NO177858B - Peptid - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører peptider som har en aminosyresekvens tilsvarende en del av svinesomatotropin (pST) valgt fra følgende sekvenser: (a) pST 110-118, (b) pST 155-163.

Disse kan anvendes til å danne anti-pST-antistoffer. Når disse antistoffer administreres sammen med pST, forbedres veksten av dyr ut over det som oppnås med administrering av pST alene.

Veksthormonet pST er naturlig forekommende hos svin og sørger for modning av dyret, innbefattet økning av vekst-hastigheten og forholdet mellom mager og fet. Endogene mengder av pST er små; derfor har anstrengelser blitt fokusert på frem-stilling av eksogene pST til anvendelse i jordbruk i stor skala.

Ett aspekt av disse anstrengelser har vært bestemmelsen av den komplette aminosyresekvens for pST. Det er blitt funnet at pST er et enkeltkj ede-polypeptid med 191 aminosyrer med to cystinbroer som binder sammen rester henholdsvis 53-164 og 181-189 (Abdel-Meguid, S.S., et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. 84. 6434-6437 (1987)).

Det er også gjort forsøk på å identifisere peptider som

består av små deler av aminosyresekvensen til somatotropin fra forskjellige arter med henblikk på å forsterke aktiviteten til disse veksthormoner. Publisert europeisk patentsøknad 137.234 beskriver spaltingen av et 7 kd-fragment fra den C-terminale

ende av humant veksthormon (hGH) . Mus ble injesert med fragmentet; musene dannet så antistoffer mot fragmentet. Disse antistoffer ble administrert til mus i kombinasjon med hGH. Det ble funnet at mus som mottok hGH pluss antistoffer mot hGH-fragmentet, viste større vekst enn de som mottok hGH alene.

Publisert europeisk patentsøknad 284.406 beskriver fremstillingen av et fragment som tilsvarer aminosyrerester 35-53 i pST. pST-fragmentet ble administrert til griser og anti-pST-antistoffer ble dannet. Et lignende forsøk ble utført med et fragment av okse-somatotropin (bST). I det sistnevnte tilfelle ble de således dannede anti-bST-antistoffer så administrert sammen med intakt bST og ble funnet å forsterke aktiviteten av bST.

Selv om andre arbeider beskrevet ovenfor har forbedret informasjonen om visse områder av somatotropin fra forskjellige arter, inkludert svin, som forsterker den vekstfremmende aktivitet av slike hormoner, har forskere i disse arbeider ikke gitt data om andre mulige fragmenter av hormonene som kan inneholde epitopiske seter, og heller ikke har det vært presentert sammenlignende data som sammenligner den vekstforsterkende aktivitet av antistoffer mot slike fragmenter.

Følgelig er det et mål for denne oppfinnelse å identifisere til leggs fragmenter av psT, som når de administreres til varmblodige dyr, danner antistoffer mot pST. Slike pST-fragmenter inkluderer peptider som har aminosyresekvenser som er homologe med følgende deler av pST: 110-118 og 155-163.

Det er en videre hensikt med denne oppfinnelse å kunne forbedre vekst ved å behandle varmblodige dyr med antistoffer dannet ved slike pST-fragmenter i kombinasjon med pST. Slike antistoffer kan være polyklonale eller monoklonale.

Det er enda en hensikt med denne oppfinnelse å kunne administrere antistoffer dannet av slike pST-fragmenter mot varmblodige dyr og å måle vekst når disse dyr deretter blir behandlet med pST. Slik pST kan enten ha en naturlig eller modifisert aminosyresekvens, så lenge som dens vekstforsterkende funksjon er tilstede.

Det er videre ønskelig å kunne sammenligne forsterkningen av vekst av dyr som er et resultat av administreringen av pST sammen med antistoffer fra forskjellige pST-fragmenter.

Disse hensikter oppnåes med oppfinnelsen som blir beskrevet nedenfor.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser aminosyresekvensen til pST og syv peptidfragmenter av pST, inkludert peptider betegnet 8, 9 og 11 som

er mål for denne oppfinnelse.

Fig. 2 viser renheten av peptid #8 som vist ved analytisk høytrykksvæskekromatografering. Fig. 3 viser renheten av immunoglobulinfraksjonen fra serum ved fraksjonering av serum på en protein A-affinitets-kolonne. Fig. 3A viser renheten av immunoglobulinfraksjonen som vist ved natriumdodekylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese

(SDS-PAGE).

Fig. 4 viser virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter behandlet med pST alene eller pST i kombinasjon med svineantistoffer mot pST-peptider. Normalt svineserum (NPS), som inneholder små mengder av endogen pST, anvendes som negativ kontroll. Fig. 5 viser virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter behandlet med pST i kombinasjon med svineantistof fer mot pST-peptider i et forsøk separat fra det vist i Fig. 4. Den samme negative kontroll er anvendt som i Fig. 4. Fig. 6A viser doseresponsen ved administrering av svineantistoffet mot pST-peptid #8 (aminosyrer 98-110) pluss pST på veksten av hypofysektomiserte rotter. Fig. 6B viser doseresponsen ved administrering av svineantistof f et mot pST-peptid #9 (aminosyrer 110-118) pluss pST på veksten av hypofysektomiserte rotter. Fig. 6C viser doseresponsen ved administrering av svineantistoffet mot pST-peptid #11 (aminosyrer 155-163) pluss pST på veksten av hypofysektomiserte rotter. Fig. 7A viser et tidsforløpsstudium som sammenligner virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter ved behandling med pST alene, pST i kombinasjon med svineantistoffet mot pST-peptid #8 (aminosyrer 98-110) eller ingen behandling. Fig. 7B viser et tidsforløpsstudium som sammenligner virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter ved behandling med pST alene, pST i kombinasjon med svineantistof f et mot pST-peptid #9 (aminosyrer 110-118) eller ingen behandling. Fig. 7C viser et tidsforløpsstudium som sammenligner virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter ved behandling med pST alene, pST i kombinasjon med svineantistof f er mot pST-peptid #11 (aminosyrer 155-163) eller ingen behandling. Fig. 8 viser virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter behandlet med pST alene eller svineantistoffer mot pST-peptider alene (ikke kombinert med pST). Fig. 9 viser virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter behandlet med pST alene eller pST i kombinasjon med kaninantistoffer mot pST-peptider. Fig. 10 viser virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter behandlet med pST alene eller pST i kombinasjon med kaninantistoffer mot pST-peptider i et forsøk separat fra det vist i Fig. 9. Normal kaninserum (NRS), som inneholder små mengder av endogen kaninsomatotropin, anvendes som negativ kontroll. Fig. 11 viser virkningen på veksten av hypofysektomiserte rotter behandlet med pST alene eller kaninantistoffer mot pST-peptider alene (ikke kombinert med pST).

Denne oppfinnelse innebærer identifisering av antigene epitoper av pST i form av peptidfragmenter som er i stand til å indusere immunloge responser i varmblodige dyr gjennom dannelse av epitop-spesifikke anti-pST-antistoffer. Slike antistoffer blir så administrert sammen med pST til dyr for å forbedre deres vekstytelse. Alternativt blir disse antistoffer administrert til dyr som deretter blir behandlet med pST.

De to pST-peptider i henhold til denne oppfinnelse er betegnet ved tall og deres aminosyresekvenser (aa) er som følger: #9 (aa 110-118): Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu #11 (aa 155-163): Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser.

Disse to peptider har aminosyresekvenser som er homologe med de tilsvarende deler av pST.

For sammenlignende formål er det konstruert fire andre pST-peptider med aminosyresekvenser basert på de beskrevet i

europeisk patentsøknad 284.406:

#2 (aa 35-52): Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe

#3 (aa 36-44): Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser #4 (aa 46-53): Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys #6 (aa 35-43): Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr

Disse syv peptider kan konstrueres ved teknikker kjent på fagområdet som inkluderer, men ikke er begrenset til kjemisk syntese, anvendelse av en fastfasepeptidsynthesizer og ekspresjon ved en DNA-nukleotidsekvens i en passende vert. Peptidene blir så renset på passende måter slik som gel-filtreringskromatografering og preparativ reversfase-høytrykksvæskekromatografering (HPLC). Renheten av peptidene blir vist ved aminosyresammensetningsanalyse.

For å forsterke dannelsen av antistoffer in vivo, blir et peptid i henhold til denne oppfinnelse fortrinnsvis bundet til et makromolekyl som virker som en bærer for peptidet. F.eks kan peptidet konjugere til et protein slik som Fissuridellidae haemocyanin (KLH). Andre bærere innen rekkevidden av denne oppinnelse inkluderer de som er kjent på fagområdet slik som humane og okseserumalbuminer, myoglobiner, j8-galaktosidase, penicillianase og bakterietoksoider. Bærerne kan også være syntetiske molekyler slik som multi-poly-DL-alanyl-poly-L-lysin og poly-L-lysin.

I én utførelsesform blir polyklonale antistoffer mot disse peptider dannet og renset fra immuniserte varmblodige dyr, slik som svin og kaniner. I en annen utførelsesform kan monoklonale antistoffer mot disse peptider fremstilles ved å anvende konvensjonelle teknikker.

Polyklonale antistoffer dannes ved å immunisere dyr med peptidene i henhold til denne oppfinnelse, enten alene eller i konjugert form. Peptidene kan administreres ved konvensjonelle veier, slik som subkutan injekson, intramuskulær injeksjon og intravenøs strøm, så vel som transdermal og oral administrering. Det er foretrukket å administrere peptidene (eller deres konjugater) i forbindelse med en bærer som inneholder en adjuvans, slik som Freund's komplette adjuvans. Det er spesielt foretrukket å anvende et doseringsskjema hvor en initiell administrering av peptidene er fulgt av én eller flere booster-administreringer av de samme peptider i jevne tidsintervaller.

Polyklonale antistoffer utvinnes ved først å oppnå en blodprøve fra et immunisert dyr etter en tilstrekkelig tid fra administrering av peptidet til at antistoffer blir dannet. Serum (som inneholder antistoffene) isoleres på konvensjonelle måter slik som ved sentrifugering. Serum separeres i frak-sjoner som inneholder immunoglobulin (lg) og som mangler immunoglobulin (ikke-Ig) ved hjelp av slik som hurtig protein-væskekromatografering (FPLC). Bare Ig-fraksjonen inneholder antistoffer mot peptidene. Antistoffene blir så isolert fra Ig-fraksjonen ved SDS-PAGE. Renheten av antistoffene isolert på denne måte, er større enn 98% som bestemt ved SDS-PAGE. Antistofftiternivået måles ved å anvende enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) i henhold til konvensjonelle fremgangs-måter .

Monoklonale antistoffer fremstilles ved å immunisere mus med ett av de tre nye pST-peptider, fjerne miltene fra musen, fremstille suspensjoner av lymfocytter, sammenføye disse lymfocytter med musemyelomceller, dyrke cellene og oppsamle supernatanter av overlevende hybridomer for antistoffkartlegging ved fastfase ELISA. De hybridomer som produserer ønskede antistoffer, blir videre subklonet og injesert i mus. Bukvæske blir så oppsamlet fra musene, og lg blir renset ved ammoniumsulfatpresipitering eller en protein A-affinitets-kolonne på FPLC. Prøver av lg renset på denne måte måles mot antigener ved å anvende ELISA til å identifisere de dannede antistoffer.

Disse antistoffer (polyklonale og monoklonale) kan anvendes på to måter for å forsterke og forøke den vekstfremmende aktivitet av pST. Først blir et antistoff administrert til et varmblodig dyr sammen med pST. Alternativt blir dyret behandlet med én eller flere doser av et anti-pST-antistoff og blir videre behandlet med pST. I hver fremgangsmåte kan mer enn ett antistoff anvendes. Således beskriver oppfinnelsen også administrering av kombinasjoner av anti-pST-antistoffer #8, 9 og 11 eller deres antigene ekvi-valenter.

Den biologiske aktivitet av disse antistoffer blir testet i hypofysektomiserte (hypoks) rotter. Hypoks-rotter har mangelfull vekst som et resultat av kirurgisk fjerning av hympofysene. Hypoks-rotter tjener som en anvendbar modell for å studere virkningen av somatotropin på vekst (Groesbeck, M.D. og Parlow, A.F., Endocrinology. 120. 2582-2590 (1987).

Behandling av disse hypoks-rotter med en kombinasjon av pST og antistoffer mot peptidene i henhold til den fore-liggende oppfinnelse, forsterker den vekstfremmende virkning av pST. pST som blir anvendt, kan isoleres fra naturlige kilder eller kan fremstilles ved å anvende rekombinante teknikker slik som de som er beskrevet i publiserte europeiske patentsøknader 104.920 eller 111.389. Kildene for og fremgangsmåten for isolering/fremstilling av pST i seg selv utgjør ingen del av denne oppfinnelse. Antistoffene kan også anvendes sammen med rekombinant pST, hvori aminosyresekvensen for naturlig pST er blitt modifisert ved å anvende en teknikk slik som setedirigert mutagenese, så lenge som den vekstforsterkende funksjon av pST er tilstede. Se f.eks. publisert europeisk patentsøknad 303.972.

Immunoreaktiviteten for antistoffer mot pST-peptider undersøkes i svin og kaniner. Som vist i Tabellene 2 og 3 nedenfor, er de fleste antistoffer dannet av disse peptider, funnet å være nokså spesifikke mot deres henholdsvise antigener. Imidlertid viser antistoff mot peptid #2 (aa = 35-52) og #8 (aa = 98-110) i svin og peptid #3 (aa = 36-44) i kaniner seg å ha et bredt spektrum av immunoreaktivitet. Denne virkning når det gjelder peptider #2 og #3 kan forklares ved overlappingene av aminosyresekvensene i peptid #2 (aa = 35-52) og #3 (aa = 36-44). Kryssreaktivitet mellom anti-peptid #6 (aa = 35-4 3)-antistoff og peptid #2 (aa = 35-52) i begge arter kan være forårsaket av den samme mulighet. Det er ikke klart hvorfor peptid #8 (aa = 98-110) induserer antistoff med multiple spesifisiteter i svin, mens det utelater å danne antistoff som gjenkjenner alle peptider som testes i kaniner. Det er verdt å legge merke til at alle antistoffer indusert av peptider, gjenkjenner pST, mens anti-pST-antistoff ikke er reaktiv med peptider, med unntak av peptid #2 i kaniner. Som forventet produserer normale dyr ikke noe antistoff mot pST og dets f ragmenter.

Daglig behandling av hypoks-rotter med pST gjenoppretter på en merkbar måte deres evne til å vokse. Den somatogene virkning forsterkes når pST blir administrert sammen med antistoffene mot pST-peptidene beskrevet tidligere (se Fig. 4 og 5). Slike antistoffer har pST-epitop-spesifisitet. Disse antistoffer forhøyer ikke bare virkningen, men akselererer også virkningen av pST (se Fig. 7A, 7B og 7C).

Funn fra en rekke forsøk (vist i Fig. 4 og 5) viser at svineantistoffer mot peptid #2 (aa = 35-52) , #8 (aa = 98-110), #9 (aa = 110-118) og #11 (aa 155-163) forsterker pST-vekst-forsterkningsevne. Imidlertid er disse antistoffer ikke effektive når de administreres i fravær av pST. Videre har normal svine-Ig (NPS), anti-pST-antistoff og antistoffer mot peptider #3 (aa = 36-44), #4 (aa = 46-53) og #6 (a = 35-43) ingen statistisk signifikant virkning. Doseresponsstudiene vist i Fig. 6A, 6B og 6C, angir at virkningen av antistoffer mot peptider #8, 9 og 11 er hurtig og viser en bi-fasisk doseresponskurve.

De vekstfremmende svineantistoffer inkluderer de som responderer på pST-aminosyresekvenser 35-52, 98-110, 110-118 og 155-163. Ingen av disse antistoffer er aktive når de anvendes i fravær av pST; de krever pST for forsterkning av aktivitet. Deres virkning er nokså hurtig og viser også en bi-fasisk doseresponskurve.

Kaninantistoffer testes på lignende måte (Fig. 9 og 10). Bare antistoffet som responderer på pST-aminosyresekvensen 110-118 (peptid #9) forsterker virkningen av pST på signifikant måte. Tatt sammen angir disse funn at antistoffer med visse pST-epitopspesifisiteter er i stand til å forsterke somatogenesen av pST. Imidlertid utelater anti-peptid #2 (aa = 35-52), #8 (aa = 98-110) og #11 (aa = 155-163) antistoffer fra kaniner å fordoble virkningen sett med svineantistoffer.

Selv om virkningsmekanismen for disse antistoffer ikke er klar, foreslår søkerne flere mulige mekanismer. Uten å være bundet av teroi kan mekanismene være som følger: 1) forlengelse av halveringstiden for somatotropin i sirkulasjonen,

2) forbedring av somatotropinavlevering til leverceller,

3) økning av somatotropinopptaks-effektivitet ved polymerisring på målcelleoverflate, 4) forlengelse av somatotropinvekselvirkningen med reseptorer ved forsinkelse av internaliseringsprosess

(endocytose),

5) begrensning av somatotopinvirkninger mot somatogenese, og 6) forandring av somatotropinkonfigurasjon som er bedre egnet til å vekselvirke med vekstrelaterte reseptorer.

Søkernes resultater antyder at det er mindre sannsynlig at muligheter 1-4 er tilfelle, fordi på tross av det faktum at alle testede antistoffer reagerer immunologisk med pST, er det bare noen få som forøker den vekstfremmende virkning av pST. Videre støtte for stadfestelsen i den foregående setning er gitt ved det faktum at antistoff dannet mot det intakte pST-molekyl, er høyt reaktivt med pST, og viser likevel ingen vekstforøkende virkning. På den annen side kan tilhefting av antistoffer til visse områder i pST-molekylet forandre strukturen, og en slik reorientering kan gjøre det bedre presentert for passende reseptorer.

Denne oppfinnelse gir mulighet for å forbedre vekst i dyreproduksjonsindustrien. Aktiv immunisering av bestand med visse pST-peptider som inneholder antigene epitoper slik som aa = 110-118 og aa = 155-163, fører til dannelse av antistoffer i vertsdyr. Disse antistoffer forsterker den somatogene virkning av endogent eller eksogent somatotropin. Alternativt kan disse nye peptider og antistoffer også anvendes til å indusere anti-idiotype antistoffer ved hjelp av konvensjonelle teknikker. Slike anti-idiotype antistoffer kan vise seg anvendbare som potensielle vaksiner.

For bedre forståelse av denne oppfinnelse, er følgende

eksempler gitt.

EKSEMPEL 1

1. Fremstilling av pST- peptider

Peptider syntetiseres manuelt eller ved en Biosearch 9600 (Miligen Biosearch, Burlington, MA) fastfasepeptidsynthesizer. Aminosyrer bindes til en N-t-butyloksykarbonyl- (Boe) beskytt-ende gruppe, nemlig Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-Ser (OBzl), Boc-Thr (OBzl), Boc-Asp (OBzl). Boc-Tyr (2-BrZ), Boc-Arg (Tos), Boc-Lys (2-Clz), Boc-Asn (Xan), Boc-Gln (Xan) og Boc-Cys (4-MeBzl) forhandles fra Advanced Chemtech, Louisville, KY, og anvendes til syntese. En Merrifield-harpiks (1% kryssbundet divinylbenzen-styren, Bachem Bioscience Inc., Philidalphia, PA) anvendes som den faste bærer. Det samlede peptid spaltes fra harpiksen ved å anvende 95% hydrofluorsyre og 5% anisol ved 0°C i en time. Alle peptider renses ved en filtreringskolonne med G-25 gel (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) og preparativ revers-fase HPLC (C18-kolonne, acetonitril/vann som inneholder 0,1% TFA, ved å anvende en gradient av 0% til 90% acetonitril i 45 minutter).

Renheten av disse peptider bestemmes ved analytisk HPLC og en aminosyreanalysator. Et eksempel på HPLC-analysen er vist for peptid #8 (aa = 98-110) i Fig. 2. Hovedtoppen i Fig. 2 antyder klart at renheten av peptid #8 er større enn 95%. Kvaliteten av peptidene i henhold til denne oppfinnelse blir videre støttet ved aminosyresammensetningsanalyse som angitt i Tabell 1:

Peptidene blir så lyofilisert og lagret ved -20°C i et eksikkatorskap inntil de blir anvendt.

2. Konju<g>ering av pST- peptider med Fissuridellidae haemocyanin ( KLH)

Peptider oppløses i fosfatbufret saltvann (PBS) (GIBCO, Grand Island, NY) og blandes med KLH (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i et passende molart forhold på 25 til 1. Glutar-aldehyd (0,5%) tilsettes som bindingsmiddel, og blandingen inkuberes ved romtemperatur i 15 til 60 minutter. NaBH4 blir videre tilsatt, og konjugeringsblandingen dialyseres ekstensivt mot PBS. Aggregatene fjernes ved sentrifugering ved høy hastighet (lO.OOOg), og konsentrasjonen bestemmes ved et UV-spektrofotometer ved en bølgelengde på 280 nm.

3. Immuniserin<g> av dvr med pST- peptider

Konjugater av pST-peptid-KLH (1 mg) emulgeres med et likt volum av Freund's komplett adjuvans (CFA, GIBCO) før administrering til svin og kaniner. Kryssavlet hunnsvin (Duroc x Yorkshire x Hampshire), 3-5 måneders alder, som veier 30-50 kg, oppnås fra avlingskolonien til American Cyanamid Company, Princeton, J.J. Svin injeseres subkutant med 0,5 mg peptid-KLH-konjugater på to forskjellige steder i nakkeområdet bak ørene. Hvite hunn- og hann-kaniner fra New Zealand, 10-15 uker gamle, som veier 2-3 kg, oppnås fra Skippack Farm, Skippack, PA. Kaniner blir immunisert på lignende måte ved å injesere konjugatene inn i bakben. Alle dyr blir gitt gjentatte booster-injeksjoner som inneholder de samme anigener hver fjerde uke.

4. Fremstilling av polyklonalt antistoff

Dyr avbløs 7-14 dager etter hver antigenboosterinjeksjon. Blod oppsamles fra halsvenen i svin og ørevenen i kaninene. Etter koagulering blir serum isolert ved sentrifugering. Alle serumprøver fortynnes til 50% med bindingsbuffer (3M NaCl, 1,5M glycin, pH 8,9) og settes på en preparativ Protein A Superose HR 16/5-kolonne på et FPLC-system (Pharmacia, Piscataway, NJ) for å rense lg fra serum. Ikke-Ig-fraksjonen elueres ved å vaske kolonnen med bindingsbufferen (Fi. 3) . Den bundne Ig-fraksjon blir videre oppsamlet ved å rense kolonnen med 0,1M sitronsyre, pH 3. Den blir umiddelbart nøytralisert til pH 7-8 med 2M Tris buffer, pH 8,2, og konsentrert ved ultrafiltrering (Amicon, Danvers, MA). Ig-fraksjonen bidrar hovedsakelig med omtrent 30% av total serumprotein. Renheten av Ig-fraksjonen er større enn 98% som bestemt ved SDS-PAGE (Fig. 3A) som følger.

Ig-prøver blir satt på en 10% SDS-PAGE-plategel, og elekt roforese utføres ved 8mA over natten. Gelen farges med Coomassie-blått, og proteinbånd analyseres ved en gel-scanner fulgt av avfarging. Molekylvektmarkører inkluderer fosforylas e B (97,4 kd), okseserumalbumin (68 kd), ovalbumin (43 kd) og a-chymotrypsinogen (25,7 kd). Etter ekstensiv dialyse mot PBS blir antistoffet fordelt i alikvote mengder og lagret ved

-20°C inntil anvendelse.

5. Fastfase- enzymbundet immunosorbent assay ( ELISA)

Antigen fremstilles i PBS og 1 ug i 100 pl tilsettes til hver brønn i en 96-brønns flatbunnet polystyrenplate. Etter å ha vært inkubert i en time, blir platen vasket tre ganger med PBS som inneholder 0,05% Tween-20 ved hjelp av en automatisk platevasker (Dynatech Wash II, Chantilly, VA), og hver brønn blir tildelt 200 ^1 2% BSA (Sigma). Platen inkuberes igjen i en time til. Serumprøver tilsettes og testes til en slutt-konsentrasjon på 5% i brønnene. Platen inkuberes i 30 minutter, vaskes seks ganger med PBS og tilsettes 100 fil alkal isk fosfatase-konjugert kanin-anti-svine-IgG eller geite-anti-svine-IgG F(ab')2 (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) i en fortynning på 1/1000. Platen vaskes igjen etter en 30 minutters inkubering, og 100 pl p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml, Sigma) i 0,1M dietanolamin, pH 10,3, tilsetts som substrat for fargeutvikling. Til slutt blir den kolorimetriske respons nedtegnet som optisk tetthet (OD) ved en ELISA-plateavleser med en bølgelengde på 405 nm. Inkuberingsprosedyre utføres alltid ved 37°C.

6. Immunoreaktivitet av antistoffer mot pST og dets peptider

Antistoffer mot pST-peptider dannes i svin og kaniner, og immunoreaktiviteten av disse antistoffer undersøkes ved å anvende pST og alle syv peptider som målantigener. Bioassay for immunoreaktivitet utføres med hypoks-rotter (hunnrotter Sprague-Dawley), 21 dager gamle, som veier 50-64 g hver, oppnå dd fra Taconic Farm, Germantown, N.Y.). Etter å ha blitt utlevert, blir disse rotter holdt under observasjon i 7-10 dager for å sikre fullstendig hypofysektomi. Ved å anvende et computer-assistert program, blir dyr tilfeldig fordelt til åtte rotter pr. gruppe. To grupper av kontroller-er alltid inkludert i alle forsøk. Den første gruppe består av ubehandlede hypoks-rotter som tjener som negative kontroller. Den andre kontrollgruppen består av hypoks-rotter som mottar en minimal effektiv dose pST (5 ug) ved daglig injeksjon og således tjener som positive kontroller. Antistoff (0,5 til 1 mg) blandet med 5 /ug pST ved romtemperatur i 1 time, administreres til hver forsøksrotte. Alle rotter injeseres med 0,2 ml testmaterialer subkutant i nakkeområdet. Veksten av disse dyr måles og nedtegnes som vektøkning i løpet av forsøket.

Den statistiske evaluering utføres ved minste kvadraters analyse av varians for vilkårlig utførelse ved å anvende fremg angsmåten de generelle lineære modeller i det statistiske analysesystem. Resultatene av immunoreaktivitetsforsøkene ved å anvende antistoffer dannet i svin, er vist i Tabell 2:

Resultatene i Tabell 2 angir at svineantistoffer dannet mot forskjellige peptider, reagerer med deres henholdsvise antigener, med unntak av anti-peptid #4 (aa = 46-53) antistoff. Antistoffer mot peptider #2 (aa = 35-52) og #8 (aa = 98-110) kryssreagerer med nesten alle antigener som blir undersøkt, mens de gjenværende antistoffer er spesifikke. Selv om alle antistoffer dannet mot peptider, gjenkjenner intakt pST, utelater antistoff mot pST å reagere med noen av dets peptider. Normalt svine-Ig er ikke reaktivt i det hele tatt.

Antistoffer fra kaniner blir testet på samme måte for deres immunoreaktivitet, og resultater er vist i Tabell 3:

Peptider #2 (aa = 35-52), #6 (aa = 35-43), #9 (aa = 110-118) og #11 (aa = 155-163) induseer antistoffer som gjenkjenner deres henholdsvise antigener. Antistoffer fra peptid #6-immuniserte kaniner kryssreagerer svakt med peptid #2. Antistoff dannet av peptid #3 (aa = 36-44) uttrykker et bredt spektrum av kryss-reaktivitet med peptider #2, #6 og #8. Peptider #4 (aa = 46-53) og #8 (aa = 98-110) utelater å indusere noen påvisbar antistofftiter mot seg selv. Selv om alle antistoffer gjenkjenner det intakte pST-molekyl, reagerer pST-indusert antistoff bare med pST, svakt med peptid #2, men ikke med andre peptider.

7. Forsterkning av vekstytelse ved hjelp av svineantistoffer

Den vekstfremmende virkning av antistoffer i konjunksjon med pST er evaluert i . hypoks-rotter. Alle dyr behandles med enten 5 /xg pST eller 5 /kj PST sammen med 1 mg svineantistof f i 10 på hverandre følgende dager. Kroppsvekten måles, og virkningen av antistoff på pST-aktivitet beregnes som prosent-vektøkning i forhold til kontroller som mottar pST alene. Resultater i Fig. 4 viser at antistoffer mot peptider #2 (aa = 35-52), #8 (aa = 98-110), #9 (aa = 110-118) og #11 (aa = 155-163) signifikant forsterker virkningen av pST. De gjenværende antistoffer, inkludert normalt svine-Ig, anti-pST-antistoff og antistoffer mot de andre peptider, er usignifikant effektive.

Virkningen av antistoffer mot noen av disse peptider blir testet på nytt i et separat forsøk, og resultater er vist i

Fig. 5. Hypoks-rotter mottar behandlinger med 5 jiig pST sammen med antistoff mot peptider #8 (0,5 mg), #9 (1 mg) og #11 (1 mg) i fire på hverandre følgende dager. Veksten av disse rotter måles, og igjen forsterker alle tre antistoffer på signifikant måte virkningen av pST-aktivitet. Normalt svine-Ig i en dose på 1 mg/dag utelater å gjøre dette.

Et doseresponsstudium utføres ved å behandle hypoks-rotter med forskjellige doser av anti-peptid #8-antistoff sammen med 5 /jg pST i fire dager. Data i Fig. 6A viser at toppvirkningen av anti-peptid #8-antistoff for å forsterke pST-aktivitet er 0,25 mg/dag. Den synker i doser på 0,5 til 2 mg/dag, men den maksimale virkning viser seg igjen ved 4 mg/dag. Den bi-fasiske doseresponskurve observeres også med antistoff mot anti-peptider #9 og 11. De optimale doser er 0,5 og 2 mg/dag for anti-peptid #9 og er 0,25 og 1 mg/dag for anti-peptid #11 (Fig. henholdsvis 6B og 6C).

Et tidsforløpsstudium av den passive immunisering med antistoffer mot peptider er også undersøkt. Det indikerer at hypoks-rotter har en defekt i den normale vekstprosess (se Fig. 7A, 7B og 7C; linje betegnet "ingen behandling"). Imidlertid gjenoppretter daglige injeksjoner med 5 ug pST i 10 dager på en merkbar måte deres evne til å øke i vekt. En kombinasjon av pST med anti-peptid #8-antistoff (0,5 mg/dag) forbedrer videre vekstutførelsen (Fig. 7A). Signifikant forsterkning ved hjelp av antistoff blir påvisbar så tidlig som to dager etter behandling, hvilket antyder en hurtig virkning. Lignende observasjoner blir også oppnådd med antistoffer mot peptider #9 og #11 (se Fig. henholdsvis 7B og 7C) .

Denne forsterkende virkning av svineantistoffer sett ovenfor resulterer bare i konjunksjon med pST, fordi disse antistoffer ikke stimulerer hypoks-rotter til å vokse når de er gitt alene uten pST (Fig. 8). Som forutsett fremmer pST alene veksten av hypoks-rotter.

8. Forsterkning av vekstytelse ved hjelp av kaninantistoffer

Kaninantistoffer mot pST-peptider blir fremstilt på samme måte og testet i hypoks-rotter. Hvert testet antistoff blir blandet separat med pST (5 jug) i en time ved romtemperatur og injesert subkutant til rotter i fire på hverandre følgende dager. Data fra to separate forsøk er oppsummert i Fig. 9 og 10. Det er klart at kaninantistoffer mot pST-peptid #9 (aa = 110-118) signifikant forsterker virkningen av pST når det gjelder å fremme veksten. De gjenværende, inkludert normalt kanin-Ig, antistoff mot pST og antistoffer mot andre peptid-sekvenser, er mindre effektive. Videre påvirker ikke kaninantistoffer mot peptid #9 veksten av hypoks-rottene når de administreres i fravær av pST (Fig. 11). Igjen er det pST alene som stimulerer en signifikant forsterkning av vekst i disse dyr.

EKSEMPEL 2

1. Dannelse av monoklonale antistoffer mot pST- peptider

Balb/C-mus, 6 til 10 uker gamle, forhandles fra Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA. Disse mus immuniseres med 100 /xg KLH konjugert med ett av peptidene #8, 9 eller 11, fremstilt i henhold til fremgangsmåten i Eksempel 1, i nærvær av Freund's komplette adjuvans. Dyrene gis booster-doser med 50 /zg av det samme peptid hver tredje uke deretter. Miltene fjernes tre dager etter den siste booster-dose, og enkeltcellesuspensjoner av lymfocytter fremstilles. Disse lymfocytter sammenføyes med PS2/0-musemyelomceller som mangler hypoksantin-fosforibosyl-transferase (HPRT-negative) med 50% polyetylenglykol, suspendert i Dulbecco's minimum essensielle medium som inneholder 20% fetalt kalveserum, 0,175 mg/ml aminopterin, 13,6 mg/ml hypoksantin, 3,88 mg/ml tymidin og 50 mg/ml gentamicin, og fordeles til slutt i 96-brønns kulturplater. Etter dyrking i 10-14 dager blir supernantanter av hybridomene som overlever på grunn av den HPRT-positive fenotype av lymfocyttene, oppsamlet for antistoffkartlegging i en fastfase-ELISA. De som bestemmes til å produsere passende antistoffer, blir videre subklonet ved en begrenset fortynning sprosedyre. De således selekterte kloner injeseres intraperit onealt i Balb/C-mus som igangsettes med pristan for produksjon av antistoff-inneholdende bukvæske.

2. Fremstilling av monoklonalt antistoff

Bukvæske oppsamles fra bukhulen fra mus, og lg renses ved 50% ammoniumsulfat-presipiteringsteknikk. Alternativt fortynnes prøver til 50% med bindingsbuffer (3M NaCl, 1,5M glycin, pH 8,9) og settes på en preparativ Protein A-Superose HR 16/5-kolonne på en FPLC-system (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Ikke-Ig-fraksjonen eluseres fra kolonnen med bindingsbufferen. Det bundne lg blir videre oppsamlet ved å rense kolonnen med 0,1M sitronsyre, pH 3. Det bundne lg blir umiddelbart nøytralisert til pH 7-8 med 2M Tris-buffer, pH 8,2. Antistoff fremstilt ved begge prosedyrer blir ekstensivt dialysert mot fosfatbufret saltvann (PBS), konsentrert ved ultrafiltrering (Amicon, Danvers, MA), delt i alikvote mengder

og tilslutt lagret ved -20°C inntil anvendelse.

Det monoklonale antistoff-titernivå måles ved å anvende ELISA-prosedyren beskrevet i Eksempel 1.

Immunoreaktiviteten til og forsterkningen av vekstytelse ved de monoklonale antistoffer i dette eksempel bestemmes ved å anvende fremgangsmåtene beskrevet i Eksempel 1.

Claims (3)

1. Peptid, karakterisert ved at det har en aminosyresekvens tilsvarende en del av svinesomatotropin (pST) valgt fra følgende sekvenser: (a) pST 110-118, (b) pST 155-163.

2. Peptid i henhold til krav 1, karakterisert ved at peptidet har aminosyresekvens Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu, eller Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser.

3. Peptid i henhold til krav 1, karakterisert ved at peptidet er bundet til en bærer.