DE69434137T2

DE69434137T2 - Chaperonin 10

Info

Publication number: DE69434137T2
Application number: DE69434137T
Authority: DE
Inventors: Halle Morton; Alice Christina Cavanagh
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2014-12-01
Also published as: EP0733071A4; US20030175280A1; JP2004067698A; US6417334B1; JP3545408B2; JP3987104B2; NZ276670A; DE69434137D1; US6113899A; JPH09506431A; AU684578B2; CA2177179C; ES2233938T3; US7358329B2; EP0733071A1; WO1995015339A1; AU1103495A; JP3986481B2; CA2177179A1; AU1103695A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Chaperonin 10, das auch als cpn 10 bekannt ist.
STAND DER TECHNIK
Chaperonine gehören zu einer größeren Klasse von molekularen Chaperonen, Moleküle, die in der posttranslationalen Faltung, im Targeting und in der Assemblierung anderer Proteine involviert sind, die aber selbst kein Bestandteil der assemblierten Endstruktur sind, wie von Ellis et al., 1991, Annu. Rev. Biochem. 60 321–347 erörtert wird. Die meisten molekularen Chaperone sind „Hitzeschock"- oder „Stress"-Proteine (hsp); d. h. ihre Produktion wird durch eine Vielfalt zellulärer Insulte (wie Stoffwechselstörungen, Sauerstoffradikale, Inflammation, Infektion und Transformation) induziert oder erhöht, wobei Hitze nur eine der besser untersuchten Belastungen ist, wie von Lindquist et al., 1988, Annu. Rev. Genet. 22 631–677 besprochen wird. Neben diesen quantitativen Veränderungen der spezifischen Proteinniveaus, kann Stress die Bewegung von konstitutiv produzierten Stressproteinen zu verschiedenen Zellräumen induzieren, wie in der oben genannten Quelle von Lindquist erwähnt wird. Die Hitzeschockreaktion ist eines der am höchsten konservierten bekannten genetischen Systeme, und die verschiedenen Hitzeschockproteinfamilien gehören zu den evolutionär stabilsten Proteinen, die es gibt. Mitglieder dieser Familien ermöglichen es nicht nur, dass Zellen mit ungünstigen Bedingungen fertig werden, sondern führen in normalen Zellen wesentliche Funktionen aus.
Es gibt zwei Typen von cpn-Molekülen, cpn60 (monomer M_r ~60.000) und cpn10 (monomer M_r ~10.000). Cpn60 wurde intensiven Studien unterzogen. Es wurde in allen untersuchten Bakterien, Mitochondrien und Plastiden identifiziert, und eine cytoplasmatische Form, TCP-1, wurde in eukaryotischen Zellen identifiziert; es soll auf der Oberfläche einiger Zellen anwesend sein, obschon dies in der oben genannten Quelle von Ellis und auch in van Eden, 1991, Immunol. Reviews 121 5–28 in Frage gestellt wird. Bis vor kurzem wurde cpn10 nur in Bakterien identifiziert, strukturelle und funktionelle Äquivalente wurden jetzt aber auch in Chloroplasten (Bertsch et al., 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89 8696–8700) und in Ratten (Hartman et al., 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89 3394–3398) und in Rinderlebermitochondrien gefunden (Lubben et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87 7683–7687).
Cpn60 und cpn10 interagieren funktionell in Gegenwart von ATP, um eine Proteinassemblierung zu vermitteln. Über Fälle, in denen cpn10 unabhängig von cpn60 wirkt, wurde bisher noch nicht berichtet, allerdings wurde scheinbar alleine wirkendes cpn60 mit völlig verschiedenen Ereignissen in Verbindung gebracht. Es ist zum Beispiel ein immundominantes Ziel von sowohl Antikörper- als auch T-Zell-Reaktionen im Laufe bakterieller Infektionen, da das Protein aber so hoch konserviert ist, wird Selbstreaktivität hervorgerufen. Bei gesunden Personen kann diese Selbsterkennung dazu genutzt werden, transformierte und infizierte autologe Zellen zu beseitigen, Defekte in der Kontrolle einer solchen Erkennung können jedoch zu Autoimmunkrankheiten führen, wie von van Eden, 1991, Immunol. Reviews 121 5–28 erörtert wird. Es überrascht nicht, dass cpn60 mit Zuständen wie Rheumatoidarthritis in Verbindung gebracht wird. Es gibt somit die zunehmende Erkenntnis, dass molekulare Chaperone, mit ihrer Fähigkeit, sich an eine große Auswahl von Polypeptiden zu binden und ihre Konformation zu ändern, Schlüsselrollen in Zellfunktionen, mit Ausnahme der Proteinbiogenese, einnehmen können. Es ist auch auf Hartman et al., 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90 2276–2280 hinzuweisen, die die Stabilisierung von Proteinmolekülen mit cpn10 und cpn60 beschreiben.
Es kann auch demonstriert werden, dass es bei Säugetier-cpn10s eine sehr enge Sequenzhomologie gibt. Das cpn10 Molekül einer Ratte (Hartman et al., 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 3394–3398) hat zum Beispiel zur Struktur von Rinder-cpn10 eine Homologie von mehr als 99%, über die in EMBL Data Base Directory unter MT BTC PN10 berichtet wird, vorgelegt von J. E. Walker, MRC Lab. of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge, UK. Im Gegensatz dazu haben cpn10s von Bakterien einen durchschnittlichen Homologiegrad zu Ratten-Chaperonin 10 von nur 34% (Hartman et al., 1992).
FRÜHER SCHWANGERSCHAFTSFAKTOR (EPF)
EPF wurde zunächst als eine mit Schwangerschaft assoziierte Substanz beschrieben (Morton et al., 1976, Proc. R. Soc. B. 193 413–419) und seine Entdeckung rief erhebliches Interesse hervor, da er den Nachweis einer potentiellen Schwangerschaft innerhalb von 6 bis 24 Stunden nach der Befruchtung ermöglichte. Anfangs wurde EPF aufgrund seiner Fähigkeit, Suppressorfaktoren von Lymphozyten freizusetzen, eine Rolle als Immunosuppressivum zuerkannt (Rolfe et al., 1988, Clin. exp. Immunol. 73 219–225). Diese Suppressorfaktoren hemmen die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion in Mäusen und können daher eine mögliche maternale Immunantwort auf den antigenisch fremden Fötus unterdrücken. In neueren Studien wurde gezeigt, dass die Produktion von EPF nicht auf Schwangerschaft begrenzt ist. Er ist ein Produkt der primären und neoplastischen Zellvermehrung und fungiert unter diesen Bedingungen als ein Wachstumsfaktor (Quinn et al., 1990, Clin, exp. Immunol. 80 100–108; Cancer Immunol. Immunother, 1992, 34 265–271). EPF ist auch ein Produkt einer Blutplättchenaktivierung, so dass vorgeschlagen wird, dass er möglicherweise eine Rolle in der Wundheilung und Hautreparatur spielt (Cavanagh et al., 1991, Journal Reproduction and Fertility 93, 355–365).
Bisher ist der Rosetteninhibitionstest das einzige Mittel für den Nachweis von EPF in komplexen biologischen Gemischen (Morton et al., 1976, Proc R Soc B 413–419). Dieser Assay stützt sich auf die ursprüngliche Erkenntnis von Bach und Antoine, 1968, Nature (Lond) 217 658–659, dass ein immunsuppressives Antilymphozytenserum (ALS) eine spontane Rosettenbildung in vitro zwischen Lymphozyten und heterologen roten Blutzellen inhibieren kann. Eine Modifikation dieses Assays wurde für den Nachweis von EPF eingeführt, nachdem demonstriert wurde, dass in EPF vorinkubierte Lymphozyten einen wesentlich höheren Rosetteninhibitionstiter (RIT) mit einem ALS hervorbringen, als Lymphozyten von demselben Spender ohne EPF, wie in der obigen Quelle von 1976 beschrieben. Dieser Test wird in der obigen Quelle von 1976 sowie in Morton et al., 1987, in "In Current Topics in Developmental Biology" Bd. 23, 73–92, Academic Press, San Diego, ausführlich beschrieben, schließt jedoch kurz gesagt eine Ereigniskaskade ein, wobei sich EPF an Lymphozyten bindet und die aufeinander folgende Freisetzung von Suppressorfaktoren induziert (Rolfe et al., 1988, Clin, exp. Immunol. 73 219–225); (Rolfe et al., 1989, Immunol. Cell Biol. 67 205–208).
In Athanasas-Platsis et al., 1989, Journal Reproduction and Fertility 87 495–502 and Athanasas-Platsis et al., 1991, Journal Reproduction and Fertility 92 443– 451, wird die Produktion monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen EPF und die passive Immunisierung trächtiger Mäuse mit diesen Antikörpern beschrieben, die zu einem Verlust der Embryolebensfähigkeit führt. Diese Studien demonstrierten, dass EPF für einen erfolgreichen Nachweis von Schwangerschaft notwendig ist.
In Quinn et al., 1990, Clin. exp. Immunol. 80 100–108, wird vorgeschlagen, dass EPF ein wachstumsreguliertes Produkt eines kultivierten Tumors und transformierter Zellen ist. Diese Zellen sind außerdem für ein anhaltendes Wachstum auf EPF angewiesen, d. h. EPF wirkt in einer autokrinen Weise.
Man stellte fest, dass EPF eine Rolle bei der Förderung von Tumorwachstum spielt, da das Wachstum von Tumorzellen durch Anti-EPF-mAbs wesentlich hinausgezögert werden kann. Darüber hinaus legt diese Quelle den Schluss nahe, dass Hybridome, die Anti-EPF-Antikörper hoher Affinität produzieren, inhärent instabil sein können.
In Quinn et al., 1992, Cancer Immunol. Immunother. 34 265–271, wird außerdem der Effekt monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen EPF auf das In-vivo-Wachstum von transplantierbaren murinen Tumoren beschrieben. Die Hauptaussage dieser Quelle ist, dass eine Neutralisation von EPF Tumorwachstum in vivo hinauszögert.
Anhand der obigen Quelle von Quinn et al. 1992 wird klar, dass, wenn sich Krebs in einem sehr frühen Wachstumsstadium befindet, eine Neutralisation von EPF durch Anti-EPF-mAb seine Entwicklung verhindert. Hat sich der Krebs jedoch einmal etabliert, dann wird eine Behandlung mit diesen mAbs den Tumor hinauszögern, aber nicht vollständig zerstören.
Zu anderen Quellen mit Bezug auf die Rolle von EPF beim Tumorwachstum gehören Quinn, 1991, Immunol. Cell Biol. 69 1–6 und Quinn, K. A. in einer Dissertation mit dem Titel "Early pregnancy factor: a novel factor involved in cell proliferation¹¹ von der University of Queensland in Australia in 1991.
EPF wird im Detail von Morton et al., 1992, Early Pregnancy Factor, Seminars in Reproductive Endocrinology 10 72–82 überprüft. Es werden der Ort und die Regulation der EPF-Produktion beschrieben, gefolgt von der Reinigung von EPF von Blutplättchen und der Beziehung des gereinigten Produkts zu EPF anderer Quellen. Diese Übersicht erörtert außerdem bestimmte Aspekte des Bioassays für EPF (d. h. den Rosetteninhibitionstest), einschließlich der Überwachung der Reinigungsverfahren und Untersuchung von Produktionsquellen. Die biologische Aktivität von EPF wird erörtert und es werden mögliche klinische Anwendungen von EPF und seinen Antagonisten beschrieben.
Morton et al., 1992, Reprod. Fertil Dev. 4 411–422 überprüft vorherige Publikationen, in denen die Immunsuppressions- und Wachstumsfaktoreigenschaften von EPF beschrieben werden. Die Rolle von EPF zur Erhaltung des Präembryos wird in dieser Quelle ebenfalls erörtert.
Beide oben erwähnten Quellen, die im Wesentlichen Übersichtsartikel sind, beschreiben die Präparation von gereinigtem EPF für Blutplättchen, die die anfänglichen aufeinander folgenden Schritte der Wärmeextraktion der Blutplättchen, Kationenaustauschchromatographie auf SP-Sephadex C-25, Affinitätschromatographie auf Heparin-Sepharose CL-6B und Concanavalin-A-Sepharose 4B umfasste. Die letzte Reinigung von EPF wurde durch hydrophobe Hochleistungsinteraktionschromatographie erreicht, gefolgt von drei Umkehrphasen-(RP)-HPLC-Schritten. Nach dem letzten RP-HPLC-Schritt wurde EPF als einzelner UV-absorbierender Peak isoliert, der mit biologischer Aktivität zusammenfiel, gut getrennt von einer Reihe geringfügiger Kontaminanten. Die biologische und Radioaktivität einer jodierten Probe dieses Materials eluierte mit identischer Retentionszeit bei einer Fraktionierung unter den gleichen Bedingungen. Bei einer Analyse durch SDS-PAGE und Visualisierung durch Autoradiographie lief das jodierte Material als eine einzelne Bande von etwa Mr 10.000, was wieder mit biologischer Aktivität zusammenfiel. Mit diesem Verfahren lag die Ausbeute von EPF bei etwa 5 μg je 100 Blutplättcheneinheiten.
Dies zeigt, dass die Anwendung dieses komplexen Reinigungsverfahrens notwendig war, um eine nur kleine Menge an nativem EPF zu erhalten, so dass dieses Verfahren nicht im kommerziellen Maßstab angewendet werden konnte. In dieser Hinsicht waren die einzigen bekannten praktischen Quellen für den Erhalt von nativem EPF zu dieser Zeit Blutplättchen und regenerierende Leber.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ergab der endgültige fraktionierte EPF, wenn er einer Sequenzierung unterzogen wurde, wie nachfolgend ausführlicher beschrieben wird, überraschenderweise, dass die Struktur von nativem EPF Chaperonin 10 entsprach, was anhand des zuvor erwähnten Standes der Technik nicht vorausgesagt werden konnte.
Diese unerwartete Entdeckung, die anhand der folgenden Offenbarung offensichtlich wird, wurde nun dahingehend in die Praxis umgesetzt, dass rekombinantes Chaperonin 10 erwiesenermaßen die gesamte biologische Aktivität aufweist, die zuvor mit EPF assoziiert wurde, und folglich kann EPF nun kommerziell produziert werden, was zuvor mit zur Herstellung von rekombinantem cpn10 geeigneten Techniken nicht möglich war. Es ist auch offensichtlich, dass EPF nun synthetisch hergestellt werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt umfasst die Erfindung die Entdeckung, dass cpn10 EPF ist und die bisher unbekannten oder unvermuteten Eigenschaften hat, die von EPF demonstriert werden. Zu den unbekannten oder unvermuteten Eigenschaften von cpn10 gehören extrazelluläre Aktivitäten wie die Fähigkeit als Wachstumsfaktor und immunsuppressiver Faktor zu fungieren. Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein oder mehrere Verfahren zur Verwendung von cpn10 bereit, um die unbekannten oder unvermuteten Eigenschaften von cpn10 auszunutzen. Das/die eine oder mehreren Verfahren umfassen ein Verfahren zur Verwendung von cpn10 zur Förderung von Wachstum und ein Verfahren zur Verwendung von cpn10 zur Unterdrückung immunologischer Aktivität.
Der hierin verwendete Begriff „cpn10" beinhaltet, sofern Verfahren zur Förderung von Zellwachstum und Immunsuppression betroffen sind, innerhalb seines Umfangs rekombinantes cpn10 sowie synthetisch hergestelltes cpn10. Der Begriff „cpn10" umfasst außerdem eukaryotisches cpn10 sowie prokaryotisches cpn10, einschließlich groES oder Derivate von rekombinantem cpn10. Rekombinantes cpn10 kann durch DNA-Rekombinationstechnologie wie anschließend beschrieben produziert werden. Der Begriff beinhaltet außerdem biologische Fragmente.
Im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt außerdem ein modifiziertes rekombinantes cpn10 sowie Derivate und Peptidfragmente, die davon abstammen.
1. ASSAY FÜR CPN10
Der Nachweis von cpn10 in Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen cpn10 oder gegen Modifikationen oder Fragmente davon alleine oder in Kombination miteinander oder mit cpn60 (in Gegenwart von ATP oder anderen Nucleotidtriphosphaten) zwecks:

(a) Schwangerschaftsdiagnose in einer beliebigen Säugetierspezies;
(b) Überwachung des Wohlbefindens des Embryos bei „Risiko"-Schwangerschaften;
(c) Diagnose von Tumoren; und
(d) Überwachung von Patienten nach einer operativen Entfernung von Tumoren.

2. BEHANDLUNG MIT CPN10
Die Verwendung von rekombinantem cpn10 als Wachstumsfaktor oder Immunsuppressivum zur Behandlung von:

(a) Haut- oder Organtransplantaten;
(b) Wundheilung, Gewebereparatur oder Regeneration von Gewebe;
(c) Autoimmunkrankheiten;
(d) Unfruchtbarkeit/Fehlgeburten;
(e) allergische Erkrankungen; und
(f) Entzündungszuständen.

VERSUCHE
1. REINIGUNG VON CPN10
(a) Reinigung von humanem EPF von humanen Blutplättchen (1a, 1b, 1c, 1d)
Extraktion
Bis zu 7 Tage klinisch überalterte Blutplättchenkonzentrate (von der Blutbank) wurden mit Tyrodes-Puffer gemäß den in Methods in Enzymology, 1989, 169 7–11, beschriebenen Techniken gewaschen, in Flüssig-N₂ schnellgefroren und bei –70°C gelagert.
Unmittelbar vor der Reinigung wurden etwa 100 gewaschene Blutplättcheneinheiten in einem kochenden Wasserbad aufgetaut und anschließend unter ständigem, leichtem Rühren 15 Minuten lang bei 75–85°C gehalten. Nach dem Kühlen auf Eis wurden Zellbruchstücke durch Zentrifugieren (8000 g, 20 min, 4°C) entfernt und das Pellet wurde zweimal durch Homogenisieren in 0,05 M Essigsäure/0,1 M NaCl/0,1 mg/ml Natriumazid, pH 3,0, und dann durch Zentrifugieren (8000 g, 15 min, 4°C) extrahiert. Die drei Überstände wurden gepoolt, um ein Gesamtextraktvolumen von 500–600 ml zu erhalten.
Ionenaustauschchromatographie
Dieser Extrakt von 100 Blutplättcheneinheiten wurde mit konz. HCl auf pH 3,0 eingestellt und über Nacht bei 4°C mit 250 ml SP-Sephadex C-25 (Pharmacia-LKB) leicht verrührt, das zuvor gequollen und mit 0,05 M Essigsäure/0,1 M NaCl, pH 3,0, ausbalanciert wurde. Das Gel wurde dann in eine Säule gepackt, die mit 20 Vol. des gleichen Puffers gewaschen und mit 5 Vol. 0,5 M Natriumphosphatpuffer/0,05 M NaCl, pH 7,5, eluiert wurde. Das Gel wurde anschließend verworfen.
Affinitätschromatographie
Das SP-Sephadex-Eluat wurde mit konz. HCl auf einen pH-Wert von 6,3–6,4 eingestellt und auf eine Säule mit Heparin-Sepharose CL-6B (2,5 × 7,5 cm; Pharmacia-LKB) aufgetragen, die zuvor mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer/0,05 M NaCl, pH 6,3, ausbalanciert wurde. Die Säule wurde dann mit 5 Vol. des gleichen Puffers gewaschen und mit 5 Vol. 0,05 M Tris-HCl/5 mM CaCl₂/0,2 M NaCl, pH 7,5, eluiert, aufgetragen in entgegengesetzter Richtung zur der, die für die Probenapplikation verwendet wurde.
Hydrophobe Hochleistungsinteraktionschromatographie (HIC-h. p. l. c.)
Festes (NH₄)₂SO₄ wurde zum Heparin-Sepharose-Eluat auf eine Endkonzentration von 2 M gegeben und nach der Passage eines 0,45 μm Filters wurde die Probe durch eine dedizierte Lösungsmittelleitung auf eine TSK Phenyl 5PW Säule (7,5 × 75 mm, Pharmacia-LKB) gepumpt, die zuvor mit 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0/5 mM CaCl₂/2 M (NH₄)₂SO₄ ausbalanciert wurde. Die Säule wurde mit 10 Vol. des gleichen Puffers gewaschen und mit einem linearen Gradienten (50 min) von diesem Puffer zu 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0/5 mM CaCl₂/10% Acetonitril eluiert. (1a)
RP-h. p. l. c.-1
Aktive HIC-h. p. l. c.-Fraktionen wurden gepoolt, dann auf einer C₃-Säule (Ultrapore RPSC. Beckman Instruments) mit einem Lösungsmittelsystem aus A, 0,04 M Tris/HCl, pH 7,0/5 mM CaCl₂ und B, 0,04 M Tris/HCl, pH 7,0/5 mM CaCl₂/80% (v/v) Acetonitril fraktioniert. Die Säule wurde mit Lösungsmittel A vor der Probenapplikation ausbalanciert und anschließend mit 5 Vol. Lösungsmittel A gewaschen und mit einem linearen Gradienten (30 min) von diesem Lösungsmittel zu 75% Lösungsmittel B eluiert. (1b)
RP-h. p. l. c. 2
Aktive Fraktionen von RP-h. p. l. c.-1 mehrerer 100-Einheitsblutplätchenpräparate wurden gepoolt, EDTA und DTT wurden auf eine Endkonzentration von jeweils 20 mM und 1 mM zugegeben und das Gemisch wurde bei 4°C 0,5 bis 1 Stunde lang stehen gelassen. Nach dem Verdünnen mit 2 Vol. Lösungsmittel A wurde es auf eine C₃-Säule aufgetragen, die für diesen und folgende Schritte bestimmt war, und wie für RP-h. p. l. c-1 beschrieben fraktioniert, wobei jedoch CaCl₂ weggelassen wurde. (1c)
RP-h. p. l. c. 3
Aktive Fraktionen von RP-h. p. l. c.-2 wurden gepoolt, Trifluoressigsäure (TFA) wurde auf eine Endkonzentration von 0,1% zugegeben und nach dem Verdünnen mit 2 Vol. 0,1% TFA wurde das Gemisch auf die C₃-Säule aufgetragen, die zuvor mit 0,1% TFR ausbalanciert worden war. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten (30 min) von diesem Lösungsmittel zu 60% (v/v) Acetonitril/0,1% TFA eluiert, gefolgt von einem linearen Gradienten (3 min) zu 90% (v/v) Acetonitril/0,1% TFA. Aktive Fraktionen wurden gepoolt. (1d)
Eine Einheit repräsentiert Blutplättchen von einer einzelnen Blutspende von etwa 500 ml. Die „aktiven Fraktionen" waren Fraktionen, die im Rosetteninhibitionstest aktiv waren.
Reinigung von EPF von anderen Quellen
EPF wurde, wie in Cavanagh & Morton, 1994, Eur. J. Biochem. 222 551–560; Quinn et al., 1994, Hepatology 20 No 5 1294–1302 erörtert, von verschiedenen Quellen gereinigt.
In jedem Fall folgte die biologische Aktivität dem gleichen Muster während des komplexen Reinigungsschemas, das oben für humane Blutplättchen beschrieben wurde. Ferner wurde die letzte aktive Fraktion von allen Quellen spezifisch durch einen immobilisierten monoklonalen Anti-EPF gebunden und konnte praktisch quantitativ wiedergewonnen werden (siehe 1e).
Diese Studien sind aus mehreren Gründen von Bedeutung:

A. Die bei allen diesen Materialien beobachtete biochemische und immunologische Ähnlichkeit liefert einen starken Beweis, dass der Bioassay eine einzelne Substanz oder eine nahe verwandte Familie von Substanzen nachweist, die in verschiedenen biologischen Situationen wirken.
B. Die von allen diesen Materialien gereinigten aktiven Agenzien sind um mehrere bis viele Größenordnungen wirksamer als praktisch alle Substanzen, die vorherigen Berichten zufolge EPF sind. Dies bestätigt unsere Vermutung, die auf ausführlichen Analysen des oben erörterten EPF-Bioassays beruht, dass Aktivität in Verbindung mit den meisten angeblichen EPF-Präparaten die Anwesenheit eines sehr kleinen Kontaminanten reflektieren muss.
C. Die einzigen Ausgangsmaterialien, die ausreichend EPF für eine Studie auf Protein-(gegenüber Aktivitäten)-Niveau lieferten, waren Blutplättchen und regenerierende Leber, die jeweils durchschnittlich 15 μg je 100 Einheiten (äquivalent zu ~50 Liter Blut) und 5 μg je 40 g Gewebe (Leberrest von 6 Ratten) hervorbrachten. Es ist sofort offensichtlich, dass weit mehr EPF innerhalb der Zelle vorliegt, als im extrazellulären Raum auftritt; dennoch zeigen gesammelte Kenntnisse über die Biologie von EPF (kürzlich in der oben genannten Quelle Morton et al. 1992 besprochen), dass dieses extrazelluläre Auftreten nicht zufällig ist.

Von humanen Blutplättchen abstammender EPF, von dem es jede Menge gibt, wurde ausführlichen Studien unterzogen. Im Rahmen einer SDS-PAGE lief er als eine einzelne Bande von etwa M_r 8.500, übereinstimmend mit biologischer Aktivität (siehe 2a); EPF von regenerierender Rattenleber zeigte ein identisches Verhalten. Eine Massenspektrometrie des Blutplättchenmaterials lieferte eine genaue und präzise Bestimmung der Molekülmasse, 10.843,5 ± 2 Da, sowie einen eindeutigen Beweis für den hohen Grad an Homogenität des Präparats (siehe 2b). Im Anschluss an Versuche mit einem Edman-Abbau, die zeigten, dass das Molekül N-blockiert ist, erfolgte eine proteolytische Spaltung von etwa 4 nmol EPF. Resultierende Peptidfragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC separiert und einer Sequenzierung durch Edman-Abbau unterzogen. Man fand, dass drei Sequenzbereiche mit 12 (Fragment 1), 27 (Fragment 2) und 33 (Fragment 3) Resten den Resten 7 bis 18, 27–53 und 69–101 (C-Terminus) in cpn10 von Ratten-Mitochondrien entsprachen. In Fragment 2 war der Rest 52 unterschiedlich (S in cpn10, G in Ratten-cpn10; alleine diese Veränderung konnte eine Erklärung dafür sein, dass humanes cpn10 30 Da größer als Ratten-cpn10 war). Alle anderen Reste waren identisch, was mit der hochkonservierten Beschaffenheit von Chaperoninen übereinstimmte (siehe 2c).
Seit der Bestätigung der Sequenzidentität zwischen EPF und cpn10 wurden mehrere Studien über die funktionelle Beziehung unter Verwendung von cpn10 von Ratten-Mitochondrien, E. coli-cpn10 (bekannt als groES) und E. coli-cpn60 (groEL) durchgeführt. Zunächst wurde demonstriert, dass cpn10 als EPF fungieren kann. Ratten-cpn10 wurde im EPF-Bioassay getestet und erwies sich über den erwarteten Verdünnungsbereich als positiv; diese Aktivität konnte durch monoklonale Antikörper gegen EPF neutralisiert werden (siehe TABELLE 1). Interessanterweise zeigte E. coli-cpn10, das –40% homolog zu Ratten-cpn10 ist, keine Aktivität im Bioassay (siehe TABELLE 1); dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass E. coli-konditioniertes Medium im EPF-Bioassay nicht aktiv ist, wohingegen Medium, das durch alle getesteten Säugetierzelllinien sowie durch Hefezellen konditioniert wird, aktiv ist. Cpn60 war im Bioassay inaktiv und hatte keinen Effekt auf die Aktivität von EPF. Anschließend wurde gezeigt, dass EPF als cpn10 wirken kann. EPF wurde mit cpn60 in An- oder Abwesenheit von ATP vermischt, und das Gemisch wurde auf einer TSK G3000SW Gelpermeationssäule fraktioniert; die resultierenden Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert. Cpn60 ist ein Decatetramer, das im Ausschlussvolumen dieser Säule (Ausschlusslimit 300.000) eluiert. In Anwesenheit von ATP, aber nicht in seiner Abwesenheit, erscheint EPF auch in dieser Fraktion, wodurch die Bildung eines stabilen Komplexes mit cpn60 demonstriert wird. Diese Fraktion war im EPF-Bioassay aktiv, die äquivalente Fraktion aus dem Experiment ohne ATP (wo EPF nicht mit cpn60 assoziierte) jedoch nicht (siehe 3a). Somit liegt EPF- und cpn10-Aktivität im selben Molekül vor.
Diese Untersuchungen liefern einen eindeutigen Beweis, dass von Blutplättchen stammender EPF ein strukturelles und funktionelles Homolog von cpn10 ist; anschließend wurde die Beziehung zwischen cpn10 und der Aktivität im Rosetteninhibitionstest untersucht (3b). In Anwesenheit, aber nicht in Abwesenheit von ATP, konnte immobilisiertes cpn60 die gesamte Aktivität aus dem archetypischen Ausgangsmaterial, Schwangerschaftsserum, entfernen und Aktivität konnte durch Entfernen von ATP aus dem immobilisierten Komplex wiederhergestellt werden. Wie bei dem in 3a beschriebenen Experiment demonstriert dieser Bedarf an ATP die Spezifität der Interaktion zwischen cpn60 und dem aktiven Anteil; cpn10 ist somit das molekulare Objekt, das im EPF-Bioassay die Reaktion initiiert.
Die Identifikation von EPF als cpn10 war in der Erforschung dieses Themas ein großer Schritt nach vorne und hilft bei der Erklärung der vielen bis heute gemachten Erkenntnisse. Kritik wurde gegen Behauptungen erhoben, dass die EPF-Produktion in einer solch großen Vielfalt biologischer Situationen stattfindet, z. B. Prä- und Postimplantationsschwangerschaft, Primär- und Tumorzellvermehrung und Blutplättchenaktivierung. In seiner Rolle als hsp (Hitzestressprotein) nach dem Auftreten der vorliegenden Erfindung sind dies alles Bedingungen, in denen das schnelle Einsetzen der EPF-Produktion nun erwartet würde. Funktionen von hsp, die für das Überleben von Zellen wesentlich sind, sind, wie in der obigen Quelle von Linquist et al. dargestellt, intrazellulär. Im Gegensatz dazu ist die bisher beschriebene Aktivität von EPF extrazellulär; sie erscheint in Serum von Mäusen zum Beispiel innerhalb von 4 bis 6 Stunden nach der Paarung, wie in Morton et al., 1987, Current Topics in Development Biology, Bd. 23 73–92 erörtert, und 4 bis 8 Stunden nach einer teilweisen Hepatektomie bei Ratten, wie in der Quinn Dissertation (1991) dargestellt ist. Wir haben gezeigt, dass EPF in einem autokrinen Modus, wie in der oben genannten Quelle von Quinn et al. 1990 erörtert, oder in einem exokrinen Modus wirken kann, wie in der oben genannten Quelle von Rolfe et al. 1988 erörtert; diese Funktionen von hsp wurden bisher nicht beschrieben.
Es ist auch zu verstehen, dass nun, da die Struktur von EPF bekannt ist, es durch jede beliebige geeignete Technik der DNA-Rekombinationstechnologie in kommerziellen Mengen produziert werden kann.
(b) Klonieren humaner cDNA, die cpn10 kodiert, und Produktion von cpn10

Eine kommerziell nützliche Produktion kann dadurch erreicht werden, dass ein Säugetier-cpn10-Gen, vorzugsweise ein humanes cDNA cpn10-Gen, in einen geeigneten Vektor wie Plasmide aus dem pGEX System und pET System, das das kodierte Säugetier-cpn10 exprimiert, eingesetzt und das rekombinante cpn10 gereinigt wird. Abkürzungen

ANGIS	Australian National Genomic Information Service
bp	Basenpaar
BSA	Rinderserumalbumin
cDNA	komplementäre DNA
cpn10	Chaperonin 10
DNA	Desoxyribonukleinsäure
E. coli	Escherichia coli
GSH	Glutathion (reduzierte Form)

GST	Glutathion-S-Transferase
LB	Luria-Bertani-Nährlösung
M	Molar
ORF	offenes Leseraster
PCR	Polymerasekettenreaktion
rEPF	rekombinanter früher Schwangerschaftsfaktor
RSP	Umkehrsequenzierungsprimer
SDS	Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE	Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
Tris	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
USP	universaler Sequenzierungsprimer

Materialien und Verfahren
Klonieren eines offenen Leserasters von humanem cpn10
Es wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt, um zuerst einen Teil des ORF (274 bp) der humanen cpn10 cDNA von einer Melanomzelllinien-A2058-cDNA-Lambda-Bibliothek (Stratagene) zu amplifizieren. Ein degenerierter cpn10 Amplimer (P1) wurde von der Aminosäuresequenz VLDDKDYFL entworfen, die den Aminosäureresten 83–91 von humanem cpn10 entsprach. Der Primer P1 hatte die Sequenz 5' ARRAARTARTCYTTRTCRTC 3', wobei R A oder G und Y C oder T ist. Der Umkehrsequenzierungsprimer (RSP) wurde zur PCR-Amplifikation (der unspezifische Primer) sowie zur Sequenzierung von DNA-Konstrukten verwendet und hatte die Sequenz 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3'. Der universelle Sequenzierungsprimer hatte die Sequenz 5' GTARAACGACGGCCAGT 3'. Eine PCR-Amplifikation der Phagenbibliothek wurde mit einem unspezifischen stromaufwärtigen Amplimer (RSP) und P1, jeweils mit einer Endkonzentration von 0,5 μM, 1,5 mM MgCl₂ (Pharmacia Biotech), 1X Polymerasepuffer (Boehringer Mannheim) und 5 Einheiten Thermus aquaticus DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) in einem Endvolumen von 50 μl erreicht. Für 30 Zyklen lauteten die Parameter: Denaturieren 1 min bei 94°C, Tempern 30 sec bei 40°C und Extension 3 min bei 72°C. Einer letzten Extension bei 72°C für 7 min folgte ein 10-minütiger Einweichzyklus bei 4°C. Eine Aliquote von 1 μl wurde unter den gleichen Bedingungen reamplifiziert, um die Kopiezahl zu erhöhen.
Es wurden zwei cpn10 spezifische Amplimer konstruiert, die das offene Leseraster umschlossen. Der stromaufwärtige Primer P2, 5'-GCGCGGATCCATGGCAGGACAAGCGTTTAG-3', wurde von der Sequenz des anfänglichen PCR-Fragments konstruiert. Der stromabwärtige Primer P3, 5'-ATATGAATTCAGTCTACGTACTTTCC-3', wurde von der von der „Expressed Sequence Tag"-Datenbank über ANGIS (Beitritts-Nr. HUM00TB037) erhaltenen Sequenz konstruiert. Ein 319 bp Fragment wurde von der Phagenbibliothek unter Verwendung der gleichen Reaktions- und Cycling-Bedingungen wie oben amplifiziert, mit der Ausnahme, dass die Tempertemperatur 50°C betrug.
DNA-Konstrukte und Analyse
Alle Restriktionsenzymverdaus von PCR-Produkten und Vektoren wurden gemäß Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) mit Restriktionsenzymen und ihren Puffern von Boehringer Mannheim durchgeführt. Das anfängliche PCR-Fragment wurde mit Eco R1 verdaut und ligiert (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) in Eco R1 und Sma I Orte von pBluescript KS(+) (Stratagene), so dass das Plasmid pRM1 erzeugt wurde (4; teilweises cpn10 Insert 274 bp). Das 319 bp Produkt wurde mit Bam HI und Eco R1 verdaut und zuerst in das Expressionsplasmid pGEX-2T (Pharmacia Biotech) kloniert, so dass das Plasmid pRM2 erzeugt wurde (5). Zur Bestätigung seiner Identität wurde das Bam HI-Eco R1 Fragment in pBluescript (SK+) (pRM3; 6) subkloniert und sequenziert. DNA wurde auf 0,8–1,0% (w/v) Agarosegelen mit Ethidiumbromid analysiert und nach der Elektrophorese unter UV-Bestrahlung betrachtet.
Transformation von E. coli
Kompetente E. coli DH5α-Zellen (100 μl) wurden mit den Plasmiden durch das Wärmeimpulsverfahren (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) transformiert. Das Gemisch aus Zellen und DNA (10–100 ng) wurde 30 Minuten lang auf Eis gelegt und exakt 2 Minuten bei 42°C wärmegepulst und 2 Minuten lang zurück auf Eis gelegt. Die Zellen ließ man nach der Zugabe von 0,9 ml LB bei 37°C unter Schütteln 1 Stunde lang regenerieren. Eine 100 μl Aliquote wurde auf LB-Agarplatten plattiert, die mit Ampicillin mit einer Endkonzentration von 100 μg/ml angereichert waren. Nach einer Übernachtinkubation bei 37°C wurden zufällige Kolonien für weitere Untersuchungen ausgewählt.
DNA-Sequenzbestimmung
Restriktionsfragmente der PCR-Produkte wurden in pBluescript kloniert und durch das Didesoxykettenabschlussverfahren mit dem T7 Polymerasekit gemäß Herstelleranweisungen (Pharmacia Biotech) in beide Orientierungen sequenziert. Etwa 2 μg Plasmid-DNA wurden denaturiert, ethanolpräzipitiert und entweder am USP, RSP oder P3 angelagert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem 8% Acrylamid/46% Harnstoff-Gel der Elektrophorese unterworfen. Nach dem Fixieren und Trocknen wurde ein Röntgenfilm über Nacht dem Gel ausgesetzt und entwickelt.
Expression und Reinigung von rekombinantem cpn10 in E. coli
Mit pRM2 transformierte Klone wurden im Hinblick auf eine Expression des Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteins auf einer kleinen Kulturskala (2 ml) gemäß den von Smith et al. (Smith et al., 1988, Gene 67 (1) 31–40) beschriebenen Verfahren gescreent. Eine Übernachtkultur wurde verdünnt, zum Exprimieren des Fusionsproteins durch die Zugabe von IPTG zu 0,1 mM induziert und mehrere Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Die Zellen wurden pelletiert, in PBS/0,1% Triton X-100 lysiert und das Lysat wurde mit 50 Glutathion-Agarose-Kügelchen (Sigma Chemical Company) vermischt. Das rekombinante Fusionsprotein wurde von den Affinitätskügelchen durch Kochen in SDS-Ladepuffer eluiert. Eine Aliquote der Probe wurde auf einem 10% SDS-PAGE-Gel laufen gelassen. Das Gel wurde fixiert und dann mit Coomassie-Blau gefärbt. Nach dem Bestätigen der Expression des Fusionsproteins fand die Reinigung von rcpn10 von dem GST-Anteil in größerem Maßstab statt.
Zellen wurden wie oben gezüchtet und induziert, das Zellpellet wurde in PBS resuspendiert, beschallt (Ausgangsleistung 4, 50% Arbeitszyklus, 2 × 30 sec) und das Zelllysat wurde bei –30°C gelagert. Lysat von einer 10-Liter-Zellkultur wurde aufgetaut und rcpn10 wurde durch ähnliche Techniken wie die von Gearing et al. (Gearing et al., 1989, Biotechnology 7 1157–1161) für die Isolation von rLIF verwendeten isoliert. Kurz, Triton X-100 wurde auf eine Endkonzentration von 0,1% zugegeben und Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt (15 min, 15.000 rpm, 4°C). Zehn ml Glutathion-Sepharose 4 B Gel (Pharmacia – LKB Biotechnologie) wurden zum Überstand gegeben und der Schlamm wurde 2 Stunden lang bei 4°C vermischt. Das Gel wurde pelletiert, 5 Mal mit 50 ml PBS/0,1% Triton X-100, einmal mit 50 ml 0,05 M Tris-HCl, pH 8,9/0,15 M NaCl und einmal mit 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0/0,15 M NaCl/2,5 mM CaCl₂ gewaschen. Das Gel wurde in 4 ml 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0/0,15 M NaCl/2,5 mM CaCl₂-Puffer resuspendiert, 1000 Einheiten Thrombin (Sigma T6884) wurden zugegeben und der Schlamm wurde in einem Schüttelwasserbad 1 Stunde lang bei 37°C vermischt. Das Gel wurde pelletiert, der Überstand zurückgehalten und das Gel wurde mit 3 × 4 ml 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0/0,15 M NaCl gewaschen. Diese Waschflüssigkeiten und der erste Überstand mit dem rcpn10 wurden gepoolt, so dass 4–5 mg rekombinantes Protein gewonnen wurden. Zusätzliches rcpn10, das unspezifisch an das Gel gebunden war, wurde wie folgt gewonnen. Vier ml 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0/2 M NaCl wurden zugegeben und der Schlamm wurde 2 Stunden lang bei 4°C vermischt.
Nach dem Pelletieren wurde das Gel mit 3 × 2 ml dieses 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0/2 M NaCl-Puffers gewaschen, die Waschflüssigkeiten wurden mit dem ersten Überstand gepoolt, so dass noch etwa 1 mg rcpn10 gewonnen wurde. Proteinkonzentrationen wurden mit dem Verfahren von Lowry et al. (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193 265–275) geschätzt; Proteine wurden durch SDS-PAGE mit 15% Tris-Tricin-Gelen analysiert (Schagger et al., 1987, Anal. Biochem. 166 368–379).
Das rekombinante cpn10 hat zwei zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus. Der N-Terminus des rekombinanten Proteins ist Gly-Ser-Methionin-Ala, wohingegen der N-Terminus des nativen Proteins Ac-Ala ist. Die Aminosäuresequenz des rekombinanten cpn10 lautet wie folgt:
2. ANWENDUNG VON SÄUGETIER-CPN10
(a) Assay für cpn10
Antigen
Ein bakterielles Fusionsprotein, GST/cpn10, wurde exprimiert und isoliert mit Glutathion-Sepharose, wie dies für die Präparation von cpn10 beschrieben wurde. Das Fusionsprotein wurde von dem Gel durch Auftragen von 50 mM reduziertem Glutathion in Tris-gepufferter Salzlösung eluiert. Eluierte Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und diejenigen mit dem meisten Fusionsprotein wurden gepoolt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Verfahren von Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193 265–275 bestimmt.
Antikörper
Antikörper gegen das Fusionsprotein wurden in Kaninchen unter Verwendung eines Immunisierungsplans angehoben, der 4 wöchentliche Injektionen und anschließend wenigstens 4 monatliche Boosts umfasste. Etwa 10 μg Protein, emulgiert in komplettem Freundschem Adjuvans für die erste Injektion und anschließend in inkomplettem Adjuvans, wurden für jede Injektion verwendet. Kaninchenserum wurde im Hinblick auf Anti-cpn10-Antikörper durch ELISA unter Verwendung von Platten, die anfangs mit cpn10 (5 μg/ml) beschichtet wurden, und einem Streptavidin-Biotin-Nachweissystem (Amersham) gescreent. Die Antikörper-(Ab)-Titer gegen cpn10 und gegen das gesamte Fusionsprotein (in diesem Fall war GST/cpn10, 5 μg/ml, an die Platte gebunden) im Serum von Kaninchen Nr. 42 sind in 7 dargestellt. Die Titration einer Serumprobe gegen cpn10, die von diesem Kaninchen nach der 4. Booster-Dosis entnommen wurde, ist in 8 dargestellt.
Immunoassay
Dieser Antikörper wurde dann in einem kompetitiven Bindungsassay für den Nachweis von cpn10 verwendet, der wie folgt durchgeführt wurde. Antiserum, verdünnt 1 : 32.000 und 1 : 64.000 (Endverdünnung; Verdünnungsmittel 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, mit 0,2% w/v Gelatine), wurde inkubiert, separat (über Nacht, 4°C) mit verschiedenen Konzentrationen von cpn10. Diese Gemische wurden dann durch ELISA wie oben beschrieben in Platten, die mit 5 μg/ml cpn10 beschichtet waren, getestet, wie die in 9 dargestellt ist. Die Absorbanzwerte für jedes Antikörper/cpn10-Gemisch werden mit den Werten verglichen, die für die gleiche Antikörperverdünnung erhalten wurden, die ohne cpn10 inkubiert wurde. Der Grad der Inhibition einer Antikörperbindung an die Platte ist proportional zur Menge von cpn10 in dem ursprünglichen Antikörper-cpn10-Gemisch; hiervon kann eine Standardkurve wie in 10 dargestellt konstruiert werden.
Während Nr. 42 nicht empfindlich genug ist, um die sehr geringe Konzentration von cpn10 im Serum nachzuweisen, haben wir Techniken ermittelt, die Folgendes können:

(1) einen Anti-cpn10-Antikörper produzieren, der normale Hyperimmunisierungseigenschaften aufweist; folglich könnte mit bekannten Techniken zur Verbesserung der Immunantwort ein Antikörper mit höherer Aktivität produziert werden; und
(2) eine Reaktion in einer standardmäßigen Immunoassaytechnik hervorrufen.

Mit verbesserten Antikörpern, der Anwendung bekannter Verfahren zur Verbesserung des Nachweissystems und Vorbehandlung von Serum, um cpn10 zu konzentrieren und teilweise zu reinigen (z. B. durch Aufbringen auf C₁₈ Seppak-Kartuschen [Waters] und Elution mit 80% Acetonitril in Tris-gepufferter Salzlösung, oder auf immobilisiertes cpn60 in Anwesenheit von ATP und Elution mit EDTA) könnte diese Technik alleine oder in Kombination mit anderen Immunoassaytechniken für den Nachweis von cpn10 in Serum entwickelt werden.
Sensitivität des Rosetteninhibitionstests, der EPF-Bioassay Der Rosetteninhibitionstest ist nicht quantitativ und kann nicht zur genauen Bestimmung der cpn10-Konzentration in Serum verwendet werden. Der Assay kann semiquantitativ durch Vergleichen der Grenzdosis von Proben angewendet werden, d. h. die höchste Probenverdünnung, die eine Positionsreaktion im Bioassay gibt. Bei diesem Ansatz ist vorsichtig vorzugehen, da andere Substanzen in komplexen biologischen Flüssigkeiten, die an sich im Bioassay inaktiv sind, die Reaktion aktiver Materialien beeinflussen können.
Wir haben festgestellt, dass der Bioassay geringe Mengen von, nur 5–50 ag/ml an reinem cpn10 nachweisen kann (Cavanagh et al., 1994, Eur. J. Biochem. 202 551–560). Auf der Basis der beobachteten Grenzdosis von Serum schwangerer Frauen (wobei bekannte Hemmsubstanzen aus frühem Schwangerschaftsserum entfernt wurden) und tumortragenden Tieren und Personen sowie von Ratten 24 Stunden nach einer teilweisen Hepatektomie liegt die cpn10-Konzentration von Serum wahrscheinlich zwischen 0,1 und 100 pg/ml.
3. BEHANDLUNG MIT CPN10
(a) Organ-/Hauttransplantate
DER EFFEKT VON REKOMBINANTEM CPN10 AUF DAS ÜBERLEBEN VON ALLOGENEN HAUTTRANSPLANTATEN BEI RATTEN
Hauttransplantation
Hauttransplantate wurden zwischen Inzucht-Lewis- und DA-Ratten (100 g) anhand des folgenden Protokolls ausgetauscht. Abdominalvollhaut wurde auf einen auf der seitlichen Brustkorbregion erzeugten ähnlich großen Defekt mit Standardtechniken genäht. In einer Sitzung wurde eine Gruppe von sechs Ratten einer Transplantation unterzogen, dabei erhielt jede Ratte ein Autotransplantat und ein Allotransplantat. Zwei Lewis- und 2 DA-Ratten erhielten täglich 2 Injektionen mit rekombinantem cpn10 und eine Lewis- und eine DA-Ratte erhielten Pufferinjektionen um die Transplantatstelle. Verschiedene Gruppen erhielten verschiedene cpn10-Dosen. Die Injektionen wurden 14 Tage lang durchgeführt. Die Transplantate wurden mit Vaseline-Mull, Melolin-Verband, Kunststoffwickel und Co-Flex-Elastikbandage bedeckt. Nach 7 Tagen wurden die Transplantate täglich auf Anzeichen einer Nekrose untersucht. Der Tag der Abstoßung war der, an dem 50% der transplantierten Haut einen nekrotischen Abbau aufwiesen.
Lebensdauer von cpn10-Aktivität in Serum nach der Injektion von rekombinantem cpn10 in Mäuse
Verschiedene Dosen von rekombinantem cpn10 (siehe 11) wurden i. p. in BALB/c Mäuse (~20 g) injiziert, und den Mäusen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung, beginnend bei 15 Minuten (Zeitpunkt Null), Blut entnommen. Das Serum wurde in Bezug auf cpn10-Aktivität im Rosetteninhibitionstest (siehe Morton et al., 1987, Current Topics in Developmental Biology 23 73–92) mit Milzzellen von C57BL/6 Mäusen getestet. Mäuse, die Blutplättchen-cpn10 erhielten, wurden parallel getestet. Es wurde die Halbwertszeit der cpn10-Aktivität in Serum bestimmt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in TABELLE 2 und 11 dargestellt.
Nach der Injektion von rekombinantem cpn10 (p < 0,001, t-Test nach Student) wurde eine wesentliche Verlängerung der Transplantatüberlebensdauer festgestellt. Die Ergebnisse wiesen eine glockenförmige Dosisreaktionskurve auf, wobei die effektivsten Dosen zwischen 2 und 20 μg cpn10 2 ×/Ratte/Tag lagen. Die Experimente mit den Mäusen legen den Schluss nahe, dass dieses rekombinante cpn10 im Vergleich zu Blutplättchen-cpn10 eine kürzere Halbwertszeit in Serum als erwartet hat; die Halbwertszeit von 1 μg und 15 μg von rekombinantem cpn10 in Serum von Mäusen lag im Vergleich zu Blutplättchen-cpn10 (5 μg), das eine Halbwertszeit von 4 Tagen hatte, jeweils bei nur 3 Stunden und 7 Stunden. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass cpn10 die Lebensfähigkeit von allogenen Hauttransplantaten bei Ratten wesentlich verlängern kann (siehe TABELLE 2).
(b) Behandlung von Säugetieren, einschließlich Menschen, mit cpn10, zur Unterstützung der Wundheilung
DIE BETEILIGUNG VON CPN10 AN DER GEWEBEREPARATUR
Wachstumsfaktoren sind wahrscheinlich am Heilungsprozess beteiligt, da ihre anfängliche Freisetzung von Blutplättchen eine grundlegende Bedeutung bei der Reparatur von Wunden hat (Falange, 1993, J. Dermatol. Surg. Oncol. 19 716–720). Es hat sich gezeigt, dass Blutplättchen eine reiche cpn10-Quelle sind (cpn10; Cavanagh et al., 1994, Eur. J. Biochem 222 551–560) und daher einer der Wachstumsfaktoren sein können, die maßgeblich an der Wundheilung beteiligt sind. Es wurden Studien durchgeführt, um den Effekt von topisch aufgebrachtem cpn10 (rcpn10) auf die Heilung von Vollhautdefekten bei Mäusen zu bestimmen.
Verfahren
Männliche Auszucht-Quackenbush-Mäuse (8 Wochen alt) wurden mit Nembutal anästhesiert, rasiert, ihre Haut wurde mit 70% v/v Ethylalkohol desinfiziert und es wurde ein Volldefekt (8 mm Durchmesser) in der seitlichen Brustkorbregion erzeugt. Ein μg rcpn10 in 5 μl Tris-gepuffertem 0,9% w/v Natriumchlorid (Salzlösung), pH 7,4, Tris-gepufferter Salzlösung alleine (5 μl) oder Salzlösung alleine (5 μl) wurde direkt auf die Wunde aufgetragen, die dann mit Vaseline-Mull, nicht anhaftendem Melolin-Verband, festgehalten von einer Co-Flex-Elastikbandage, abgedeckt wurde. Die Mäuse wurden zweimal pro Tag leicht mit Halothan (Fluothan, ICI) anästhesiert, die Verbände wurden abgenommen, 5 μl der entsprechenden Lösung wurden aufgetragen und die Wunde wurde wieder neu verbunden. Zu verschiedenen Zeitpunkten, d. h. 24 h, 48 h, 3 T, 4 T, 5 T, 6 T und 7 T, wurden Gruppen von Mäusen mit Halothan euthanasiert, Wunde und umliegendes Gewebe wurden entfernt und die Wundfläche wurde gemessen.
Ergebnisse
Nach einer Behandlung mit rcpn10 kam es im Vergleich zu Wunden, die mit Puffer oder Salzlösung behandelt wurden, zu einer wesentlichen Beschleunigung der Wundkontraktion (12). Bei den mit cpn10 behandelten Wunden begann die Wundkontraktion innerhalb der ersten 24 Stunden, wohingegen die Kontraktion der Kontrollwunden nach 2 Tagen begann (12). Ab dem 3. Tag gab es keinen bedeutenden Unterschied bezüglich der Wundgröße.
Schlussfolgerungen
Auf Vollwunden bei Mäusen topisch aufgetragenes cpn10 beschleunigt die Kontraktion und Heilung, wobei der Prozess direkt nach der Verletzung einzusetzen scheint. Bei den Kontrollmäusen wurde eine Wundkontraktion erst nach mindestens 48 Stunden sichtbar.
Normalerweise erfolgt die Wundheilung in drei Phasen. Phase 1, die Entzündungsphase (0–48 h), beginnt unmittelbar nach der Verletzung und ist der Zeitpunkt, an dem aktivierte Blutplättchen Wachstumsfaktoren in den Defekt sekretieren, wodurch die Fibroblastenaktivierung erleichtert und die Aktivität der Zellen, z. B. Makrophagen, erhöht wird, die in den folgenden Stadien der Wundheilung involviert sind. Phase 2, die Proliferationsphase (2–6 Tage), beginnt mit dem Auftreten der ersten Fibroblasten und der Vermehrung und Wanderung von Epidermiszellen zur Wundstelle. Phase 3 ist die Maturationsphase.
Die Wundkontraktion beginnt normalerweise nicht in Phase 1, die auch als Lag-Phase bekannt ist. Während dieser Phase wird die Gestalt und Größe der exzidierten Wunde durch Spannkräfte in der angrenzenden Haut beeinflusst. Diese Kräfte vergrößern die anfängliche Größe des Defekts und erzielen eine andere Gestalt, die den Spannungslinien in der Haut entspricht. Wie wir in den mit Puffer oder Salzlösung behandelten Gruppen von Mäusen demonstriert haben, vergrößerten sich die Wunden in den ersten 48 Stunden. Im Gegensatz dazu zogen sich die Wunden der mit rcpn10 behandelten Mäuse während dieser Zeit zusammen, was darauf schließen lässt, dass die direkte Verabreichung von rcpn10 auf die Wunde die Migration von Fibroblasten zur und Absetzung von Kollagen auf die Wundfläche beschleunigt. Diese Erkenntnis wird in der Behandlung von Wunden wie Verbrennungen eine enorme Bedeutung haben, da durch eine beschleunigte Wundkontraktion Flüssigkeitsverlust und Infektionsrisiken stark verringert werden.
(c) Autoimmunkrankheit
DER EFFEKT VON CPN10 AUF DIE ENTWICKLUNG EXPERIMENTELLER ALLERGISCHER ENZEPHALOMYELITIS BEI RATTEN, EINEM TIERMODELL DER AUTOIMMUNKRANKHEIT
Einleitung
Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) ist eine Demyelinationsautoimmunkrankheit des Nervensystems, die durch Inokulation von Tieren mit basischem Myelinprotein (MBP) des zentralen Nervensystems in Adjuvans induziert wird und als Tiermodell von multipler Sklerose weithin untersucht wird (Raine, 1984, Laboratory Investigation 50 608–635). Die klinischen Merkmale von EAE in einer Ratte, einer gewöhnlich untersuchten Spezies, sind ein drastischer Gewichtsverlust über Nacht ab dem 10. Tag nach der Inokulation, gefolgt von einer Schwanzschwäche und -lähmung, Hinterbeinschwäche und gelegentlich -lähmung. Gelegentlich kommt es zu einer Vorderbeinschwäche und -lähmung (Pender, 1986, Journal of Neurological Sciences 75 317–328). Es wurden Experimente durchgeführt, um zu ermitteln, ob die Verabreichung von rcpn10 an Ratten nach der Inokulation den Krankheitsverlauf beeinflusst.
Verfahren
EAE-Modell: EAE wurde in weiblichen Inzucht-Lewis-Ratten (Alter – 10 Wochen) nach der Inokulation mit MBP in Freundschem Adjuvans in einen Fußballen induziert. Die Studie umfasste drei Gruppen von Ratten. Alle wurden am Tag 0 inokuliert. Gruppe 1 (n = 4) erhielt keine Behandlung und die Tiere wurden im Laufe der Inkubationsperiode der Krankheit (Tag 0 bis Tag 8) nicht behandelt. Gruppe 2 (Kontrollgruppe; n = 5) erhielt Tris-gepufferte Salzlösung (0,1 ml) i. p. 2 Mal täglich vom Tag 0 bis Tag 20. Gruppe 3 (Testgruppe; n = 5) erhielt 15 μg rcpn10 in Tris-gepufferter Salzlösung (0,1 ml) i. p. 2 Mal täglich vom Tag 0 bis Tag 20. Ab dem B. Tag wurden alle Ratten gewogen und 30 Tage lang täglich untersucht.

(I) Die Schwanzschwäche wurde wie folgt eingestuft: 0 = keine Schwäche 1 = Schwäche nur im distalen Teil des Schwanzes; distales Schwanzteil kann sich nicht um den Finger des Untersuchers wickeln 2 = Schwäche im gesamten Schwanz, allerdings kann das proximale Schwanzteil noch immer gegen die Schwerkraft senkrecht aufgerichtet werden 3 = starke Schwäche, mit nur einem Anflug einer Schwanzbewegung 4 = komplette schlaffe Paralyse des Schwanzes.
(II) Die Hinterbeinschwäche wurde wie folgt eingestuft: 0 = keine Schwäche 1 = leichtes Schleifen der Zehen beider Hinterfüße 2 = starkes Schleifen beider Hinterfüße, aber nicht der restlichen Hinterbeine; 3 = starkes Schleifen beider Hinterbeine, wobei beide Hinterbeine oft zu einer Seite des Körpers hin verlagert sind 4 = totale schlaffe Paralyse der Hinterbeine
(III) Die Vorderbeine wurden in ähnlicher Weise wie die Hinterbeine bewertet.

Die Gesamtpunktzahl war die Summe aus den Punkten in (I), (II) und (III).
Ergebnisse
Der Zeitpunkt des Gewichtsverlustbeginns und der Zeitraum des maximalen Gewichtsverlustes in den Gruppen, die keine Behandlung oder nur Salzlösungsinjektionen erhielten (Kontrollgruppe), unterschieden sich nicht wesentlich (Tabelle 3). Der anfängliche Gewichtsverlust sowie der Zeitraum des maximalen Gewichtsverlustes waren jedoch in der Gruppe, die cpn10 erhielt (Testgruppe), im Vergleich zur Gruppe ohne Behandlung, verzögert (Tabelle 3; p < 0,001 χ² Verteilung). Es gab keinen wesentlichen Unterschied zwischen den Mittelwerten des maximalen Gewichtsverlustes in den drei Gruppen (Tabelle 3).
Die Verabreichung von i. p. Injektionen an die Ratten zweimal pro Tag, mit der damit verbundenen erforderlichen Behandlung, wirkte sich nicht auf den Zeitpunkt des Ausbruchs oder auf die Schwere der Krankheit aus, zögerte jedoch den Krankheitsverlauf um mehrere Tage hinaus (Tag 17 bis Tag 18, wie in 13 dargestellt). Ein deutlicher Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen war jedoch der starke Krankheitsrückfall in der Kontrollgruppe am 22. Tag, der bis zum 30. Tag anhielt. In der Gruppe, die keine Behandlung erhielt, trat am 27. und 28. Tag bei 3 Ratten nur ein leichter Krankheitsrückfall auf.
Wie der frühe Gewichtsverlust wurden Schwäche und Lähmung von Schwanz und Beinen in der Testgruppe, die rcpn10 erhielt, im Vergleich zur Kontrollgruppe verzögert (14; Tag 12, p < 0,01; Tag 13, p < 0,05, heteroskedastischer t-Test). In der Testgruppe entwickelte nur eine Ratte zwischen dem 14. und 16. Tag eine schwere Erkrankung, ähnlich der, die bei den Kontrollratten auftrat. Die restlichen 4 Ratten erkrankten während dieses Zeitraums nur leicht (15, p < 0,95, heteroskedastischer t-Test). Schwere Krankheitsrückfälle gab es in der Testgruppe während des Untersuchungszeitraums nicht; eine Ratte entwickelte am 22. Tag eine leichte Erkrankung und die restlichen Ratten zwischen Tag 27 und Tag 30.
Schlussfolgerungen
Die Behandlung an sich, d. h. die zweimal tägliche i. p. Verabreichung von Flüssigkeit an Ratten, hatte keinen Einfluss auf Ausbruch oder Schwere der Krankheit, verlängerte jedoch geringfügig ihren Zeitverlauf. Ferner kam es bei den Ratten, denen täglich Tris-gepufferte Salzlösung injiziert wurde, aber nicht bei den Ratten, die keine Behandlung erhielten, während des Beobachtungszeitraums zu einem schweren Krankheitsrückfall.
Die interessanteste Beobachtung, die in dieser Studie gemacht wurde, war, dass die Behandlung der Ratten mit cpn10 den Ausbruch wesentlich verzögerte und die klinischen Merkmale der Krankheit bei 4 von 5 Ratten modifizierte. Sie verhinderte außerdem einen schweren Krankheitsrückfall, während die Tiere unter Beobachtung standen.
(d) Unfruchtbarkeit und Fehlgeburt
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Behandlung von Fruchtbarkeit und/oder Fehlgeburten durch die Verabreichung von cpn10. Dies ist dort von Bedeutung, wo das Problem aufgrund eines cpn10-Mangels auftritt. Die folgenden belegenden Versuchsdaten demonstrieren den Bedarf an cpn10 während der Embryoentwicklung.
Zur Schaffung einer Situation mit reduzierter cpn10-Konzentration wurden Anti-cpn10-Antikörper entwickelt und verwendet. Es steht kein Tiermodellsystem zur Verfügung. Man folgert daher anhand der Versuchsdaten, dass durch die Verabreichung von cpn10 zur Erhöhung der Konzentration von cpn10 während der Schwangerschaft die zuvor genannten Probleme von Unfruchtbarkeit und Fehlgeburt überwunden werden.
Synthese von cpn10-stämmigen Peptiden
Peptide wurden so synthetisiert, dass sie mit einem N-terminalen Fragment (N-Peptid, d. h. Ac-AGQAFRKFLPLC) und einem internen Fragment (I-Peptid, d. h. EKSQGKVLQATC) von cpn10 übereinstimmten.
Konjugation von Peptiden mit Ovalbumin
Peptide wurden mit Ovalbumin durch das heterobifunktionelle Reagens SPDP gemäß Herstelleranweisungen (Pharmacia-LKB Biotechnolkogy, Uppsala, Sweden) konjugiert.
Immunisierungspläne
Erwachsene Auszucht-New-Zealand-Kaninchen wurden mit einem der Konjugate im Rahmen von 4 wöchentlichen Injektionen und anschließend mehreren monatlichen Boosts immunisiert.
Zur Injektion wurde das Antigen in 0,9% Salzlösung (Mr 12–15.000 abgeschnittener Dialyseschlauch, Visking, Union Carbide, IL, USA) dialysiert und mit einem gleichen Volumen an Freundschem Adjuvans (für erste Injektion komplett, anschließend inkomplett) emulgiert. Die Immunisierungen erfolgten über den s. c. Weg.
Screening von Antiserum
Antisera wurden in einem ELISA gegen die relevanten Antigene (nämlich I-Peptid oder N-Peptid; Ovalbumin) (5 mg/ml) getestet. Gebundenes IgG wurde mit dem Biotin-Streptavidin-System (Amersham) mit o-Phenylendiamin als Substrat nachgewiesen. Die Absorbanz wurde bei 492 nm abgelesen.
IaG wurde von Antiserum durch 45% Ammoniumsulfat präzipitiert, und die Konzentration wurde durch Lowry und Gelelektrophorese bestimmt. Die IgG-Präparate wurden in einem ELISA (Tabelle 4) gegen das immunisierende Peptid getestet, das mit Rinderserumalbumin konjugiert war. Die Präparate wurden auch im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Neutralisation von Mausschwangerschaftsserum im Rosetteninhibitionstest getestet. Verschiedene Antikörperkonzentratioren wurden mit einem gleichen Volumen an Serum inkubiert, anschließend wurden die Gemische hinsichtlich einer Aktivität im Rosetteninhibitionstest getestet. Es wurde die geringste Antikörperkonzentration ermittelt, die Aktivität vollständig neutralisieren konnte (siehe Cavanagh et al., 1994, Eur. J. Biochem. 222 551–560). Zehn pg Anti-N-Peptid-Ab neutralisierten die Aktivität von 1 ml Schwangerschaftsserum, wohingegen 4 ng Anti-I-Peptid-Ab für eine vollständige Neutralisation nötig waren.
Passive Immunisierung
Ausgewachsene männliche und weibliche Auszucht-Quackenbush-Mäuse wurden morgens um 7.30 Uhr paarweise in Käfige gesperrt und um 8.30 voneinander getrennt. Weiblichen Mäusen mit Vaginalplugs wurden um 9.00 Uhr und 17.00 am Tag 1 (Tag der Paarung) und 2 der Schwangerschaft Anti-N-Peptid/Ovalbumin-, Anti-I-Peptid/Ovalbumin- oder Anti-Ovalbumin-IgG-Präparate injiziert. Die Dosis des im 2-Dosen-Regime injizierten spezifischen IgG wurde mit etwa 1 mg/Maus/Tag veranschlagt. Am 7. Tag wurden die Mäuse mit CO₂ euthanasiert, Uteri wurden auf implantierte Embryos hin untersucht und die Anzahl von Corpora lutea (CL) gezählt. In jeder Gruppe wurde die Zahl der Embryos/CL bei Mäusen, die mit dem Test-IgG behandelt wurden, mit der Zahl derer verglichen, die die gleiche Dosis an Kontroll-IgG (χ² Test) erhielten.
Ergebnisse
Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Neutralisation von cpn10 in Schwangerschaftsserum die Embryolebensfähigkeit in den frühen Phasen der Schwangerschaft nachteilig beeinflussen kann. Die Fähigkeit von Antikörpern zur Neutralisation der Aktivität im Rosetteninhibitionstest ist ein In-vitro-Monitor ihrer Fähigkeit, eine Schwangerschaft in vivo zu beeinträchtigen.
SONSTIGE ASPEKTE DER ERFINDUNG
In einem anderen Aspekt der Erfindung haben weitere Arbeiten nun zwei Regionen des Moleküls mit biologischer Aktivität verdeutlicht, die den Resten 1–11 und 34–44 in Ratten- und humanem cpn10 entsprechen.
Ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Ac-AGQAFRKFLPL sowie ein Peptid mit der Sequenz EKSQGKVLQAT erwiesen sich im Rosetteninhibitionsassay als aktiv. Gegen beide diese Peptide angehobene Antikörper sind als Antagonisten von cpn10 aktiv, wie ausführlich in der internationalen Anmeldung PCT/AU94/00742 (WO95/15339) beschrieben ist. Beide Peptide werden synthetisch hergestellt.
Die Erfindung umfasst daher innerhalb ihres Umfangs Aminosäuresequenzen:

(i) AGQAFRKFLPL;
(ii) Ac-AGQAFRKFLPL, wobei Ac Acetyl ist;
(iii) EKSQGKVLQAT

₁

₂

(iv) A₁AGQAFRKFLPLA₂;
(v) AGQAFRKFLPLA₂;
(vi) A₁AGQAFRKFLPL;
(vii) Ac-A₁AGQAFRKFLPLA₂;
(viii) Ac-AGQAFRKFLPLA₂;
(ix) Ac-A₁AGQAFRKFLPL;
(x) A₁EKSQGKVLQATA₂;
(xi) EKSQGKVLQATA₂;
(xii) A₁EKSQGKVLQAT;

₁

₂

Bei den obigen Molekülen (i) bis (xii) ist es zu verstehen, dass solche Moleküle innerhalb ihres Umfangs auch eine einzelne Aminosäureaddition, -deletion oder -substitution beinhalten.
Mit Bezug auf die Verwendung von cpn10 zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten sind relevante Krankheiten, die durch die Verabreichung von cpn10 behandelt werden können, insulinabhängiger Diabetes mellitus, Rheumatoidarthritis, systemischer Lupus erythematodes, das Sjögrensche Syndrom, die Gravesche Krankheit und multiple Sklerose. Dies wird anhand der relevanten belegenden Daten mit Bezug auf das hierin beschriebene EAE-Rattenmodell offensichtlich.
Im Hinblick auf die Verwendung von cpn10 zur Behandlung von Organtransplantaten, Hauttransplantaten, beziehen sich die hierin enthaltenen belegenden Daten auf das hierin beschriebene Rattenhauttransplantationsmodell.
Im Hinblick auf die Verwendung von cpn10 zur Behandlung von Unfruchtbarkeit oder Vorbeugung einer Fehlgeburt beziehen sich die relevanten belegenden Daten auf den Effekt des cpn10-Antikörpes auf die Embryoentwicklung und Implantation in Mäusen.
Mit Bezug auf die Verwendung von cpn10 zur Wundheilung und Gewebereparatur oder Geweberegeneration kann cpn10 für die Behandlung von Verbrennungen, chirurgischen Eingriffen, Traumata, Hautgeschwüren wie Druckgeschwüre und Diabetesgeschwüre, Infektionskrankheiten mit Gewebe- und Organschäden (z. B. Hepatitis), Stoffwechselkrankheiten mit Gewebe- und Organschäden (z. B. Leberzirrhose) und Degenerationskrankheiten mit Gewebe- und Organschäden verwendet werden. Der Beleg für diese Schlussfolgerungen wird in dem hierin beschriebenen Maus-Wundmodell und in den Leberregenerationsdaten nach einer teilweisen Hepatektomie gegeben, die in Quinn et al., 1994, Hepatology 20 Nr 5 1294–1302 erörtert werden.
Die hierin genannten Daten liefern außerdem einen eindeutigen Beleg für die Verwendung von cpn10 zur Behandlung von Entzündungszuständen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen und Infektionskrankheiten. Diese hierin beschriebenen Daten beinhalten Hinweise, die von dem immunosuppressiven Effekt von cpn10 in den Ratten-EAE- und Hauttransplantationsmodellen bezogen wurden. Dies wird auch von Rolfe et al., 1983, Clin. exp. Immunol. 51 45–52 and Nature 278 Nr. 5705 649–651 belegt, wo gezeigt wird, dass EPF eine verzögerte Hypersensitivität bei Mäusen reduzieren kann.
Die Verwendung von cpn10 zur Behandlung allergischer Krankheiten wie allergische Rhinitis, Asthma, Atopik-Dermatitis, akute Urtikaria und Arzneimittelhypersensitivität wird ebenfalls durch den immunosuppressiven Effekt von cpn10 in den Ratten-EAE- und Hauttransplantationsmodellen vollständig belegt. Zu dieser Schlussfolgerung kann man auch anhand Rolfe et al., 1983, Clin. exp. Immunol. 51 45–52 and Noonan et al., 1979, Nature 278 Nr. 5705 649–651 gelangen, wo der Effekt von EPF zur Reduzierung von verzögerter Hypersensitivität bei Mäusen gezeigt wird.
Die Verwendung von cpn10 zur Diagnose von Tumoren und/oder Überwachung von Patienten nach einer operativen Entfernung' von Tumoren wird durch die Quelle von Quinn et al., 1992, Cancer Immunol. Immunother. 34 265–271 belegt.
Eine geeignete Dosierung zur Verabreichung von cpn10 würde in der Größenordnung von 1–1000 μg/kg Körpergewicht und bevorzugter bei 50–200 μg/kg Körpergewicht liegen.
TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3
TABELLE 4
TABELLE 5
TABELLENLEGENDE
TABELLE 1

Aktivität von cpn10 im Rosetteninhibitionstest

TABELLE 2

Hauttransplantat-Überlebensdauer
p-Wert im Vergleich zur Kontrollgruppe, die nur Puffer erhält
* p < 0,001

TABELLE 3

Zeitpunkt des anfänglichen Gewichtsverlustes und maximaler Gewichtsverlust in den drei Behandlungsgruppen im Laufe von EAE.
* χ² Verteilung
* t-Test nach Student

TABELLE 4

Anti-N-Peptid-, Anti-I-Peptid- und Kontroll-Anti-Ovalbumin-Antikörper, getestet in einem ELISA gegen N-Peptid und I-Peptid.
* 1 in 1000 war die geringste getestete Verdünnung.

TABELLE 5

Effekt der passiven Immunisierung von bestätigt gepaarten Mäusen am Tag 1 und 2 p. c., mit Antikörpern gegen cpn10-stämmige Peptide, auf die Anzahl von implantierten Embryos und Corpora lutea am Tag 7 p. c.
* (heteroskedastischer t-Test).

FIGURENLEGENDEN
1a Reinigung von EPF. Hitzeextrahierte humane Blutplättchen (100 Einheiten) wurden auf SP-Sephadex und Heparin Sepharose fraktioniert, anschließend auf eine TSK-Phenyl 5PW Säule aufgetragen und mit einem Umkehrsalzgradienten eluiert. Fraktionen wurden im Rosetteninhibitionstest getestet (auf der Basis der Fähigkeit von EPF, die Rosetteninhibitionsaktivität eines immunsuppressiven Antilymphozytenserums zu verstärken).
1b Aktive Fraktionen
von (a) wurden durch RP-HPLC-1
1c Aktive Fraktionen
von (b) wurden durch RP-HPLC-2 raktioniert.
1d Aktive Fraktionen
von (c) wurden durch RP-HPLC-3 fraktioniert.
1e Interaktion von immobilisiertem monoklonalem Anti-EPF-Antikörper 5/341 mit aktiven Fraktionen von (d) und äquivalenten Fraktionen von humanem Schwangerschaftsserum, 6 T Gestation (10 ml); humanem Schwangerschaftsurin, bis zu 1 Monat Gestation (10 Liter); Medium, konditioniert durch östrische Maus-Ovarien (100), stimuliert mit Prolactin und Mausembryo-konditioniertem Medium (Ovarium CM); serumfreiem Medium, konditioniert durch die Rindernierenzelllinie MDBK (MDBK-CM; ATCC CCL 22, 10 Liter); Rattenserum, erhalten 24 h nach einer teilweisen Hepatektomie (nach tH, 10 ml); Rattenleber, erhalten 24 h nach tH (40 g); alle fraktioniert wie in (a) bis (d). Anti-EPF-gebundene und ungebundene Fraktionen wurden im Rosetteninhibitionstest getestet, Spezifität wurde durch einen Vergleich mit einem Parallelexperiment unter Verwendung eines irrelevanten Antikörpers demonstriert, in dem Aktivität nicht gebunden war.
2a Analyse von EPF, der von 300 Einheiten humaner Blutplättchen wie in 1A gereinigt wurde. Bestimmung der monomeren Größe. Jodiertes EPF wurde fraktioniert durch SDS-PAGE,²⁹ das Gel in Scheiben geschnitten (2 mm breite Scheiben) und die Verteilung von Radioaktivität und biologischer Aktivität wurde verglichen. (Einlage) Direkte Coomassie-Blau-Färbung desselben Präparates.
2b Ionenspray-Massenspektrum von EPF, angezeigt als mehrfach protonierte Molekülionen. (Einlage) Computerrekonstruktion als Molekülmasse.
2c Aminosäuresequenz (Einbuchstabencode) von Peptiden, die von humanem EPF stammen, im Vergleich zu Ratten-cpn10 (unterstrichen). EPF wurde mit Endoproteinase lys C und Endoproteinase glu C verdaut, die resultierenden Peptide wurden durch RP-HPLC separiert und sequenziert. Die Sequenz individueller Fragmente ist dargestellt; alle, außer 74–101, stammten von dem lys-Verdau.
3 Interaktion von EPF und cpn60 (groEL).
3a Peakfraktionen im Ausschlussvolumen einer TSK G3000SW Gelpermeationssäule wurden, nach dem Auftragen eines cp60-EPF-Gemischs +Mg²⁺ATP, durch SDS-PAGE analysiert (Schagger et al., 1987) und mit Silber gefärbt (Morrissey, 1981), Linke Bahn, +ATP; rechte Bahn –ATP. (Cpn60 ist ein Decatetramer, M, 840.000; Säulenausschlusslimit > 300.000. Höhere M_r Banden auf dem SDS-Gel sind oligomere Formen von groEL).
3B Immobilisiertes cpn60 wurde mit humanem Schwangerschaftsserum (6 T Gestation) in An- oder Abwesenheit von Mg²⁺ ATP vermischt. Ungebundene und gebundene Fraktionen (Letztere wurden von dem Gel durch Entfernen von ATP mit EDTA gewonnen) wurden dann im Rosetteninhibitionstest getestet. Die Ergebnisse sind als Grenzdosis ausgedrückt, wobei die höchste Probenverdünnung ein positives Ergebnis im Rosetteninhibitionstest liefert.
4 pRM1
5 pRM2
6 pRM3
7 Präparation von Antikörpern gegen cpn10
8 Nachweis von Anti-cpn10-Antikörpern in Kaninchenserum durch ELISA
9 Kompetitiver Bindungsassay für cpn10
10 Prozentuale Inhibition der Antikörperbindung
11 Zeitverlauf von rekombinanter cpn10- und Blutplättchen-cpn10-Aktivität in Serum von Mäusen nach i. p. Injektion.
12 Effekt von rcpn10 auf Wundkontraktion bei Mäusen. Bei Mäusen wurden Wunden (~45 mm²) erzeugt, 1 μg rcpn10 oder Kontrolllösungen (5 μl) wurden topisch zweimal täglich aufgetragen und die Größe der Wundfläche bei Gruppen von Mäusen zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen (Mittel ± SD); T 0, n = 10, T 1–T 3, N = 3, T 4–T 7, n = 2* p < 0,05 im Vergleich zur Pufferkontrollgruppe.
13 Effekt der Behandlungsmethode auf die Entwicklung von EAE bei Ratten.
14 Effekt von cpn10 auf die Entwicklung von EAE bei Ratten.
15 Effekt von cpn10 auf die Entwicklung von EAE bei Ratten.

Claims

Protein oder Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem rekombinanten oder synthetischen Chaperonin 10 (cpn 10) von einem Säuger, b) einem rekombinanten oder synthetischen modifizierten Protein mit der Aminosäuresequenz:
c) einem Peptid mit der Aminosäuresequenz: AGQAFRKFLPL, d) einem Peptid mit der Aminosäuresequenz: Ac-AGQAFRKFLPL und e) einem Peptid mit der Aminosäuresequenz: EKSQGKVLQAT, f) einem Peptid mit der Sequenz in c), d) oder e) modifiziert durch eine einzelne Aminosäureaddition, -deletion oder -substitution, und mit Funktion als aktive Zentren des cpn10-Moleküls zur Verwendung als Arzneistoff.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Förderung von Immunsuppression.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von Entzündungszuständen.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von allergischen Erkrankungen.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Förderung von Zellwachstum.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Verbesserung von Wundheilung, Gewebereparatur oder Geweberegeneration.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Verbesserung der Lebensfähigkeit bei Organ- oder Hautübertragungen.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Vorbeugung von Unfruchtbarkeit oder Vorbeugung von Fehlgeburten.
Peptid vom cpn10-Protein, mit Funktion als aktive Zentren des cpn10-Moleküls ausgewählt aus der Gruppe von: – AGQAFRKFLPL, – Ac-AGQAFRKFLPL und – EKSQGKVLQAT.
Peptid vom cpn10-Protein nach Anspruch 10, mit einer einzelnen Aminosäureaddition, -deletion oder -substitution und mit Funktion als aktive Zentren des cpn10-Moleküls.