CN102294024A - 一种多肽疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽疫苗，其活性成分是偶联多肽，所述偶联多肽是由免疫活性多肽偶联到非蛋白载体上而成。本发明的多肽疫苗不但具有显著的免疫活性、稳定性，还避免了传统多肽-载体蛋白疫苗所引起的的炎症或过敏反应等毒副作用，大大提高了多肽疫苗的安全性和特异性。本发明还提供了所述多肽疫苗的制备方法，该方法简单易行、生产成本低、质量有保证，易于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽疫苗及其制备方法。
背景技术
多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。多肽抗原作为完整病毒的一部分，不具备传染疾病的危险性，并可以大量合成生产，已成为疫苗发展的重要途径之一。
但是，由于抗原多肽的分子量太小，不易产生免疫响应，往往需要接到载体蛋白上，以增强免疫效果。主要是应用戊二醛等连接分子法将有效的抗原肽接到载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素(TT)上。但此类抗原肽-载体蛋白复合疫苗仍存在许多的技术问题，例如，抗原肽-载体蛋白复合疫苗中存在载体蛋白，载体蛋白通常为异体蛋白，这样在接种时易引起炎症或过敏反应，还会影响抗原肽的特异性。由于有这些副作用，导致抗原肽-载体蛋白复合疫苗未能在市场上广泛推广应用。
由此可见，解决上述技术问题，提供一种无载体蛋白、无过敏反应的多肽疫苗对于人类和动物健康具有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无需载体蛋白、无过敏反应的多肽疫苗及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种多肽疫苗，其活性成分是偶联多肽，所述偶联多肽由免疫活性多肽偶联到非蛋白载体上而成。
优选的，所述非蛋白载体为具有可偶联基团的非蛋白多聚体，可偶联基团为氨基（-NH2），羧基 (-COOH)，巯基（-SH）中的至少一种。
优选的，所述非蛋白载体为多糖、脂质体中的至少一种。
优选的，所述多肽疫苗还含有医学上可接受的佐剂。
上述多肽疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1) 将免疫活性多肽溶解，得到多肽溶液，备用；
2) 将非蛋白载体溶解，得到非蛋白载体溶液，备用；
3) 在多肽溶液或非蛋白载体溶液中加入偶联剂，混合均匀；
4) 将非蛋白载体溶液与多肽溶液混合均匀，搅拌反应，使多肽偶联到非蛋白载体上；
5) 反应完全后，去除未参与反应的偶联剂，纯化得到偶联多肽；
6) 在偶联多肽中加入医学上可接受的佐剂，得到多肽疫苗。
优选的，多肽与非蛋白载体的质量混合比为1～100 : 1。
优选的，非蛋白载体与偶联剂的质量混合比为1：1～100。
优选的，所述偶联剂为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐（EDC）、N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚基胺盐酸盐（EEDQ）、戊二醛中的至少一种。
本发明主要是通过偶联剂将免疫活性多肽偶联到具有可偶联基团的非蛋白载体上，从而得到一种多肽疫苗活性成分。本发明还可通过进一步的技术操作，如非蛋白载体的选择，对多肽、非蛋白载体、偶联剂的反应顺序的控制，将多肽对免疫不重要的一端定向偶联到非蛋白载体上，进一步提高多肽疫苗的免疫活性。因此，本领域技术人员可选用的非蛋白载体是多种多样的，既可以来自天然，也可以是人工合成的非蛋白多聚体。此外，非蛋白载体既可以只具有一种可偶联基团，亦可同时具有多种可偶联基团，均可达到本发明的效果。同样的，可选用的偶联剂也是多种多样的，所用的偶联剂能够活化多肽或非蛋白载体上的偶联基团，并将多肽偶联到非蛋白载体上，且不影响其免疫活性。同样地，本领域技术人员可以根据实际情况及需要（如多肽、非蛋白载体、偶联剂的性质）来决定多肽、非蛋白载体、偶联剂的反应量及三种物质的反应顺序。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明的多肽疫苗的活性成分是由免疫活性多肽偶联到非蛋白载体上而成，其不但具有显著的免疫活性、稳定性，还避免了传统多肽-载体蛋白疫苗所引起的的炎症或过敏反应等毒副作用，大大提高了多肽疫苗的安全性和特异性；
（2）本发明还可通过进一步的技术操作，如非蛋白载体的选择，对多肽、非蛋白载体、偶联剂的反应顺序的控制，将多肽对免疫不重要的一端定向偶联到非蛋白载体上，进一步提高多肽疫苗的免疫活性；
（3）本发明的多肽疫苗制备方法，制备工艺简单、生产成本低、质量有保证，易于规模化生产。
附图说明
图1是小鼠免疫PRRS病毒多肽疫苗抗体滴度检测图；
图2是多肽疫苗刺激T细胞增殖的效果图。
具体实施方式
一种多肽疫苗，其活性成分是偶联多肽，所述偶联多肽由免疫活性多肽偶联到非蛋白载体上而成。
优选的，所述非蛋白载体为具有可偶联基团的非蛋白多聚体，可偶联基团为氨基（-NH2），羧基 (-COOH)，巯基（-SH）中的至少一种。
优选的，所述非蛋白载体为多糖、脂质体中的至少一种。
优选的，所述多肽疫苗还含有医学上可接受的佐剂。
上述多肽疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1) 将免疫活性多肽溶解，得到多肽溶液，备用；
2) 将非蛋白载体溶解，得到非蛋白载体溶液，备用；
3) 在多肽溶液或非蛋白载体溶液中加入偶联剂，混合均匀；
4) 将非蛋白载体溶液与多肽溶液混合均匀，搅拌反应，使多肽偶联到非蛋白载体上；
5) 反应完全后，去除未参与反应的偶联剂，纯化得到偶联多肽；
6) 在偶联多肽中加入医学上可接受的佐剂，得到多肽疫苗。
优选的，多肽与非蛋白载体的质量混合比为1～100 : 1。
优选的，非蛋白载体与偶联剂的质量混合比为1：1～100。
优选的，所述偶联剂为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐（EDC）、N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚基胺盐酸盐（EEDQ）、戊二醛中的至少一种。
下面，以抗猪蓝耳病的多肽疫苗为实施例对本发明作进一步的说明。当然，根据本领域技术人员的理解范围，本发明的方法同样可以用于制备其他动物体以及人体传染性疾病的多肽疫苗，因此，本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
猪蓝耳病的多肽疫苗及其制备方法
1、多肽的筛选及合成
1）多肽的筛选
通过计算机分析软件对猪蓝耳病毒 (PRRSV)结构糖蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇（epitopes），初选多肽序列。
使用酶连法 (ELISA) 检测不同多肽与猪蓝耳病毒抗血清的反应，最后选出具有良好的反应原性和免疫原性的 B 细胞抗原决定簇多肽P1~P4，其序列如下所示：
P1： SHIQLIYNLNC （SEQ ID NO：1）
P2： SHIQLIYNLTLCEPL（SEQ ID NO：2）
P3：VEKGFKVVFGNVSGIVA（SEQ ID NO：3）
P4：RKVYVDIKHQFICADH （SEQ ID NO：4）
使用多肽刺激猪T细胞 (IFNγ/ELISPOT) 法, 检测不同多肽激活猪T细胞的反应，最后选出具有良好的反应原性和免疫原性的T细胞抗原决定簇多肽P5~P7，其序列如下所示：
P5：VLAALICFVIRL （SEQ ID NO：5）
P6：YRWRSSVIVEK （SEQ ID NO：6）
P7：RLYRWRSSVIK（SEQ ID NO：7）
2）根据Fmoc化学合成方法分别合成序列P1~P7，经过HPLC纯化的多肽。
2、偶联多肽的制备
偶联多肽P1
1） 称取 10mg 的多肽P1，加50μl DMSO溶解多肽，然后加入10ml双蒸水，得到多肽溶液；
2） 称取 1mg 的载体葡糖胺，加1ml PBS(pH 7.2)溶解，在载体溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀 ；
3） 然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3 小时；
4） 使用透析袋 （孔径MWCO 10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化，冻干，得到偶联多肽P1。
偶联多肽P2
1） 称取 10mg 的多肽P2，加50μl DMSO溶解多肽，然后加入10ml双蒸水，得到多肽溶液；
2） 称取 1mg 的载体半乳糖胺，加1ml PBS(pH 7.2)溶解，在载体溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀；
3） 然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3 小时；
4） 使用透析袋 （孔径MWCO 10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化，冻干，得到偶联多肽P2。
偶联多肽P3
1） 称取 10mg 的多肽P3，加50μl DMSO溶解多肽，然后加入10ml双蒸水，得到多肽溶液；
2） 称取 1mg 的载体半乳糖胺，加1ml PBS(pH 7.2)溶解，在载体溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀；
3） 然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3小时；
4） 使用透析袋 （孔径MWCO 10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化，冻干，得到偶联多肽P3。
偶联多肽P4
1） 称取 10mg 的多肽P4，加50μl DMSO溶解多肽，然后加入10ml 双蒸水，得到多肽溶液；
2） 称取 1mg 的载体半乳糖胺，加1ml PBS(pH 7.2)溶解，在载体溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀；
3） 然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3小时；
4） 使用透析袋 （孔径MWCO 10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化，冻干，得到偶联多肽P4。
偶联多肽P5
1） 称取 10mg 的多肽P5，加50μl DMSO溶解多肽，然后加入10ml双蒸水，得到多肽溶液；
2） 称取 1mg 的载体半乳糖胺，加1ml PBS(pH 7.2)溶解，在载体溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀；
3） 然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3 小时；
4） 使用透析袋 （孔径MWCO 10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化，冻干，得到偶联多肽P5。
偶联多肽P6
1） 称取 10mg 的多肽P6，加50μl DMSO溶解多肽，然后加入10ml双蒸水，得到多肽溶液；
2） 称取 1mg 的载体半乳糖胺，加1ml PBS(pH 7.2)溶解，在载体溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀；
3） 然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3 小时；
4） 使用透析袋 （孔径MWCO 10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化，冻干，得到偶联多肽P6。
偶联多肽P7
1） 称取 10mg 的多肽P7，加50μl DMSO溶解多肽，然后加入10ml双蒸水，得到多肽溶液；
2） 称取 1mg 的载体半乳糖胺，加1ml PBS(pH 7.2)溶解，在载体溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀；
3） 然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3 小时；
4） 使用透析袋 （孔径MWCO 10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化，冻干，得到偶联多肽P7。
当然，根据本领域技术人员的理解范围，上述偶联多肽的制备中，除了可以单独添加每条多肽外，还可将多条多肽组合起来，一起偶联到载体上；载体除了可以用葡糖胺和半乳糖胺外，还可以选用其他具有可偶联基团的非蛋白多聚体，如脂质体、人工合成多糖等。偶联剂EDC可活化非蛋白载体上或多肽上的-COOH，将非蛋白载体的-COOH/-NH2和多肽的-NH2/-COOH连起来，从而形成偶联多肽。当然，本领域技术人员还可以选用其他可将多肽与非蛋白载体偶联在一起的偶联剂，如N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚基胺盐酸盐（EEDQ）、戊二醛等。同样地，本领域技术人员还可以根据实际情况及需要（如多肽、非蛋白载体、偶联剂的性质）来决定多肽、载体、偶联剂的反应量及三种物质的反应顺序。
多肽疫苗反应原性的检定
1、小鼠的免疫：
1) 分别取等量的P1-P7偶联多肽混合均匀，得到混合偶联多肽，取1mg混合偶联多肽溶于1ml无菌PBS中，用1ml的完全弗氏佐剂进行乳化；
2) 每只小鼠腹腔注射0.4 ml，共注射5只；
3) 两周后按同样的方法和浓度与不完全弗氏佐剂进行乳化后加强免疫，两周后采血测抗体。
2、多肽疫苗抗体B 细胞抗原活性的ELISA测定
包被液：5.3 g Na2CO3 和4.2 g NaHCO3 加1 L 双蒸水，pH 9.6；稀释液：PBS/0.1% BSA；洗涤液：PBS/0.05% Tween-20 （PBST)；
1) 将含有偶联多肽P1、P4 (5μg/ml) 的包被液分别加入抗原包被板中 (100 μl/孔)，37℃作用2小时，PBST洗涤5次；
2) 采集免疫小鼠的血清用PBS/0.1% BSA倍比稀释后，加入每孔中，37℃作用30 分钟， PBST洗涤5次，山羊抗小鼠的碱性磷酸酶标二抗用PBS进行1:2000稀释，加入每孔中，37℃作用30分钟， PBST洗涤5次，加入PNPP底物， 37℃作用10分钟，然后在分光光度仪上读405nm值。
其结果如图1所示：血清稀释度从左到右依次为1：102、1：103、1：104、1：105。从图1中可知，本发明多肽疫苗诱导产生的血清抗体，滴度高，可很好地与抗原反应。
3．多肽疫苗T 细胞抗原活性的测定
1) 无菌取免疫小鼠的脾脏，使用RPMI 培养基清洗2 次，然后置于培养皿内的RPMI培养基中，将脾脏碾碎，然后转入离心管内，冰上静置10分钟， 取上清液，离心300×g (4℃)，使用Ficoll-Isopaque 方法分离单核淋巴细胞、将单核淋巴细胞 ( 3×104/孔) 和T细胞抗原决定簇多肽(游离多肽P5、 P6、 P7 的混合物, 浓度：1.25、2.5、5、10μg/孔) 或CD3单抗（0.5μg/孔， 阳性对照) 加在96孔细胞培养板上，培养3天；
2) 细胞培养48 小时后，将BrdU 标记物（10μM) 加入每孔中，72 小时后，收集细胞；
3) 使用酒精溶液固定细胞 30分钟，离心300×g 10分钟， 细胞在1% BSA/TBS (pH 7.4) 中室温孵育30分钟， 将过氧化氢酶标记的兔抗BrdU用PBS进行1:2000稀释，加入每孔中；
4) 室温孵育 1小时，清洗细胞，加 100 μl TMB 溶液，然后在分光光度仪上读450nm值。
其结果如图2所示。 由图2可知，本发明的多肽疫苗可显著地刺激T细胞的增殖。
4、小鼠抗PRRSV血清病毒中和试验
采集免疫小鼠的抗血清按2倍比稀释，使其稀释度为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16… …1:4096；将毒价为107.0TCID50/mL的病毒（VR2332）稀释为200TCID50/mL；将不同稀释度的稀释血清与毒价为200TCID50/mL稀释液等体积混合，37℃温箱1小时，得到血清-病毒中和液；病毒回归样同样置37℃温箱作用1小时；将血清-病毒中和液与病毒回归样分别加入不同的细胞板孔中，细胞板孔中的细胞为MARC-145，每个稀释度重复4次，5%CO2 37℃温箱培养，逐日观察记录；使用Reed和Muench两氏法计算结果，其结果如下表所示。
可见，由本发明的多肽疫苗诱导的血清抗体可以很好的中和PRRS病毒。
<110> 广东现代农业集团研究院有限公司
<120> 一种多肽疫苗及其制备方法
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 猪蓝耳病病毒（PRRSV）
<400> 1
Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Asn Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 猪蓝耳病病毒（PRRSV）
<400> 2
Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Pro Leu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 猪蓝耳病病毒（PRRSV）
<400> 3
Val Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val
1 5 10 15
Ala
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 猪蓝耳病病毒（PRRSV）
<400> 4
Arg Lys Val Tyr Val Asp Ile Lys His Gln Phe Ile Cys Ala Asp His
1 5 10 15
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<211> 12
<212> PRT
<213> 猪蓝耳病病毒（PRRSV）
<400> 5
Val Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 猪蓝耳病病毒（PRRSV）
<400> 6
Tyr Arg Trp Arg Ser Ser Val Ile Val Glu Lys
1 5 10
<210> 7
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<212> PRT
<213> 猪蓝耳病病毒（PRRSV）
<400> 7
Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Ser Val Ile Lys
1 5 10
Claims (8)
1.一种多肽疫苗，其活性成分是偶联多肽，所述偶联多肽由免疫活性多肽偶联到非蛋白载体上而成。
2.根据权利要求1所述的一种多肽疫苗，其特征在于：所述非蛋白载体为具有可偶联基团的非蛋白多聚体，可偶联基团为氨基（-NH2），羧基 (-COOH)，巯基（-SH）中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种多肽疫苗，其特征在于：所述非蛋白载体为多糖、脂质体中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种多肽疫苗，其特征在于：所述多肽疫苗还含有医学上可接受的佐剂。
5.权利要求1所述多肽疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1）将免疫活性多肽溶解，得到多肽溶液，备用；
2）将非蛋白载体溶解，得到非蛋白载体溶液，备用；
3）在多肽溶液或非蛋白载体溶液中加入偶联剂，混合均匀；
4）将非蛋白载体溶液与多肽溶液混合均匀，搅拌反应，使多肽偶联到非蛋白载体上；
5）反应完全后，去除未参与反应的偶联剂，纯化得到偶联多肽；
6）在偶联多肽中加入医学上可接受的佐剂，得到多肽疫苗。
6.根据权利要求5所述多肽疫苗的制备方法，其特征在于：多肽与非蛋白载体的质量混合比为1～100 : 1。
7.根据权利要求5所述多肽疫苗的制备方法，其特征在于：非蛋白载体与偶联剂的质量混合比为1：1～100。
8.根据权利要求5所述多肽疫苗的制备方法，其特征在于：所述偶联剂为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐（EDC）、N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚基胺盐酸盐（EEDQ）、戊二醛中的至少一种。
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