DE69738017T2

DE69738017T2 - Verfahren und verwendung eines polypeptids in der sperma-eizellen-bindung zur erhöhung oder verringerung der fertilität

Info

Publication number: DE69738017T2
Application number: DE69738017T
Authority: DE
Inventors: Roy H. Boalsburg HAMMERSTEDT; Palmer G. State College CRAMER; Guy F. State College BARBATO
Original assignee: Penn State Research Foundation
Current assignee: Penn State Research Foundation
Priority date: 1996-01-11
Filing date: 1997-01-06
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2017-01-07
Also published as: BR9707134A; JP2001500102A; US6103483A; EP0876610B1; US6004586A; CA2242347C; CA2242347A1; DE69738017D1; ATE370412T1; EP0876610A4; US5910568A; EP0876610A1; DK0876610T3; USRE39034E1; WO1997025620A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Sperma-Eizellen-Bindungsproteine und ihre Verwendungen.
STAND DER TECHNIK
Unterstützte reproduktive Technologien wie zum Beispiel künstliche Befruchtung sind beim Viehbestand und bei Pferden für fast ein Jahrhundert kommerziell durchgeführt worden und bei Geflügel, Menschen und anderen Spezies fast ein halbes Jahrhundert. Künstliche Befruchtung benötigt eine Samenprobe, die aus Spermatozoen besteht, die durch die Hoden produziert werden und Samenplasma, das durch Epithelzellen der Nebenhoden, Samenleiter und akzessorischen Geschlechtsdrüsen beigesteuert wird. Zusätzlich zu Wasser enthält das Samenplasma zahlreiche Proteine und Glykoproteine, Phospholipide, Lipide, Zucker und andere Kohlenhydrate und Ionen.
Es wurde früh erkannt, dass jene Anteile des Samenplasmas, die aus den Samenleitern und akzessorischen Geschlechtsdrüsen stammen nicht notwendig sind, damit die Spermatozoen fertilisierende Fähigkeiten erlangen oder beibehalten. Darüber hinaus ist für manche Spezies oder für bestimmte Männchen einer Spezies die Retention von Spuren oder geringen Mengen an Samenplasma gemeinsam mit dem Spermium für die Beibehaltung der fertilisierenden Fähigkeit während der Lagerung wünschenswert, wohingegen Samenplasma für andere schädlich ist. Die förderlichen oder schädlichen Wirkungen von Samenplasma auf Sperma wurden zunehmend offensichtlich, als Verfahren entwickelt wurden, um Sperma für mehrere Stunden oder Tage bei 4 bis 22°C, oder für Jahre bei –196°C zu lagern.
Es ist klar geworden, dass bestimmte Proteine oder Glykoproteine, Phospholipide und andere Komponenten von Samenplasma wahrscheinlich durch die Interaktion mit dem Glykocalyx, der die Plasmamembran des Spermas umgibt, locker an Sperma gebunden sein können, oder weniger häufig durch echte Aufnahme in die Plasmamembran. Solche Moleküle könnten an der Bindung von Sperma an Eizellen beteiligt sein. Es ist berichtet worden, dass ein rohes Proteingemisch, das aus menschlichem Sperma durch die Behandlung mit 0,6 M KCl extrahiert wurde, die Zahl an menschlichem Sperma erhöhte, das in vitro an menschliche Zona pellucida band. Jean et al., „Increased Zona-binding Ability After Incubation of Spermatozoa with Proteins Extracted from Spermatozoa of Fertile Semen", J. of Reproduction and Fertility (1995), Bd. 105, Seiten 43-48. Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung wurde dieses Protein jedoch nicht durch Einfrieren von Sperma erhalten und diese Veröffentlichung gibt keinen Hinweise auf die Identität des (der) aktiven Molekül(e)s, des Wirkungsmechanismus, oder der Speziesspezifität. Biochemistry 27, 4557-64 (1988) offenbart die Struktur des gesamten Prosaposin-1.
Das anfängliche Ereignis im Befruchtungsprozess ist die Bindung von einem oder mehreren Spermien an die Eizellenhülle. Die meiste Forschung hat sich auf die Art der Eizellenumhüllung in Säugern konzentriert (Zona pellucida, eine azelluläre Beschichtung außerhalb einer Säuger-Oozyte und Plasmamembran) und die Art der Enzyme oder Glykoproteine auf oder in der Plasmamembran oder des Akrosoms des Spermiums in Säugern und Wirbellosen konzentriert. Wenig Forschung ist über die molekulare Natur von Sperma-Eizellen-Bindung von Vögeln durchgeführt worden, insbesondere was die „Spermien-Seite" der Interaktion betrifft.
In Säugern wird von einem Spermatozoon angenommen, dass es durch eine Reihe von Eizellen-bindenden Proteinen (Liganden), die auf der Oberfläche des Spermatozoons liegen, an die Oocyte bindet, welche mit den geeigneten Mitgliedern einer Reihe an Spermienrezeptoren interagieren, die auf der Hülle der Oocyte liegen, nämlich der Zona pellucida und Oocyten-Plasmamembran.
Sperma-Eizellen-bindende-Proteine werden im Allgemeinen als Transmembranproteine oder Glykoproteine betrachtet, möglicherweise mit enzymatischer Aktivität mit einer extrazellulären Domäne, die mit einem spezifischen Sperma-Rezeptor interagiert. Das Konsensus-Szenario, das entstanden ist, ist eines von sequentieller Bindung (a) lockere Bindung an die Zona pellucida über ein oder mehrere Moleküle, die auf der Sperma-plasmamembran liegen, (b) feste Bindung an die Zona pellucida über (a) Moleküle(s), die auf der Plasmamembran und/oder der akrosomalen Membran liegen und (c) feste Bindung an die Plasmamembran der Oocyte, gefolgt durch Fusion des Spermas und der Eizellen-Plasmamembranen und Eintritt des gesamten Spermatozoon in die Oocyte. Spezies-spezifische Adhäsion zwischen Sperma und Eizellen sind daher auf Komplexe zurückführbar, die zwischen Eizell-bindenden Proteinen auf Spermien und auf komplementäre Sperma-Rezeptoren auf Eizellen gebildet werden. Es wird angenommen, dass Spezies unspezifische Eizellen-bindende Proteine existieren, da die Bindung an Zona-freie Hamster-Oocyten mit Spermien von vielen Spezies stattfindet, aber mindestens ein Spezies-spezifisches Eizellen-bindendes Protein muss auch auf der Sperma-Oberfläche liegen. Bis jetzt ist keine universelle Klasse an Kandidatenmolekülen als die Spezies-unspezifische, lockere Eizellen-bindende-Komponente identifiziert worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes Polypeptid dar (bezeichnet als universelles primäres Sperma-Eizellen-Bindungsprotein oder UPSEBP), welches die anfängliche Bindung von Sperma an Oocytenhüllen gewährleistet und die Verwendungen des Polypeptids. Das erfinderische Polypeptid weist in einer Vielzahl von Vogel und Säugerspezies biologische Aktivität auf und hat aktive Stellen innerhalb der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 12 dargestellt ist, welche:
Eine dieser aktiven Stellen liegt innerhalb des Teiles der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 9 oder Tyr-Pro-Gln-Asg-Arg-X-Arg-Ser-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Ala-Asn, verkörpert ist, wobei X Thr oder Pro ist.
Die Tertiärstruktur von SEQ ID NO: 12 hat Einfluss auf die biologische Aktivität. Verwendungen von synthetischen oder natürlichen Polypeptiden umfassen in vitro die Behandlung von Sperma, um fertilisierende Fähigkeit für manche Proben an aufgetautem kryokonserviertem Sperma wiederherzustellen oder um das fertilisierende Potential von manchem frischem Sperma zu erhöhen, intravaginale Behandlung von Sperma, um die Sperma-Eizellen-Bindung zu erhöhen und die Wahrscheinlichkeit der Fertilisierung zu erhöhen und die Verwendung in einem in vitro Test zur Bestimmung des fertilisierenden Potential des Spermas. Antikörper zu dem Polypeptid sind auch für in vitro Tests nützlich, um mögliche Fertilität von Sperma oder die Anzahl an Sperma-bindenden Stellen auf einer Eizellenhülle zu bestimmen oder in vivo als ein Verhütungsmittel.
Es besteht ein Bedarf für universelles Sperma-Eizellen-Bindungsmaterial in der Verwendung bei der Verstärkung der Fähigkeit von Sperma locker an eine Eizelle zu binden oder bei der Fertilisierung oder bei Verhütungstechniken.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 vergleicht die Menge an Sperma, das vor und nach der Kryokonservierung gebunden ist, behandelt mit UPSEBP und nicht behandeltem frischem Sperma;
2 vergleicht die stärkende Fähigkeit von SGP-1 (Prosaposin) und den Saposinen A, B, C und D, wenn sie zur Behandlung von gefrorenem-aufgetautem Hahnsperma verwendet wurde;
3 vergleicht die Reduktion in der Zahl von Hahnsperma, das nach der Behandlung von Sperma mit polyclonalem Antikörper gegen Ratten SGP-1, Saposine A, B, C und D und einem Teil der intervenierenden Sequenz zwischen Saposin A und Saposin B, gebunden ist;
4 vergleicht die Prozentsätze von Eiern, die fertilisiert wurden (Versuch 1) und ausschlüpften, um ein Küken bereitzustellen (Versuch 2), die durch Hennen gelegt wurden, die mit frischem Sperma, eingefrorenem-aufgetautem Sperma und behandeltem, eingefrorenem-aufgetautem Hahnsperma künstlich befruchtet wurden.
5a zeigt die Fertilität von 20 einzelnen Hähnen als Prozentsatz an gelegten Eiern, die ein lebendes Küken liefern, wenn 18 Hennen/Männchen mit frischem Sperma befruchtet wurden und 18 andere Hennen/Männchen mit behandeltem frischem Sperma aus dem gleichen Ejakulat, mit drei wiederholten Besamungen befruchtet werden.
5b zeigt den Prozentsatz der Fertilitätszunahme, die aus der Behandlung von Sperma mit UPSEBP für die 20 Hähne von 5a resultiert;
6 zeigt eine Auswahl an UPSEBP-Mengen (rohes Extrakt von nativem Protein), welche die Bindungsfähigkeit zu eingefrorenem-aufgetautem Hahnsperma teilweise wiederherstellten;
7a zeigt die Fähigkeit zur Wiederherstellung von Hahn-UPSEBP (natives Protein, das aus Hahn-Sperma extrahiert wurde) und Ratten SGP-1 auf die Bindung von aufgetautem kryokonserviertem Truthahnsperma;
7b zeigt die Fähigkeit zur Wiederherstellung von Truthahn-UPSEBP (natives Protein, das aus Truthahnsperma extrahiert wurde) auf die Bindung von aufgetautem kryokonserviertem Hahnsperma und aufgetautem kryokonserviertem Truthahnsperma;
8 zeigt die Fähigkeit von Hahn-UPSEBP und Truthahn-UPSEBP die Bindung von Truthahnsperma wiederherzustellen, das für 24 Stunden bei 4°C gelagert wurde; und
9 zeigt die Fähigkeit zur Wiederherstellung von Hahn-UPSEBP (natives Protein, das aus Hahnsperma extrahiert wurde) auf die Bindung von aufgetautem kryokonserviertem Hengstsperma.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist eine natives oder synthetisches Polypeptid, das eine Sperma-Eizellen-Bindung bereitstellt und die Verwendungen dieses Polypeptids. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist ein Mitglied der Familie von Proteinen einschließlich Prosaposin (auch als SGP-1 bezeichnet) und Saposinen. Es ist von Prosaposin in menschlichem Samenplasma bei 90 μg/ml berichtet worden und es weist lange Kohlenhydrat-Seitenketten auf. Vier Saposine (A, B, C, D) werden durch proteolytische Spaltung von Prosaposin hergestellt und weisen jeweils Molekulargewichte von ungefähr 15 kDa auf. Die drei verbleibenden intervenierenden Segmente zwischen den Saposinen A, B, C und D haben keine bekannte Funktion. Das Eltern-Prosaposin und die prozessierten Saposine sind in fast jedem untersuchten Gewebe nachgewiesen worden, einschließlich dem Gehirn, Hoden, Herz, Niere, Leber, Milz, Samen und Milk.
Das native Polypeptid dieser Erfindung wurde durch Zentrifugation von Sperma-Suspensionen gereinigt, die in der Anwesenheit von 10 bis 12% Glyzerin eingefroren und aufgetaut wurden, was eine Überstandsfraktion ergab, die durch eine 300 kDa „Cut-Off"-Ultrafiltrationsmembran geleitet wurde. Das Filtrat wurde mit N-Butanol:Diisopropylether extrahiert, um Lipid zu entfernen und eine rohe Proteinpräparation bereitzustellen. Das Hinzufügen von diesem rohen Protein zu einer Suspension von eingefrorenem-aufgetautem Hahnsperma hat seine Fähigkeit gestärkt an die Membran-Präparationen von Hühnereiern zu binden. Der aktive Anteil des nativen Polypeptids wurde in der wässrigen Phase nach der Lipidextraktion konzentriert und hatte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 10 Kilodaltons.
Das aktive Molekül stellte weniger als 0,1% des rohen Proteins dar, das aus den N-Butanol:Diisopropyletherextrakten wiedergewonnen wurde und war in seiner spezifischen Aktivität durch die Verwendung einer G3000-SWXL-Gelfiltrationssäule verstärkt, gefolgt durch C4-Hydrophobizitäts-Chromoatographie.
Danach wird das Molekül, das ursprünglich aus Hahnsperma isoliert wurde, als „universelles primäres Sperma-Eizellen-Bindungsprotein" oder „UPSEBP" bezeichnet. Von der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 (Tyr-Pro-Gln-Asp-Arg-Thr-Arg-Ser-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Ala-Asn) wurde festgestellt, dass sie wie SEQ ID NO: 9 (Tyr-Pro-Gln-Asp-Arg-Pro-Arg-Ser-Gln-Pra-Gln-Pro-Lys-Ala-Asn) und SEQ ID NO: 12
erhebliche Bindungsaktivität verlieh. SEQ ID NO: 12, die SEQ ID NO: 9 enthält, verleiht erhebliche Bindungsaktivität, insbesondere wenn sie oxidiert ist, um ein Molekül zu bilden, das eine Haarnadelform aufweist. Diese Aminosäuresequenzen werden in Tabelle 1 mit den entsprechenden Teilen der Aminosäuresequenzen des ähnlichen Ratten SGP-1 (SEQ ID NO: 14) verglichen. Menschliches Prosaposin (SEQ ID NO: 15) und Maus-Prosaposin (SEQ ID NO: 16) werden auch in Tabelle 1 gezeigt. Weder SEQ ID NO: 1 noch SEQ ID NO: 9 überlappen mit den Aminosäuresequenzen von Saposin A oder Saposin B, und SEQ ID NO: 12 stellt die gesamte intervenierende Sequenz (Intron) von Saposin A-B und den terminalen 6 Aminosäuren von Saposin A und den ersten 4 Aminosäuren von Saposin B dar. Die biologische Aktivität von SEQ ID NO: 12 oder UPSEBP ist verschieden von jenen, die Saposin A, Saposin B oder anderen Regionen des intakten Prosaposinmoleküls zugeschrieben werden. SEQ ID NO: 13 ist eine Variation von SEQ ID NO: 12 und sollte auch hohe biologische Aktivität aufweisen.
Die biologische Aktivität des nativen UPSEBP, das aus Hahnsperma erzeugt wurde und synthetische Aminosäuresequenzen wurden in einem in vitro Test von Sperma-Bindung verglichen, der in der gleichzeitig angemeldeten Vereinigte Staaten Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/234.448 ( WO-A-9529983 ) beschrieben wurde. Dieser "Microwell-Assay" verwendet Platten, in welchen die Vertiefungen mit einem Bindungssubstrat beschichtet sind, welches aus einem Extrakt der Vitellinmembran von Hühnereiern erzeugt wurde. Das aufgetaute Hahnsperma, von dem bekannt ist, dass es reduziertes UPSEBP aufweist, wurde einmal mit isotonischen Salzlösungen gewaschen, bei 50 × 10⁵/0,1 ml resuspendiert und 30 Minuten mit 0,02-50 μg/0,5 ml nativem UPSEBP oder synthetischem Peptid inkubiert. Dann wurden 0,1 ml einer Suspension von etwa 5 × 10⁶ Spermien in dreifacher Ausführung in jede der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte platziert. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C wurde nicht gebundenes Sperma weggewaschen und gebundenes Sperma wurde gefärbt und unter Verwendung eines Mikroskops gezählt. Die Menge des gebundenen Spermas wurde als ein Maßstab für die biologische Aktivität betrachtet, da es zwischen der Zahl von Hahnsperma, das in vitro an ein solches Eizellenextrakt gebunden ist und dem Fertilisierungspotential von Sperma in einer Probe eine starke Korrelation gibt, wie es durch den Prozentsatz an Eiern kalkuliert werden kann, aus welchen nach künstlicher Befruchtung Küken ausschlüpfen.
Tabelle Nr. 1 stellt die Aminosäuresequenz von synthetischen Peptiden dar und die daraus resultierende Bindungskapazität, wenn sie mit nativem UPSEBP (gesamte Sequenz nicht bereitgestellt) verglichen wird. Anfängliche Bewertungen der Fähigkeiten von SEQ ID NO: 1 bis einschließlich SEQ ID NO: 11, nativem UPSEBP und Ratten SGP-1 zur Erhöhung der Spermabindung an Eizellenmembransubstrat wurden auf visuelle Zählungen von gebundenem Sperma basiert und über etliche Monate durchgeführt. Die Bindungsdaten für SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 12 und natives UPSEBP und Ratten SGP-1, die in Tabelle 1 dargestellt sind, wurden unter Verwendung einer neuen Version des Sperma-Eizellen-Bindungstests als zwei Datengruppen erhalten, in welchen das gebundenen Sperma mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt wurde, der an DNA bindet und unter Verwendung eines Fluoreszenz-Microwell-Plattenlesegeräts durch Techniken quantifiziert, die Fachleuten bekannt sind. Die Aminosäuresequenzen von Teilen von menschlichem Prosaposin (SEQ ID NO: 15) und Maus-Prosaposin (SEQ ID NO: 16) werden auch gezeigt.
Ein synthetisches Peptid, das SEQ ID NO: 1 aufweist, stellt Sperma-Bindungsfähigkeit bereit, die ähnlich jener des nativen UPSEBP ist. Unter Verwendung von nanomolaren Konzentrationen von SEQ ID NO: 1, wurden ungefähr zweimal so viele Spermien an das Eimembran-Substrat gebunden. Die etwas kürzere Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hatte eine niedrigere Bindungskapazität und die sehr kurze SEQ ID NO: 3 war im Wesentlichen ohne Bindungsaktivität. Das Hinzufügen von Aminosäuren distal zum terminalen Asparagin von SEQ ID NO: 3, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, hat die biologische Aktivität nicht wesentlich verändert. Ersetzen des terminalen Prolins in SEQ ID NO: 2 durch ein Cystein resultierte in SEQ ID NO: 6, mit minimaler Veränderung in der biologischen Aktivität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2. Das Hinzufügen einer Acetyl-Gruppe in SEQ ID NO: 7 oder von Phenylalanin-Gruppen in SEQ ID NO: 8 am NH₂-Ende hat die biologische Aktivität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 nicht unterdrückt. SEQ ID NO: 1 ergab durchwegs höhere biologische Aktivität als SEQ ID NO: 2 bis einschließlich SEQ ID NO: 8.
Substitutionen von Threonin an der Aminosäurenummer sechs in SEQ ID NO: 1 mit Prolin resultierte in SEQ ID NO: 9, welche auch sehr hohe biologische Aktivität aufwies, ungefähr gleich wie jene von SEQ ID NO: 1. Das Hinzufügen von L-Leucin zum NH₂-Ende von SEQ ID NO: 1 resultierte in SEQ ID NO: 10 und das Hinzufügen von D-Leucin zum NH₂-Ende von SEQ ID NO: 1 resultierte in SEQ ID NO: 11. Die Bindungsaktivität von SEQ ID NO: 10 mit der natürlichen Form von Leucin war größer als jene von SEQ ID NO: 11, obwohl beide dieser Sequenzen im Vergleich zu SEQ ID NO: 1 verminderte Aktivität aufwiesen.
Ein synthetisches Peptid, welches die gesamte intervenierende Sequenz zwischen Ratten-Saposin A und Saposin B verkörpert, wurde als SEQ ID NO: 12 erzeugt. SEQ ID NO: 12 wurde in zwei Formen untersucht. Wie synthetisiert hatte SEQ ID NO: 12 eine lineare reduzierte Form mit SH-Gruppen auf den beiden terminalen Cystein-Aminosäuren; in dieser linearen Form hatte SEQ ID NO: 12 eine erhebliche biologische Aktivität und induzierte Bindungsaktivität bei 0,002 nM und hatte daher eine ungefähr 90-mal höhere Potenz als SEQ ID NO: 9, welche vollkommen in SEQ ID NO: 12 enthalten ist, oder ungefähr 85-mal die Potenz von SEQ ID NO: 1. Induzierte Oxidation der SH-Gruppen in SEQ ID NO: 12, haben sie in eine Haarnadelform oder eine geschlossene Schlaufe umgeändert, mit einer -S-S-Bindung zwischen den beiden terminalen Cystein-Aminosäuren. In dieser Haarnadelform wies SEQ ID NO: 12 erhöhte biologische Aktivität auf und induzierte die Bindungsaktivität bei 0,0004 nM und hatte daher eine 5-fach höhere Aktivität der linearen Form von SEQ ID NO: 12 und 425-mal die Aktivität von SEQ ID NO: 1. Die Haarnadelform von SEQ ID NO: 12 war aktiver als die lineare Form. Die tertiäre Struktur sowie die Aminosäuresequenz sind daher für die Bindung von Sperma an Eizellenmembranen durch das Molekül wichtig, welches der Gegenstand dieser Erfindung ist.
Die Aminosäuresequenzen von Ratten-SGP-1 und menschlichem oder Maus-Prosaposinen, die in Tabelle 1 teilweise dargestellt sind, deuten darauf hin, dass der Großteil des SGP-1 oder Prosaposin-Moleküls für die Sperma-Eizellen-Bindungsaktivität nicht wesentlich ist. Darüber hinaus ist der Teil des Prospaposin-Moleküls mit einer Sequenz ähnlich zu der von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 9 eine intervenierende Sequenz, die während dem Prozessieren von Prosaposin proteolytisch gespalten wird, nämlich der distale Teil der intervenierenden Sequenz zwischen Saposin A und Saposin B. Sequenzen, die für jedes der Saposine (A, B, C oder D) wesentlich sind, sind für die biologische Aktivität von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 9 nicht notwendig. SEQ ID NO: 12 verlängert die intervenierende Sequenz zwischen Saposin A und Saposin B um 6 Aminosäuren in der NH₂-Richtung in Saposin A hinein und um 4 Aminosäuren in die COOH-Richtung, in Saposin B hinein. Diese Verlängerungen stellen die terminalen Cysteine bereit, die für die Bildung der Haarnadel-Schlaufenform von SEQ ID NO: 12 wesentlich sind. SEQ ID NO: 5 kombiniert den Anfangsteil von Saposin B mit dem terminalen Teil der intervenierenden Sequenz zwischen Saposin A und Saposin B mit nahezu keiner biologischen Aktivität.
Natives oder synthetisches UPSEBP ist für die folgenden Anwendungen nützlich: a) als ein die Befruchtung förderndes Hilfsmittel für Flüssigkeiten, die verwendet werden um Sperma zu irgendeinem Zeitpunkt der Prozessierung von Samen für künstliche Befruchtung oder für in vitro Fertilisierung oder ähnliche unterstützte reproduktive Technologie zu suspendieren oder zu resuspendieren; b) als der aktive Bestandteil für eine vaginale befruchtungsfördernde Medikation zur Selbstverabreichung; c) als die Grundlage für Analoge, welche die Epitope enthalten, die Spermabindung gewährleisten, aber mit Sequenzen, die erfolgreiche die Bindung an die Eizellenhüllen hemmen zur Empfängnisverhütung; d) als Grundlage für ein Reagens zur Verwendung bei der Quantifizierung der Menge an UPSEBP, das auf dem Sperma vorhanden ist, um Information bezüglich der möglichen Fertilität eines einzelnen Spermatozoon oder der Population von Sperma in einer Samenprobe zu liefern; und e) als Antigen für die Produktion von Antikörpern, die bei der Vorhersage der möglichen Fertilität nützlich sind.
In einer Ausführungsform wird natives oder synthetisches UPSEBP verwendet, um die Kapazität von frischem oder eingefrorenem-aufgetautem Sperma zu verbessern, um Eizellen zu befruchten. Vor der künstlichen Befruchtung wird ein Aliquot an frischem oder eingefrorenem-aufgetautem Sperma mit dem nativen oder synthetischen UPSEBP gemischt, das die Befruchtungskapazität des Spermas erhöht.
In einer anderen Ausführungsform kann natives oder synthetisches Polypeptid als eine befruchtungsfördernde Medikation verwendet werden, um intravaginal in halbfester oder flüssiger Form oder als Schaum kurz vor dem Koitus verabreicht zu werden. Die Medikation kann irgendeine von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder natives UPSEBP als einen aktiven Bestandteil enthalten, der in einem geeigneten Träger suspendiert ist, der biologische Aktivität beibehält, angemessene Dispersion nahe dem externen Muttermund gewährleistet und die wirkungsvolle und schnelle Verteilung des aktiven Bestandteils im Sperma nach der Ejakulation erleichtert.
Analoge der essentiellen Sequenz innerhalb von UPSEBP, wie zum Beispiel SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, oder SEQ ID NO: 13, welche das (die) Epitop(e) enthalten, die das Molekül an das Spermium binden und außerdem alternative Sequenzen enthalten, welche die Bindung eher hemmen als erleichtern, sind wegen ihres empfängnisverhütenden Effekts auf Sperma nützlich. Eine empfängnisverhütende Medikation, die das Analog enthält, wird intravaginal halbfest, flüssig oder als Schaum kurz vor dem Koitus verabreicht. Die Medikation, die ein UPSEBP-Analog enthält, wird in einem geeigneten Träger aufgelöst, welcher die biologische Aktivität aufrechterhält und die angemessene Dispersion nahe dem externen Muttermund und die wirkungsvolle sowie die schnelle Verteilung des aktiven Bestandteils des Spermas nach der Ejakulation erleichtert.
In einer anderen Ausführungsform wird die Menge an UPSEBP, das auf dem Spermium vor der Befruchtung vorhanden ist quantifiziert und sagt das Befruchtungspotential voraus. Synthetische Sequenzen wie zum Beispiel SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 13 werden als Grundlage für ein Reagens verwendet, das bei der Quantifizierung der Menge an UPSEBP verwendet wird, das auf dem Spermium vorhanden ist, um Information bezüglich der möglichen Fertilität des einzelnen Spermiums oder der Spermapopulation in einer Samenprobe bereitzustellen. UPSEBP bindet offensichtlich in einer stöchiometrischen Weise an Sperma bis Sättigung erreicht ist. Inkontaktbringen des Spermas mit dem markierten Molekül ermöglicht die Quantifizierung von nicht besetzten Spermastellen zur Bindung von UPSEBP und indirekt die Zahl an UPSEBP-Molekülen, die auf dem Spermium vorhanden gewesen sind. Die synthetische Sequenz (wie zum Beispiel SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13) von UPSEBP wird mit Fluorescein-Isothiocyanat, Texas Rot, oder anderen Cyanin-Farbstoffen konjugiert, von welchen jeder mit einer charakteristischen Emissionswellenlänge und Intensität fluoresziert wenn er mit Licht der richtigen Wellenlänge angeregt wird. Eine Spermasuspension wird einem Überschuss an markierter SEQ ID NO: 1 ausgesetzt, zum Beispiel für 5 Minuten, um die Bindung zu ermöglichen und dann > 1:10.000 verdünnt und zur Quantifizierung der Menge an SEQ ID NO: 8, die von jedem der 3.000 bis > 10.000 Spermien gebunden ist, die für jene dieser Probe repräsentativ sind, durch ein Durchfluss-Cytometer durchgelassen. Ein Verteilungsprofil kann für die Prozentsatz an Sperma in der Probe gemacht werden, dem UPSEBP fehlt oder das vor der Analyse genug davon aufweist, wobei das Letztere wahrscheinlich ein hohes Befruchtungspotential aufweist. Ähnlich konnte eine synthetische Sequenz oder UPSEBP verwendet werden, das mit einem Licht-absorbierenden Reporter markiert ist.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung Antigene zur Herstellung von Antikörpern, die nützlich sind, um die mögliche Fertilität des Spermas vorauszusagen. Natürliches oder rekombinantes/synthetisches UPSEBP oder ein Analog davon kann verwendet werden, um monoclonale oder polyclonale Antikörper gegen ein oder mehrere Epitope von UPSEBP herzustellen, die exponiert sind während das Molekül durch Sperma gebunden ist. Antikörper gegen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 12 sind hergestellt worden und für die Verwendung in solchen Tests untersucht worden. Alternativ kann zum Beispiel ein primärer Antikörper gegen SEQ ID NO: 13 in Fab-Fragmente gespalten werden, die dann direkt mit einem fluoreszierenden Cyaninfarbstoff vor der Bindung an das Sperma markiert werden. Proben, die einen hohen Prozentsatz an Sperma enthalten, die eine große Menge an Antikörper binden, haben ein hohes Befruchtungspotential. Umgekehrt würden Proben in welchen den meisten Spermien die üblichen Mengen an UPESBP fehlen schlechtes Befruchtungspotential aufweisen. In dieser Ausführungsform werden geeignete Antikörper (oder Fragmente davon) mit einer fluoreszierenden oder einer Licht-absorbierenden Reportergruppe markiert und dann als ein Reagens verwendet, um die Zahl an UPSEBP-Molekülen, die in jedem Mitglied einer Spermapopulation vorhanden sind zu quantifizieren. Das mit markierten Fab-Antikörperfragmenten behandelte Sperma kann in ein automatisiertes Bildanalysesystem platziert werden, in welchem sowohl Bewegungscharakteristika von einzelnen Spermien gemäß den Technologien, die Fachleuten bekannt sind, quantifiziert werden als auch gleichzeitig die Zahl der exponierten Bindungsstellen für UPSEBP auf jedem Spermatozoon, wie hierin offenbart, auf der Basis der Fluoreszenz bestimmt werden. Die resultierenden Daten etablieren ein multidimensionales Verteilungsprofil für den Prozentsatz an Sperma in der Probe, dem UPSEBP fehlt, oder das vor der Analyse ausreichend aufweist, um eine hohes Befruchtungspotential aufzuweisen und außerdem die Bewegungscharakteristika von jeder Zelle hinsichtlich Geschwindigkeit, Scheren oder Flattern des Kopfes und Linearität der Bewegung. Eine solche Multi-Vektor-Analyse von jedem einzelnen Mitglied einer Probenpopulation sagt die mögliche Fertilität einer Probe voraus.
Obwohl die Erfindung vorstehend allgemein beschrieben worden ist, geben spezifische Beispiele eine zusätzliche Beschreibung der Produkte und Verfahrensschritte, die für das vorliegende Polypeptid und die Verwendungen davon typisch sind. Die in den 1 bis 3 und 6 bis 9 präsentierten Daten zeigen die Zahl an Sperma, das pro Einheitsfläche einer Perivitellinmembran eines gelegten Hühnereis gebunden ist, oder Daten, die von einer solchen Bindung abgeleitet werden oder an ein Substrat gebunden sind, das unter Verwendung eines Extraktes aus solchen Perivitellinmembranen entsprechend dem Verfahren erzeugt wurde, das im gleichzeitig angemeldeten Patent mit der Anmeldungsseriennummer 08/234.448 offenbart wurde. Außer wenn vermerkt, wurde natives Protein mit UPSEBP-Aktivität verwendet, das aus dem Hahnsperma extrahiert wurde.
BEISPIEL 1: Wiederherstellung der Sperma-Bindungskapazität
Frisch gesammeltes Hahnsperma wurde kryokonserviert, aufgetaut und prozessiert, um Glyzerin zu entfernen. Ein Teil des aufgetauten Spermas erhielt rohes UPSEBP bei einer Konzentration von 2 μg Protein pro 10⁶ Spermien. Proben, die 1-10 × 10⁶ Spermien enthielten wurden in Vertiefungen platziert, die mit einem Extrakt von Hühner-Eimembran beschichtet waren und 180 Minuten inkubiert. Nicht gebundenes Sperma wurde mit Diamido-2-Phenylindol gefärbt und unter Verwendung eines Epifluoreszenz-Mikroskops gezählt. Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von UPSEBP die Kapazität von eingefrorenemaufgetautem Hahnsperma wiederherzustellen, um im Vergleich mit unbehandeltem Sperma Membranprotein aus Hühnereiern zu binden.
BEISPIEL 2: Vergleich von UPSEBP mit SGP-1 und menschlichen Saposinen
Die Verfahren von Beispiel 1 wurden unter Verwendung von SGP-1 und den menschlichen Saposinen A, B, C und D wiederholt. 2 zeigt, dass das Inkontaktbringen von eingefrorenem-aufgetautem Sperma mit SGP-1 bis ≥ 100% von jener Bindung wieder herstellt, die durch Inkontaktbringen von anderen Aliquots der gleichen Probe an eingefrorenem-aufgetautem Sperma mit UPSEBP (2 μg/Million Sperma) erzielt wurde und dass menschliches Saposin B bis etwa 70% der Bindung von der Menge wieder herstellte, die unter Verwendung von UPESBP erzielt wurde. Die Saposine A, C und D waren bei der Wiederherstellung der Bindung nicht wirksam.
BEISPIEL 3: Fähigkeit von polyclonalen Antikörpern die Sperma-Eizellen-Bindung zu neutralisieren
Polyclonale Antikörper gegen Ratten-SGP-1, menschliche Saposine und einen Teil der intervenierenden Sequenz zwischen Saposin A und B wurden von anderen bereitgestellt, welche die Antikörper mit Techniken erzeugt hatten, die im Fachgebiet bekannt sind. Antikörper und 12,5 × 10⁶ Spermien wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Spermabindung wurde wie in Beispiel 1 bestimmt. Wie in 3 gezeigt waren die Antikörper gegen die intervenierende A-B-Sequenz, Saposin B und SGP-1 bei Eliminierung der Aktivität von UPSEBP sehr wirkungsvoll. Antikörper gegen Saposin A waren weniger wirkungsvoll und Antikörper gegen Saposine C und D hatten keinen Effekt.
BEISPIEL 4: Fähigkeit von UPSEBP die Fertilität von eingefrorenem-aufgetautem Hahnsperma zu verbessern
Sperma in einer Probe von vereinigtem Samen wurde verwendet, um die Fertilitätsdaten vor der Kryokonservierung (d.h. frisch) und nach der Kryokonservierung und nach dem Auftau-Prozess zu erhalten, um Glyzerin langsam zu entfernen (eingefroren-aufgetaut). Ein Teil des aufgetauten Spermas wurde in Minnesota-A-Puffer allein suspendiert und der Zweite wurde mit Minnesota-A-Puffer behandelt, der rohes UPSEBP bei 2 μg Protein pro 10⁶ Spermien enthielt. Wie in 4 gezeigt war die Fertilität des Spermas, das in UPSEBP prozessiert wurde doppelt so hoch wie die von Sperma das nicht mit UPSEBP behandelt wurde und erreichte die Höhe von frischem Sperma. Bruterfolg von Eiern, die mit Sperma künstlich befruchtet wurden, das mit UPSEBP behandelt wurde, erhöhte sich von 18 auf 25%.
BEISPIEL 5: Fähigkeit von UPSEBP die Fertilität von frischem Hahnsperma zu verbessern
Frisches Sperma aus 20 einzelnen Hähnen wurde in zwei Aliquots aufgeteilt: eines blieb unbehandelt und das andere wurde mit nativem Hahn-UPSEBP bei 0,04 μg Protein pro 10⁶ Spermien behandelt. Die Fertilitätsprozent (Prozent von ~200 gelegten Eiern, die in einem lebenden Küken resultierten) und die Prozent an Fertilitätserhöhung im Vergleich mit unbehandeltem Sperma wurde bestimmt und wird in den 5a und 5b dargestellt. Für 8 von den 20 getesteten Hähnen resultierte das Hinzufügen von UPSEBP in einer Fertilitätszunahme von mehr als 25 Prozent und für weitere 5 von 20 Hähnen gab es eine Fertilitätserhöhung von 7 bis 23 Prozent. Das Hahnsperma mit niedrigeren natürlichen Fertilitätsmengen waren am meisten durch die Behandlung mit UPSEBP begünstigt.
BEISPIEL 6: Menge an UPSEBP
Hahnsperma, das einem Kryokonservierungs-Zyklus unterzogen wurde, wurde mit zunehmenden Mengen an teilweise gereinigtem UPSEBP behandelt und gemeinsam mit Aliquots von nicht eingefrorenem (frischem) Sperma, einem Standard-Bindungstest unterzogen. 6 zeigt, dass die Behandlung von eingefrorenem-aufgetautem Hahnsperma mit 0,04-4,0 μg UPSEBP pro 10⁶ Spermien die Fähigkeit des Spermas teilweise wiederherstellte an die Membran eines Hühnereies zu binden.
BEISPIEL 7: UPSEBP quer durch Hühnerspezies
Eingefrorenes-Aufgetautes Truthahnsperma wurde mit Hahn-UPSEBP oder teilweise gereinigtem SGP-1 in Kontakt gebracht. Die Behandlung von aufgetauteneingefrorenen Truthahnsperma mit Hahn-UPSEBP stellte die wie in 7a dargestellte Fähigkeit von Sperma an eine Membran eines Hühnereis zu binden wieder teilweise her. Truthahn-UPSEBP, das in einer ähnlichen Weise zu jener hergestellt wurde, die verwendet wurde um natives Hahn-UPSEBP herzustellen, stellte auch die wie in 7b dargestellte Fähigkeit der Bindung des Truthahnsperma oder Hahnsperma an das Hühnerei-Membranprotein teilweise wieder her.
BEISPIEL 8: Behandlung von gelagertem Truthahnsperma
Truthahnsperma wurde für 24 Stunden bei 4°C gelagert. Proben des gelagerten Spermas wurden nicht behandelt oder mit 2 μg Protein pro 10⁶ Spermien von Hahn-UPSEBP oder Truthahn-UPSEBP behandelt. Proben des behandelten und unbehandelten Spermas wurden gemeinsam mit Proben von frischen oder getöteten Spermien bei 2,5 × 10⁶ Spermien/Vertiefung auf ihre Fähigkeit geprüft an die Membranpräparationen von Hühnereiern zu binden. Wie in 8 gezeigt, hatte unbehandeltes Sperma im Vergleich mit dem frischen Sperma (0 Stunden) nach 24 Stunden eine verminderte Bindung auf und die Behandlung mit entweder Hahn oder Truthahn-UPSEBP stellte die Bindung teilweise wieder her.
BEISPIEL 9: Behandlung von Hengstplasma
Die Fähigkeit von Hahn-UPSEBP die Bindung von eingefrorenemaufgetautem Hengstplasma an die Membranpräparationen von Hühnereiern zu verstärken wurde bewertet. Sperma von zwei Hengsten von unbekannter Fertilität wurde durch ein herkömmliches Verfahren eingefroren. Ein Teil von jeder Probe erhielt keine Ergänzung, während ein zweiter Teil 2 μg Hahn-UPSEBP pro 10⁶ Spermien erhielt. 9 zeigte, dass für beide Samenproben Hahn-UPSEBP wirkungsvoll bei der Prozentzunahme von Hengstsperma war, das an die Hühner-Eimembran gebunden war.
BEISPIEL 10: Antikörper
Ein primärer Antikörper wurde in zwei Kaninchen gegen SEQ ID NO: 5 erzeugt, die über die Cystein-Aminosäure mit der Verwendung von Standard-Adjuvantien und Techniken an "keyhole limpet" gebunden wird. Das Immunserum wurde geerntet und als ein primärer Antikörper verwendet, um Hahnsperma zu markieren, in niedriger Ionenstärke unter Verwendung von Paraformaldehyd fixiert und durch Standard-Techniken prozessiert, danach wurde Fluorescein-Isothiocyanatmarkiertes Ziege-anti-Schaf-Gamma-Globulin als ein sekundärer Antikörper verwendet. Analysen mittels Durchfluss-Cytometrie offenbarten die Prozent an Sperma wie markiert und optische Überprüfung durch Epifluoreszenzmikroskopie offenbarte die Lokalisierung der Antikörper an der Kopfregion. Ein ähnlicher Antikörper wurde gegen SEQ ID NO: 12 erzeugt.
Obwohl die Erfindung mit allen Einzelheiten im vorstehenden Text und in den Beispielen beschrieben wurde, soll die Erfindung nur insofern eingeschränkt sein, wie es in den begleiteten Ansprüchen dargelegt wird.

^a Konzentration des Peptids (nanomolar), das nach zehnfacher Verdünnung der Spermasuspension maximale Bindung gewährleistet.
^b Aktivität relativ zu SEQ ID NO: 1.
^c Ende von Saposin A.
^d Start der intervenierenden Sequenz zwischen Saposin A und Saposin B.
e Ende der intervenierenden Sequenz zwischen Saposin A und Saposin B.
f Start von Saposin B.
✝ Maximale Bindung, erhalten mit dem nativen Molekül in einem halbgereinigten Extrakt aus Hahnsperma ergab eine Wert von 80 Sperma (fluoreszierenden) äquivalenten Einheiten/Flächeneinheiten; Konzentration des aktiven Moleküls im Extrakt ist unbekannt, aber wenn ein Molekulargewicht = 10.000 und eine Reinheit von 0,1% angenommen wird, würde die verwendete Masse eine 1 nM Lösung ergeben haben. Sperma, das mit SEQ ID NO: 1 behandelt wurde, ergab einen Wert von 76 Sperma (fluoreszierend) äquivalenten Einheiten/Flächeneinheiten wie verglichen mit einem Wert von 40 für unbehandeltes Kontrollsperma, und Werte für andere Sequenzen erstrecken sich von –40 bis 141 Sperma (fluoreszierend) Einheiten/Flächeneinheiten bei der ausgewiesenen Konzentration an Peptid. Aminosäuren in Ratten-SGP-1 (Prosaposin; Collard et al., 1988) werden mit jenen im menschlichen Prosaposin (O'Brien & Kishimoto, 1991; Kishimoto et al., 1992) und Maus-Prosaposin (Tsuda et al., 1992) verglichen.
* SEQ ID NO: 12 wurde in zwei Formen untersucht: (1) wie synthetisiert, in einer linearen reduzierten Form mit SH-Gruppen in den beiden terminalen Cysteinen und (2) modifiziert zu einer oxidierten Haarnadelform mit einer -S-S-Bindung zwischen den beiden terminalen Cysteinen, induziert durch Oxidation der SH-Gruppen. Als ein lineares reduziertes 60 Aminosäurenmolekül, war SEQ ID NO: 12 bei 0,002 nM aktiv und wies daher eine ~ 85-mal höhere Potenz als SEQ ID NO: 1 auf. Als ein 60 Aminosäuren langes oxidiertes Haarnadelmolekül jedoch war SEQ ID NO: 12 bei 0,0004 nM aktiv und hatte daher 425-mal mehr Potenz als SEQ ID NO: 1. Die biologische Aktivität von SEQ ID NO: 12 war daher von seiner Tertiärstruktur abhängig, mit Bioaktivität der Haarnadel-Schlaufenform von 5-mal jener der linearen Form.

Claims

Gereinigtes Polypeptid, welches in der Lage ist, die Sperma-Eizellen-Bindung zu erleichtern, wobei das Polypeptid ein verkürzter Teil eines Prosaposin-Moleküls ist, wobei der Teil die Aminosäuresequenz umfasst, die sich vom letzten Cystein in Saposin A bis zum ersten Cystein in Saposin B erstreckt.
Polypeptid nach Anspruch 1, zumindest umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 13.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei der letzte Cysteinrest von Saposin A und das erste Cystein von Saposin B durch eine Disulfidbindung verbunden sind.
Polypetid nach einem der Ansprüche 1-3 mit einem Molekulargewicht von bis zu 10 Kilodalton.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung der Sperma-Eizellen-Bindung.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid zu einer wässrigen Suspension des Spermas hinzugefügt wird, damit ein Gemisch entsteht, bevor dieses Gemisch zumindest einem Oocyt ausgesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die wässrige Suspension vor der Zugabe des Polypeptids gefrierkonserviert und anschließend aufgetaut wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Gemisch gefrierkonserviert und anschließend aufgetaut wird, bevor das Gemisch zumindest einem Oocyt ausgesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6-9, wobei das Gemisch zumindest einem Oocyt ausgesetzt wird durch Verabreichen des Gemischs auf intravaginalem oder intracervikalem Weg oder durch intrauterine Insertion.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid intravaginal inseriert wird, gefolgt vom intravaginalen Einbringen einer wässrigen Suspension des Spermas.
Verfahren zur Bestimmung des Befruchtungspotentials des Spermas, umfassend das In-kontaktbringen einer Spermaprobe mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid markiert ist und die Menge des markierten Polypeptids pro Spermium gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid mit einer lichtempfindlichen Einheit markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei ein erster Antikörper an das Polypeptid gebunden ist, wobei der erste Antikörper gegen ein Epitop des Polypeptids gerichtet ist, welches frei liegt, während das Polypetid an das Sperma gebunden ist, ein markierter zweiter Antikörper an den ersten Antikörper gebunden ist und die Menge des zweiten markierten Antikörpers pro Spermium gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der zweite Antikörper mit einer lichtempfindlichen Einheit markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der erste Antikörper ein Fab-Fragment des markierten Antikörpers ist.
Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Spermiumbindestellen auf einer Eizelle, umfassend a) das Herstellen eines ersten Antikörpers gegen zumindest ein Epitop des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-4, das in die Bindung des Polypeptids an die Eizelle involviert ist; b) das in vitro-Binden des ersten Antikörpers an die Epitope auf der Eizelle; c) das Binden eines markierten zweiten Antikörpers an den ersten Antikörper; und d) das Messen der Menge an markiertem zweiten Antikörper pro Spermium.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Antikörper, der an eine Eizelle gebunden ist, ein Fab-Fragment des markierten Antikörpers ist.