Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft die immunologische Kontrolle von Fett
im Säugetierkörper, insbesondere in nicht-menschlichen Tieren (die
hier einfach als Tiere bezeichnet werden).
2. Beschreibung des Standes der Technik
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Ein Übermaß an Fett bei Tieren wird als nachteilig für eine
Senkung der Produktionskosten und als Gesundheitsrisiko für menschliche
Verbraucher anerkannt. Ein Versuch, die Ablagerung von Fett in Tieren
zu verringern, bestand darin, einen β-Agonisten in das Futter
einzubringen. β-Agonisten begegneten vielen Schwierigkeiten, insbesondere
daß sie die Fleischqualität und deren Bewahrung während einer
Lagerung nachteilig beeinflussen können und daß die Tiere innerhalb einer
kurzen Zeitspanne, nachdem die Verbindung dem Futter entzogen worden
ist, geschlachtet werden müssen. Ein anderer Versuch war die
Verwendung von Wachstumshormonen, wie Rinder-Somatotrophin (BST). Neben
einer Stimulierung der Milchausbeute verbessert BST das Protein: Fett-
Verhältnis und die Futterverwertungseffizienz in Rindern. Obwohl die
Milchindustrie BST als sicher ansieht, war es Gegenstand
beträchtlicher Bedenken von Seiten regulativer öffentlicher Stellen und
Verbrauchergruppen.
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Angesichts dieser Probleme haben als erste D. J. Flint et al.
(International Journal of Obesity 1, 69-77 (1986)) die Idee
aufgeworfen, Antikörper gegen die Plasmamembranen von Adipozyten zu erzeugen
und diese Tieren zu injizieren. Es wurde festgestellt, daß diese
Behandlung die Menge an Fett beträchtlich verringerte und daß diese
Verringerung mehrere Monate andauerte, ohne daß ungünstige Wirkungen
induziert wurden. Die ersten veröffentlichten Berichte, in denen
gezeigt wurde, daß gegen ganze Adipozyten-Plasmamembranen von Ratten
erzeugte rohe Antiseren eine solche Wirkung hatten, stammten von D. J.
Flint, H. Coggrave, C. E. Futter, M. J. Gardner und T. Clarke,
International Journal of Obesity 1, 69-77 (1986) und von D. J. Flint und C. E.
Futter, Annual Report of the Hannah Research Institute, Ayr,
Schottland 1986. Es wurde nicht nur Fett reduziert, sondern es trat eine
Körpergewichtszunahme und eine Verbesserung der
Futterverwertungseffizienz auf. In einem Artikel "Can obesity be controlled" von D. J.
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Flint, C. E. Futter und M. Peaker, News in Physiological Sciences 2,
1-2 (Februar 1987) wird darüber berichtet, daß ähnliche Antikörper
gegen Fettzellen von Schafen und Schweinen erzeugt worden sind und
daß alle in vivo gegen Adipozyten wirksam sind. Ein detaillierterer
Bericht über die Wirkungen einer Behandlung von Ratten mit anti-
Adipozyten-Antikörpern wird von D. Panton, C. E. Futter, 5. Kestin und
D. J. Flint im American Journal of Physiology 258, (Endocrinol. Metab.
21): E985-E989 (1990) gegeben. Siehe auch A. P. Moloney und P. Allen,
Proc. Nutrition Society, July 1988 Meeting, Seite 14. Obwohl J.
Killefer und C. Y. Hu, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 194, 172-176 (1990)
darüber berichtet haben, daß ein monoklonaler Antikörper gegen
Adipozyten-Plasmamembranen vom Schwein erzeugt worden sei, wird
angenommen, daß das Hybridom nicht öffentlich verfügbar ist, und die
Veröffentlichung enthält keinen Nachweis, daß der Antikörper Fettzellen
lysieren würde. J. T. Wright und G. J. Hausman, Int. J. Obesity 14,
395-409 (1990) berichten über die Herstellung von monoklonalen
Antikörpern gegen Schweineadipozyten-Plasmamembranen von zwei Wochen
alten Schweinen. Es wird berichtet, daß die Antikörper Proteine mit
einer relativen Molekülmasse von 77 und 90 kD immunpräzipitieren. Diese
Experimente waren darauf gerichtet, Zelloberflächenantigene zu
identifizieren, die als Marker zum Unterscheiden oder Differenzieren von
Adipozyten nützlich sind.
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J. Killefer und C. Y. Hu, J. Cell. Biochem. 44, 167-175 (1990)
beschreiben ein 64 kD-Protein, das in der Plasmamembran von
Adipozyten und genetisch bedingt mageren Schweinen, nicht jedoch in
Adipozyten von genetisch bedingt fettleibigen Schweinen vorliegt.
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Obwohl einige der vorstehend erläuterten Arbeiten experimentell
die Möglichkeit einer Behandlung einer Fettablagerung in vivo durch
die Verabreichung von anti-Adipozyten-Antikörpern gezeigt haben, ist
es ein Problem, daß die Produktion solcher Antikörper sehr
arbeitsintensiv sein kann. Die Verabreichung der Plasmamembranen selbst als
Antigene könnte in Betracht gezogen werden, wenn sie mit
Trägerproteinen konjugiert oder gekoppelt werden könnten und dadurch
"nichtselbst" gemacht werden könnten. Jedoch wirft die Herstellung von
Plasmamembranmaterial aus Schlachthäusern Schwierigkeiten
hinsichtlich einer Qualitätskontrolle auf. Wenn das oder die für die
Fettverringerung verantwortliche(n) Antigen(e) isoliert und gereinigt werden
könnte(n), wäre der Weg frei für die Herstellung derselben durch eine
DNA-Rekombinationsmethode oder durch Proteinsynthese.
Zusammenfassung der Erfindung
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Nach beträchtlicher Forschungstätigkeit haben die Erfinder aus
Plasmamembranen von Fettzellen vom Schwein Antigene isoliert, clie für
Adipozyten spezifisch zu sein scheinen (zumindest in dem Sinne, daß
sie in vielen anderen Körpergeweben des Tiers nicht nachweisbar sind)
und mit Antikörpern gegen Fettzellplasmamembranen reagieren. Jedoch
erzeugen nicht alle dieser Antigene Antiseren, die tatsächlich in
vivo eine Fettzellablagerung verringern. Nach Tests von Schaf-anti-
Schweinefettzellplasmamembranen an Schweinen in vivo haben die
Erfinder bestimmte Antigene gefunden, die solche Antikörper produzieren
können. Dementsprechend stellt die Erfindung vier isolierte Antigene
bereit, die dadurch definiert sind, daß sie in der Plasmamembran von
reifen weißen Adipozyten vom Schwein anwesend sind, und die in
Schweineleber, -niere, -milz, -hirn, -herzmuskel, -skelettmuskel oder
-lunge oder in Schweineerythrozyten nicht anwesend sind, die mit
gegen diese Adipozyten erzeugten Antiseren reagieren und die bei SDS-
PAGE Proteinbanden erzeugen mit einer relativen Molekülmasse (r.m.m.)
von ungefähr 37 (A), 50 (B), 51 (C) bzw. 121 (D) Kilodalton, wie
anhand von Markern mit einer relativen Molekülmasse von 29, 45, 66, 97,
116 und 205 Kilodalton bestimmt. Diese Werte für die Proteine A, B, C
und D werden als die nächstkommende ganze Zahl ausgedrückt und
unterliegen einem möglichen Fehler von bis zu ungefähr 2,5%.
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12 Kandidatenantigene, bezeichnet als 1a, 1b, 2-6, A-F und H,
die sämtlich potentiell spezifisch für Fettzellen sind, wurden durch
SDS-PAGE unter Schwierigkeiten aufgetrennt. Der einzige Weg, auf dem
bestimmt werden konnte, ob sie eine Fettablagerung verringern würden,
bestand darin, Antikörper zu erzeugen und sie in Schweinen zu testen.
Als Ergebnis dieser Tests wurde bestimmt, daß zumindest A, B, C und D
aktiv sind.
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Die Erfindung stellt auch die Verwendung solcher Antigene und
Antikörper dagegen für die aktive und passive Immunisierung von
Schweinen bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt ein mit Coomassie Blau angefärbtes Gel von durch
SDS-PAGE aufgetrennten Schweineadipozyten-Plasmamembran-Polypeptiden
mit einem Laserdensitometrie-Abtastprofil, welches die Positionen der
Kandidatenantigene zeigt;
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Fig. 2 ist eine Photographie eines Immun-Blots, der die
Wechselwirkung eines Antiserums gegen Adipozytenplasmamembranen mit
Protein
banden, die von verschiedenen Schweinegeweben, einschließlich
Adipozytenplasmamembranen erhalten worden sind, zeigt;
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Fig. 3 zeigt ELISA-Daten für die Reaktivität verschiedener gegen
die Kandidatenantigene erzeugten Antiseren gegenüber ganzen
Adipozytenplasmamembranen;
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Fig. 4 (a) und (b) zeigen Schnitte durch das Rückenfett von
Schweinen, die (a) mit Kontrollantiserum und (b) mit Antikörpern
gegen ganze Adipozytenplasmamembranen behandelt worden sind, wobei die
Verarmung an Fett, die nach einer Zerstörung von Adipozyten auftritt,
veranschaulicht wird; und
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Fig. 5 (a), (b), (c) und (d) sind Photographien von typischen
histologischen Schnitten von Rückenfett, behandelt mit Kontrollserum
(d) bzw. Antikörpern der Erfindung (a, b, c).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die zur Herstellung der Antigene verwendeten Adipozytenmembranen
können von jeder Schweinerasse erhalten werden, da es wahrscheinlich
ist, daß sie zwischen den Rassen hochgradig konserviert sind. Es wird
vorgeschlagen, daß sie von reifen weißen Adipozyten erhalten werden.
Ein reifer Adipozyt ist einer, der morphologisch und biochemisch den
Adipozyten-Phänotyp einschließlich der Gegenwart eines großen
zentralen uniloculären Fetttröpfchens innerhalb der Zelle zeigt. Alle
Bezugnahmen auf "Adipozyten" bedeuten hier reife Adipozyten. Es wird
auch vorgeschlagen, daß die Adipozyten durch ein sanftes Verfahren,
das sie nicht beschädigt und extrazelluläres Material entfernt,
erhalten werden. Es ist festgestellt worden, daß ein Collagenase-Enzym
aus Clostridium histolyticum für eine solche Entfernung besonders
nützlich ist. Man läßt die Zellen dann sich erholen mittels eines
Konditionierschritts einer Inkubation bei einer Temperatur von 37ºC
für eine Zeitdauer von mehreren Stunden, z. B. 2 bis 24 h.
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Die Adipozyten können dann abgetrennt und durch Flotation
gewaschen werden, wobei die schwimmende Adipozytenschicht zurückgehalten
wird, die dann homogenisiert wird, und die Plasmamembranen auf einem
diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten aufgetrennt werden. Es ist
dann erforderlich, entweder nicht-Adipozyten-spezifische Antigene zu
entfernen oder zu identifizieren, welche der in dem Extrakt
vorliegenden Antigene Adipozyten-spezifisch sind. Zu diesem Zweck wird
anderes Schweinegewebe benötigt. Je größer die für diesen Zweck
eingesetzte Anzahl von Gewebearten ist, desto besser sind die Chancen,
Adipozyten-spezifische Antigene zu erhalten. Die Erfinder haben
fest
gestellt, daß es vorzuziehen ist, einen direkten Proteinbanden-Immun-
Blot-Vergleich vorzunehmen, indem man aus verschiedenen
Schweinegeweben hergestellte Plasmamembranextrakte einer SDS-PAGE unterwirft,
Western-Blotting und dann Immun-Blotting von spezifischen Proteinbanden
mit gegen Plasmamembranen von Adipozyten erzeugten Antikörpern
durchführt. Dieser Immunnachweis wurde unter Schwierigkeiten unter Einsatz
von Abtast-Laserdensitometrie ausgeführt. Bei Vergleich der Laser-
Scans von den Adipozytenplasmamembranen mit jenen von anderen Geweben
wurden 12 als Kandidaten in Frage kommende "Adipozyten-spezifische
Antigene" aus den Blots einer großen Anzahl von Proteinen
identifiziert.
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Um ausreichend Material durch dieses Verfahren zu erzeugen,
wurden Präparationen in großem Maßstab mittels SDS-PAGE ausgeführt und
die jeweils eines der 12 Antigene enthaltenden Banden aus den Gelen
ausgeschnitten und dann Proteine daraus elektroeluiert. Gegen die 12
elektroeluierten Produkte wurden Antiseren erzeugt und festgestellt,
daß 10 von diesen immunogen mit ganzen Adipozyten-Plasmamembranen
reagierten. Die Antiseren wurden dann in vivo durch passive
Immunisierung von Schweinen durch lokale Injektionen in Flächen des
Körpers, die beträchtliches subkutanes Fett aufwiesen, untersucht. Die
größten Läsionen, die die Verringerung von Fett anzeigten und aus
dieser Behandlung resultierten, waren jene, die durch anti-ganze
Adipozytenplasmamembranen, anti-Antigen A und anti-Antigen C induziert
wurden, obwohl einige nützliche Ergebnisse mittels der Antigene B und
D erhalten wurden. Die Erfindung umfaßt dementsprechend diese
Antigene. Es wird gegenwärtig angenommen, daß D die schwächste Wirkung
aufweist.
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Die hier gegebene Information ermöglicht es, daß Antigene
identifiziert, isoliert und durch im Stand der Technik wohlbekannte
Verfahren gereinigt werden. Es ist dann möglich, Antikörper durch
herkömmliches Erzeugen von Antiseren oder Produktion monoklonaler
Antikörper durch das Köhler-Milstein-Verfahren und Variationen davon
herzustellen. Immunogene Abschnitte natürlicher Antikörper werden von
dem Umfang des Begriffs "Antikörper", wie er hier verwendet wird,
ebenfalls umfaßt wie auch hybride Mensch-Maus-Antikörper und andere
antikörperähnliche Produkte, die durch DNA-Rekombinationsmethoden
erhalten werden können.
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Die dadurch produzierten Antikörper werden verwendet, um dazu
beizutragen, Antigene aus der Adipozytenmembran durch eine DNA-
Rekombinationsmethode zu identifizieren. Die Herstellung solcher
An
tigene wurde begonnen, indem eine cDNA-Bibliothek hergestellt wurde
aus RNA, erhalten von isolierten Adipozyten unter Verwendung eines
Guanidiniumisothiocyanat-Extraktionsverfahrens (Chomczynski und
Sacchi, Analyt. Biochem. 162, 156-159 [1987]), gefolgt von
Affinitätschromatographie zur Anreicherung von polyA+ RNA (Avid und Leder,
Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 69, 1408-1412 [1972]). Die aus dieser
angereicherten RNA hergestellte cDNA wurde in den
Phagenexpressionsvektor λgt 11 insertiert. Die korrekten Klone werden identifiziert unter
Verwendung entweder der bereits früher erwähnten Antikörper
(Mienendorf et al., Methods in Enzymology 152, 451-457 [1987]) oder
durch Synthetisieren einer Mischung der überaus wahrscheinlich
komplementären Oligonukleotide, wie aus der Aminosäuresequenz der
Antigene und unter Berücksichtigung der normalen DNA-Kodonverwendung
bestimmt, als Sonden. Die so identifizierten und isolierten Klone
können nach Bestätigung ihrer Bindung von Antikörper verwendet werden,
um das Protein von Interesse zu exprimieren.
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Die Hauptverwendung der Erfindung besteht in der Behandlung
einer übermäßigen Fettproduktion in Schweinen. Obwohl sowohl aktive als
auch passive Immunisierung wahrscheinlich eine Wirkung haben werden,
ist aktive Immunisierung bevorzugt, und zu diesem Zweck muß das
Antigen "nichtselbst" gemacht werden, so daß es nicht der Immuntoleranz
des Wirts unterliegt. Dies kann durch jedes beliebige der
herkömmlicherweise ermittelten Methoden, insbesondere durch Konjugation an ein
Trägerprotein, wie Kaninchenserumalbumin oder KLH, erzielt werden. Es
können Epitope des Antigens identifiziert werden, wodurch ermöglicht
wird, daß kürzerkettige Peptide als Immunogene verwendet werden. Die
Erfindung umfaßt diese innerhalb ihres Umfangs. Solche Peptide können
auch in Form von Konjugaten oder anderen komplizierten Strukturen,
wie verzweigten Formen davon, in denen das Peptid auf "Armen" eines
Trägers, wie einem verzweigten Lysin-Kern, präsentiert wird,
verwendet werden.
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Die bevorzugte vorgeschlagene Verabreichungsroute für eine
aktive Immunisierung erfolgt über subkutane Injektion. Es werden
Antigenmengen im Bereich von 1 ug bis 1 g pro Behandlung in Betracht
gezogen, wobei das Tier vorzugsweise nur einmal aus landwirtschaftlichen
Zweckmäßigkeitsgründen behandelt wird. Adjuvantien, wie kleine
Komponenten von komplettem Freund'-Adjuvans, oder Peptide können
eingesetzt werden. Orale oder nasale Routen sind mögliche Alternativen.
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Für eine passive Verabreichung werden die Antikörper
vorzugsweise ohne ein Adjuvans verabreicht, wieder vorzugsweise durch subkutane
Injektion. Andere Routen, wie intraperitoneal oder oral, sind
möglich.
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Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
BEISPIEL
Abschnitt 1
Isolierung von reifen weißen Adipozyten aus Fettgewebe von Schweinen
Methoden
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Aus den folgenden Depots frisch getöteter Schweine wurde
Fettgewebe gesammelt: Kanal, mesenterisch, perirenal und subkutan. Das
gemischte Fettgewebe wurde fein zerkleinert und Collagenase zu 1 mg/ml
in Medium 199 (Gibco Biocult) und 1% normales Schweineserum wurden
zugesetzt (20 ml Medium auf 10 g Gewebe). Das Gewebe wurde bei 37ºC
1,5 h geschüttelt und isolierte Adipozyten durch Filtrieren durch ein
Sieb erhalten. Die Adipozyten wurden dreimal durch Flotation
gewaschen und dann 2 h in Medium 199, das 1% normales Schweineserum
enthielt, bei 37ºC konditioniert. Die isolierten Adipozyten wurden bei -
20ºC bis zur Verwendung gelagert.
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Die auf diese Weise isolierten Zellen erwiesen sich zu mehr als
90% intakt und lebensfähig unter Verwendung von
Standard-Zellebensfähigkeitstests, und es war maximale Immunreaktivität erzielt worden.
Abschnitt 2
Die Isolierung und vorläufige Charakterisierung von
Plasmamembranpräparationen aus konditionierten Schweineadipozyten
Methoden
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Adipozyten, isoliert und konditioniert, wie in Abschnitt 1
beschrieben, wurden für die Herstellung von Plasmamembranen verwendet.
Typischerweise wurden 30 ml Adipozyten mit 30 ml auf Sucrose
basierendem Extraktionsmedium (0,25 M Sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4,
2 mM EDTA, 2 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl-fluorid)), das auf 37ºC
vorgewärmt worden war, gemischt. Die suspendierten Zellen wurden dann
durch Mischen für 3 · 30 s in einem Vortex-Mischer aufgebrochen. Das
fertige homogenisierte Material wurde bei durchschnittlich 1000 g
5 min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die resultierende
untere Phase unterhalb des schwimmenden Pfropfens aus Fett durch
Ansaugen entfernt und auf Eis gehalten. Diese wurde dann bei 100000 g
1 h zentrifugiert. Der Überstand wurde dann entfernt und das Pellet
in 2 ml 50 mM Tris-Puffer unter Verwendung einer Kunststoff-Pasteur-
Pipette resuspendiert. Dann wurde diskontinuierliche
Sucrose-Dichte
gradientenzentrifugation verwendet, um Mitochondrien und andere
Komponenten von den Plasmamembranen zu trennen. Die Membranen wurden von
der 0/32% Sucrose-Phasengrenzfläche entfernt und bei 100000 g 1. h bei
4ºC pelletiert. Das Pellet wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,
resuspendiert und bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert.
Abschnitt 3
Die in Form von Wiederholungsversuchen durchgeführte SDS-PAGE-Analyse
des Musters von Polypeptiden von Schweineadipozyten-Plasmamembranen
Methoden
Herstellung und Elektrophorese analytischer Gele
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Die vorstehend hergestellten Plasmamembranen von
Schweineadipozyten wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung eines linearen
Polyacrylamidkonzentrationsgradienten von 5% bis 15% für das Trenngel
analysiert. Die Gele wurden hergestellt und einer Elektrophorese
unterzogen mittels einer Modifizierung der ursprünglich von Laemmli, Nature
227, 680-685 (1970) erläuterten Vorgehensweise in einer vertikalen
Elektrophoreseeinheit (Atto Corporation) gemäß den Anweisungen des
Herstellers. Die Elektrophorese wurde in 7 · 8 cm-"Minigelen" (0,75
mm dick) ausgeführt. Siehe auch Tume, Lee und Cryer, Comp. Biochem.
Physiol. 80B, 127-134 (1985).
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Protein-Standardverbindungen (Biorad high molecular weight) von
205,.116, 97, 66, 45 und 29 kD wurden 2 h auf 37ºC in Gegenwart eines
gleichen Volumens Auftragspuffers erwärmt. [1,0 ml Sammelgelpuffer,
0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, enthaltend 0,1% (Gew./Vol.) SDS, 400 ul 10%
Glycerol, 200 ul 2-Mercaptoethanol, 100 ul 0,25% Bromphenolblau,.
300 ul destilliertes Wasser]. Schweineadipozyten-Plasmamembranen
wurden auf ähnliche Weise 30 min behandelt. Eine Elektrophorese wurde
bei konstanter Spannung von 150 V ausgeführt. Der verwendete
Elektrodenpuffer war 0,25 M Tris, enthaltend 0,192 M Glycin und 0,1%
(Gew./Vol.) SDS bei pH 8,3.
Färbung und Entfärbung von Gelen
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Gele wurden 1-2 h in 0,125% (Gew./Vol.) Coomassie Brilliant Blue
in 10% (Vol./Vol.) Eisessig, enthaltend 40% Methanol, eingetaucht. Um
Proteinbanden sichtbar zu machen, wurden die Gele dann in wiederholt
ausgetauschter 10%iger (Vol./Vol.) Essigsäure in 30% (Vol./Vol.)
Methanol entfärbt.
Kalibrierung unter Verwendung von Standardverbindungen mit bekannter
relativer Molekülmasse
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Die Beziehung zwischen relativer Molekülmasse und Mobilität
wurde bestimmt, indem analytische Gele mit einer Standardmischung von
vorgefärbten Polypeptiden mit bekannter relativer Molekülmasse
(Biorad high molecular weight), wie vorstehend und in der
"Zusammenfassung der Erfindung" angegeben, beladen wurden. Die relative
Mobilität jedes Polypeptids wurde durch manuelles Ausmessen der Gele
berechnet und gegen log&sub1;&sub0; der Molekülmasse aufgetragen. Es wurde durch
Berechnung mittels Regressionsanalyse festgestellt, daß der Gradient
linear war, was es ermöglichte, relative Molekülmassen unbekannter
Verbindungen durch Interpolation zu bestimmen.
Laserabtastdensitometrie
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Die Gele, zur Sichtbarmachung von Proteinbanden gefärbt und
entfärbt, wurden durch ein Laserabtastdensitometer abgetastet, wodurch
die Intensität (optische Dichte) der Banden in eine Peakhöhe
umgerechnet wird und deren Größe durch die Fläche unter dem Peak
angegeben wird. Tabelle 1 zeigt die relative Molekülmasse der spezifischen
Antigene und die relativen Mengen an Protein, repräsentiert durch
Flächen unter Peaks, die aus dem Kalibrierungsdiagramm bestimmt
wurden. In Fig. 1 der Zeichnungen wurden die SDS-PAGE-Banden dem
Laserdensitometerscan zugeordnet.
TABELLE 1 Relative Molekülmassen und relative Häufigkeit von
Adipozytenantigenen, die für eine Immunisierung von Schafen verwendet
wurden
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Die Standardfehler für A, B, C und D betrugen 2,0, 1, 2, 2, 2 bzw.
2,0%.
Abschnitt 4
Vergleich der Muster von bei Adipozytenplasmamembranen festgestellten
reaktiven Banden mit auf ähnliche Weise behandelten Membranen,
hergestellt aus anderen Schweinegeweben, und die Verwendung solcher
Vergleiche zur Identifizierung von Adipozyten-spezifischen Antigenen der
Adipozytenmembran
Methoden
Herstellung von Schweineplasmamembranen aus anderen Geweben als
Fettgewebe
Sammlung von Geweben
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Andere Gewebe als Fettgewebe wurden aus frisch getöteten
Schweinen herausgeschnitten. Die Proben wurden in kleine Stücke (ungefähr
2 g) geschnitten und in flüssigen Stickstoff eingetaucht, bis sie
vollständig gefroren waren. Das Material wurde dann bei -70ºC bis zur
Verwendung gelagert.
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Blut für die Herstellung von Membranen roter Blutzellen (rbc)
wurde aus der Jugularvene lebender Schweine in heparinisierte
Röhrchen abgenommen.
Herstellung von Gewebeplasmamembranen
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10 g von jedem Gewebe wurden fein zerkleinert, dann wurden 20 ml
Membranextraktionsmedium (MEM), bestehend aus 1,4 g Na&sub2;HPO&sub4;, 81,5 g
Sucrose, 0,83 g EDTA pro Liter, und 20 ul PMSF-Lösung (0,2 M
Stammlösung) zugesetzt. Diese Probe wurde dann homogenisiert unter
Verwendung eines Gewebehomogenisators (Bursts von 3 · 10 s) und das
resultierende homogenisierte Material bei 20000 g 20 min zentrifugiert, um
dichtes partikuläres Material zu entfernen. Der resultierende
Überstand wurde dann bei 100000 g 1 h in einer Sorvall
Combi-Ultrazentrifuge zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 50 mM
Tris/HCl resuspendiert.
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Sucrose-Gradienten wurden in Polypropylenröhrchen durch
Aufeinanderschichten von Lösungen von 32, 36 und 40% Sucrose hergestellt.
Die Pellets, suspendiert in Tris/HCl, wurden dann oben auf den
Gradienten unter Verwendung einer Pasteur-Pipette aufgetragen. Der
hergestellte Gradient wurde dann bei 100000 g 1 h lang zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation war eine diffuse Bande von Material bei
der 0/32% Phasengrenzfläche sichtbar. Diese wurde sorgfältig durch
Ansaugen entfernt und in Tris gewaschen und zu einer geeigneten
Konzentration resuspendiert.
Herstellung von Ghosts roter Blutzellen vom Schwein
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Ghosts von roten Blutzellen vom Schwein (d. h.
enthämoglobinisiert) wurden unter Einsatz des Verfahrens von Raval und Allan,
Biochem. Biophys. Acta 856, 595-601 (1986) hergestellt. Dafür wurden 60
ml frisches Blut in heparinisierte 10 ml-Röhrchen gesammelt und bei
durchschnittlich 2010 g 10 min zentrifugiert. Dann wurde das Plasma
durch Ansaugen entfernt und die zurückbleibenden gepackten roten
Zellen dreimal durch Zugabe von 10 ml isotonischem Tris/HCl-Puffer (50
mM Tris, 150 mM NaCl, 4,2 mM HCl, mit 1 M NaOH auf pH 7,4
eingestellt), gefolgt von einer Zentrifugation bei durchschnittlich 2010 g
für 10 min. gewaschen. Die Zellen wurden dann durch die Zugabe von 10
ml hypotonischem Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris, 4,2 mM HCl, mit 1 M
NaOH auf pH 7,4 eingestellt) lysiert. Die in dieser Lösung
suspendierten Zellen wurden bei Raumtemperatur 10 min stehengelassen und
dann wurde die Mischung bei durchschnittlich 38720 g 10 min
zentrifugiert. Das sedimentierte Material wurde dreimal in dem Lysispuffer
gewaschen. Nach dieser Prozedur waren die Membranen, wenn sie als
Pellet gesammelt wurden, von blaßrosa bis weißer Farbe, wobei wenig
restliches Hämoglobin vorlag.
SDS-PAGE-Immun-Blot-Analyse
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Fig. 2 zeigt das Muster von Banden in verschiedenen
Schweinegewebeplasmamembranen, die mit Schafantikörpern gegen ganze Adipozyten-
Plasmamembranen vom Schwein reagierten, wodurch das hohe Ausmaß an
Reaktivität mit Fettgewebe und die vergleichsweise geringe
Reaktivität mit allen anderen untersuchten Gewebetypen angezeigt wird.
Laserdensitometrie von Immun-Blots von SDS-PAGE-Gelen
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Zuerst wurden (a) Blots von SDS-PAGE-Gelen, die mit Coomassie
Brilliant Blue angefärbt worden waren, und (b) Immun-Blots derselben
Gele gegen Schaf-anti-Schweineadipozytenplasmamembranen, angefärbt
mit 4-Chlor-1-naphthol, unter Verwendung eines verbesserten
Laserdensitometers (Ultroscan XL LKB) abgetastet. Von dem Laserdensitometer
gesammelte Daten wurden unter Verwendung des Gelscan XL-Software-
Pakets analysiert und gespeichert. Dies erlaubte, Vergleiche der
Polypeptidzusammensetzung von mittels SDS-PAGE aufgetrennten Membranen
und von Immun-Blots von Membranpolypeptiden vorzunehmen (s.u.).
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Es wurde festgestellt, daß
Schaf-anti-Schweineadipozytenplasmamembran mit Plasmamembranen, hergestellt aus anderen Schweinegeweben,
wechselwirkte, obwohl in einem überraschend geringen Ausmaß.
Dementsprechend wurde Laserdensitometerabtastung der reaktiven Banden in
Adipozytenplasmamembranen und in Membranen aus anderen Geweben
eingesetzt, um Adipozyten-spezifische Antigene zu identifizieren. D. h.
Immun-Blots von den Gelen ganzer Adipozytenplasmamembranen wurden mit
Immun-Blots von den Gelen von Membranen anderer Gewebe, nämlich
Schweineleber, -niere, -milz, -hirn, -muskel, -lunge und
-erythrozyten (rote Blutghosts), verglichen.
Identifizierung von Adiozyten-spezifischen immunreaktiven
Plasmaproteinen
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Die Muster/Scans reaktiver Proteine aus
Adipozytenplasmamembranen unterschieden sich von den Mustern der Membranproteine von
ande
ren Schweinegeweben und unterschieden sich auch gegenseitig
voneinander. Jedoch zeigte ein näherer Vergleich, daß einige der
immunreaktiven Proteine ähnliche Mobilitäten aufwiesen, obwohl einige mit
spezifischen unterschiedlichen Anfärbungsintensitäten in Bezug zu dem in
Frage stehenden Membrantyp auftraten. Um genau jene Proteine zu
identifizieren, die auf dem Blot definitiv nur in Adipozytenmembranen
vorlagen, wurden die Rf-Werte aller nachgewiesenen Proteine in den
verschiedenen Geweben mit den Rf-Werten der Proteine aus Adipozyten
verglichen. Wenn eines der anderen Gewebe auf dem Blot Proteine
innerhalb von 0,003 Rf-Einheiten eines beliebigen
Adipozytenmembranproteins aufwies, dann wurde angenommen, daß dieses Protein nicht für
Adipozytenmembranen spezifisch ist.
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Dieser Rf-Vergleich wurde für jeden Blot separat ausgeführt,
dann wurden die Rf-Werte von mit Amidoschwarz angefärbten
Molekulargewichtsmarkern von jedem Blot verwendet, um Kalibrierungskurven der
relativen Molekülmasse gegen Rf auf logarithmischem Papier zu
erstellen. Diese Kalibrierungskurven wurden verwendet, um die relativen
Molekülmassen dieser anfänglich identifizierten Adipozyten-spezifischen
immunreaktiven Membrankomponenten festzustellen. Die unter Verwendung
separater Blots bestimmten relativen Molekülmassen der spezifischen
Adipozytenmembranproteine wurden aufgelistet und verglichen. Es wurde
angenommen, daß jene, die auf vier oder mehr Blots identifiziert
wurden, reproduzierbar detektierbare Adipozyten-spezifische
immunreaktive Membrankomponenten waren, die einer weiteren Untersuchung Wert
waren.
Ergebnisse
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Auf diese Weise wurden 12 Adipozyten-spezifische Antigene mit
den in der vorstehenden Tabelle 1 gezeigten relativen Molekülmassen
gefunden. Die Anzahl der vorgenommenen Bestimmungen betrug zwischen 4
und 7 für jedes Antigen. Es wurden Biorad
Niedermolekulargewichtsmarker verwendet.
Abschnitt 5
Herstellung der vorstehend identifizierten Antigene in größerem
Maßstab
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14 · 12 cm-Gele (1,5 mm dick) wurden verwendet, um größere
Proben von Schweineadipozyten-Plasmamembranen aufzutrennen. Die
verwendeten Puffer- und Gellösungen waren wie bei den analytischen Gelen.
Die Gele wurden auf die gleiche Weise hergestellt und einer
Elektro
phorese unterworfen, jedoch in einer größeren Elektrophoreseeinheit.
Sie wurden mit Coomassie-Blau, wie in Abschnitt 3 beschrieben,
angefärbt. Es wurde festgestellt, daß diese Prozedur reproduzierbar war.
Die Banden, aus denen Polypeptide (A-F, H und 1-6) eluiert
werden sollten, wurden aus den Gelen ausgeschnitten und in die
Probenvertiefungen eines elektrophoretischen Konzentrators (Biorad
minielutor) gelegt. Die Proteine wurden in einem Puffer aus 25 mM Tris,
192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,3, auf eine Membran mit einem
Molekülmassenausschluß von 12500 elektroeluiert. Elutionen wurden bei
konstant 100 V 2-3 h vorgenommen. Eluierte Proben wurden unter
Verwendung einer Pasteur-Pipette entfernt.
Abschnitt 6
Entfernung von SDS und Renaturierung von Polypeptiden durch Dialyse
gegen "QAE Sephadex" und nicht-ionisches Detergens
-
Eine Entfernung der hohen Salzkonzentration, die in den
Proteinproben nach der Elution vorlag, und ein Austausch von SDS gegen ein
nicht-ionisches nicht-denaturierendes Detergens "Nonidet P40" wurde
durch Dialyse unter Verwendung einer Modifizierung der Vorgehensweise
von Hjertan, Biochem. Biophys. Acta 736, 130-136 (1983) erzielt.
-
Nach einer Elution, wie vorstehend beschrieben, wurden die
Proben in 6,3 mm-Dialyseschläuche, die man zweimal 10 min in 1 mM EDTA
enthaltendem Wasser ausgekocht hatte, eingefüllt. Sie wurden dann
gegen 5 l 0,2 mM "Nonidet P40", enthaltend 2 g des Anionenaustauschers
"QAE Sephadex" zur Verbesserung der Effizienz der SDS-Entfernung,
dialysiert. Eine Dialyse wurde 25 h bei Raumtemperatur ausgeführt,
wobei die Dialyselösung nach 12 h ausgetauscht wurde.
-
Nach der Dialyse wurden die Proben bei -20ºC gelagert.
Abschnitt 7
Die Verwendung der individuellen elektroeluierten Membrankomponenten
als Immunogene
-
Eluierte Proteine wurden 1 : 2 mit komplettem Freund'-Adjuvans für
die erste Immunisierung und nachfolgend mit unvollständigem Freund'-
Adjuvans gemischt. Immunisierungen erfolgten subkutan in drei
Stellen, 2 in das Hinterteil und 1 in die Schulter vier Wochen nach der
ersten Immunisierung. Nachfolgende Immunisierungen wurde in
zweiwöchentlichen Intervallen durchgeführt.
Abschnitt 8
Die Demonstration einer Antikörperantwort bei Anwendung von ELISA,
wenn jedes der 12 individuellen Antigene als Immunogen verabreicht
wurde
-
Serumproben, die von Schafen gesammelt wurden, denen jedes
Antigen, wie in Abschnitt 7 beschrieben, injiziert worden war, wurden
hinsichtlich ihrer Immunreaktivität mit Adipozytenplasmamembran
(ELISA) oder einer Elektrophorese unterworfenen Proben individueller
Antigene oder ganzer Adipozytenplasmamembranen, elektrogeblottet auf
Immobilon (Immun-Blotting), untersucht.
ELISA
-
Dieser wurde gemäß dem Verfahren von Flint et al. (1986)
ausgeführt. Kurz gesagt wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit
Schweineadipozyten-Plasmamembranen (1 ug/Vertiefung in PBS, pH 7,4)
beschichtet, indem bei 4ºC über Nacht inkubiert wurde, und es wurde
Eselanti-Schaf-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, verwendet, um
eine Antikörperbindung aus den Antiseren, die in Schafen gegen
elektroeluierte Antigenproben erzeugt worden waren, zu detektieren.
Proben, die aus Schafen nach der dritten Injektion von Immunogen (2.
Blutung) stammten, wurden gegen Schafadipozyten-Plasmamembranen
getestet. Antiserum, das von einem Schaf, das vorab mit ganzen
Schweineadipozyten-Plasmamembranen behandelt worden war, gesammelt worden
war, wurde als Positivkontrolle verwendet. Die gegen ganze
Schweineadipozyten-Plasmamembranen erzeugten Antiseren reagierten stark mit
den auf der Platte immobilisierten Membranen wie auch eine Anzahl der
Antiseren gegen spezifische Antigene. Fig. 3 (a) bis (d) zeigt
Auftragungen von vier Sätzen von ELISAs, in denen die Veränderung der
optischen Dichte pro h gegen log&sub1;&sub0; der Verdünnung des gegen jedes der
12 spezifischen Antigene und gegen ganze
Schweineadipozyten-Plasmamembranen erzeugten Antiserums aufgetragen ist. Es wird festgestellt,
daß Antigen 6 überhaupt nicht und F kaum reagierte. Diese zwei wurden
von der weiteren Untersuchung ausgeschlossen.
Abschnitt 9
Entwicklung eines in vivo-Rückenfettests in Schweinen
Die schnelle Untersuchung von Antiseren hinsichtlich Cytotoxizität
für Adipozyten in vivo
-
Die 10 gegen spezifische Antigene erzeugten Antiseren, die eine
positive Reaktion in dem ELISA lieferten, wurden hinsichtlich ihrer
Cytotoxizität gegenüber intakten Schweineadipozyten untersucht. Der
Test umfaßte die Messung der sehr offensichtlichen Läsion, die sich
um die Injektionsstelle eines cytotoxischen Antiserums herum
entwikkelt. Diese Läsionen wurden zuerst beobachtet, wenn Schweine passiv
subkutan mit einem Antiserum, das in Schafen gegen ganze
Schweineadipozyten-Plasmamembranen erzeugt worden war, immunisiert wurden. Kurz
gesagt entwickeln sich nach einer Injektion des Antiserums direkt in
ein subkutanes Fettdepot Bereiche nekrotischen Fettgewebes. Eine
Woche nach der Injektion erscheinen diese Stellen als Bereiche von
nekrotischem Fett- und Entzündungsgewebe. Später degeneriert das
nekrotische Gewebe und nach 8 Wochen erscheint die Stelle normal, enthält
jedoch kein Fett mehr, siehe Fig. 4 (b). Keine derartige Läsion
entwickelt sich um die Injektionsstelle eines Kontrollantiserums herum,
Fig. 4 (a).
-
Schweine im Alter zwischen 6 und 8 Wochen wurden auf einer
Standard-Schweinestarterdiät gehalten. Dann wurden Injektionsstellen mit
einem Markierstift auf der Haut angezeichnet. Diese Stellen, vier pro
Seite, waren 5 bis 10 cm von der Mittellinie und jeweils 10 cm
voneinander entfernt. Bereiche, die bekanntermaßen relativ sehr wenig
subkutanes Fett enthielten, wurden vermieden.
-
Die Antiseren von Schafen, die mit individuellen
Schweineadipozyten-Plasmamembranantigenen immunisiert worden waren, positive
Kontrollantiseren von Schafen, die mit ganzen
Schweineadipozytenplasmamembranen immunisiert worden waren, und negative Kontrollseren von
Schafen, die keine Immunisierung erhalten hatten, wurden auf
identische Weise hergestellt und bei -20ºC gelagert. Vor einer Injektion
wurden die Antiseren aufgetaut und in individuelle Spritzen
aufgezogen und auf Raumtemperatur erwärmt. Eine Mischung gleicher Anteile
der individuellen Testantsseren wurde gleichfalls hergestellt
(ausschließlich der + und -Kontrollantiseren) für einen Vergleich mit
Antiseren gegen die ganze Membran.
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Jedes verwendete Schwein erhielt eine Injektion von jedem der
positiven und negativen Kontrollantiseren. Den verbleibenden 6
Stellen wurden nach dem Zufallsprinzip Testantiseren zugeordnet. Jede
Immunisierung betrug 1 ml, der in das subkutane Fett injiziert wurde.
-
7 Tage nach der Behandlung wurden Schweine nach Fesseln durch
ein Bolzengeschoß geschlachtet, an den Hinterbeinen aufgehängt und
ausgeblutet. Nachdem der gesamte Blutfluß aufgehört hatte, wurde ein
rechteckiger Hautstreifen von 40 cm Breite, der alle
Injektionsstellen und umgebendes Gewebe umfaßte, sorgfältig durch Enthäuten
beginnend am Hinterteil nach unten abgezogen. Dieser wurde an dem
Tierka
daver am Hals hängengelassen (um eine Verwechslung der Stellen zu
vermeiden). Es wurde Sorgfalt darauf verwendet, das subkutane
Fettgewebe mit der Haut zu entfernen.
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Die gesamte Hautfläche wurde hinsichtlich jeglicher Bereiche von
Nekrose und Schädigung untersucht. Große Läsionen waren
offensichtlich und kleine Läsionen waren als Bereich sich gelb färbenden
Gewebes nachweisbar. Die gesamte Hautfläche wurde untersucht und Läsionen
in Zusammenhang mit den Injektionsmarkierungen auf der Haut gefunden.
Nach einer Messung mit Mikrometerschraube und Photographie wurden
Proben von Läsionsgewebe von jeder Stelle und Kontrollproben von
Stellen entfernt von jeder Injektionsstelle entfernt und in
gepufferter Formalin-Kochsalzlösung für eine Histologie gelagert.
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Die Größen der Läsionen, die bei mindestens drei unabhängigen
Studien festgestellt wurden, sind in Tabelle 2 gezeigt. Photographien
werden als Fig. 5 (a) bis (d) bereitgestellt. Fig. 5 (d) zeigt
die Fettzellen in einem Schnitt von einem Kontrolltier, wo die Zellen
ein großes Triglyceridtröpfchen im Zentrum der Zelle gelagert
aufweisen (welches in den Photographien weiß erscheint). Dem
gegenübergestellt werden Fig. 5 (a), (b) und (c), die typisch für die
erfindungsgemäß mit Antiseren gegen Antigene A, B bzw. C behandelten Tiere
sind, in denen die dunklen Flächen Lymphozytenzellen, die das
Fettgewebe infiltrieren, darstellen.
TABELLE 2 Wirkungen von gegen individuelle spezifische Antigene
auf Fettgewebe erzeugten Antiseren in vivo
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Schweine erhielten eine einzelne subkutane Injektion von
Antiserum an verschiedenen Stellen des Rückens. Nach 7 Tagen wurde die
Größe der Stelle der Adipozytenzerstörung bestimmt.
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Die Ergebnisse sind die Mittelwerte, die von mindestens drei
getrennten Experimenten erhalten worden sind.
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Ein Proben bei der Auswertung der Ergebnisse von Tabelle 2
betrifft die effektiven Mengen an erzeugtem Antikörper. Das bei der
Herstellung der spezifischen Antigene eingesetzte
Elektroelutionsverfahren führte wahrscheinlich zu einem gewissen Abbau von Proteinen.
Dementsprechend könnten die Antiseren gegen Komponenten der Antigene
mit höherer relativer Molekülmasse und nicht gegen Vollängen-Proteine
erzeugt worden sein. Dies macht es besonders schwierig, Mengen an
effektivem Epitop sogar mit dem Vorteil der ELISA-Daten zu vergleichen.
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Trotz dieser Beschränkungen war es überraschend, festzustellen,
daß einige Antiseren (anti-A und -B), die stark mit
Adipozytenplasmamembranen im ELISA reagierten, auch in vivo eine Adipozytenlyse
bewirkten, während alle anderen außer C und D, von denen mehrere
mindestens genauso gut im ELISA reagiert hatten, keine
Adipozytenzerstörung hervorriefen (Vergleiche Fig. 3 und Tabelle 2).