DK173981B1 - Farmaceutisk antigenetisk formulering - Google Patents

Description

i DK 173981 B1

Den foreliggende opfindelse angår en farmaceutisk antigenisk formulering omfattende et peptid og midler til tilvejebringelse af adjuvans- og bærerfunktioner .

5 Mange polypeptidhormoner, især væksthormoner, er vigtige medicinsk eller indenfor animalsk landbrug, væksthormoner findes i alle hvirveldyr, idet væksthormonet (GH) af hver art sædvanligvis har en aminosyre-sekvens, der er lidt forskellig fra aminosyresekvensen 10 af GH'et fra en anden art. Generelt sagt omfatter molekylet en enkelt lineær sekvens af ca, 191 aminosyrer. Aminosyresekvensen af humant væksthormon (hGH) er beskrevet af Choh Hao Li i "Molecular and Cellular Biochemistry", 46, 31-41 (1982). Væksthormoner vides at 15 øge vækst (somatogenese), at øge mælkeproduktion (lactogenese) og have en insulinlignende hypoglykæmisk virkning.

Det er kendt fra EP-A-137 234 (Wellcome) at visse antistoffer mod væksthormoner kan forstærke hele 20 hormonets aktivitet, mens man tidligere i almindelighed troede, at antistoffer, i det mindste in vivo, ville antagonisere hormonets virkning. Sådanne forstærkende antistoffer kan frembringes in situ ved vaccination af værtsdyret med et passende fragment af væksthormon, så-25 ledes at en klasse af polyklonale antistoffer med begrænset specificitet dannes, hvilke antistoffer vil forstærke det .endogene hormons aktivitet. Et stort (7K) fragment er beskrevet i dette tidligere skrift som værende egnet til et sådant formål.

30 Det er også kendt, f.eks. fra WO84/04915 (Amgen), at peptider svarende til dele af GH molekylet kan have nyttig biologisk aktivitet, især til udvikling af hypoglykæmiske virkninger, når de administreres sam- 2 DK 173981 B1 tidigt med eksogent insulin. Administrering af sådanne peptider i et antigenisk middel beskrives ikke i W084/04915, idet formålet med administrering i dette skrift ikke er at fremkalde dannelse af antistoffer mod 5 peptidet.

Det har nu vist sig, at visse delsekvenser af GK-molekylet er særligt egnede til fremkaldelse af antistoffer, der vil forstærke hormonets aktivitet i et hvirveldyr. Disse peptider er væsentligt mindre end 10 7K-fragmentet nævnt ovenfor og kan således fremstilles lettere og billigere.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således en farmaceutisk antigenisk formulering, der omfatter et peptid med 5 til 25 aminosyrerester, hvor en 15 del, som udgør mindst 45% af peptidet har en aminosyre-sekvens svarende til mindst 35% af regionen, der spænder fra position 35 til 53 i bovint væksthormon eller de tilsvarende regioner 1 aviant eller porcint væksthormon; eller en variant af peptidet indeholdende en 20 eller flere deletioner eller konservative substitutioner, således at peptidets tertiære struktur er uændret; og midler til tilvejebringelse af adjuvans- og bærerfunktioner .

Den nævnte region fra position 35-53 i bovint 25 (og ovint) GH er: Nf^-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-lle-GLn-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cys-COOH.

Peptiderne anvendt ifølge opfindelsen har fortrinsvis mindre ehd 20 aminosyrerester. Antallet af aminosyrerester, der har strukturel homologi med hormo-30 net, som er indeholdt i det lille peptid anvendt ifølge opfindelsen, afhænger typisk af det lille peptids længde og kan variere fra en sekvens på nogle få aminosyrerester til en sekvens, der i det væsentlige omfatter 3 DK 173981 B1 hele det lille peptid. Sekvensen af aminosyrerester med den strukturelle homolog!, har typisk en længde på mindst 5 aminosyrerester, fortrinsvis mindst ca. 8-10 aminosyrerester.

5 Som anvendt heri betyder udtrykket "forstærke", at det lille peptid virker direkte eller indirekte til forøgelse eller forstærkning af aktiviteten af hormonet, med hvilket det har strukturel homologi.

Udtrykket "konservativ substitution" er define-10 ret funktionelt ovenfor. Eksempler på substitutioner, der kan være konservative i denne sammenhæng, omfater de substitutioner, der giver i det væsentlige samme hydrofobe egenskaber, størrelse, ladning og/eller aromatiske egenskaber som den oprindelige aminosyresekvens.

15 Alle sådanne substitutioner og modifikationer er alment velkendte for fagfolk indenfor peptidkemien. Potentielle substitutioner omfatter f.eks.: prolin i stedet for glycin og omvendt, alanin eller valin i stedet for glycin og omvendt, isoleucin i stedet for leu-20 cin og omvendt, tryptophan i stedet for tyrosin og omvendt, histidin i stedet for lycin og omvendt, serin i stedet for asparagin og omvendt, arginin i stedet for glutamat og omvendt, threonin i stedet for cystein og omvendt, serin eller alanin i stedet for threonin og 25 omvendt, og glutamin i stedet for asparagin og omvendt.

Det følgende er eksempler på regioner af ikke-bovine GH'er, der svarer til 35-53-regionen af det bovine væksthormon: 4 DK 173981 B1

Svin og rotte 35-53

Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-

Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys.

5 Fjerkræ (35-53)

Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys.

Udtrykket "antigenisk ækvivalent" betyder, at 10 peptidet kan anvendes i en passende formulering til at fremkalde antistoffer i et hvirveldyr, hvilke antistoffer virker forstærkende på væksthormonets virkning i dette hvirveldyr. Især har peptider, der er lidt kortere eller længere end de nævnte regioner, eller som i 15 det væsentlige overlapper disse regioner, f.eks. 30-4Θ eller 26-43, vist sig at være antigenisk ækvivalente med disse. Udtrykket "lidt længere", "lidt kortere" og "i det væsentlige overlapper" angiver peptider, hvori i det mindste 45% (fortrinsvis 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 20 eller 100%) af det ækvivalente peptid overlapper med mindst 35% (fortrinsvis 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% eller 100%) af de nævnte 35-53-regioner. Især kan antigenisk ækvivalente peptider, der er kortere end de nævnte fragmenter, f.eks. 35-43 eller 35-48, anvendes.

25 Med særlig, skønt ikke udelukkende, relation til bovint GH er de·følgende sekvenser nyttige ved udøvelse af opfindelsen: 26-43 r(Ala-Tyr), 35-43 (Thr-Tyr), 37-48 (Ile-Thr) , 39-46 (*Glu-Gln) , 43-54 (Tyr-Phe) og 43-61 (Tyr-Pro).

30 Det har vist sig, at anvendelse af et lille pep tid ifølge opfindelsen fra en anden art end dyret, til hvilket peptidet administreres, f.eks. administrering af porcint 35-53 til får eller kvæg, kan være hensigts- 5 DK 173981 B1 mæssig. Variationer fra dyrets egen GH-sekvens kan fremkalde en kraftigere immunreaktion, mens der stadig opnås antistoffer, der kan genkende dyrets eget Gtt.

Desuden kan peptider, hvori én eller flere af 5 aminosyreresterne er modificeret kemisk inden eller efter fremstilling af peptidet, anvendes, forudsat at peptidets virkning, nemlig dannelsen af specifikke antistoffer in vivo, forbliver i det væsentlige uændret.

Sådanne modifikationer omfatter dannelse af salte med 10 syrer eller baser, især fysiologisk acceptable, organiske eller uorganiske syrer og baser, dannelse af en ester eller et amid af en terminal carboxylgruppe og vedhæftning af aminosyrerbeskyttende grupper, såsom N-t-butoxycarbonyl. Sådanne modifikationer kan beskytte 15 peptidet mod in vivo-metabolisme. Peptiderne kan foreligge som enkeltkopier eller som multiple kopier, f.eks. tandem-gentagelsesenheder, såsom 35-53+35-53.

Sådanne tandem-gentagelsesenheder eller multiple gentagelsesenheder kan være tilstrækkeligt antigeniske 20 selv til undgåelse af anvendelse af en bærer. Det kan være hensigtsmæssigt at peptidet er formet som en løkke med de N-terminale og C-terminale ender bundet sammen eller at tilsætte én eller flere Cys-rester til en af enderne til forøgelse af antigeniciteten og/eller for 25 at muliggøre dannelse af disulfidbindinger. Hvis peptidet er bundet kovalent til en bærer, fortrinsvis et po-lypeptid, er arrangementet fortrinsvis således, at peptidet ifølge opfindelsen danner en løkke.

Ifølge de nuværende, immunologiske teorier skal 30 en bærerfunktion være til stede i enhver immunogen formulering til stimulering eller forstærkning af stimuleringen af immunsystemet. Det formodes, at bærere udgør (eller sammen med antigenet danner) en hjælper 6 DK 173981 B1 T-celleepltop. Peptiderne kan være bundet sammen, f.eks. ved tværbinding, med en separat bærer, såsom serumalbuminer, myoglobiner, bakterielle toxoider og dolkhalehæmocyanin. Nyligt udviklede bærere, der 5 fremkalder T-celle-hjælp i Immunreaktionen, omfatter hepatitis-B-kerneantigenet (også kaldt nucleocapsid-protein), formodede hjælper T-celle-epitoper, såsom Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn, β-galactosi-dase og 163-171-peptidet af interleukin-1. Den sidste 10 forbindelse kan skiftevis betragtes som en bærer eller som et adjuvans eller som begge dele. Alternativt kan adskillige kopier af det samme peptid eller af forskellige peptider ifølge opfindelsen tværbindes til hinanden. I dette tilfælde findes der ingen separat bæ-15 rer som sådan, men en bærerfunktion kan tilvejebringes ved denne tværbinding. Egnede tværbindingsmidler omfatter de midler, der er listet som sådanne i Sigma- og Pierce-katalogerne, f.eks. glutaraldehyd, carbodiimid og succinimidyl- 4-(N-maleimidomethyl)cyclo-hexan-l-20 carboxylat, idet det sidstnævnte middel benytter -SH-gruppen på den C-terminale cysteinrest af 35-53-regio-nen.

Egnede adjuvanser er kendte for fagfolk indenfor vaccineteknikken, f.eks. Freund's fuldstændige el-25 ler ufuldstændige adjuvans, aluminiumhydroxid, saponin, DEAE-dextran, muramyldipeptid, mineralolier, neutralolier (såsom . miglyol), vegetabilske olier (såsom arachisolie), "Iscbmer", liposomer, Pluronic polyoler eller Ribi-adjuvanssystemet (se f.eks. GB-A-2 189 141).

30 "Pluronic" er et varemærke.

Peptidet ifølge opfindelsen kan bindes til andre antigener til opnåelse af en dobbeltvirkning. F.eks. kan peptidet bindes til en del eller hele somatostatin- 7 DK 173981 B1 molekylet, således at der foruden anti-GH-antistoffer, dannes anti-somatostatin antistoffer, som vil fremme vækst, eller det kan bindes til en del eller hele kønshormonmolekylet til samtidig tilvejebringelse af immun-5 kastration, eller til en del eller hele det luteinise-ringshormonfrigivende hormon (LHRH).

Peptiderne og adjuvanserne og/eller bærerne kan formuleres på vilkårlig egnet måde, som kan angives af fagmanden under anvendelse af kendte eller endnu ikke 10 opdagede administreringsbærere og kriterier. Især kan formuleringerne være baseret på bionedbrydelige polymerer, såsom lactid-glycolidcopolymerer, som dem der er beskrevet i EP-A-58481 (ICI).

De antigeniske formuleringer ifølge opfindelsen 15 vil sædvanligvis blive administreret intravenøst, subcutant eller intramuskulært, skønt intranasal, transdermal, oral og rektal vej kan være egnet for nogle formuleringer ifølge opfindelsen. Formuleringerne vil normalt være sterile og (til parenteral anvendelse) 20 ikke-pyrogene, og en enhedsdosis vil typisk omfatte 1 til 1000 yg af det omhandlede lille peptid, typisk 10 til 500 yg, fortrinsvis 50 yg eller mindre. Én eller flere gentagelser af immuniseringer kan være hensigtsmæssige, som det er kendt indenfor den immunologiske 25 videnskab. Formuleringerne kan i almindelighed fremstilles og/eller administreres af en læge eller dyrlæge i overensstemmelse med hans erfaring og ekspertise.

Peptiderne kan tilvejebringes ved kendte fremgangsmåder indenfor peptidsyntese eller ved passende 30 spaltning af det naturlige Gtt-molekyle. Peptidsyntese kan opnås efter den almene fremgangsmåde ifølge Stewart et al, beskrevet i "Solid Phase Peptide Synthesis" (W Η Freeman, San Francisco, 1969) eller ved fremgangsmåder- 8 DK 173981 B1 ne beskrevet af Marglin og Merrifield i Anual Reviews of Biochemistry, 39, 841-866 på 862 (1970), og efter følgende artikler. Etablerede fremgangsmåder til peptidsyntese ved fast fasemetoder og lignende metoder er 5 sædvanligvis ikke egnede til storskalaproduktion (skønt de kan blive det i fremtiden), og kommerciel produktion af peptiderne vil således normalt ske ved dyrkning af en passende organisme transformeret med en polynucleo-tidsekvens, der koder for det ønskede peptid.

10 Eksempler i overensstemmelse med opfindelsen beskrives i det følgende med henvisning til tegningerne, hvorpå:

Figur 1 viser resultaterne af et præliminært dværgmuseforsøg. Søjlerne repræsenterer 1 standardaf-15 vigelse med 6 dyr pr. behandling.

Figur 2 viser resultaterne af et andet dværgmuseforsøg, ved hvilket aktivitet af igG (globulin) fra to får 772 (35-53 alene + FCA) og 775 (35-53 konjugeret med KLH f FCA) sammenlignedes med OA11 ved forskellige 20 globulinkoncentrationer.

772 rent - 10,5 mg protein/ml; 775 = 9,6 mg protein/ml, OA11 - 5 mg protein/ml. Søjler = 1 standardafvigelse; n=6.

Figur 3 viser resultaterne af et tredie drærg-25 museforsøg, der viser aktiviteten af globuliner fra forskellige får; der alle er behandlet med 35-53 X-bun-det + FCA (4600, 4609,.4602, 4612, 4610), eller negativ kontrolimmunisering (4660, 4608). Søjler = 1 standardafvigelse, n=6.

30 Figur 4 viser, hvorledes antistoffer dannet mod b35-53 i nogle tilfælde på forskellige måder kan binde til bovint væksthormon og det porcine molekyle. Affiniteten for det sidstnævnte er reduceret med ca. 10 9 DK 173981 B1 gange. Resultaterne af et dværgmuseforsøg er vist. Søjler b 1 standardafvigelse, n=6.

Figur 5 viser resultaterne af et forsøg med hy-pofysektomiserede rotter udført som beskrevet nedenfor, 5 hvilket forsøg viser vægtforøgelsen af grupper (n=6) af rotter i løbet af 9 dages perioden. Søjler repræsenterer 1 standardafvigelse. Alle behandlede dyr modtog hormon.

• anti-bovint 35-53 anti-serum samlet fra 4 im-10 muniserede får, der var positive for bovin væksthormonbinding (RIA). x anti-serum som ovenfor fra et af de fire får. o negativ kontrol-anti-serum.

(fmonoklonalt antistof (behandlet som antiserum) 15 OA15.

Π monoklonalt antistof OA17 (se Aston et al., 1986).

Figur 6 viser resultatet af et yderligere forsøg med hypofysektomiserede rotter.

20 A: kontrolfåreimmunoglobulin.

B: anti-35-53-antiserum, får 1064, 5 mg/ml.

C: anti-35-53-antiserum, får 1064, 15 mg/ml rent.

Søjler repræsenterer 1 standardafvigelse, n=6.

Figur 7 viser resultaterne af et yderligere for-25 søg med hypofysektomiserede rotter, nemlig'en sammenligning af antipept idantistof fer konjugeret med enten ovalbumin eller" somatostatin.

Søjler repræsenterer 1 standardafvigelse, n=6.

Hver af disse globulinpræparater var komplexbun-30 det med bovint væksthormon inden administrering til rotterne.

Figur 8 viser resultaterne af et yderligere forsøg med hypofysektomiserede rotter, hvilket forsøg il- 10 DK 173981 B1 lustrerer, hvorledes anti-bovint 35-53 også kan forstærke porcint væksthormon. Rotter fik en dosis på blot 15 yg pr. dag, men med den sædvanlige mængde anti-glo-bulin. Søjler repræsenterer 1 standardafvigelse, n=6.

5 Figur 9 viser resultaterne af et andet forsøg med hypofyseectomiserede rotter, ved hvilket rotter behandledes med anti-peptidantistoffer dannet mod en række forskellige peptider med relation til enten bovine eller porcine molekyler. Alle var komplexbundet med 10 porcint væksthormon inden administrering til rotter.

Søjler repræsenterer 1 standardafvigelse, n=6.

FREMGANGSMÅDER

1 5 Fremstilling af peptider

Alle peptider fremstilledes ved Fmoc-polyamid-fastfasepeptidsyntesemetoden.

Midlertidig Na~aminogruppebeskyttelse ydes af 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-gruppen. Gentagende 20 spaltning af denne i høj grad baselabile beskyttelsesgruppe fremkaldes ved anvendelse af 20% piperidin i Ν,Ν-dimethylformamid.

Funktionelle grupper på sidekæder beskyttes som deres butylethere (for serin, threonin og tyrosin), bu-25 tylestere (for glutaminsyre og asparaginsyre), butylo-xycarbonylderivat (for lysin og histidin), tritylderi-vat (for cystein) og 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzen-sulfonylderivat (for arginin). Når glutamin eller aspa-ragin er den C-terminale rest, udnyttes 4,4'-dimethoxy-30 benzhydrylgruppen til beskyttelse af funktionelle side-kædeamidgrupper.

Fastfasebæreren er baseret på en polydimethyl-acrylamidpolymer bestående af de tre monomere dimethy- 11 DK 173981 B1 lacrylamid (hovedkædemonomer), bis-acryloylethylen- diamin (tværbindingsmiddel) og acryloylsarcosinmethyl-ester (funktionaliseringsmiddel).

Det anvendte spaltelige peptid-til-harpiksbundne 5 middel er det syrelabile 4-hydroxymethyl-phenoxyeddike-syrederivat.

Alle aminosyrederivater tilsættes som deres præfremstillede, symmetriske anhydridderivater, bortset fra asparagin og glutamin, der tilsættes under anven-10 delse af en omvendt N,N-dicyclohexylcarbodiimid/l-hydroxybenzotriazolmedieret koblingsprocedure.

Alle koblingsreaktioner og reaktioner til fjernelse af beskyttende grupper følges ved anvendelse af ninhydrin-, trinitrobenzensulfonsyre- eller isotintest-15 metoden.

Efter afslutning af syntese spaltes peptiderne fra harpiksbæreren under ledsagende fjernelse af side-kædebeskyttende grupper ved behandling med 95% tri-fluoreddikesyre indeholdende en 5% renseblanding 20 ("scavenger"-blanding). Almindeligt anvendte rensemidler er ethandithiol, phenol, anisol og vand, idet det nøjagtige valg afhænger af de aminosyrer som det syntetiserede peptid består af. Trifluoreddikesyre fjernes ved inddampning i vakuum med efterfølgende triturering 25 med diethylether til opnåelse af det rå peptid. Al tilstedeværende rensemiddel fjernes ved en simpel ekstraktionsmetode, som efter lyofilisation af den vandige fase giver det rå peptid frit for rensemidler.

Oprensning kan udføres ved en vilkårlig eller en 30 kombination af fremgangsmåder, såsom størrelsesafskæ-ringschromatografi, ionbytningschromatografi og (først og fremmest) revers-fase hplc.

Peptidanalyse udføres ved anvendelse af tyndt-lagschromatografi, reversfase hplc, aminosyreanalyse 12 DK 173981 B1 efter syrehydrolyse og ved hurtigt-atombombardement-(FAB)-massespektrometrianalyse som er velkendt for fagfolk.

5 I. Fåreforsøg: præliminært

Fremgangsmåder: 1. Fremstilling af Immunogent middel 10 Tværbinding til dolkhalehæmocyanin under anven delse af glutaraldehyd: 10 mg peptid (ovin/bovin sekvens 35-53) opløstes i 500 \il dimethylformamid og blandedes med 10 mg dolkhalehæmocyanin i 400 vi 0,05M phosphatpuffer, pH 7,8, 1 T5 ml 0,02M glutaraldehydopløsning i 0,05M phosphatpuffer pH 7,8, tilsattes dråbevist i løbet af en time under omrøring ved stuetemperatur. Man lod blandingen omrøre ved stuetemperatur i yderligere 3 timer og dialyserede den dernæst mod phosphatpufret saltopløsning, pH 7,2.

20 Halvdelen af præparatet blandedes med et dobbelt så stort volumen af Freund's fuldstændige adjuvans og injiceredes i to får mange steder subcutant. 28 dage senere emulgeredes den anden halvdel af præparatet på samme måde, og den injiceredes i Freund’s ufuldstæn- 25 dige adjuvans. Blod udtoges fra fårene ugentligt under immunisering. Den optimale antistofreaktion opnåedes ca. 14 dage efter den anden immunisering.

2. Radioimmunoassay af fåreserum 30 Antistofdannelse hos får efter immunisering med GH-peptid fragment 35-53 bestemtes ved en direkte væs-kefasebindingsassay med ^^I-bGH i det væsentlige som beskrevet tidligere (Aston, et al., 1985).

13 DK 173981 B1 3. Vækstassay Vækstforøgende peptidantisera (anti-35-53) bedømtes med hensyn til aktivitet ved dværgmusevækstmo-dellen som beskrevet tidligere (Aston, et al., 1986; 5 1987) efter fremstilling af γ-globuliner ud fra serae ne.

Resultater

Sera fra får immuniseret med peptider opnået 10 ud fra bovint/ovint GH bedømtes med hensyn til deres binding til 125I-bGH og deres virkninger på bioaktiviteten af bGH in vivo. Dværgmus, der modtog bGH i et komplex med anti-35-53-antiserum, voksede signifikant bedre end mus behandlet med bGH og kontrolfåreglobulln.

15 Resultaterne er vist i figur 1.

II. Fåreforsøg; undersøqelsesmæsslqe Fremgangsmåder; 20 1. Konjugation med ovalbumin eller dolkhalehæmocyanln (KLH) 1,4 mg peptid (f.eks. bovint 35-53) opløstes i 140 μΐ dimethylformamid. 70 μΐ 10 mg/ml ovalbumin eller 25 KLH i Dulbecco's phosphatapufret saltopløsning (PBS) tilsattes og blandedes omhyggeligt dermed. 200 μΐ frisk fremstillet 0,04M glut.araldehyd tilsattes langsomt under omrøring i løbet af 10 minutter, hvorefter blandingen henstod ved stuetemperatur i yderligere 60 minut-30 ter. 0,7 ml PBS tilsattes og efterfulgtes af yderligere 100 μΐ 0,04M glutaraldehyd som ovenfor. Denne blanding henstod i 60 minutter ved stuetemperatur inden den dialyseredes natten over ved +4DC mod PBS.

14 DK 173981 B1 2. Tværbinding 11,4 mg peptid opløstes i 140 yl dimethylforma-mid, og 170 yl 0,04M glutaraldehyd tilsattes som ovenfor. Hvis ingen tværbinding eller konjugation var 5 nødvendig, opløstes peptidet i dimethylformamid, dis-pergeredes i PBS men dialyseredes ikke.

3. Negative kontroller

Negative kontrolparallelprøver til de ovennævnte 10 fremstilledes uden anvendelse af peptid med ovalbumin (eller KLH) eller ved anvendelse af polylysin (molekylvægt 1000-2000 Da) og tværbinding.

4. Adjuvanser og administrering - "Freunds" 15 Efter dialyse bragtes volumenerne af de oven nævnte præparater op til 4,5 ml med PBS og vand-i-olie-emulsioner fremstillet under anvendelse af to volumener af Freund's fuldstændige adjuvans (FCA) (Difco eller Sigma). Dette opnåedes ved lydbehandling i kulden eller 20 anvendelse af en Potter-Elvehjen homogenisator. Emulsioner testedes ved dispersion (eller mangel derpå) på en vandoverflade. Injektioner udførtes samtidig to steder (en på hver side) i Cheviot får (9-12 måneder gamle, kastrerede hanner, 30-35 kg), l ml administreredes 25 hvert sted. En anden, lignende immunisering fuldendtes under anvendelse af frisk fremstillet peptid, konjugeret på samme måde, men emulgeret i Freund's ufuldstændige adjuvans (FI^C) (Difco eller Sigma). Alle efterfølgende immuniseringer udførtes på samme måde men med 30 28 dages mellemrum.

15 DK 173981 B1 5. Adjuvanser og administrering - andre.

DEAE-dextran (fuldstændig hydratiseret natten over i dobbeltdestilleret vand) (Pharmacia), Saponin (Sigma) og aluminiumhydrogel anvendtes alene og i kom-5 binationer. Efter dialyse tilsattes 3,1 ml PBS plus 7 ml 5% DEAE-dextran (Dd) plus 2,8 ml 5 mg/ml saponin; eller 5,9 ml PBS plus 7 ml 5% Dd; eller 10,1 ml PBS plus 2,8 ml 5 mg/ml saponin. Aluminium ("AlOH") anvendtes om passende i en slutkoncentration på 1,0 mg/ml.

10 ingen emulgering var nødvendig, men man måtte passe på, at bestanddelene bevaredes i homogen suspension. 1 ml administreredes i får som beskrevet ovenfor. Immuniseringer udførtes med samme intervaller.

15 6. Blodprøver 10 ml's blodprøver blev taget ved halsvenepunk-tur fra fårene, der testedes, lige inden enhver administrering og med 3x1 uges mellemrum derefter. Efter man havde ladet blodet størkne ved stuetemperatur (ca.

20 5 timer) fjernedes serumet efter centrifugering til øjeblikkelig antistofpåvisningsradioimmunoassay. større prøver af sera opsamledes på samme måde fra ca. 150 ml blod, blev frosset til -20°C til efterfølgende fraktionering og anvendelse i vaekstanalyser.

25 7. Radioimmunoassay Påvisningen af.antistoffer mod peptider, hvilke antistoffer også ville bindes til bovint væksthormon bestemtes ved direkte væskefasebinding som beskrevet 30 tidligere (Aston et al., 1985; Chard, 1987).

16 DK 173981 B1

Resultater 1 tabel 1 sammenfattes resultaterne fra fåreforsøgene, og disse viser overlegenheden af FCA ved de fleste konjugater (eller peptid alene) under anvendelse 5 af peptid 35-53. Små ændringer som i porcint 35-53 indført i får forbedrede reaktionsgraden (og den faktiske titer - ikke vist) yderligere. Peptider omkring, med og indenfor 35-53-sekvensen gav mindst moderate reaktioner .

10

Tabel 1

Radioimmunoassay til påvisning af antistoffer i fårese-ra, hvilke antistoffer var i stand til at binde til in-15 takt, bovint væksthormon i væskefase.

Behandling % reagerende Individer efter 56 dage med ti-

Konjugat Adjuvans tere på 1/1000 eller 20 mere (n=5).

Bovin 35-53 variationer: KLH FCA 60 KLH AlOH ingen 25 KLH Saponin 20 KLH Dd 20 KLH Dd+AlOH . 20 Λ 30 17 DK 173981 B1

Ovalbumin XFCA (lydbehandlet) 20 " XFCA 80 " AlOH 20 " Saponin 60 5 " Dd ingen ·' Dd+AlOH 80

Tværbundet FCA 80 " Saponin 20 10 " Dd+Saponin 80 " Dd alene 20

Ingen FCA 40

AlOH 20 15 Saponin 20

Dd 20

Dd+AlOH 20

Andre peptider - alle over bovin (undtagen angivet) 2o konjugeret til ovalbumin og administreret i FCA.

46-61 cys 60 43-53 20 35-43 Cys 20 25 Porcin 35-53 100 x Hvis ikke andet er ..angivet fremstilledes emulsioner ved forskydningskræfter.

30 18 DK 173981 B1 III. -Immunstlmulerende virkninger Fremgangsmåde

Der udførtes et forsøg til demonstration af, at 5 35-53 sekvensen (eller dens analoger og beslægtede se kvenser) kunne bindes til et andet peptid eller molekyle af immunologisk interesse, og at reaktionen overfor begge peptider forbedres.

I den sammenhæng, og specielt relevant for im-10 munneutralisationens rolle i dyr, valgtes somatostatin af illustrative årsager og på grund af vanskeligheden med at fremkalde effektive immunneutraliserende antistoffer (se Spencer, 1986).

Konjugationen fuldendtes ved anvendelse af 15 (1-14) somatostatin (Sigma) som beskrevet ovenfor (II-I), bortset fra at somatostatin kun tilsattes til 4 mg/ml, og at der ikke udførtes dialyse i nogen af behandlingerne. Alle andre konjugater fremstilledes som beskrevet ovenfor (II-I).

2o Radioimmunoassays for væksthormonbindende anti stoffer udførtes som ovenfor {IX—7) for somatostatin som beskrevet af spencer et al., (1983) under anvendelse af 125I-mærket Tyr-somatostatin.

2 5 Resultater

Dataene sammenfattet i tabel 2 viser den sædvanlige. vanskelighed med at fremkalde gode antistoftitere mod somatostatin οή hvorledes tværbindingen til bovint 35-53 (ikke blot indre tværbinding) overvinder denne 30 tolerance mod samme.

DK 173981 B1 19

Tabel 2

Radioimmunoassays for antistoffer mod intakt bovint væksthormon og/eller mod somatostatin efter en immuni-5 sering under udnyttelse af 35-53-somatostatinkonjuga-tion.

Behandling % antistofdannere (n=5) der genkender 10 bGH Somatostatin tværbundet 35-53: FCA 80 ingen PIA ingen ingen

Dd+Saponin 80 ingen 15 tværbundet somatostatin : PCA ingen 40 PIA ingen ingen

Dd+Saponin ingen ingen 20 35-53 pluds somatostatin : PCA 80 80 PIA 40 60

Dd+Saponin 80 40 25

Bundet til somatostatin : 35-43 Cys 60 40 (jvf. tabel 1) Φ3-53 40 40 30 20 DK 173981 B1 IV - Forsøg med svin

Fremgangsmåder: 5 1. generelt

Sekvens 35-53 plus T-celleepitopen beskrevet tidligere indførtes i svin efter opløsning i dimethyl-formamid, dispergering i PBS (se II-2) og emulgering i FIA. Der anvendtes ingen konjugation eller tværbinding 10 ved denne metode.

Det således fremstillede peptid administreredes subcutant 4 steder i halsregionen af store, hvide grise (5 uger gamle; kropsvægt ca. 9 kg) til indgivelse af 500 yg peptid pr. svin. En anden immunisering under an-15 vendelse af samme præparat udførtes 28 dage senere. Ved denne lejlighed blev alt Indgivet i FIA. Blodprøver udtoges lige inden denne immunisering og ugentligt derefter ved hjælp af vakuum ved venepunktur (Corvac, Sarstedt, U.K.) af den pulmonære vene. Seraene blev testet 20 for antistofgenkendelse af porcint væksthormon under anvendelse af en enzymlinket immunosorbentassay (ELISA) baseret på Voller, 1979 ved hvilken de efterfølgende blev tværbundet ved kompetitiv binding ved en lignende assay med vandigt hormon.

25

2. ELISA

96-brøndes plader behandlet for immunoassaykon-sistens (Nunc, Immtmo-kvalitet, høj bindingskapacitet) blev belagt under anvendelse af 50 yg hormon/ml med 5 30 yg/brønd (100 yl) i natriumcarbonat/hydrogencarbonat-puffer, 0,05M,pH 9,5, og ladet henstå natten over ved +4eC. Hormonopløsningen fjernedes forsigtigt og brøndene vaskedes én gang med PBS. En opløsning af 3% hæmo- 21 DK 173981 B1 globin tilsates til blokering af brøndene ved henstand natten over ved 4°C. Dette fjernedes, og brøndene vaskedes tre gange med PBS med 0,05% Tween. Man lod alle plader tørre langsomt ved stuetemperatur, og opbevarede 5 dem ved -20°C individuelt indpakket i klæbefilm. Seraene, der testedes, sattes til hver af brøndene til 1/50 og dernæst log^Q fortyndinger (100 pi), som henstod i 2 timer ved stuetemperatur. Seraene fjernedes, og brøndene vaskedes tre gange i PBS, som udskiftedes med 100 pi 10 kaninanti-svine-IgG-alkalisk phosphatasekonjugat (Sigma) fortyndet til 10-3. Dette fjernedes og vaskedes som ovenfor. 100 pi p-nitrophenylphosphat ved 1,0 mg/ml tilsattes, og brøndenes absorbans aflæstes under anvendelse af en Titertek Multiscan plus 2 med 405nm fil-15 ter.

Resultater

Tabel 3 viser, at tilstedeværelse af antistoffer, som genkender belagt, porcint væksthormon (og det-20 te vil konkurrere med vandigt hormon) kunne påvises i et antal af svinene.

25 30 DK 173981 B1 22

Tabel 3

Anti-pGH-antistoffer i peptidimmuniserede svin efter 42 dage målt ved ELISA-metoden.

5

Peptidbehandling % positive dyr (n=6) l/50x l/500x 35-53 T-celleeptitop 100 100 10 xantiserumfortynd.ing.

V - Biologiske assays for GH-aktlvitet 15 Fremgangsmåder: 1. Immunoqlobulinpræparater.

Sera fra større blodprøver taget fra særlige dyr (udpeget ved immunoassayene) fraktioneredes ved natri-20 umsulfatfældning (Johnstone & Thorpe, 1982) først og fremmest til isolation af gammaglobulinerne (IgG), som dialyseredes omfattende mod PBS inden de igen blev frosset ved -20°C. Inden anvendelse ved dyreforsøg ti-treredes de rensede (IgG)--fraktioner igen til måling af 25 fældningens eventuelle virkninger.

2. Dværgmusroetoden q q __

Ved denne anvendes inkorporeringen af JJS04 i ribbensbrusket af dværgmus (hypofysedeficiente) og er 30 beskrevet andetstedt (Aston et al, 1986).

23 DK 173981 B1 3. Fremgangsmåde med hypofysektomiserede rotter

Disse dyr gøres hypofysedeficiente ved kirurgisk fjernelse af hypofysen. Ved testen måles hormonets samlede virkning på rottens kropsvægt og de cirkulerende 5 koncentrationer af somatomedin-C.

Det kirurgiske indgreb på hanlige Wistarrotter udførtes af Charles River U.K. Limited (Margate, kent, U.K.) og rotterne leveredes 14 dage senere med en væg i området fra 125 til 145 g. De vejedes og observeredes 10 i yderligere 7-10 dage for at sikre stabil kropsvægt og fysiologiske egenskaber (f.eks. ikke-fremkomst af testikler) konsistente med godt helbred og fuldstændigt kirurgisk indgreb. Tilfredsstillende dyr fordeles tilfældigt til opnåelse af seks dyr pr. behandling. Disse 7 5 injiceredes dagligt med 0,5 ml PBS indeholdende ca. l mg fåre-IgG fra immuniseringsbehandlingen, der skulle undersøges (herunder negative kontroller), til hvilket der var tilsat 50 pg (undtagelsesvist lo pg - se resultater) bovint eller porcint væksthormon efter 20 ønske. Inden administrering blandedes hormonet og IgG, og blandingen henstod ved stuetemperatur i 60 minutter. Injektioner udførtes subcutant og intraskapulart. Dyrene vejedes og injiceredes dagligt i 8 dage på samme tidspunkt af dagen hver gang. På den niende dag vejedes 25 dyrene, de terminalanæstetiseredes, og en blodprøve udtoges fra aortaforgreningen. EDTA-plasma blev ned-frosset ved -20°C til, senere bedømmelse af det relative, samlede somatotnedin-C indhold under anvendelse af materialer leveret af Nichols Institute (San Juan Capi-30 strano, CA 92675, USA).

24 DK 173981 B1

Resultater 1, Dværgmusernodel

Ud fra dataeene sammenfattet i figur 2, 3 og 4 5 kan det ses, hvorledes dværgmus, der modtager væksthormon i komplex med fåre-anti-bovint-(b)35-53-antiserum inkorporerede væsentligt større mængder af 3^S (fra

3 C

Na2 S04) i deres kostale brusk end de mus, der behandledes med bGH og kontrolfåreglobulin. Dette opstår 10 ud fra en række forskellige immuniseringsmetoder og er relateret til antiserumfortyndingen inden komplexbin-ding (figur 2). Dette fænomen kan også ses, når et antiserum dannet mod bovint 35-53, som også genkender intakt, porcint væksthormon (skønt meget svagere end det 15 genkender det homologe hormon), komplexbindes med det, hvor en øget 35S-inkorporering i kostalt brusk vil opnås .

2. Model med hypofyseectomlserede rotter 20 Under anvendelse af en vækstrelateret model kan det ses, (figur 5-9), at en række forskellige anti-peptidsera vil øge aktiviteten af bovine og porcine væksthormoner, når de administreres til disse kirurgisk ændrede rotter.

25 I dette system er antisera mod peptider med re lation til 35-53-regionen aktive til forstærkning af reaktionen mod. væksthormon (figur 7). Denne fænomen vil krydse artsbarrierer som vist (figur 7), forudsat at antiseraene vil binde til det pågældende målhormon.

30 Hvis bindingskapaciteten eller -affiniteten er begrænset, kan det i visse tilfælde være nødvendigt at justere globulin: hormonforholdet til maksimering af andelen af hormon-antistofkomplexer, som vist i figur 8.

25 DK 173981 B1 VI - konjugatantistoffer (Somatostatin)

Fremgangsmåde

Under anvendelse af in vitro-fremgangsmåden be-5 skrevet tidligere (Hart et al, 1984) måltes aktiviteten af anti-somatostatin-antiseraene efter frigivelse af væksthormonet fra ovine hypofyseceller (i primær kultur). På grund af at antistoffernes væksthormonbindende egenskaber ville interferere med assayen, fjerne-10 des disse ved passage gennem en affinitetskolonne, til hvilken bovint væksthormon var hæftet. En aktiveret Sepharose-CNBr-kolonne fremstilledes ved fremgangsmåden beskrevet af producenten (Pharmacia, Milton Keynes,

Bucks, U.K.).

15 Somatostatin-14 (Sigma) sattes til brønde i 10 μΐ immunt (anti-somatostatin aktivitet ved RIA) eller ikke-immunt (anti-35-53 alene) fåresera over intervallet 5-250xl0-11 mol/L, og dette peptids inhibitoriske aktivitet på niveauerne for væksthormonfrigivelse til 20 mediet bestemtes.

Resultater

Tabel 4 viser klart, hvorledes den inhibitoriske aktivitet af somatostatin tilsat i et antiserum inde-25 holdende somatostatinantistoffer reduceres bemærkelsesværdigt. Det er således vigtigt at bemærke, at anti-serumet fremkaldt mod det bovine 35-53 + somatostatin-konjugat synes at Aindeholde to populationer af antistoffer - en der bindes til intakt, bovint væksthormon 30 og forstærker dets aktivitet, og en anden, der bindes til intakt somatostatin-14 og neutraliserer det.

DK 173981 B1 26

Tabel 4

Virkning af somatostatin på ovine hypofyseceller dyrket i primær kultur som beskrevet af Hart et al, 1984.

5

Somatostatin- %-vis middelinhibering af GH-grigivelse niveau ant.i-35-53 alene anti-somatostatin antisera antisera 5 5 5 10 25 10 5 125 70 20 250 90 70

Referencer 15 1. Aston, R., Cooper, L., Holder, A.T., Ivanyi, J., og Preece, M.A. (1985). Molecular Immunol, 22 271-275.

2. Aston, R., Holder, A.T., Preece, M.A., og 20 Ivanyi, J. (1986) J. Endocrinol. 110 381-388.

3. Aston, R., Holder, A.T., Ivanyi, J. og Bomford, R. (1987). Molec. Immunol. 2_4 143-150.

25 4. Chard, T. (1987). An Introduction to Radioimmu noassay and Related Techniques. 3. udgave

Elsevier, Amsterdam.

+ 5. Hart, I.C., James, S., Perry, B.N., og Simmonds, 30 A.D., (1984), J. Endocrinol. 103 173-178.

6. Johnstone, A., og Thorpe, R. (1982), Immuno-chemistry in Practice, Blackwells, London.

35 7. Spencer, G.S.G. (1986). Control and Manipulation 27 DK 173981 B1 of Animal Growth. Pp 179-293, Butterworths,

London.

8. Spencer, G.S.G., Garssen, G.J., og Hart, I.C., 5 (1983). Livestock Production Science 1_0 25-37 .

9. Voller, A., Bidwell, D.E. og Bartlett, A.

(1979). The Enzyme Linked Immunosorbent Assay,

Dynatech Europe, Guernsey.

10

Claims (6)

1. 2. Formulering ifølge krav l, kendeteg ne t ved, at peptidet har fra 5 til 20 aminosyrerester .
2. 3. Formulering ifølge krav l, kendetegnet ved, at peptidet er udvalgt blandt følgende 20 peptider: ( a ) NH2-Thr-Tyr-I le-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Thr-Gln-Va1-Ala-Phe-Cys-COOH. (b) Ala-Tyr-11 e~P ro-G lu-G ly-G ln-Arg-Tyr-S er-I le-G ln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys·. 25 (c) Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-Lys-Asn- Ser-Gln-Ala-Ala-Phe-Cysv
3. 4. Formulering ifølge krav 1, kendeteg- 30 net ved, at peptidet er udvalgt blandt følgende peptider: DK 173981 B1 (d) bGh 26-43 (e) bGh 35-43 (f) bGh 37-48 (g) bGh 39-46 5 (h) bGh 43-54 (i) bGh 43-61
4. 5. Formulering ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at pepti-det er bundet til en bærer.
5. 6. Formulering ifølge krav 5, kendeteg - net ved, at peptidet er konjugeret med {a) sig selv, (b) et andet peptid som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 4, (c) en T-celleepitop eller (d) en del af eller hele somatostatinmolekylet.
6. 7. Formulering ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at peptidet, hvad enten det er bundet til en bærer eller ej, er blandet med et adjuvans.