DK173435B1

DK173435B1 - Injicerbare præparater samt fremgangsmåder til potentiering af administrering af et hormon til normale hvirveldyr eller til

Info

Publication number: DK173435B1
Application number: DK198403940A
Authority: DK
Inventors: Roger Aston; Juraj Ivanyi; Andrew Thomas Holder
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1983-08-17
Filing date: 1984-08-16
Publication date: 2000-10-23
Also published as: DK394084A; PH26708A; EP0137234B1; HUT35529A; NZ209246A; EP0137234A2; AU3200084A; DE3483385D1; IE57497B1; IE842114L; JPH06293661A; AU564783B2; HU192989B; DK394084D0; CA1259923A; EP0137234A3

Description

Λ DK 173435 B1

Opfindelsen angår et injicerbart præparat omfattende en farmaceutisk acceptabel steril injicerbar bærer og enten antistoffer til et hormon, bortset fra insulin og EGF, eller (a) et hormon, bortset fra insulin 5 og EGF, og (b) mindst en type antistof til dette hormon, eller det omfatter et potentierende antigenisk "fragment" (som defineret nedenfor) af et sådant hormon. Opfindelsen angår endvidere fremgangsmåder til fremstilling af sådanne præparater samt fremgangsmåder 10 til enten potentiering af hormonadministrering til, eller forøgelse af en hormonreguleret respons hos et "normalt" hvirveldyr (som defineret nedenfor).

Udtrykket "hormon" er defineret som omfattende et hvilket som helst stof, som frigøres i en del af 15 legemet og virker selektivt på mindst én anden del i afstand derfra. Mange sådanne stoffer sekreteres af de endocrine kirtler, eksempelvis sekreteres væksthormon fra hypofysen. Grundlaget for selektiviteten for et eller flere givne mål-væv er tilstedeværelse 20 eller fravær i vævet af receptorer, som binder stoffet specifikt. I tilfælde af proteinhormoner, såsom insulin, findes receptorerne på celleoverfladen. Interferon medvirker ved forsvaret af pattedyr-celler mod virusangreb. Det udskilles ikke af en endocrin kirtel og 25 har ikke den specificitet for mål-væv, som f.eks.

væksthormon har. Alligevel er det et stort glycosyle-ret proteinmolekyle, som bindes til specifikke celleoverflade-receptorer. Der findes også visse lignende stoffer, der har indflydelse på celleaktiviteten ved 30 at bindes til specifikke receptorer på celleoverfladen, f.eks. tumornecrosefaktor og lymfokiner, såsom inter-leukiner. I nærværende beskrivelse anvendes udtrykket "hormon" som omfattende alle sådanne proteiner eller polypeptider (eventuelt glycosylerede) og lignende, 35 som har en celleoverflade-receptor.

2 DK 173435 B1

Det er påvist, at visse antistoffer til insulin og til epidermal vækstfaktor (EGF) forstærker eller efterligner virkningen af disse hormoner in vitro (Y. Schechter et al., Proo. Nat. Acad. Sci. 76(6), 5 2720, (1979) og Y. Schechter et al., Nature 278, 835, (1979)). Det formodes, at dette sker, fordi antistofferne, som er bivalente, bevirker aggregation af hormon-recpetor-komplekserne på celleroverfladen, hvilken aggregation medvirker til at aktivere den anden 10 messenger inde i cellen; monovalente Fab-fragmenter af antistoffer bevirker ikke en sådan forstærkning eller efterligning. Undersøgelserne har alene drejet sig om karakterisering af insulin- og EGF-receptorerne og om identificering af virkningsmåden for sådanne 15 hormoner. Endvidere har ikke alle undersøgelser vist en sådan forstærkning (de Pirro et al., Diabetologia 19, 118 (1980) og Schechter et al., Proc. Nat. Acad.

Sci., 75(12), 5788 (1978)). Det har ikke været antaget, at en sådan forstærkning ville forekomme in vivo, 20 eller at fænomenet er mere almindeligt anvendeligt.

Dannelsen af antistoffer til insulin og andre hormoner in vivo antoges endog at være i høj grad uønsket, da hormon-antistof-komplekserne ville blive fjernet fra legemets immunsystem, og at virkningen af hormonet 25 ikke ville blive forstærket, men tværtimod modvirket -se f.eks. Schwartz J., Endocrinology, 107(4), 877;

Fraisier, Endocrine Reviews 4(2), 155 og Gause et al., Endocrinology 112(5), 1559 angående væksthormon og Blake & Kelch, Endocrinology 109 (6), 2175,angående 30 luteiniserende hormonfrigørende hormon.

Det har nu overraskende vist sig, at administreringen af visse specifikke antistoffer til andre hormoner kan potentiere en administrering af hormonet, forudsat at den epitope specificitet af antistoffet 35 vælges hensigsmæssigt.

3 DK 173435 B1 I overenstemmeIse hermed er det omhandlede inji-cerbare præparat i sine som ovenfor beskrevne to første udførelsesformer ejendommeligt ved, at den epitope specificitet af mindst nogle af antistofferne er valgt så-5 ledes, at præparatet, når det indgives til et hvirveldyr, vil potentiere administrering af hormonet til dette hvirveldyr.

Idet udtrykket "normal” her anvendes til angivelse af et individ, som har en tilstrækkelig endogen mængde 10 af det pågældende hormon for normal funktion af de væv, som reguleres af dette hormon, er den omhandlede fremgangsmåde til potentiering af hormonadministrering til et "normalt" hvirveldyr ejendommelig ved, at man til hvirveldyret ved injektion indgiver et som ovenfor de-15 fineret injicerbart præparat ifølge opfindelsen.

Endelig er fremgangsmåderne til fremstilling af de som ovenfor definerede injicerbare præparater ifølge opfindelsen ejendommelige ved det i den/de kendetegnende del (e) af krav 13, eller krav 13 + krav 14, angivne.

20 Opfindelsen angår fortrinsvis potentiering af aministrering af væksthormon, insulin, thyroidstimu-lerende hormon og interferon.

De kliniske unormaliteter som er resultat af en mangel på et givet hormon, er i mange tilfælde 25 velbeskrevne og vil ikke blive omtalt her. Imidlertid er eksempler herpå (på grund af mangel på væksthormon) hypofysær dværgvækst, Turner's syndrom og cachexia, (på grund af mangel på insulin) diabetes og (på grund af mangel på thyroidstimulerende hormon) cretinisme, 30 struma simplex og myxødem.

Ved antistof "til" et specielt hormon skal forstås et antistof, som vil bindes til dette specielle hormon. F.eks. vil en række antistoffer fremkaldt mod væksthormon (GH) krydsreagere med chorion somatomammo-35 tropin (CS) på grund af den vidtgående sekvens-homologi 4 DK 173435 B1 mellem de to hormoner. Endvidere kan det være muligt at fremkalde antistoffer mod en syntetisk analog af et hormon eller en del af hormonet.

Det skal anføres, at antistofferne ikke nødven-5 digvis behøver at være til det specielle hormon fra de arter, til hvilke præparatet eller fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal anvendes. Fortrinsvis er dette imidlertid tilfældet. Det har vist sig, at ikke alle antistoffer til hormonet vil potentiere 10 administreringen af dette hormon; et antistofs evne til at virke ifølge opfindelsen synes derimod at afhænge af den specifikke determinant (dvs. antigene område) for antistoffet på hormonet. Det vil derfor været klart at polyklonale antistoffer (dvs. en samling 15 af antistoffer med en række determinant-specificiteter) er mindre egnede til anvendelse i præparater eller fremgangsmåder ifølge opfindelsen, end monoklonale antistoffer er. Fagmanden vil efter at have læst denne beskrivelse rutinemæssigt være i stand til at udvælge 20 et monoklonalt antistof, der er egnet til anvendelse ifølge opfindelsen. Blandinger af egnede monoklonale antistoffer kan i nogle tilfælde anvendes. Det er imidlertid også muligt at anvende antisera fra dyr eller mennesker frembragt ved "konventionel" immuni-25 sering, forudsat at den epitope specificitet af antistofferne er som beskrevet. Specielt foretrukne monoklonale antistoffer til væksthormon (GH) og chorion somatomammotropin (CS) er EB01 og EB02. Antistof QB01 foretrækkes til prolactin (PRL).

30 Det har vist sig, at tilstedeværelse af hormonet i dyret er nødvendig for at antistoffet (når det administreres alene) kan virke på den beskrevne måde.

I tilfælde af "normale" individer vil administrering af det valgte antistof alene således have den beskrevne 35 effekt, men f.eks. til individer uden endogen GH, 5 DK 173435 B1 såsom børn med hypofysær dværgvækst, skal endvidere administreres GH, dog ikke nødvendigvis samtidig med antistoffet.

I stedet for at fremstille antistoffet udenfor 5 dyret er det muligt at fremkalde antistoffer med den Ønskede specificitet ved injektion til dyret af et forudvalgt fragment af et egnet væksthormon-molekyle sammen med et adjuvans-stof. Fragmentet skal vælges således, at det kun omfatter den eller de epitoper, 10 til hvilke en eller flere af de hormon-forstærkende antistoffer er specifikke, og kan opnås ved passende spaltning af hormonet eller ved syntese af et peptidfragment (eller en analog til et sådant fragment).

Ved at vælge dele af hormonet, der indeholder mange 15 hydrofile grupper, er det mere sandsynligt, at man opnår eller udvælger et fragment (en "antigen determinant) , som findes på overfladen af hele hormonmolekylet, og som derfor vil krydsreagere med hele molekylet. Ligeledes må fragmentet ikke indeholde det 20 område af hormonet, som binder til celleoverflade-receptoren, eller et område, som bindes til et stof, der bevirker ændring af konformation, således at receptorbinding hindres. Ellers vil de frembragte antistoffer snarere hæmme end forstærke virkningen 25 af hormonet. Ved en vellykket immunisering af denne type vil der således blive dannet en række polyklonale antistoffer med snæver specificitet i det omhandlede dyr, hvorved der opnås, at det ikke er nødvendigt at injicere dyret så hyppigt, som hvis exogene anti-30 stoffer blev administreret passivt. Det vil være klart, at der i stedet for et egentligt fragment kan anvendes et funktionelt fragment, i hvilket de uønskede epitoper af molekylet er til stede, men på en eller anden måde er beskyttet mod tilgængelighed 35 for antistof. Udtrykket "fragment" skal i denne beskrivelse betegne egentlige eller funktionelle fragmenter.

6 DK 173435 B1 I overenstemmelse hermed er den omhandlede fremgangsmåde til forøgelse af en hormonreguleret respons hos et som ovenfor defineret "normalt" hvirveldyr ejendommelig ved, at man til hvirveldyret indgiver et præ-5 parat, som omfatter mindst et forudvalgt antigenisk "fragment" (som defineret ovenfor) af et hormon, bortset fra insulin og EGF, eventuelt sammen med en adju-vans, til frembringelse af potentierende antistoffer til hormonet hos hvirveldyret. Opfindelsen angår også 10 et sådant præparat, idet dette er ejendommeligt ved det i krav 11's kendetegnende del angivne, og idet det kan fremstilles på sædvanlig måde.

I sådanne konventionelle vacciner anvendes ofte immunologiske bærere til forøgelse af 15 immunogeniciteten af antigenet, f.eks. "keyhole limpet haemocyanin" eller tetanus toxoid. Ligeledes medtages ofte adjuvanser til stimulering af immunsysternet, f.eks. aluminiumhydroxid, saponin eller muramyldipeptid.

Sædvanligvis skal ca. 0,001 til 10 ymol antigen være 20 til stede i en enhedsdosis, fortrinsvis ca. 0,01 til 0,05 ymol, skønt det er nemt for en fagmand at vælge en egnet mængde antigen.

I tilfælde af passiv overførsel af antistoffer 4 7 til et hvirveldyr skal administreres 10 -10 , fortrins- C f.

25 vis 10-10 ABT5q enheder antistof i et hvilket som helst egnet sterilt medium, såsom saltvand, i en dosis på 0,01 til 10 ml, fortrinsvis ca. 0,5 ml.

For som eksempel blot at nævne tre hormoner, nemlig GH, CS og PRL, antages præparater 30 ifølge opfindelsen at være egnede til: (a) at fremme opnåelsen af fuld vækst af industrielt vigtige dyr (dvs. husdyr), såsom kvæg, grise og fjerkræ, eller at opnå en sådan vækst med reducerede fodermængder? 35 (b) at forøge væksten af sådanne dyr udover det normale maksimum? 7 DK 173435 B1 (c) at forøge varigheden eller graden af amning hos pattedyr, f.eks. til opnåelse af større mælkeudbytte fra kvæg, eller til at bringe en human moder i stand til at amme sit barn; 5 (d) at forøge mængden af magert kød i forhold til fedt hos husdyr; (e) at forøge væksten af uld, pels eller andre nyttige overfladeprodukter fra dyr, f.eks. får; 10 (f) at behandle et individ med GH-mangel, f.eks.

et barn med dværgvækst, til opnåelse af normal vækst.

I alle tilfælde formodes det, at anvendelsen af præparater og/eller fremgangsmåder ifølge opfindel-15 sen kan bevirke væsentlige omkostnings- og arbejds-besparende fordele sammenlignet med anvendelse af hormonet alene, ikke mindst da forstærkningen af hormonvirkningen forventes at resultere i, at færre administrationer er nødvendige. Endvidere kan forven-20 tes reduktion af eventuelle skadelige rester i kødet eller mælken fra behandlede dyr. Da husdyr ofte rutinemæssigt injiceres med andre vacciner, f.eks. mod mund-og klovsyge, ville det endelig være yderst hensigtsmæssigt at inkorporere et præparat ifølge opfindelsen 25 i en sådan vaccine.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de følgende eksempler.

8 DK 173435 B1

Liste over forkortelser.

hGH “ humant væksthormon hCS ~ humant chorionisk sorTetanairmotropin hPRL - humant prolactin 5 bGH - bovint væksthormon MAB - monoklonalt antistof PBS - phosphatpufret saltvand PMSF - phenylmethylsulfonylfluorid

Ig - immunoglobulin 10 MHC - "major histocompatibility complex" SPRIA - fastfase radioimmunoassay

Wt - vægt til tiden 0 SDS-PAGE - SDS polyacrylamid-gelelektroforese EDTA - ethylendiamintetraeddikesyre 15 RIA - radioimmunoassay

Statistisk vurdering.

Aritmetriske middelværdier og standardafvigelser blev beregnet ved anvendelse af sædvanlige metoder.

20 Forskelle mellem grupper blev fastlagt ved hjælp af uparret StudentTs t-test.

Beskrivelse af figurer.

Figur 1 henviser til eksempel. A og viser vægtforøgelse hos dværgmus med præparater ifølge opfin-25 delsen;

Figur 2 henviser til eksempel C, og viser tilsvarende vægtforøgelse hos normale mus;

Figur 3 henviser til eksempel D og viser vægtforøgelse af duekro; og 30 Figur 4 henviser til eksempel E og viser vægtforøgelse af egernaber.

Praparationseksempler:

Eksempel 1 35 Fremstilling af monoklonalt antistof til humart væksthormon (hGH) .

De ved denne undersøgelse anvendte antistoffer 9 DK 173435 B1 kan fås fra Wellcome Diagnostics, Temple Hill, Dartford,

Kent, U.K. og er velkarakteriserede (Ivanyi, 1982 a b,

Aston and Ivanyi, 1983). BALB/c-Muse-miltceller blev sammensluttet med NSI-myelomaceller og klonet ved 5 sædvanlige fremgangsmåder (Ivanyi and Davis, 1980, 1981). De opnåede antistoffer var alle IgG^ isotype og var ikke-precipiterende, når de blev undersøgt ved dobbelt diffusion i agar. Ved konkurrenceforsøg er fastlagt fire determinanter på hGH (QA68, NA71, EB01 10 og EB02) af hvilke to er fuldstændig fælles med hCS (EBOl og EB02). Imidlertid krydsreagerede ingen af antistofferne med human prolactin. Ingen af antistofferne med human prolactin. Antistofkoncentrationer er udtrykt som ABT^q-værdier, hvilket svarer til den 15 reciprokke antistof-titer, der kræves til opnåelse 125 af 50% binding af 1-hGH ved RIA (Ivanyi, 1982a). Bindingsundersøgelser med proteolytisk modificerede former af hGH antyder, at alle fire determinanter findes Indenfor de første 1-139 rester, og at EBOl 20 determinanten også er til stede i sekvensområdet 146-191 (Aston and Ivanyi, 1983).

Eksempel 2

Fremstilling af Fab'-fragment af EBOl.

25 Ascites globulin (5 mg/ml) af EBOl blev affini tetsrenset på hGH (100 mg) immobiliseret på CNBr-akti-veret Sepharose®. Tilbageholdt materiale blev elueret med glycin-HCl-puffer, pH 2,3, og rørglas indeholdende proteinmateriale blev straks indstillet til pH 7,5 30 med NaOH (1M). Det rensede antistof blev koncentreret til 20 mg/ml (2 ml) og dialyseret mod natriumphosphat-puffer (0,5M, pH 8,0) indeholdende cystein (0,01M) og EDTA (0,002M).

Dette materiale blev behandlet med 0,4 mg papain 35 (BDH) i 4 timer ved 37°C efterfulgt af dialyse mod PBS til fjernelse af cystein og EDTA. Derefter blev dialysatet påført en kolonne af DEAE-cellulose (20 cm x 1,2 cm) og elueret med en lineær gradient bestående af 10 DK 173435 B1 natriumphosphat-puffer (0,005M - 0,3M, pH 8,0). Den første elueringstop fra kolonnen indeholdt ingen "heavy chain"-antistof bestemt ved SDS-PAGE og bibe- -3 holdt en aktivitet på 10 x ABT^q.

5

Eksempel 3

Hormoner,

Human væksthormon anvendt til injektion opnåedes fra lagre af dato-udløbet materiale af klinisk kvali- 10 tet fra Institute of Child Health, London, medens hormon anvendt i forsøg var mere end 99% rent. hGH kan fås fra RIA(UK) Ltd, Washington, Co. Durham U.K.

Radioiodinering af hGH blev udført med lactoperoxidase, hvilket resulterede i en tracer med høj specifik akti- 15 vitet (80 x 106 cpm/g) (Linde et al., 1981). Monomer 125 Ι-hGH blev skilt fra aggregeret materiale før undersøgelse ved Ultrogel®-søjlechromatografi. Antistof-hormon-komplekser til administrering i dyr blev fremstillet ved sammenblanding af opløsningerne 20 il time forud for injektion. I langvarige forsøg, hvor der blev givet Injektioner i adskillige uger, blev komplekserne fremstillet i portioner tilstrækkelige til 1 uge og opbevaret i4°C.

En opløselig ekstrakt blev fremstillet fra 25 egernabe-hypofyse ved homogenisering af vævet i 0,05M natriumbicarbonat 2mM PMSF pH 8,6. Det resulterende homogenisat blev centrifugeret véd 10.000 g i 20 minutter, og supernatenten (20 ml) blev afprøvet.

30 Biologiske eksempler.

Eksempel A

Kumulative vægtforøgelser hos dværgmus behandlet med hGH-EBOl-kompleks.

Dværgmus blev avlet fra normale dyr, som var 35 heterozygote med hensyn til dw-genet, eller fra en heterozygotisk hunmus og en homozygotisk han-dværgmus behandlet med thyroxin. Dværgmusene,som vejede 9,1 io,4g 11 DK 173435 B1 blev anbragt tilfældigt i behandlingsgrupper på seks dyr og derefter fordelt i flere små bure, som hver indeholdt en repræsentant for hver behandlingsgruppe.

Hormoner blev injiceret subkutant i ryggen i 0,1 ml-5 doser i de angivne tidsrum. Vægt blev målt ved starten, i løbet af behandlingen og sommetider efter behandlingen. Vægtforøgelser ved kortvarige forsøg eller de kumulative vægtforøgelser i løbet adskillige dages undersøgelse blev udtrykt som relative værdier (%) i 10 forhold til start-legemsvægtene eller som nettovægte (g). Halelængder blev målt ved fremgangsmåden ifølge Hughes og Tanner (1970).

I løbet af tre uger havde kontrolmus behandlet med phosphatpufret saltvand (PBS) relative vægtforøgel-15 ser på ca. 15% (figur 1). Mus behandlet med 10 yg hGH forøgede deres vægt med 22% i forhold til start-vægten i den samme periode. Imidlertid steg den kumulative vægtforøgelse til 34% ved anvendelse af hGH-EBOl-komplekser, hvilket svarer til en yderligere forøgelse 20 på 12% udover den forøgelse, som blev opnået ved behandling med hGH alene.

Forøgelse af hGH-dosen i komplekset fra 10 yg til 160 yg bevirkede, at vægtforøgelsen steg til 44% af start-legemsvægten. Det fremgår (figur 1), at for-25 skellene mellem behandlede grupper og kontrolgrupper forøgedes progressivt i løbet af forsøgsperioden på 21 dage. Medens hGH-MAB-komplekser bevirkede en væsentlig forøgelse i løbet af 48 timer, blev forskellen mellem grupperne behandlet med hGH alene og kontrol-30 gruppen injiceret med PBS ikke synlig før dag 7.

Eksempel B

Vækstforøgelse med EBOl-Fab'-fragmenter.

Til bestemmelse af, om det at EBOl-antistof 35 er bivalent, var en forudsætning for vækstforøgelse, blev komplekser af EBOl-Fab1-hGH undersøgt for 35 2- deres virkninger på SO^ optagelse dværgmus.

12 DK 173435 B1

Dværgmus indenfor et forholdsvis snævert vægt- område (7-10 g) blev randomiseret ved anvendelse af tabeller med vilkårlige tal (Fisher and Yates, 1957) 35 2- og injiceret med en dosis S04 afhængig af legems-5 vægten (0,5 Ci/g legemsvægt) 24 timer efter den sidste hormon-injektion (Herbai, 1970). Musene blev dræbt 20 timer senere, og brystkasserne blev fjernet, anbragt i kogende vand i 20 minutter, udblødt natten over i mættet natriumsulfat og vasket i ledningsvand i 10 2 timer og destilleret vand i 1 time. Benfraktionen af ribbenene blev derefter sammen med ca. 1 mm påhængende brusk (costochondral-binding) afskåret, hvorved der blev efterladt den costale brusk, som var knyttet til brystbenet. Alt vedhængende blødt væv blev fjernet, 15 og de fem længste stykker costal-brusk, som var forbundet direkte med brystbenet, blev fjernet hele fra hver side af brystkassen og forenet for hvert dyr.

Hver gruppe på 10 costal-bruskstykker blev derefter tørret ved stuetemperatur natten over, vejet og be- 35 2- 20 handlet til bestemmelse af indhold af SO. . Optagel- 35 2- 4 sen af S04 i costal-brusk blev udtrykt som spaltninger pr. minut pr. mg brusk.

Mængderne af sulfatoptagelse af brusk forøget med EBOl eller EBOl-Fab' var ikke væsentlig for-25 skellige, når antistoffet og fragmenter blev sammenlignet med samme ABT5Q-dosis (tabel 1). Imidlertid var væksten, som blev iagttaget i nærværelse af hGH alene væsentlig mindre, end den som blev iagttaget for Fabf-hGH. Forøgelse af valensen af Fab'-fragmentet ved .

30 inkludering af et "andet" enten monoclonalt anti- "light chain"-antistof (TC187) eller polyclonalt anti- muse Ig-antistof ændrede ikke i væsentlig grad op-35 2- tagelsen af S04 . Endvidere hæmmede Fab1-fragmenter ikke kompetetivt den forstærkende virkning af EB01-35 antistof. Fremstilling af komplekser af EBOl med ækvimolære mængder af hGH og hCS formindskede heller ikke graden af forstærkning. Sådanne komplekser ville hovedsagelig omfatte typen hGH-EBOl-hCS, som skulle 13 DK 173435 B1 forventes at have formindsket aktivitet, hvis bivalens var nødvendig, da hCS kun har 10% af hGH’s somatotrope aktivitet. Faktisk resulterede EBOl-hCS-komplekset i væsentlig lavere vækstaktivitet end det tilsvarende 5 kompleks med ftGH.

DK 173435 B1 14

Tabel 1

Virkning af antistof-Fab-fragment-hGH-kompleks på sulfatoptagelse.

5 ___ optagelse

HORMONE Ug) _ANTISTOF Ug)_ dpm/mg * SD

EBOl ' ΑΝΤΙ-MUSE fg" hGH(160) - - 1640 ± 160 10 hGH(160) Ig(ZOO) - 4280 ± 300 hGH(160) Ig(20) - 2500 ±400 hGH(160) Fab(20) - 2700 ± 120* hGH(160) Fab(20) TC187(12) 2300 ± 100 15 hGH(160) Fab(20) R-Poly(5) 2000 ± 100 hGHCl60) Fab(20)+Ig(200) - 4880 ± 190 hCS(160) . !g(200) - 1200 ± 70 hGH(80VhCS(80) IgC200> - ' 3820 ± 250 hGH(80)+hCS(80) Ig(200) R-Poly(5) 4250 ±500 20 PBS - - 600 ± 75

I_^^^_I

25 dværgmus (n = 6) blev injiceret 2 gange med hormon plus antistof (0 og 24 timer) efterfulgt af 35SC>42 (48 timer) og dræbt for undersøgelse efter 72 timer.

TC187 = Monoclonalt anti-muse-L-kædej R-poly = kanin-polyclonal-anti-muse Ig.

30 Xp 0/001 sammenlignet med hGH alene.

Eksempel C

Forøgelse af vækst hos unge BALB/c mus.

Da stimuleringen af vækst hos dværgmus udøves på 35 baggrund af meget langsom aktivitet/ var det af interesse at fastslå om den af antistoffet fremkaldte forøgelse kunne påvises på normale, dvs. hurtigt voksende unge mus. Tre uger gamle BALB/c-mus med en vægt på mellem 15 DK 173435 B1 7 og 10 g blev random!seret og injiceret som beskrevet ovenfor for dværgmus. Vægte blev målt 3 gange pr. uge ved langvarige forsøg. Gruppe 1 modtog PBS 2 gange om ugen under hele forsøget; gruppe 2 fik 160 yg hGH 3 5 gange i løbet af en uge, og gruppe 3 fik det samme 3 gange om ugen i 4 uger; grupperne 4 og 5 fik kompleks af 160 yg hGH/200 yg EB01 3 gange om ugen i henholdsvis 1 eller 4 uger; og gruppe 6 fik daglig injektioner af dette kompleks i 4 uger. Grupperne 10 5 og 6 voksede 31% og 37% mere end kontroller injiceret med PBS {fig. 2). En væsentlig vægtforøgende virkning af hGH-EBOl-komplekser kunne påvises allerede 48 timer efter administrering (tab. 2). Dyr, som modtog 10, 40 eller 160 yg hGH i nærværelse af EBOl udviste 15 væsentlig større vægtforøgelse end dyr, som kun fik hGH.

20 25 30 35 DK 173435 B1 16

Tabel 2

Korttidsvægtforøgelser hos unge BALB/c-mus injiceret med forskellige doser hGH kompleksbundet til EB01-antistof.

5 hGH hGH- Relativ EBD1-- vægtforøgelse p (signifikans) ug Complex

' (160/200^g) % ± SD

10 - - 13.0 i 11.0 16.0 ± 12.0 10 <0.050 + 27.0 ± 6.0 15------- “ 16.0 + 11.0 40 <0.050 + 29.0 + 8.0 - - 13.0+13.0 20 160 ~ <0.025 + 29.0 + 11.0

Tre uger gamle mus (WtQ=8,0 + 1,0) blev injiceret til 25 tiden 0 og 24 timer. Vægtforøgelser udtrykt som % af legemsvægt blev bestemt efter 48 timer.

Eksempel D

Forstærkning af den lactogene aktivitet af hGH.

30 Human væksthormon frembringer en væsentlig lactogen aktivitet som bestemt ved dets virkning på due- kro-sæk eller brystvæv in vivo eller ved dets evne til 125 at fortrænge I-hPEL fra at bindes til mælkekirtel-receptorer. Ved due-krosæk-bioassay-fremgangsmåden 35 måles den lactogene aktivitet af hormonet, og denne bestemmelse svarer til andre mammotrope bestemmelser omfattende enten brystkirtel eller corpus luteum fra rotter eller mus. Hormoner, komplekser eller kontrol- 17 DK 173435 B1 opløsninger blev administreret (0,1 ml) fra kodede flasker intradermalt nær hver halvkro, idet der var fem fugle i hver gruppe. Injektionsprogrammet var enten Λ en administration på dag 1 alene (2 x 10 ABT5Q) eller 5 tre administrationer i løbet af 36 timer (hver på 2 x 10 ABT^q) eller forenet med to yderligere injektioner på dag 2. Fuglene blev dræbt på dag 3, og vådvægten af krosæk-slimhinne med en diameter på 2,5 cm blev bestemt (Nicoll, 1967). Ved administrering af 10 komplekset eller det frie hormon intradermalt nær ved hver af de to enkelte halvkroer er den forstærkende virkning blevet undersøgt under betingelser, der udelukker systemisk hormonfordeling. Vægten af krosæk-slimhinnen efter injektionen af 100 ug hGH i tre doser 15 var ca. 100 mg, medens kontrollen (kun behandlet med PBS eller antistof) vejede 10-13 mg (fig. 3).

Behandling med 10 yg hormon alene frembragte en stigning på 48 mg, men i nærværelse af EBOl eller EB02 forøgedes stigningen af vægten til henholdsvis 108 mg 20 og 80 mg. Som i dværgmus var NA71 uden forstærkende virkning, medens QA68 i væsentlig grad nedsatte slimhindesekretionen. Endvidere forøgede EBOl den lactogene effekt proportionalt i samme udstrækning, uafhængigt af om hormonet blev administreret i en eller tre doser.

25 Imidertid forstærkede EBOl ikke deft lactogene effekt af mættende doser af hGH. Da EBOl ligeledes bindes til hCS undersøgtes også forstærkning af den lactogene aktivitet af dette hormon. Resultaterne viste, at antistof-komplekser roed 10 yg hCS havde fordoblet vægten af 30 krosæk-slimhinden sammenlignet med kontroller, som kun modtog hormonet.

Eksempel E

Forøgelse af vaskst hos egernaber.

35 Den forøgende effekt på enten murinvækst eller reaktion af due-krosask var afhængig af administreringen af exogen hGH, da ingen af de her beskrevne antistoffer krydsreagerede med gnaver-væksthormonet. Imidlertid har det 18 DK 173435 B1 vist sia, at EBOl-antistof blev bundet til egernabe-væksthormon, når det blev afprøvet ved "immunoblot assay". Denne iagttagelse muliggjorde bedømmelsen af forøgelse af vækst af egernaber med EB01 i fravær af 5 exogent administreret hormon (fig. 4). Seksten dyr, som var randomiseret på vægtbasis, blev opdelt i fire grupper, der modtog 0,4 mg hGH alene, hGH (0,4 mg) + EBOl (2 mg), EBOl (2 mg) alene eller PBS tre gange per uge. To søsterdyr måtte fjernes fra forsøget efter en 10 uge på grund af vedvarende vægttab. Dyr behandlet i 44 dage med PBS forøgede deres vægt med 68 g, medens gruppen, som modtog EBOl alene, viste en gennemsnitlig vægtforøgelse på ca, 103 g. Grupper, som modtog hormon alene eller kompleks, havde vægtforøgelser mellem 15 de vægtforøgelser, som blev iagttaget for gruppen, der modtog EBOl alene, og kontrolgruppen. Den relative vægtforøgelse (% over start-legemsvægt) af dyrene, som modtog antistof, var 89%, medens dyrene i kontrolgruppen kun forøgede deres vægt med 61%. Trods kontinuerlig 20 administration af heterologt antistof til egernaberne i 6 uger er bivirkninger, eventuelt af anaphylaktisk oprindelse, endnu ikke iagttaget.

Eksempel F

25 Yderligere forsøg med due-krosæk.

Forsøget med due-krosæk ifølge eksempel D blev gentaget med 1 ug højrenset (prep. L) eller 3 ug QBOl-MAB-affinitetsrenset (prep. R) hPRL alene eller komplekstbundet til en konstant dos is, 2500 ABT^q 30 monoklonale antistoffer. Præparatet af QIBOl-antistoffer svarede til den i eksempel 1 ovenfor beskrevne og er offentliggjort. (Ivanyi & Davies, 1981).

De i tabel 3 anførte resultater viser stærk forøgelse med QBOl-antistof for begge præparater af hPRL.

35 Talene viser gennemsnitsværdier for seks kroer per gruppe samt standardafvigelse.

DK 173435 B1 19

Tabel 3

Antistof Vægt af krosæk (mg)

5__Prepn. L_Prepn. R

QBOL 68,0+30,5 75,0+18,0

Kontrol A (hPKL alene) 22,5 + 14,5 22,0 + 11,0

Kontrol B (ikke injiceret)! 19,5+5,0 ~~

10 Eksempel G

Vækst og sammensætning af dværgmuse-legeme.

Dværg (dw/dw) mus blev opdelt i tre grupper på 18 mus og fodret med 100%, 75% eller 50% af den sædvanlige ad libitum foderindtagelse i 10 dage. I hver 15 diétgruppe blev seks mus behandlet med saltvand, seks med hGH (40 millienheder) og seks med hGH/EBOl-kompleks 4 (10 ABTgQ-antistof). Musene blev undersøgt for totalvækst (S^so^-optagelse i interkostal brusk, sulfat injiceret på dag 9), fedtindhold, vægtforandring og 20 halelængde. Resultaterne er vist i tabellerne 4-7.

Det fremgår, at anvendelse af et hormon/antistof-kompleks kan modvirke en diet med reduceret fodermængde og også reducere den forholdsvise mængde af fedt i et dyr ved fortrinsvis at bevirke vækst af muskler, 2 5 hvilken fordel er endnu mere udtalt i forbindelse med en diæt med nedsat fodermængde.

30 35 DK 173435 B1 20

Tabel 4

Sulfatoptagelse i interkostal brusk.

DIÆT

5__100%__75% 50%

Behandling

Saltvand 2393+_ 695± 540+ _ 315__76__57 10 hGH 5569+ 4492+ · '2958+ 209_ 317 202 hGH+ 1956+_ 5531+_ 4840jf EB01 865 691 668 15 Resultaterne er udtrykt som spaltninger per minut per milligram væv; gennemsnit + S.E.

Tabel 5

Fedtindhold.

20 . - .....— : _DIÆT__ _ 100% : 75%__50% „ Λ 2533 1502 1082

Saltvand +83 +304 +89 25 iGH 1857 ΪΪ73 631 • +130 +127 +152 hGH+ ΪΪ64 733 347 ' EB01 +99 ' +51 +91 30

Talene er mængder af fedt i milligram.

35 DK 173435 B1 21

Tabel 6 Vægtforandring i % af startvægt (startvægt = 100%).

DIÆT

5 100% '·[ " 75½ ' 50%

Behandling 104?67+ 94.5+ 87.83+

Saltvand _ __ ” , ~ , ,, “ 0^95 1,63 ,.4,14 10 ~hGH 119.67+ 107,5+ 91,67+ lt94 1,61 0,8 hGH+ 127.17+ 111,67+ 95;2+ EBQ1 2,12 0;8B 2,52 15

Talene betegner gennemsnit + S.E.

Tabel 7 Længdevækst af hale (forøgelse i millimeter).

20 ------,-»------I - .. I----i _DIÆT _ 100% 75%__50%

Behandling 25 0,96 0,5+ 0,71+

Saltvana . ^ o,19 o,36 “hGH 3,33+ 3,29+ 2,04+ .

__0£___0^47__0,28 hGH+ 5,21+ 4,96+ 4,05+ 30 1 - - 1 - EB01_0,39 0,31_ 0,16

Talene betegner gennemsnit + S.E.

35 DK 173435 B1 22

Eksempel H

Vækst af normale mus.

Forsøget ifølge eksempel C blev gentaget, idet 35 der blev undersøgt for SO^-optagelse i interkostal 5 brusk i stedet for vægstforøgelse. Mus med en alder på 4 uger (vægt 10 g) , 6 uger (14 g) og 9 uger (19 g) blev anvendt og injiceret subkutant med 0,1 ml af enten saltvand, hGH (100 yg) eller hGH-EBOl komplekser (100 pg/104ABT50) to dage før administrering af °SO^.

10 Brusk blev fjernet 24 timer senere. Resultaterne er anført i tabel 8 og viser væsentlig øget vækst med komplekserne (p >0,0005 for de ældste mus).

Tabel 8

15 ~ I

Alder af mus

Behandling 4 uger__6 uger__9 uger

Saltvand 16B6+282 1176+85 505+32 20 hGH j 1621+158 1330+83 j 605+5* nGH/EBOl j 2*31 + 307 j 1738+191 j 1071+85 » . .. . * · / ·«

Enheder: counts/min./milligram brusk.

25 Eksempel I

Anvendelse af polyclonalte antistoffer med reduceret specificitet.

Et 7K (7000 Daltons) fragment blev spaltet fra C-terminalen af hGH med subtilisin, hvorefter det blev 2q chromatograferet under denaturerende betingelser (Aston & Ivanyi 1983) . To mus blev hver injiceret med 50 ug fragmentet emulgeret i Freund's fuldstændige adjuvans men uden en bærer, og 21 dage senere modtog de yderligere 50 yg uden nogen adjuvans. Serum blev 35 udtaget lo dage efter den anden behandling, kompleksbundet med hGH (10 yg) og injiceret i dværgmus.

Den efterfølgende vækst af musene blev bestemt ved 35 måling af SO^-optagelse som ovenfor. Resultaterne - (tabel 9) viser, at denTpolyclonaleantiserum forøgede vækst.

DK 173435 B1 23

Tabel 9 t-·· - -- — „ , --i - - --- 35

Behandling SO^-optagelse (c.p.m./mg brusk' 5 Saltvand 500+50 hGH (10^) 1365+146 hGH plus 4425+703

antiserum I

hGH plus 3272+471

iO

antiserum II > ----- _ --- - 1 _ _ r 24 DK 173435 B1

Eksempel J

Forøgelse af aktivitet af ovin væksthormon.

Monoklonale antistoffer til ovin (dvs. får) væksthormon (oGH) blev fremstillet analogt med frem-5 gangsmåden ifølge eksempel 1, og kan fås fra

Department of Experimental Immunobiology, Wellcome Research Laboratories, Langley Court, Beckenham, Kent, BR3 3BS, UK. Dværgmus, som reagerer på oGH, blev opdelt i grupper på seks og behandlet med 50 yg af 10 hormonet, enten alene eller kompleksbundet til et af fire antistoffer dertil, på to på hinanden følgende 35 dage forud for injektion af SO^. Intercostal brusk blev fjernet 24 timer senere, opløst i myresyre, og radioaktiviteten blev målt. Resultaterne er anført i 15 tabel 10:

Tabel 10 35

Behandling MAB-titer Optagelse af SO^ (gennemsnit + 2Q standardafvigelse? _cpm/mg væv)_ oGH alene - 1411 + 261 oGH + 1D11 H9 1X10“4 5871 + 1339 OGH + 4B62 D9 3,2X10~4 4323 + 671 oGH + 2B 11 4,2X10'"3 3408 + 642 25 oGH + 3B 11 5,6X10~2 3434 + 719

Saltvand - 557 + 79

Eksempel K

Forøgelse af vækst af får.

30 Grupper med to får (gennemsnitsvægt 17 kg) blev behandlet med forskellige doser af anti-oGH-antistof 2B11 (se eksempel J) eller, som kontrol, muse-globulin, to på hinanden følgende dage forud fra for intra- 35 peritoneal injektion af SO. (146 yCi/kg). Firedobbelte 35 4 prøver af intercostal brusk blev fjernet fra hver side 24 timer senere og analyseret som ovenfor. Resultaterne er anført i tabel 11.

35 25 DK 173435 B1

Behandling Optagelse af SO^ (gennemsnit + standardafvigelse; ______cpm/10 mg brusk) ._ 5 106ABTg02Bll 3094 + 630 0,2X10°ABT502B11 5168 + 24 0/04X106ABT5Q2Bll 2373 + 183

Kontrol 2084 + 771 10 Disse resultater, som ved variansanalyse er meget signifikante, viser, at præparater ifølge opfindelsen kan forøge virkningen af endogen GH i en økonomisk betydningsfuld art.

15 Eksempel L

Forøgelse af vækst af får.

Eksempel K blev gentaget, idet der yderligere blev anvendt et andet monoklonalt antistof, lDll H9, og grupper på fem får, gennemsnitsvægt 24 kg.

20 Resultaterne er anført i tabel 12:

Tabel 12 35

Behandling SO^-optagelse (gennemsnit + standardafvigelse; 25 _cpm/10 mg) ._ 8t8X105ABT502Bll 3315 + 560 2X106ABT501D11 H9 2818 + 343

Kontrol immunoglobulin 1908 + 299 30 Signifikant (P 0,05> forøget vækst ses hos grupperne behandlet med MAB.

Eksempel M

Forøgelse af aktivitet af thyroidstimulerende hormon 35 (TSH) .

TSH er et glycoprotein, som produceres af hypofysen og aktiverer skjoldbruskkirtelen hos hvirveldyr. TSH-mangel bevirker indskrumpning af skjoldbrusk-• kirtelen og udfladning af epitheliet. Hos mennesker kan 26 DK 173435 B1 en sådan mangel bevirke cretinisme, simpel struma og en mængde unormale tilstande, der kollektivt er kendt som myxødem. Den kan behandles med jodforbindelser eller skjoldbruskkirtel-ekstrakter. Dværgmus har 5 ringe hypofyseaktivitet, og skjoldbruskkirtelen er indskrumpet. Behandling med TSH hæver serum-T^ niveauerne og bevirker i nogen grad histologisk genoprettelse af skjoldbruskkirtelen.

Et monoklonalt antistof (GC73) til TSH blev 10 fremstillet analogt med eksempel 1 ovenfor og kan fås fra samme sted som anført i eksempel J. GC73 er specifikt for β-kæden i TSH. Dværgmus blev tilfældigt opdelt i grupper på 5 og behandlet som anført i tabel 13 på 5 efter hindanden .følgende dage før analyse 15 af serum for T^-indhold ved radioimmunoassy og mikroskopisk histologisk undersøgelse af skjoldbruskkirtel-væv præpareret i 10% formalin i saltvandsopløsning og derefter indstøbt i voks eller plastik. De målte T^-data er anført i tabel 13; resultaterne blev be-20 kræftet ved mikroskopisk undersøgelse.

Tabel 13

Behandling T^-indhold (gennensnit + 25 _standardafvigelse) .

0,1 internationale enheder TSH 62,8 + 3,7 0,05 enheder TSH 36,4 + 6,3 0,1 enheder TSH+ Ί n6 2 ± 5>3 30 10 “t50GC73 j 0,05 enheder TSH+ 1 104ABT5QGC73 j 72,2 - n'75

Saltvand mindre end 5 10 ABT5QGC73 alene mindre end 5 27 DK 173435 B1

Referencer.

Aston/ R and Ivanyi, J. The EMCO Journal 2 493-497 (1983).

5 Fisher, R.A. and F. Yates (Ed.) "Statistical tables for biological, agricultural and medical research" Oliver0 Boyd (1957).

Herbai G. Acta. Physiol. Scandinavica _80 (1970) 470-491. Hughes, P.C.R. and Tanner, J.M. J. Anatomy 106 (1970) 10 349-370.

Ivanyi J. In: Monoclonal Hybridoma Antibodies:

Techniques and Applications (Edited by Hussell, J.G.R.) CRC press, Cleveland, Ohio (1982) pp 59-79.

Ivanyi J. Mol. Immunol. 1_9 (1982) 1611-1618.

15 Ivanyi. J. and P. Davis. Mol. Immunol. 17 (1980) 287-290. Ivanyi, J. and P. Davis. Protides of the Biological Fluids 29th Colloquium 1981.

Ed. H.· Peeters Pergamon Press, Oxford and New York, 1982.855-860.

20 Linde, S., B. Hausen, A. Lernmark. Analyt Biochem 107 (1980) 165-176.

* Nicoll, C.S. Endocrinology JB0 641-655 (1967) .

Claims

1. Injicerbart præparat omfattende en farmaceutisk acceptabel steril injicerbar bærer og antistoffer til et hormon, bortset fra insulin og EGF, kende- 5 tegnet ved, at den epitope specificitet af mindst nogle af antistofferne er valgt således, at præparatet, når det indgives til et hvirveldyr, vil potentiere administreringen af hormonet til dette hvirveldyr.

2. Injicerbart præparat omfattende en farmaceu- 10 tisk acceptabel steril injicerbar bærer og komplekser af (a) et hormon, bortset fra insulin og EGF, og (b) mindst en type antistof til dette hormon, kendetegnet ved, at den epitope specificitet af mindst nogle af antistofferne er valgt således, at præparatet, 15 når det administreres til et hvirveldyr, vil potentiere administreringen af hormonet til dette hvirveldyr.

3. Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at hormonet er væksthormon, prolactin, chorionisk somatomammotropin eller thyroidstimule- 20 rende hormon.

4. Præparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at hormonet er væksthormon.

5. Præparat ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav, kendetegnet ved, at artti- 25 stoffet er et monoklonalt antistof.

6. Præparat ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof med i det væsentlige samme epitope specificitet som EBOl eller EB02.

7. Fremgangsmåde til potentiering af hormonadmi nistrering til et "normalt" hvirveldyr {som defineret ovenfor), kendetegnet ved, at man til hvirveldyret ved injektion indgiver et præparat ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav. DK 173435 B1

8. Fremgangsmåde til forøgelse af en hormonreguleret respons hos et "normalt" hvirveldyr {som defineret ovenfor), kendetegnet ved, at man til hvirveldyret indgiver et præparat, som omfatter mindst 5 ét forudvalgt antigenisk "fragment" (som defineret ovenfor) af et hormon, bortset fra insulin og EGF, eventuelt sammen med en adjuvans, til frembringelse af potentierende antistoffer til hormonet hos hvirveldyret.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kende tegnet ved, at hormonet er væksthormon, prolactin, chorionisk somatomammotropin eller thyroidstimule-rende hormon.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, k e n -15 detegnet ved, at responsen reguleres af væksthormon.

11. Præparat, kendetegnet ved, at det omfatter et potentierende antigenisk "fragment" (som defineret ovenfor) af et hormon, bortset fra insulin og

20 EGF, sammen med en immunologisk bærer og/eller en adjuvans kombineret med en farmaceutisk acceptabel bærer.

12. Præparat ifølge krav 11, kendetegnet ved, at hormonet er udvalgt blandt væksthormon, prolactin, chorionisk somatomammotropin og thyroidsti- 25 mulerende hormon,

13. Fremgangsmåde til fremstilling af præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter trinene (a) fremstilling af et monoklonalt antistof med be- 30 grænset specificitet til nævnte hormon, (b) bestemmelse af, om antistoffet fra trin (a) po- tentierer aktiviteten af hormonet og, hvis det gør, (c) tilknytning af antistoffet til en steril farma- 35 ceutisk acceptabel bærer.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13 til fremstilling af et præparat ifølge krav 2, kendeteg- DK 173435 B1 net ved, at antistoffet efter trin (b) og før trin (c) kompleksbindes med det nævnte hormon.