DE3851455T2

DE3851455T2 - Biologisch wirksame Moleküle.

Info

Publication number: DE3851455T2
Application number: DE3851455T
Authority: DE
Inventors: Roger Aston; Robert Bomford; Stephen James
Original assignee: Pitman Moore Ltd
Current assignee: SP Veterinary Ltd
Priority date: 1987-03-27
Filing date: 1988-03-25
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2008-03-26
Also published as: PT87080A; KR890700606A; WO1988007547A1; JPH01502753A; ATE111483T1; IE66732B1; BR8806474A; CA1330420C; PT87080B; PH31238A; IE880898L; EP0284406B1; MY103251A; EP0284406A1; ZA882166B; ES2059507T3; NZ224028A; DE3851455D1; AU1496888A; GB8707398D0

Description

Die Erfindung betrifft biologisch aktive Moleküle, insbesondere Peptide.
Viele Polypeptidhormone sind medizinisch oder in der Tierzucht wichtig, insbesondere die Wachstumshormone. Wachstumshormone finden sich in allen Vertebraten, wobei das Wachstumshormon (GH) jeder Art üblicherweise eine geringfügig andere Aminosäuresequenz als die des GHs einer anderen Art besitzt. Allgemein ausgedrückt umfaßt das Molekül eine einzelne lineare Sequenz von etwa 191 Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons (hGH) ist von Choh Hao Li in "Molecular and Cellular Biochemistry", 46, 31-41 (1982) beschrieben. Es ist bekannt, daß Wachstumshormone das Wachstum erhöhen (Somatogenese), die Milchproduktion erhöhen (Lactogenese) und eine insulinartige hypoglykämische Wirkung besitzen.
Aus der EP-A-137 234 (Wellcome) ist bekannt, daß bestimmte Antikörper gegen das Wachstumshormon die Aktivität des ganzen Hormons verstärken können, wohingegen früher allgemein angenommen wurde, daß Antikörper zumindestens in vivo einen Antagonismus gegen die Wirkung des Hormons ausüben würden. Solche verstärkenden Antikörper können in situ durch Impfen des Wirtstieres mit einem geeigneten Fragment eines Wachstumshormons erzeugt werden, so daß eine Klasse von polyclonalen Antikörpern mit beschränkter Spezifität erzeugt wird, die die Aktivität des endogenen Hormons verstärkt. In dieser früheren Druckschrift wird offenbart, daß ein großes (7K) Fragment für einen solchen Zweck geeignet ist.
Es ist auch bekannt, beispielsweise aus der WO84/04915 (Amgen), daß Peptide entsprechend Teilen des GH-Moleküls eine nützliche biologische Aktivität besitzen können, insbesondere bezüglich der Erzeugung der hypoglykämischen Wirkungen bei gleichzeitiger Verabreichung mit exogenem Insulin. Die WO84/04915 lehrt jedoch nicht die Verabreichung solcher Peptide zum Zwecke der Antigenbildung, da die Aufgabe der Verabreichung gemäß der WO84/04915 nicht die Erzeugung von Antikörpern gegen das Peptid ist.
Es wurde nun gefunden, daß spezielle Teilsequenzen des GH- Moleküls sich besonders zur Erzeugung von Antikörpern, die die Aktivität des Hormons in einem Vertebraten verstärken, eignen. Diese Peptide sind wesentlich kleiner als das vorstehend angegebene 7K-Fragment und können daher leichter und billiger synthetisiert werden.
Die Erzeugung betrifft somit eine pharmazeutische antigene Formulierung, umfassend
ein Peptid mit 5-25 Aminosäureresten, worin ein Teil, der mindestens 45% des Peptids ausmacht, eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 35% der Region, die die Positionen 35-53 des Rinderwachstumshormons umfaßt, oder der entsprechenden Regionen des Wachstumshormons von Vögeln, Lachs oder Schweinen entspricht;
oder eine Variante des Peptids, enthaltend eine oder mehrere Deletionen oder konservative Substitutionen, so daß die Tertiärstruktur des Peptids unverändert ist;
und Mittel zur Bereitstellung adjuvanter und Trägerfunktionen.
Die genannten Positionen 35-53 des Rinder- (und Schaf-) GHs lauten:
NH&sub2;-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn- Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cys-COOH.
Bevorzugt besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Peptide weniger als 20 Aminosäurereste. Die Anzahl der Aminosäurereste, die eine strukturelle Homologie mit dem Hormon besitzen und die in den kleinen Peptiden, die erfindungsgemäß verwendet werden, enthalten sind, hängt typischerweise von der Länge des kleinen Peptids ab und kann von einer Sequenz von ein paar Aminosäureresten bis zu einer Sequenz, die im wesentlichen das ganze kleine Peptid umfaßt, variieren. Typischerweise ist die Sequenz der Aminosäurereste mit der strukturellen Homologie mindestens 5 Aminosäurereste lang und bevorzugt mindestens 8-10 Aminosäurereste lang.
Der hier verwendete Ausdruck "verstärken" bedeutet, daß das kleine Peptid direkt oder indirekt auf eine Erhöhung oder Verstärkung der Aktivität des Hormons, mit dem es die strukturelle Homologie besitzt, einwirkt.
Der Ausdruck "konservative Substitution" ist funktionell vorstehend definiert. Beispiele für Substitutionen, die in diesem Zusammenhang konservativ sind, umfassen diejenigen, die im wesentlichen die gleiche Hydrophobie, Größe, Ladung und/oder Aromatizität wie der ursprüngliche Aminosäurerest besitzen. Alle derartigen Substitutionen und Modifikationen sind im allgemeinen einem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie gut bekannt. Beispielsweise umfassen Kandidaten für Substitutionen: Prolin für Glycin und umgekehrt, Alanin oder Valin für Glycin und umgekehrt, Isoleucin für Leucin und umgekehrt, Tryptophan für Tyrosin und umgekehrt, Histidin für Lysin und umgekehrt, Serin für Asparagin und umgekehrt, Arginin für Glutamat und umgekehrt, Threonin für Cystein und umgekehrt, Serin oder Alanin für Threonin und umgekehrt und Glutamin für Asparagin und umgekehrt.
Nachstehend sind Beispiele für Regionen von Nicht-Rinder- GHs, die der 35- bis 53-Region des Rinderwachstumshormons entsprechen, angegeben:

Schwein und Ratte (35-53)

Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Ala- Gln-Ala-Ala-Phe-Cys

Vogel (35-53)

Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-Lys-Asn-Ser- Gln-Ala-Ala-Phe-Cys

Lachs (oder Forelle) (31-49)

Thr-Leu-Leu-Pro-Asp-Glu-Arg-Arg-Gln-Leu-Asn-Lys-Ile-Phe- Leu-Leu-Asp-Phe-Cys
Der Ausdruck "antigen äquivalent" bedeutet, daß das Peptid in einer geeigneten Formulierung zur Erzeugung von Antikörpern in einem Vertebraten verwendet werden kann, wobei die Antikörper so wirken, daß sie die Wirkung des Wachstumshormons in dem Vertebraten verstärken. Insbesondere wurde gefunden, daß Peptide, die geringfügig kürzer oder länger als die Regionen sind, oder die eine wesentlichen Überlappung mit den Regionen zeigen, beispielsweise 30-48 oder 26-43, antigen äquivalent sind. Die Ausdrücke "geringfügig länger", "geringfügig kürzer" und "wesentliche Überlappung" bezeichnen Peptide, bei denen mindestens 45%, (bevorzugt 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 100%) des äquivalenten Peptids mit 35% (bevorzugt 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% und 100%) der 35-53 Regionen überlappen. Insbesondere können antigen äquivalente Peptide, die kürzer als die Fragmente sind, verwendet werden, beispielsweise 35-43 oder 35-48.
Unter spezieller obwohl nicht ausschließlicher Beziehung zu Rinder-GH sind die folgenden Sequenzen bei der Praxis der Erfindung nützlich: 26-43 (Ala-Tyr), 35-43 (Thr-Tyr), 37-48 (Ile-Thr), 39-46 (Glu-Gln), 43-54 (Tyr-Phe) und 43-61 (Tyr- Pro).
Es wurde gefunden, daß die Verwendung eines kleinen erfindungsgemäßen Peptids von einer Art, die sich von dem Tier, dem das Peptid verabreicht werden soll, unterscheidet, vorteilhaft sein kann, beispielsweise die Verabreichung von Schweine-35-53 an Schafe oder Rinder. Variationen von der Sequenz des tiereigenen GHs können eine größere Immunantwort verursachen, während sie noch Antikörper ergeben, die das tiereigene GH erkennen können.
Zusätzlich können Peptide, in denen einer oder mehrere der Aminosäurereste chemisch modifiziert ist bzw. sind, bevor oder nachdem das Peptid synthetisiert wird, verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Funktion des Peptids, d. h. die Erzeugung von spezifischen Antikörpern in vivo, im wesentlichen unverändert bleibt. Solche Modifikationen umfassen die Bildung von Salzen mit Säuren oder Basen, insbesondere physiologisch verträglichen organischen oder anorganischen Säuren und Basen, die Bildung eines Esters oder eines Amids einer terminalen Carboxylgruppe und die Anheftung von Aminosäureschutzgruppen, wie N-t-Butoxycarbonyl. Solche Modifikationen können das Peptid vor dem in vivo-Metabolismus schützen. Die Peptide können als einzelne Kopien oder als Mehrfachkopien, beispielsweise Tandem-Repeats, wie 35- 53+35-53 vorhanden sein. Solche Tandem- oder Mehrfachrepeats können selbst ausreichen antigen sein, so daß die Verwendung eines Trägers überflüssig wird. Es kann vorteilhaft sein, wenn das Peptid als Schleife gebildet ist, wobei die N-terminalen und C-terminalen Enden miteinander verknüpft sind, oder daß ein oder mehrere Cys-Reste an ein Ende gebunden sind, um die Antigenität zu erhöhen und/oder um die Bildung von Disulfidbrücken zu erlauben. Wenn das Peptid covalent an einen Träger, bevorzugt ein Polypeptid, gebunden ist, dann ist die Anordnung bevorzugt derart, daß das erfindungsgemäße Peptid eine Schleife bildet.
Ein zweiter Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein pharmazeutisches antigenes Präparat, umfassend ein oder mehrere irgendwelcher der Peptide des ersten Gesichtspunkts der Erfindung mit Mitteln, die Träger- und adjuvante Funktionen bereitstellen.
Gemäß den gegenwärtigen immunologischen Theorien sollte eine Trägerfunktion in jeder immunogenen Formulierung vorhanden sein, um das Immunsystem zu stimulieren oder die Stimulierung des Immunsystems zu verstärken. Man nimmt an, daß die Träger ein T-Helferzell-Epitop ausbilden (oder zusammen mit dem Antigen ein solches Epitop erzeugen). Die Peptide können beispielsweise durch Vernetzung mit einem getrennten Träger, wie Serumalbuminen, Myoglobinen, bakteriellen Toxoiden und Schnecken-Hämocyanin (KLH) assoziiert sein. Jüngst entwickelte Träger, die die T-Helferzellen bei der Immunantwort induzieren, umfassen das Hepatitis-B-Core- Antigen (auch als Nucleocapsidprotein bezeichnet), vermutliche T-Helferzell-Epitope, wie Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala- Glu-Thr-Thr-Asn, beta-Galactosidase und das 163-171-Peptid von Interleukin-1. Die zuletzt genannte Verbindung kann auf verschiedene Weise als ein Träger oder ein Adjuvans oder als beides betrachtet werden. Alternativ können mehrere Kopien des gleichen oder verschiedener Peptide gemäß der Erfindung miteinander vernetzt sein. Dann gibt es keinen getrennten Träger als solchen, sondern eine Trägerfunktion kann durch eine derartige Vernetzung bereitgestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel umfassen diejenigen, die als solche in den Katalogen von Sigma und Pierce aufgeführt sind, beispielsweise Glutaraldehyd, Carbodiimid und Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, wobei das zuletzt genannte Mittel die SH-Gruppe an dem C-terminalen Cysteinrest der 35-53-Region ausnützt.
Geeignete Adjuvantien sind diejenigen, die auf dem Gebiet der Impfstoffe bekannt sind, z. B. Freundsches komplettes oder inkomplettes Adjuvans, Aluminiumhydroxid, Saponin, DEAE-Dextran, Muramyldipeptid, Mineralöle, Neutralöle (wie Miglyol), Pflanzenöle (wie Erdnußöl), "Iscoms", Liposome, Pluronic Polyole oder das Ribi-Adjuvans-System (vergleiche z. B. die GB-A-2 189 141). "Pluronic" ist ein eingetragenes Warenzeichen.
Das erfindungsgemäße Peptid kann an andere Antigene geknüpft sein, wodurch ein doppelter Effekt erzeugt wird. Beispielsweise kann das Peptid an einen Teil oder die Gesamtheit des Somatostatinmoleküls gebunden werden, um zusätzlich zu den Anti-GH-Antikörpern Anti-Somatostatin-Antikörper zu erzeugen, die das Wachstum fördern würden, oder es kann an einen Teil oder die Gesamtheit eines Moleküls eines Sexualhormons gebunden sein, um die gleichzeitige Immunkastrierung zu erzeugen, oder an einen Teil oder die Gesamtheit des Luteinisierungshormon-Releasinghormons (LHRH) gebunden sein.
Die Peptide und Adjuvantien und/oder Träger können auf jede geeignete Weise formuliert werden, die von dem Fachmann unter Verwendung bekannter oder noch zu entdeckender Abgabeträger oder -kriterien entwickelt wird. Insbesondere können die Formulierungen auf biologisch abbaubaren Polymeren, wie Lactidglycolid-Copolymeren, wie denjenigen, die in der EP- A-58481 (ICI) beschrieben sind, beruhen.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein nicht-therapeutisches Verfahren zur Behandlung eines nichtmenschlichen Vertebraten mit einem vorstehend beschriebenen antigenen Präparat, um beispielsweise das Wachstum des Vertebraten über normale Größen hinaus oder mit einer beschleunigten Geschwindigkeit zu stimulieren, um abnormal niedrige Wachstumsraten auf die Norm zu bringen, um die Milchausbeute zu stimulieren und um andere biologische Wirkungen im Zusammenhang mit GH zu stimulieren oder zu verstärken. Der Anteil von fettarmem Fleisch zu Fett in einem Tier kann auch unter Verwendung solcher Verfahren erhöht werden.
Die erfindungsgemäßen antigenen Präparate werden üblicherweise intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht, obwohl intranasale, transdermale, orale und rektale Wege für die gleichen erfindungsgemäßen Formulierungen geeignet sein können. Die Formulierung ist normalerweise steril und (für die parenterale Verwendung) apyrogen, und eine Einheitsdosis umfaßt typischerweise 1 bis 1000 ug des kleinen erfindungsgemäßen Peptids, typischerweise 10 bis 500 ug, bevorzugt etwa 50 ug oder weniger. Ein oder mehrere wiederholte Immunisierungen können vorteilhaft sein, wie es auf dem Gebiet der Immunologie bekannt ist. Die Formulierungen können im allgemeinen von einem Arzt oder Tierarzt gemäß seinem Können und seiner Erfahrung hergestellt und/oder verabreicht werden.
Die vorstehend erwähnten Peptide können durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese oder durch geeignete Spaltung des nativen GH-Moleküls synthetisiert werden. Die Peptidsynthese kann nach dem allgemeinen Verfahren von Stewart et al., das in "Solid Phase Peptid Synthesis" (W.H. Freeman, San Francisco, 1969) beschrieben ist, oder nach den Verfahren, die von Marglin und Merrifield in Annual Reviews of Biochemistry 39, 841-866 auf 862 (1970) und den folgenden Artikeln beschrieben sind, durchgeführt werden. Etablierte Verfahren der Peptidsynthese mittels der Festphasentechnik oder ähnlicher Techniken sind üblicherweise für eine Produktion im großen Maßstab nicht geeignet (obwohl sie dies in Zukunft werden könnten) und so würde die handelsmäßige Erzeugung der Peptide normalerweise die Züchtung eines geeigneten Organismus, der mit einer Polynucleotidsequenz, die das gewünschte Peptid codiert, transformiert wurde, sein.
Beispiele gemäß der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben. Darin zeigt
Fig. 1 die Ergebnisse eines vorläufigen Experiments mit einer Zwergmaus. Die Balken bezeichnen die l.S.A. mit 6 Tieren pro Behandlung;
Fig. 2 die Ergebnisse eines zweiten Versuchs mit Zwergmäusen, bei dem die Aktivität von IgG (Globulin) aus zwei Schafen 772 (nur 35-53 + FCA) und 775 (35-53, konjugiert an KLH + FCA) mit OA11 bei verschiedenen Immunoglobulinkonzentrationen verglichen wurde.
772 rein = 10,5 mg Protein/ml; 775 = 9,6 mg Protein/ml OA11 = 5 mg Protein/ml. Balken = l.S.A.; n = 6;
Fig. 3 die Ergebnisse eines dritten Experiments mit Zwergmäusen, welches die Aktivität von Globulinen aus verschiedenen Schafen, die alle mit durch Röntgenstrahlen vernetztem 35-53 + FCA (4600, 4609, 4602, 4612, 4610) oder einer negativen Kontrollimmunisierung (4660, 4608) behandelt wurden. Balken = l.S.A., n = 6;
Fig. 4, wie die Antiseren, die gegen b35-53 erzeugt wurden, auf verschiedene Arten an das Rinderwachstumshormon und das Schweinemolekül binden können und in einigen Fällen daran binden. Die Affinität für das zuletzt genannte ist um etwa zehnfach erniedrigt. Die Ergebnisse eines Experiments mit Zwergmäusen sind gezeigt. Balken = l.S.A., n = 6;
Fig. 5 die Ergebnisse eines Versuches mit hypophysektomierten Ratten, welcher, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt wurde, wobei der Gewichtszuwachs der Gruppen (n = 6) an Ratten über die 9tägige Zeitspanne gezeigt ist. Die Balken bedeuten die l.S.A. Alle Behandlungsgruppen erhielten Hormone.
Anti-Rinder 35-53-Antiseren, vereinigt aus 4 immunisierten Schafen, positiv bezüglich der Bindung an Rinderwachstumshormon (RIA),
x Antiseren wie vorstehend aus einem der 4 Schafe
Negative Kontrollantisera,
Monoclonaler Antikörper (behandelt wie die Antiseren) OA15,
Monoclonale Antikörper OA17 (vergleiche Aston et al., 1986);
Fig. 6 das Ergebnis eines weiteren Versuchs mit hypophysektomierten Ratten.
A: Kontroll-Schafimmunglobulin
B: Anti-35-53-Antisera, Schaf 1064, 5 mg/ml.
C: Anti-35-53-Antisera, Schaf 1064, 15 mg/ml netto. Die Balken bedeuten die l.S.A.; n = 6;
Fig. 7 die Ergebnisse eines weiteren Experiments mit hypophysektomierten Ratten, d. h. einen Vergleich von Anti-Peptid-Antikörpern, die entweder an Ovalbumin oder Somatostatin konjugiert sind. Die Balken bedeuten die l.S.A.; n = 6.
Jedes dieser Immunoglobulinpräparate wurde mit Rinderwachstumshormon vor der Verabreichung an die Ratten komplexiert.
Fig. 8 die Ergebnisse eines weiteren Experiments mit hypophysektomierten Ratten, welches zeigt, wie Anti-Rinder-35- 53 auch das Schweinewachstumshormon verstärken kann. Den Ratten wurde nur eine Dosis von 15 mg/Tag, aber mit dem üblichen Gehalt von Anti-Globulin verabreicht. Die Balken bedeuten die l.S.A., n = 6;
Fig. 9 die Ergebnisse eines weiteren Experiments mit hypophysektomierten Ratten, worin die Ratten mit Antipeptid-Antikörpern, die gegen eine Vielzahl von Peptiden, die entweder in Zusammenhang mit Rinder- oder Schweinemolekülen stehen, erzeugt wurden. Alle wurden mit Schweinewachstumshormon vor der Verabreichung an die Ratten komplexiert. Die Balken bedeuten die l.S.A., n = 6.

VERFAHREN

Herstellung der Peptide

Alle Peptide wurden nach dem Fmoc-Polyamid-Verfahren der Festphasenpeptidsynthese synthetisiert.
Ein zeitweiliger Nα-Aminogruppenschutz wird durch die 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe gewährleistet. Die wiederholte Spaltung dieser stark basenlabilen Schutzgruppe wird unter Verwendung von 20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid durchgeführt.
Die Funktionen der Seitenketten werden als ihre Butylether (im Falle von Serin, Threonin und Tyrosin), Butylester (im Falle von Glutaminsäure und Asparaginsäure), Butyloxycarbonylderivate (im Falle von Lysin und Histidin), Tritylderivate (im Falle von Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6- trimethylbenzylsulfonylderivat (im Falle von Arginin) geschützt. Wenn Glutamin oder Asparagin C-terminale Reste sind, wird die 4,4'-Dimethoxybenzhydrylgruppe zum Schutz der Amidofunktionen der Seitenkette verwendet.
Der Festphasenträger beruht auf einem Polydimethylacrylamid-Polymeren, das aus den drei Monomeren Dimethylacrylamid (Rückgrat-Monomeres), Bis-acryloylethylendiamin (Vernetzer) und Acryloylsarcosinmethylester (funktionalisierendes Mittel) besteht.
Das verwendete spaltbar verknüpfte Peptid-Harzmittel ist das säurelabile 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure-Derivat.
Alle Aminosäurederivate werden als ihre vorgebildeten symmetrischen Anhydridderivate zugesetzt, ausgenommen Asparagin und Glutamin, die unter Verwendung eines umgekehrten N,N'-Dicylohexylcarbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol-vermittelten Kopplungsverfahrens angefügt werden.
Alle Reaktionen zur Kopplung und Abspaltung der Schutzgruppe werden unter Verwendung von Ninhydrin-, Trinitrobenzolsulfonsäure oder Isotin-Testverfahren überwacht.
Nach Beendigung der Synthese werden die Peptide von dem Harzträger unter begleitender Entfernung der Schutzgruppen der Seitenkette durch Behandlung mit 95%iger Trifluoressigsäure, enthaltend ein 5%iges Einfängergemisch, gespalten. Die üblicherweise verwendeten Einfänger sind Ethandithiol, Phenol, Anisol und Wasser, wobei die genaue Wahl von den aufbauenden Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptids abhängen. Trifluoressigsäure wird durch Verdampfung im Vakuum entfernt, wobei anschließend mit Diethylether verrieben wird, wodurch das Rohpeptid erhalten wird. Alle vorhandenen Einfänger werden durch ein einfaches Extraktionsverfahren entfernt, das bei Lyophilisation der wäßrigen Phase das Rohpeptid frei von den Einfängern ergibt.
Die Reinigung kann nach irgendeinem oder nach einer Kombination aus einer der Techniken, wie Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie und (im Prinzip) Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, durchgeführt werden.
Die Analyse der Peptide wird unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie, Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse und durch Fast Atom Bombardment (FAB)-Massenspektrometrieanalyse, wie einem Fachmann gut bekannt ist, durchgeführt.

I. SCHAF-EXPERIMENTE: VORVERSUCHE

Verfahren: 1: Herstellung des immunogenen Präparats

Vernetzung mit Schnecken-Hämocyanin (KLH) unter Verwendung von Glutaraldehyd:
10 mg Peptid (Schaf/Rindersequenz 35-53) wurden in 500 ul Dimethylformamid aufgelöst und mit 10 mg Schnecken-Hämocyanin in 400 ul 0,05M Phosphatpuffer pH 7,8 gemischt. 1 ml einer 0,02 M Glutaraldehydlösung in 0,05M Phosphatpuffer mit pH 7,8 wurde tropfenweise im Verlauf 1 Stunde zugesetzt, während bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur weitere drei Stunden lang rühren gelassen und dann gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit pH 7,2 dialysiert.
Die Hälfte des Präparats wurde mit einem doppelten Volumen an Freundschem komplettem Adjuvans vermischt und zwei Schafen an mehreren subkutanen Stellen injiziert. 28 Tage später wurde die zweite Hälfte des Präparats auf ähnliche Weise emulgiert und in Freundschem inkomplettem Adjuvans injiziert. Den Schafen wurden in wöchentlichen Intervallen während der Immunisierung Blut abgenommen, wobei die optimale Antikörperantwort etwa 14 Tage nach der zweiten Immunisierung erhalten wurde.

2. Radioimmunoassay der Schafseren

Die Antikörperbildung durch die Schafe nach der Immunisierung mit dem GH-Peptidfragment 35-53 wurde durch einen direkten Flüssigphasen-Bindungsassay mit ¹²&sup5;I-bGH im wesentlichen wie zuvor beschrieben (Aston et al., 1985) bestimmt.

3. Wachstumsassay

Antiseren gegen das wachstumsverstärkende Peptid (anti-35- 53) wurden auf die Aktivität im Wachstumsmodell mit Zwergmäusen, wie vorstehend beschrieben (Aston et al., 1986; 1987), nach Präparation der γ-Globuline aus den Seren bewertet.

Ergebnisse

Seren von Schafen, die mit Peptiden, die von Rinder/Schaf- GH abgeleitet waren, wurden auf ihre Bindung an ¹²&sup5;1-bGH und ihre Wirkungen auf die Bioaktivität von bGH in vivo getestet. Zwergmäuse, die bGH im Komplex mit anti-35-53-Antiserum erhielten, wuchsen signifikant besser als diejenigen, die mit bGH und Kontroll-Schafglobulin behandelt wurden.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.

II - SCHAFEXPERIMENTE: FORSCHUNGSEXPERIMENTE

Verfahren 1. Konjugation an Ovalbumin oder Schnecken-Hämocyanin (KLH)

1,4 mg Peptid (z. B. Rinder-35-53) wurden in 140 ul Dimethylformamid aufgelöst. 70 ul von 10 mg/ml Ovalbumin oder KLH in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden zugesetzt und gründlich vermischt. 200 ul frisch hergestellten 0,04M Glutaraldehyds wurden langsam unter Rühren im Verlauf einer Zeitspanne von 10 Minuten zugesetzt und dann bei Raumtemperatur weitere 60 Minuten lang stehengelassen. 0,7 ml PBS wurden zugesetzt, und anschließend wurden weitere 100 ul 0,04M Glutaraldehyd wie vorstehend zugesetzt. Das Gemisch wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen, bevor es über Nacht bei +4ºC gegen PBS dialysiert wurde.

2. Vernetzung

1,4 mg Peptid wurden in 140 ul Dimethylformamid aufgelöst, und 170 ul 0,04M Glutaraldehyd wurden wie vorstehend zugesetzt. Ansonsten wurde wie vorstehend vorgegangen. Wenn keine Vernetzung oder Konjugation benötigt wurde, wurde das Peptid in Dimethylformamid aufgelöst, in PBS dispergiert aber nicht dialysiert.

3. Negative Kontrollen

Paralle negative Kontrollen für die vorstehenden Versuche wurden unter Verwendung von keinem Peptid mit Ovalbumin (oder KLH) oder unter Verwendung von Polylysin (Molekulargewicht 1000-2000 Da) und Vernetzung hergestellt.

4. Adjuvantien und Verabreichung - "Freunds"

Nach der Dialyse wurden die Volumina der vorstehenden Präparationen mit PBS auf 4,5 ml aufgefüllt, und Wasser-in-Öl- Emulsionen wurden unter Verwendung von zweier Volumina komplettem Freundschem Adjuvans (FCA) (Difco oder Sigma) hergestellt. Dies wurde durch Beschallung in der Kälte oder unter Verwendung eines Potter-Elvehjen-Homogenisators durchgeführt. Die Emulsionen wurden durch Dispersion (oder Fehlen davon) auf einer Wasseroberfläche getestet. Die Injektionen wurden subkutan an zwei Stellen (eine auf jeder Flanke) in Cheviot-Schafe (9-12 Monate alt, kastrierte Männchen, 30-35 kg) verabreicht. 1 ml wurde auf jeder Seite verabreicht. Eine zweite ähnliche Immunisierung wurde unter Verwendung von frisch hergestelltem Peptid, das in gleicher Weise konjugiert war, aber in inkomplettem Freundschem Adjuvans (FIA) (Difco oder Sigma) emulgiert war, vollendet. Alle anschließenden Immunisierungen waren ähnlich, aber fanden in 28tägigen Intervallen statt.

5. Adjuvans und Verabreichung - Sonstiges

DEAE-Dextran (vollständig hydratisiert über Nacht in zweifach destilliertem Wasser) (Pharmacia), Saponin (Sigma) und Aluminiumhydrogel wurden allein und in Kombinationen verwendet. Nach Dialyse wurden Zugaben von 3,1 ml PBS plus 7 ml 5% DEAE-Dextran (Dd) plus 2,8 ml 5 mg/ml Saponin oder 5,9 ml PBS plus 7 ml 5% Dd; oder 10,1 ml PBS plus 2,8 ml 5 mg/ml Saponin gemacht. Aluminium ("AlOH") wurde in einer Endkonzentration von 1,0 mg/ml, sofern geeignet, verwendet.
Keine Emulgierung wurde benötigt, aber es wurde aufgepaßt, um die Bestandteile in homogener Suspension zu halten. 1 ml wurde dem Schaf, wie vorstehend beschrieben, verabreicht. Die Immunisierungen wurden in den gleichen Intervallen durchgeführt.

6. Blutproben

10 ml Blutproben wurden durch Venenpunktion der Jugularis von den zu testenden Schafen kurz vor jeder Verabreichung und in 3 · wöchentlichen Intervallen danach entnommen. Nach Bildenlassen des Blutgerinsels bei Raumtemperatur (etwa 5 Stunden) wurde das Serum nach der Zentrifugation zum sofortigen Antikörpernachweis-Radioimmunoassay entnommen. Grössere Proben an Serum wurden auf gleiche Weise aus etwa 150 ml Blut entnommen, bei -20ºC für die anschließende Fraktionierung gefroren und in den Wachstumsassays eingesetzt

7. Radioimmunoassay

Die Detektion von Antikörpern gegen Peptide, die auch an Rinderwachstumshormon binden würden, wurde durch die direkte Bindung in der flüssigen Phase, wie vorstehend beschrieben (Aston et al., 1985; Chard, 1987), durchgeführt.

Ergebnisse

Die Tabelle 1 faßt die Ergebnisse aus den Schafexperimenten zusammen und zeigt die Überlegenheit von FCA mit den meisten Konjugaten (oder des Peptids allein) unter Verwendung des Peptids 35-53. Kleine Veränderungen, wie in Schwein-35- 53, das in das Schaf eingebracht wurde, besserten weiterhin die Ansprechrate (ebenso wie den tatsächlichen Titer - nicht gezeigt). Peptide um, aber einschließlich, und innerhalb der 35-53-Sequenz ergaben mindestens mäßiges Ansprechen. Tabelle 1: Radioimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern in Schafseren, die an intaktes Rinderwachstumshormon in der flüssigen Phase binden konnten. Behandlung Konjugat Adjuvans % Ansprechende nach 56 Tagen mit einem Titer von 1/1000 oder mehr (n=5) Rinder-53-53-Variationen Ovalbumin Vernetztes FCA Keines
Die anderen Peptide - alle obigen Rinderpeptide (außer angegeben) waren an Ovalbumin konjugiert und wurden in FCA verabreicht.
46-61 Cys 60
43-53 20
35-43 Cys 20
Schweine 35-53 100
* Außer anders angegeben, wurden die Emulsionen durch Scherkräfte hergestellt.

III - Immunstimulierende Wirkungen

Verfahren

Ein Versuch wurde durchgeführt, um zu zeigen, daß das 35-53 (oder seine analogen und verwandten Sequenzen) an ein anderes Peptid oder Molekül von immunologischem Interesse gebunden werden konnte, und die Antwort auf beide Peptide verbessert werden konnte.
In diesem Zusammenhang und mit besonderer Relevanz für die Rolle der Immunneutralisation in Tieren wurde Somatostatin für erläuternde Zwecke und für die Schwierigkeit bezüglich der Erzeugung wirksamer immunneutralisierender Antikörper (vergleiche Spencer, 1986) ausgewählt.
Unter Verwendung von (1-14) Somatostatin (Sigma) wurde die Konjugation, wie vorstehend beschrieben (II-I), vervollständigt, ausgenommen, daß das Somatostatin nur in einer Konzentration von 4 mg/ml zugesetzt wurde, und daß keine Dialyse bei irgendeiner der Behandlungen durchgeführt wurde. Alle anderen Konjugate wurden, wie vorstehend beschrieben (II-I), hergestellt.
Radioimmunoassays auf Wachstumshormon-bindende Antikörper wurden wie vorstehend (II-7) für Somatostatin wie von Spencer et al. (1983) beschrieben unter Verwendung von ¹²&sup5;I- markiertem Tyr-Somatostatin durchgeführt.

Ergebnisse

Die in Tabelle 2 zusammengefaßten Daten zeigen die übliche Schwierigkeit bei der Erzeugung guter Antikörpertiter gegen Somatostatin, und wie die Vernetzung mit Rinder-35-53 (nicht nur innere Vernetzung) überraschenderweise diese Selbsttoleranz überwindet. Tabelle 2: Radioimmunoassays auf Antikörper gegen intaktes Rinderwachstumshormon und/oder gegen Somatostatin nach einem Immunisierungsverfahren unter Verwendung einer 35-53- Somatostatin-Konjugation. Behandlung % Antikörper-Erzeuger (n=5), welche erkennen bGH Somatostatin vernetztes keines Somatostatin Gebunden an Somatostatin (vgl. Tabelle 1)

IV - Schweineexperiment

Verfahren

1. Allgemein

Die Sequenz 35-53 plus das früher beschriebene T-Zellepitop wurden in Schweine nach Auflösen in Dimethylformamid, Dispergieren in PBS (siehe II-2) und Emulgieren in FIA eingebracht. Keine Konjugation oder Vernetzung wurden bei dieser Sequenz verwendet.
Das so hergestellte Peptid wurde subkutan an vier Stellen in der Nackenregion großen weißen Ferkeln (5 Wochen alt, etwa 9 kg Körpergewicht) verabreicht, so daß 500 ug Peptid pro Schwein erhalten wurden. Eine zweite Immunisierung unter Verwendung eines ähnlichen Präparats wurde 28 Tage später verabreicht. Bei diesem Anlaß wurden alle in FIA verabreicht. Die Blutproben wurden kurz vor dieser Immunisierung und wöchentlich danach durch eine vakuumunterstützte Venenpunktur (Corvac, Sarstedt, UK) der Lungenvene entnommen. Die Seren wurden auf die Antikörpererkennung des Schweinewachstumshormons unter Verwendung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) auf der Basis von Voller 1979 getestet, der anschließend kompetitiv in einem ähnlichen Assay mit einem wasserlöslichen Hormon vernetzt wurde.

2. ELISA

Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten, die zur übereinstimmenden Qualität des Immunoassays behandelt worden waren (Nunc, Immunqualität, hohe Bindungskapazität), wurden unter Verwendung von 50 ug Hormon/ml in einer Konzentration von 5 ug/Kavität (100 ul) in 0,05M Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet und über Nacht bei +4ºC stehengelassen. Die Hormonlösung wurde sorgfältig entfernt und die Kavitäten wurden einmal mit PBS gewaschen. Eine Lösung aus 3% Hämoglobin wurde zugesetzt, um die Kavitäten zu "blockieren" und über Nacht bei +4ºC stehengelassen. Diese wurde entfernt, und die Kavitäten wurden dreimal mit PBS mit einer Konzentration von 0,05% Tween gewaschen. Alle Platten ließ man langsam bei Raumtemperatur trocknen und sie wurden einzeln eingepackt in einem Klebefilm gelagert. Die Testseren wurden jeder der Kavitäten in einer Konzentration von 1/50 und den anschließenden log&sub1;&sub0;-Verdünnungen (100 ul) zugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Diese wurden entfernt, und die Kavitäten wurden dreimal mit PBS gewaschen und durch 100 ul Kaninchen-Anti-Schwein-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma) in einer Verdünnung von 10&supmin;³ ersetzt. Dieses wurde entfernt und wie vorstehend gewaschen. 100 ul p-Nitrophenylphosphat in einer Konzentration von 1,0 mg/ml wurden zugesetzt und die Absorption der Kavitäten wurde unter Verwendung eines Titertek Multiscan Plus 2 mit einem 405 nm- Filter abgelesen.

Ergebnisse

Die Tabelle 3 zeigt, daß das Vorhandensein von Antikörpern, die beschichtetes Schweinewachstumshormon (und dies würde mit dem wasserlöslichen Hormon in Konkurrenz treten) erkannten, in einer Anzahl von Schweinen nachgewiesen werden konnten. Tabelle 3: Anti-pGH-Antikörper in mit dem Peptid immunisierten Schweinen nach 42 Tagen, gemessen mittels der ELISA-Technik. Peptidbehandlung % Positive Tiere Zellepitop
* Verdünnung der Antiseren

V - BIOLOGISCHE ASSAYS AUF GH-AKTIVITÄT

Verfahren

1. Immunoglobulinpräparate

Seren aus größeren Blutproben, die speziellen Tieren (angezeigt durch die Immunoassays) entnommen worden waren, wurden durch Natriumsulfat-Präzipitation (Johnstone & Thorpe, 1982) fraktioniert, um prinzipiell die gamma-Globuline (IgG) zu isolieren, die extensiv gegen PBS dialysiert wurden, bevor sie erneut bei -20ºC eingefroren wurden. Vor der Verwendung in den Tierexperimenten wurden die gereinigten IgG-Fraktionen erneut titriert, um die Wirkungen der Präzipitation, sofern vorhanden, zu überwachen.

2. Zwergmaus

Hierbei wird der Einbau von ³&sup5;SO&sub4;&supmin;&supmin; in den Rippenknorpel einer Zwergmaus (ohne Hirnanhangsdrüse) verwendet, und dieses Verfahren wurde an anderer Stelle beschrieben (Aston et al., 1986).

3. Hypophysektomierte Ratte

Bei diesen Tieren wurde das Fehlen der Hirnanhangsdrüse (Hypophyse) durch chirurgische Entfernung erzeugt. Der Assay zeigt die Gesamtwirkung des Hormons auf das Körpergewicht bei der Ratte ebenso wie auch die zirkulierenden Gehalte an Somatomedin-C an.
Der chirurgische Eingriff an männlichen Wistar-Ratten wurde durch Charles River UK Limited (Margate, Kent, UK) ausgeführt und die Ratten wurden 14 Tage später mit einem Gewicht im Bereich von 125-145 g ausgeliefert. Sie wurden gewogen und weitere 7-10 Tage lang beobachtet, um ein stabiles Körpergewicht und physikalische Eigenschaften (z. B. das Nichtauftreten von Hoden), die guter Gesundheit und einem vollständigen chirurgischen Eingriff entsprechen, zu gewährleisten. Zufriedenstellende Tiere wurden willkürlich zugeordnet, um sechs Tiere pro Behandlungsgruppe zu ergeben. Diesen wurden täglich 0,5 ml PBS, enthaltend etwa 1 mg Schaf-IgG aus der zu untersuchenden Immunisierungsbehandlung (einschließlich negativer Kontrollen) injiziert, welchem 50 ug (ausnahmsweise 10 ug - siehe Ergebnisse) Rinder- oder Schweinewachstumshormon, sofern geeignet, zugesetzt worden waren. Vor der Verabreichung wurden das Hormon und das IgG vermischt und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Injektionen wurden subkutan und intraskapular durchgeführt. Die Tiere wurden gewogen und sie erhielten täglich 8 Tage lang zur gleichen Tageszeit bei jedem Anlaß eine Injektion. Am 9. Tag wurden die Tiere gewogen, abschließend anästhesiert und eine Blutprobe wurde aus der Aorten-Bifurkation entnommen. Das EDTA-Plasma wurde bei -20ºC zur anschließenden Abschätzung der relativen Gesamtgehalte an Somatomedin-C unter Verwendung der vom Nichols Institute bereitgestellten Materialien (San Juan Capistrano, CA 92675, USA) eingefroren.

Ergebnisse

1. Zwergmausmodell

Aus den in den Fig. 2, 3 und 4 zusammengefaßten Daten kann entnommen werden, wie Zwergmäuse, die Wachstumshormon im Komplex mit Schaf-Anti-Rind-(b)35-53-Antiseren erhielten, signifikant größere Mengen an ³&sup5;S (aus Na&sub2;³&sup5;SO&sub4;) in ihre Rippenknorpel einbauten als diejenigen, die mit bGH oder mit dem Kontroll-Schafglobulin behandelt wurden. Dies ergibt sich aus einer Vielzahl von Immunisierungsverfahren und steht im Zusammenhang mit der Antiserenverdünnung vor der Komplexbildung (Fig. 2). Dieses Phänomen kann auch beobachtet werden, wenn ein Antiserum gegen Rinder-35-53, das auch intaktes Schweinewachstumshormon erkennt (obwohl viel schwächer als es das homologe Hormon erkennt), damit komplexiert wird, wenn ein erhöhter ³&sup5;S-Einbau in den Rippenknorpel erfolgt.

2. Modell der hypophysektomierten Ratten

Unter Verwendung eines auf das Wachstum bezogenen Modells kann gesehen werden (Fig. 5-9), daß eine Vielzahl von Antipeptidseren die Aktivität der Rinder- und Schweinewachstumshormone bei Verabreichung an diese chirurgisch modifizierten Ratten verstärkt.
In diesem System sind die Antiseren gegen Peptide, die mit der 35-53-Region in Zusammenhang stehen, aktiv dahingehend, daß sie die Antwort auf das Wachstumshormon verstärken (Fig. 7). Dieses Phänomen überschreitet wie gezeigt die Artbarrieren (Fig. 7), vorausgesetzt, daß die Antiseren an das infragekommende Zielhormon binden. In bestimmten Fällen kann es, wenn die Bindungskapazität oder Affinität begrenzt ist, notwendig sein, das Globulin : Hormonverhältnis einzustellen, um den Anteil der Hormon-Antikörper-Komplexe zu maximieren, wie in Fig. 8 gezeigt ist.

VI - KONJUGATANTIKÖRPER (SOMATOSTATIN)

Verfahren

Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen in vitro-Verfahrens (Hart et al., 1984) wurde die Aktivität der Anti- Somatostatin-Antiseren nach Freisetzung des Wachstumshormons aus den Zellen der Hirnanhangsdrüse von Schweinen (in Primärkultur) gemessen. Weil die Bindungseigenschaften des Wachstumshormons der Antikörper den Assay stören würden, wurden diese durch Passage durch eine Affinitätssäule, an die das Rinderwachstumshormon gebunden worden war, entfernt. Eine aktivierte Sepharose-CNBr-Säule wurde, wie vom Hersteller beschrieben, hergestellt (Pharmacia, Milton Keynes, Bucks, UK).
Somatostatin-14 (Sigma) wurde den Kavitäten in einer Konzentration von 10 ul Immun- (Anti-Somatostatin-Aktivität gemäß RIA) oder Nicht-Immun- (nur Anti-35-53) Schafseren über den Bereich von 5-250 · 10&supmin;¹¹ mol/l zugesetzt, und die Hemmaktivität dieses Peptids auf die Höhen der Wachstumshormonfreisetzung in die Medien wurde bewertet.

Ergebnisse

Tabelle 4 zeigt klar, wie die Hemmaktivität von Somatostatin, das einem Antiserum, das Somatostatin-Antikörper enthielt, zugesetzt wurde, beachtlich verringert wird. So ist es wichtig, darauf hinzuweisen, daß das Antiserum gegen das Rinder-35-53-Somatostatin-Konjugat zwei Populationen an Antikörpern zu enthalten scheint - eine, die an das intakte Rinderwachstumshormon bindet und dessen Aktivität verstärkt, und eine andere, die an das intakte Somatostatin-14 bindet und es neutralisiert.
Tabelle 4 Wirkung von Somatostatin auf die Zellen der Hirnanhangsdrüse von Schafen, gezüchtet in einer Primärkultur, wie von Hart et al., 1984, beschrieben. Somatostatinspiegel Mittlere prozentuale Hemmung der GH-Freisetzung Antiseren Anti-Somatostatin-Antiseren

Literaturstellen

1. Aston, R., Cooper, L., Holder, A.T., Ivanyi, J., und Preece, M.A. (1985). Molecular Immunol. 22 271-275.
2. Aston, R., Holder, A.T., Preece, M.A., und Ivanyi, J. (1986) J. Endocrinol. 110 381-388.
3. Aston, R., Holder, A.T., Ivanyi, J. und Bomford, R. (1987). Nolec. Immunol. 24 143-150.
4. Chard, T. (1987). An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques. 3. Auflage Elsevier, Amsterdam.
5. Hart, I.C., James, S., Perry, B.N., und Simmonds, A.D., (1984). J. Endocrinol. 103 173-178.
6. Johnstone, A., and Thorpe, R. (1982). Immunochemistry in Practice, Blackwells, London.
7. Spencer, G.S.G. (1986). Control and Manipulation of Animal Growth. Pp 179-293, Butterworths, London.
8. Spencer, G.S.G., Garssen, G.J., und Hart, I.C., (1983). Livestock Production Science 10 25-37.
9. Voller, A., Bidwell, D.E. and Bartlett, A. (1979). The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Europe, Guernsey.

Claims

1. Pharmazeutische antigene Formulierung, umfassend ein Peptid mit 5 bis 25 Aminosäureresten, worin ein Teil, der mindestens 45% des Peptids bildet, eine Aminosäuresequenz entsprechend mindestens 35% der Region, die die Positionen 35 bis 53 des Rinderwachstumshormons umfaßt,

oder der entsprechenden Regionen des Vogel-, Lachs- oder Schweinewachstumshormons besitzt,

oder eine Variante des Peptids, enthaltend eine oder mehrere Deletionen oder konservative Substitutionen, so daß die Tertiärstruktur des Peptids unverändert ist, und

Mittel zur Bereitstellung adjuvanter und Trägerfunktionen.

2. Formulierung nach Anspruch 1, worin das Peptid 5 bis 20 Aminosäurereste besitzt.

3. Formulierung nach Anspruch 1, worin das Peptid aus den folgenden Peptiden ausgewählt ist:

(b) NH&sub2;-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cys-COOH.

(c) Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln- Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys.

(d) Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-Lys- Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys.

(e) Thr-Leu-Leu-Pro-Asp-Glu-Arg-Arg-Gln-Leu-Asn-Lys- Ile-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Cys.

4. Formulierung nach Anspruch 1, worin das Peptid aus den folgenden Peptiden ausgewählt ist:

(f) bGH 26-43

(g) bGH 35-43

(h) bGH 37-48

(i) bGH 39-46

(j) bGH 43-54

(k) bGH 43-61.

5. Formulierung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin das Peptid an einen Träger gebunden ist.

6. Formulierung nach Anspruch 5, worin das Peptid an (a) sich selbst, (b) ein anderes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, (c) ein T-Zellepitop oder (d) einen Teil oder die Gesamtheit des Somatostatin-Moleküls konjugiert ist.

7. Formulierung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin das Peptid unabhängig davon, ob es an einen Träger gebunden ist oder nicht, mit einem Adjuvans vermischt ist.

8. Nicht-therapeutisches Verfahren zur Veränderung der biologischen Eigenschaften eines nicht-menschlichen Vertebraten, wobei man dem Vertebraten eine Formulierung nach einem der vorausgehenden Ansprüche verabreicht.

9. Verfahren nach Anspruch 8 zur Erhöhung der Somatogenese oder der Lactogenese.