JP2004067698A - シャペロニン10 - Google Patents
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Abstract
Description
シャペロニン類は、より広いクラスの分子シャペロン類に属し、翻訳後のひだ形成、ターゲッティングおよび他のタンパク質の集合に含まれる分子であるが、Ellisら, 1991, Annu.Rev.Biochem. 60, 321-347に論じられているように、それ自体は最終的な集合構造の部分を形成しない。大部分のシャペロン類は“熱ショック”または“ストレス”タンパク質(hsp)であり、すなわち、その生成は、種々の細胞傷害(例えば代謝性破壊、酸素ラジカル、炎症、感染および変形)により誘導または増大される。Lindquistら, 1988, Annu.Rev.Genet. 22 631-677で評されているように、熱がよりよい研究ストレスの唯一のものである。特定のタンパク質レベルにおけるこれらの量的変化と同様に、上記のLindquistらに言及されているように、ストレスは本質的に生成したストレスタンパク質の異なる細胞区分への移動を誘導し得る。熱ショック反応は最も高く維持されている遺伝系の一つであり、そして種々の熱ショックタンパク質が最も進化論的に安定なタンパク質の中に存在している。逆境条件の下で細胞が切り抜けられるように、これらの類のあるものは正常細胞内で基本的な機能を果す。
EPFは最初、妊娠関連物質として言及され(Mortonら, 1976, Proc.R.Soc.B. 193 413-419)、この発見は受精から6−24時間以内に妊娠の有無を検査できるので非常に興味を呼んだ。最初にEPFは、リンパ球から免疫抑制因子を放出する能力により、免疫抑制剤としての役割が考えられた(Rolfeら, 1988, Clin.exp.Immunol 73 219-225)。これらの抑制因子は、マウスにおいて遅延型の過敏症を低下せしめ、よって、抗原的に異質の胎児に対する母体の免疫反応を抑制するのであろう。さらに最近の研究によると、EPFの生成は妊娠に限られていない。これは初期および新生細胞増殖の産物であり、これらの状態において成長因子として働く(Quinnら, 1990, Clin.exp.Immunol. 80 100-108;Cancer Immunol. Immunother. 1992, 34 265-271)。EPFは血小板活性化の産物でもあり、したがって、創傷治癒および皮膚再生に関係することが言われている(Cavanaghら, 1991, Journal Reproduction and Fertility 93, 355-365)。
構造は明らかでなかった。
発明の要約
一つの態様において、本発明は、cpn10がEPFであることおよびEPFでもって示された未知または未予測の作用を有することの発見にある。cpn10のこの未知または未予測の作用は、成長因子および免疫抑制因子としての作用活性のような細胞外活性を含んでいる。他の態様において、本発明は、cpn10の未知または未予測の作用を開発するためにcpn10を利用して1またはそれ以上の方法を提供する。この方法は成長を促進するためにcpn10を利用する方法および免疫活性を抑制するためにcpn10を利用する方法を含んでいる。
1.cpn10についての検定
cpn10に対する、その修飾体に対する、またはフラグメントに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を単独で、相互に併用してまたはcpn60と共に(ATPまたは他のヌクレオチドトリホスフェートの存在下で)、下記の目的のために用いて、血清または他の生物体液中のcpn10の検出。
(a)すべての哺乳類における妊娠の診断;
(b)危険にさらされている妊娠における胚の状態の監視;
(c)腫瘍の診断;および
(d)腫瘍の外科的摘出後の患者の監視。
下記の処置における成長因子または免疫抑制剤としてのcpn10の使用。
(a)皮膚または臓器移植;
(b)創傷治癒、組織修復または組織再生;
(c)自己免疫疾患;
(d)不妊/流産;
(e)アレルギー性疾患;および
(f)炎症状態。
1.cpn10の精製
(a)ヒト血小板からのヒトEPFの精製(図1a、1b、1c、1d)
抽出
臨床的に7日まで経過の濃縮血小板(血液銀行より)をチロード(Tyrodes)緩衝液で洗い、Method in Enzymology, 1989, 167 7-11に記載の技法を用い、液体N2で凍らせて−70℃で保存した。
100血小板単位からの抽出液を濃塩酸でpH3.0に調整し、0.05M酢酸/0.1M NaCl pH3.0であらかじめ平衡化した250ml SP−Sephadex C−25(Pharmacia-LKB)と共に緩やかに一晩、4℃で撹拌した。ゲルを同じ緩衝液20volで洗ったカラムに入れ、0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液/0.05M NaCl pH7.5で溶出した。次いで、ゲルを、捨てた。
SP−Sephadex溶出物を、濃塩酸でpH6.3−6.4に調整し、0.05Mリン酸ナトリム緩衝液/0.05M NaCl pH6.3であらかじめ平衡化したHeparin-Sepharose CL-6Bのカラム(2.5×7.5cm;Pharmacia-LKB)にかけた。カラムを同じ緩衝液5volで洗い、0.05Mトリス−HCl/5mM CaCl2/0.2M NaCl pH7.5の5volで溶出し、サンプル適用のために用いるカラムに逆方向でかけた。
固体の(NH4)2SO4をHeparin-Sepharose溶出液に最終濃度が2Mになるまで加え、0.45μmフィルターを通した後、0.1Mトリス−HCl pH7.0/5mM CaCl2/2M (NH4)2SO4であらかじめ平衡化したTSK Phenyl 5PWカラム(7.5×75mm、Pharmacia-LKB)上の専用溶媒ラインを通してサンプルをポンプで送った。このカラムを同じ緩衝液10volで洗い、この緩衝液から0.1M トリス−HCl pH7.0/5mM CaCl2/10%アセトニトリルの50分直線勾配溶出を行った(図1a)。
活性HIC−h.p.l.c.フラクションをプールし、A、0.04M トリス/HCl pH7.0/5mM−CaCl2およびB、0.04M トリス/HCl pH7.0/5mM CaCl2/80%(v/v)アセトニトリルからなる溶媒を用いてC3カラム(Ultrapore RPSC, Beckman Institute)上で分画した。カラムをサンプル適用する前に溶媒Aで平衡化し、その後溶媒A5volで洗い、この溶媒から30分75%溶媒Bまでの直線勾配で溶出を行った(図1b)。
いくつかの100単位血小板のRP−h.p.l.c.−1からの活性フラクションをプールし、EDTAとDTTをそれぞれの最終濃度が20mMと1mMになるように加え、この混合物を0.5−1時間4℃で放置した。溶媒Aの2volで希釈した後、C3カラムにかけ、この工程および次の工程を行い、RP−h.p.l.c.−1に記載されたように、しかしCaCl2を除き、分画した(図1c)。
RP−h.p.l.c.−2からの活性フラクションをプールし、トリフルオロ酢酸(TF
A)を最終濃度が0.1%になるように加え、0.1%TFA2volで希釈し、0.1%TFAであらかじめ平衡化したC3カラムに混合物をかけた。この溶媒と60%(v/v)アセトニトリル/0.1%TFAの30分直線勾配溶出を、次いで90%(v/v)アセトニトリル/0.1%TFAの3分直線勾配溶出を行った。活性フラクションをプールした(図1d)。
Cavanagh&Morton, 1994, Eur.J.Biochem. 222 551-560;Quinnら, 1994, Hepatology 20印刷中に論じられたように、種々の供給源からEPFを精製した。
A. すべての材料で観察された生化学的および免疫的類似性は、生物検定法が種々の生物的状況において作用する単一の物質または近接する類の物質を検出することの証拠である。
B. これらの材料すべてから精製された活性体は、EPFであるとして以前に報告されたすべての物質よりも多くの程度より強力である。これは、上に論じたEPFの生物検定法の詳細な分析を基に、推定EPF製剤に関した活性が非常に少量の不純物の存在を反映しているに違いないとの我々の推測を確認している。
C. (活性の妨害として)タンパク質レベルで研究するのに充分なEPFを提供する唯一の供給源材料は血小板と再生肝であり、量はそれぞれ平均100単位当たり15μg(〜50l血に相当)および40g組織当たり5μg(6匹ラットよりの摘出肝)。EPFは細胞外に表れるよりも細胞中に多く存在していることは明白である。しかし、蓄積されたEPFについての生物学的知識(上記のMortonら、1992参照)は、この細胞外での出現が思いがけないものでないことを示している。
との明白な証拠を提供する。cpn10とロゼット阻害試験における活性との関係が試験された(図3b)。ATPの存在下において、ATPの非存在下ではそうでないのであるが、固定化cpn60は原型源資料、妊娠血清からすべての活性を除去し得た。そして固定化複合物からATPを取り除くと活性は回復し得た。図3aに記載した実験のように、このATPの必要性はcpn60と活性分子との相互関係の特殊性を示している。cpn10はEPF生物検定法において反応を司る分子単位である。
(b)cpn10をコードするヒトcDNAのクローニングおよびcpn10の製造
商業的使用のための製造は、哺乳動物cpn10遺伝子、望ましくはヒトcDNAcpn10遺伝子をpGEX系、pET系からのプラスミドのような適当なベクターに挿入し、コードされた哺乳動物cpn10を発現し、組換えcpn10を精製することにより達成され得る。
ANGIS オーストラリア国立遺伝情報サービス
bp 塩基対
BSA 牛血清アルブミン
cDNA 相補的DNA
cpn10 シャペロニン
DNA デオキシリボ核酸
E.coli 大腸菌
GSH グルタチオン(還元型)
GST グルタチオン−S−トランスフェラーゼ
LB ルリア−ベルタニブロス
M モル
ORF オープンリーディングフレーム(翻訳領域)
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
rEPF 組換え初期妊娠因子
RSP 逆配列プライマー
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SDS−PAGE ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動
Tris トリ(ヒドロキシメチル)アミノメタン
USP 正配列プライマー
ヒトcpn10オープンリーディングフレームのクローニング
メラノーマ細胞系A2058cDNAラムダライブラリー(Stratagene)からのヒトcpn10cDNAのORF(274bp)部分を最初に増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた。変性cpn10アンプリマー(P1)は、ヒトcpn10のアミノ酸残基83−91に対応するアミノ酸配列VLDDKDYFLからつくられた。プライマーP1は配列5' ARRAARTARTCYTTRTCRTC3'を有し、RはAまたはG、YはCまたはTである。逆配列プライマーは、PCR増幅(非特異的プライマー)および配列DNA構築に用いられ、配列5' CAGGAAACAGCTATGAC3'を有する。正配列プライマーは配列5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'を有している。ファージ・ライブラリーのPCR増幅は、非特異的上流アンプリマー(RSP)およびP1を、それぞれ0.5μM最終濃度、1.5mM MgCl2(Pharmacia Biotech)、1Xポリメラーゼ緩衝液(Boehringer Mannheim)、テルムスアクアティカス(Thermus aquaticus)DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)5単位および最終容量の50μL中で用いて、達成された。30サイクルについてのパラメーターは、94℃、1分間での変性、40℃、30秒間のアニーリングおよび72℃、3分間のエクステンションであった。72℃で7分間の最終エクステンションが4℃10分間のソークサイクルに続いて、なされた。1μLのアリコートがコピー数を増すために同じ条件で増幅された。
Boehringer Mannheimから得た制限酵素およびバッファーを用いて、Sambrookら(Sambrookら, 1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)に従って、PCR生成物およびベクターのすべての制限酵素による切断を行った。最初PCRフラグメントをEcoR1で消化し、プラスミドpRM1を形成するpBluescript KS(+)(Stratagene)のEcoR1とSma I位でライゲートした(Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)(図4;部分cpn10挿入274bp)。319bp生成物をBamHIおよびEcoR1で消化し、プラスミドpRM2を形成する発現プラスミドpGEX−2T(Pharmacia Biotech)に最初にクローン化した。この同一性を確認するために、BamHI−EcoR1フラグメントをpBluescript(SK+)にサブクローン化し、配列決定した。DNAを、エチディウムブロマイドを含む0.8−1.0%(w/v)アガローズゲルで分析し、電気泳動の後、UVイルミネーションで観測した。
適格なE.coli DH5αの細胞(100μL)をプラスミドで熱律動法(Sambrookら,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)により形質転換した。細胞とDNAの混合物(10−100ng)を30分間氷の上におき、正確に2分間42℃で熱律動せしめ、2分間氷の上にもどした。LBの0.9mLを加えた後1時間後振り、37℃で細胞を回収した。100μLの部分標本を最終濃度100μg/mLでアンピシリンを補ったLB寒天プレート上に置いた。37℃で一夜、培養した後、ランダムコロニーを次の実験に選択した。
PCR生成物の制限フラグメントをpBluescript中にクローンし、製造業者(Pharmacia Biotech)の指示に従ってT7ポリメラーゼキットを用いてジデオキシチェインターミネーション法によって両定位に配列した。約2μgのプラスミドDNAを変性し、エタノール沈殿し、USP、RSPまたはP3のいずれかにアニーリングした。配列反応を8%アクリルアミド/46%ウレア ゲル上で電気泳動した。固定し乾燥した後、X−線フィルムをゲルに一夜さらし、そして現像した。
Smithら(Smithら,1988,Gene 67(1)31−40)に記載された方法により小培地スケール(2ml)でグルタチオン−S−トランスフェラーゼ融合タンパク質の発現のためにpRM2で組換えたクローンをスクリーニングした。一夜置いた培地を希釈し、0.1mM IPTGを加え、37℃で数時間おいて融合タンパク質を発現せしめた。細胞をペレット化し、PBS/0.1%Triton X−100に溶解し、溶解質を50%グルタチオン−アガローゼ ビーズ(Sigma Chemical Company)と混合した。組換え融合タンパク質をSDSバッファー中で煮沸することにより親和性ビーズから溶出した。サンプルのアリコートを10%SDS−PAGEゲルにかけた。ゲルを固定し、コーマシーブルー(Coomassie blue)で着色した。融合タンパク質の発現を確認した後GST分子からのrcpn10の精製がより大きい規模で行われた。
(a)cpn10の検定
抗原
細菌融合タンパク質、GST/cpn10を、cpn10の製造で記載したように、発現させ、グルタチオン−セファロースで単離した。この融合タンパク質を、トリス緩衝化食塩水中の50mM還元グルタチオンをかけることにより、ゲルから溶出させた。溶出フラクションをSDS−PAGEで分析し、最も融合タンパク質を含むフラクションをプールした。タンパク質の濃度をLowryら, 1951, J.Biol.Chem. 193 265-275の方法により測定した。
融合タンパク質に対する抗体を、週4回の注射、続く少なくとも月4回の追加免疫からなる免疫化スケジュールによりウサギで発生させた。最初の注射用のフロイド完全アジュバント中およびその後のフロイド不完全アジュバント中に乳濁したタンパク質約10μgをそれぞれの注射に使用した。ウサギ血清で、最初にcpn10(5μg/ml)でプレートをコートし、ストレプトアビジン−ビオチン検出系(Amersham)を使用したELISAにより、cpn10に対する抗体をスクリーニングした。ウサギ#42の血清のcpn10および全融合タンパク質(GST/cpn10がプレートに結合している場合)に対する抗体(Ab)力価を図7に示す。このウサギから、4回目の追加免疫後に採取した血清サンプルのcpn10に対する力価を図8に図説する。
次いで、抗体を下記のように行うcpn10検出用競合結合検定に使用した。1:32000および1:64000(最終希釈;希釈50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、0.2%w/vゼラチン含有)に希釈した抗血清を、別々に、(一晩4℃で)種々の濃度のcpn10とインキュベーショした。これらの混合物を、図9に図説するように、上記のように、5μg/ml cpn10でコートしたプレートでELISAにより試験した。抗体/cpn10混合物の吸光度を、cpn10非存在下でインキュベーショした同じ抗体希釈により得られた値と比較する。プレートへの抗体の結合の阻害度が元の抗体−cpn10混合物におけるcpn10の量と比例している;これから、標準曲線を、図10に示すように作ることができる。
(1)製造超免疫化特性を示す抗−cpn10の産生;したがって、既知の免疫応答の促進技術と組み合わせて、高い親和性抗体を産生できる;および
(2)標準免疫検定技術における応答の産生
ができる技術を確立する。
ロゼット阻害試験は、非定量的であり、正確な血清中cpn10の濃度測定に使用できない。この検定は、サンプルの限界量を比較することにより、半定量的に使用され、即ち、サンプルの最も高い希釈が生物検定反応における位置を与える。それ自身生物検定に不活性である複合生物学的液体中の他の物質が、活性物質の応答に影響を与えることができるため、この研究には注意が必要である。
(a)器官/皮膚移植片
ラットの同種皮膚移植片生存における組換えcpn10の効果
皮膚移植
皮膚移植片は、以下のプロトコールを使用して、近交系ルイス(Lewis)およびDAラット(〜100g)の間で交換した。腹部完全厚皮膚を、標準技術を使用して、胸郭側面に作った同じ大きさの欠損部に縫合した。6匹のラットの群に1回で移植し、それぞれのラットが一つの自己移植片および一つの同種移植片を受けた。2匹のルイスおよび2匹のDAラットは、毎日2回の組換えcpn10の注射を受け、一匹のルイスおよび1匹のDAに、移植片の回りに緩衝液を注射した。異なった群は異なった用量のcpn10を投与された。注射は14日間続けた。移植片をワセリンガーゼ、メロリン包帯、ビニールラップおよび伸縮自在の包帯で覆った。7日後、移植片を毎日壊死の兆候について試験した。拒絶反応の日は、移植皮膚の50%が壊死分解を示す日とした。
マウスに組換えcpn10を注射した後の血清におけるcpn活性の寿命
結果は表2および図11に示す。
組換えcpn10注射に続いて、有意な移植片生存延長があった(p<0.001、スチューデントのt検定)。結果は、ベル型用量反応曲線を示し、最も有効な量は2−20μg cpn10×2/ラット/日であった。マウスにおける実験は、この組換えcpn10が、血小板cpn10と比較した場合、予期される半減期より短いことを示唆する;マウス血清における組換えcpn10 1μgおよび15μgの半減期は、それぞれ僅か3時間および7時間であった;4日間の半減期を有する血小板cpn10(5μg)と比較。しかしながら、これらの結果は、cpn10がラットにおいて同種皮膚移植片の生存率を有意に延長できることを示している(表2参照)。
組織修復におけるcpn10の掛かり合い
成長因子は、血小板からのその最初の遊離が創傷修復において基本的に重要であるため、治癒工程に含まれるようである(Falange, 1993, J.Dermatol.Surg.Oncol. 19 716-720)。血小板はcpn10の豊富な源であることが示され(cpn10;Cavanaghら, 1994、Eur.J.Biochem. 222 551-560)、従って、創傷治癒に密接に含まれる成長因子の一つであり得る。研究は、マウスで産生した完全厚皮膚欠損の治癒における局所適用組換えcpn10(rcpn10)の効果を測定するために行われている。
非近交系、雄カッケンブッシュ(Quackenbush)マウス(8週齢)をネンブタール麻酔し、毛を剃り、皮膚を70%v/vエチルアルコールで滅菌し、完全厚欠損(直径8mm)を胸郭外側領域に作った。トリス緩衝化0.9%w/v塩化ナトリウム(食塩水)、pH7.4、5μl中のrcpn10 1μg、トリス緩衝化食塩水単独(5μl)または食塩水単独(5μl)を直接創傷に適用し、次いでワセリンガーゼ、メロリン非粘着性包帯で覆い、伸縮自在の包帯で固定した。1日2回、マウスをハロタン(Fluothane, ICI)で軽く麻酔し、包帯を外し、好適な溶液5μlを適用し、再び創傷に包帯をした。種々の間隔、即ち、24時間、48時間、3日、4日、5日、6日および7日に、マウス群をハロタンで安楽死させ、創傷および周りの組織を回収し、創傷の領域を測定した。
rcpn10処置に続き、緩衝液または食塩水で処置した創傷と比較して、創傷収縮が有意に促進された(図12)。cpn10で処置した創傷において、創傷収縮は最初の24時間以内に開始するが、一方、対照の創傷では、収縮は2日以降に開始する(図12)。3日目以降、創傷の大きさに有意な差はなかった。
結論
ラットにおける、自己免疫疾患の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎の発症におけるcpn10の効果
実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)は、動物にアジュバント中の中枢神経系ミエリン塩基性タンパク質(MBP)を接種することにより誘発される神経系の自己免疫性脱髄疾患であり、多発性硬化症の動物モデルとして広く研究された(Raine, 1984, Laboratory Investigation 50 608-635)。広く研究されている種であるラットにおけるEAEの臨床的特徴は、接種後10日からの劇的一夜体重減少、続く尾弱化および麻痺、後肢弱化およびある場合は麻痺である。前肢弱化は時々発症する(Pender, 1986, Journal of Neurological Sciences 75 317-328)。実験は、接種後のラットへのrcpn10投与が、疾病の進行に影響を与えるかどうかを測定するために行った。
EAEモデル:EAEは、近交系、雌ルイスラット(年齢〜10週齢)の一方の足蹠にフロインドアジュバント内のMBPを接種後誘発された。ラット3群が研究に含まれる。全部、0日に接種した。1群(n=4)は、処置を受けず、動物は疾病の潜伏期間中(0日から8日)抱き上げなかった。2群(対照群;n=5)はトリス緩衝化食塩水(0.1ml)i.p.×1日2回を0日から20日に投与された。3群(試験群;n=5)は、トリス緩衝化食塩水(i.p.)×1日2回を0日から20日に投与された。8日目から、全てのラットを体重測定し、毎日30日まで試験した。
0=弱化なし;
1=弱化は尾の末端部のみ、尾末端部は試験者の指に巻き付くことができない;
2=尾全体の弱化であるが、尾の付け根はまた重力に対して垂直に直立できる;
3=尾が揺れ動くのみの重度の弱化;
4=尾が完全にぐにゃぐにゃのまひ。
0=弱化なし;
1=両方の後足部の足指の僅かな引きずり;
2=両方の後足部をひどく引きずるが、後肢の残りは違う;
3=両方の後肢をひどく引きずり、両方の後肢がしばしば体の一方に置かれる;
4=後肢が完全にぐにゃぐにゃの麻痺。
合計得点は(I)、(II)および(III)の合計である。
処置を受けていないまたは緩衝液のみ(対照群)を受けている群の体重減少開始時期および最大体重減少期間は有意に異ならなかった(表3)。しかしながら、cpn10投与群(試験群)は、処置を受けていない群と比較して、最初の体重減少が遅れ、また最大体重減少もそうであった(表3;p<0.001%χ2分布)。3群で最大体重減少の平均に有意差はなかった(表3)。
処置それ自体、即ちラットへの液体のi.p.1日2回の投与は疾病の開始また重症度に影響を与えないが、その期間を僅かに延ばした。更に、トリス緩衝化食塩水を毎日投与されたラットにおいて、観察期間中重い疾病が再発したが、処置を受けていないラットではしなかった。
本発明の更なる態様は、cpn10の投与による不妊および/また流産の処置である。この問題がcpn10の欠乏により起こる場合、重大である。下記の実験的支持は、胚発育中のcpn10の必要性を証明する。
cpn10由来ペプチドの合成
ペプチドを、異種2機能性試薬SPDPにより、製造者(Pharmacia LKB. Biotechnolkogy, Uppsala, Sweden)の指示に従って、卵白アルブミンに結合させた。
成熟非近交系ニュージーランドウサギを、接合体の一つを週4回注射し、続いて数カ月追加免疫することにより免疫化した。
注射のために、抗原を0.9%食塩水(Mr12−15000除去透析管、Visking, Union Carbide, IL, USA)で透析し、等量のフロインドアジュバント(一回目は完全、それ以降不完全)に乳濁化した。免疫化はs.c.経路経由であった。
抗血清を、適当な抗原(即ち、I−ペプチドまたはN−ペプチド;卵白アルブミン)(5mg/ml)に対してELISAで試験した。結合IgGは、o−フェニレンジアミンを基質として、ビオチン−ストレプトアビジン系(Amersham)で検出した。吸光度は492nmで読んだ。
成熟非近交系雄および雌カッケンブッシュマウスを、7:30a.m.に対でケージに入れ、8:30p.m.に離した。膣栓のある雌マウスに、妊娠1日目(交配の日)および2日目の9:00a.m.および5:00p.m.に、抗−N−ペプチド/卵白アルブミン、抗−I−ペプチド/卵白アルブミンまたは抗−卵白アルブミンIgG製剤を注射した。2用量レジメにおける特異的IgGの注射量は、約1mg/マウス/日と概算した。7日目に、マウスをCO2で安楽死させ、着床胚および計数した黄体(CL)について子宮を試験した。それぞれの群において、試験IgGで処理したマウスの胚/CLの数を、同量の対照IgGを投与したものの数と比較した(χ2試験)。
本発明の別の態様において、更なる実験が、ラットおよびヒトcpn10の1−11および34−44残基に対応する分子の2つの領域の生物活性を説明する。
(i)AGQAFRKFLPL;
(ii)Ac−AGQAFRKFLPL(式中、Acはアセチル);
(iii)EKSQGKVLQAT
をその範囲内に含む。
(iv)A1AGQAFRKFLPLA2;
(v)AGQAFRKFLPLA2;
(vi)A1AGQAFRKFLPL;
(vii)Ac−A1AGQAFRKFLPLA2;
(viii)Ac−AGQAFRKFLPLA2;
(ix)Ac−A1AGQAFRKFLPL;
(x)A1EKSQGKVLQATA2;
(xi)EKSQGKVLQATA2;
(xii)A1EKSQGKVLQAT;
〔式中、A1およびA2は分子(i)から(xii)の一端または両端に付加し得るアミノ酸配列であり、Acはアセチルである。〕
を有する分子(i)、(ii)および(iii)をその範囲内に含む。
表1
ロゼット阻害試験におけるcpn10の活性
表2
皮膚移植片生存時間
緩衝液のみ投与された対照群と比較したp値
*p<0.001
EAE経過における3処置群の初期体重減少および最大体重減少の時間
#χ2分布
*スチューデントのt検定
表4
N−ペプチドおよびI−ペプチドに対するELISAで試験した抗−N−ペプチド、抗−I−ペプチドおよび対照抗卵白アルブミン抗体
*1/1000が試験した最低希釈であった
表5
確認交配マウスのcpn10由来ペプチドの1日目および2日目p.c.による受動免疫の、p.c.7日目に存在する着床胚および黄体数における効果
*(ヘテロセダスティックt検定)
Claims (14)
- アミノ酸配列AGQAFRKFLPLおよび/またはアミノ酸配列EKSQGKVLQATから基本的になるペプチド。
- 配列
GSMAGQAFRKFLPLFDRVLVERSAAETVTKGGIMLPEKSQGKVLQATVVAVGSGSKGKGGEIQPVSVKVGDKVLLPEYGGTKVVLDDKDYFLFRDGDILGKYVD
を有する組換え cpn10である、請求項1記載のペプチド。 - ペプチドがアミノ酸配列AGQAFRKFLPLを有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ac−AGQAFRKFLPLを有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列EKSQGKVLQATを有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列A1AGQAFRKFLPLA2(式中、A1およびA2はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列AGQAFRKFLPLA2(式中、A2はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列A1AGQAFRKFLPL(式中、A1はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ac−A1AGQAFRKFLPLA2(式中、A1およびA2はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ac−AGQAFRKFLPLA2(式中、A2はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ac−A1AGQAFRKFLPL(式中、A1はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列A1EKSQGKVLQATA2(式中、A1およびA2はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列EKSQGKVLQATA2(式中、A2はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列A1EKSQGKVLQAT(式中A1はアミノ酸配列である)を有する、請求項1記載のペプチド。
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JPH02157298A (ja) | 新規補体制御物質 |
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