生，以估算由于氨基酸取代造成的潜在冲突，这种氨基酸取代可能会影响CDR的存在。现情况下没有在结构探查中检测出明显的冲突；因此，使用由氨基酸序列同源性探查推断出的DNA编码。
使用由人骨髓瘤免疫球蛋白(COR)获得的抗体的重链构架区[E.M.Press和N.M.Hogg，Biochem.J.117：641-660(1970)]。发现该序列在氨基酸水平上与3B9可变区具有约77％的同源性(69.4％等同性)。
对合适的轻链可变构架区，使用H.G.Klobeck等，Nucl.AcidsRes.，13：6515-6529(1985)中鉴定的人抗体的轻链可变构架序列。发现人抗体序列在氨基酸水平与鼠3B9可变轻链区有近80.2％是同源的(72.0％等同)。
给出鼠3B9 CDRs[SEQ ID NO：15-26]和人抗体序列，来制备合成的重链及PCR操作以填充和扩增DNA，由下面重叠的寡核苷酸合成这些序列并以PCR扩增。SEQ ID NO：31-37提供5个重叠寡核苷酸(oligos)和2个PCR引物。发现寡核苷酸1[SEQ ID NO：31]跨越碱基5-121。发现寡核苷酸2[SEQ ID NO：32]跨越碱基122-241，寡核苷酸3[SEQ ID NO：33]跨越碱基242-361。两条底链引物SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35跨越碱基134-110和碱基253-230。在作出图谱序列中的任意由PCR插入的错误均被改正。使用作为5′引物的核苷酸1-25 SEQ ID NO：36和作为3′引物的核苷酸361-341 SEQ ID NO：37再次进行PCR。
合成的可变区与来自嵌合重链构建物的合成信号序列SEQ IDNO：5和6和IgG1人恒定区一起被连接入表达载体pCD。合成VH和信号序列核苷酸及氨基酸序列由图4提供[SEQ ID NOS：11和12]。CDRs的氨基酸序列[SEQ ID NOS：22、24和26]与鼠3B9 CDRs相同。然而，这些CDRs的编码序列[SEQ ID NOS：54、55和56]不同于鼠3B9编码序列[SEQ ID NOS：21、23和25]。得到的表达载体IL4hzhc-1-Pcd示于图9。
先前存在的轻链构架的CDR基因区被限制消化除去，并以下面的合成IL-4 CDR基因取代，其是以合成法制得。
    对于CDR1：
SEQ ID NO：38：5′CTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAAC
TGCAAGG 3′
SEQ ID NO：39：CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGACACAG
SEQ ID NO：40：TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAG
TTATATGAACTGGTATCAGCAGAAACCC
SEQ ID NO：41：
GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATA
ATCAACACTTTGGGAGGCCTC
   对于CDR2：
SEQ ID NO：44：
GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGCTGCATCCAATCTA
GAATCTGGGGTAC
SEQ ID NO：45：
CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGG
AGGCTGCCC
   对于CDR3：
SEQ ID NO：42：
ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGG
CGGAGGGAC
SEQ ID NO：43：
CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTG
CTGACAGTAGT
合成的VL和信号序列核苷酸及氨基酸序列由图5提供[SEQ IDNOS：13和14]。首先的两个CDRs氨基酸序列[SEQ ID NOS：16和18]与相应的鼠3B9 CDRs相同。然而第一CDR的编码序列[SEQ IDNO：53]不同于鼠3B9编码序列[SEQ ID NO：15]。进一步地，在最后的CDR中，构建了两个3B9氨基酸序列的人源化构建物。一个[SEQ ID NO：28]由于一个氨基酸不同[SEQ ID NO：20]而不同于天然鼠3B9序列。SEQ ID NO：28由SEQ ID NO：27编码。合成的可变轻链区与信号序列[SEQ ID NOS：7和8]一起连接入表达载体中。所得的表达载体之一IL4hzlc1-0-Pcn描绘于图10。
在构建人源化抗体中使用这些合成的可变轻链和/或重链序列。实施例4-人源化MAb在COS和CHO细胞中的表达
制备VH的pUC18亚克隆以增加一个最初得自人抗体的信号序列SEQ ID NO：5。对于VL，制备pUC18的亚克隆以增加一个信号序列SEQ ID NO：7。
源自IgG1同种型的人源化重链，在氨基酸水平上与来自3B9的鼠重链呈89.3％的同源性(84.3％等同性)。这一合成的VH为SEQ IDNOS：11和12的氨基酸20-141。
人源化轻链，人Kappa链在氨基酸水平上与3B9显示出92.0％的同源性(86.6％的等同性)。设计这一含3B9 CDRs的合成VL[SEQ IDNOS：13和14的氨基酸21至131]并根据上述合成重链的方法合成。
含有其各自的与人重链可变区或轻链可变区相连的信号DNA片断以常规方法[上述Maniatis等]被插入pUC-19为基础的哺乳动物细胞表达质粒中，该质粒含有CMV启动子和下面实施例5生产的嵌合体的人重链或人轻链恒定区，生产出质粒IL4hzlc1-1-Pcd(重链)[图9]和IL4hzlc1-0-Pcn(轻链)[图10]。HZHC和HZLC质粒被共转染入COS细胞，三和五天后以上述的ELISA分析上清液中人源化抗体的存在。以IgG4同种型构建另一个人源化抗体。
上面的实施例描述了一例工程抗体的制备。使用常规方法所开发的其它抗-IL4抗体(如6A1-实施例7)采取相似的步骤生产其它工程抗体。实施例5-嵌合抗体的构建
A.从原始鼠MAb 3B9中分离作为 EcoRI- BstE II限制片断的鼠可变重链区来构建嵌合重链。设计一小段DNA寡聚体，并合成以连接鼠可变区与人IgG1恒定区( BstE II- ApaI)：5′引物SEQ ID NO：50：GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC3′引物SEQ ID NO：51：CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG
这两个片断被连接入已编码人IgG1恒定区的质粒pCD(见图7)(以EcoRI和 ApaI消化)。这一克隆不表达，因此自然存在5′UTR和信号序列缺失并以SEQ ID NO：5和6取代。
因为在信号序列的3′末端不能获得常规的限制性内切酶位点，所以通过PCR引入 BstEII位点(即沉默诱变)。使用下面的PCR引物：SEQ ID NO：48：5′引物：5′CAGGTTACCCTGAAAGAGTC 3′SEQ ID NO：49：3′引物：5′GAAGTAGTCCTTGACCAG 3′
然后从该质粒中分离出 BstE II- PstI限制性片断。之后设计新的信号序列和5′UTR并合成使具有 EcoRI和 BstE II末端。SEQ ID NO：46：5′引物：AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTG CCTACGGGCAGSEQ ID NO：47：3′引物：GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAGAAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCG
应用PCR技术，嵌合轻链被构建到被克隆入pGEM72f(+)[Promega]的起始鼠3B9轻链上构建。使用的引物是可购买到的pUC18通用的在5′末端(EcoRI)反向引物和引入一个 NarI位点的3′引物[5′CATCTAGATGGCG CCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3′SEQ ID NO：52]，这些引物用来将鼠可变区融合入人恒定区。然后该可变区被连接入包含人Kappa区的表达载体pCDN( EcoRI  NarI)(图8)中。
三天和五天后收集培养基上清液并用下述的ELISA分析：用0.1μg与人抗体Fc区特异的羊抗体涂布ELISA板，加入基质上清液时间为1小时。加入与整个人IgG抗体特异的羊抗体结合的辣根过氧化物酶，然后加入ABTS过氧化物酶底物(Kirkegaard & Perry LaboratoriesInc.，Gaithersburg，MD)1小时。检测嵌合抗体的表达。在另一ELISA中含有嵌合抗体的COS细胞上清液与重组人IL4蛋白特异地结合，这一结果确证了编码特异于IL4的抗体的基因已被克隆。
B.也可从这一嵌合重链获得人源化重链。在人构架中插入鼠CDRs设计人源化重链。所选的人构架如上所述，其是Swiss Protein数据库中与鼠3B9 VH(SEQ ID NO：4氨基酸20-140)最同源的蛋白序列，合成制备该人源化重链序列( EcoRI  ApaI)并进行PCR操作以填充和扩增上述DNA。合成的可变区与来自嵌合重链构建物的合成信号序列SEQ ID NOS：5和6及IgG1人恒定区一起连接入表达载体pCD( EcoRI  ApaI)。
相类似地，根据制备重链所述的方法，人源化轻链可自嵌合的轻链制备。基因( EcoRV  NarI)也是合成制备的。人源化VL与信号序列( EcoRI  EcoRV)一起连接入由 EcoRI  NarI消化的表达载体pCN。表达载体提供了人Kappa恒定区。实施例6-人源化MAb-纯化和热力学
通过常规的蛋白质A(或G)亲和层析及随后离子交换和分子筛层析可纯化CHO表达的嵌合和人源化3B9。相类似的方法已成功地用于其它MAbs的纯化，纯度大于95％(如与呼吸性合胞体病毒和疟环子孢子抗原)。
通过滴定微量热法测定IL4与人源化MAb 3B9和鼠3B9(实施例1)结合的亲和性和详细的热力学，该方法利用其反应的内热测定结合反应(参见如Wiseman等， Aanl. Biochem. 179：131-137(1989))。发现这两种MAbs的亲和力太大以致于在环境温度下不能直接测量。因此采用的热力学途径为i)在60℃测量亲和力，这时亲和力很弱足以直接测量；ii)从30°-60℃测量结合焓的温度依赖性。利用Gibbs-Helmholz方程将这些数据一起计算广范围温度下的亲和力。
人源化和鼠3B9抗体的IL4结合热力学总结于表1。基于两种MAbs的自由能，焓、熵和热容的变化，结合热力学是不易觉查的。
                      表1
        在pH7.4，150mM NaCl，和25℃下hIL-4
        与人源化3B9和鼠3B9的结合热力学MAb         Kd        ΔG         ΔH       -TΔS     ΔC
        微微摩尔   kcal/       kcal/     kcal/     cal/mol
                   mol IL4     mol IL4   mol IL4   IL4/°K人源化3B9   11         -13.6±0.6  -21.8±2  8.2±2.1  -580±160鼠3B9       19         -13.3±0.6  -20.5±1  7.2±1.2  -660±200
分别测定人源化3B9和鼠3B9的IL-4亲合力，使成四倍和两倍值测。实施例7-大鼠MAb的生产和特征
用实施例1中描述的免疫鼠的同样的免疫过程免疫大鼠，所选择的高度亲和性MAb 6A1由一只已免疫大鼠得到。6A1选自杂交瘤，该杂交瘤从人IL4免疫的大鼠制备(特别是杂交瘤3426A11C1B9)。
根据Beatty等， J.Immunol，Methods， 100：173-179(1987)描述的方法计算6A1的Kd为2×10-10M。
根据European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)，杂交瘤3426A11C1B9于1993年10月6日保藏于PublicHealth Laboratory Service Centre for AppliedMicrobiology & Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，United Kingdom，保藏号9310062Q，且根据用于专利程序目的的微生物保藏的1977年布达佩斯条约，该杂交瘤已作为专利保藏而被接受。实施例8-MAbs 3B9(人源化)，3B9(鼠)和6A1的生物活性
用下述方法进行随后的分析。
A.与糖基化的rhIL4结合
将上面确认的抗体与产生于E.coli的非糖基化重组人IL4(rhIL4)一起放置。因为天然人IL4是糖基化的，所以确证与哺乳动物细胞细分泌的材料间的结合是很重要的。3B9与糖基化和非糖基化的人重组IL4的结合是正好等同的，因此不指导遮盖于天然人IL4上的表位。
B.IL4与受体结合的抑制作用
使用结合于gibbon细胞系MLA[ATCC TIB201]125I-rhIL4研究3B9对IL4与其受体结合的抑制力，细胞系中每个细胞约有6000个受体。在37℃下MLA细胞与125I-IL4一起保温30分钟。以油梯度离心分离结合有125I-IL4的细胞后，在一γ计数器上测定放射活性的摄取量，通过在100倍mol过量的未标记IL4存在下保温，测定非特异性的结合[Park等， J.Exp.Med.， 166：476-488(1987)]。当IL4的量(加入的)是83pM时这种分析中未标记的IL4的IC50值为22pM。完整的鼠(IgG)3B9 IC50是63pM，Fab片断是93pM。在另一浓度的IL4(218pM)情况下，鼠(IgG)3B9的分析量为109pM。
C.淋巴细胞增殖的抑制
使用Spits等， J.Immunol.， 139：1142-1147(1987)中所描述的方法，人外周血淋巴细胞与植物凝集素，一种T细胞促分裂原一起保温3天，以向上调节IL4受体。然后进一步用IL4刺激生成的blas成母细胞3天。通过3H胸苷的掺入测量增殖情况。用下列修改的Callard等，在 Lymphokines and Interferons，A Practical Approach，ch.19，p.345中的分析方法测量B细胞增殖。用IL4和固定化抗-IgM刺激纯化的人扁桃体B细胞。通过3H胸苷的掺入测量增殖情况。
3B9(鼠)抑制3H-胸苷的掺入，通过以133pM IL4刺激的人外周血T淋巴细胞以167pM IL4刺激的人扁桃体B淋巴细胞来抑制。IL2-刺激的T淋巴细胞不受影响。抑制T细胞增殖的IC50是30pM，抑制B细胞增殖的是103pM。3B9(鼠)Fab片断相应的值是108和393pM。
D.CD23介入的抑制
CD23是IgE(FcERII)的低亲和性受体，其由低浓度IL4导入停留B淋巴细胞膜上，作为一种产生IgE的必要条件，用IL4刺激纯化的人扁桃体B细胞2天。用流动细胞计数[Defrance等， J.Exp.Med.，165：1459-1467(1987)]测定表达CD23受体的细胞百分数。3B9(鼠)抑制CD23在8.3pM IL4刺激的人扁桃体B淋巴细胞中的表达，IC50值为136pM。
E.IgE分泌的抑制
不象其它分析测定中的IL4以EC50浓度加入[ Pere等， Proc.Natl.Acad.Sci. 85：6880-6884(1988)]，为了减少该系统固有的变化性在IL4给出最大分泌的浓度条件下检查IgE分泌。根据下述方法测量T细胞的增殖。人外周血淋巴细胞与IL4一起保温10-18天，优选12天。由ELISA测定培养上清液中的IgE浓度。
在1.7nM IL4存在条件下，用3B9(鼠)和3B9的Fab片断抑制IgE分泌，分别得出IC50值为1.9和5.0nM。使用较低浓度的IL4 66.7pM重复进行该实验，使对于3B9(鼠)的IC50值减少至0.65nM。抗体(IgG)与IL4的摩尔比在所测浓度范围内保持不变(1∶1)。
F.数据总结及解释
在生物测定中抑制50％功能所需的IL4与各种MAbs的摩尔比例在表2示出。
表2                 在IL-4依赖的生物测定中mAbs 3B9，6A1和人源化3B9[IgG1和IgG4的变异体]间的对比活性
测定物质                              IC50(pM)[范围]n
  鼠3B9   鼠3B9(Fab)   大鼠6A1     人源化3B9
    IgG1   IgG4*
RBA   63[17-109]2   93   ＞50000
T cell   30[10-40]4   108   87     44[30-56]3   40
B cell   103[79-120]3   393   187     47[10-80]3   79
CD23导入   136[53-272]4   216   80     333
IgE合成   658[370-1070]6   1170   623[412-833]2     54[35-83]3   406
n＝实施分离试验的数目
*不同时测定IgG1和IgG4
在所有分析测定中，除IgE的分泌测定外，IL4约以ED50浓度加入。在两个淋巴细胞增殖分析测定中对人源化3B9，鼠3B9和6Al来说达50％抑制作用所要求的抗体与IL-4的摩尔比是相似的，但在CD23导入分析的情况下人源化3B9较高。后者为一种特别灵敏的分析，明显要求很低(～5％)的受体占据(Kruse等， EMBOJ， 12：5121 1993)，这从用鼠3B9所得结果明显可见，这种分析主要测定中间分析的变化性。
大鼠6A1和鼠3B9的活性对比结果显示出相似的功能效果曲线，但未想到6A1不能完全抑制放射性碘化IL4和其受体的结合。我们认为用于受体结合分析中的放射性碘化IL4在易受影响的第124位残基酪氨酸被碘化。当对比6A1对未标记的或碘化IL4诱导的CD23表达的抑制力时，发现对碘化配体的抑制效果要差。这些结果表明6A1在酪氨酸124区与IL4结合，但不是特异性的。
因此根据现有数据，6A1是一种高度亲和性的与IL4结合区域大大不同于3B9的中和抗体。实施例9-药物动力学
在雄性Sprague Dawley鼠上进行人源化3B9的药物动力学研究。人源化3B9以iv 丸剂形式1mg/kg给药于4只动物，用药后抽血样持续5周时间，使用IL-4/抗-人IgG夹心ELISA测定血浆人源化3B9浓度，设计ELISA实验不仅确证循环人IgG的存在，而且确证其与重组人IL-4的结合能力。
该研究结果总结于表3
                表3在雄性Sprague Dawley鼠中人源化3B9的药物动力学
        (剂量：1mg/kg iv丸)
          Clp(mL/h/kg)
大鼠1     0.442大鼠2     0.655大鼠3     0.555大鼠4     0.447
平均值    0.525SD        0.101
药物动力学数据缩写如下：Clp，表观血浆清除率
表示中间动物变化性的数据相对较小且血浆中人源化3B9的消失表现为双相的。表观血浆清除率低(0.5ml/kg)。半衰期示为11天。因此源于CHO细胞的人源化3B9的药物动力学特性与大鼠中其它人源化单克隆抗体是一致的。人源化3B9在大鼠中的长循环半衰期也显示出当给药于人时，人源化3B9在延长的时间期间看来是有效的。
本发明的各种修饰和改变包括在上述的说明书中，且认为其对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，人构架区或其修饰物，不是上述例证的抗体，可用于人源化抗体的构建物中。对本发明组合物和方法的这种修饰和改变被认为包含在这里所附的权利要求的范围中。
序列表<110>史密丝克莱恩比彻姆公司<120>用于治疗IL4介导疾病的重组IL4抗体<130>P50186-2<140>08/117,366<141>1994-09-07<150>08/136,783<151>1993-10-14<160>58<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>396<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(396)<400>1atg gag aca gac aca atc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca  48Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1                5                  10                  15ggc tcc act ggt gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct  96Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
        20                  25                  30gtg tct cta ggg cag agg gcc acc atc tcc tgc aag gcc agc caa agt  144Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
    35                  40                  45gtt gat tat gat ggt gat agt tat atg aac tgg tac caa cag aaa cca  192Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50                  55                  60gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat gct gca tcc aat cta gaa tct  240Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser65                  70                  75                  80ggg atc cca gcc agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc  288Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
            85                  90                  95ctc aac atc cat cct gtg gag gag gag gat gct gca acc tat tac tgt  336Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
        100                 105                 110cag caa agt aat gag gat cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg  384Gln Gln Ser Ash Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
    115                 120                 125gaa atc aaa cgg                                                  396Glu Ile Lys Arg
130<210>2<211>132<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>2Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1                5                  10                  15Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
        20                  25                  30Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
    35                  40                  45Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50                  55                  60Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser65                  70                  75                  80Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
            85                  90                  95Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
        100                 105                 110Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
    115                 120                 125Glu Ile Lys Arg
130<210>3<211>483<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(64)...(483)<400>3gaattcgcgg ccgctatgca gggacaatca gcagcagcaa tgaggaagta agcctgtgca 60gat atg aac agg ctt act tcc tca ttg ctg ctg ctg att gtc cct gca   108
Met Asn Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala
1                5                  10                  15tat gtc ctg tcc cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg   156Tyr Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu
            20                  25                  30cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca   204Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser
        35                  40                  45ctg agc act tct ggt atg ggt gtg agc tgg att cgt cag cct tca gga   252Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly
    50                  55                  60aag ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tac tgg gat gat gac aag cgc   300Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg
65                  70                  75tat aac cca tcc ctg aag agc cgg ctc aca atc tcc aag gat acc tcc   348Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser80                  85                  90                  95agc aac cag gta ttc ctc aag atc acc agt gtg gac act gca gat act   396Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr
            100                 105                 110gcc aca tac tac tgt gct cga aga gag act gtg ttc tac tgg tac ttc   444Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe
        115                 120                 125gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca               483Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140<210>4<211>140<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>4Met Asn Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr1               5                   10                  15Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln
        20                  25                  30Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
    35                  40                  45Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys
50                   55                 60Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr65                  70                  75                  80Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser
            85                  90                  95Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala
        100                 105                 110Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
    115                 120                 125Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140<210>5<211>60<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(60)<400>5atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc att tct ctg ttg ctc tgg atc tct  48Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1               5                  10                  15ggt gcc tac ggg                                                  60Gly Ala Tyr Gly
        20<210>6<211>20<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>6Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1               5                  10                  15Gly Ala Tyr Gly
      20<210>7<211>57<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(57)<400>7atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt  48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1               5                  10                  15gtc cac tcc                                                      57Val His Ser<210>8<211>19<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>8Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1               5                  10                  15Val His Ser<210>9<211>423<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(423)<400>9atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc att tct ctg ttg ctc tgg atc tct  48Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1               5                  10                  15ggt gcc tac ggg cag gtt acc ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg  96Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu
        20                  25                  30cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca   144Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser
    35                  40                  45ctg agc act tct ggt atg ggt gtg agc tgg att cgt cag cct tca gga   192Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly
50                  55                  60aag ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tac tgg gat gat gac aag cgc   240Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65                  70                  75                  80tat aac cca tcc ctg aag agc cgg ctc aca atc tcc aag gat acc tcc   288Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
            85                  90                  95agc aac cag gta ttc ctc aag atc acc agt gtg gac act gca gat act   336Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr
        100                 105                 110gcc aca tac tac tgt gct cga aga gag act gtg ttc tac tgg tac ttc   384Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe
    115                 120                 125gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca               423Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140<210>10<211>141<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>10Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1               5                  10                  15Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu
        20                  25                  30Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser
    35                  40                  45Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly
50                  55                  60Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65                  70                  75                  80Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
            85                  90                  95Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr
        100                 105                 110Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe
    115                 120                 125Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140<210>11<211>423<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(423)<400>11atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc att tct ctg ttg ctc tgg atc tct   48Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1               5                  10                  15ggt gcc tac ggg cag gtt acc ctg cgt gaa tcc ggt ccg gca cta gtt   96Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val
        20                  25                  30aaa ccg acc cag acc ctg acg tta acc tgc acc ttc tcc ggt ttc tcc   144Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser
    35                  40                  45ctg tcg acc tcc ggt atg ggt gtt tcc tgg atc cgt cag ccg ccg ggt   192Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50                  55                  60aaa ggt cta gaa tgg ctg gct cac atc tac tgg gac gac gac aaa cgt   240Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65                  70                  75                  80tac aac ccg agc ctg aaa tcc cgt ctg acg ata tcc aaa gac acc tcc   288Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
            85                  90                  95cgt aac cag gtt gtt ctg acc atg act aac atg gac ccg gtt gac acc   336Arg Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr
        100                 105                 110gct acc tac tac tgc gct cga cgc gaa acc gtt ttc tac tgg tac ttc   384Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe
    115                 120                 125gac gtt tgg ggt cgt ggt acc cca gtt acc gtg agc tca                 423Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140<210>12<211>141<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>12Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1               5                  10                  15Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val
        20                  25                  30Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser
    35                  40                  45Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50                  55                  60Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65                  70                  75                  80Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
            85                  90                  95Arg Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr
        100                 105                 110Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe
    115                 120                125Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140<210>13<211>393<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(393)<400>13atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt   48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1               5                  10                  15gtc cac tcc gat atc gtg atg acc cag tct cca gac tcg cta gct gtg   96Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val
        20                  25                  30tct ctg ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag gcc tcc caa agt gtt   144Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
    35                  40                  45gat tat gat ggt gat agt tat atg aac tgg tat cag cag aaa ccc ggg   192Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50                  55                  60cag cct cct aag ttg ctc att tac gct gca tcc aat cta gaa tct ggg   240Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65                  70                  75                  80gta cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc   288Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
            85                  90                  95acc atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gta tac tac tgt cag   336Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
        100                 105                 110caa agt aat gag gat cct ccg agg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag   384Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
    115                 120                 125atc aaa cgt                                                       393Ile Lys Arg
130<210>14<211>131<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>14Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1               5                  10                  15Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val
        20                  25                  30Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
    35                  40                  45Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50                  55                  60Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65                  70                  75                  80Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
            85                  90                  95Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
        100                 105                 110Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
    115                 120                 125Ile Lys Arg
130<210>15<211>45<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(45)<400>15aag gcc agc caa agt gtt gat tat gat ggt gat agt tat atg aac       45Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn1               5                  10                  15<210>16<211>15<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>16Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn1               5                  10                  15<210>17<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(21)<400>17gct gca tcc aat cta gaa tct                                       21Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser1               5<210>18<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>18Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser1               5<210>19<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(27)<400>19cag caa agt aat gag gat cct ccg acg                               27Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr1               5<210>20<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>20Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr1               5<210>21<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(21)<400>21act tct ggt atg ggt gtg agc                                       21Thr Ser Gly Met Gly Val Ser1               5<210>22<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>22Thr Ser Gly Met Gly Val Ser1               5<210>23<211>48<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(48)<400>23cac att tac tgg gat gat gac aag cgc tat aac cca tcc ctg aag agc  48His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1               5                  10                  15<210>24<211>16<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>24His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1               5                  10                  15<210>25<211>33<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(33)<400>25aga gag act gtg ttc tac tgg tac ttc gat gtc                         33Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1             5                  10<210>26<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>26Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val1               5                  10<210>27<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<220><221>CDS<222>(1)...(27)<400>27cag caa agt aat gag gat cct ccg agg                                 27Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg1               5<210>28<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>28Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg1               5<210>29<211>36<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>29ctaacactca ttcctgttga agctcttgac aatggg                             36<210>30<211>29<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>30gtacatatgc aaggcttaca accacaatc                                     29<210>31<211>117<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>31ggttaccctg cgtgaatccg gtccggcact agttaaaccg acccagaccc tgacgttaac  60ctgcaccttc tccggtttct ccctgtcgac ctccggtatg ggtgtttcct ggatccg     117<210>32<211>120<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>32tcagccgccg ggtaaaggtc tagaatggct ggctcacatc tactgggacg acgacaaacg  60ttacaacccg agcctgaaat cccgtctgac gatatccaaa gacacctccc gtaaccaggt  120<210>33<211>120<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>33tgttctgacc atggacccgg ttgacaccgc tacctactac tgcgctcgtc gcgaaaccgt  60tttctactgg tacttcgacg tttggggtcg tggtacccca gttaccgtga gctcccaacc  120<210>34<211>25<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>34acccggcggc tgacggatcc aggaa                                         25<210>35<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>35atggtcagaa caacctggtt acgg                                          24<210>36<211>25<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>36ttcgggttac cctgcgtgaa tccgg                                        25<210>37<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>37ccaaccctcg agtgccattg a                                            21<210>38<211>43<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>38ctagctgtgt ctctgggcga gagggccacc atcaactgca agg                    43<210>39<211>39<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>39ccttgcagtt gatggtggcc ctctcgccca gagacacag                         39<210>40<211>67<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>40tcgagaggcc tcccaaagtg ttgattatga tggtgatagt tatatgaact ggtatcagca  60gaaaccc                                                            67<210>41<211>63<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>41gggtttctgc tgataccagt tcatataact atcaccatca taatcaacac tttgggaggc  60ctc                                                                 63<210>42<211>51<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>42atactactgt cagcaaagta atgaggatcc tccgaggttc ggcggaggga c           51<210>43<211>53<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>43cttggtccct ccgccgaacc tcggaggatc ctcattactt tgctgacagt agt         53<210>44<211>55<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>44gggcagcctc ctaagttgct catttacgct gcatccaatc tagaatctgg ggtac       55<210>45<211>51<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>45cccagattct agattggatg cagcgtaaat gagcaactta ggaggctgcc c           51<210>46<211>83<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>46aattcgagga cgccagcaac atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct  60ggatctctgg tgcctacggg cag                                          83<210>47<211>84<212>DNA<213>智人(Homo sapien)<400>47gtaacctgcc cgtaggcacc agaga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        20                  25                  30tct ctg ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag gcc tcc caa agt gtt  144Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
    35                  40                  45gat tat gat ggt gat agt tat atg aac tgg tat cag cag aaa ccc ggg  192Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50                  55                  60cag cct cct aag ttg ctc att tac gct gca tcc aat cta gaa tct ggg  240Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65                  70                  75                  80gta cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc  288Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
            85                  90                  95acc atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gta tac tac tgt cag  336Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
        100                 105                 110caa agt aat gag gat cct ccg acg ttc ggc gga ggg acc aaa gtg gag  384Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
    115                 120                 125atc aaa cgt                                                      393Ile Lys Arg
130<210>58<211>131<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>58Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala ThrAla Thr Gly1               5                  10                 15Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val
        20                  25                  30Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys LysAla Ser Gln Ser Val
    35                  40                 45Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50                  55                  60Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65                  70                  75                  80Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
            85                  90                  95Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
        100                 105                 110Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
    115                 120                 125Ile Lys Arg
13012

Claims (8)

1.一种具有与人白细胞介素-4(IL4)结合特异性的融合蛋白质，其包含特征为与人IL4的解离常数等于或小于2×1010M的源自非人类中和单克隆抗体的互补决定区(CDRs)，和第一融合配体，
其中所说的非人类中和单克隆抗体选自3B9和6A1。
2.一种含有重链和轻链的人源化抗体，所说抗体特征为与人IL4的解离常数等于或小于约2×1010M，其中所说重链和轻链的构架区源自至少一个所选择的人抗体，每一所说链的互补决定区的氨基酸序列是特异于人IL4，特征为与人IL4的解离常数等于或小于约2×1010M的源自非人类中和单克隆抗体。
3.根据权利要求2的抗体，其中所说的抗体可选择地与一个效应子连接，效应子选自非蛋白载体分子，聚苯乙烯和塑料珠构成的组。
4.一种含有一重链和一轻链的嵌合抗体，所说抗体特征在于与人IL4的解离常数等于或小于约2×1010M，其中所说重链和所说轻链的互补决定区氨基酸序列源自特异于人IL4的非人类中和单克隆抗体，其特征为与人IL4的解离常数等于或小于2×1010M。
5.一种治疗人体变应性和其它相关于过量IgE产生的疾病的方法，包含步骤在需要时给药于所说病人有效量的权利要求1的融合蛋白。
6.一种诊断人体变应性或其它相关于过量免疫球蛋白产生的其它疾病的方法，包括用人IL4的高滴度单克隆抗体接触一生物液体样品，分析所说单克隆抗体和人白细胞介素4间结合的产生。
7.一种筛选对人白细胞介素4具有高滴度的单克隆抗体的方法，包括：
a)制备特征为分泌人白细胞介素4的单克隆抗体的杂交瘤细胞系；和
b)用醛偶联的人白细胞介素4或生物素化的人白细胞介素4筛选所说的杂交瘤细胞系。
8.一种对人白细胞介素4具有高滴度的中和抗体，其Fab片断或F(ab′)片断，通过用醛偶联的人白细胞介素-4或生物素化的人白细胞介素-4筛选杂交瘤产品库而生产。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102294024A (zh) * 2011-01-17 2011-12-28 广东现代农业集团研究院有限公司 一种多肽疫苗及其制备方法

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US6768004B2 (en) * 2001-01-11 2004-07-27 Mueller Sybille Nucleotide sequences encoding variable regions of heavy and light chains of monoclonal antibody 1F7, an anti-idiotypic antibody reactive with anti-HIV antibodies
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
PE20050627A1 (es) 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
EP2168986A3 (en) 2004-02-19 2010-07-28 Genentech, Inc. CDR-repaired antibodies
PE20060560A1 (es) * 2004-08-03 2006-06-27 Novartis Ag Anticuerpos de interleucina-4 humana
JP2008523815A (ja) 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのヒト化アミロイドβ抗体
WO2007107349A1 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Apogenix Gmbh Antibody specific for human il-4 for the treament of cancer
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
DK2041576T3 (da) 2006-06-21 2011-12-05 Apogenix Gmbh Differentiel cytokinekspression i humane cancere
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
JP4971872B2 (ja) 2007-05-23 2012-07-11 株式会社トプコン 眼底観察装置及びそれを制御するプログラム
DK2182983T3 (da) 2007-07-27 2014-07-14 Janssen Alzheimer Immunotherap Behandling af amyloidogene sygdomme med humaniserede anti-abeta antistoffer
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
JP5324839B2 (ja) 2008-06-19 2013-10-23 株式会社トプコン 光画像計測装置
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
CN107614762B (zh) * 2015-02-24 2022-08-05 台湾地区“中央研究院” 一种由噬菌体表达的单链变异片段抗体库
CN113156134B (zh) * 2020-11-26 2024-01-23 江苏荃信生物医药股份有限公司 用于检测人白介素23的elisa试剂盒及检测方法
CN112646040B (zh) * 2020-12-31 2022-03-25 中元汇吉生物技术股份有限公司 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5041381A (en) * 1986-07-03 1991-08-20 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
JP2646007B2 (ja) * 1988-01-30 1997-08-25 財団法人 化学及血清療法研究所 抗ｈｉｖ抗体可変領域をコードする遺伝子断片およびこれらを用いて発現された抗ｈｉｖキメラ抗体ならびにその製法
EP0365209A3 (en) * 1988-10-17 1990-07-25 Becton, Dickinson and Company Anti-leu 3a amino acid sequence
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
JPH07119238B2 (ja) * 1989-12-18 1995-12-20 小野薬品工業株式会社 ヒトインターロイキン―４に対するモノクローナル抗体および該抗体の利用方法
IL96714A0 (en) * 1989-12-20 1991-09-16 Schering Corp Antibody antagonists of human interleukin-4
JPH04141095A (ja) * 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
EP0627002B1 (en) * 1992-02-19 1998-09-23 Schering Corporation Cloning and expression of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
JPH06269663A (ja) * 1993-03-17 1994-09-27 Toyobo Co Ltd Ｃｄ４陽性細胞捕集材
ES2254207T3 (es) * 1999-07-30 2006-06-16 Battelle Memorial Institute Material de union vitroceramico y procedimiento de union.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102294024A (zh) * 2011-01-17 2011-12-28 广东现代农业集团研究院有限公司 一种多肽疫苗及其制备方法

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