CN102015757B - 修饰的Cpn10以及PRR信号 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的Cpn10多肽，与AlaCpn10多肽相比该多肽具有对一种PRR配体增加的亲和性。在一个进一步的实施方案中，本发明还涉及修饰的伴侣蛋白10多肽，并且涉及编码该多肽的核酸，并且涉及包括此类多肽的组合物，以及它们的用途。

Description

修饰的Cpn10以及PRR信号

发明领域

本发明涉及修饰的伴侣蛋白10多肽，并且涉及编码它的核酸。本发明进一步涉及伴侣蛋白10的突变体并且涉及包括此类多肽的组合物。

发明背景

哺乳动物伴侣蛋白10(Cpn10)，也称作热休克蛋白10(Hsp10)以及早孕因子(EPF)，典型的特征为涉及与伴侣蛋白60(Cpn60)一起进行蛋白折叠的一种线粒体“分子伴侣”蛋白，伴侣蛋白60(Cpn60)也称作热休克蛋白60(Hsp60)。Cpn10与Cpn60分别是细菌蛋白GroES与GroEL的同系物。GroES与Cpn10各自寡聚成为7元环，它们作为一个盖子分别结合到一个桶样结构上，该桶样结构包括14个GroEL或7个Cpn60分子，这些分子将变性蛋白束成复合物(BukauandHorwich，1998，Cell92：351-366；HartlandHayer-Hartl，2002，Science295：1852-1858)。

Cpn10蛋白在种间是高度保守的。人Cpn10与牛、犬、绵羊以及猪的Cpn10是100％完全相同的，并且与大鼠的Cpn10仅在一个单独的氨基酸位置上有差异。人Cpn10与大肠杆菌的GroES共享38％序列一致性(60％相似性)。Cpn10/GroES蛋白是圆顶形的7聚环，其中每个单体基本上包括3个不同的结构区，一个内核的反平行的β-桶形区，侧面为一个“顶部”β-发夹环形区以及一个“移动环形”区。每个单体的反平行的β-桶形区形成一个圆顶的内核并且当装配成七聚体时，每个单体的β-发夹环形成该圆顶的顶部。在每个单体中，该移动环区位于相对于该顶环的该β-桶形的相对端。该反平行的β-桶形区的一个区段形成该空腔的一个向内的较低的边缘区。该较低的边缘区包含多个种系发育保守的氨基酸，包括在位置75的一个酪氨酸(Y75)。

除了作为一种分子伴侣的它的细胞内角色，还经常在细胞表面(参见Bellesetal.，1999，InfectImmun67：4191-4200)以及在细胞外流体中(参见Shinetal.，2003，JBiolChem278：7607-7616)发现Cpn10，并且Cpn10被越来越多地认作具有治疗炎性疾病潜力的一种免疫应答的调节剂。因此，近来已经在治疗患有类风湿性关节炎(Vanagsetal.Lancet2006，368：855-863)和牛皮癣(Williamsetal.Arch.Dermatol.2008，144：683-685)的人类患者中证实了Cpn10的疗效和安全性。

然而，仍然不清楚在Cpn10分子中负责介导该免疫调节活性的位点。本发明涉及这样的发现，即Cpn10的修饰影响Cpn10的免疫调节活性，特别是在结合模式识别受体(PRR)的配体中它的作用，这些模式识别受体(PRR)例如Toll样受体(TLR)、结合核苷酸的结构域含LRR家族(NLR)，RIG-I样受体(RLR)，IRF的DNA依赖性激活剂(DAI)，C型凝集素受体(CLR)或IFI20X/IFI16家族的一个成员(例如Ifi16、Aim2、MNDA以及IFIX)。

发明概述

根据本发明的第一个方面，在此提供了一种分离的Cpn10多肽，与Ala-Cpn10多肽(SEQIDNo：3)相比该多肽具有对于一种基于核酸的PRR配体增加的亲和性。

该PRR可以是一种Toll样受体(TLR)、结合核苷酸的结构域含LRR家族(NLR)、RIG-I样受体(RLR)，IRF的DNA依赖性激活剂(DAI)、C型凝集素受体(CLR)或IFI20X/IFI16家族的一个成员(例如Ifi16、Aim2、MNDA以及IFIX)。

该TLR可以选自下组，其构成为TLR3、TLR7、TLR8或TLR9中的至少一种。在一个实施方案中该TLR可以是TLR9。

该配体可以是一种激动剂或拮抗剂。在一个实施方案中，所述多肽与Ala-Cpn10多肽相比具有更多的净正电荷。

与野生型Cpn10多肽相比，分离的多肽可以进一步包括在N端的甘氨酸(G)处的一个氨基酸插入。该多肽可以是自然衍生的、重组生产的或合成生产的。该Cpn10可以来自真核生物。该多肽可以来自哺乳动物。该多肽可以是人Cpn10。

在另一个实施方案中，该分离的多肽具有Ala-Cpn10分子的至少一个突变。该突变可以是一种氨基酸取代、加入或缺失或它们的一种组合。取代可以是用一个或多个正电荷残基代替一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以用一个中性的或正电荷的残基代替一个或多个负电荷残基。突变加入可以是加入一个或多个正电荷残基。突变缺失可以是去除一个或多个负电荷残基。

在另一个实施方案中，可以用一种正电荷残基代替一种中性残基。该正电荷残基可以是精氨酸(R)，赖氨酸(K)或组氨酸(H)。该中性残基可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)或H。注意，组氨酸具有大约6.5的pKa，因此在pH7.4(例如细胞外环境)下它将大约11％电离，并且在pH6.0(例如包含TLR3、TLR7、TLR8以及TLR9的溶酶体内区室)下大约76％电离。

在另一个实施方案中，至少一个突变位于N端、β-桶、移动环、顶环、C端，或野生型Cpn10分子的这三个连接环的任何一个或它们的任意组合。

在又一个实施方案中，该多肽包括在一个氨基酸位置上的一种突变，该氨基酸位置选自下组，其构成为：野生型Cpn10分子的位置1至7、9、12至14、16、18至42、44、46、50、52至63、65至69、73至79、81、83至89、91至94、96、98、100以及101或它们的任意组合。

在另一个实施方案中，所述多肽包括选自下组一种突变，该组的构成为：A1(K、R或H)、G2(K、R或H)、Q3(K、R或H)、A4(K、R或H)、F5(K、R或H)、R6(K或H)、K7(R或H)、L9(K、R或H)、F12(K、R或H)、D13(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、R14(K或H)、L16(K、R或H)、E18(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、R19(K或H)、S20(K、R或H)、A21(K、R或H)、A22(K、R或H)、E23(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、T24(K、R或H)、V25(K、R或H)、T26(K、R或H)、R27(K或H)、G28(K、R或H)、G29(K、R或H)、I30(K、R或H)、M31(K、R或H)、L32(K、R或H)、P33(K、R或H)、E34(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、K35(R或H)、S36(K、R或H)、Q37(K、R或H)、G38(K、R或H)、K39(K、R或H)、V40(K、R或H)、L41(K、R或H)、Q42(K、R或H)、T44(K、、R或H)、、V46(K、R或H)、S50(K、R或H)、S52(K、R或H)、K53(R或H)、G54(K、R或H)、K55(R或H)、G56(K、R或H)、G57(K、R或H)、E58(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、I59(K、R或H)、Q60(K、R或H)、P61(K、R或H)、V62(K、R或H)、S63(K、R或H)、K65(R或H)、V66(K、R或H)、G67(K、R或H)、D68(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、K69(R或H)、P73(K、R或H)、E74(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、Y75(E、GK、K、R或H)、G76(K、R或H)、G77(K、R或H)、T78(K、R或H)、K79(R或H)、V81(K、R或H)、D83(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、D84(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、K85(K、R或H)、D86(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、Y87(K、R或H)、F88(K、R或H)、L89(K、R或H)、R91(K或H)、D92(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、G93(K、R或H)、D94(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、L96(K、R或H)、K98(R或H)、V100(K、R或H)、D101(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、MH-Cpn10、MR-Cpn10、MK-Cpn10、MKK-Cpn10、MKKK-Cpn10、Ala-Cpn10-K21、Ala-Cpn10-KK21、Ala-Cpn10-K39、Ala-Cpn10-KK39、Ala-Cpn10-K57、Ala-Cpn10-KK57、Ala-Cpn10-K76、Ala-Cpn10-KK76、Ala-Cpn10-K85、Ala-Cpn10-KK85、Ala-Cpn10-K102、Ala-Cpn10-KK102、ΔD13、ΔE18、ΔE23、ΔE34、ΔE58、ΔE68、ΔE74、ΔD83、ΔD84、ΔD86、ΔD92、ΔD94以及ΔD101或它们的组合。

在另一实施方案中，该突变位于N端，如在表2中所定义。该突变可以是一种插入。例如，在该N端的该插入选自下组，其构成为：MH、MK、MKK、MKKK以及MR，如分别在SEQIDNos：307、313、316、319以及310中所列出。

此外，该Cpn10多肽可以包括取代Q3K或K7R，如分别在SEQIDNos.37或10中所列出。

在另一实施方案中，该突变位于移动环，如在表2中所定义。该突变可以是一种缺失。该缺失可以是E23或E34如在SEQIDNos：199以及202中所列出。该突变可以是一种插入。该插入可以是K21或KK21，如在SEQIDNos：322以及325中所列出。该突变可以是一种取代。例如，该取代选自下组，其构成为A22K、E23Q、T24K、K27R、G29K、M31K、E34K、E34Q、Q37K，如在SEQIDNos：16、64、67、70、73、76、79、265以及268中所列出。

在此还提供一种分离的Cpn10寡聚体，该寡聚体包括7个Cpn10单体，其中两个或多个单体彼此共价连接。在该Cpn10七聚体中在一个单体的C端与邻近的单体的N端之间形成共价键。用于形成一种共价键的该C端和N端可以通过加入一个或多个氨基酸(例如Ala-Cpn10或Gly-Cpn10)而加长，或通过去除一个或多个氨基酸而缩短。例如，该分离的Cpn10多肽是在SEQIDNO：355中列出的共价的Cpn10。

在另一个实施方案中，该共价键七聚体中的每一个单体可以包含选自下组的一个或多个突变，该组的构成为：A1(K、R或H)、G2(K、R或H)、Q3(K、R或H)、A4(K、R或H)、F5(K、R或H)、R6(K或H)、K7(R或H)、L9(K、R或H)、F12(K、R或H)、D13(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、R14(K或H)、L16(K、R或H)、E18(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、R19(K或H)、S20(K、R或H)、A21(K、R或H)、A22(K、R或H)、E23(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、T24(K、R或H)、V25(K、R或H)、T26(K、R或H)、R27(K或H)、G28(K、R或H)、G29(K、R或H)、I30(K、R或H)、M31(K、R或H)、L32(K、R或H)、P33(K、R或H)、E34(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、K35(R或H)、S36(K、R或H)、Q37(K、R或H)、G38(K、R或H)、K39(K、R或H)、V40(K、R或H)、L41(K、R或H)、Q42(K、R或H)、T44(K、R或H)、V46(K、R或H)、S50(K、R或H)、S52(K、R或H)、K53(R或H)、G54(K、R或H)、K55(R或H)、G56(K、R或H)、G57(K、R或H)、E58(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、I59(K、R或H)、Q60(K、R或H)、P61(K、R或H)、V62(K、R或H)、S63(K、R或H)、K65(R或H)、V66(K、R或H)、G67(K、R或H)、D68(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、K69(R或H)、P73(K、R或H)、E74(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、Y75(E、GK、K、R或H)、G76(K、R或H)、G77(K、R或H)、T78(K、R或H)、K79(R或H)、V81(K、R或H)、D83(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、D84(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、K85(K、R或H)、D86(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、Y87(K、R或H)、F88(K、R或H)、L89(K、R或H)、R91(K或H)、D92(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、G93(K、R或H)、D94(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、L96(K、R或H)、K98(R或H)、V100(K、R或H)、D101(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或T)、MH-Cpn10、MR-Cpn10、MK-Cpn10、MKK-Cpn10、MKKK-Cpn10、Ala-Cpn10-K21、Ala-Cpn10-KK21、Ala-Cpn10-K39、Ala-Cpn10-KK39、Ala-Cpn10-K57、Ala-Cpn10-KK57、Ala-Cpn10-K76、Ala-Cpn10-KK76、Ala-Cpn10-K85、Ala-Cpn10-KK85、Ala-Cpn10-K102、Ala-Cpn10-KK102、ΔD13、ΔE18、ΔE23、ΔE34、ΔE58、ΔE68、ΔE74、ΔD83、ΔD84、ΔD86、ΔD92、ΔD94以及ΔD101或它们的组合。在另一实施方案中，该突变位于如在表2中所定义的β-桶中。至少一个突变可以是一种取代。该取代可以是L9K、F12K、D13K、D13N、E18A、E18K、E18M、E18Q、E18S、E18R、R19K、S20K、L41K、Q42K、T44K、S50K、S50R、V66K、D68K、D68N、K69R、P73K、G77K、T78K、K85R、D86K、D86N、D86R、Y87K、F88K、L89K、D92K、D92N、G93K、D94A、D94K、D94M、D94N、D94R、D94S、L96K、K98R或V100K，如在SEQIDNos13、25、28、31、46、49、52、55、58、61、58、61、85、88、91、94、97、118、121、124、145、148、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、217、244、250、253、256、259、262、274、286、289、292、295、298、301中所列出。

在另一实施方案中，该突变位于如在表2中所定义的顶环中。该突变可以是一种插入。该插入可以是K57或KK57，如在SEQIDNos：334或337中所列出。该突变可以是一种缺失。该缺失可以是如SEQIDNos：205中列出的E58。该突变可以是一种取代，例如该分离的Cpn10多肽是X-Cpn10-K53E、Ala-Cpn10-S52K、G54K、K55R、G56K、E58K、E58Q、Q60K、P61K，如在SEQ.IDNos：6、22、100、103、106、109、112、115、271中所列出。在另一个实施方案中，该分离的Cpn10多肽包括在顶环中在野生型Cpn10多肽的氨基酸序列的氨基酸残基位置53和/或55上的一个或多个氨基酸取代。例如，分离的Cpn10多肽可以是如由在SEQ.IDNo：8中列出的序列编码的Ala-Cpn10-K53M，K55M。

在另一实施方案中，该突变位于如在表2中所定义的连接环L1中。该突变可以是一种插入。该插入可以是如在SEQIDNos：328或331中所列出的K39或KK39。该突变可以是一种取代。例如，该取代选自下组，其构成为：如在SEQIDNos：19或82中列出的K39R或V40K。在另一实施方案中，该突变位于如在表2中所定义的连接环2(较低的边缘区)中。该突变可以是一种插入。该插入可以是如在SEQIDNos：340中所列出的K76。该突变可以是一种取代。该取代可以是如在SEQIDNo：130中列出的X-Cpn10-Y75K或如在SEQIDNos：127、133、136、139、142、238或277中列出的Ala-Cpn10-E74K、Y75H、Y75K、Y75R、Y75GK或G76K。该突变可以是一种缺失。该缺失可以是如在SEQIDNos：208中列出的E74。

在另一实施方案中，该突变位于如在表2中所定义的连接环3中。该突变可以是一种插入。该插入可以是如在SEQIDNos：343或346中所列出的K85或KK85。该突变可以是一种取代。该取代可以是如SEQIDNos：151、154、157、280或283中列出的V81K、D83K、D83N、D84K或D84N。该突变可以是一种缺失。该缺失可以是如在SEQIDNos：211中列出的D84。

在另一实施方案中，该突变位于如在表2中所定义的C端。该突变可以是一种插入。该插入可以是如在SEQIDNos：349或352中所列出的K102或KK102。该突变可以是一种取代。该取代可以是如在SEQIDNos：193、196或304中列出的D101K、D101N或D101R。

在另一个实施方案中，该多肽可以在Cpn10的一个或多个区域内的任意一个位置上包括至少2个突变，其中这些区域的构成为：如表2定义的N端、β-桶、移动环、顶环、C端，或该野生型Cpn10分子的这三个连接环的任何一个。例如该Cpn10多肽可以包括Ala-Cpn10-F12K，D92K、E18K，D101K；E34Q，Y75K；Q42K，D101K；T44K，D101K；S50K，D101K；Q60K，T78K；E74K，Y75E；Y75GK；Y75G，G76K；Y75K，D94K；Y75K，D94N。这些多肽可以包括如在SEQIDNos.214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247中列出的氨基酸序列。

根据本发明的第二个方面，在此提供了编码根据第一个方面的一种多肽的一种分离的核酸。

在一个实施方案中，该分离的核酸可以包括选自下组的一个核苷酸序列，该核苷酸序列的构成为：SEQIDNos.7、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47、48、50、51、53、54、56、57、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、117、119、120、122、123、125、126、128、129、131、132、134、135、137、138、140、141、143、144、146、147、149、150、152、153、155、156、158、159、161、162、164、165、167、168、170、171、173、174、176、177、179、180、182、183、185、186、188、189、191、192、194、195、197、198、200、201、203、204、206、207、209、210、212、213、215、216、218、219、221、222、224、225、227、228、230、231、233、234、236、237、239、240、242、243、245、246、248、249、251、252、254、255、257、258、260、261、263、264、266、267、269、270、272、273、275、276、278、279、281、282、284、285287、288、290、291、293、294、296、297、299、300、302、303、305、306、308、309、311、312、314、315、317、318、320、321、323、324、326、327、329、330、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354或356。

根据本发明的第三个方面，在此提供了一种表达构建体，它包括可操作地连接到一个或多个调节序列的根据第二个方面的一种核酸。

该核酸可以是一种密码子优化的Cpn10核酸。

该密码子优化的核酸序列可以具有一个或多个核苷酸取代，这些取代增加了转移RNA池的利用，开发了更有效的终止密码子，去除了RNA二级结构和/或不稳定的元件。

根据本发明的第四个方面在此提供了一种宿主细胞，该宿主细胞表达了第一个方面的一种多肽，或包括了第二个方面的一种核酸或第三个方面的一种表达构建体。

根据本发明的第五个方面，在此提供了一种抗体，该抗体选择性地结合到第一个方面的一种多肽上。

根据本发明的第六个方面，在此提供了与第一个方面的一种多肽复合的一种促炎性的核酸或免疫抑制的核酸。

根据本发明的第七个方面在此提供了一种药物组合物，它包括第一个方面的一种多肽、第二个方面的一种核酸或第三个方面的一种表达构建体或第五个方面的一种抗体。

根据本发明的第八个方面，在此提供了治疗受试者的一种方法，包括向所述受试者给予一个治疗有效量的第一个方面的一种Cpn10多肽或第二个方面的一种核酸的步骤。

该治疗可以调节受试者体内的免疫应答。该免疫应答可以通过PRR信号的调整来调节。

根据本发明的第九个方面，在此提供了治疗或预防受试者体内的一种疾病、障碍或病症的一种方法，该方法包括向该受试者给予一个有效量的第一个方面的一种Cpn10多肽或第二个方面的一种核酸。

该疾病、障碍或病症可以选自：急性或慢性炎性疾病，如胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、斯耶格伦病、格雷夫斯病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、慢性疲乏综合征、阿耳茨海默病、哮喘、过敏症、GVHD、动脉粥样硬化、炎性疼痛、牛皮癣、HIV、慢性免疫激活、慢性肌炎、硬皮病；或癌症如，非小细胞肺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、结肠直肠癌、基底细胞癌；或一种传染性疾病。该传染性疾病可以是一种细菌性、病毒性或真菌的感染的结果。

在一个实施方案中，慢性免疫激活与细菌性和/或病毒产物从胃肠道漏泄到循环系统中相关。例如，可以从口腔，肠或小肠发生漏泄。细菌性或病毒性产物的漏泄可以由一种感染或疾病(如细菌感染、病毒感染、炎性肠病以及牙龈疾病)而引起。病毒感染的一个例子是一种HIV或丙型肝炎感染。细菌性产物可以包括LPS或核酸。病毒性产物可以包括核酸。

在另一个实施方案中，慢性免疫激活涉及通过LPS或核酸结合到TLR上的TLR信号的免疫调节。LPS结合到TLR4上，同时核酸可以结合到LR3、7、8或9上。

根据本发明的第十个方面，在此提供用于在一位受试者体内或在他的至少一个细胞、组织或器官中调节PRR信号的一种方法，该方法包括给予一个治疗有效量的第一个方面的一种Cpn10多肽或第二个方面的一种核酸。

根据本发明的第十一个方面，在此提供用于在一位受试者体内或在他的至少一个细胞、组织或器官中调节一种或多种免疫调节剂的生产和/或分泌一种方法，该方法包括给予一个治疗有效量的第一个方面的一种Cpn10多肽或第二个方面的一种核酸。

该多肽通过结合一个PRR配体可以调节来自一个PRR的信号。

该免疫调节剂可以是一种促炎细胞因子或趋化因子或一种抗炎细胞因子或趋化因子。该细胞因子或趋化因子可以选自TNF-α、IL-1、IL-6、RANTES、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β或一种I型干扰素。该I型干扰素可以是IFNα、IFNβ或IFNγ。

根据本发明的第十二个方面，在此提供用于在一位受试者体内或在他的至少一个细胞、组织或器官中抑制一种或多种免疫调节剂的生产和/或分泌一种方法，该方法包括给予一个治疗有效量的第一个方面的一种Cpn10多肽或第二个方面的一种核酸。

该多肽通过结合一个PRR配体可以调节来自一个PRR的信号。该多肽到一个PRR配体上的结合可以在具有该PRR的细胞上产生免疫调节影响。该细胞可以是一种抗原呈递细胞或一种T-细胞或一种B-细胞。该抗原呈递细胞可以是一种树突细胞、巨噬细胞或单核细胞。

该免疫调节剂可以是一种促炎细胞因子或趋化因子或一种抗炎细胞因子或趋化因子。该细胞因子或趋化因子可以选自TNF-α、IL-1、IL-6、RANTES、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β或一种I型干扰素。该I型干扰素可以是IFNα、IFNβ或IFNγ。

根据本发明的第十三个方面，在此提供鉴定一种化合物的一种方法，该化合物结合到第一个方面的一种多肽上，该方法包括以下步骤：

(a)将一种候选化合物与所述多肽进行接触；并且

(b)检测该候选化合物与所述多肽之间的一种复合物的形成。

对于一种复合物的形成的检测可以是一种竞争性结合测定、一种双杂交测定、凝胶过滤色谱法、高通量筛选、一种电泳迁移率(凝胶迁移)检测和/或一种孔板捕获检测(platecaptureassay)。

该测试可以是定性的或定量的。

根据本发明的第十四个方面，在此提供筛选一种化合物的一种方法，该化合物调节第一个方面的一种多肽的活性，该方法包括以下步骤：

(a)将所述多肽与一种候选化合物在适于能够使所述候选化合物与所述多肽相互作用的条件下进行接触；并且

(b)检测所述多肽的活性。

对于该多肽的活性的检测可以包括加入一种标记底物并且测量该标记底物的变化的一个步骤。

根据本发明的第十五个方面，在此提供了筛选一种PRR配体的一种方法，该方法包括以下步骤：

(a)将第一个方面的多肽与一种候选PRR配体化合物在适于能够使所述候选化合物与所述多肽相互作用的条件下进行接触；并且

(b)检测与Ala-Cpn10相比所述化合物与所述多肽的增加的亲和性；和/或

(c)在候选PRR配体化合物以及第一个方面的多肽的存在下检测减小的或增加的PRR活化作用。

本发明还考虑了根据上述方面或实施方案的该分离的Cpn10多肽以及多核苷酸的变体、衍生物、同系物、类似物以及片段。

根据上述方面以及实施方案，该Cpn10多肽以及多核苷酸可以从任何动物得到，可以使用重组DNA技术生成或可以合成生成。Cpn10可以是一种真核生物的Cpn10。例如Cpn10是人Cpn10。

该野生型Cpn10分子或多肽可以是乙酰基-Cpn10或X-Cpn10(SEQIDNo.1)。

根据上述方面以及实施方案，一种Cpn10多肽的免疫调节活性可以涉及生成该多肽的七聚体。该七聚体可以是以任意组合包括一种突变体或多种未突变的多肽。

定义

在本说明书的上下文中，术语“包括”是指“主要包括，但并非必须是仅包括”。此外，单词“包括”的各种变体，如“包括”以及“包括了”具有相应的含义。

在此使用的与Cpn10分子或多肽相关的术语“野生型”包括天然的或非天然的形式。例如，天然的人Cpn10在它的N端是乙酰化的。在术语野生型Cpn10的范围内，本发明考虑如通过SEQIDNo.1表示的乙酰化的或非乙酰化的(X-Cpn10)分子。

术语“Ala-Cpn10”是指在大肠杆菌中生成的人Cpn10，其中生成具有一个额外的N端丙氨酸残基的Cpn10。Ala-Cpn10的序列作为SEQIDNo.3而提出。

术语“免疫调节剂”是指一种分子调节剂，该调节剂与免疫系统相互作用并且它在一种免疫应答的激活、阻止、调节、维持、成熟、抑制、或放大中起作用。该免疫调节剂可以是一种促炎细胞因子或趋化因子或一种抗炎细胞因子或趋化因子。该细胞因子或趋化因子可以选自TNF-α、IL-1、IL-6、RANTES、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β或一种I型干扰素。该I型干扰素可以是IFNα、IFNβ或IFNγ。

在此使用的术语“模式识别受体”或PRR是指几种种系编码的蛋白，包括Toll样受体(TLR)，结合核苷酸的结构域含LRR家族(NLR)、RIG-I样受体(RLR)，IRF的DNA依赖性激活剂(DAI)，C型凝集素受体(CLR)或IFI20X/IFI16家族的一个成员(例如Ifi16、Aim2、MNDA以及IFIX)(参见例如Akiraetal.，Cell2006，124：783-801；Latz，E.andFitzgerald，K.A.(2008)Nat.Rev.Immunol.Vol.8，No.4，Poster)。通常，PRR可以分成两组：基于核酸的PRR(通常位于细胞内)以及细胞表面PRR(通常识别疏水配体)。PRR位于不同细胞类型上，这些细胞类型包括但不限于抗原呈递细胞(例如树突细胞、单核细胞以及巨噬细胞)、T细胞以及B细胞。

术语“Toll样受体”或TLR是指与病原体相互作用并且启动对感染的宿主免疫应答的受体。在哺乳动物中，通过病原体的TLR的激活启动了一种先天的免疫炎性过程，该过程阻止了病原体的传播，并且通过树突细胞上的TLR指导了获得性免疫的发展。该TLR是由种系中有限数量的基因编码的，在人中已知10个基因。这10个受体识别广泛多样的来自病原体的分子特征标志，包括糖脂类如脂多糖，蛋白类如鞭毛蛋白，以及核酸类如dsRNA。可以将TLR分成两组：通常识别疏水配体的细胞表面TLR以及通常识别基于核酸的配体的细胞内TLR(例如TLR-3、TLR-7、TLR-8以及TLR-9)。

如在此使用的术语“调节”，“调节了”以及它们的变体是指与在缺少该调节分子或试剂下其活性、生产、分泌或其他功能水平相比在存在一种本发明的特别的调节分子或试剂下一个分子的活性、生产、分泌或功能水平的增加或降低。这些术语不隐含定量的增加或减少。该调节可以是足以产生希望的结果的任何大小并且可以是直接的或间接的。

在此使用的术语“净电荷”指一个分子的电荷。包含一个氨基酸序列的分子例如蛋白、肽以及多肽(例如Cpn10多肽)可以或者是正电荷的或者是负电荷的。在一个给定的pH下的一个多肽的净电荷可以基于Henderson-Hasselbalch方程式(Hasselbalch，K.A.，1917BiochemischeZeitschrift78：112-144)以及可离子化的氨基酸侧链的以及多肽的N端和C端的已知的pKa值进行计算。

在此使用的术语“更多的净正电荷”是超过Ala-Cpn10的分子正电荷的增加。

术语“移动环”是Cpn10分子的一个柔性区域，它包括18个氨基酸残基。该移动环包括残基A21至G38(参见图1；残基编号是基于如在此描述的或者乙酰化的或者非乙酰化的X-Cpn10(SEQIDNo.1))。

术语“顶环”是Cpn10分子的一个柔性区域，它包括14个氨基酸残基。该顶环包括残基S52至V62(参见图1；残基编号是基于如在此描述的或者乙酰化的或者非乙酰化的X-Cpn10(SEQIDNo.1))。

如在此描述的“β-桶”是该Cpn10分子的一个区域，它包含5个片段，即第一、第二、第三、第四以及第五片段。第一片段包括残基F8至S20，第二片段包括L41至G51，第三片段包括S63至P73，第四片段包括G77至V80并且第五片段包括残基K85至V100(参见图1)。残基编号是基于如在此描述的X-Cpn10(SEQIDNo.1)。

术语“连接环”是指该Cpn10分子的柔性区域，它将Cpn10分子的不同的环(如该移动环以及顶环)连接到该β-桶上。有三种连接环，第一、第二以及第三种。第一种连接环包括残基K39至V40。第二种连接环包括E74至G76并且第三种环包括残基V81至D84(参见图1)。残基编号是基于如在此描述的X-Cpn10(SEQIDNo.1)。

术语“N端”是在该Cpn10分子的N端的一个柔性区域，它包括残基A1至K7(参见图1)。残基编号是基于如在此描述的X-Cpn10(SEQIDNo.1)。

术语“C端”包括该Cpn10分子的D101(参见图1；残基编号是基于如在此描述的X-Cpn10(SEQIDNo.1))。

在此使用的术语“氨基酸”指含有胺以及羧基官能团两者的任何分子。

在此使用的术语“带电荷的残基”是指具有一种侧链的任何氨基酸残基，该侧链具有携带一个正电荷或负电荷的潜力。

术语“多肽”是指通过肽键将氨基酸连接到一起构成的一种聚合物。术语“多肽”可以构成一个全长蛋白的一部分。进一步地，术语“多肽”是指一种多肽，该多肽与一种野生型Cpn10分子相比其氨基酸序列可以呈现至少一种修饰。该修饰可以包括这些化学修饰技术，如泛素化、标记(例如用放射性核素或不同的酶)、共价聚合物连接(如聚乙二醇化作用(从聚乙二醇衍生))以及通过化学合成氨基酸如鸟氨酸的插入或取代，它们是自然发生在人蛋白中的。

在此使用的术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸碱基或自然核苷酸的已知类似物或它们的混合物的一种单链或双链聚合物。除非另外说明，该术语包括是指该特异性的序列、以及指与其互补的序列。术语“多核苷酸”以及“核酸”在此是可交换地使用的。

在此使用的术语“CpG”是指在DNA的区域内的未甲基化位点，其中在碱基的线性序列中沿着它的长度一个胞嘧啶核苷酸紧接一个鸟嘌呤核苷酸出现，并且通过一个磷酸分开，该磷酸在DNA中将这两个核苷连接在一起。“CpG”用于将上述含义和与一个鸟嘌呤配对的胞嘧啶碱基区别开。已经识别了三种不同类型的CpG寡脱氧核苷酸，在刺激抗原呈递细胞的能力上它们存在差异：CpG-A(人ODN-2216)在浆细胞样树突细胞(PDC)中诱导大量的干扰素-α(IFN-α)以及IFN-β；CpG-B(人ODN-2006以及小鼠ODN-1826)诱导PDC成熟并且是B细胞的一种有效的激活剂但仅刺激少量的IFN-α和IFN-β然而CpG-C(人ODN-M362)诱导B以及NK细胞并且诱导人外周血单核细胞的IFN-α的生成。

术语“分离的”指所讨论的分子已经从它的自然环境或宿主中取出，并且减少或除去了相关的杂质从而使所讨论的分子成为存在的主要种类(例如在该组合物/样品中以摩尔计它比任何其他单独的种类更丰富)。典型地，一种基本上纯化的组分是一种组合物，其中目标种类占存在的所有大分子种类的至少约30％。通常，一种基本上纯的组合物将占该组合物中存在的所有大分子种类的约80％-90％以上。最典型地，纯化这些目标种类从而使之基本上是均质的(通过常规的检测方法在该组合物中不能检测出污染物种类)其中该组合物基本上由一种单一的大分子种类构成。

在此使用的术语“基本上”指大多数但不必要是所有，并且因此与一种修饰的多肽相关，该多肽“基本上”缺少相应的野生型多肽的一种组分区域，该修饰的多肽可以保留该组分区域的一部分。例如，“基本上”缺少相应的野生型多肽的一种组分区域的一种修饰的多肽可能保留约该组分区域的50％或以下的序列，尽管典型地由于缺失该区域的序列的比例导致该组分区域结构性和/或功能性失活。

在此使用的术语“保守氨基酸取代”是指用具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸代替一种氨基酸。可以基于一种或多种以下的相似性进行保守氨基酸取代：极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或涉及的残基的两亲性的本质。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸以及甲硫氨酸；极性不带电荷的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、以及谷氨酰胺；极性带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸以及谷氨酸。氨基酸“插入”或“缺失”优选地在约1至20个氨基酸的范围内，更优选地在1至10个氨基酸的范围内。通过使用重组DNA技术系统地在一种多肽分子中制备氨基酸的插入、缺失、或取代并且测定得到的重组变体的活性可以实验性地测定该变体。

在此使用的术语“治疗”，“治疗了”以及它们的变体，是指任意一种或所有的用途，它们治疗一种疾病状态或症状，预防疾病的形成，或其他地无论怎样以任意一种方式预防、阻止、延缓或逆转疾病或其他不希望的症状的进程。

在此使用的术语“有效量”在它的含义中包括一个无毒的但是足够的量的一种试剂或化合物以提供希望的治疗或预防作用。所需要的确切的量将从受试者到受试者进行改变，取决于以下因素如有待治疗的物种，受试者的年龄以及总体健康情况，有待治疗的病症的严重性，有待给予的具体的试剂以及给予的方式等。因此，不可能限定一个精确的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域中普通技术人员仅使用常规的实验即可以确定一个适当的“有效量”。

附图简要说明

图1.A.大肠杆菌Cpn10(GroES)的晶体结构，显示了Cpn10的不同区域。Cpn10包括7个完全相同的10kDa亚基。B.显示Cpn10以及GroES的氨基酸序列。从由Xu等人(Nature1997，388：741-750)公开的X射线晶体坐标生成GroES带状结构，在该结构中，这些通常无序的移动环通过与GroEL(在该图中省去GroEL)的相互作用而完全地对齐。

图2.人Cpn10与来自多种生物界的Cpn10同系物的序列比对。与人Cpn10不同的氨基酸被涂上阴影。指出了该移动环以及该β-发夹顶环的位置。盒子(标记为a到e)指出该55残基β-桶核心的预测的边界(Huntetal.，1997Cell90：361-371。示出了相对于人Cpn10不同的同系物的百分比一致性以及相似性。给出了每一种蛋白的SwissProt登录号。用NCBIblast(Altschuletal.，1997NucleicAcidsRes.25：3389-3402)、NS＝没有发现显著的相似性进行与人Cpn10的序列％一致性以及％相似性的计算。用ExPASy蛋白质组学服务器ProtParamTool(www.expasy.org/tools/protparam.html)计算等电点(pI)。

图3.用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE显示重组的Cpn10蛋白是＞99％纯的。

图4.在23℃下将1μgTLR3激动剂聚(I:C)(一种合成的dsRNA类似物)与50μgCpn10变体以及在指出的盐浓度下在10mMTris-HCl(pH7.6)中进行孵育1小时。将这些样品溶于1％TAE琼脂糖凝胶并且用溴化乙锭染色。自由的Cpn10向负电极迁移(该凝胶的顶部)而自由的聚(I:C)向正电极迁移(该凝胶的底部)，Cpn10-聚(I:C)的复合物延缓了两个分子两者的移动。

图5.在23℃下将1μg人ODN-2216类别A(TLR9激动剂；Invivogen)与50μgCpn10在10mMTris-HCl(pH7.6)中以及在指出的盐浓度下进行孵育15分钟。将这些样品溶于1％TAE琼脂糖凝胶并且用溴化乙锭染色。自由的Cpn10向负电极迁移(该凝胶的顶部)而自由的CpG-ODN向正电极迁移(该凝胶的底部)，Cpn10-CpG-ODN的复合物延缓了两个分子两者的移动。

图6.在23℃下将0.5μg大肠杆菌K12ssRNA(InvivogenCat#tlrl-ecrna)(TLR7/8激动剂)与50μgCpn10变体在10mMTris-HCl(pH7.6)中并且在指出的盐浓度下(0、150以及500mMNaCl)进行孵育30分钟。将这些样品溶于1％TAE琼脂糖凝胶并且用溴化乙锭染色。自由的Cpn10向负电极迁移(该凝胶的顶部)而自由的ssRNA向正电极迁移(该凝胶的底部)，Cpn10-ssRNA的复合物延缓了两个分子两者的移动。

图7.Cpn10结合到CpG寡核苷酸(ODN)的定量分析在配制缓冲液pH7.2(Invitrogen)中以1μg/μl配制Ala-Cpn10与Cpn10的突变体，并且在4℃下将50μg吸收于一个96孔板的的三乘孔中16小时。将未结合的蛋白倾析之后，在23℃下用在PBSpH7.2中的1％BSA以及5％蔗糖封闭该板2小时。将以0.02μg/μl配制于PBSpH7.2中的50μl3’-生物素标记的人ODN-2216类别A、人ODN-2006类别B、或人ODN-M362类别C(TLR9激动剂)(Proligo/Sigma)加入每个孔并且在23℃下孵育2小时。用PBS(pH7.2)+0.05％吐温20冲洗五次以去除未结合的配体。用抗生蛋白链菌素HRP与TMB检测系统在A450nm分析结合的CpG-ODN。结果是三次重复测试的平均值并且归一化为Ala-Cpn10与每一种CpG的结合的水平。

图8.Cpn10调节CpG-BODN-诱导的NFκB活性。根据制造厂家的说明书(Novogen)用Genejuice用pNiftyNFκB-荧光素酶报告基因质粒(InvivoGen)转染RAW264.7(小鼠巨噬细胞)细胞。24小时后将细胞进行胰蛋白酶消化，计数并且将2.5x10⁵细胞铺于一个24孔板的每个孔中的1ml培养基中，并且保留使粘附过夜。将100μg的一种Cpn10构建体或配制缓冲液对照与4μgCpG-BODN-1826(Invivogen)混合并且通过一个离心过滤装置YM10(Amicon)。将全部流过的体积加入到RAW264-pNIFty-LUC细胞中并且在37℃下孵育5小时。将细胞冲洗并且随后用每孔100μlCCLR1X溶液(Promega荧光素酶裂解缓冲液)进行裂解，按照生产厂家的说明书与荧光素酶底物进行混合并且测量该荧光素酶的数量。图中显示以100％归一化为Ala-Cpn10的NFκB激活水平。

图9.Cpn10突变体对聚(I:C)刺激的作用。按照生产厂商的说明书(Novogen)使用GeneJuice用为TLR3以及pNiftyNFkB-荧光素酶编码质粒(InvivoGen)瞬时转染HEK293细胞。24小时后将转染的细胞进行胰蛋白酶消化，计数并且将1x10⁵细胞铺于一个24孔板的每个孔中的1ml培养基中，并且允许粘附24小时。然后向每个孔中加入100ugCpn10、0.1ug聚(I:C)(InvivoGen)以及10ulSUPERaseRNA酶抑制剂(Ambion)保持24小时。然后去除上清液，在PBS中冲洗这些细胞并且用1x裂解缓冲液(Promega)进行裂解，并且测试荧光素酶。荧光素酶的水平以100％归一化为单独的聚(I:C)。这些值表示三乘孔的平均值。

发明的详细描述

Cpn10是一种圆顶形的、完全相同的10kDa亚基的七聚环(图1)。该圆顶的表面是亲水性的并且是带有大量电荷的。每一个Cpn10亚基以5个片段形成一个不规则的β-桶形拓扑，这5个片段通过几个环形结构进行连接。存在3个小的连接环以及2个大的环延伸，该环延伸从该桶突出出来。第一个延伸是一个β-发夹环(“顶环”)，该环向该七聚体的中心延伸并且形成该圆顶样结构的顶部。有趣的是，然而GroES(大肠杆菌Cpn10)的顶部在该顶环的尖端在生理条件下含有一簇负电荷残基，该哺乳动物Cpn10的顶部在该顶环的尖端含有一个正电荷簇的氨基酸；而该顶部的大部分的从该噬菌体Cpn10(Gp31)完全缺失。该分子还具有另一个延伸，该延伸是一个柔性的18个氨基酸的移动环，该环从该圆顶的底部延伸并且介导与Cpn60的相互作用。包括残基Glu-74、Tyr-75以及Gly-76的一个这些小的连接环从该圆顶的底部延伸并且向内突出从而形成一个较低的边缘区。在该较低边缘区内的氨基酸残基在多数真核生物中是种系发育保守的。

不受任何机理或途径的限制，诸位发明人已经主要地通过氨基酸取代、缺失、加入或它们的组合产生了一系列的突变，这改变了一种Cpn10多肽的电荷，并且在此证明这些突变在改变Cpn10与一种或多种PRR配体的相互作用中、特别是在增加Cpn10与该PRR配体的结合亲和性中是有效的，这表明通过PRR信号调节免疫系统/应答的能力。该Cpn10多肽到一个PRR配体上的结合可以在具有该PRR的特定的免疫细胞上产生免疫调节影响。该细胞可以是一种抗原呈递细胞、T-细胞或B-细胞。该抗原呈递细胞可以是一种树突细胞、巨噬细胞或单核细胞。

包括Toll样受体(TLR)、结合核苷酸的结构域含LRR家族(NLR)、RIG-I样受体(RLR)，IRF的DNA依赖性激活剂(DAI)、C型凝集素受体(CLR)以及IFI20X/IFI16家族(Ifi16、Aim2、MNDA以及IFIX)的模式识别受体(PRR)是免疫系统的哨兵，它们起对抗病原体侵入、识别特异性的病原相关分子模式(PAMPS)、以及启动一种免疫应答的的第一道防线的作用。看来PRR还在包括脓毒症、自身免疫或慢性炎性疾病的许多炎性综合征中起作用，其中改变的自身分子活性过高的PRR导致病理学状态的发展。

Cpn10多肽的突变体

通过加入正电荷残基或去除负电荷残基从而加入过量的正电荷产生一种Cpn10分子，该分子显著地更强地(与Ala-Cpn10以及X-Cpn10相比)结合到基于核酸的PRR配体上。可以通过(1)用一个正电荷残基取代一个现有的表面/溶液暴露的中性或负电荷残基，(2)用一个中性残基取代一个现有的表面/溶液暴露的负电荷残基，(3)引入一个另外的表面/溶液暴露的正电荷残基(例如延长一种环形结构或N端以及C端)或(4)缺失一个现有的表面/溶液暴露的负电荷残基(例如缩短一种环形结构或N端以及C端)加入过量的正电荷。我们的结果还显示出，引入多个正电荷(例如Ala-Cpn10-Y75K，D94K)可以比单一突变显著地更大地增加结合潜力。

蛋白净电荷的计算

在一个给定pH下的一个多肽的净电荷是基于Henderson-Hasselbalch方程式(Hasselbalch，K.A.，1917BiochemischeZeitschrift78：112-144)以及可离子化的氨基酸侧链的以及多肽的N端和C端的已知的pKa值进行计算。Henderson-Hasselbalch方程式表明，含有一种弱酸/碱的以及它的共轭碱/酸的一种溶液的pH仅依赖于这两种溶质的摩尔浓度之间的比率并且保持与稀释无关，如以下方程式中所示：

Henderson-Hasselbalch方程式

酸的方程式：pH＝pK_a+log[A-]/[HA](用于C端、Asp、Glu、Cys、Tyr)

碱的方程式：pH＝pK_a+log[B]/[BH⁺](用于N端、Lys、Arg、His)

其中，[A^-]表示一种相关酸的共轭碱的摩尔浓度(C端、Asp、Glu、Cys、Tyr)，并且[BH⁺]是一种相关碱的共轭酸的摩尔浓度(N端、Lys、Arg、His)。一种多肽中可电离基团的pKa值在本领域中是已知的并且可以在许多期刊和教科书中找到。依赖于使用的这套pKa值，一种蛋白的计算的净电荷可以稍微变化，但这没有改变在这项研究中获得的结论。表3中使用的pKa值是N端8.0、C端3.1、Lys10.0、Arg12.0、His6.5、Glu4.4、Asp4.4、Tyr10.0以及Cys8.5(Stryer，L.，1988“Biochemistry”textbook3rdEdition，NewYork，W.H.Freeman，ISBN0716719207)。

所以对于具有多个可电离基团的多肽，可以在给定的pH下如下计算该多肽的净电荷：

1.列出所有可电离的残基(Cys、Asp、Glu、His、Lys、Arg、Tyr、羧基端、氨基端)

2.如果一个可电离的基团的pKa为远离该pH值≥2单位，无需计算，该电荷可以指定为1、0、-1。例如，在pH7.3下赖氨酸(pKa10.0)将100％质子化，并且将具有平均电荷+1。另一方面，在pH7.3下谷氨酸(pKa4.4)以及天冬氨酸(pKa4.4)两者将100％去质子化，给出平均电荷-1。

3.使用Henderson-Hasselbalch方程式计算在给定的pH下每个可电离基团的百分比电离。在表3中在pH7.3以及pH7.4下进行计算(用作生理pH)。

4.每个可电离基团百分比电离(z_i)乘以在给定的多肽中出现的单个可电离基团的总数(n_i)从而得到每个可电离基团贡献的总电荷。然后通过总计每个可电离基团贡献的所有电荷Z＝∑n_iz_i提供在给定pH下一种多肽的净电荷(Z)从而得到在给定pH下该多肽的净电荷。

存在许多免费的可用资源，其中计算多肽上净电荷的该方法已经自动化从而易于使用。例如

ProteinCalculatorV3.3(http://www.scripps.edu/～cdputnam/protcalc.html)是一种免费可获得的基于氨基酸序列计算蛋白上的净电荷的工具。该工具用于计算在生理pH下(取为7.3到7.4)多种Cpn10多肽的净电荷，如表3中所示。

突变的类型

通过加入正电荷残基或去除负电荷残基可以生成具有对于促炎性核酸高度亲和性的Cpn10变体。用于生成对于促炎性核酸具有高度亲和性的Cpn10变体的突变可以是氨基酸残基插入、缺失、取代或加入或它们的一种组合，只要该突变导致Cpn10变体在pH7.4下比Ala-Cpn10具有更高的正电荷。

在一个实施方案中，一个现有的残基可以被取代为一个正电荷的残基，一个负电荷的残基可以被一种中性残基代替，可以加入一个另外的正电荷残基，或可以缺失负电荷残基，例如对于图1b中定义的该Cpn10多肽的区域的任意一个。可以通过本领域中任何已知的方法进行突变，例如定点诱变、同源重组、转座子诱变或序列标签诱变。典型地，定点诱变将被使用。

本领域中普通技术人员将认识到导致一种Cpn10变体在pH7.4下具有比Ala-Cpn10更高的正电荷以及对于促炎性核酸具有更高的亲和性的任何数量以及类型的突变落在本发明的范围内。

多肽

如在此披露的，本发明考虑了分离的Cpn10多肽以及与Ala-Cpn10相比它的增加的对于一种基于核酸的PRR配体的亲和性，包括一个或多个氨基酸缺失、加入或取代。

Cpn10可以是天然的、天然衍生的、重组的或合成的Cpn10。该Cpn10分子可以是来自一种真核生物的任何Cpn10多肽。通过举例，如图2中所示，该Cpn10可以从酵母(例如酿酒酵母)、线虫(例如，秀丽隐杆线虫)、蛙(例如，非洲爪蟾)、鸡(例如，原鸡)、斑马鱼(例如，斑马鱼)、蝇(例如果蝇例如黄猩猩果蝇)、植物(例如，拟南芥)或哺乳动物得到。该哺乳动物Cpn10可以是灵长类、鼠类、绵羊、牛、犬、猫、猪或马。可替代地，该Cpn10可以是起源于远古的。在具体的实施方案中，该Cpn10是人Cpn10。

本发明还涉及如以上披露的人Cpn10多肽同系物的改变并且包括这些通过加入、缺失或取代其中一个或多个氨基酸残基而改变的分子，以及这些改变如何能够增加这些Cpn10多肽对基于核酸的PRR配体的亲和性。此外，氨基酸的加入可能涉及一种Cpn10多肽或其片段与第二种多肽或肽(如一种聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白融合物、谷胱甘肽S转移酶融合物、绿色荧光蛋白融合物)的融合、或一种表位标签如FLAG、c-myc或六组氨酸标签的加入。该Cpn10多肽可以或不可以在N端包括起始的甲硫氨酸。例如，人Cpn10可以在N端包括一个另外的GSM三肽(参见例如WO95/15338，该披露的内容通过引用结合在此)，或一个另外的丙氨酸(A；SEQIDNos.3-5)或一个另外的甘氨酸。本发明还考虑了使用编码这些Cpn10改变形式的多核苷酸。在基于或基本上从人Cpn10得到的本发明的Cpn10多肽的情况下，这些多肽可以包括N端序列AGQAFRKFL、MAGQ、AGQ或AAGQ并且可选择地包括一种或多种如上所述的改变。

如在此使用的术语“变体”是指基本上相似的序列。通常，多肽序列变体具有相同的定性的生物学活性。进一步地，这些多肽序列变体可以共享至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。同样包括在术语“变体”的含义中的是本发明的多肽的同系物。同系物典型地是来自不同物种但与对应的在此披露的多肽共享基本上相同的生物学功能或活性的一种多肽。

进一步地，术语“变体”还包括本发明的多肽的类似物，其中术语“类似物”是指一种多肽，该多肽是本发明的多肽的一种衍生物，它的衍生包括加入、缺失、取代一个或多个氨基酸，从而使该多肽保持基本上相同的功能。

本发明还考虑了在此披露的多肽的片段。术语“片段”是指编码一种组分的一种多肽分子或是本发明的多肽或其变体的一种组分。典型地，该片段具有与它是其一种组分的多肽性质上相同的生物学活性。该多肽片段可以是约5到约150个氨基酸长度之间，约5到约100个氨基酸长度之间，约5到约50个氨基酸长度之间，或约5到约25个氨基酸长度之间。可替代地，该肽片段可以是在约5到约15个氨基酸长度之间。

在N端和/或C端通过如上所述加入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基修饰的Cpn10多肽也落在本发明的范围内。

Cpn10cDNA序列的优化

本发明使用优化的Cpn10cDNA序列来增加使用丰富的转移RNA(tRNA)池用于Cpn10多肽的生产。已知tRNA池提供了特异性的编码特异性氨基酸的密码子用于从信使RNA翻译蛋白。此外，还已知一些tRNA池比另一些更丰富。当大量的蛋白从某些表达系统生产时，这可能导致被耗尽的较低的丰度的tRNA库导致较低的产量和/或tRNA取代生成突变。

与本发明相关，发现易于受此影响的特异性的Cpn10变体。例如，在大肠杆菌中过量表达Cpn10的过程中，用于Gly39的稀有甘氨酸(Gly)GGAtRNA被耗尽并且可以用非常常用的谷氨酸盐/谷氨酸(Glu)GAAtRNA取代。

相应地，可以构建在任意数量的位置上使用优化的密码子的一种优化的序列具体地，特异性优化的甘氨酸以及精氨酸残基G3、G29、G39、G50、G55、G58、G68、G77、G98、R8、R16、R21以及R93导致野生型cDNA表达水平但是在保持Cpn10总产量的同时变体水平显著地降低。

此外，由于核糖体读过该细胞TGA终止密码子，可以生成Cpn10变体。在这个方面，可以通过将它改变成一个TAA终止密码子而优化该TGA终止密码子从而排除这个问题。

Cpn10的生产

根据本发明可以使用对于本领域中普通技术人员已知的重组DNA以及细胞生物学的标准的技术生产Cpn10多肽。例如可以从标准文本如Sambrooketal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NewYork，1989以及Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePubl.Assoc.andWiley-Intersciences，1992获得指导。描述于Mortonetal.，2000(ImmunolCellBiol78：603-607)、Ryanetal.，1995(JBiolChem270：22037-22043)以及Johnsonetal.，2005(JBiolChem280：4037-4047)中的方法是适合于Cpn10多肽纯化方法的实例，尽管了解该技术的人员应该理解本发明不受使用的纯化或生产方法的限制并且根据本发明的方法以及组合物使用的任何其他方法可以用于生产Cpn10。

使用标准的重组核酸技术可以得到根据本发明使用的Cpn10多肽以及肽片段，或可以合成它，例如使用常规的液相或固相合成技术。通过用一种或多种蛋白酶如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C以及葡萄球菌V8-蛋白酶消化一种多肽可以生产Cpn10肽。可以通过例如高效液相色谱(HPLC)技术纯化消化的肽片段。

可以将本发明的Cpn10多肽的纯化进行放大用于大规模生产的目的。例如，如在此所述，本发明的诸位发明人已经开发了一种生物过程用于生产大量(克级)高纯度临床级的Cpn10多肽。

还可以通过对于本领域中普通技术人员已知的液相或固相化学的标准方法合成本发明的Cpn10多肽，连同其片段以及变体。例如，按照Steward与Young(Steward，J.M.&Young，J.D.，SolidPhasePeptideSynthesis.(2ndEdn.)PierceChemicalCo.，Illinois，USA(1984)的固相化学过程可以合成这些分子。

总体而言，这样一种合成方法包括将一种或多种氨基酸或适当地受保护的氨基酸顺序地加到一个增长的肽链上。典型地，第一个氨基酸的氨基或羧基基团由一个适宜的、保护性基团进行保护。然后将该保护的氨基酸或者连接到一个惰性固体支撑物上或者通过加入序列中的下一个氨基酸用于溶液中，该序列具有适宜地保护的互补基团(氨基或羧基)并且在适合用于形成该酰胺的条件下。然后从该新加入氨基酸残基去除保护基团并且加入下一个(保护的)氨基酸，等等。在所有的所希望的氨基酸已经连接之后，顺序地或同时地去除任何残余的保护基团，并且如果有必要的话去除任何固体支撑物从而生成最终的多肽。

Cpn10多肽中的氨基酸改变可以通过对于相关领域中普通技术人员已知的技术实现。例如氨基酸改变可以通过核苷酸代替技术来实现，它包括加入、缺失、或取代核苷酸(保守的和/或非保守的)，只要保持适当的阅读框。示例性的技术包括随机诱变、定点诱变、寡核苷酸介导的或多核苷酸-介导的诱变、通过使用现有的或设计的限制酶位点缺失选择的一个或多个区域、以及聚合酶链式反应。

通过本发明的Cpn10多肽的免疫调节活性的生成可能涉及该Cpn10多肽的七聚体的形成。为了本发明的目的可以通过对于本领域中普通技术人员已知的多种技术的任何一种进行免疫调节活性的测试。如在此举例的，通过测量该多肽调节来自Toll样受体TLR-3的信号能力可以测定Cpn10多肽的免疫调节活性，例如使用一种NF-κB-荧光素酶报告基因细胞系，并且典型地在一种TLR-3激动剂例如聚(I:C)存在下。如在此所述还测试了其他的TLR如TLR-7、8以及9。可替代地或此外，可以使用在体外、离体或体内的其他检测来测定免疫调节活性，例如通过测量细胞中(如外周血单核细胞)细胞因子的产生、竞争性结合测定、一种双杂交测定、一种过滤检测、一种电泳迁移率(凝胶迁移)检测、一种孔板捕获检测或能够使人们测量免疫调节活性的检测的任意组合。

多核苷酸

本发明的实施方案提供了编码如上所述的Cpn10多肽的分离的多核苷酸以及这些多核苷酸的变体以及片段。在本发明的范围内考虑的多核苷酸的非限制性的例子在此表示为SEQIDNo’s7、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47、48、50、51、53、54、56、57、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、117、119、120、122、123、125、126、128、129、131、132、134、135、137、138、140、141、143、144、146、147、149、150、152、153、155、156、158、159、161、162、164、165、167、168、170、171、173、174、176、177、179、180、182、183、185、186、188、189、191，.192、194、195、197、198、200、201、203、204、206、207、209、210、212、213、215、216、218、219、221、222、224、225、227、228、230、231、233、234、236、237、239、240、242、243、245、246、248、249、251、252、254、255、257、258、260、261、263、264、266、267、269、270、272、273、275、276、278、279、281、282、284、285、287、288、290、291、293、294、296、297、299、300、302、303、305、306、308、309、311、312、314、315、317、318、320、321、323、324、326、327、329、330、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354或356。

对于以上讨论的多肽，如在此使用的术语“变体”是指基本上相似的序列。通常，多核苷酸序列变体编码多肽，这些多肽具有性质上相同的生物学活性。进一步地，这些多核苷酸序列变体可以共享至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。同样包括在术语“变体”的含义中的是本发明的多核苷酸的同系物。同系物典型地是来自不同物种但共享基本上相同活性的一种多核苷酸。

还考虑了本发明的多核苷酸的片段。术语“片段”是指一种核酸分子，该核酸分子编码一种组分或是本发明的多核苷酸的一种组分。多核苷酸的片段不必要需要编码保留生物学活性的多肽。然而，例如该片段可以用作一种杂交探针或PCR引物。该片段可以从本发明的一种多核苷酸得到或可替代地可以通过一些其他方法例如化学合成方法合成。本发明的多核苷酸以及其片段还可以使用本领域中普通技术人员已知的技术用于生产反义分子。

相应地，本发明考虑基于本发明的多核苷酸序列的寡聚核苷酸以及片段用作引物以及探针。寡聚核苷酸是核苷酸残基的短的一段序列适合用于核酸扩增反应如PCR，典型的是长度至少是约10个核苷酸至约50个核苷酸，更典型的是约15至约30个核苷酸长度。探针是可变长度的核苷酸序列，例如在约10个核苷酸与几千个核苷酸之间，用于检测同源序列，典型地是通过杂交。序列之间同源性的水平(序列一致性)将主要通过杂交条件的严紧性来测定。特别地，用作探针的核苷酸序列可以在低严紧性、中等严紧性或高严紧性条件下杂交到在此披露的多核苷酸的同系物或其他变体上。低严紧性杂交条件可以对应于在50℃下在2xSSC中进行杂交。存在对于本领域中普通技术人员已知的多种条件和因素，它们可以用于改变杂交的严紧性。例如，有待杂交到一种特异性的核酸上的核酸的长度和本性(DNA、RNA、碱基组合物)；盐以及其他组分的浓度，如甲酰胺、葡聚糖硫酸盐、聚乙二醇等的存在或缺少；以及改变杂交和/或冲洗步骤的温度。例如，杂交滤膜可以在2XSSC中、0.5％SDS以及至少55℃(低严紧性)、至少60℃(中严紧性)、至少65℃(中/高严紧性)，至少70℃(高严紧性)或至少75℃(非常高的严谨性)下冲洗两次持续30分钟。

在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸可以克隆到一个载体中。该载体可以是一种质粒载体、一种病毒载体或适合插入外源序列、将它们引入到真核细胞中、并且将这些引入的序列进行表达的任何其他适合的载体。典型地，该载体是一种真核表达载体并且可以包括表达控制以及处理序列，如一个启动子、一个增强子、核糖体结合位点、聚腺苷酸化作用信号以及转录终止序列。

抗体

本发明提供多种抗体，这些抗体选择性结合到本发明的Cpn10多肽以及其片段和类似物上。适合的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合体、人源化、单链、Fab片段，以及一种Fab表达库。本发明的抗体可以作为Cpn10多肽或其片段或类似物的激动剂或拮抗剂。

可以从本发明的Cpn10多肽的不同区域或片段制备抗体，特别是涉及提供免疫调节活性和/或配偶体或底物结合的那些。抗原性Cpn10多肽包含至少约5个、并且优选地至少约10个氨基酸。

用于生成适合的抗体的方法已经被本领域中普通技术人员所了解。例如典型地包含Fab部分的一种抗Cpn10单克隆抗体可以使用Antibodies-ALaboratoryManual，HarlowandLane，eds.，ColdSpringHarborLaboratory，N.Y.(1988)中描述的杂交瘤技术制备。

在制备针对本发明的Cpn10多肽、其片段或类似物的单克隆抗体中，可以使用提供用于在培养中通过连续细胞系产生抗体分子的任何技术。这些包括最初由Kohler等人Nature，256：495-497(1975)，开发的杂交瘤技术，连同三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术[Kozboretal.，ImmunologyToday，4：72(1983)]，以及EBV杂交瘤技术从而生成人单克隆抗体[Coleetal.，inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，pp.77-96，AlanR.Liss，Inc.，(1985)]。可以通过除了融合之外的技术生成不死的生产抗体的细胞系，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用爱泼斯坦-巴尔病毒转化。参见例如M.Schreieretal.，″HybridomaTechniques″(1980)；Hammerlingetal.，″MonoclonalAntibodiesandT-cellHybridomas″(1981)；Kennettetal.，″MonoclonalAntibodies″(1980)。

总之，产生了从中生产单克隆抗体的杂交瘤的一种方法，将骨髓瘤或其他能使自身永久存在的细胞系与从用其识别因子结合部分、或识别因子或其起源特异性的DNA结合部分超量免疫的哺乳动物的脾脏得到的淋巴细胞进行融合。通过它们的与现有识别因子免疫反应的能力以及它们的在目标细胞中抑制特异性转录活性的能力识别生产有用于实现本发明的单克隆抗体的杂交瘤。

可以通过启动一种单克隆杂交瘤培养系生产有用于实现本发明的单克隆抗体，该培养系包括含有杂交瘤的一种营养物培养基，该杂交瘤分泌适当的抗原特异性的抗体分子。在一定条件下保持该培养物并且持续足以使该杂交瘤向培养基中分泌该抗体分子的一段时间。然后收集含有培养基的抗体。然后可以通过已知的技术进一步分离抗体分子。

类似地，存在本领域中已知的多个过程，这些过程可以用于生产对于本发明的Cpn10多肽、或其片段或类似物的多克隆抗体。为了生产Cpn10多克隆抗体，可以通过注射一种Cpn10多肽、或其片段或类似物免疫不同的宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。此外，可以将该Cpn10多肽或其片段或类似物连接到一种免疫原性的载体上，例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)。还可以使用不同的辅助剂从而增加免疫应答包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽类、油性乳液、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基酚以及潜在有用的人类辅助剂如BCG(卡介苗)以及短小棒状杆菌。

通过本领域中已知的多种技术还可以实现筛选希望的抗体。抗体的免疫特异性结合的检测包括但不限于放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、三明治免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定、补体固定测定、萤光免疫检验、蛋白A测定、以及免疫电泳测定、等(参见例如，Ausubeletal.，eds，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork)。通过一抗Cpn10抗体上的可检测的标志物可以检测抗体结合。可替代地，通过它与一种二抗/或适当地标记的试剂结合可以检测抗Cpn10抗体。用于检测免疫测定中结合的多种方法在本领域中是已知的并且在本发明的范围内。

本发明的抗体可以用于诊断方法以及试剂盒从而定性地或定量地检测体液中或组织中的Cpn10，这对于本领域中普通技术人员是已知的，或可替代地抗体可以用于多种方法和组合物中用于治疗不同的疾病、紊乱以及病症。

抗本发明的Cpn10多肽或其片段或类似物生成的抗体(或其片段)具有对于Cpn10的结合亲和性。优选地，该抗体(或其片段)具有大于约10⁵M^-1、更优选地大于约10⁶M^-1、更优选地还大于约10⁷M^-1以及最优选地大于约10⁸M^-1的结合亲和性或亲和力。

就根据本发明获得适合的量的抗体而言，人们可以使用用不含培养基的血清的批量发酵的方法生产一种或多种抗体。发酵后，可以通过多步步骤结合色谱以及病毒失活/去除步骤纯化抗体。例如，可以首先通过蛋白A亲和层析分离抗体并且然后用溶剂/洗涤剂处理从而使任何类脂包膜的病毒失活。进一步纯化，典型地通过阴离子和阳离子交换层析，可以用于去除残余的蛋白、溶剂/洗涤剂以及核酸。可以进一步纯化已纯化的抗体并且使用凝胶过滤柱配制成0.9％盐水。然后将配制的大量制品进行消毒以及细菌过滤以及分配。

激动剂以及拮抗剂

使用以上描述的方法，可以识别一种试剂是本发明的多肽或其一种变体或片段的一种激动剂。是激动剂的试剂增强了该多肽的一种或多种生物学活性。可替代地，以上描述的方法可以识别一种试剂是本发明的多肽或其一种变体或片段的一种拮抗剂是拮抗剂的试剂延缓了该多肽的一种或多种生物学活性。激动剂增强了一种分子如在此描述的Cpn10多肽的一种或多种生物学活性，而拮抗剂延缓了这些多肽的一种或多种生物学活性。在一个实例中，本发明的多肽的一种激动剂可以是一种免疫抑制的核酸。该核酸可以结合到本发明的多肽上形成一种复合物。在另一个实例中，本发明的多肽的一种拮抗剂可以是一种促炎性的核酸。该核酸还可以结合到本发明的一种多肽上形成一种复合物。可以生成本发明的这些多肽的活性的这些潜在的调节剂用于通过以上方法通过对于本领域中普通技术人员已知的多种技术进行筛选。例如，如X射线晶体学以及核磁共振谱学的方法可以用于对本发明的多肽或其变体或片段的结构进行建模，从而有助于使用基于计算机的建模设计潜在的调节试剂。不同形式的组合化学还可以用于生成推测的调节物。使用以下描述的筛选方法，可以识别一种试剂是本发明的多肽或其一种变体或片段的一种激动剂或拮抗剂。抗体、低分子量的肽、核酸以及非蛋白质的有机分子是这些试剂的实例，这些试剂可以作为本发明的多肽或其一种变体或片段的激动剂或拮抗剂起作用。

筛选

可以通过不同的适合的方法识别与本发明的多肽和多核苷酸结合或否则相互作用的化合物以及调节它们活性的特异性化合物。非限制性的方法包括双杂交方法、共免疫沉淀反应、亲和纯化、质谱、串联亲和纯化、噬菌体展示、标签转移、DNA微阵列/基因共表达以及蛋白质微阵列。

本发明的Cpn10多肽以及适当的片段和变体可以用于高通量筛选以检测能够与Cpn10结合或否则相互作用的候选化合物。这些候选化合物可以是促炎性核酸或免疫抑制的核酸，它们与如在此描述的多肽、该多肽的片段或变体形成复合物。候选化合物可以是蛋白。

可以抗功能Cpn10进一步筛选这些候选化合物从而确定该化合物在Cpn10活性上的作用。本发明的多肽以及多核苷酸以及其片段和类似物用于筛选和识别与这些分子相互作用的化合物和试剂。具体地，希望的化合物是调节这些多肽和多核苷酸的活性的那些。这些化合物可以通过激活、刺激、增加、抑制或阻止该多肽和/或多核苷酸的表达或活性起调节作用。适合的化合物可以通过或者直接(例如结合)或间接相互作用而起作用。如在此描述的，存在多种筛选调节本发明的Cpn10多肽的活性或否则与其相互作用的化合物的方法。可以通过多种适合的方法识别这些化合物。使用标准的竞争结合测定如凝胶迁移测定以及或双杂交测定系统中描述的多孔板结合测定可以测定相互作用和/或结合。

例如，该双杂交测定是一种基于酵母的遗传测定系统(FieldsandSong，1989)典型地用于测定蛋白-蛋白相互作用。简言之，该检测利用转录激活剂的多结构域的本性。例如，可以将一种已知的转录激活剂的结合DNA的结构域融合到本发明的一种Cpn10多肽或其片段或变体上，并且使该转录激活剂的活性结构域融化到一种候选蛋白上。该候选蛋白与该Cpn10多肽或其片段或变体之间的相互作用可以带来DNA结合以及使该转录激活剂的活性结构域进入紧密的邻近。因此可以通过转录通过该转录激活剂激活的一种特异性的报告基因检测相互作用。

可替代地，可以使用亲和层析识别Cpn10的结合配偶体。例如，可以将本发明的Cpn10多肽或其片段或变体固定在一种支撑物上(如琼脂糖凝胶(sepharose))并且使细胞裂解液流过该柱子。然后可以将结合到该固定Cpn10多肽、片段或变体的蛋白从该柱子洗脱并且识别。首先通过例如N端氨基酸测序可以识别这些蛋白。

在上述技术的一种改进中，通过将一种Cpn10多肽、片段或变体融合到一种可检测的标签如碱性磷酸酶上并且使用如由FlanaganandLeder(1990)描述的免疫沉淀反应的一种改进的形式可以生成一种融合蛋白。用于检测调节Cpn10活性的化合物的方法可以涉及将一种Cpn10多肽与一种候选化合物以及一种适合的标记的底物结合并且通过底物的变化监测该化合物在Cpn10上的作用(可以作为时间函数测定)。适合标记的底物包括标记用于例如基于色度法的、放射性测量的、荧光测定法或荧光共振能量转移(FRET)方法的那些。

例如，共免疫沉淀可以用于检测是否一种候选试剂或多种候选试剂与本发明的多肽或其变体或片段相互作用或结合。使用这些技术，可以在适合于保存蛋白-蛋白相互作用的在非变性条件下裂解氰基毒性生物、蓝细菌和/或甲藻。然后可以将得到的溶液与对于本发明的多肽或其变体或片段的特异性的一种抗体孵育并且从该总体溶液中免疫沉淀，例如通过用连接到一种固体支撑物上的一种抗体结合蛋白捕获。通过本方法的本发明的多肽或其变体或片段的免疫沉淀有助于与该蛋白相关的一种试剂的共免疫沉淀。识别一种相关试剂可以使用本领域中已知的多种方法实现，包括但不限于SDS-PAGE、蛋白质印迹法以及质谱法。

可替代地，噬菌体展示方法以用于检测是否一种候选试剂或多种候选试剂与本发明的多肽或其变体或片段相互作用或结合。噬菌体展示是通过将来自基因库的多个基因整合到噬菌体中用于筛选蛋白质相互作用的一种测试。在这种方法中，当与噬菌体的外壳蛋白融合时使用重组DNA技术表达多种基因，从而将每个基因的肽或蛋白产物展示于该病毒颗粒的表面上。用这种方式可以生成感兴趣的噬菌体展示的肽或蛋白产物的全部的文库。然后可以筛选得到的噬菌体展示的肽或蛋白产物的文库，检测结合到本发明的多肽或其变体或片段的能力。从相互作用的噬菌体中提取的DNA包含相互作用的蛋白的序列。

可替代地，亲和层析方法以用于检测是否一种候选试剂或多种候选试剂与本发明的多肽或其变体或片段相互作用或结合。例如，可以将本发明的多肽或其变体或片段固定在一种支撑物上(如琼脂糖凝胶)并且使细胞裂解液流过该柱子。然后可以从该柱子洗脱结合到本发明的固体的多肽或其变体或片段的蛋白并且例如通过N端氨基酸测序进行识别。本发明还考虑了可以在本发明的多肽上通过改变该多肽的表达起到它们的调节作用的化合物。在这个例子中，可以通过比较在存在该候选化合物下该多肽的表达水平与缺少该候选化合物下表达的水平来识别这些化合物。

在抗体的上下文中，通过本领域中已知的多种技术还可以实现筛选希望的抗体。抗体的免疫特异性结合的检测包括但不限于放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、三明治免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定、补体固定测定、萤光免疫检验、蛋白A测定、以及免疫电泳测定、等(参见例如，Ausubeletal.，eds，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork(1994))。通过一抗体上的可检测的标志物可以检测抗体结合。可替代地，通过它与一种二抗/或适当地标记的试剂结合可以检测抗体。用于检测免疫测定中结合的多种方法在本领域中是已知的并且包括在本发明的范围内。

应当理解的是以上描述的方法仅仅是可以用于识别能够与本发明的多肽或其变体或片段相互作用或调节其活性的试剂的方法的类型的实例。其他适合的方法将被本领域中的普通技术人员知晓并且在本发明的范围内。

组合物以及给药途径

本发明的Cpn10多肽和多核苷酸可以用作治疗剂。通过给予受试者一个治疗有效量的这样的一个分子，这些分子例如在受试者体内治疗或预防一种疾病或病症中找到用途。典型地，通过调整受试者体内的免疫应答，这些疾病或病症是易于治疗的。作为举例，这些疾病以及或病症可以包括：急性或慢性炎性疾病，如胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、斯耶格伦病、格雷夫斯病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、慢性疲乏综合征、阿耳茨海默病、哮喘、过敏症、多发性硬化症、GVHD、动脉粥样硬化、炎性疼痛、牛皮癣、HIV、慢性免疫激活(chronicimmuneactivation)、慢性肌炎、硬皮病。该疾病还可以是一种癌症，如非小细胞肺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、结肠直肠癌、基底细胞癌。该疾病可以是一种传染性疾病。

该传染性疾病可以因一种细菌性、病毒性的或真菌性感染引起。慢性免疫激活与细菌性(例如LPS)和/或病毒性产物(例如核酸)从胃肠道渗漏到循环系统中相关。例如，可以从口腔、肠或小肠发生渗漏。细菌性或病毒性产物的渗漏可以由一种感染或疾病(如细菌感染、病毒感染、炎性肠病以及牙龈疾病)而引起。病毒感染的一个例子是一种HIV或丙型肝炎感染。

慢性免疫激活涉及通过LPS或核酸结合到TLR上的TLR信号的免疫调节。LPS可以结合到TLR2或TLR4上，同时核酸可以结合到TLR3、7、8或9上。

相应地，在此考虑了用于治疗或预防疾病以及病症的包含Cpn10多肽以及多核苷酸的药学上有用的组合物。

本发明的Cpn10多肽的激动剂以及拮抗剂，包括抗Cpn10抗体，也可以用作治疗剂。相应地，本发明还考虑使用此类激动剂以及拮抗剂以及包含它们的药物组合物的治疗方法。

总之，根据本发明的方法使用的合适的组合物可以根据本领域中普通技术人员已知的方法以及步骤来制备，并且相应地可以包括一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或辅助剂。

组合物可以通过标准途径来给药。通常，这些组合物可以通过肠胃外的(例如静脉内的、脊柱内的、皮下的或肌内的)、口服的或局部的途径来给药。给药可以是全身的、区域性的或局部的。在任何给定情况下，有待使用的具体给药途径将取决于多种因素，这些因素包括：有待治疗的病症的性质、病症的严重性以及程度、有待递送的具体化合物的所需剂量以及该化合物的潜在副作用。

通常地，合适的组合物可以根据本领域中普通技术人员已知的方法来制备并且可以包括一种药学上可接受的稀释剂、辅助剂和/或赋形剂。这些稀释剂、辅助剂以及赋形剂必须在与该组合物的其他成分是相容的，并且对它们的接受者是无害的方面是“可接受的”。

药学上可接受的载体或稀释剂的例子是脱矿物的或蒸馏的水；盐溶液；基于蔬菜的油类，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、麻油类，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、麻油、花生油、或椰子油；硅油类，包括聚硅氧烷类，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷以及甲基苯基聚硅氧烷；挥发性有机硅类；矿物油类，如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物类，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇类，例如乙醇或异丙醇；低级芳链烷醇类(aralkanols)；低级聚亚烷基二醇类或低级亚烷基二醇类，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯类，如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍树胶或阿拉伯树胶、以及石油膏。典型地，该载体或这些载体将占按重量计组合物的从10％至99.9％。

本发明的组合物可以是一种适合注射给药的形式、是适合口服摄取的一种配制品的形式(例如像胶囊、片剂、胶囊形片剂、酏剂)、是适合局部给药的一种软膏、乳剂、或洗液的形式、是一种适合作为一种滴眼液而递送的形式、是一种适合通过吸入给药(如通过鼻内吸入或口腔吸入)的气溶胶形式、是一种适合肠胃外给药(即皮下的、肌内的或静脉内的注射)的形式。

对于作为一种可注射溶液或悬浮液的给药，无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载体可以包括：林格式溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇以及1，2丙二醇。

对于口服使用合适的载体、稀释剂、赋形剂以及辅助剂的一些例子包括：花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯树胶、黄蓍树胶、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明胶以及卵磷脂。此外，这些口服配制品可以包含合适的调味料以及着色剂。当以胶囊形式使用时，这些胶囊可以用如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的化合物包被，这些化合物延迟了崩解。

辅助剂典型地包括：柔润剂类、乳化剂类、增稠剂类、防腐剂类、杀细菌剂类、以及缓冲剂类。

用于口服给药的固体形式可以包含人类和兽医药学实践中可接受的粘合剂类、增甜剂类、崩解剂类、稀释剂类、调味料类、涂层剂类、防腐剂类、润滑剂类和/或延时剂。适合的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适合的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬酰苯丙氨酸甲酯或糖精。适合的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。适合的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢二钙。适合的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、桔子或覆盆子调味料。适合的涂层剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇类、玉米素、虫胶或面筋。适合的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适合的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

除以上试剂外，用于口服给药的液体形式还可以包含一种液体载体。适合的液体载体包括水、油类，如橄榄油、花生油、麻油、向日葵油、红花油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油，脂肪醇类、甘油三酸酯类或它们的混合物。

用于口服给药的悬浮液可以进一步包含分散剂类和/或助悬剂类。适合的助悬剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯酮、海藻酸钠或乙酰醇。适合的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸(如硬脂酸)的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸盐酯，等等。

用于口服给药的乳液可以进一步包括一种或多种乳化剂。适合的乳化剂包括如以上所列举的分散剂类或天然树胶，如瓜尔胶、阿拉伯树胶或黄蓍树胶。

用于制备可胃肠外给药的组合物的方法对于本领域中普通技术人员是清楚的，并且更详细地描述于例如Remington′sPharmaceuticalScience，15thed.，MackPublishingCompany，Easton，Pa.中，从而通过引用结合在此。

本发明的局部配制品包含与一种或多种可接受的载体一起的一种活性成分、以及可任选地任何其他治疗性成分。适合局部给药的配制品包括适于渗透穿过皮肤到达需要治疗的位点的液体或半液体制品，如搽剂、洗液、乳剂、软膏或糊剂，以及适合对眼、耳或鼻给药的滴剂。

根据本发明的滴剂可以包括无菌的水性或油性溶液或悬浮液。这些可以通过将活性成分溶解在一种杀菌的和/或杀真菌的试剂和/或任何其他合适的防腐剂的、并且可任选地包括一种表面活性剂的水溶液中来制备。然后可以将生成的溶液通过过滤澄清、转移到一个适合的容器中并且灭菌。灭菌可以通过以下方式来完成：在高压灭菌或维持在90℃-100℃下半小时、或通过过滤，随后通过一种无菌技术转移到一个容器中。适合包含在滴剂中的杀菌的和杀真菌的试剂的例子是苯汞的硝酸盐或醋酸盐(0.002％)、氯化苄烷铵(0.01％)以及醋酸氯己定(0.01％)。用于制备一种油性溶液的适合的试剂包括甘油、稀释的乙醇以及丙二醇。

根据本发明的洗液包括适合应用于皮肤或眼睛的那些。一种洗眼液可以包含一种无菌的水溶液(该水溶液可任选地包含一种杀细菌剂)并且可以通过与以上所述的与制备滴剂的相关的那些方法类似的方法来制备。应用于皮肤的洗液或搽剂还可以包括一种用来加速干燥以及用来冷却皮肤的试剂，例如如乙醇或丙酮、和/或一种保湿剂如甘油，或油如蓖麻油或花生油。

根据本发明的乳剂、软膏或糊剂是用于外部施用的活性成分的半固体配制品。它们可以通过将活性成分以精细分散的或粉末的形式、单独地或以一种水性或非水性流体在溶液或悬浮液中、与一种油脂的或非油脂的基底进行混合来制成。该基底可以包括烃类，如硬的、软的或液体石蜡、甘油、蜂蜡、一种金属皂；一种黏液；一种自然来源的油，如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄榄的油；羊毛脂或它的衍生物、或一种脂肪酸，如硬脂酸或油酸与一种醇(如丙二醇或聚乙二醇)一起。

该组合物可以掺入任何适合的表面活性剂，如一种阴离子的、阳离子的或非离子的表面活性剂，如山梨聚糖酯类或它们的聚氧乙烯衍生物。还可以包括助悬剂如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料(如含硅的硅石)、以及其他成分(如羊毛脂)。

这些组合物还可以是以脂质体的形式来给药的。脂质体通常是从磷脂或其他脂类物质得到的，并且是通过分散于一种水性介质中的单-或多-层水合液体晶体来形成的。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的并且可代谢的脂类。脂质体形式的组合物可以包含稳定剂、防腐剂类、赋形剂，等等。优选的脂类是磷脂以及磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们两个是天然的以及合成的。形成脂质体的方法在本领域中是已知的，并且与此具体参考有关的是：Prescott，Ed.，MethodsinCellBiology，VolumeXIV，AcademicPress，NewYork，N.Y.(1976)，p.33etseq.，其内容通过引用结合在此。

这些组合物可以与一系列聚乙二醇(PEG)衍生物相关联。向蛋白中的加入PEG(聚乙二醇化作用)是一种得到充分确认的用于降低蛋白的等离子体清除率的方法，从而增加了它们的疗效(Nuccietal.，1991，Adv.DrugDel.Rev.6：133)。聚乙二醇化作用的另外的优点可以包括：蛋白更大稳定性、降低免疫原性、提高溶解度以及降低对蛋白水解作用的敏感性(SheffieldW.2001，CurrDrugTargetsCardiovascHaematolDisord.1：1-22)。PEG分子包含-(OCH₃CH₂)n-OH的基本重复结构并且根据它们的分子量分成几组。将PEG衍生物连接到蛋白上以增加它们的流体动力学半径，并且通常它们在半衰期上的增加是直接与所连接的PEG链的大小相关的(SheffieldW.2001，CurrDrugTargetsCardiovascHaematolDisord.1：1-22)。

这些组合物还可以是以微颗粒的形式来给药的。从聚丙交酯(PLA)、聚丙交酯-共聚-乙交酯(PLGA)以及∈-己内酯(ε-己内酯)形成的生物可降解的微颗粒已经广泛地用作药物载体以增加等离子体半衰期并且从而延长疗效(R.Kumar，M.，2000，JPharmPharmaceutSci.3(2)234-258)。已经配制了微颗粒用于一系列候选药物(包括疫苗、抗生素、以及DNA)的递送。此外，已经开发了这些配制品用于不同的递送途径，包括肠胃外的皮下注射、静脉内注射和吸入。

这些组合物可以掺入一种控制释放的基质，该基质是由蔗糖乙酸异丁酸酯(SAIB)以及有机溶剂或多种有机溶剂的混合物组成的。可以将聚合物添加剂作为一种释放改性剂加入到运载体中以进一步增加粘度并且延缓释放速率。SAIB是一种熟知的食品添加剂。它是一种非常疏水的、完全酯化的蔗糖衍生物，标称比率为六个异丁酸酯比两个乙酸酯基团。作为一种混合的酯，SAIB没有结晶而是作为一种澄清的粘稠液体而存在。SAIB与一种药学上可接受的有机溶剂(如乙醇或苯甲醇)的混合充分降低了该混合物的粘度从而允许注射。可以将一种活性药物成分加入到该SAIB递送运载体中以形成SAIB溶液或悬浮液配制品。当将该配制品皮下注射时，溶剂从基质扩散，允许以一种原位形成贮藏物质(insituformingdepot)形成SAIB-药物或SAIB-药物-聚合物混合物。

为了本发明的目的，可以将分子以及试剂作为组合物治疗性地或预防性地给予受试者的。在一个治疗性应用中，将组合物以足以治愈或至少部分抑制一种疾病以及其并发症的量给予已经患有该疾病的一位患者。该组合物应该提供足以有效治疗该患者的量的分子或试剂。

本发明的实施方案还考虑了一种编码Cpn10的多核苷酸的给药。在此类情形下，该多核苷酸典型地是是可操作地连接到一个启动子上，从而在给予该患者该多核苷酸之后，生成了适当的多肽序列。该多核苷酸可以在一个载体中给予患者。该载体可以是一种质粒载体、一种病毒载体或适合插入外源序列、将它们引入到真核细胞中、并且将这些引入的序列进行表达的任何其他适合的载体。典型地，该载体是一种真核的表达载体并且可以包括表达控制以及处理序列，如一个启动子、一个增强子，核糖体结合位点、聚腺苷酸化作用信号以及转录终止序列。有待给予的核酸构建体可以包括裸露的DNA或可以是与一种或多种药学上可接受的载体一起的一种组合物的形式。

本领域中普通技术人员应当理解，根据本发明的方法，本发明的Cpn10多肽可以单独给药或与一种或多种另外的试剂联合给药。例如，一种本发明的Cpn10多肽可以与能够刺激TLR受体(如TLR-3)的一种或多种激动剂一起给予。此外，本发明考虑了使用本发明的Cpn10多肽与用于治疗疾病或障碍的其他治疗方法联合的组合疗法。例如，Cpn10多肽可以用于病毒性疾病的治疗中，使用I型干扰素(如IFNβ或IFN1β)的疗法对这些疾病起作用，并且本发明的Cpn10多肽可以用于与IFNβ联合用于治疗自身免疫病，如多发性硬化症。

对于此类联合治疗，联合治疗的各组分可以同时给药、或以任何次序顺序地给药、或在不同的时间给药，从而提供所希望的效果。可替代地，这些组分可以以一个单一剂量单位的形式配制在一起成为一种组合产物。当分开给药时，优选的是这些组分可以通过相同的给药途径来给药，虽然对于这些组分不是必须要这样做的。

剂量

对于任何具体患者的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，这些因素包括：所治疗的障碍以及该障碍的严重性；所使用的分子或试剂的活性；所使用的组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别以及日常饮食；给药时间；给药途径；分子或试剂的隔离(sequestration)速率；治疗的持续时间；与治疗联合或同时使用的药物，与医学中所熟知的其他相关因素一起。

本领域中普通技术人员应该能够通过常规实验确定一个治疗可适用的疾病或以及病症所需要的有效的、无毒的量的试剂或化合物。

通常地，一个有效剂量预期是在每两周每千克体重大约0.0001mg至大约100mg的范围内；典型地，每两周每千克体重大约0.001mg至大约75mg；每两周每千克体重大约0.01mg至大约50mg；每两周每千克体重大约0.05mg至大约50mg；每两周每千克体重大约0.1mg至大约10mg；近似地，每两周每千克体重大约0.1mg。在此还考虑了每周一次或每三周一次的基础上给予该剂量。

可替代地，一个有效剂量可以是每两周每位患者大约25mg至150mg。通常地，一个有效剂量预期是在每两周每位患者大约2.5mg至大约750mg的范围内，优选每两周每位患者大约10mg至大约350mg，更优选每两周每位患者大约25mg至大约150mg，甚至更优选每周大约25mg至大约200mg。

在典型情况下，在治疗性应用中，这种治疗是要针对疾病状态的持续期间。

此外，本领域中普通技术人员应当清楚的是，单独剂量的最佳量和间隔将通过所治疗的疾病状态的性质和程度、给药的形式、途径以及位点、以及所治疗的具体个体的性质来确定。同样地，这些最适宜的条件可以通过常规技术来确定。

本领域中普通技术人员还应该清楚的是，最佳的疗程(如对于规定天数，每天所给予的组合物的剂量的数量)可以由本领域中普通技术人员使用治疗确定试验的常规疗程来确定。

现在将通过引用具体实施例对本发明进行说明，它们不得以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：Cpn10多肽的生产

为了进一步定义本发明Cpn10多肽的生产方法，提供了以下非限制性实施例。

首先，将一个编码人Cpn10(经修饰或未经修饰)的热诱导表达质粒转化进入大肠杆菌菌株XL1-Blue(Stratagene)中，并且从一个单独的选出的克隆建立了一个主细胞库。然后在大肠杆菌中基本上如由Ryan等人所述(1995，JBiolChem270：22037-22043)生产Cpn10。此外，将没有结合Macro-PrepHighQ(BioRad)的物质通过S-Sepharose并且然后通过凝胶过滤(Superdex200，AmershamBiosciences)进行进一步纯化。将在一个50mMTris-HCl(pH7.6)以及150mMNaCl缓冲液中的纯化的Cpn10根据生产厂家的说明书通过具有0.2mmMustangE膜的Acrodisc(PallCorporation，AnnArbor，MI.CatNo.MSTG5E3)进行过滤从而去除残余的内毒素并且在-70℃下保存。通过在SDS-PAGE上的考马斯亮蓝染色，测定Cpn10(例如，如图3中所示的不同的Cpn10突变体多肽)的纯度为＞99％。在使用之前，立即将等分部分解冻。

实施例2：Cpn10蛋白的分子伴侣活性

为了检验与分子伴侣活性相关的不同氨基酸残基的重要性、它们的潜在电荷、以及这些残基的位置，诸位发明人测试了包含一个或多个突变并且具有或不具有一个额外N端丙氨酸(Ala)残基的Cpn10多肽(参见表1)检测作为分子伴侣起作用以及与大肠杆菌GroEL联合折叠蛋白的能力。这是使用适合WeberF.和Hayer-HartlM.K.(ChaperoninProtocols，EdSchneiderC.，HumanaPressInc.，2000，p117-126)的一种方法、通过测定硫氰酸酶体外重折叠来确定的。

将天然的牛硫氰酸酶(30μM，SIGMA)在一个20mMMOPS-KOH(pH7.5)、100mMKCl以及20mMMgCl₂(缓冲液A)(包含5M盐酸胍以及8mMDTT)中变性，然后随后从变性剂稀释(75倍)到缓冲液A(包含GroEL(400nM))中，从而使得硫氰酸酶的最终浓度是400nM。GroEL快速并稳定地结合到变性的硫氰酸酶(D-Rho)上，然而单独在缓冲液中，D-Rho错折叠并且聚集(即无效的自发折叠)。加入Cpn10以及ATP(20.1mM)预先形成GroEL结合硫氰酸酶的稳定复合物允许进行有效折叠。在缺少Cpn10的情况下，加入ATP引起了D-Rho以一种不能折叠的方式循环上下GroEL，最终导致错折叠并且聚集(此反应用作一个适合的分析空白试验)。每个折叠反应具有的总体积为290μL，在特定的时间点(即0、15、30、45、60、75、90分钟)，取出30μL等分部分并且与70μL的硫氰酸酶活性测定混合物(57.1mMKH₂PO₄(pH7.5)、71.4mMEDTA、71.4mM硫代硫酸钠以及71.4mMKCN)合并6分钟。在用ATP引发折叠反应之前，在折叠时间点T＝0分钟，取出30μL等分部分。硫氰酸酶活性测定混合物之内的EDTA螯合了Mg²⁺离子，这阻止了GroEL结合ATP，结果是该折叠反应的立即终止。随后，在加入50μL的15％(体积/体积)甲醛(终浓度5％体积/体积)6分钟后硫氰酸酶活性终止。

硫氰酸酶催化了从硫代硫酸盐与氰化物形成硫氰化物(‘硫氰酸盐’)。通过在硝酸铁的存在下形成它的红色铁络合物，硫氰化物是容易用色度法检测到的(吸光度450nm)。通过加入150μL的硝酸铁试剂(164.5mM硝酸铁以及9.2％v/v硝酸)开发了硫氰酸酶活性测定(150μL)。硫氰酸酶活性测定是在96孔板上在A450nm处读取的。

随着时间进行，一个典型的硫氰酸酶折叠反应在硫氰酸酶活性(即折叠的硫氰酸酶)方面沿指数倾斜达到折叠的硫氰酸酶的最大产量。在恒量的GroEL(400nM)以及硫氰酸酶(400nM)情况下，随着Cpn10的量的增加(直到Cpn10(7链节)与GroEL(14链节)达到相同的摩尔浓度(即400nM)，观察到一个线性关系(在硫氰酸酶活性与时间之间)。在Cpn10的浓度高于400nM的情况下，硫氰酸酶活性的增加快速达到一个最大值。该测定由五个标准样品(一式两份)以及多个测试样品(一式两份)组构成。Cpn10标准样品的浓度是0nM、140nM、250nM、280nM以及350nM。将从30、45、60、75以及90分钟时间点测量的硫氰酸酶活性(即Cpn10活性)进行平均。0nMCpn10标准样品用作测定的背景活性的适合的测量；因此将0nMCpn10标准样品的吸光度值从所有其他计算的吸光度值(或活性值)中减去。在背景修正后，将280nMCpn10标准样品的吸光度值指定为100％活性并且将所有其他的吸光度值转换成基于100％标准样品的一个相对％活性。通过比较重复测量结果，将偏离的数据点去除，重复样品之间＞30％偏差则被认定为不能接受的。使用可接受的数据，用五个标准浓度0nMCpn10(0％活性)、140nMCpn10(50％活性)、250nMCpn10(89.3％活性)、280nMCpn10(100％活性)以及350nMCpn10(125％活性)生成了一个线性的校准曲线。将硫氰酸酶活性(即Ala-Cpn10活性)对Ala-Cpn10浓度绘图。为了修正测定偏差，将来自测试样品的百分比活性值使用从线性校准曲线生成的方程式进行重新计算。

使用这些蛋白的寡聚分子量(MW)计算伴侣蛋白(GroEL以及Cpn10)的浓度，而使用单体MW计算硫氰酸酶；例如大肠杆菌GroEL14链节(SwissProtP0A6F5)＝800,766.4g/mol，人Ala-Cpn107链节(SwissProtP61604)＝76,100.5g/mol，人X-Cpn10-Y75K7链节＝75,358.5g/mol，人Ala-Cpn10-Y75K7链节＝75,855.5g/mol以及牛硫氰酸酶1链节(SwisProtP00586)＝33,164.6g/mol。

如以下表1中所示，从一个Ala-Cpn10标准曲线线性方程式测定多种Cpn10蛋白的活性。所有的反应都是一式两份地完成的。

表1：伴侣蛋白10活性

实施例3：Cpn10突变体结合到聚(I:C)、CpG-ODN以及RNA

TLR是细胞外地以及细胞内地表达的，细胞表面上的那些(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10以及TLR11)通常识别疏水的配体，而在细胞内区室中的那些(TLR3、TLR7、TLR8以及TLR9)通常识别基于带负电荷核酸的配体(Akraetal.2006，124：783-801)。

如在此所述，诸位发明人已经指出，Ala-Cpn10结合基于带负电荷的核酸的TLR配体，这些包括：如图4中所示的聚(I:C)(TLR3激动剂)、如图5以及图7中所示的若干类别的未甲基化的单链的CpG-寡核苷酸(ODN)(人ODN-2216类别A、人ODN-2006类别B、人ODN-M362类别C；都是TLR9的激动剂)以及如图6中所示的大肠杆菌K12ssRNA(TLR7/8配体)。

如以下所述，诸位发明人已经另外指出，多种突变体比Ala-Cpn10更牢固地结合到聚(I:C)(图4)、CpG-ODN(图5)以及ssRNA(图6)上。

联系图4，突变体如Ala-Cpn10-E18A、Ala-Cpn10-E34Q、Ala-Cpn10-D68N、Ala-Cpn10-D83N、Ala-Cpn10-D94N、Ala-Cpn10-Y75R、Ala-Cpn10-E18K，D101K、Ala-Cpn10-E34Q，Y75K、Ala-Cpn10-Q42，D101K、Ala-Cpn10-T44K，D101K、Ala-Cpn10-S50K，D101K、Ala-Cpn10-E74K，Y75E、Ala-Cpn10-Y75G，G76K、Ala-Cpn10-Y75GK、Ala-Cpn10-Y75K，D94K、Ala-Cpn10-Q3K、Ala-Cpn10-S50K、Ala-Cpn10-D68K、Ala-Cpn10-D94K、Ala-Cpn10-D101K、共价的-Cpn10、MR-Cpn10以及MKKK-Cpn10比Ala-Cpn10更牢固地结合到聚I:C上。此外，几种突变体如X-Cpn10-Y75K以及Ala-Cpn10-Y75K如此紧密地结合到TLR3激动剂聚(I:C)上以致它不能用500mMNaCl完全释放，不像Ala-Cpn10在150mMNaCl(Fig.4)下即可分离。有趣的是，在低的NaCl浓度下，多种Cpn10突变体以将它们从溴化乙锭插层(图4)隔离的方式结合聚(I:C)的长的聚合物上，可能指示出若干Cpn10七聚物结合一个单一的聚(I:C)链。包括Ala-Cpn10-Y75K、Ala-Cpn10-KK21、Ala-Cpn10-D94N以及Ala-Cpn10-Y75K，D94K的若干突变体也在低盐浓度下从溴化乙锭插层隔离结合的聚(I:C)，但是在≥150mM下，结合位点充分打开用于溴化乙锭插入，而没有使结合的聚(I:C)逃逸。

类似于与聚(I:C)的相互作用，在生理盐浓度下(大约150mM)观察到X-Cpn10以及Ala-Cpn10与TLR9激动剂CpG-类别A的一种不稳定的复合物(图5)。相比之下，诸位发明人观察到，类似于与聚(I:C)的相互作用，在若干Cpn10变异体与CpG-类别A之间形成了一个显著更强的缔合作用(图4和5)。事实上，与CpG-类别A的复合物在500mMNaCl下大部分是抗解离(图5)。关于TLR7以及TLR8激动剂大肠杆菌K12ssRNA，实验还显示出，与多种Cpn10变异体如Ala-Cpn10-Y75K、Ala-Cpn10-KK21、Ala-Cpn10-D94N和Ala-Cpn10-Y75K，D94K形成了比Ala-Cpn10更强的缔合作用(图6)。在150mMNaCl下，Ala-Cpn10以及X-Cpn10与ssRNA完全解离的。然而，在500mMNaCl的存在下，若干突变体仍然稳固地结合。

实施例4：Cpn10结合到CpG寡核苷酸(ODN)的定量分析

为了测定Cpn10突变体结合到ODN上的量，以10μg/μl在PBSpH7.2(Invitrogen)下配制突变体，并且在4℃下将50μg吸附到96孔板的三重孔上持续16小时。在倾析未结合的蛋白之后，用1％BSA以及5％蔗糖的PBSpH7.2在23℃下封闭该板2小时。将在PBSpH7.2中配制为0.01μg/μl的50μl的3’-生物素标记的人ODN-2216类别-A、人ODN-2006类别-B、或人ODN-M362类别-C(TLR9激动剂)(Proligo/Sigma)加入各孔中并且在23℃下孵育2小时。用五次PBS(pH7.2)+0.05％吐温20冲洗去除未结合的配体。用一个Streptavidin-HRP以及TMB检测系统在A450nm下分析结合的CpG-ODN。

在图7中，在生理盐浓度(大约150mM)下的一个定量分析突出显示了与Ala-Cpn10相比CpG-类别A、B以及C与多种突变体的显著更强的相互作用。

制作了包含正电荷取代(Q3K、E18K、Q42K、T44K、S50K、D86K和D101K)的Cpn10突变体，并且测试与Ala-Cpn10相比具有对CpG-ODN类别-A\B\C的显著提高的亲和性。

所研究的所有的负电荷变为中性的取代(E18Q、E18A、E18S、E18M、D68N、D83N以及D101N)与Ala-Cpn10相比具有对CpG-ODN类别-A\B\C的显著提高的亲和性。

关于多重正电荷取代的Cpn10突变体，结合到CpG-ODN类别-A\B\C的定量分析证实，与Ala-Cpn10相比，所有都具有显著提高的亲和性，如Ala-Cpn10-Y75K，D94K以及Ala-Cpn10-E34Q，Y75K(图7)。

所研究的所有的正插入(延长)的Cpn10突变体(例如MK-Cpn10以及Ala-Cpn10-K85)与Ala-Cpn10相比具有对\CpG-ODN类别-A/B/C的显著提高的亲和性。

实施例5：Cpn10调节CpG-B0DN-诱导的NFκB活性。

为了确定是否PRR配体的高亲和性结合可能与增加的免疫调节活性相关，开发了若干种基于细胞的测定法以评估不同Cpn10突变体隔离促炎症反应核酸并且从而降低PRR信号水平的能力。首先，使用相对于Ala-Cpn10以及X-Cpn10(其中与CpG-ODN类别B以及未结合的PRR配体孵育)的高亲和性粘合剂从而刺激小鼠巨噬细胞中的NFκB(RAW264细胞)。

用一个NFκB-荧光素酶报告基因质粒(pNIFty2-LUC；Invivogen)稳定地转染RAW264.7(小鼠巨噬细胞)细胞。将RAW264-pNIFty2-LUC细胞从板中挑出并且留下使之附着过夜。将100μg的一种Cpn10构建体或配制品缓冲液对照物与4μg的CpG-BODN-1826(Invivogen)混合并且流过一个离心过滤装置YM10(Amicon)。将整个流过体积加入到RAW264-pNIFty2-LUC细胞并且在37℃下孵育5小时。洗涤细胞并且随后用每孔100μl的CCLR1X溶液(Promega荧光素酶裂解缓冲液)裂解，与荧光素酶底物混合(遵循产品说明书)并且测定荧光素酶计数。TLR9对于Ala-Cpn10的活化水平的指定为值100％。

图8显示了与Ala-Cpn10相比，高亲和性粘合剂与降低的NFκB水平之间的紧密相关性。从图8可以看出，包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或加入(如Ala-Cpn10-Y75K、Ala-Cpn10-E18A、Ala-Cpn10-Y75K，D94K、Ala-Cpn10-E34Q、Y75K、Ala-Cpn10-Q3K、Ala-Cpn10-E18K、D101K以及MKK-Cpn10)的分离的Cpn10多肽导致了与Ala-Cpn10相比TLR9的更低水平的活化。

实施例6：在HEK293细胞中通过TLR-3Cpn10突变体抑制聚(I:C)-诱导的NFκB产生

用TLR3以及pNIFTY-NFκB荧光素酶报告基因瞬时转染HEK293细胞。转染后24小时将细胞挑出以1x10⁵放到24孔板中并且留下使之附着过夜。然后用0.1ug聚(I:C)在存在或不存在100ug这些Cpn10突变体以及10ul的SUPERaseRNA酶抑制剂(Ambion)(作为一种竞争性测定)下刺激细胞18小时(图9)。在加入到细胞之前，将聚(I:C)与Cpn10在所需浓度下混合到一起持续30分钟。每个条件重复3次进行测试。将刺激18小时后将细胞裂解并且测定荧光素酶计数。

将荧光素酶计数对仅有聚(I:C)进行归一化，给定其值为100％。当用聚(I:C)刺激这些细胞时，Ala-Cpn10能够将荧光素酶(即NFκB)的水平降低22％。若干突变体(Ala-Cpn10-Y75K、X-Cpn10-Y75K、Ala-Cpn10-D94K、Ala-Cpn10-Y75GK、Ala-Cpn10-E18K，D101K以及Ala-Cpn10-E34Q，Y75K)显示出显著聚(I:C)诱导TLR3的调节，例如Ala-Cpn10-Y75K减低信号53％，X-Cpn10-Y75K降低信号71％，并且Ala-Cpn10-D94K降低信号82％(图9)。这表明了，大多数Cpn10突变体具有调节免疫系统的能力(具体地，当涉及TLR3信号时)。

实施例7：突变体列表

在应用以上方法以及测试中，诸位发明人制备了具有不同突变的多种Cpn10多肽用于评定与这样的Cpn10分子如X-Cpn10和Ala-Cpn10相比不同氨基酸残基(例如在Cpn10分子中的电荷以及位置)的重要性，与一个PRR配体(如聚(I:C)以及若干类别的ODN)它们具有增加的结合到一个PRR配体(如聚(I:C)和若干类别的ODN)上的能力。

诸位发明人已经在Cpn10分子的每个N端、β-桶、移动环、顶环、C端和连接环中取代了至少一个氨基酸残基，如表1中所示。诸位发明人已经用一个带正电荷的残基代替了一个中性氨基酸残基，用一个中性的或带正电荷的残基代替了一个带负电荷的氨基酸残基，用另一个带正电荷的残基代替了带正电荷的残基，插入带正电荷的残基，或缺失带负电荷的残基。

表2：Cpn10突变体列表

除了单一取代的突变外，诸位发明人还制备了具有以上突变的两个或多个的任意组合的Cpn10多肽，如双重突变型(例如Ala-Cpn10-F12K，D92K、Ala-Cpn10-E18K，D101K、Ala-Cpn10-E34Q，Y75K、Ala-Cpn10-Q42K，D101K、Ala-Cpn10-T44K，D101K、Ala-Cpn10-S50K，D101K、Ala-Cpn10-Q60K，T78K、Ala-Cpn10-E74K，Y75E、Ala-Cpn10-Y75GK、Ala-Cpn10-Y75G，G76K、Ala-Cpn10-Y75K，D94K以及Ala-Cpn10-Y75K，D94N)。此外，诸位发明人已经制备了正插入(延长)以及负缺失(去除)的Cpn10变异体(例如MH-Cpn10、MR-Cpn10、MK-Cpn10、MKK-Cpn10、MKKK-Cpn10、Ala-Cpn10-K21、Ala-Cpn10-KK21、Ala-Cpn10-K39、Ala-Cpn10-KK39、Ala-Cpn10-K57、Ala-Cpn10-KK57、Ala-Cpn10-K76、Ala-Cpn10-KK76、Ala-Cpn10-K85、Ala-Cpn10-KK85、Ala-Cpn10-K102、Ala-Cpn10-KK102、ΔD13、ΔE18、ΔE23、ΔE34、ΔE58、ΔE68、ΔE74、ΔD83、ΔD84、ΔD86、ΔD92、ΔD94以及ΔD101)。

在此考虑了，导致生成另外的双重突变型、三重突变型等等的以上突变的任意组合是在本发明的范围内。

实施例8：Cpn10多肽的净电荷的计算

计算蛋白净电荷

如以上所述，一个多肽在一个给定pH下的净电荷是基于Henderson-Hasselbalch方程(Hasselbalch，K.A.，1917BiochemischeZeitschrift78：112-144)以及可电离的氨基酸侧链以及多肽的N端和C端的已知pKa值来计算的。表3中使用的pKa值是N端8.0、C端3.1、Lys10.0、Arg12.0、His6.5、Glu4.4、Asp4.4、Tyr10.0以及Cys8.5(Stryer，L.，1988“Biochemistry”textbook3rdEdition，NewYork，W.H.Freeman，ISBN0716719207)。使用上述方法，在pH7.3以及pH7.4(取作生理pH)下计算Cpn10变异体的净电荷，如表3中所示。

表3：计算的Cpn10变异体的净电荷值

净电荷值是在生理pH(pH7.3至7.4)下使用ProteinCalculatorV3.3工具(http://www.scripps.edu/～cdputnam/protcalc.html)来计算的。

实施例9：总结

诸位发明人先前已经发现了Cpn10调节若干病原体识别受体(PRR)并且最近已经展示出它在治疗患有类风湿性关节炎(Vanagsetal.Lancet2006；368：855-863)和牛皮癣(Williamsetal.Arch.Dermatol.2008；144：683-685)的人类患者中的疗效和安全性。诸位发明人现在展示出，Cpn10的变异体特异地结合到若干基于核酸的PRR配体上。

加入额外的正电荷(通过加入正电荷或去除负电荷残基)生成了一种Cpn10分子，该Cpn10分子显著更强地(与Ala-Cpn10以及X-Cpn10相比)结合到基于核酸的PRR配体上。额外的正电荷可以通过以下来加入：(1)用一个正电荷残基取代一个现有的表面/溶液暴露的中性的或负电荷的残基，(2)用一个中性残基取代一个现有的表面/溶液暴露的负电荷残基，(3)引入一个额外的表面/溶液暴露的正电荷残基(如延长一个环结构或N端以及C端)或(4)缺失一个现有的表面/溶液暴露的负电荷残基(例如缩短一个环结构或N端以及C端)。我们的结果还显示，引入多个正电荷(例如Ala-Cpn10-F12K，D92N；E18K，D101K；E34Q，Y75K；Q42K，D101K；T44K，D101K；S50K，D101K；Q60K，T78K；E74K，Y75E；Y75GK；Y75G，G76K；Y75K，D94K；Y75K，D94N)可以比单一突变显著地更大地增加结合潜力。

检测了用或者赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基取代事先存在的中性的以及负电荷的残基的效果。所研究的所有正电荷取代(A1K、Q3K、Q3R、F5K、D13K、E18K、E18R、S20K、A22K、T24K、G29K、M31K、E34K、Q37K、V40K、L41K、Q42K、T44K、S50K、S50R、S52K、G54K、G56K、E58K、Q60K、P61K、V66K、D68K、P73K、E74K、Y75K、Y75H、Y75R、G76K、G77K、T78K、V81K、D83K、D84L、D86K、D86R、Y87K、F88K、L89K、D92K、G93K、D94K、D94R、L96K、V100K、D101K以及D101R；SEQIDNos：34-45以及52-198)与Ala-Cpn10相比具有对聚(I:C)、大肠杆菌K12ssRNA以及若干CpG-ODN类别-A\B\C的显著提高的亲和性(图4至9)。

还检测了用中性残基(即N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S、T、H)取代事先存在的负电荷的残基(即E和D)的效果。此外，所研究的所有负电荷到中性的取代(D13N，E18A，E18M，E18Q，E18S，E23Q，E34Q，E58Q，D68N，E74Q，D83N，D84N，D86N，D92N，D94A，D94M，D94N，D94S以及D101N；SEQIDNos：250-306)与Ala-Cpn10相比具有对聚(I:C)、大肠杆菌K12ssRNA以及若干CpG-ODN类别-A\B\C的显著提高的亲和性(图4至9)。

为了检测是否加入多个正电荷可以提供更牢固的结合，制备了若干变异体(例如E18K/D101K、Q42K/D101K、T44K/D101K以及S50K/D101K；SEQIDNos：217-231)。如所预期的，对所有基于核酸的PRR配体观察到高亲和性结合(图4至9)。如以上所概述的，通过用正电荷的残基(K、R、H)代替现有的中性的或负电荷的残基、以及用中性残基代替负电荷的残基，可以将正电荷加入到Cpn10。加入正电荷的另一种方法是在可以忍受此类结构变化的Cpn10中的位置处插入正电荷的残基(K、R、H)。每个Cpn10亚基是从101氨基酸形成的，该氨基酸折叠成一个不连续的β-桶状结构，该结构由3个小环和2个更大的β-发卡转弯环(β-hairpinturnloop)来连接(图1)。该β-桶状结构提供了所有的亚基-亚基相互作用以及Cpn10七聚物的稳定性。延长β-桶的区段将可能导致结构的不稳定性。相比较而言，延长N端、C端或若干连接环将可能更好地忍受此类结构变化。与此预测一致，若干Cpn10同系物具有自然地延长的片段(图2)。例如，噬菌体T4Cpn10(Gp31)具有一个显著延长的移动环以及L-3环。蚊、蝇和分支杆菌的Cpn10具有延长的顶环，而众多Cpn10包含更长的N端和C端。将正电荷的残基成功地插入到5个连接环(即L-1、L-2、L-3、移动环和顶环)的每个、N端以及C端中，如表4中所示。

表4.正插入(延长)Cpn10变异体

SEQ ID#	突变体	延长的位点
			307	MH-Cpn10	N端
310	MR-Cpn10	N端
			313	MK-Cpn10	N端
316	MKK-Cpn10	N端
			319	MKKK-Cpn10	N端
322	Ala-Cpn10-K21	移动环
			325	Ala-Cpn10-KK21	移动环

328	Ala-Cpn10-K39	L1连接环
			331	Ala-Cpn10-KK39	L1连接环
334	Ala-Cpn10-K57	顶环
			337	Ala-Cpn10-KK57	顶环
340	Ala-Cpn10-K76	L2连接环
			343	Ala-Cpn10-K85	L3连接环
346	Ala-Cpn10-KK85	L3连接环
			349	Ala-Cpn10-K102	C端
352	Ala-Cpn10-KK102	C端

所研究的所有的正插入(延长)Cpn10变异体与Ala-Cpn10相比具有对聚(I:C)以及若干CpG-ODN类别-A\B\C的显著提高的亲和性(图4至9；SEQIDNos：307-354)。

具有一个单独的正电荷加入的所有Cpn10变异体与大肠杆菌K12ssRNA相互作用，并且与Ala-Cpn10相比显示出更高的亲和性。类似地，具有多重正电荷加入(即E18K/D101K、Q42K/D101K、T44K/D101K、S50K/D101K、MKK-Cpn10、MKKK-Cpn10、Ala-Cpn10-KK39、Ala-Cpn10-KK85以及Ala-Cpn10-KK102)的Cpn10变异体与Ala-Cpn10相比具有对大肠杆菌K12ssRNA的一个提高的亲和性(图6)。通过用中性的或正电荷的残基取代负电荷的残基，可以增加净正电荷。另一个可能性是完全去除负电荷的残基。如以上所讨论的，众多的Cpn10同系物具有自然地延长的并且也具有缩短的连接环(即L-1、L-2、L-3、移动环以及顶环)。在位置23、34、58、74以及84(SEQIDNos：199-213)处的负电荷的残基的去除证明了这些Cpn10变异体具有对基于核酸的PRR配体的增加的亲和性。还可以在不破坏Cpn10的结构完整性下缺失负电荷的残基D68、D84和D101，并且这些变异体被设想为也是高亲和性粘合剂。

为了证实是否PRR配体的高亲和性结合可能与增加的免疫调节活性相关，开发了若干种基于细胞的测定法用于评估不同Cpn10突变体隔离促炎症反应核酸并且从而降低PRR信号水平的能力。首先，将相对于Ala-Cpn10的高亲和性粘合剂与CpG-ODN类别B进行孵育，并且用未结合的PRR配体刺激小鼠巨噬细胞中的NFκB(RAW264细胞)。图8显示了与Ala-Cpn10相比，高亲和性粘合剂与降低的NFκB水平之间的紧密相关性。同样地，具有对PRR配体的折中的亲和性的突变体(如X-Cpn10-K53E以及Ala-Cpn10-K53M，K55M)与Ala-Cpn10相比具有一个增加的水平的NFκB活化。为了测试高亲和性粘合剂在细胞上的生物学活性，随后评估当用聚(I:C)刺激时Cpn10变异体的降低促炎症反应NFκB活化(从表达TLR3的HEK细胞)的能力。在此体系中，与Ala-Cpn10相比高亲和性粘合剂(例如Ala-Cpn10-D101K)通常显示出显著提高的抑制NFκB活化的能力(图7+9)。用另一个带正电的残基代替一个带正电的残基(例如K7R、R19K、K27R、K39R、K55R、K69R、K85R以及K98R；SEQIDNos：10-33)，与Ala-Cpn10相比，对此类Cpn10变异体结合促炎症反应核酸的能力没有显著影响(图8)。

在此证明了，具有以上所述并且贯穿本说明的突变的分离的Cpn10多肽具有对基于核酸的PRR配体(特别是TLR-3激动剂聚(I:C)、TLR7以及TLR8激动剂大肠杆菌ssRNA以及TLR9激动剂未甲基化的CpG-寡核苷酸(ODN)(ODN-2216类别A、ODN-2006类别B以及ODN-M362类别C)的增加的亲和性。在此还证明了，这些Cpn10多肽抑制了聚(I:C)以及CpG诱导的NFkB活化。

结论

在此所包含的数据显示，在实施例8下列出的具有对基于核酸的PRR配体的增加的亲和性的Cpn10突变体可以通过在Cpn10分子之内加入带正电荷的残基或缺失带负电荷的残基、通过用中性的或带正电荷的残基取代带负荷电的残基、或通过用带正电荷的残基取代中性残基来生成。例如，诸位发明人已经鉴定出，Ala-Cpn10-Y75K连同多种其他Cpn10突变体与Ala-Cpn10相比具有对聚(I:C)、CpG-ODN类别-A\B\C以及大肠杆菌K12ssRNA的显著提高的亲和性(图4至7)，这可以归于通过氨基酸取代、缺失、和/或插入来增加Cpn10分子的净正电荷。

此外，诸位发明人已经发现，高亲和性结合到基于核酸的PRR配体可以通过在Cpn10分子中的若干位置引入正电荷来实现。本发明的多肽对一个基于核酸的PRR配体的增加的亲和性表明增加了免疫调节活性。

Claims (10)

1.一种分离的Cpn10多肽，其来自人伴侣蛋白10并且与Ala-Cpn10多肽相比具有对PRR配体的增加的亲和性，其中所述多肽与Ala-Cpn10多肽相比具有更多的净正电荷，以及其中所述多肽具有Ala-Cpn10分子的至少一个突变，其中所述多肽选自：

(a)与Ala-Cpn10相比显示出增加的对TLR3激动剂聚(I：C)的结合亲和性的多肽，选自：Ala-Cpn10-E18A、Ala-Cpn10-E34Q、Ala-Cpn10-D68N、Ala-Cpn10-D83N、Ala-Cpn10-D94N、Ala-Cpn10-Y75R、Ala-Cpn10-E18K，D101K、Ala-Cpn10-E34Q，Y75K、Ala-Cpn10-Q42K，D101K、Ala-Cpn10-T44K，D101K、Ala-Cpn10-S50K，D101K、Ala-Cpn10-E74K，Y75E、Ala-Cpn10-Y75G，G76K、Ala-Cpn10-Y75GK、Ala-Cpn10-Y75K，D94K、Ala-Cpn10-Q3K、Ala-Cpn10-S50K、Ala-Cpn10-D68K、Ala-Cpn10-D94K、Ala-Cpn10-D101K、共价-Cpn10、MR-Cpn10和MKKK-Cpn10；

(b)与Ala-Cpn10相比显示出增加的对TLR7和TLR8激动剂大肠杆菌K12ssRNA的结合亲和性的多肽，选自：Ala-Cpn10-Y75K、Ala-Cpn10-KK21、Ala-Cpn10-D94N和Ala-Cpn10-Y75K，D94K；和

(c)与Ala-Cpn10相比显示出增加的对CpG-ODN类别-A\B\C的结合亲和性的多肽，选自：Ala-Cpn10-Q3K、Ala-Cpn10-E18K、Ala-Cpn10-Q42K、Ala-Cpn10-T44K、Ala-Cpn10-S50K、Ala-Cpn10-D86K、Ala-Cpn10-D101K、Ala-Cpn10-E18Q、Ala-Cpn10-E18A、Ala-Cpn10-E18S、Ala-Cpn10-E18M、Ala-Cpn10-D68N、Ala-Cpn10-D83N、Ala-Cpn10-D101N、Ala-Cpn10-Y75K，D94K、Ala-Cpn10-E34Q，Y75K、MK-Cpn10和Ala-Cpn10-K85。

2.一种分离的核酸，该核酸编码权利要求1所述的多肽。

3.一种表达构建体，包含权利要求2所述的核酸，其中所述构建体可操作地连接到一个或多个调节序列上。

4.一种宿主细胞，该宿主细胞表达了权利要求1所述的多肽、或包含权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的表达构建体。

5.一种抗体，该抗体选择性地结合到权利要求1所述的多肽上。

6.一种药物组合物，包含单独的权利要求1所述的多肽或该多肽与至少一种基于核酸的PRR配体的组合，权利要求2所述的核酸，权利要求3所述的表达构建体，或权利要求5所述的抗体或它们的任意组合。

7.鉴定一种化合物的方法，该化合物结合到权利要求1所述的多肽上，该方法包括以下步骤：

(a)将一种候选化合物与所述多肽进行接触；并且

(b)检测该候选化合物与所述多肽之间的一种复合物的形成。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述检测选自：竞争性结合测定、凝胶过滤色谱法、高通量筛选、双杂交测定、电泳迁移率检测、以及孔板捕获检测。

9.筛选一种化合物的方法，该化合物调节权利要求1所述的多肽的活性，其中所述化合物选自促炎性的核酸、免疫抑制的核酸和蛋白，该方法包括以下步骤：

(a)将所述多肽与一种候选化合物在适于能够使所述候选化合物与所述多肽相互作用的条件下进行接触；并且

(b)检测所述多肽的活性。

10.筛选一种PRR配体的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将权利要求1所述的多肽与一种候选PRR配体化合物在适于能够使所述候选化合物与所述多肽相互作用的条件下进行接触；并且

(b)检测与野生型Cpn10相比所述化合物与所述多肽的增加的亲和性；和/或

(c)在候选PRR配体化合物以及所述多肽的存在下检测减小的或增加的PRR活化作用。