MX2008000596A

MX2008000596A - Inmunomodulacion inducida por la chaperonina 10.

Info

Publication number: MX2008000596A
Application number: MX2008000596A
Authority: MX
Inventors: Barbara Jane Johnson; Dean Jason Naylor; Caroline Amanda Dobbin; Christopher Bruce Howard; Linda Allison Ward; Inge E A Flesh
Original assignee: Cbio Ltd
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2006-07-11
Publication date: 2008-03-19
Also published as: EP1906989A4; CA2614480A1; WO2007006095A2; WO2007006095A3; US20090047240A1; JP2009500430A; NZ565731A; US9457062B2; BRPI0613515A2; EP1906989A2; KR20080080079A

Abstract

La presente invencion concierne a metodos para modular senales del receptor similar al de Toll en un sujeto, o al menos una celula, tejido u organo de este, a metodos para tratar o prevenir una enfermedad o condicion en un sujeto, a metodos para modular la produccion y/o la secrecion de uno o mas inmunomoduladores en un sujeto, o al menos una celula, tejido u organo del mismo, en donde dichos metodos involucran la administracion de chaperonina 10, y en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activacion. Tambien se contemplan composiciones asociadas y usos de las mismas.

Description

INMUNOMODULACION INDUCIDA POR LA CHAPERONINA 10 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne generalmente al uso de chaperonina 10 en la modulación de la señalización del receptor similar al de Toll, en particular de la señalización de TLR2, TLR3, TLR , TLR7 y TLR9 (TLR, del inglés Toll-Li e Receptor, Receptor similar al de Toll) , y a métodos y a composiciones para el tratamiento de enfermedades, que incluyen pero no se limitan a infecciones virales y bacterianas, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, vía la modulación inducida por chaperonina 10 de dicha señalización.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un sistema central del sistema de defensa del huésped contra bacterias, hongos, levaduras y patógenos virales invasores involucra el reconocimiento exitoso del patógeno, o de componentes del mismo, por medio de receptores celulares que inducen una cascada de señalización que da como resultado la estimulación del sistema inmune y la producción de varias citoquinas. Una familia de receptores que desempeñan un papel clave en esta línea de defensa es la familia de receptores similar al de Toll (TLR) . Los TLRs son expresados en células inmunes que incluyen monolitos, macrófagos, células dendríticas, células B y granulocitos, y una variedad de otros tipos celulares que incluyen el endotelio y el epitelio. La activación del TLR por patógenos, o por moléculas derivadas de éstos, induce la señalización intracelular que primeramente da como resultado la activación del factor de transcripción NF-?B (Beg, 2002, Trenes Immunol 23: 509-12) y la modulación de la producción de citoquina. Sin embargo, una serie de otras trayectorias pueden también ser activadas, incluyendo las trayectorias de la quinasa activada por el mitógeno p38, de la quinasa c-Jun-N-terminal y de la quinasa relacionada con la señal extracelular (Flohe y colaboradores, 2003, J. Immunol. 170:2340-2348; Triantafilou & Triantafilou, 2002, Trends Immunol 23: 301-304) . Los interferones de tipo I, principalmente IFNa e IFNß, son contribuyentes importantes en la respuesta inmune a infecciones virales y bacterianas. La fuente primaria de interferones de tipo I después de dichas infecciones son las células dendríticas plasmacitoides, (PDC, del inglés Plasmocytoid Dentritic Cells, células dendríticas plasmocitoides) , una subpoblación especializada de células mononucleares de sangre periférica. Las PDCs expresan a los receptores similares al de Toll TLR7 y TLR9 y es la estimulación de TLR7/TLR9 que es responsable de la activación de PDC y de la producción de grandes cantidades de interferones de tipo I. Un intervalo de factores derivados de patógenos es capaz de estimular selectivamente a diferentes TLRs. Uno de los mejor caracterizados de éstos es el lipopolisacárido (LPS) , un glicolípido derivado de la membrana externa de bacterias Gram-negativas, las cuales son agonistas de TLR4. TLR2 reconoce al ácido lipoteicoico (LTA, petidoglicano (PGN) y lipopéptido, TLR3 reconoce a ARN de doble hebra, típicamente de origen viral; TLR7 reconoce a ARN de una sola hebra viral y TLR9 reconoce a dinucleótidos de CpG no metilados, típicamente en ADN viral y bacteriano. Las TLRs pueden también ser estimulados por una variedad de agonistas sintéticos, por ejemplo poliI:C (ácido polisitidílico-poliinosínico) en el caso de TLR3, imidazoquinolinas tales como resiquimod (R848) e imiquimod en el caso de TLR7 y oligonucleótidos ricos en CpG en el caso de TLR9. La elucidación de mecanismos para la modulación de la señalización de TLR y de la modulación de citoquinas estimuladas por TLR t la producción de quimioquina proporcionará avenidas para el desarrollo de procedimientos terapéuticos para el tratamiento de una variedad de enfermedades y condiciones, incluyendo enfermedades bacterianas y virales. La chaperonina 10 (Cpn 10) de mamíferos, también conocida como proteína de choque térmico 10 (HsplO) (Hsp del inglés Heat SOC Protein, proteína de choque térmico) , está típicamente caracterizada como una "chaperona molecular" mitocóndrica involucrada en la duplicación de proteínas junto con la chaperonina 60 (CpndO; Hsp60). Cpn 10 es un homólogo de la proteína bacteriana GroEL. GroEL y Cpn 10, oligomerizan en anillos de siete elementos que enlazan como un opérculo sobre una estructura de tipo barril que comprende catorce moléculas GroEL o siete Hsp 60, las cuales atan a las proteínas desnaturalizadas al complejo. Cpn 10 es también frecuentemente encontrada en la superficie celular (Belles y colaboradores, 1999, Infect. Immun. 67: 191-4200) y en el fluido extracelular (Shin y colaboradores, 2003, J. Biol. Chem. 278: 7607-7616) . No obstante, Cpn ha mostrado también poseer actividad inmunosupresora en encefalomielitis autoinmune experimental, hipersensibilidad del tipo retardada y modelos de rechazo de aloinjertos (Zhang y colaboradores, 2003, J. Neurol. Sci. 212:37-46; Morton y colaboradores, 2000, Immunol Cell Biol 78:603-607).

Previamente, los inventores de la presente han demostrado también que en la presencia de agonistas de TLT4 y TLR2 (LPS y PAM3CysSK4, respectivamente) , Cpn 10 reduce la avivación de TLR4 y de NF-?B estimulada por TLR2, reduce la secreción de TNF-a y RANTES, mientras que incrementan la secreción de IL-10 en una manera dependiente de la dosis (Jonson y colaboradores, 2005, J. Biol. Chem. 280:4037-4047; la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/AU2005/000041; WO2005/067959, cuyas descripciones se incorporan al presente como referencia) .

Los inventores han encontrado ahora, sorprendentemente, que Cpn 10 también modula la señalización por TLR3, TLR7 y TLR9. Se muestra en la presente que mejora la capacidad de respuesta a la dosis, la producción de IFNa e IFNß en la presencia de un ligando específico de TLR3, y de reducir la activación de NF-KB en la presencia de ligandos específicos de TLR7 y de TLR9. Además, los inventores mostraron sorprendentemente que Cpn 10, pero no Cpn 60 o GroES, se asocian con TLRs en la activación de aglomerados en la superficie celular, con dicha activación los aglomerados modulan la señalización de TLR.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modular la señalización del receptor similar al de Toll en un sujeto, o en al menos una célula, tejido u órgano de éste, en donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la señalización del receptor similar al de Toll involucra la asociación de la chaperonina 10 con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación. De conformidad con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modular la señalización del receptor similar al de Toll en un sujeto, o en al menos una célula, tejido u órgano de éste, en donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde la señalización del receptor similar al de Toll involucra la asociación de la chaperonina 10 con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, yen donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por medio del aglomerado de activación.

El aglomerado de activación puede localizarse sobre la superficie de una célula. El aglomerado de activación puede comprender chaperonina 10, un receptor similar al de Toll, y opcionalmente, al menos otra molécula. La al menos otra molécula puede comprender un agonista del receptor similar al de Toll. En una modalidad, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR2 y ácido lipoteicoico (LTA) . En una modalidad adicional, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR3 y ARN de doble hebra . En otra modalidad, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR4 y LPS. En una modalidad adicional, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR7 y ARN de una sola hebra. En aún una modalidad adicional, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR9 y ADN que comprende un motivo CpG. La chaperonina 10 puede ser una chaperonina 10 derivada de manera natural, producida recombinantemente o producida sintéticamente. La chaperonina 10 puede ser de origen eucariótico. La chaperonina 10 puede ser chaperonina 10 humana. La chaperonina 10 puede comprender la secuencia polipeptídica que se expone en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. La chaperonina 10 puede ser acetilada o no acetilada. La chaperonina 10 puede ser administrada en la forma de una chaperonina 10 que codifica a un polinucleótido.

La chaperonina 10 que codifica a un polinucleótido puede estar localizada en una construcción genética, operablemente ligada a un promotor. El polinucleótido puede comprender la secuencia como se expone en la SEC ID NO: 4. El método puede comprender la administración de al menos un agente adicional. El agente adicional puede ser un inmunomodulador. El inmunomodulador puede ser un interferón de tipo I Tal como IFNa o IFNß. De conformidad con un tercer aspecto de la presente invención se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un sujeto, en donde dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la iniciación, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición. De conformidad con un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona un método para el tratamiento o la prevención de un trastorno en el sujeto, en donde dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición. La enfermedad o condición puede ser seleccionada del grupo que consiste de infecciones virales fúngicas, por levaduras o bacterianas, enfermedades inflamatorias agudas o crónicas que incluyen choque séptico, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, psoriasis, enfermedad cardíaca, arterioesclerosis, enfermedad pulmonar crónica, caquexia, esclerosis múltiple, GVHD, y cáncer. En una modalidad, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR2 inducida por LTA. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción de inmunomoduladores inducida por TLR2.

En una modalidad adicional, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR3 inducida por ARN de doble hebra. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR3. En otra modalidad, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR4 inducida por LPS. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducidas por TLR4. En una modalidad adicional, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR7 inducida por ARN de una sola hebra viral. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR7. En aún una modalidad adicional, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR9 inducida por el motivo CpG. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción de inmunomodulador inducida por TLR9. La chaperonina 10 puede ser una chaperonina 10 producida sintéticamente o producida recombinantemente, derivada naturalmente. La chaperonina 10 puede ser de origen eucariótico. La chaperonina 10 puede ser chaperonina 10 humana. La chaperonina 10 puede comprender la secuencia polipeptídica como se expone en las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. La chaperonina 10 puede ser acetilada o no acetilada. La chaperonina 10 puede ser administrada en la forma de un polinucléotido que codifica a chaperonina 10. El polinucleótido que codifica a chaperonina 10 puede estar localizado en una construcción genética, ligada operablemente a un promotor. El polinucleótido puede comprender la secuencia como se expone en la SEC ID NO: 4. El método puede comprender adicionalmente la administración de al menos un agente adicional. El agente adicional puede ser un inmunomodulador. El inmunomodulador puede ser un interferón de tipo I tal como IFNa o IFNß. De conformidad con un quinto aspecto de la presente invención se proporciona una composición cuando se usa para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición, la composición que comprende chaperonina 10 junto con al menos un portador aceptable farmacéuticamente, diluyente o adyuvante, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociado con la iniciación, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune la enfermedad o condición.

La composición puede comprender adicionalmente al menos un agonista de un receptor similar al de Toll. La composición puede comprender adicionalmente al menos un inmunomodulador tal como un interferon de tipo I. De conformidad con un sexto aspecto de la presente invención se proporciona una composición cuando se usa para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición, la composición que comprende al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene a la chaperonina 10 asociarse con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por medio del aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición. De conformidad con un séptimo aspecto de la presente invención se proporciona el uso de chaperonina 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la iniciación, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición.

De conformidad con un octavo aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un antagonista de chaperonina 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición, en donde el antagonista previene que la chaperonina se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición. De conformidad con un noveno aspecto de la presente invención se proporciona un método para modular la producción y/o la secreción de uno o más inmunomoduladores en un sujeto, o al menos una célula, tejido u órgano del mismo, en donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la modulación de la producción y/O la secreción del uno o más inmunomoduladores. De conformidad con un décimo aspecto de la presente invención se proporciona un método para modular la producción y/o la secreción de uno o más inmunomoduladores en un sujeto, o al menos una célula, tejido u órgano del mismo, en donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la modulación de la producción y/o la secreción del uno o más inmunomoduladores. El inmunomodulador puede ser, por ejemplo, TNF-a, IL-lß, IL-6, IL-10, IL-12 o un interferón de tipo I. El interferón de tipo I puede ser IFNa o IFNß. Los aspectos y modalidades anteriores contemplan el uso de formas modificadas y de tipo salvaje de chaperonina 10, así como también polipéptidos de chaperonina 10 de extensión total y fragmentos y derivados de ésta reteniendo la actividad inmunomoduladora. Definiciones En el contexto de esta especificación, el término "que comprende" significa "que incluye principalmente pero no necesariamente solamente". Además, variaciones de la palabra "que comprende", tal como "comprendido" y comprende, tienen correspondientemente significados variados . Como se usa en la presente los términos "tratamiento", "tratar", y variaciones de éstos, se refieren a cualquiera y a todos los usos que remedian un estado o síntoma de enfermedad, previene el establecimiento de enfermedad, o de otra manera previene, obstaculiza, retarda, mejora o invierte el progreso de la enfermedad u otros síntomas indeseables en cualquier manera que fuere. Como se usa en la presente el término, "cantidad efectiva" incluye en su significado una cantidad suficiente pero no tóxica de un agente o compuesto para proporcionar el efecto profiláctico o terapéutico deseado. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto dependiendo de factores tales como las especies que son tratadas, la edad y condición general del sujeto, de la severidad de la condición que es tratada, el agente particular que es administrado y el modo de administración etc. Así, no es posible especificar una "cantidad exacta". No obstante, para un caso dado, una "cantidad efectiva" puede ser determinada por un experto en la materia usando solamente experimentación de rutina.

El término "polipéptido" significa un polímero elaborado de aminoácidos ligados juntos por enlaces peptídicos. Los términos "polipéptido" y "proteína" son usados indistintamente en la presente, aunque para los propósitos de la presente invención un "polipéptido" puede constituir una porción de una proteína de extensión total. Los polipéptidos pueden incluir también, pero no se limitan a, fragmentos, análogos, variantes y derivados de los mismos. Dichos fragmentos, análogos, variantes y derivados de los mismos pueden compartir una similaridad estructural y/o funcional con el polipéptido. El término "polinucleótido" como se usa en la presente se refiere un polímero de una sola o de doble hebra de bases desoxiribonucleicas, ribonucleicas o análogos conocidos o nucleótidos naturales, o mezclas de los mismos. En el alcance del término "polinucleótido" se incluye el complemento contrario del polinucleótido, y fragmentos, análogos, variantes y derivados del polinucleótido, así como también cualquier otro polinucleótido que hibridiza al polinucleótido bajo condiciones de alta severidad. Como se usa en la presente los términos "modular", "modula" y variaciones de los mismos, se refieren a incrementar o disminuir el nivel de actividad, producción, secreción o funcionamiento de una molécula en la presencia de una molécula o agente modulador particular de la invención en comparación al nivel de actividad, producción, secreción u otra función de éstos en la ausencia de la molécula o agente modulador. Estos términos no implican la cuantificación del incremento o decremento. La modulación puede ser de cualquier magnitud suficiente para producir el resultado deseado y puede ser directa o indirecta. El término "inmunomodulador" como se usa en la presente incluye, pero no se limita a, un mediador moleculares secretado por uno o más tipos celulares y que desempeña un papel en la iniciación, activación, mantenimiento, mejoramiento, maduración, inhibición, supresión o aumento de una respuesta inmune. El término "aglomerado de activación" como se usa en la presente se refiere a una asociación de moléculas que funcionan para producir una señal biológica. Típicamente, la señal biológica puede comprender la modulación de una respuesta inmune, y en particular puede involucrar la modulación de la señalización del receptor similar al de Toll como parte de este proceso de modulación. Un aglomerado de activación puede asociarse, por ejemplo, sobre la superficie de una célula o en endosomas, y puede comprender, por ejemplo, chaperonina 10 junto con un agonista de receptor similar al de Toll y un receptor similar al de Toll. O Pueden asociarse también otras moléculas como parte de un aglomerado de activación, incluyendo, pero no limitándose a, CD14.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se describirá ahora, a manera de ejemplo no limitante solamente, con referencia a las figuras que se anexan. Figura 1. Secreción de IFNß (pg/ml en sobrenadante de células RAW264.7 después de estimulación con 100 µg/ml de poliI:C por 23 horas y en la presencia de 10 -200 µg/ml de Cpn 10 humana recombinante, añadida 2 horas después de estimulación. Los resultados mostrados son de experimentos por duplicado. Figura 2. Secreción de tipo interferones I (Ul/ml) en sobrenadante de células RAW264.7, después de estimulación ya sea con 100 ng/ml de LPS re-purificado o 100 µg/ml de poli:C en la presencia de 10 - 100 µg/ml de Cpn 10 humano recombinante, añadido 2 horas pre-estimulación. Figura 3. Activación de NF-?B (x veces) en células HEK293 después de transfección con la construcción que expresa a TLR7/TLR4 y una construcción informadora de NF-KB-luciferasa, en la presencia (cuadrados abiertos) de 50 µg/ml de Cpn 10 humana recombinante (añadido simultáneamente con el agonista) . Las células fueron estimuladas ya sea con formol, 13-acetato, 12-miristato (PMA; activador de la proteína C quinasa), R848 (R848; agonista de TLR7), Oligonucleótido de CpG (CpG; agonista de TLR9) o lipopolisacárido re-purificado (LPS; agonista de TLR4) Figura 4A y 4B muestran la activación de NF-?B (x veces) en células HEK293 después de transfección con la construcción que expresa a TLR9 y una construcción informadora de NF-?B que expresa a NF-?B, en la presencia (cuadrados abiertos) de o en ausencia (cuadrados llenos) de 50 µg/ml de CpnlO humana recombinante de (añadida simultáneamente con el agonista) . Fueron estimuladas las células ya sea con formol 12-miristato 13 acetato (PMA; activador de la proteína quinasa C) , R848 (R848; agonista de TLR7), oligonucleótido CpG (CpG; agonista, TLR9) o lipopolisacárido re-purificado (LPS; agonista de TLR4 ) . Se presentan los resultados para dos clones independientes, Figura 4A para el clon 1 y Figura 4B para el clon 2. Figuras 5A y 5B muestran el efecto de la concentración de Cpn 10 humano recombinante (12.5 µg/ml, 258 g/ml, 50 µg/ml y 100 µg/ml sobre la activación de NF-?B, la Figura 5A, se refiere a unidades luciferasa y la Figura 5B, se refiere a, unidades de luciferasa relativa, en células HEK293 transfectadas con la construcción que expresa a TLR9 y una construcción informadora de NF-?B-luciferasa en la presencia de ADN de CpG (Cpn 10, añadida simultáneamente con el agonista) . Figura 6A muestra TNF-a liberada (n/ml a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) estimulada con lipopolisacárido re-purificada (LPS9 y en la presencia de concentraciones variables de Cpn 10 humano recombinante (1 µg/ml, 10 µg/ml o 50 µg/ml o en la ausencia de Cpn 10 (añadida simultáneamente con agonista) . Figura 6B muestra como para A, excepto que PBMCs fueron agotadas primero de células dentríticas plasmocitoides (PDCs) Figura 7A muestra la liberación de IL-10 (ng/ml a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) estimulada con lipopolisacárido (LPS) re-purificado y en la presencia de concentraciones variables de Cpn recombinante humana (1 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml) o en la ausencia de Cpn 10. Figura 7B muestra como para A, excepto que las PBMCs fueron primero agotadas de células dentríticas plasmocitoides (PDCs) . Figura 8. Cpn 10 no reduce la activación de NF-?B a través de Poli (I:C) en la línea celular RAW264-pNFTy2-LUC. Figura 9. La capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 promueve la producción de IFNs de tipo I en células RAW264.7 estimuladas por LPS (predominantemente IFN-ß) o Poli(I:C) (predominantemente IFN-a) por 24 horas . Figura 10. La capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 promueve la producción de IFNß al nivel transcripcional en células RAW264.7 estimuladas con Poli(I:C). La potenciación de IFNß en la presencia de Cpn 10 se ha visto también en células RAW264.7 estimuladas con LPS. Figura 11. PBMC humano de dos diferentes donadores estimulado con 50 µg/ml de Poli(I:C) produce niveles crecientes de IFN-a en la presencia de Cpn 10. Figura 12. Cpn pero no GroES induce una capacidad de respuesta a la dosis creciente en IFN-ß inducida por Poli(I:C) . Figura 13. La pre-incubación de Cpn 10 seguida por lavado reduce el aumento de la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 en la producción de IFN-ß inducida por Poli (I:C) . Figura 14. Cpn 10 no potencia una respuesta a la dosis en BMM a partir de ratones-/-IFNARl . Figura 15. Se requieren cebadores de macrófagos a través de la trayectoria del interferón de tipo I para la modulación de una respuesta de TLR4 (n = 2) .

Figura 16A muestra los niveles de TNFa en suero en ratones con inflamación generalizada inducida por LPS, la Figura 16B muestra los niveles de IFNß en suero. Figura 17. La supervivencia de ratones C57BL/6 neonatos de 6 a 9 días de edad, infectados con SFV. Se usaron ratones C57BL/6 neonatos de 6 a 9 días de edad como sigue: Grupo A: SFV (n = 13); Grupo B: SFV + Cpn 10, 20 µg (n = 13); Grupo C: SFV + Cpn 10, 50 µg (n = 13). Los Grupa B y C fueron inyectados i.p. con 20 y 50 µg de Cpn 10 seguido por (3 horas después) por inyección de 50 µl de SFV (30 x TCID50) a los tres grupos. La supervivencia se gráfico de conformidad con la leyenda que se muestra. Figura 18A-I muestran que el promotor de Cpn 10 es inducido por estimulación de choque térmico (HS, Heat schock) y estimulación de TLR. Figura 18 A muestra ensayos representativos demuestran que el choque térmico con recuperación de 6 horas indujeron significativamente la actividad promotora de Cpn 10, la cual entonces regresó a niveles básales por 18 horas post HS (n = 2, ensayos por duplicado) . En contraste, la estimulación con LTA (agonista de TLR2) condujo a una inducción de 2.7 veces del promotor por estimulación de 24 horas y permanencia constante a 30 horas. Figuras 18B y 18 C muestran la estimulación de células con un título de ligandos de TLR2, Figuras 18D y 18E muestran TLR7 o Figuras 18F y 18G muestran TLR9, las cuales indejeron al promotor de Cpn 10 en una manera dependiente de la dosis (n = 2 a 6 réplicas) . Los datos presentados en Figuras 18C, 18E y 18G reflejan los mismos datos que en 18B, 18D y 18F pero son representados como veces de cambio sobre la línea base. La Figura 18H muestra las barras de error reflejan una desviación estándar de la media; los agonistas de TLR y las citoquinas indujeron al promotor de Cpn 10 con niveles máximos variables. La actividad promotora de Cpn 10 es expresada como cps de luciferasa normalizada contra niveles básales para cada agonista. Las concentraciones óptimas de agonista y repeticiones de ensayo: TLR2 : 100 µg/ml de LTA de B . subtilis, n = 12; TLR3: 100 µg/ml de poli(I:C), n = 6; TLR4 : 10 ng/ml de LPS Ultrapure de E. coli , n = 12; TLR7 : 10 mg/ml de imiquimod R837, n = 2; TLR9, 1 mM de CpG ODN, , n = 2; 1 ng/ml de IFN?, n = 3, IL-lß (1 ng/ml), n - 2, TNFa (100 ng/ml) , n = 2 (H) . Se evaluó si fueron significativos (p< 0.02) para (Figura 18A) y (p < 0.05) para (Figura 18F) por ANOVA y está indicado por * . Cps = conteo por segundo. En células RAW264.7 no transfectadas estimuladas con LTA, finalmente en la Figura 181, un incremento dependiente de la concentración transitorio en los niveles de mARN de Cpn 10 se midió por PCR en tiempo real. La expresión genética fue normalizada para controlar genes domésticos (18S y Pbgd) . Figura 19A-E se refieren a agonistas de TLR y el choque térmico inducen la producción de Cpn 10 pero solamente agonistas de TLR dan como resultado la liberación extracelular de Cpn 10. Figura 19A muestra el análisis cuantitativo de lisados celulares totales de RAW264.7 estimulados por LTA por medio de ELISA mostraron poco cambio en niveles de Cpn 10 entre células control y tratadas, no obstante, en la Figura 19B, el análisis de sobrenadantes de cultivo demostraron un incremento de 3 veces en Cpn 10 extracelular después de estimulación con 100 µg/ml de LTA durante 30 horas. La Cpn 10 sobrenadante fue normalizada contra el número de células por pocilio. El tiempo de análisis transcurrido demostró la activación del promotor de Cpn 10 persistente durante 30 horas en respuesta a la ligadura de TLR2. La Figura 19C muestra los resultados estandarizados de conformidad con la concentración de proteína en la muestra. La Figura 19D muestra que el choque térmico medio, moderado o severo de células RAW264.7 no indujo la liberación extracelular de Cpn 10. Niveles de Cpn 10 en el torrente sanguíneo de pacientes con RA son significativamente más altos que en pacientes con MS o psoriasis, o sujetos control saludables.

La Figura 19E muestra que se analizó el significado por ANOVA unidireccional con la post-prueba de Turkey y se indicó por un * (p< 0.01(, o ** (p<0.001). Figura 20A-E muestran que Cpn 10 limita la señalización inducida por agonista a través de numerosos TLRs. En la Figura 20A se muestra que las células RAW264.7 transfectadas establemente con la construcción del promotor HIV-LTR-LUC fueron pre-incubadas con Cpn 10 antes de estimulación con una variedad de ligandos de TLR, dando como resultado la inhibición de la actividad luciferasa, una medición de la activación de NF-?B en estas células. Las Figuras 20B y 20C muestran las concentraciones de agonista y el tiempo de incubación fueron; 16.25 µg/ml de CpG ODN, 4 horas; 10 µg/ml de imiquimod, 2 horas; 100 µg/ml de poli(I:C), 4 horas; 10 µg/ml de zimosano, 2 horas; 10 µg/ml de PGN, 2 horas; 10 ng/ml de LPS Ultrapure, 2 horas; 5 ng/ml de LPS, 2 horas. La pre-incubación de Cpn 10 de células RAW264.7 o Figura 20D PBMC humano seguida por la estimulación de 10 ng/ml de LPS en 100 ng/ml células RAW264.7 en PBMC, condujo a una reducción de la capacidad de respuesta a la dosis en niveles de señales MAPK fosforiladas. La Figura 20E muestra la estimulación de PBMC humano con ligandos para TLRs 2, 2/6, 4, 7, 9 en la presencia de Cpn 10 da como resultado niveles decrecientes de TNF-a, IL-lß, IL-6, e IL-10 y la producción de IFN-a inducida por ODN de CpG e imiquimod- creciente. Las concentraciones de ligandos usados fueron: 10 µg/ml de PGN, 10 µg/ml de LTA, 10 µg/ml de zimosano, 0.12 ng/ml de LPS, 6.5 µg/ml de ODN de CpG, 10 µg/ml de imiquimod. Figura 21. células RAW264 desarrolladas en suspensión fueron incubadas por 4 horas en la presencia de 100 µg/ml de Cpn 10, o el volumen equivalente de regulador diluyente, y luego se tiñó para la presencia de TLR4. Figura 22. Células RAW264 desarrolladas en suspensión fueron incubadas por 4 horas en la presencia de 100 µg/ml de Cpn 10 o el volumen equivalente de regulador diluyente con o sin 2 ng/ml de LPS (añadido para las últimas 2 horas de tratamiento de Cpn 10) y luego se tiñeron para la presencia de TLR4. Figura 23. Células RAW264 desarrolladas en suspensión fueron incubadas por 4 horas en la presencia de 100 µg/ml de Cpn 10 o el volumen equivalente de regulador diluyente, con o sin 20 ng/ml de LPS añadidos para las últimas 2 horas de tratamiento con Cpn 10, antes de teñido para TLR4. (Intensidad de fluorescencia media: Naranja: 4.39, Negro: 6.14, Azul: 25). Figura 24. Células RAW264 desarrolladas en suspensión fueron incubadas toda la noche en la presencia de 100 µg/ml de Cpn 10 o el volumen equivalente de regulador diluyente, con o sin LPS (2 ng/ml) añadido para las últimas 2 horas de tratamiento con Cpn 10, y fueron entonces teñidos para TLR4. La intensidad de fluorescencia media: Azul: 25, Rojo: 33, Naranja: 11.7, Negro: 20. Figura 25. Células RAW264 desarrolladas en suspensión fueron incubadas toda la noche en la presencia de 100 µg/ml de Cpn 10 o el volumen equivalente de regulador diluyente, con o sin 20 ng/ml de LPS añadido por al menos 2 hr de tratamiento con Cpn 10 y luego se tiñeron para TLR4. (Intensidad de fluorescencia media: Naranja: 3.9, Negro: 7.9). Figura 26A-J muestran ligandos de TLR representativos y la inhibición de la actividad luciferasa por Cpn 10. Los datos en las Figuras 26A, 26C, 26E, 26G, 261 exponen las unidades luciferasa en CPS, mientras que en las Figuras 26B, 26D, 26F, 26H, 26J representan estos datos como por ciento de inhibición de la actividad luciferasa en células RAW264-HIV-LTR-LUC estimuladas con LPS. Figura 27. Inhibición máxima inducida por Cpn 10 de la activación de LTR-HIV estimulada por un amplio intervalo de ligandos de TLR, como una medida indirecta de la activación de NF-?B.

Figura 28A muestra la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 reduce el nivel de p38 fosforilado, la Figura 28B muestra ERK, y JNK1/2 en células estimuladas con LPS por 30 minutos. En la Figura 28C se muestra por la línea celular de macrófago de roedor RAW264.7, la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 redujo el nivel de fosforilación de p38, ERK1/2, y JNK1/2 inducida por LPS en PBMC humana recientemente aislada. Puesto que la activación de la trayectoria de MAP quinasa está estrechamente ligada con la inducción de la cascada inflamatoria de la producción de citoquina, estos datos muestran que los cambios mediados por Cpn 10 en la producción de citoquina inducida por ligando resulta de cambios en la cascada de señal de TLR. Las Figuras 29A-D muestran la producción de citoquina inducida por agonistas para TLR2 o TLR4 (PGN, LTA, Zimosano, LPS), incluyendo TNF-a, IL-lß, IL-6 e IL-10, se redujo en la presencia de Cpn 10. De manera similar, la estimulación de PBMC con agonistas para TLR7 o 9 con Imiquimod o CpG (ODN2216) en la presencia de Cpn 10 condujo a una producción reducida de citoquinas en comparación con los cultivos control sin Cpn 10, indicado por los datos en la Figura 29E. Figura 30. La pre-incubación de Cpn 10 seguida por un lavado previo a la adición de LPS aún limita la activación de BF-?B en una manera correspondiente a la dosis . Figura 31. La pre-incubación de Cpn 10 seguida por estimulación con IFN-? por 6 horas da como resultado la producción de TNF-a por medio de células RAW264.7. Figura 32. El análisis por SDS-PAGE de moléculas que enlazan a Cpn 10. Gel de SDS-PAGE de proteínas de lisado celular enlazadas a y eluídas desde la columna de afinidad para Cpn 10. Figura 33. Electroforesis sobre gel en 2D de moléculas que enlazan a Cpn 10. El gel en 2D de proteínas de lisado celular enlazadas a y eluidas desde la columna de afinidad para Cpn 10. Figura 34A muestra el perfil de toxicidad de PoliI:C en células RAW264 y la Figura 34b en HeLa durante 3 días.

Figura 35A muestra la influencia de Cpn 10 sobre PolilrC en células RAW264 y en la Figura 35B en HeLa durante 3 días. Figura 36A-C muestran que la Cpn 10 interactúa con células presentadoras de antígeno humano en la superficie celular, y es interiorizada en compartimentos endo-lisosómicos. PBMC purificadas, fueron incubadas con Cpn 10 conjugada con fluoróforo por 10 minutos a 4 °C y en la Figura 36A muestra la fluorescencia superficial que se midió por citometría de flujo. En la Figura 36B muestra que Cpn 10 se asoció más fuertemente con mDC y pDC, y los monocitos mostraron enlace creciente de Cpn 10 fluorescente después de estimulación con LTA durante 4 horas. Células RAW264.7 y pDC humanas purificadas fueron incubadas con Cpn 10 fluorescente por 30 minutos a 37 °C antes de formación de imágenes confocales. En la Figura 36C se muestra que la co-incubación con marcadores fluorescentes de compartimentos ácidos y mitocóndricos reveló la interiorización de Cpn 10 en compartimentos endo-lisosómicos. La secuencia de aminoácidos de Cpn 10 humana de tipo salvaje (No. de Acceso de GenBank X75821) se proporciona en la SEC ID NO: 1. Las secuencias de aminoácidos de dos formas modificadas de Cpn 10, con residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal se proporcionan en las SEC ID NOs: 2 y 3. La secuencia de nucleótido que codifica a las mismas se proporciona en la SEC ID NO: 4. Cebadores oligonucleótidos usados en los ejemplos como se describen en la presente se proporcionaron en la SEC ID NO: 5 - 10.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha mostrado previamente que Cpn 10 reduce la producción de citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-a y RANTES ambas en cultivos celulares e in vivo (ver por ejemplo Johnson y colaboradores, 2005, J. Biol. Chem. 280: 4037-4047 y la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/AU2005/000041, WO2005/067959, cuyas descripciones se incorporan a la presente como referencia. Estos descubrimientos apoyan el uso de Cpn 10 como un agente terapéutico para el tratamiento de una variedad de enfermedades inflamatorias que incluyen, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad del huésped versus injerto. Métodos para modulación de la señalización del receptor similar al de Toll y producción del inmunomodulador Como se describe en la presente los inventores han demostrado que Cpn 10 humana, cuando se administró con poli(I:C) agonista de TLR3, dio como resultado un marcado incremento sinérgico en la producción de IFNß e IFNa. Adicionalmente, Cpn 10 ha demostrado que modula la señalización vía TLR7 y TLR9 como se midió por las reducciones en la activación de NF-?B. Además, los inventores han mostrado sorprendentemente que Cpn 10, pero no Cpn 60 o GroES, se asocia con TLR4 en toda la superficie celular después de estimulación con LPS en la forma de un "aglomerado de activación". Los inventores han mostrado adicionalmente que Cpn 10 se asocia con TLR2 después de estimulación con ácido lipoteicoico (LTA) ; con TLR7 después de la estimulación con ARN viral de una sola hebra y/o imiquimod, y con TLR9 después de estimulación con ADN de CpG. En cada caso dicha asociación está en la forma de Cpn 10 que interactúa con un "aglomerado de activación" que comprende un TLR particular y su agonista. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para modular la señalización del receptor similar al de Toll en un sujeto, o en al menos una célula, tejido u órgano de éste, en donde dichos métodos comprenden administrar una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la señalización del receptor similar al de Toll involucra la asociación de la chaperonina 10 con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación. La señalización del receptor similar al de Toll puede también ser modulada por administración de una cantidad efectiva de al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde la señalización del receptor similar al de Toll involucra la asociación de la chaperonina 10 con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación.

El aglomerado de activación puede estar localizado sobre la superficie de una célula o sobre la superficie de una vesícula celular tal como un endosoma. El aglomerado de activación puede comprender chaperonina 10, un receptor similar al de Toll, y opcionalmente, al menos otra molécula. La al menos otra molécula puede comprender un agonista del receptor similar al de Toll. En una modalidad, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR2 y ácido lipoteicoico (LTA) . En una modalidad adicional, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR3 y ARN de doble hebra. En otra modalidad, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR4 y LPS. En una modalidad adicional, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR7 y ARN de una sola hebra. En aún una modalidad adicional, el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR9 y ADN que comprende un motivo CpG. La chaperonina 10 puede ser una chaperonina 10 derivada naturalmente, producida sintéticamente, o producida recombinantemente. La chaperonina 10 puede ser de origen eucariótico. La chaperonina 10 puede ser chaperonina 10 humana. La chaperonina 10 puede comprender la secuencia polipeptídica como se expone en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. La chaperonina 10 puede ser acetilada o no acetilada, y puede comprender o no una extensión N-terminal simple o múltiple. La chaperonina 10 puede ser administrada en la forma de un polisacárido que codifica a chaperonina 10. El polisacárido que codifica a chaperonina 10 puede estar localizado en una construcción genética, operablemente ligada a un promotor. El polinucleótido puede comprender la secuencia como se expone en la SEC ID NO: 4.

El método puede comprender adicionalmente la administración de al menos un agente adicional. El agente puede ser un inmunomodulador. El inmunomodulador puede ser, por ejemplo, TNF-a, IL-lß, IL-6, IL-10, IL-12 o un interferón de tipo I. El interferón de tipo 1 puede ser IFNa o IFNß. Típicamente, la actividad moduladora de Cpn 10 es exhibida a través de la exposición inicial de TLRs a CpnlO, y luego la adición de uno o más agonistas de TLR, como demostraron los inventores y se describe en la presente, por ejemplo, en relación a ensayos inmunomoduladores que involucran células RAW264.7. El agonista puede ser un patógeno bacteriano, fúngico, levadura o viral, una molécula o componente derivado de éstos o producido así o un compuesto sintético. El agonista de TLR puede también ser un producto de células humanas dañadas asociadas con enfermedades autoinmunes, como se ejemplifica por TLR9 que tiene como un ADN humano agonista. Ejemplos no limitantes de agonistas de TLR3 incluyen ARN de doble hebra y poliI:C. Ejemplos no limitantes de agonistas de TLR7 incluyen ARN de una sola hebra, imidazoquinolinas tales como resiquimol e imiquimol y agonistas de molécula pequeña tal como isatoribina. Ejemplos no limitantes de agonistas de TKR9 incluyen ADN que contiene motivos ricos en CpG no metilados y oligonucleótidos que comprendan CpG sintético. No obstante los expertos en la materia apreciarán fácilmente que la presente invención no está limitada por la identidad de los agonistas de TLR. La presente invención también proporciona métodos para modular la producción y/o la secreción de uno o más inmunomoduladores en un sujeto, o al menos una célula, tejido u órgano de éste, en donde dichos métodos comprenden administrar una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la modulación de la producción y/o secreción del uno o más inmunomoduladores.

La modulación de la producción y/o la secreción de uno o más inmunomoduladores puede lograrse también administrando una cantidad efectiva de un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la modulación de la producción y/o la secreción del uno o más inmunomoduladores. El inmunomodulador puede ser, por ejemplo, TNF-a, IL-lß, IL-6, IL-10, IL-12 o un interferón de tipo I. El interferón de tipo I puede ser IFNa o IFNß. Métodos para tratar o prevenir una enfermedad Los descubrimientos de los inventores como se presentan en la presente apoyan el uso de Cpn 10 en el manejo clínico de una variedad de enfermedades y condiciones, incluyendo enfermedades bacterianas y virales crónicas y agudas. Por consiguiente la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades bacterianas y virales y trastornos causados por o de otra manera asociados con infecciones virales o bacterianas, que comprende la administración de Cpn 10. Adicionalmente, la estimulación de TLR3, TLR7 y/o TLR9 está implicada en respuestas naturales para y/o en el tratamiento terapéutico de otros trastornos que incluyen asma, alergia, enfermedad intestinal inflamatoria e inflamación general. Así, la presente invención también contempla métodos para el tratamiento o la prevención de dichas enfermedades y trastornos que comprenden la administración de Cpn 10. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un sujeto, en donde dichos métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociado con la iniciación, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición. Dichos métodos pueden comprender también administrar al sujeto una cantidad efectiva de al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición.

La enfermedad o condición puede incluir, pero no limitarse al grupo que comprende infecciones virales, fúngicas, por levaduras o bacterianas, enfermedades inflamatorias agudas o crónicas incluyendo choque séptico, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, psoriasis, enfermedad cardíaca, arterioesclerosis, enfermedad pulmonar crónica, caquexia, esclerosis múltiple, GVHD y cáncer. Cualquier enfermedad o condición, cuyo establecimiento y/o progreso, ola iniciación, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune contra la cual, involucra la asociación de chaperonina 10 con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, están contemplados como en el alcance de la presente invención. En una modalidad, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR2 inducida por LTA. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o secreción del inmunomodulador inducida por TLR2. En una modalidad adicional, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR3 inducida por ARN de doble hebra. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR3. En otra modalidad, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR4 inducida por LPS. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR4.

En una modalidad adicional, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR7 inducida por ARN de una sola hebra viral. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR7. En una modalidad aún adicional, la chaperonina 10 regula la señalización de TLR9 inducida por el motivo CpG. La chaperonina 10 puede modular la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR9. Composiciones y usos de las mismas La presente invención proporciona composiciones cuando se usan para el tratamiento o la enfermedad de una enfermedad o condición, las composiciones que comprenden chaperonina 10 junto con al menos un portador, diluyente o adyuvante aceptables farmacéuticamente, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la iniciación, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición. Las composiciones pueden comprender adicionalmente al menos un agonista de un receptor similar al de Toll. La composición puede comprender adicionalmente al menos un inmunomodulador tal como un interferón de tipo I. Otras composiciones usadas para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición, la composición comprende al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonína 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición. Usos de chaperonina 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición se contemplan también, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la iniciación, mejoramiento y/o el mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición. Usos de antagonistas de chaperonina 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición se contemplan también, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición. En general, composiciones adecuadas para uso de conformidad con los métodos de la presente invención pueden ser preparadas de conformidad con métodos y procedimientos que son conocidos por los expertos en la materia y por consiguiente puede incluir un portador, diluyente y/o adyuvante aceptable farmacéuticamente. Terapias en combinación Los expertos en el arte apreciarán que de conformidad con los métodos de la presente invención Cpn 10 puede ser administrada sola o en conjunción con uno o más agentes adicionales. Por ejemplo, Cpn 10 puede ser administrada junto con uno o más agonistas de TLR capaces de estimular a uno o más de TLR2, TLR3, TLR4 , TLR7 y TLR9. Adicionalmente, la presente invención contempla la terapia en combinación usando Cpn 10 en conjunción con los procedimientos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos. Por ejemplo, Cpn 10 puede ser útil en el tratamiento de enfermedades virales que son capaces de responder a terapia con interferones de tipo I tales como IFNß o IFNa. De manera adicional, como activación inducida por agonista de TLR7 y TLR9 se han reportado previamente para mejorar la repuesta de tumores a terapia de radiación, Cpn 10 puede ser usada conjuntamente con terapia de radiación para el tratamiento de cáncer. Para dichas terapias en combinación, cada componente de la terapia en combinación puede ser administrado al mismo tiempo, o secuencialmente en cualquier orden, o a diferentes momentos, de modo de proporcionar el efecto deseado. De manera alternativa, los componentes pueden ser formulados juntos en una sola unidad de dosificación como un producto en combinación. Cuando se administran separadamente, puede preferirse para los componentes que sean administrados por la misma ruta de administración, aunque no es necesario para esto que sea así. Chaperonina 10 De conformidad con aspectos y modalidades de la presente invención, un sujeto en necesidad de tratamiento se le administra una cantidad efectiva de Cpn 10. En modalidades particulares el sujeto a ser tratado es un humano, y por consiguiente, el polipéptido de Cpn 10 en el polipéptido de Cpn 10 humano. Los expertos en la materia apreciarán que la identidad precisa de la Cpn 10 usada de conformidad con la presente invención puede variar dependiendo de numerosos factores, por ejemplo las especies a ser tratadas , de modo que la Cpn 10 pueda ser seleccionada para así derivarse de las especies a ser tratadas.

Típicamente, la Cpn 10 es Cpn 10 recombinante. Los métodos descritos en Morton y colaboradores, 2000 (Immunol Cell Biol. 78: 603-607), Ryan y colaboradores, 1995 (J Biol Chem 270: 22037-22043) y Johnson y colaboradores, 2005 (J. Biol. Chem 280: 4037-4047) son ejemplos de métodos de producción adecuados para la proteína de Cpn 10 recombinante, aunque la experiencia apreciará que la presente invención no está limitada por el método de purificación o producción usado y cualquier otro método puede ser usado para producir Cpn 10 para uso de conformidad con los métodos y composiciones de la presente invención. Fragmentos de péptidos y polipéptidos de Cpn 10 para uso de conformidad con la presente invención pueden ser obtenidos usando técnicas de ácido nucleico recombinante estándares o pueden ser sintetizados, por ejemplo usando técnicas de síntesis en fase sólida o líquida convencionales. Los péptidos de Cpn 10 pueden ser producidos por digestión de un polipéptido con una o más proteinasas tales como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C y proteasa de staphylococcus V8. Los fragmentos de péptídos digeridos pueden ser purificados por, por ejemplo, técnicas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) .

Modalidades de la invención también contemplan la administración de un polinucleótido que cosifica a Cpn 10. En dichas situaciones el polinucleótido es típicamente ligado operablemente a un promotor de modo que la secuencia polipeptídica apropiada es producida después de administración del polinucleótido al sujeto. El polinucleótido puede ser administrado a sujetos en un vector. El vector puede ser un vector plásmido, un vector viral, o cualquier otro vehículo adecuado adaptado para la inserción de secuencias extrañas, su introducción en células eucarióticas y la expresión de las secuencias introducidas. Típicamente el vector es un vector de expresión eucariótica y puede incluir secuencias de procesamiento y de control de expresión tales como un promotor, sitios de enlace de ribosoma, señales de poliadenilación y secuencias de terminación de transcripción. La construcción de ácido nucleico a ser administrada puede comprender ADN desnudo o puede estar en la forma de una composición, junto con uno o más portadores aceptables farmacéuticamente. El polipéptido de Cpn 10 puede tener, pero no se limita a, la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos del polinucleótido que codifica a Cpn 10 puede ser como se expone en la SEC ID NO: 4 o presentar suficiente identidad de secuencia con ésta para hibridizar a la secuencia de la SEC ID NO: 4. En modalidades alternativas, la secuencia de nucleótidos del polinucleótido puede compartir al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 4. En el alcance de los términos "polipéptido" y "polinucleótido" como se usan en la presente son fragmentos y variantes de los mismos. A manera de ejemplo solamente, fragmentos de péptidos de Cpn 10 como se describe en WO 95/15338 puede ser usado de conformidad con aspectos y modalidades de la presente invención. El término "fragmento", se refiere a una secuencia de ácido nucleico o polipéptido que codifica a un constituyente o es un constituyente de la proteína de Cpn 10 de extensión total. En términos del polipéptido el fragmento posee actividad biológica cualitativa en común con la proteína de extensión total. Un fragmento activo biológicamente de Cpn 10 de conformidad con la presente invención puede poseer típicamente al menos aproximadamente 50 % de la actividad inmunomoduladora de la proteína de extensión total correspondiente, más típicamente al menos aproximadamente 60 % de dicha actividad, más típicamente al menos aproximadamente 70 % de dicha actividad, más típicamente al menos aproximadamente 80 % de dicha actividad, , más típicamente al menos aproximadamente 90 % de dicha actividad, y más típicamente al menos aproximadamente 95 % de dicha actividad. El término "variante" como se usa en la presente se refiere a moléculas sustancialmente similares. Generalmente variantes de secuencias de ácido nucleico codifican a polipéptidos los cuales poseen actividad biológica cualitativa en común. Generalmente, variantes de secuencia polipeptídica también poseen actividad biológica cualitativa en común. Adicionalmente, estas variantes de secuencia de polipéptido pueden compartir al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 09 % o 99 % de identidad de secuencia. Adicionalmente, un polipéptido variante puede incluir análogos, en donde el término "análogo", significa un polipéptido que es un derivado de Cpn 10, dicho derivado comprende la adición, eliminación, sustitución de uno o más aminoácidos, de modo que el polipéptido retenga sustancialmente la misma función que Cpn 10 nativo. Es bien sabido en el arte que algunos aminoácidos pueden ser cambiados en un polipéptido sin alterar la actividad del polipéptido (sustituciones conservadoras) . El término "sustitución conservadora de aminoácidos", se refiere a una sustitución o reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades similares en una cadena polipeptídica /secuencia primaria de una proteína) . Por ejemplo, la sustitución del aminoácido cargado ácido glutámico (Glu) por el amino ácido cargado de manera similar ácido aspártico (Asp) sería una sustitución conservadora. Las adiciones de aminoácidos pueden resultar de la fusión de un polipéptido de Cpn 10 o fragmento de éste con un segundo péptido o polipéptido, tal como una polihistidina marcada, fusión de proteínas de enlace a maltosa, fusión de glutatión S transferasa, fusión de proteína verde fluorescente, ola adición de un epítope marcado tal como FLAG o c-myc. Por ejemplo, el polipéptido de Cpn 10 humano de tipo salvaje puede comprender una porción tripeptídica GSM adicional en el N-terminus (SEC ID NO: 2; ver por ejemplo WO 95/15338, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia) o una alanina (A) adicional reside en el N-terminus (SEC ID NO: 3; WO 2004/041300, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia) . Otra forma mutada de Cpn 10 incluye aquellas descritas en la solicitud de patente provisional Australiana No. 2005904765, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia. La presente invención también contempla el uso de polinucleótidos que codifican dichas formas modificadas de Cpn 10.

Pueden generarse variantes de Cpn 10 por mutagénesis de una proteína de Cpn 10 o mutagénesis de y un ácido nucleico codificador, tal como por mutagénesis aleatoria o mutagénesis específica puntual usando métodos bien conocidos por los expertos en el arte. Dichos métodos pueden ser encontrados, por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology (Capítulo 9) , Ausubel y colaboradores, John Wiley & Sons, Inc., New York, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia. Las variantes y análogos también abarcan polipéptidos complejados con otras porciones químicas, proteínas de fusión o de otra manera modificadas transicionalmente . Ejemplos de modificaciones adecuadas se describen en la Solicitud de Patente internacional No. PCT/AU2005/000041; WO2005/067959 provisionales cuya descripción se incorpora a la presente como referencia. Adicionalmente, el polipéptido de Cpn 10 o fragmento de éste puede poseer otras modificaciones post-translacionales, incluyendo modificaciones de cadena lateral tales como por ejemplo acetilación, amidación, carbonilación, alquilación reductiva y otras modificaciones que son conocidas por los expertos en la materia. Un polinucléotido de Cpn 10 puede comprender adicionalmente, pero no limitarse a, cualquier polinucleótido que hibridize a un polinucléotido de Cpn 10 como se definió en la presente bajo condiciones de alta severidad. El término "alta severidad" como se usa en la presente, se refiere a las condiciones bajo las cuales dos polinucleótidos pueden ser hibridizados, y pueden incluir, por ejemplo, la concentración de sales y/o detergentes en una solución, la temperatura de una solución que es usada durante la hibridización de dos polinucleótidos y el período de tiempo de la hibridización. Por consiguiente, el término "alta severidad" como se usa en la presente, se refiere a condiciones en una solución que son útiles para hibridización de dos polinucleótidos solamente donde dichos polinucleótidos comparten un alto grado de homología. El grado de homología puede incluir pero no limitarse a, un intervalo desde aproximadamente 50 % a 99 %. Así, condiciones de "alta severidad" pueden involucrar, pero no limitarse al uso de un regulador de lavado que comprende 0 a 10 % de dodecil sulfato de sodio y/o 0 a 1 % de cloruro de sodio-citrato de sodio a una temperatura en el intervalo desde aproximadamente 60 °C a 70 °C, o cualquier otra combinación de reguladores, temperatura o período de tiempo que produciría una solución de "alta severidad" para hibridización. Rutas de administración Las composiciones pueden ser administradas por rutas estándares. En general, las composiciones pueden ser administradas por la ruta parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutánea o intramuscular) , oral o tópica. La administración puede ser generalizada, regional o local. La ruta de administración particular a ser usada en cualquier circunstancia dada dependerá de numerosos factores, incluyendo la naturaleza de la condición a ser tratada, la severidad y grado de la condición, la dosificación requerida del compuesto particular a ser liberado y los efectos secundarios potenciales del compuesto. Las composiciones de la invención pueden estar en una forma adecuada para administración por inyección, en la forma de una formulación adecuada para ingestión oral (tal como cápsulas, tabletas, capletos, elíxires, por ejemplo) , en la forma de un ungüento, crema o loción adecuados para administración tópica, en una forma adecuada para liberación en unas gotas para los ojos, en una forma de aerosol adecuada para administración por inhalación, tal como por inhalación intranasal o inhalación oral, en una forma adecuada para administración parenteral, esto es, inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa.

Para administración como una solución o suspensión inyectable , pueden incluir diluyentes o portadores no tóxicos aceptables parenteralmente, solución de Ringer, solución salina isotónica, solución alcalina regulada con fosfato, etanol y 1, 2- propilen glicol. Diluyentes , portadores , adyuvantes y excipientes En general, pueden prepararse composiciones adecuadas de conformidad con métodos que son conocidos por los expertos en la materia y pueden incluir diluyentes, adyuvantes y/o excipientes aceptables farmacéuticamente. Los diluyentes, adyuvantes y excipientes deben de ser "aceptables" en términos de ser compatibles con los otros ingredientes de la composición, y no ser perjudiciales a los recipientes de la misma. Ejemplos de portadores o diluyentes aceptables farmacéuticamente incluyen, pero no se limitan a, agua destilada o desmineralizada, solución salina, aceites basados en vegetales tales como aceite de cacahuate, aceite de girasol, aceite de oliva, aceite de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo, aceite de cacahuate o aceite de coco; aceites de silicio, incluyendo polisiloxanos, tales como metil polisiloxano, fenil polisiloxano y metil fenil polisiloxano; silicios volátiles; aceites minerales tales como parafina líquida, parafina blanda o escualano; derivados de celulosa tales como metil celulosa, etil celulosa, carboximetil celulosa, carboximetil celulosa de sodio o hidroxipropil metil celulosa, alcanoles inferiores, por ejemplo, etanol o iso-propanol; alcanoles inferiores; polialquilen glicoles inferiores o alquilen glicoles inferiores, por ejemplo polietilen glicol, polipropilen glicol, etilen glicol, propilen glicol, 1, 3- etilen glicol o glicerina: esteres de ácidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo, oleato de etilo, polivinilpirrolidona; agar, carrageninas, goma de tragacanto o goma acacia, gelatina de petróleo. Típicamente, el portador o los portadores formarán desde 10 % a 99.9 % en peso de las composiciones. Algunos ejemplos de portadores, diluyentes, excipientes y adyuvantes adecuados para uso oral, incluyen, pero no se limitan a, aceite de cacahuate, parafina líquida, carboximetil celulosa sódica, metil celulosa, alginato de sodio, goma de acacia, goma de tragacanto, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, gelatina y lecitina. Además estas formulaciones orales pueden contener agentes saborizantes y colorantes adecuados. Cuando se usan en forma de cápsula las cápsulas pueden ser recubiertas con compuestos tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo los cuales retardan la desintegración.

Los adyuvantes típicamente incluyen, pero no se limitan a, agentes emolientes, emulsificantes, espesantes, conservadores, bactericidas y agentes reguladores . Formas sólidas para administración oral pueden contener, pero no limitarse a, aglutinantes, aceptables en la práctica farmacéutica veterinaria y humana, edulcorantes, agentes desintegrantes, diluyentes, saborizantes, agentes recubridores, conservadores, lubricantes y/o agentes retardadores del tiempo. Los aglutinantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, goma de acacia, gelatina, almidón de maíz, goma de tragacanto, alginato de sodio, carboximetil celulosa o polietilen glicol. Edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartame o sacarina. Agentes desintegrantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, almidón de maíz, metil celulosa, polivinil pirrolidona, goma guar, goma de xantana, bentonita, ácido algínico o agar. Diluyentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, latosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolín, celulosa, carbonato de calcio, silicato de sodio o fosfato dicálcico. Agentes saborizantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite de menta piperita, aceite esencial de gaulteria, sabor de cereza, naranja, o frambuesa. Agentes recubridores adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus esteres, ceras, alcoholes grasos de seína, goma laca o gluten. Conservadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, benzoato de sodio, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metil parabeno, propil parabeno o bisulfito de sodio. Los lubricantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, ácido esteárico, oleato de sodio, cloruro de sodio o talco. Agentes retardadores de tiempo adecuados incluyen monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Formas líquidas para administración oral pueden contener, además de los agentes anteriores, un portador líquido. Portadores líquidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, aceites tales como aceite de oliva, aceite de cacahuate, aceite de sésamo, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de coco, parafina líquida, etilen glicol, propilen glicol, polietilen glicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, triglicéridos o mezclas de los mismos. Suspensiones para administración oral pueden comprender adicionalmente agentes dispersantes y/o agentes de suspensión. Agentes de suspensión adecuados incluyen, pero no se limitan a, carboximetil celulosa sódica, metil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, polivinil pirrolidona, alginato de sodio o alcohol acetílico. Agentes dispersantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, lecitina, esteres de polioxietileno de ácidos grasos tales como ácido esteárico, -estearato o laureato, mono- o di- oleato de polioxietilen sorbitol, -estearato o -laureato, mono- o di- oleato de polioxietilen sorbitán y los similares. Las emulsiones para administración oral pueden comprender adicionalmente uno o más agentes emulsificantes. Agentes emulsificantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes dispersantes como se ejemplifican anteriormente o gomas naturales tales como goma guar, goma de acacia o goma de tragacanto. Métodos para preparar composiciones administrables parenteralmente son obvios para los expertos en la materia, y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ava. Edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa . , incorporada a la presente como referencia. Las formulaciones tópicas de la presente invención, comprenden un ingrediente activo junto con uno o más portadores aceptables, y opcionalmente cualquiera de otros ingredientes terapéuticos. Formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen, pero no se limitan a, preparaciones líquidas y semi-líquidas adecuadas para penetración a través de la piel en el sitio en donde se requiera el tratamiento, tales como linimentos, lociones, cremas, ungüentos y pastas, y gotas adecuadas para administración al ojo, oído o nariz. Gotas de conformidad con la presente invención pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles. Estas pueden ser preparadas disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa de un agente bactericida y/o fúngico y/o cualquier otro conservador adecuado, y que incluyen opcionalmente un agente tensoactivo. La solución resultante puede entonces ser clarificada por filtración, transferida a un contenedor adecuado y esterilizada. La esterilización puede ser lograda por: autoclave o manteniendo a 90 °C -100 °C por media hora, o por filtración, seguida por transferencia a un contenedor por medio de una técnica aséptica. Ejemplos de agentes bactericidas y fúngicos adecuados para inclusión en las gotas son acetato o nitrato fenil mercúrico (0.002 %), cloruro de benzalconio (0.01 %) y acetato de clorhexidina (0.01 %). Solventes adecuados para la preparación de una solución . oleosa incluyen, pero no se limitan a, glicerol, alcohol diluido y propilen glicol, Lociones de conformidad con la presente invención incluyen aquellas adecuadas para aplicación a la piel o al ojo. Una loción ocular puede comprender una solución acuosa estéril opcionalmente que contenga un bactericida y puede ser preparada por medio de métodos similares a los descritos anteriormente en relación a la preparación de gotas. Lociones o linimentos para aplicación a la piel pueden también incluir, pero no limitarse a, un agente para acelerar el secado y enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un humectante tal como glicerol, o aceite tal como aceite de ricino o aceite de cacahuate. Cremas, ungüentos o pastas de conformidad con la presente invención son formulaciones semi-sólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Pueden ser elaboradas por mezcla de los ingredientes activos en forma pulverizada o finamente dividida, solo o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abeja, un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural tal como aceite de almendras, maíz, cacahuate, ricino, u oliva; grasa de lana o sus derivados, o un ácido graso tal como ácido esteárico u oleico junto con un alcohol tal como propilen glicol o macrogoles . La composición puede incorporar cualquier tensoactivo adecuado tal como un tensoactivo aniónico, catiónico o no iónico tales como esteres de sorbitan o derivados de polioxietileno de los mismos. Agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices siliciosos, y otros ingredientes tales como lanolina, pueden también ser incluidos. Las composiciones pueden también ser administradas en la forma de liposomas. Los liposomas generalmente, son derivados de fosfolípidos u otras sustancias lípidicas, y se forman por cristales líquidos hidratados mono- o multi-laminales que se dispersan en un medio acuoso. Puede usarse cualquier lípido no tóxico aceptable fisiológicamente y metabolizable capaz de formar liposomas. Las composiciones en forma de liposomas pueden contener estabilizantes, conservadores, excipientes y los similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidil colinas (lecitinas) , tanto naturales como sintéticas. Los métodos para formar liposomas son conocidos en el arte, y en relación a esto, se hace referencia específica a: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 y sec., cuyo contenido se incorpora a la presente como referencia. Las composiciones pueden ser conjugadas en un conjunto de derivados de polietilen glicol (PEG) . La adición de PEG a proteínas (PEGilación) es un método bien establecido para disminuir las velocidades de eliminación plasmática de proteínas, incrementando así su eficiencia (Nucci y colaboradores, 1991, Adv. Drug Del. Rev. 6: 133). Los beneficios adicionales de la PEGilación pueden incluir mayor estabilidad de proteínas, ínmunogenicidad decreciente, solubilidad mejorada y susceptibilidad decreciente a proteólisis (Sheffield W. 2001, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 1:1-11). Moléculas de PEG contienen la estructura de repetición básica de - (OCH3CH2) n-OH y son clasificadas en grupos de conformidad con su peso molecular. Derivados de PEG son conjugados a proteínas para aumentar su radio hidrodinámico y en general, su incremento en vida media está directamente relacionado con el tamaño de la cadena PEG fijada (Sheffield W. 2001, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 1:1-22) Las composiciones pueden también ser administradas en la forma de micropartículas. Micropartículas degradables formadas de polilacturo (PLA) , polilacturo-co-glicoluro (PLGA) y épsilon-caprolactona (e-caprolactona) han sido extensivamente usados como portadores de fármacos para incrementar la vida media plasmática y así prolongar la eficiencia (R. Kumar, M., 2000, J. Pharm. Pharmaceut Sci. 3(2) 234-258). Las micropartículas han sido formuladas para la liberación de un intervalo de fármacos candidatos incluyendo vacunas, antibióticos, y ADN. Además, estas formulaciones han sido desarrolladas para varias rutas de liberación incluyendo inyección subcutánea parenteral, inyección intravenosa e inhalación. Las composiciones pueden incorporar una matriz de liberación controlada que está compuesta de isobutirato acetato de sacarosa (SAIB) y solvente orgánico o mezcla de solventes orgánicos. Los aditivos poliméricos pueden ser añadidos al vehículo como un modificador de liberación para incrementar adicionalmente la viscosidad y abatir lentamente la velocidad de liberación. SAIB es un aditivo alimenticio bien conocido. Es un derivado de sacarosa esterificada totalmente muy hidrofóbica, en una proporción nominal de seis grupos isobutirato a dos acetatos. Como un éster mezclado, SAIB no cristaliza pero existe como un líquido viscoso claro. Mezclando SAIB con un solvente orgánico aceptado farmacéuticamente tal como etanol o alcohol bencílico disminuye la viscosidad de la mezcla suficientemente para permitir la inyección. Un ingrediente farmacéutico activo puede ser añadido al vehículo de liberación de SAIB para formar las formulaciones en suspensión o en solución de SAIB. Cuando la formulación es inyectada subcutáneamente, el solvente se difunde desde la matriz permitiendo al fármaco-SAIB o mezclas de polímero-fármaco-SAIB para producir una formación en depósito in si tu . Para los propósitos de la presente invención moléculas y agentes pueden ser administrados a sujetos como composiciones ya sea preventiva o terapéuticamente. En una aplicación terapéutica, las composiciones son administradas a un paciente que ya sufre de una enfermedad en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. La composición debe de proporcionar una cantidad de la molécula o agente suficiente para tratar efectivamente al paciente. Dosificaciones El nivel de dosis efectivo terapéuticamente para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que es tratado y la severidad del trastorno; actividad de la molécula o agente empleado; la composición empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, la velocidad de secuestración de la molécula o agente, la duración del tratamiento, fármaco usado en combinación o coincidentalmente con el tratamiento, junto con otros factores relacionados bien conocidos en medicina.

Un experto en el arte sería capaz, por medio de experimentación de rutina, determinar una cantidad efectiva, no tóxica de agente o compuesto que se requeriría para tratar enfermedades aplicables. Generalmente, se espera que una dosificación efectiva esté en el intervalo de aproximadamente 0.0001 mg a aproximadamente 1000 mg por kg de peso corporal por 24 horas; Típicamente, aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 750 mg por kg de peso corporal; aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 500 mg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 250 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 1.0 mg a aproximadamente 250 mg por kg de peso corporal por 24 horas. Más típicamente, se espera que un intervalo de dosis efectiva esté en el intervalo de aproximadamente 1.0 mg a aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 1.0 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 1.0 mg a aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 1.0 mg a aproximadamente 25 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 5.0 mg a aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 5.0 mg a aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 5.0 mg a aproximadamente 15 mg por kg de peso corporal por 24 horas. Alternativamente, una dosificación efectiva puede ser de hasta aproximadamente 500 mg/m2. Generalmente, se espera que una dosificación efectiva esté en el intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 mg/m2, preferiblemente aproximadamente 25 a aproximadamente 350 mg/m2, más preferiblemente aproximadamente 25 a aproximadamente 300 mg/m2, aún más preferiblemente aproximadamente 25 a aproximadamente 250 mg/m2, aún más preferiblemente aproximadamente 50 a aproximadamente 250 mg/m2, y aún igualmente más preferiblemente aproximadamente 75 a aproximadamente 150 mg/m2. Típicamente, en aplicaciones terapéuticas, el tratamiento sería para la duración del estado de enfermedad. Adicionalmente, será obvio para un experto en la materia que la cantidad y espaciamiento óptimos de dosificaciones individuales será determinado por la naturaleza y el grado del estado de enfermedad que es tratado, la forma y el sitio de administración, y la naturaleza del individuo particular que es tratado. También, dichas condiciones óptimas pueden ser determinadas por medio de técnicas convencionales.

Para un experto en la materia será obvio que el curso óptimo del tratamiento, tal como el número de dosis de la composición dadas por día por un número definido de días, puede ser averiguado por el experto en la materia usando pruebas de determinación del curso de tratamiento convencionales. Agonistas y antagonistas de Chaperonina 10 La presente invención también contempla el uso de agonistas y antagonistas de Cpn 10 y métodos de cribar y de producir dichos agonistas y antagonistas. Agonistas y antagonistas de Cpn 10 pueden ser diseñados específicamente o cribados de acuerdo a su efecto a partir de la señalización del receptor similar al de Toll y de la secreción del inmunomodulador. Los anticuerpos pueden actuar como agonistas o antagonistas de Cpn 10, o fragmentos o análogos de los mismos. Preferiblemente, anticuerpos adecuados son preparados a partir de regiones discretas o de fragmentos del polipéptido de Cpn 10, en particular aquellos involucrados en conferir la actividad proteasa y/o de acompañar o enlazar al sustrato. Un polipéptido de Cpn 10 antigénico contiene al menos aproximadamente 5, y preferiblemente al menos aproximadamente 10 aminoácidos.

Métodos para la generación de anticuerpos adecuados serán apreciados fácilmente por los expertos en el arte.

Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-Cpn 10, típicamente que contenga porciones Fab, puede ser preparado usando la tecnología del hibridoma descrita en Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow & Lañe, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988) . En esencia, en la preparación de anticuerpos monoclonales dirigida hacia Cpn 10, o fragmento o análogo de ésta, puede usarse cualquier técnica que se proporciona para la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen la técnica del hibridoma originalmente desarrollada por Kohier y colaboradores, 1975, Nature, 256: 495-497, así como también la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y colaboradores, 1983, Immunology Today, 4:72), y la técnica del hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, pág. 77-96, Alan R. Liss, Inc. (1985)). Líneas celulares que producen anticuerpo, inmortales puede ser creadas por medio de técnicas diferentes de fusión, tales como transformación de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con el virus de Epstein-Barr. Ver, por ejemplo, M. Schreier y colaboradores, "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling y colaboradores, "monoclonal Antibodies and, T-cell Hybridomes" (1981); Kennett y colaboradores, "Monoclonal Antibodies" (1980) . En resumen, un medio de producir un hibridoma a partir del cual sea producido el anticuerpo monoclonal, un mieloma u otra línea celular auto-perpetuadora es fusionada con linfocitos obtenidos a partir de bazo de un mamífero hiperinmunizado con una porción de enlace de factor de reconocimiento de éste, o factor de reconocimiento, o una porción de enlace de ADN específico de origen de éste. Hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útiles al practicar esta invención son identificados por su habilidad para inmunoreaccionar con el factor de reconocimiento de la presente y su habilidad para inhibir la actividad transcripcional específica en células diana. Un anticuerpo monoclonal útil al practicar la presente invención puede ser producido por iniciación de un cultivo de hibridoma monoclonal que comprenda un medio nutriente que contenga un hibridoma que secrete moléculas de anticuerpo de la especificidad antigénica apropiada. El cultivo es mantenido bajo condiciones y por un período de tiempo suficiente para el hibridoma para secretar las moléculas de anticuerpo en el medio. El medio que contiene el anticuerpo es entonces colectado. Las moléculas de anticuerpo pueden entonces ser aisladas adicionalmente por medio de técnicas bien conocidas. De manera similar hay varios procedimientos conocidos en el arte que pueden ser usados para la producción de anticuerpos monoclonales. Para la producción del anticuerpo policlonal anti-Cpn 10, pueden ser inmunizados varios huéspedes animales por inyección con Cpn 10, o un fragmento o análogo de éste, incluyendo, pero no limitándose a caballos, conejos, pollos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. Adicionalmente, el polipéptido de Cpn 10 o fragmento o análogo de éste. Puede ser conjugado a un portador inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de molusco (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin) . También, varios adyuvantes pueden ser usados para incrementar la respuesta inmunológica, incluyendo pero no limitándose a geles minerales de Freund (completos e incompletos), tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de moluscos, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (Bacille Calmette-Guerin) y Corynobacterium parvun . El cribado para el anticuerpo deseado puede también lograrse por medio de una variedad de técnicas conocidas en el arte. Ensayos para enlace inmunoespecífico de anticuerpos pueden incluir, pero no limitarse a, radioinmunoensayos, ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assay) , inmunoensayos en emparedado, ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación por difusión de gel, ensayos por inmunodifusión, inmunoensayos in situ, tinción Western, reacciones de precipitación, , ensayos por aglutinación, ensayos por fijación del complemento, ensayos por inmunofluorescencia, ensayos con proteína A, y ensayos por inmunoelectroforesis, y los similares (ver. Por ejemplo, Ausubel y colaboradores, eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). El enlace del anticuerpo puede detectarse en virtud de una marca detectable sobre el anticuerpo primario. Alternativamente, el anticuerpo puede ser detectado en virtud de su enlace con un anticuerpo o reactivo secundario el cual está marcado apropiadamente. Una variedad de métodos son conocidos en el arte para detectar el enlace en inmunoensayos y están en el alcance de la presente invención. El anticuerpo (o fragmento del mismo) cultivado contra Cpn 10 o un fragmento o análogo del mismos tiene afinidad de enlace para Cpn 10. Preferiblemente, el anticuerpo (o fragmento de éste) tiene afinidad o avidez de enlace mayor que 105 M"1, más preferiblemente mayor que aproximadamente 106 M"1, más preferiblemente aún mayor que aproximadamente 107 M"1 y más preferiblemente mayor que aproximadamente 108 M"P En términos de obtener una cantidad adecuada de un anticuerpo de conformidad con la presente invención, uno puede fabricar el anticuerpo usando la fermentación discontinua con medio libre de suero. Después de fermentación el anticuerpo puede ser purificado vía un procedimiento multi-etapas, que incorpora etapas de cromatografía e inactivación/remoción viral. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser primero separado por cromatografía por afinidad con Proteína A y luego tratado con detergente/solvente para inactivar cualquier virus envuelto en lípido. La purificación adicional, típicamente por cromatografía de intercambio aniónico y catiónico puede ser usada para remover proteínas residuales, solventes/detergentes y ácidos nucleicos. El anticuerpo purificado puede ser purificado adicionalmente y formulado en solución salina al 0.9 % usando columnas de filtración sobre gel. La preparación a granel formulada puede entonces ser esterilizada y filtrada y distribuida viralmente. Se contemplan también agonistas y antagonistas diferentes de anticuerpos. Un agonista o antagonista candidato puede ser identificado por una habilidad para formar un complejo molecular con un receptor similar al de Toll, y opcionalmente un agonista de receptor similar al de Toll. Adicionalmente, un antagonista candidato puede ser identificado por una habilidad para prevenir o interrumpir la formación de un complejo molecular que comprenda Cpn 10, y un receptor similar al de Toll o un agonista de receptor similar al de Toll. Los expertos en la materia conocen técnicas y procedimientos para identificar y producir agonistas y antagonistas, que incluyen el cribado de bibliotecas de moléculas tales como bibliotecas de productos químicos sintéticos tales como bibliotecas combinatorias, cribado de bases de datos estructurales auxiliado por computadora, modelaje y/o diseño auxiliado por computadora, o más técnicas biofísicas tradicionales que detectan interacciones de enlaces moleculares. La presente invención será descrita ahora con mayor detalle con referencia a los ejemplos específicos siguientes, los cuales no se construyeron de manera limitante del alcance de la invención. Ejemplos Chaperonina 10 humana recombinan te Para los experimentos en los Ejemplos 1 a 4 siguientes, se produjeron Cpn 10 humanas recombinantes (No. de Acceso a GenBank: X75821) en E. coli con un residuo Alanina N- terminal como se describe en Johnson y colaboradores, 2005 (J. Biol Chem 280: 4037-4047). Se determinó la pureza y fue > 97 % por SDS-PAGE. Se descongelaron alícuotas congeladas de Cpn 10 solamente una vez antes de uso. Todos los lotes de Cpn 10 mostraron la misma actividad molar que GroES de E. coli en ensayos de duplicación por rodanesa mediados por GroEL (datos no mostrados) . Ejemplo 1 - Producción del IFNß de citoquina antiviral en la presencia de polil : C Se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto de Cpn 10 sobre la producción del interferon beta (IFNß) de citoquina antiviral, cuando se administró en combinación con el agonista selectivo de TLR3, polil :C (ácido poliinosínico:polisitidílico) . Se condujeron experimentos en la línea celular de macrófagos de roedor RAW264.7 (No. de Acceso a ATCC No. TIB71) como se describe en Johnson y colaboradores, 2005 (J. Biol Chem 280:4037-4047). Abreviando, las células RAW264.7 fueron sembradas a 2 x 105 células/pocilio en placas de 24 pocilios y se cultivaron toda la noche (37 °C, C02 al 5 %) . Cpn 10 humana recombinante (a concentraciones entre 10 µg y 200 µg/ml) o regulador fueron añadidas a células por duplicado por 2 horas seguido por la adición de polil: C (TLRlrpic, InvivoGen, San Diego, CA) a una concentración final de 100 µg/ml. Después de 24 horas, se colectaron los sobrenadantes y se analizaron para niveles de IFNß usando un ELISA específico de conformidad con las instrucciones de fabricante (No. de Cat. 42400-1, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) . Como se muestra en la Figura 1, células RAW264.7 sin estimular liberaron IFNß no detectable en los sobrenadantes del cultivo. La estimulación con polil :C a 100 µg/ml dio como resultado 292 pg/ml de IFNß que es liberado en los sobrenadantes del cultivo de RAW264.7 en la ausencia de Cpn 10. La adición de dosis crecientes de Cpn 10 desde 10 µg/ml hasta 200 µg/ml dio como resultado un incremento dependiente de la dosis en los niveles e IFNß en los sobrenadantes de cultivo, que alcanzaron un nivel máximo de 900 pg/ml de IFNß a 150 µg/ml de Cpn 10. Ejemplo 2 - Actividad anti-viral de sobrenadantes de células RA 264.7 Los sobrenadantes del cultivo celular obtenido de los experimentos descritos en el Ejemplo 1 anterior fueron congelados y almacenados a - 20 °C antes de análisis para actividad anti-viral total (liberación de interferon de tipo I total) en un ensayo de reducción del efecto citopático de células L (CPER) .

Resumiendo, 3 x 104 células L fueron sembradas en placas de 96 pocilios y dejadas por 4 horas a 37 °C para adherir. Se añadieron a la placa duplicados de estándares de IFN y sobrenadantes de prueba en series de diluciones semi log10. Las diluciones de los estándares fueron tales para dar un intervalo de actividad de IFN de 1 a 104 Ul/ml. La placa fue incubada toda la noche por 15 horas, el medio fue retirado, y se añadió el virus de Semliki Forest a los pocilios a un título de 100 veces el de la ID50 del cultivo de tejido. Las placas fueron incubadas por 3 días a 37 °C y luego evaluadas para viabilidad celular. Cada placa contuvo una fila de duplicados de células ya sea sin IFN o bien sin sobrenadante de prueba para servir como un control para muerte celular máxima. Los títulos de IFN fueron determinados como al concentración de IFN para proporcionar protección al 50 % de las células en relación al National Institutes of Health Standard GA02901511. Como se ilustra en la Figura 2, la adición de Cpn 10 dio como resultado un incremento en la capacidad de respuesta a la dosis significativo en la liberación de interferones de tipo I (a un máximo de 100 µg/ml de Cpn 10) en la presencia de polil :C. Los datos presentados en los Ejemplos 1 y 2 indican que la administración de Cpn 10 en el contexto de una infección viral donde los ácidos nucleicos virales pueden ser liberados, o cuando se co-administraron con un agonista de TLR3 dio como resultado la estimulación de un nivel mejorado de inmunidad anti-viral. Ejemplo 3 - Activación de NF-KB en células HEK293 que expresan a TLR7 Se investigó la efectividad de Cpn 10 humana para modular la señalización vía el receptor similar al de Toll TLR7, en la línea celular de riñon embrionario humano HEK293. Líneas celulares estables de HEK293 que expresan tanto a TLR7 como a TLR4 fueron establecidas como se describe en Latz y colaboradores, 2002 (J Biol Chem 277:47834-47843) y se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad de 2 x 104 células por pocilio. Después de desarrollar toda la noche para facilitar la determinación de la activación de NF-?B, las células fueron transitoriamente transfectadas con una construcción informadora de NF-?B-luciferasa (como para Latz y colaboradores, 2002, J. Biol Chem 277:47834-47843) , que comprende un promotor artificial compuesto de un multímero de 5 sitios NF-?B activadores de la expresión del gen de luciferasa de luciérnaga, junto con el gen informador de luciferasa de Renilla activa constitutivamente . Después de cultivo de las células toda la noche, se administró Cpn 10 humana recombinante a las células a una concentración final de 50 µg/ml ya sea sola o simultáneamente con uno de los siguientes agonistas selectivos de TLR7 , Resiquimod R949, un oligonucleótido de CpG fosfotioato (MWG Biotech) (agonista selectivo de TLR9) , el lipopolisacárido (LPS) agonista selectivo de TLR4 o el activador de la proteína quinasa C, 12-miristato 13- acetato (PMA) de forbol (PMA, phorbol 12-Myristate 13 - Acétate), a manera de un control. La activación de NF-?B se determinó entonces y se cuantificó 5 horas post estimulación por medición de la actividad luciferasa usando el Sistema Informador de Ensayo de Luciferasa-Dual conforme a las instrucciones del fabricante (Promega, Madison Wl) y un luminómetro lector de placas (Perkin-Elmer) . Los resultados, expresados como las veces de activación de NF-?B se muestran en la Figura 3. En la ausencia de estimulación (medio solo) la activación de NF-?B no fue inducida. En contraste, el agonista selectivo de TLR7, R848 a concentraciones que variaron desde 0.32 a 40 µM indujeron más de 5 veces la activación de NF-?B vía TLR7. No obstante en la presencia de 50 µg/ml de Cpn 10, esta activación se redujo en aproximadamente 2 veces. Ejemplo 4 - Activación de NF-KB en células HEK293 que expresan a TLR9 Se investigó la efectividad de Cpn 10 humana para modular la señalización vía el receptor similar al de Toll TLR9 en células HEK293. Se efectuaron ensayos como se describe en el Ejemplo 3. Se condujeron ensayos sobre dos clones independientes de células HEK293 transfectadas establemente que expresan a TLR9. Se muestran los resultados en las Figuras 4A-B. En la ausencia de estimulación (medio solo) no se indujo la actividad de NF-KB. NO obstante la activación de HEK-TLR9 con ADN de CpG a concentraciones que variaron de 0.08 a 10 µM indujeron hasta aproximadamente 33 veces la activación de NF-?B. Esta se redujo en la presencia de 50 µg/ml de Cpn 10 en 5 a 10 veces. Para investigar adicionalmente el efecto de Cpn sobre la capacidad de respuesta de células HEK293 que expresan a TLR9 a ADN de CpG, se efectuaron experimentos similares a los descritos anteriormente usando concentraciones variables de Cpn 10 - 12.5 8/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml y 100 µg/ml (ver Figuras 5A-B) . Estos resultados confirman el efecto mediado por Cpn 10 observado anteriormente (Figuras 4A-B) e ilustra la capacidad de respuesta a la dosis del efecto mediado por Cpn 10 sobre la señalización de TLR9.

Ejemplo 5 - Liberación de citoquina a partir de células mononucleares de sangre periférica humana. Para determinar la habilidad de Cpn 10 para modular la liberación de citoquina en células humanas primarias se usaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) aisladas de donadores voluntarios saludables. Las PBMCs fueron aisladas de sangre heparinizada por centrifugación con gradiente de densidad ascendente como se describió en Johnson y colaboradores, 2005 (J Biol Chem 280: 4037-4047). La mitad de las PBMCs aisladas fueron tratadas para remover células dentríticas plasmacitoides (PDCs) a partir de la población celular usando columnas anti-BDCS-2APC (Miltenyi) como se describe en Latz y colaboradores, 2004 (Nature Immunol 5:190-198). Las PDCs son la fuente primaria del interferon de tipo I IFNa en la población de PBMC. Las PDCs son conocidas por expresar a TLR7 y a TLR9 y son el tipo celular crítico para el reconocimiento de ácidos nucleicos de una sola hebra. Tanto las PBMC que contienen PDCs como las PBMC agotadas de PDCs, las células fueron sembradas en placas de 96 pocilios a 105 células viables por ml en 200 µl y fueron cultivadas como se describe en Johnson y colaboradores, 2005 (J Biol Chem 280:4037-4047). Resumiendo, Cpn 10 fue añadida a una concentración final de 1 µg/ml, 10 µg/ml o 50 µg/ml y las placas se incubaron por 1 hora antes de que fuera añadida LPS (no purificada o re-purificada) . Las células fueron entonces incubadas por 20 horas adicionales a 37 °C y C02 al 5 %. Los sobrenadantes fueron colectados y analizados para producción de la citoquina pro-inflamatoria TNF-a (Figuras 6A-B) y la citoquina anti-inflamatoria IL-10 (Figura 7A-B) usando ELISAs específicas de conformidad con las instrucciones del fabricante (R & D Systems, Inc. Minneapolis, MN) . Como se muestra en las Figuras 6 y 7, ni el medio solo ni Cpn 10 indujeron la producción de TNF-a o de IL-10 en la ausencia de LPS. La adición de LPS re-purificada (desde 0.01 a 10 ng/ml) a cultivos intactos de PBMC dio como resultado la producción de TNF-a que de capacidad de respuesta a la dosis decreciente (máximo 32 %) en la presencia de hasta 10 µg/ml de Cpn 10 (Figura 6A) . No obstante en PBMC agotada de PDCs, la influencia de Cpn 10 sobre la producción de TNF-a se perdió (Figura 6B) . Así, el efecto de Cpn 10 sobre la producción inducida por LPS de TNF-a requiere la presencia de PDCs y es cancelada en su ausencia. Este hallazgo es algo sorprendente cuando PDCs no expresa a TLR4 y por consiguiente no responde a la estimulación con LPS, sugiriendo así que el efecto modulador de Cpn 10 sobre la señalización directa de TLR4 puede ser indirecto. En el caso de IL-10 (Figura 7A-B) , los sobrenadantes de PBMC demostraron que aumentan la producción de IL-10 en la presencia de Cpn 10, aunque los sobrenadantes de PBMC agotados de PDCs demostraron un mayor aumento en la capacidad de respuesta a la dosis (hasta 10 µg/ml de Cpn 10) en la producción de IL-10 (Figura 7B) que la observada en PBMC intacta con PDCs (Figura 7A) . Ejemplo 6 - Modulación por Cpn 10 de la activación de TLR3 Se realizó este estudio para determinar si Cpn 10 regula de manera diferencial la respuesta a la ligación de TLR3 versus otros TLRs, lo cual puede indicar un objetivo de interacción molecular. La estimulación de TLRs por agonistas específicos, inicia la activación de dos trayectorias de señalización corriente abajo, ya sea dependiente de MyD88 o bien independientemente de MyD88 es una molécula adaptadora común a todos los TLRs, excepto para TLR3. La función de esta molécula es reclutar quinasa asociada a IL-IR (IRAK) y factor 6 asociado a TNFR (TRAF6) juntos para activar el complejo quinasa I?B (IKK)aß?, el cual luego fosforila a I?Ba, que conduce a translocación nuclear y a enlace de ADN de NF-?B. La activación independiente de MyD88 de TLRs involucra la activación del adaptador que contiene el dominio Toll/IL-IR que induce a IFN-ß (TRIF) . Esto da como resultado la activación retardada de NF-?B, y del factor 3 regulador de IFN (IRF3) el cual provoca la producción de IFN-ß y la expresión de genes inducibles por IFN. La ligación de TLR3 primeramente activa la trayectoria de TRIF, mientras que TLR4 activa tanto la trayectoria de MyD88 como la dependiente de TRIF. Uno de los objetivos de este estudio fue determinar si Cpn 10 podía regular las dinámicas de la respuesta debida a la activación de TLR3 versus otros TLRs, y proporcionar así alguna información sobre el objetivo y modo de acción de Cpn 10. 6.1. Materiales Generales Se usaron Cpn 10 lote CH003 y GroES con y sin LPS (Sigma) y Poli(I:C) (Invivogen). Las líneas celulares usadas incluyeron RAW264-pNifty2-LUC y RAW264.7. 6.2.Resultados 6.2.1. Cpn 10 no inhibe la activación de NF-KB a través de TLR3 La línea celular similar a la de macrófago de ratón RAW264.7 fue transfectada establemente con un plásmido activado por el promotor ELAMI (RAW264-pNifty2-LUC) . El promotor ELAMI es proximal a cinco sitios de NF-?B y activa la expresión de un gen informador de luciferasa en respuesta a la translocación nuclear y activación del factor de transcripción de NF-?B en células. Como se muestra en la Figura 8, la presencia de un amplio intervalo de concentración de Cpn 10 no alteró las dinámicas de activación de NF-?B inducida por TLR3 en células RAW264-pNifty2-LUC estimulada con poli(I:C). Poli(I:C) es un análogo sintético de ARN de doble hebra, un patrón molecular asociado con infección por virus que activa NF-?B vía interacción con TLR3. 6.2.2.La capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 incrementa la producción de IFNs de tipo I en respuesta a la ligación de TLR3 y TLR4 Se pre-incubaron células RAW264.7 por 2 horas con Cpn 10 luego fueron estimuladas con LPS o Poli(I:C) por 24 horas. En este punto el sobrenadante de cultivo celular fue colectado y analizado para actividad antiviral de IFNa/ß usando el bioensayo de reducción del efecto citopático como se describió previamente (Hamilton y colaboradores, (1996) J Immunol 156 (7 ) : 2553) . Como se muestra en la Figura 9 posterior, la estimulación a través ya sea t TLR4 (LPS) o TLR3[Poli (I : C) ] por 24 horas en la presencia de Cpn 10 conduce a una sobre-regulación de IFNs de tipo I. Células RAW264.7 fueron entonces sembradas a 2.5 x l?Vml en placas de 34 pocilios estériles y se dejaron adherir por 16-20 horas. Las células fueron pre-incubadas en la presencia de una titulación de Cpn 10 estimulada con LPS (TLR2/4) o Poli(I:C) por 4 o 6 horas. Los lisados celulares fueron colectados y ya sea congelados a - 70 °C o bien procesados inmediatamente para aislamiento de mARN directo usando Dynabeads . El mARN fue transcrito inversamente con cebadores oligo (dT) y el Superscript III First-Strand Synthesis System para RT-PCR. Los cADN resultantes fueron amplificados en un PCR con cebadores específicos de IFNß de ratón. Para verificar que cantidades equivalentes de patrón fueron añadidas a cada reacción y para confirmar la amplificación uniforme, GAPDH (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa) fue transcrita y amplificada para cada muestra. Los productos de PCR fueron separados sobre gel de agarosa y se visualizaron después de tinción con bromuro de etidio como se muestra en la Figura 10. Además de los datos de la línea celular de macrófago de ratón RAW264.7, se demostró también que PBMC humano estimulado con Poli(I:C) mostró producción creciente de IFN de tipo I (IFN-a) en la presencia de Cpn 10, como se muestra en la Figura 11. 6.2.3. GroES, el homólogo de E. coli de Cpn 10, no puede aumentar la producción de IFN-ß inducida por Poli(I:C) A fin de determinar la especificidad del incremento mediado por Cpn 10 en la producción de IFN-ß inducida por Poli(I:C), el homólogo de Cpn 10 de E. coli , GroES, fue probado. Como se muestra en la Figura 12. GroES no moduló la producción de IFN-ß inducida por Poli(I:C) a través de TLR3. 6...2. . Pre-incubación de con Cpn 10 seguida por un lavado anula el aumento de la capacidad de respuesta a la dosis en la producción de IFN-ß inducida por Poli(I:C) En ensayos de estimulación con LPS, la preincubación con Cpn 10 seguida por un lavado con PBS antes de la adición de LPS no impactó la habilidad de Cpn 10 para modular la activación de NF-?B. No obstante, en el ensayo con Poli(I:C), la pre-incubación de células RAW264 con Cpn 10 seguida por un lavado con PBS redujo dramáticamente el aumento de la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 en la producción de IFN-ß con estimulación con Poli(I:C) como se muestra en la Figura 13. 6.2.5. Modulación por Cpn 10 de una respuesta inducida por LPS o por Poli(I:C) requiere retroalimentación positiva de la trayectoria del interferon de tipo I Ratones con una mutación nuil en el IFNAR1 (receptor 1 asociado con interferón) el componente del receptor de IFN de tipo 1 está caracterizado por una carencia completa de respuestas antivirales correspondientes a susceptibilidad creciente a infección viral y a pérdida de respuestas anti-proliferativas a IFNa/ß (Hwang y colaboradores, (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:11284). Ratones deficientes en IFNAR1/- tienen una ausencia de actividad IFN constitutiva y anormalidades en las proporciones y respuestas de células hematopoyéticas, incluyendo macrófagos. Se efectuó una evaluación ex vivo del involucramiento de Cpn 10 en una respuesta "cebada" con IFN usando macrófagos derivados de médula ósea (BMMs) aislados de ratones IFNAR1-/- o de tipo salvaje (wt) . Las BMMs fueron aisladas y activadas con un panel de agonistas de TLR, Poli(I:C) - TLR3 o LPS -TLR4 ) en la presencia de una titulación de dosis de Cpn 10. Los sobrenadantes fueron colectados después de 24 horas y se analizaron los niveles de citoquina usando un equipo para ELISA de IFNß de ratón y CBA para Inflamación de Ratón BD. Los resultados de estos ensayos indican que una respuesta de retroalimentación positiva a través del receptor de IFNAR1 es necesaria para la modulación de Cpn 10 tanto de la producción de IFNß inducida por Poli(I:C) como de la producción de TNFa inducida por LPS (Figura 15) .

Estos datos, que vinculan la trayectoria de retroalimentación de IFN a la actividad mediada por Cpn, fueron corroborados adicionalmente con resultados in vivo de un estudio de endotoxemia de ratón. En este modelo de sepsis de roedor, los ratones fueron pretratados por 30 minutos con 100 µg de Cpn 10 vía administración i.v. antes de inyección i.v. de 10 µg de LPS. Se colectó el suero después de 1.5 horas y se analizó para producción de citoquina pro-inflamatoria usando CBA para Inflamación de Ratón BD y ELISA para IFNß. Una reducción significativa (p < 0.05) en los niveles de TNFa en suero en ratón co-tratado con Cpn 10 se correlacionó con una disminución significativa (p<0.01) en los niveles de IFNß en suero como se muestra en la Figura 16B. 6.3. Discusión y Conclusiones Al menos una excepción al patrón de modulación de NF-?B mediada por Cpn 10 involucra la activación de células por el ligando de TLR3 Poli(I:C). En este sistema de TLR3, se encontró que Cpn 10 no tiene efecto sobre la activación de NF-?B en respuesta a la estimulación de células con Poli(I:C). Además, se encontró que Cpn 10 induce un incremento sinérgico en la producción de interferones de tipo I en respuesta a Poli(I-.C). Una explicación para esta anomalía aparente es que Cpn 10 participa en la modulación de un cebador o respuesta en circuito de retro-alimentación. Por ejemplo, se ha mostrado que interferones de tipo 1 desempeñan papeles importantes en la respuesta regulada por LPS ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de SOCS1) . Este es un desarrollo significativo en el entendimiento de los mecanismos de acción de Cpn 10 porque sugiere que Cpn 10 activa la sub-regulación de citoquinas pro-inflamatorias tales como TNFa por humedecimiento del cebador celular inicial por IFN de tipo I. Ejemplo 7 - Modulación por Cpn 10 de la infección por el Virus de Semliki Forest (SFV) en ratones Esta serie de estudios fue realizada para determinar si la administración de Cpn 10 afectó la letabilidad del Virus de Semliki Forrest (SFV) en un modelo de ratón, y si Cpn modula la producción de IFN de tipo I en respuesta a la activación de TLR. El modelo in vivo involucró una infección generalizada del Virus de Semliki Forest (SFV) por determinación inicial de modulación de la actividad antiviral de IFNs de tipo I. El modelo puede ser realizado en ratones neonatos donde todos los órganos incluyendo el cerebro están infectados, causando letalidad en 4 - 6 días dependiendo de la dosis, y por consiguiente tiene la ventaja de sensibilidad y agudeza de infección. Alternativamente el modelo puede ser probado en ratones adultos que son menos susceptibles al virus, debido al tipo de producción de IFN de tipo I. Se entiende que la producción de IFN en las primeras 24 - 48 horas después de infección por el virus da como resultado la disminución de los títulos virales. Este modelo es manejable para análisis de respuestas "crónicas" incluyendo análisis de suero y de respuestas inmunes. El estudio in vi tro incluyó una serie de ensayos para probar el efecto de cebado de macrófagos sobre la modulación de Cpn 10 de la producción de citoquinas en respuesta a la activación por TLR, incluyendo la comparación de macrófagos de médula ósea aislados recientemente a partir de ratones deficientes en IFNAR1 y WT. 7.1. Materiales y Métodos Se usó el lote CH003 de Cpn 10 a 5.0 mg/ml en 50 mM de Tris, y 150 mM de NaCl con endotoxina < 0.01 UE/ml. El regulador de la formulación diluyente comprendió 50 mM de Tris y 150 mM de NaCl. Pam3Cys y Poli(I:C) fueron de Invivogen. Los ratones fueron C57BL/6. Para el estudio in vivo, se realizó un pre-estudio que involucra la titulación viral en ratones para adaptar el lote viral apropiado y las dosificaciones. Para el estudio completo se usaron 10 a 13 ratones por grupo con 3 grupos de ratones por dosis de virus. Los grupos fueron tratados como sigue: (A) virus solamente; (B) irus más concentrado A de Cpn 10; (C) virus + concentrado B de Cpn 10. Se inyectaron i.p. ratones neonatos de aproximadamente 6 a 9 días de edad con Cpn 10 (o formulación reguladora) y SFV y se mantuvieron con sus madres. Además, ratones adultos (deficientes en wt y IFNAR) de 6 a 8 semanas de edad fueron inyectados i.p. con SFV, con Cpn 10 administrada cada 12 horas durante la primera semana de infección viral, y a dosis como se determinó Para el estudio in vi tro, el efecto del macrófago cebador sobre la modulación de Cpn 10 de la producción de citoquina en respuesta a la activación por TLR y se compararon con la de macrófagos deficientes en WT e IFNAR. Macrófagos derivados de médula ósea (BMM) provenientes de ratones deficientes en WT e IFNAR fueron tratados con los agonistas de TLR: pam3cys (TLR2) , poli (I:C) (TLR3) , y LPS(TLR) durante un intervalo de dosis de Cpn 10. 7.2. Resultados Los datos del estudio de infección viral en neonatos in vivo demostraron un incremento significativo en la supervivencia de ratones infectados con SFV tratados con Cpn 10. Los grupos siguientes de ratones C57BL/6 neonatos de 6 a 9 días de edad comprendidos en el estudio: Grupo A: SFV (n = 13); Grupo B: SFV + 20 µg de Cpn 10 (n = 13); Grupo C: SFV + 50 µg de Cpn 10 (n = 13) . A los grupos B y C se les inyectó i.p. con 20 y 50 µg de Cpn 10, seguido por (3 horas después) inyección de 50 µl de SFV (30 x TCID50) . A los tres grupos. Los ratones fueron alojados con sus madres y manejados cuidadosamente en el transcurso del experimento. Los cachorros fueron cuidadosamente monitoreados a intervalos regulares (12 / 24 horas) para señales estándares del status de salud incluyendo movilidad, condición, conducta, etc. A 72 horas 54 % y 69 % de los ratones tratados con 20 y 50 µg de Cpn 10 estuvieron aliviados, en comparación con el 15 % de supervivencia en los ratones sin tratar (Figura 17) . También se hace notar que ratones en el grupo de dosis máxima estuvieron moviéndose alrededor, aunque los otros dos grupos estuvieran muy enfermos y se colocaron sobre sus lados. En 84 horas todos los ratones tratados con SFV solamente sucumbieron al virus, mientras que 31 % de los grupos B y C vivieron. 7.3. Discusión y conclusiones La administración de Cpn 10 prolongó la supervivencia después de infección viral en una manera dependiente de la dosis, como se ve en los datos a 72 horas. A 96 horas post-infección, 18 % de los ratones inyectados con Cpn 10 sobrevivieron, mientras que todos los ratones sin tratar fueron muertos a 88 horas post-infección. La supervivencia de 50 % y 70 % de los ratones a 72 horas post-infección en los dos grupos tratados con Cpn, versus 18 % en el grupo sin tratar, fue significativa dada la dosis masiva de virus administrado. Fue también notable que estos resultados se obtuvieran después de una administración única de Cpn 10. Esta dosis sugiere la inducción de protección antiviral por Cpn 10.

Ejemplo 8 - Cpn 10 se asocia con el aglomerado del receptor de LPS independiente de CDl4 La membrana plasmática de células está compuesta de heterogeneidades laterales, parches y micro-dominios. Estos micro-dominios de membrana o lípidos flotantes son enriquecidos en glicoesfingolípidos y colesterol y han sido implicados en procesos celulares tales como de tipo membrana y de transducción de señal. Los inventores propusieron que Cpn 10 puede localizar la capa flotante de lípidos durante la aglomeración de la señal de LPS por enlace ya sea directamente a TLR4 o a uno de los otros participantes del aglomerado para interrumpir la señalización. 8.1. Materiales y Métodos Mareaje celular por FRET. Se marcaron células MonoMac 6 (una línea celular monocítica humana) con 100 µl de una mezcla de anticuerpo conjugado donador (Cy3) y anticuerpo conjugado receptor (Cy5) . Para el mareaje de Cpn 10, se usó un anticuerpo policlonal de conejo anti-Cpn 10. Las células fueron enjuagadas dos veces en PBS/0.02 % de BSA, antes de fijación con formaldehido al 4 % por 15 minutos. Las células fueron fijadas a fin de prevenir la re-organización potencial de la proteína durante el transcurso del experimento. Formación de imágenes homo focales . Las células fueron transformadas en imágenes e un microscopio homofocal de Cari Zeiss, Inc. LSM510 (con un microscopio fluorescente Axiovert 200) usando un objetivo de 1.4 NA 63x Zeiss. Las imágenes fueron analizadas usando el programa de análisis de imágenes LSM 2.5 (Cari Zeiss, Inc.) . Cy3 y Cy5 fueron detectados usando los ajustes de filtro apropiados. Usando los tiempos de exposición típicos para la adquisición de imágenes (menos de 5 s), no se observó fluorescencia desde un espécimen marcado con Cy3 usando el grupo de filtros para Cy5, ni se detectó fluorescencia de Cy5 usando el grupo de filtros para Cy3. Mediciones por FKET. FRET es una técnica de formación de imágenes no invasora usada para determinar la proximidad molecular. FRET puede tener lugar sobre distancias de 1 - 10 nm, y efectivamente incrementa la resolución de microscopio óptico al nivel molecular. Involucra la transferencia no radioactiva de energía desde el estado excitado de una molécula donadora a un receptor apropiado (Wu y Brand (1994) Anal Biochem 218: 1-13) . La velocidad de transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia, entre donador y receptor (Kenworthy y Edidin (1998) Journal of Cell Biology 142:69-84; Kenworthy y Edidin (1998) en Gelb, M.H. (Ed.) Methods in Molecular Biology. Human Press Inc., Totowa, NJ pág. 37-49) . La eficiencia de la transferencia de energía (E) es definida con respecto a r y R0, la distancia de Forster característica por: E = l/[l+(r/R0)6][l] En el presente estudio, FRET fue medido usando un método como se describió previamente (Kenworthy y Edidin (1998) Journal of Cell Biology 142: 69-84; Kenworthy y Edidin (1998) en Gelb, M. H. (Ed.) Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc., Totowa, NJ pág. 37-49). Abreviando, se marcaron muestras con anticuerpos conjugados donador y receptor, y se detectó la transferencia de energía como un incremento en la fluorescencia del donador (des-extinguida) después de fotodecoloración completa de la molécula receptora. Las células marcadas solamente con la sonda 26ic-Cy3 fueron usadas a fin de determinar el tiempo mínimo requerido para decolorar Cy3. Cy3 fue decolorado por excitación continua con una lámpara de arco usando un conjunto de filtros para Cy3 por 5 minutos. Bajo estas condiciones, Cy5 no fue decolorado. Las imágenes de FRET fueron calculadas a partir del incremento en la fluorescencia del donador después de fotodecoloración del receptor por: E ( % ) xl 00 = 10 , 000x[ ( Cy3post-decoloración-Cy3pre-decoloración ) /Cy3post- decoloraciónj L¿-J El factor de escala de 10,000 se usó a fin de expandir E a la escala de imágenes de 12 bits. 8.2.Resultados y discusión En el primer grupo de datos mostrados en la Tabla 1, se usó FRET para determinar la concentración de moléculas receptoras involucradas en la activación celular inducida por LPS (células MonoMac6) en lípidos flotantes. Al efectuar los experimentos de FRET, fue posible investigar si Cpn 10 (lote P003-04 o CH003), Hsp60, GroES de E . coli y otras moléculas fueron co-localizadas con lípidos flotantes, Se midió FRET en términos de fluorescencia del donador des-extinguida después de fotodecoloración completa del fluoróforo donador. La fluorescencia creciente del donador después de destrucción del receptor indicó que la fluorescencia del donador fue extinguida en la presencia del receptor a causa de la transferencia de energía. La eficiencia de la transferencia de energía en el sistema fue probada usando un control positivo, esto es, la transferencia entre mAbs a diferentes epítopes sobre moléculas de GM1 (gangliosida, una molécula asociada a la capa flotante) , que mostraron que la eficiencia de transferencia de energía máxima E (%) fue de 37 ± 1.0. Se usó también un control negativo entre FITC-GM1 y rodamina-MHC, lo cual no reveló ninguna transferencia de energía significativa (3 ± 0.4). Este valor de FRET de fondo se piensa que es causado por FRET aleatorio cuando ambas especies están presentes a concentraciones altas Tabla 1. Valores de Eficiencia de Transferencia de Energia entre pares de donador-receptor .

Donador (Cy3) Receptor (Cy5) E ± ?E (% Células MM6 sin estimular GM1 GM1 37 ± 1. GM1 MHC de clase 1 3 ± 0.4 GM1 CD14 34 ± 2.0 GM1 TLR4 5 ± 1.5 GM1 HspdO 6 ± 0.5 GM1 GroES 7 ± 1.5 GM1 Cpn 10 15 ± 2 Células MM6 estimuladas con LPS GM1 MHC de clase 1 3 ± 0.5 GM1 CD14 35 ± 1.5 GM1 TLR4 32 ± 1.8 GM1 Hsp60 8 ± 2.0 GM1 GroES 6 ± 1.0 GM1 CpnlO 28 ± 2.0 La transferencia de energía entre diferentes pares se detectó a partir del incremento en la fluorescencia del donador después de fotodecoloración del receptor. Los datos representan la media ± desviación estándar de un número de experimentos independientes. Los datos presentados en la Tabla 1 demuestran que CD14 reside en la capa flotante de lípidos, pero no se encontró que TLR4 esté asociado con la capa lipídica flotante antes de estimulación con LPS, y aparentemente es reclutado ahí después de estimulación con LPS. El siguiente grupo de datos describe la proximidad de Cpn 10 al aglomerado de TLR4, ptra vez, usando FRET.

En la Tabla 2, el control positivo fue TLR4 consigo mismos, y dio una eficiencia de transferencia de energía máxima (% de E) de 36 ± 2.0.

Tabla 2. Valores de Eficiencia de Transferencia de Energia entre pares de donador-receptor .

Donador (Cy31 Receptor (Cy5) E ± ?E (%) Células MM6 sin estimular TLR6 TLR4 36 ± 2.0 Cpn 10 CD14 12 ± 0.5 Cpn 10 Hsp70 9 ± 1.0 Cpn 10 Hsp90 6 ± 2.0 Cpn 10 CXCR4 3 ± 1.0 TLR4 Hsp60 5 ± 1.0 CD14 Hsp60 6 ± 0.5 Cpn 10 Hsp60 5 ± 2.0 GroES CD14 8 ± 1.0 GroES TLR4 7 ± 1.5 GroES Hsp70 6 ± 1.0 GroES Hsp90 7 ± 1.5 GroES CXCR4 4 ± 2.0 Células MM6 estimuladas con LPS Cpn 10 TLR4 36 Cpn 10 CD14 32 ± 5 Cpn 10 Hsp70 24 ± 1.0 Tabla 2 (Continuación) Donador (Cy3) Receptor (Cy5) E ± ?E (%) Cpn 10 Hsp 90 18 ± 12.0 Cpn 10 CXCR4 12 ± 1.0 TLR4 Hsp60 6 ± 1.0 CD14 Hsp60 4 ± 2.0 Cpn 10 Hsp60 6 ± 1.5 GroES CD14 7 ± 0.5 GroES TLR4 8 ± 1.0 GroES Hsp70 7 ± 1.5 GroES Hsp90 8 ± 2.0 GroES CXCR4 3 ± 1.0 Se detectó la transferencia de energía entre diferentes pares a partir del incremento en la fluorescencia del donador después de fotodecoloración del receptor. Los datos representan la media ± la desviación estándar de un número de experimentos independientes. Como se muestra en la Tabla 2, Cpn 10 no se asoció con Hsp70, Hsp90 o CXCR4 en ausencia de LPS, pero demostró una asociación con estos elementos del aglomerado de activación con LPS después de estimulación con LPS. Aunque los datos que demuestran si hay una asociación de Cpn 10 con TLR4 antes de estimulación con LPS no se muestran en la presente, hay una fuerte asociación de Cpn 10 con TLR4 a partir de la estimulación con LPS. Estos datos también demuestran que HspdO no se asocia con TLR4, CD14 o la capa lipídica flotante antes de o después de estimulación de las células. De manera importante, el homólogo de Cpn 10 de E. coli , GroES, el cual es rutinariamente usado como un control negativo en experimentos que prueban la actividad de Cpn 10 como un modulador de la respuesta inmune, tampoco se asocia con la capa lipídica flotante o con otros elementos del aglomerado de activación de LPS independiente de CD14. Ejemplo 9 - Cpn 10 interactúa con aglomerados de TLS y en la capa lipidica flotante en la superficie de PBMC A fin de determinar si Cpn 10 producida de manera endógena interactúa en la superficie de células PBMC con TLRs, moléculas asociadas con TLR y con componentes de micro-dominios lipidíeos, los inventores usaron un análisis de FRET usando un anticuerpo de anti- Cpn 10 marcado con fluoróforo, en respuesta a la estimulación con LPS de monocitos adherentes humanos aislados recientemente. Ya que Cpn 10 no recombinante fue añadido al cultivo celular antes de formación de imágenes, Cpn 10 reconocida en la superficie celular había sido exportada desde depósitos intracelulares. 9.1. Materiales y métodos Marcador celular por FRET. Se aislaron PBMC a partir de sangre de donadores saludables usando centrifugación con gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque y se prepararon células adherentes. Las células fueron lavadas a fin de remover células no-adherentes . Las monocapas de células adherentes remanentes (1 - 2 x 105 monocitos/pocillo) fueron cultivadas en placas de 24 pocilios en medio libre de suero Gibco) suplementado con L-glutamina al 0.01 % y 40 µg/ml de gentamicina. Una alícuota de la preparación de monocitos enriquecida fue evaluada rutinariamente para pureza por citometría de flujo (> 80 % pura) . Alternativamente, se cultivaron DC derivada de monocitos por 5 días a partir de monocitos de sangre periférica adherente enriquecida con GM-CSF e IL-4 (R & D Systems) de conformidad con el protocolo publicado (Bender, A y colaboradores 1996, J. Immunol . Methods 196:121-135) antes del ensayo de FRET. El marcado celular para análisis de FRET se efectuó esencialmente como e publicó previamente (Triantafilon, K. 2001. Nat. Immunol 2: 338-345). Se estimularon DC derivados de monocitos o de monocitos humanos aislados recientemente con 100 ng/ml de LPS (Re-LPS de S. Minnesota, List Labs, CA) , 10 ng/ml de LTA de S . aureus (de la clase regalada por Thomas Hartung, Konstanz, Alemania), 0.1 µg/ml de Poli(I:C), 20 ng/ml de imiquimod, 1 µM de ODN de CpG (Invivogen), 25 µg/ml de ssARN purificado de Coxsakievirus B3, o control con regulador por 10 minutos, se lavó, y luego se marcó con una mezcla 1:1 de anticuerpo conjugado con donador (Cy3) y anticuerpo conjugado con receptor (Cy5).Las células se fijaron entonces para prevenir la re-organización de proteínas Anticuerpos . Los anticuerpos usados en análisis de FRET incluyeron: Cpn 10 (Johnson, B. 2005 J. Biol. Chem. 280:4037-4047), Hsp70, CXCR4 , TLR3, TLR7, TLR9 (Santa Cruz), TLR2 (Genentech), Hsp90 (Bioquote) , CD14 (26ic, ATCC, del hibridoma HB246), GMl, (GM1-1, Calbiotech, GMl-2b, North Star Bioproducts, Liverpool, UK) , MHC de clase I (MCA115, Serotec), TLR4 (HTA125, HyCult). Los anticuerpos fueron marcados ya sea con Cy3 o con Cy5 usando el equipo para marcado FluoroLink (Amersham Pharmacia) . Mediciones de FRET. Cy3 fue excitada con un emisor de rayos láser de helio/neón a 543 nm, y Cy5 con un emisor de rayos láser de helio/neón a 633 nm. Las células fueron conformadas en imagen en un microscopio homofocal Cari Zeiss LSM510 META (con un microscopio fluorescente Axiovert 200) usando un objetivo dxl.4 NA 63 x Zeiss. Las imágenes fueron analizadas usando el paquete para análisis de imágenes LSM 2.5 (Cari Zeiss, Inc.) Cy3 y Cy5 fueron detectados usando el conjunto de filtros apropiado. Usando tiempos de exposición típicos para la adquisición de imágenes (menos de 5 s), no se observó fluorescencia alguna a partir del espécimen marcado con Cy3. Las bandas fueron escaneadas secuencialmente solamente con un rayo láser y el canal detector respectivo activo para exploración. Se midió FRET en términos de des-extinción de la fluorescencia del donador después de fotodecoloración completa del fluoróforo receptor. La eficiencia de transferencia de energía (E) es definida con respecto a r y a RO, la distancia de Forster característica por: E = 1/[1+ (r/R0) 6] (29). Este método de medición de FRET fue descrito previamente (30) . 9.2. Resultados Como se muestra en la Tabla 3, se encontró que Cpn 10 producida endógenamente se asocia con TLR4 y con otros elementos del complejo de señal de TL4 después de estimulación con LPS. La identificación de Cpn 10 que interactúa con porciones de de la capa lipídica flotante antes de estimulación con LPS puede indicar su liberación por células muertas, o sobre-regulación debido a manipulación física de células durante la purificación. La demostración de Cpn 10 endógena en dominios de la capa lipídica flotante sugiere su modo de liberación en la superficie celular y secreción extracelular. Tabla 3. Cpn 10 endógena se asocia con la capa lipidica flotante y elementos del complejo de señalización de TL4 sobre PBMC como se determinó por FRET Donador (Cy3) Receptor (Cy5) E ± ?E (%) Monocitos sin estimular GM1 GM-1 38 ± 1.0 MHC1 GM-1 5 + 1.5 CD14 GM-1 37 + 2.0 TLR4 GM-1 6 ± 1.0 Cpn 10 GM-1 20 ± 1.5 TLR4 TLR4 37 ± 1.0 Cpn 10 CD14 10 ± 1.2 Cpn 10 TLR4 10 ± 1.0 Cpn 10 Hsp70 9 ± 1.2 Cpn 10 Hsp90 5 ± 1.0 Cpn 10 CXCR4 4 ± 1.5 Monocitos estimulados con LPS MHC1 GM-1 4 ± 1.5 CD14 GM-1 36 ± 1.0 TLR4 GM-1 36 ± 1.2 Tabla 3 (Continuación) Donador (Cy3) Receptor (Cy5) E ± ?E (%) Cpn 10 GM-1 30 + 2.0 Cpn 10 CD14 34 ± 2.5 Cpn 10 TLR4 35 ± 1.2 Cpn 10 Hsp70 25 ± 1.0 Cpn 10 Hsp90 20 ± 2.0 Cpn 10 CXCR4 16 ± 1.0 Los datos representan la media ± la desviación estándar de varios experimentos independientes. Los inventores también buscaron determinar si Cpn 10 se asocia con otras TLRs usando el análisis de FRET y células aisladas recientemente. Se midió FRET en términos de des-extinción de la fluorescencia del donador después de fotodecoloración completa del fluoróforo receptor. Como se muestra en la Tabla 4, se observó gran desextinción entre Cpn 10 y la mayoría de TLRs (con la excepción de TLR3) localizados ambos sobre la superficie celular y en el endosoma de DV derivado de monocitos (MoDC) en la presencia, pero no la ausencia de ligando (Observe que una señal de FRET positiva con TLRs 7 y 9 sobre MoDC más probablemente indica la presencia de un pequeño número de pDC en la población de células de MoDC) . Tabla 4. Cpn 10 se asocia con TLRs en la superficie celular y en el endosoma de MoDC humano en la presencia, pero no la ausencia, de ligando, como se determinó por FRET.

Donador TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR9 (Cy3) E±?E E±?E E+?E E±?E E±?E i (%) (%) (%) (%) (%) Control neg. d±i.o 5±0.2 8±0.8 4+0.4 5+1.0 Control Pos TLR4 36±1.0a LTA 28+2.0 6±1.0 8±1.0 5+0.6 5+1.0 Poli (I:C) 9±1.2 7±1.0 8+0.5 9+2.0 8+1.0 LPS 711.0 5±1.0 32+1.5 5+0.2 4+0.5 ssARN Viral 9±1.5 12±0.8 8+0.5 20+2.0 15+1.0 Imiquimod 9±1.2 13+1.0 9+1.5 21+0.7 15+1.2 ODNN de CpG d±l.O 12+1.0 9+1.5 14+1.4 22+1.0 La transferencia de energía (E±?E (%) ) entre diferentes pares fue detectada desde el incremento en la fluorescencia del donador después de fotodecoloración del receptor. Para cada par, el donador (Cy3) fue Cpn 10, excepto en el experimento control donde el donador (Cy3 fue TLR4; el receptor (Cy5) fue el TLR. Se calculó FRET a partir del incremento en la fluorescencia del donador después de fotodecoloración del receptor por: e(%)xl00 = 10,000 [(donador post-decoloración - donador pre-decoloración) /donador post-decoloración]. Los datos representan la media ± desviación estándar de varios experimentos independientes. Ejemplo 10 - Efecto de la ligación de TLR sobre Cpn 10 Para determinar la relación entre la ligación de TLR y Cpn 10, y en particular, para probar si Cpn 10 es un regulador endógeno del sistema inmune, los inventores examinaron si Cpn 10 endógeno es inducido por células fatigadas en la forma de ligación de TLR o activación de citoquina. Los inventores también examinaron si Cpn 10 es liberada a partir de células cuando se sometieron a estímulos apropiados, y si Cpn 10 fue capaz de limitar la señal inducida por ligandos a otros TLRs. 10.1. Materiales y métodos Reactivos . Se produjo Cpn 10 recombinante humana para especificaciones de GMP por BresaGen Limited (Adela?de, Aus) esencialmente como se describió previamente (Johnson, B. 2005. J. Biol Chem 280: 4037-4047). La pureza de Cpn 10 se determinó que fue > 99 % por SDS-PAGE y mostró la misma actividad molar que GroES en un ensayo de duplicación de rodanesa mediada por GroES (Brinker, 2001. Cell 107: 223-233) (datos no mostrados).

Por análisis por FACS, se diseñó un residuo de cisteína sobre el C-terminus de Cpn 10 y se marcó con AlexFluor647 (Invitrogen) de conformidad con las instrucciones del fabricante. La contaminación por LPS de Cpn 10 se determinó por el ensayo de Endosafe (Charles River Laboratories) que fue rutinariamente < 0.2 UE/mg de proteína. Ligandos de TLR y citoquinas incluyeron: LPS de E. coli (cepa 055:B5, Sigma), LPS Ultrapure de E. coli (0111:B4 Sigma), LTA de S . aureus, LTA de B . subtilis, PGN de S . aureus, PGN de B . subtilis, pared celular de zimosano de S . cerevisae, poli(I:C), Imiquimod R837, ODN 1826 de CpG control, (todos de Invitrogen, San Diego, CA) ; IFN? recombinante de ratón, (Chemicon) , IL-lß (PeproTech), y TNF-a recombinante humana (Invivogen). Anticuerpos . Anticuerpos policlonales de conejo fueron criados contra Cpn 10 y se purificaron por afinidad en Cbio. Los Grupos Flex de Cytometric Bead Array (CBA) que reconocieron proteínas de señal fosforilada (tanto humana como de ratón) incluyendo ERK1/2 (T202/Y204), JNK1/2, (T183/Y185), p38/MAPquinasa (T180/Y182), CD14, y FcBlock (CD16/CD32) fueron de BD. Análisis de Transfección, Estimulación Celular y de Promotor. La construcción del promotor de pCAT/LUC-CPN se proporcionó por M. Ryan y N. Hoogenraad (La Trobe University, Melbourne) . Se transfectaron transitoriamente células RAW264.7 usando GeneJuice (Novagen). Después de 24 horas las células fueron cosechadas y se evaluó la viabilidad celular por exclusión de la coloración con azul de triptano. Las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios y recibieron choque térmico (43 °C por 15 minutos (media) , 30 min (moderada) , o 60 min (severa) ) seguido por la recuperación a 37 ° o estimulada después de 18 horas. Las células fueron lavadas, cosechadas en Reactivo de Lisis para Cultivo Celular (CCLR, Promega) y se midió la señal de luciferasa de luciérnaga usando el Sistema de Ensayo para Luciferasa (Promega) y el Wallac Víctor 2 Multilabel Counter (Perkin-Elmer) . PCR en Tiempo Real . Se sembraron células RAW264.7 a 2.5 x 104 /ml en placas de 24 pocilios estériles y se adhirieron por 16 - 20 horas antes de estimulación. Se ensayaron réplicas de muestras por cada condición. Se aisló mARN usando Dynabeads (Dynal) y se transcribieron de manera inversa con cebadores oligo (dT) y el Superscript III First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen). Los cADN resultantes fueron amplificados en 10 µl de reacciones de qPCR que contenía cada una 2.5 µl de un estándar de cADN diluido (20 %), 6.25 µl de Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG (Invitrogen) y 0.25 1 de cada uno de 10 µM y cebadores antisentido. Las condiciones de reacción fueron como sigue: 95 °C 2 minutos, 40 ciclos de 95 °C 10 s, 60 °C 15 s y 72 °C 20 s una etapa de fusión final 72 - 95 °C por 50 s. La reacción de qPCR fué efectuada sobre el instrumento Rotor-Gene 3000 (Corbertt Research) . Se normalizó la expresión del gen objetivo para controles internos y se analizaron como se describió previamente (Livak, K. J. , y T. D. Schmittgen, 2001, Methods 25:402-408). Cebadores: 18S en el sentido CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA (SEC ID NO: 5), 18S antisentido GCT GGA ATT ACC GCG GCT (SEC ID NO: 6); Cpn 10 en el sentido GCC GAA ACT GTA ACC AAA GG (SEC ID NO: 7=, Cpn 10 antisentido CAG GCT CAA TCT CTC CAC TC (SEC ID NO: 8) Pbgd en el sentido CCT GGT TGT TCA CTC CCT GA (SEC ID NO: 9), Pbgd antisentido CAA CAG CAT CAC AAG GGT TTT (SEC ID NO: 10) . Cuantificación de Cpn 10 endógena en sobrenadante de cultivo celular, lisados celulares y suero del paciente. Células RAW264.7 no transfectadas fueron tratadas como se describe, y se concentraron los sobrenadantes de cultivo. Se evaluaron las células para viabilidad, se conjuntaron por condición (n = 4), se compactaron por centrifugación y se resuspendieron en CCLR. Se cuantificó el contenido total de proteína celular por medio del ensayo de Bradford modificado (BioRad) . Se analizaron los niveles de Cpn 10 en sobrenadantes celulares y en extractos (25 µg por muestra) por ELISA (límite de detección 0.195 ng/ml) . El suero de sujetos de ensayo clínico fué probado a la entrada del estudio para niveles de Cpn 10 circulante por ELISA. Estos ensayos fueron conducidos de conformidad con las guías de GCP y se obtuvieron los consentimientos por escrito de cada sujeto antes de probar la muestra. Los protocolos de ensayo fueron aprobados por los comités de ética humana en centros locales . Ensayo con RAW264. 7-HIV-LTR-LUC. El ensayo con RAW264.7-HIV-LTR-LUC se efectuó esencialmente como se describió previamente (Johnson, B. 2005. J. Biol. Chem 280: 4037-4047). Se pre-incubaron las células con Cpn 10 o regulador control por 2 horas seguido por la adición de un intervalo de dosis de ligando de TLR. En cada ensayo, se probó Cpn 10 en un intervalo de concentración de 25 -100 µg/ml, y se usaron ligandos a concentraciones que provocan un corte en la curva de respuesta a la dosis, es decir LPS de E. coli a 0.2 - 5 ng/ml, LPS Ultrapure de E. coli a 5 - 10 ng/ml, LTA y PGN a 10 - 100 µg/ml, zimosano a 10 - 100 µg/ml, poli(I:C) a 10 - 100 µg/ml, imiquimod a 1 - 10 µg/ml y ODN de CpG a 325 - 16.25 µg/ml. Los tiempos de incubación con cada agonista fueron optimizados para asegurar suficiente señal sobre el fondo. Como un control negativo para Cpn 10 humano, el homólogo de Cpn 10 de E. coli, denominado GroES se usado rutinariamente (esencialmente purificado como se describió previamente (Brinker, 2001. Cell 107:223-233)). Observe que el nivel de contaminación con endotoxinas en las preparaciones Cpn 10 y GroES y en reactivos del ligando de TLR se sabe que con inferiores al nivel mostrado previamente para inducir la activación de HIV-LTR a la concentración usada en estos ensayos con esta línea celular (Johnson, B. J. Biol. Chem. 280:4037-4047). Ensayos con citoquina de PBMC humana . Se aislaron PBMC humanas de sangre de voluntarios saludables por centrifugación con gradiente de densidad flotante sobre Placas Ficoll-Plus (Amersham Bioscience. Se pre-trataron PBMC con Cpn 10 (o control con regulador) por 1 hora, seguido por estimulación con agonista por 20 horas a 37 °C y C02 al 5 % antes de la recolección de los sobrenadantes del cultivo. Se analizaron los niveles de citoquina usando CBA (BD) o ELISA (Bender MedSystems) . Detección de la fosforilación de proteínas . Se incubaron RAW264.7 o PBMCs con Cpn 10 por 2 horas seguido por estimulación con LPS por 30 minutos, se centrifugaron y compactaron lisados con SDS al 1 % en PBS. Se hirvieron los lisados por 5 horas, se enfriaron, se compactaron los residuos celulares por centrifugación, y los sobrenadantes se ensayaron para concentración de proteínas como se hizo anteriormente. Las proteínas de señal fosforiladas fueron detectadas usando equipos BD CBA Flex para p38, ERK1/2 y JNK1/2. De manera alternativa, RAW264.7 fueron tratadas con Cytifix Cytoderm (BD) y teñido dual para p38 y CD14 de superficie celular. Las muestras fueron analizadas usando el Bioanalizador BD FACSArray con programa de red FCAP. Análisis Estadístico. Los cambios en la actividad del promotor después de estimulación celular fueron evaluados usando un ANOVA unidireccional y la Prueba de Comparación Múltiple de Tukey que compara condiciones sin estimula con estimuladas a concentraciones de agonista óptimas. Cpn 10 en muestras de suero de sujetos fueron probadas para significado entre grupos usando ANOVA unidireccional y la Post-Prueba por Comparación Múltiple de Tukey. 10.2. Resultados 10.2.1. La ligación de TLR induce al promotor de TLR Se transfectaron células RAW264.7 con una construcción informadora donde la producción de luciferasa estuvo bajo el control del promotor de Cpn 10. IFB?, TNF-a e IL-lß recombinantes purificados, fueron probados como agonistas no-TLR. Las células tratadas con choque térmico moderado (43 °C, 30 minutos) demostraron inducción significativa del promotor de Cpn 10 en el punto de tiempo de recuperación de 6 horas, con regreso al nivel basal en 18 horas (Figura 18A) . Se estableció entonces que agonistas de TLR indujeron independientemente de la dosis al promotor de Cpn 10, con activación máxima observada después de 20 horas (Figura 18A y 19C) . Las concentraciones de agonista fueron entonces optimizadas para inducir respuesta de promotor máxima (Figura 18B-G) . La comparación de respuestas con agonistas de TLR y no de TLR demostró un perfil distinto de actividad promotora de Cpn 10 (Figura 18H) . Se observó una sobre-regulación significativa de Cpn 10 en respuesta a ligandos de TLR 2, 7, y 9, lo que sugiere una correlación con la trayectoria de señalización de TLR dependiente de MyS88. No se observó ninguna sobre-regulación significativa del promotor de Cpn 10 usando ligandos de TLR los cuales pueden utilizar la trayectoria de señalización dependiente de TRIF (TLR3 y 4). Además, los agonistas no de TLR IFN?, IL-lß y TNF-a no inducen sobre-regulación sustancial del promotor de Cpn 10, indicando un cierto grado de especificidad en el control transcripcional de Cpn 10. Como otra demostración de la transcripción de Cpn 10 inducida por TLR, el análisis de PCR en tiempo real se usó para mostrar que la estimulación con LTA de células RAW264.7 da como resultado la inducción dependiente de la concentración de mARN de Cpn 10, con inducción máxima a 18 horas y retorno a cerca del nivel de la línea base en 24 horas post estimulación (Figura 181) . 10.2.2. Cpn 10 es liberada desde células después de ligación con TLR Para examinar si Cpn 10 es liberada desde células cuando son sometidas al estímulo apropiado, los inventores estimularon células RAW264.7 con LTA y monitorearon por ELISA la presencia de Cpn 10 endógena, y Cpn 10 liberada por células en el medio de cultivo. El análisis de lisados celulares reveló poco cambio en los niveles de Cpn 10 intracelular a partir de células control y tratadas con LTA (Figura 19A) . El análisis de los sobrenadantes de cultivo, sin embargo, reveló un incremento de 3 veces en Cpn 10 soluble después de 30 horas (Figura 19B) sobre células control sin estimular. Además, niveles de Cpn 10 extracelular producidos por células estimuladas se correlacionaron con el incremento visto en la actividad promotora de Cpn 10 durante el tiempo (Figura 19C) . Estos datos indican que una proporción de Cpn 10 recientemente sintetizado bajo condiciones de estimulación inmune es liberada por células. El análisis de sobrenadantes de cultivo de células (ya sea células RAW264.7 o RAW264.7 transfectadas en pCAT/LUC-CPN) expuestas a choque térmico (HS, Heat shock) ligero, moderado o severo demostró poca acumulación de Cpn 10 extracelular en comparación con sobrenadantes de células estimuladas con LTA (Figura 19D) . Estos datos sugieren que Cpn 10 es inducida por HS para ayudar al desdoblamiento de la proteína mitocóndrica aunque la estimulación inmune específica conduce a la acumulación extracelular de Cpn 10. A fin de aumentar la evidencia de que Cpn 10 puede ser regulada en enfermedades, los inventores probaron niveles séricos de referencia de Cpn 10 en pacientes que sufren de enfermedades inflamatorias crónicas y se compararon estos con una corte de voluntarios saludables. Como se muestra en la Figura 19E, niveles circulantes de Cpn 10 en pacientes con artritis reumatoide fueron significativamente más altos que en pacientes con esclerosis múltiple, psoriasis o en sujetos saludables (1.32 ng/ml ± 1.41, n = 23, 0.44 ng/ml ± 0.46, n = 46; 0.55 ng/ml ± 0.52, n = 25; 0.45 ng/ml ± 0.32, n = 24, respectivamente) . Por consiguiente, los niveles séricos respectivos de Cpn 10 pueden correlacionarse con inflamación en proceso en un individuo y/o nivel de enfermedad. Si debido a la liberación pasiva después de lisis celular o liberación estimulada después de estimulación celular inmune durante la estimulación inflamatoria, es claro que Cpn 10 se acumula en el medio extracelular, y que su exportación es mejorada con ciertos estímulos celulares. 10.2.3. Cpn 10 limita las dinámicas de señalización de TLR Los inventores examinaron si Cpn 10 recombinante fue capaz de limitar la señal inducida por ligandos a otros receptores similar al de Toll. La pre-incubación de esta línea celular informadora con una concentración óptima de Cpn 10 por 2 horas antes de estimulación con una variedad de ligandos de TLR, que varía desde péptidoglicanos bacterianos Gram positivos (PGN) y ácidos lipoteicoicos (LTA) a motivos de ADN y ARN sintéticos, dieron como resultado reducciones significativas en la actividad luciferasa inducida por NF-?B en comparación con células estimuladas en la ausencia de Cpn 10 exógeno.

Con la excepción del ácido poli-inosinpolicitidílico (poli(I:C)), ligando de TLR3 sintético, la presencia de Cpn 10 en cultivos celulares estimulados con todos los otros ligandos de TLR probados dieron como resultado 20 -80 % de inhibición de actividad luciferasa (Figura 20A) . Estos resultados indican que Cpn 10 es capaz de modular la potencia de la señal de la respuesta inmune generada por ligandos a la mayoría de los TLRs. La estimulación de células con LPS activa tanto cascadas de señalización independiente de cómo dependientes de MyD88. La cascada dependiente de MyD88 es compartida por todos los TLRs con la excepción de TLR3, e involucra NF-?B y las quinasas (MAPK) de proteínas derivada de mitógeno (MAP), que incluyen p38, quinasa regulada por señal extracelular (ERK) , y la quinasa (JNK) N-terminal de c-Jun. Ambas de estas trayectorias culminan en la regulación de la iniciación y dinámicas de una respuesta inmune. A fin de elucidar los eventos por los cuales Cpn 10 regula tanto la activación de NF-?B como la producción de citoquina después de estimulación de las células, los inventores analizaron los niveles de fosforilación de proteínas claves involucradas en la trayectoria de la señal de quinasa de MAP. Como se muestra en las Figuras 20B-D, la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 redujo el nivel de fosforilación inducida por LPS de p38, ERK1/2 y JNK1/2 en ambas, una línea celular de macrófago de ratón (RAW264.7) y en PBMC humana recientemente aisladas. Puesto que la activación de la trayectoria de MAPK está estrechamente vinculada con la inducción de la cascada inflamatoria de producción de citoquina, estos datos demostraron que cambios mediados por Cpn 10 en la producción de citoquina inducida por ligando resultan de la cascada de señal de TLR.

Para confirmar la actividad de Cpn 10 sobre la producción de citoquinas por medio de células humanas recientemente aisladas estimuladas con una variedad de ligandos de TLR, los inventores pre-trataron PBMC de donadores saludables con o sin Cpn 10 por 1 hora y luego los estimularon con un intervalo seleccionado de ligandos de TLR por 20 horas. Los niveles de citoquina en sobrenadantes de cultivos celulares fueron entonces ensayados usando ELISA o conjunto de perlas citométricas (CBA) . Como se muestra en la Figura 20E, la producción de citoquinas inducida por agonistas para TLR2, TLR2/6 o TLR4 (PGN, LTA, Zimosano, LPS), incluyendo TNF-a, IL-lß, IL-6, e IL-10, fue inhibida en la presencia de Cpn 10. Se observa que mientras una ligera inducción mediada por Cpn 10 de la producción de IL-10 inducida por LPS, los datos demostraron producción reducida de IL-10 en respuesta a otros ligandos de TLR. De manera similar, la estimulación de PBMC con agonistas para TLR7 o 9 con imiquimod u ODN de CpG en la presencia de Cpn 10 condujo a producción reducida de TNF-a y creciente de IFN-a, en comparación con cultivos control sin Cpn 10. 10.3. Discusión Este estudio no cubre un papel no identificado previamente de Cpn 10 como un regulador endógeno del sistema inmune. La estimulación de células vía el sistema TLR de receptores, pero no a través de receptores de TNF-a, IFN-? o IL-lß, induce al promotor de Cpn 10 y la producción de la proteína de Cpn 10 que puede ser medida en el medio extracelular. La adición de la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 recombinante limita la activación de células activadoras de TLR, como se evaluó por la activación de NF-?B, fosforilación de MAPK, producción de citoquinas por una línea celular de roedor y por PBMC humana aislada recientemente in vi tro . Estos resultados demuestran la inducción de Cpn 10 con traumatismo inmune junto con datos que muestran limitación mediada por Cpn 10 de la magnitud de una respuesta inflamatoria, proporcionan fuerte evidencia de que Cpn 10 es un elemento esencial de una trayectoria central de retroalimentación negativa al sistema de respuesta inmune. Ejemplo 11 - Modificación de la expresión de TLR4 inducida por Cpn 10 a partir de la estimulación de LPS Los inventores buscaron determinar el efecto de Cpn 10 sobre la expresión de TLR4 en células RAW264 a fin de examinar si Cpn 10 afecta la expresión de superficie de TLR4 a partir de la estimulación con LPS. 11.1. Materiales y métodos LPS se originó de E. coli (Sigma), biotina-TLR4/MD-2 anti-ratón y Estreptavidina-Ficoeritrina fue originaria de Bioscience, IFN-? anti-ratón fue originaria de BD. Las células fueron cultivadas por el período de tiempo indicado en suspensión en la presencia o ausencia de 100 µg/ml de Cpn 10. Las células fueron entonces transferidas a tubos de 10 ml, contadas, compactadas y re-suspendidas en medio de cultivo recientemente preparado. Se transfirieron 10 µl de suspensión celular a tubos Eppendorf (106 células/tubo) . Se efectuaron cuatro horas de tratamiento y estimulación con LPS en los tubos Eppendorf, conservados en la incubadora con mezcla leve cada 15 minutos. Las células fueron lavadas 3x con PBS/FBS al 0.2 % . Biotina-TLR4 anti-ratón (1 µl en 50 µl de PBS/FBS al 0.2 %) o anticuerpo control ( IFN-?-biotina anti-ratón) fue incubado con las células sobre hielo por 1 hora. Las células fueron lavadas 3x en 1 ml de PBS/FBS al 0.2 % y luego se bloquearon con 50 µl de PBS/FBS al 10 % por 45 minutos a 4 °C. Se añadió entonces estreptavidina-PE a dilución de 1/100 y se incubaron por 1 hora adicional sobre hielo. Después de 3 lavados las células fueron fijadas en paraformaldehido al 1 % en PBS y se analizaron sobre FACS Caliber usando el programa Cell Quest. 11.2.Resultados Cpn 10 incubada con células RAW264 por 4 horas no cambió la expresión de TLR4. TLR4 fue detectado fácilmente sobre la superficie de células RAW264 usando TLR4/MD-2-Biotina anti-ratón seguido por Estreptavidina-PE (Figura 21) . El anticuerpo control falló al mostrar tinción significativa (datos no mostrados) . Ni el tratamiento con Cpn 10 por 4 horas o tratamiento con regulador control dieron como resultado una alteración de la expresión de TLR4. Sub-regulación de TLR4 por LPS y la influencia de Cpn 10. La adición de 2 ng/ml de LPS causó ligera reducción (Figura 22), y 20 ng/ml de LPS causó casi completa pérdida (Figura 23) de la expresión de TLR4 2 horas post adición de LPS. Incubación de Cpn 10 por 4 horas no cambió significativamente el comportamiento de TLR4 después de la adición de LPS. Cuando el tratamiento con Cpn 10 se extendió a toda la noche. La expresión de TLR4 se redujo ligeramente (Figura 24 y 25) en comparación con células tratadas con regulador (Figuras 24 y 25) . La reducción en la expresión de TLR4 mediada por LPS fue ligeramente más pronunciada en células tratadas con Cpn 10 cuando a las células se les dio 2 ng/ml de LPS (Figura 24) . Cuando las células fueron cosechadas con 20 ng/ml de LPS, la expresión de TLR4 fue esencialmente perdida en todos los grupos (Figura 25) . 11.3. Discusión y conclusiones La reducción de la actividad de LUC mediada por 4 horas de tratamiento con Cpn 10 causó una reducción de 30 - 50 % en la activación de NF-?B inducida por LPS. Este efecto es improbablemente debido a la sub-regulación de la expresión de TLR4 mediada por Cpn 10 cuando dicho tratamiento cambió poco los niveles de expresión de TLR4.

La sub-regulación mediada por 2 ng/ml de LPS fue tal vez muy ligeramente más pronunciada después de 4 horas de tratamiento con Cpn 10, y ciertamente fue más pronunciada después de toda la noche de tratamiento con Cpn 10. Estos resultados sugieren que Cpn 10 es capaz de cambiar las dinámicas de expresión de TLR4 después de adición de LPS.

Ejemplo 12 - Cpn 10 limita la respuesta celular a un amplio espectro de agonistas de TLR Los inventores emprendieron la documentación de la ampliación de la inhibición mediada por Cpn 10 de la activación de NF-?B inducida por un número de ligandos de TLR. 12.1. Materiales y métodos LPS de E. coli 055 :B5 fue originaria de Sigma, y LPS de E. coli 0111:B4 Ultrapure (1 x 106 UE/mg). Ácido lipoteicoico de S . aureus (LTA) (12.5 UE/mg), péptidoglicano (PGN) de S . aureus (< 0.125 UE/mg), ácido lipoteicoico (LTA) de B. subtilis (12.5 UE/mg), péptidoglicano (PGN) de B . subtlis (0.25 UE/mg), Zimosano de S . cerevisiae (< 0.125 UE/ml) , Imiquimod R837, CpG ODN1826 (ratón), CpG ODN2216 (humano, y CpG ODN 1826 (controles no estimuladores) , fueron todos obtenidos de Invivogen. IL-lß recombinante de ratón fue obtenido de R & D Systems, IFN? recombinante de ratón y TNFa recombinante de ratón fueron obtenidos de Chemicon. El grupo de perlas de citoquina fue obtenido de BD. Bioensayo con RAW264-HIV-LTR-LUC. El bioensayo fue efectuado esencialmente como se describe en Johnson, B. y colaboradores 2005, J. Biol. Chem. 280:4037-4047. En cada ensayo, se probó Cpn 10 en un intervalo de concentración de 25 - 100 µg/ml, y los estimulantes se usaron a concentraciones que provocaron una curva de respuesta a la dosis aguda, es decir LPS de E. coli a 0.2 - 5 ng/ml, LPS de E. coli UltraPure a 5 - 10 ng/ml, LTA y PGN de S . aureus y B. subtilis a 10 - 100 µg/ml, Zymosano de S . cerevisae a 10 - 100 µg/ml. Se observa que el nivel de contaminación por endotoxina en ambas preparaciones de Cpn 10 y en ligandos de TLR fue conocido y fue de menos del nivel mostrado previamente para inducir la activación de HIV-LTR a la concentración usada en estos ensayos usando esta línea celular (Johnson, B. y colaboradores 2005 J. Biol Chem 280:4037-4047). En datos presentados posteriormente, se observa que la salida por lectura de estimulación de esta línea celular se describe como activación de NF-KB en el entendimiento de que LTR de HIV es conocido por tener muy alta capacidad de respuesta a la activación de NF-?B y por consiguiente es una medida indirecta de la activación de este factor de transcripción. Ensayo con citoquina de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMN) Humana . Se aislaron PBMC de sangre heparinizada de voluntarios saludables por centrifugación con gradiente de densidad flotante sobre Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences) . Se usaron PBMC como células recientemente aisladas, o alternativamente concentrados fueron almacenados en crio-tubos en nitrógeno líquido hasta uso. Se distribuyeron PBMC a 200 µl/pocillo a 8 x 105 células viables/ml en placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria) . Se añadió Cpn 10 por 1 hora, seguido por estimulación con agonista por 20 horas a 37 °C y C02 al 5 % antes de colección de sobrenadantes de cultivo. Se analizaron los niveles de citoquina usando equipos ELISA disponibles comercialmente (R & D Sciences) y conjunto de perlas citométricas (BD) . Detección de niveles de fosforilación de moléculas de señal . RAW264.7 o PBMCs fueron incubadas con Cpn 10 por 2 horas, seguido por estimulación con LPS por 30 minutos, se centrifugaron y los lisados se compactaron con SDS al 0.1 % en PBS. Los lisados fueron hervidos por 5 minutos, se enfriaron, se compactaron los desechos celulares por centrifugación, y los sobrenadantes se ensayaron para concentración de proteínas como anteriormente. Se detectaron las proteínas de señal fosforilada usando los Conjuntos de BD CBA Flex para p38, ERK1/2 y JNK1/2. De manera alternativa, RAW264.7 fueron tratadas con Cytofix/Cytoperm (BD) teñido dual para ?38 intracelular y CD14 de superficie celular. Se analizaron muestras usando el Bioanalizador BD FACSArray con programa del grupo FCAP. 12.2. Resultados Activación de HIV-TLR inducida por agonista de TLR. Los datos representados en la Figura 26 demuestran la habilidad de Cpn 10 para regular la activación de NF-?B en células RAW264-HIV-LTR-LUC de macrófago de roedor que fueron estimuladas con un intervalo de concentración de • ligandos de TLR. Se ensayó un amplio intervalo de ligandos a los TLRs, incluyendo ambos LPS no purificado y Ultra-Pure (TLR4 solamente) (descrito como estimulante tanto TLR4 como TLR2), LTA de dos bacterias Gram- positivas, B. subtilis y S . aureus, (TLR2), y PGN de las dos bacterias Gram-positivas anteriores (TLR2) . Además, las células fueron estimuladas con Zimosano, una preparación aislada de la pared celular de la levadura S. cerevisiae, (TLR2/TLR6) , y el ARN de doble hebra sintético, poli(I:C), las cuales enlazan y estimulan a través de TLR3, Las células fueron también probadas después de estimulación con ADN de CpG (TLR9) o imiquimod (R837), una molécula sintética de bajo peso molecular que activa células vía la trayectoria dependiente de MyD88 de TLR7, en la presencia de Cpn 10. Los datos presentados muestran la modulación de la activación de NF-?B inducida por Cpn 10 después de ligación de cuatro de los TLRs probados (TLR2, 4, 7, 9) . La Figura 27 expone el por ciento máximo de inhibición de actividad luciferasa inducida por Cpn 10 en células RAW264-HIV-LTR-LUC estimuladas por una variedad de ligandos de TLR. Aunque el patrón de respuesta es muy similar para la mayoría de los ligandos probados, con un promedio de inhibición de 50 % de activación de HIV-LTR, Cpn 10 no parece cambiar la activación de NF-?B inducida por TLR3 en respuesta a poli(I:C). Además, Cpn 10 afectó una inhibición de NF-?B limitada de aproximadamente 20 % en células activadas por la preparación de pared celular de levaduras, zimosano. La influencia de Cpn 10 en la fosforilación de proteínas de señal intracelular. La estimulación con LPS de células RAW264 activa varias trayectorias de señalización intracelular incluyendo la trayectoria de IkapaB quinasa (IKK)-NF-?B, y tres trayectorias de proteína quinasa activadas por mitógeno (MAPK) : quinasas reguladas por señal extracelular (ERK) 1 y 2, quinasa c-Jun N-terminal (JNK) y p38. Adicionalmente, desde el extremo 31 hacia el extremo 5' en el sentido de la hebra de ADN dupleto , estas trayectorias de señalización activan un número de factores de transcripción que incluyen NF-?B y AP-1 los cuales coordinan entonces la inducción de genes que codifican a mediadores de inflamación. A fin de evaluar la influencia de Cpn 10 sobre este sistema de señales, los inventores midieron los niveles de p38 fosforilado, JNKl/2 y ERK1/2 en células estimuladas con LPS por 30 minutos, en la ausencia o presencia de Cpn 10. Los inventores han mostrado que la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 limita la fosforilación inducida por LPS de cada uno de estos elementos de las trayectorias de señalización (Figuras 28A-C) . Para confirmar la actividad de Cpn 10 sobre la producción de citoquinas por células humanas recientemente aisladas estimuladas con una variedad de ligandos de TLR, los inventores pre-trataron PBMC de donadores saludables con Cpn 10 por 1 hora y luego se estimularon con un intervalo seleccionado de ligandos de TLR por 20 horas. Los niveles de citoquina en sobrenadantes de cultivo celular fueron entonces ensayados usando ELISA o el conjunto de perlas citométricas . Como se muestra en la Figura 29A-D, la producción de citoquina inducida por agonistas para TLR2 o TLR4 (PGN, LTA, Zimosano, LPS), incluyendo TNF-a, IL-lß, IL-6 e IL-10, se redujo en la presencia de Cpn 10. De manera similar, la estimulación de PBMC con agonistas para TLR7 o 9 con Imiquimod o CpG (ODN2216) en la presencia de Cpn 10 condujo a una producción reducida de citoquinas en comparación con cultivos control sin Cpn 10, indicado por los datos en la Figura 29E. La pre-incubación de Cpn 10 seguido por lavado no impacta la habilidad de Cpn 10 para limi tar la activación de NF-?B inducida por LPS. Los inventores han determinado previamente que la pre-incubación de células RAW264-HIV-LTR-LUC por 2 horas con Cpn 10 antes de estimulación con LPS estimula la reducción de la capacidad de respuesta a la dosis en la actividad luciferasa. También han demostrado ahora que una pre-incubación de 2 horas con Cpn 10 seguido por un lavado con PBS antes de estimulación con LPS no altera la reducción mediada por Cpn 10 en la actividad luciferasa, como una medida de la activación de NF-?B, como se muestra en la Figura 30.

Activación de NF-?B inducida por agonista diferente del de TLR. A fin de caracterizar adicionalmente la actividad de Cpn 10, los inventores probaron la modulación de Cpn 10 de un número de agonistas no de TLR. Como parte de este programa no de TLR, células RAW fueron estimuladas con 1 - 10 ng/ml de IFN-? recombinante de ratón de baja endotoxina (2.24 UE/mg) por 6 horas en la presencia de Cpn 10 (Figura 31). Sobrenadantes celulares fueron colectados y analizados para TNF-a usando ELISA. Se encontró que Cpn 10 potencia la producción de TNF-a inducida por IFN-?. El incremento sinérgico marcado en la producción de TNF-a fue mejorado cuando las células fueron pre-incubadas con Cpn 10 por 2 horas previas a la estimulación con IFN-?. Los niveles de luciferasa inducidos por NF-?B crecientes fueron también medidos en lisados de células RAW264-HIV-LTR-LUC .estimulados con IFN-? en la presencia de Cpn 10 por 2 o 4 horas. 12.3. Discusión y conclusiones Los inventores han demostrado la habilidad de Cpn 10 para regular las dinámicas de la respuesta de macrófago a una variedad de ligandos específicos de TLR incluyendo TLR2, 4, 7 y 9, y por consiguiente la influencia de Cpn 10 sobre la fosforilación de moléculas de señalización desde el extremo 5' hacia el extremo 31 en el sentido de la hebra de ADN dupleto de la activación de BF-?B y la producción de citoquina, es decir elementos de la familia de MAPK de proteínas de señalización, incluyendo ERK, JNK y p38. Los inventores también han mostrado que la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 reduce niveles de MAPKs fosforilados intracelulares en células activadas por LPS. Los datos presentados en este ejemplo demuestran que la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 regula las dinámicas de la respuesta inmune innata en macrófagos estimulados in vitro con un intervalo de ligandos de TLR. El nivel máximo de inhibición de la activación de NF-?B inducida por Cpn 10 iniciada por estas moléculas fue aproximadamente de 80 % después de estimulación de la línea celular RAW264-HIV-LTR-LUC con un agonista de TLR7 (R837) . En el otro extremo de la escala, Cpn 10 añadida a concentraciones que varían entre 10 y 100 µg/ml no influye las dinámicas de unión de TLR2/6 por la preparación de pared celular de levadura, zimosano en más de 20 %. Al menos una excepción al patrón de activación de NF-?B reducido por Cpn 10 involucra la activación del ácido poli-inosina-pilicitidílico (poli(I:C)). Poli(I:C) es un análogo sintético de ARN de doble hebra, un patrón molecular asociado con infección por virus que activa NF-KB vía interacción con TKR3. En vez de limitar la señal de activación de NF-?B, la capacidad de respuesta a la dosis de Cpn 10 aumenta la producción de interferones de tipo I en respuesta a este agonista. Ejemplo 13 - Identificación de receptores de superficie celular que enlazan a Cpn 10 conjugada a matriz sólida 13.1. Materiales y métodos Aislamiento de receptores sobre en células huéspedes que enlazan a Cpn 10. Se prepararon columnas de afinidad (Hi-Trap activada con NHS) usando Cpn 10 (suministrada por CBio Ltd., Lote (CH003). Se dializó Cpn 10 en regulador de bicarbonato a pH de 3 y se conjugó sobre una columna de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se lisaron monocitos humanos usando regulador de lisis NP40 (0.05 % en peso/volumen), lisados de célula enteras se pasaron a través de la columna de afinidad para Cpn 10 y las moléculas sin enlazar fueron retiradas por lavado con PBS. Se eluyeron moléculas receptoras de enlace a Cpn 10 usando el regulador de elución b-octil glucósido (b-OG) (15 mM de trietanolamina, pH de 11.5, 140 mM de NaCl, y 30 mM de b-OG) , se neutralizó con ácido 2- (N- morfolino) etansulfónico 1 M pH de 5, y se dializó contra PBS. Como un control, lisados celulares fueron también pasados sobre una columna sobre la cual no había sido conjugada ninguna proteína. Los eluyentes fueron concentrados usando Centriprep YM-10 (Millipore) , se concentró a menos de 1 ml y se analizó ya sea por SDS-PAGE (Figura 32) o bien por electroforesis sobre gel 2D (Figura 33) . Por electroforesis sobre gel 2D la solución eluida concentrada fue inter cambiada con regulador usando regulador de rehidratación (urea 8M, CHAPS 2 %, 10 mM de DTT, Biolyte al 0.2 %) (Biorad) antes de análisis. Las bandas o manchas de interés fueron excisadas, digeridas con tríptico y enviadas para análisis por MALDI-TOF. Separación de proteínas por electroforesis sobre gel de ID. La solución eluida fue tratada 2 x SDS regulador reductor PAGE (4 ml de SDS al 10 %, 2.5 ml de Tris 0.5 M - HCl pH de 6.8, 5 g de Glicerol, 1 ml de mercaptoetanol 14.3 M, y 5 mg de Azul de bromofenol) y se colocó en agua hirviente por 5 minutos. A fin de correr las muestras se usaron los geles con gradiente Criterion Tris - HCl Precast 4 - 20 % (Biorad) . El marcador de peso molecular RAINBOW de intervalo total (2 µl) fue cargado en el primer pocilio y los pocilios restantes fueron cargados con 40 µl de muestra. El gel fue entonces colocado en el tanque electroforético y se añadió el regulador de corrida. El regulador de corrida consistió de 0.025 M de Tris, 0.2 M de glicina, SDS al 0.1 %, y se ajustó el pH a 8.3. Se llevó a cabo la electroforesis por 50 minutos a voltaje constante de 200 voltios. Después de electroforesis los geles fueron retirados, fijados toda la noche con regulador de fijación (etanol al 40 %, ácido acético al 10 %, H20 al 50 %) y se tiñó con tinción de azul de Coomasie (azul de Coomasie al 50 % (0.3 peso/volumen), metanol al 25 %, ácido acético al 5 %, H20 al 20 %) por 1.5 horas. Los geles fueron finalmente desteñidos por medio de varios lavados con decolorador (etanol al 10 %, ácido acético al 10 %, H20 al 80 % . Separación de proteínas por electroforesis sobre gel de 2D. Un gradiente de pH inmovilizado no lineal ( 3-10 tiras ReadyStrip IPG de 11 cm) se usó como la primera dimensión. Se pipetearon alícuotas de 200 µl de muestra en la bandeja de enfoque y la tira IPG fue colocada sobre ella con el lado de gel hacia abajo a través de la solución que contenía muestra y regulador. Se colocó aceite mineral sobre la tira IPG para evitar la precipitación de la urea. Las tiras se dejaron rehidratar por 12 horas bajo condiciones pasivas a 20 °C . las tiras fueron entonces enfocadas por aproximadamente 52,000 v-hora a 6000 - 7000 voltios a una constante de 50 µA por tira. Para preparar las tiras ReadyStrip IPG para la segunda dimensión, fueron retiradas del enfocamiento y equilibradas en 5 ml de regulador que contenía 50 mM de Tris HCl, pH de 8.8, 6 M de urea, SDS al 2 %, glicerol al 30 %, DTT al 1 % . Un segundo equilibrio seguido en 5 ml de volumen del mismo regulador con iodoacetamida al 1.5 % sustituido por el DTT. Después de equilibrio, las tiras ReadyStrip IPG fueron colocadas sobre los geles Criterion (gradiente de 4 - 20 %) y recubrió encima con agarosa al 0.5 % con una huella de mercaptoetanol. Los geles fueron corridos en la celda de Criterion por 60 minutos a 200 V. Después de electroforesis los geles fueron retirados, fijados toda la noche con regulador de fijación (etanol al 40 %, ácido acético al 10 %, H20 al 50 %) y se tiñó con tinción de azul de Coomasie (azul de Coomasie al 50 % (0.3 peso/volumen), metanol al 25 %, ácido acético al 5 %, H20 al 20 %) por 1.5 horas. Los geles fueron finalmente desteñidos por medio de varios lavados con decolorador (etanol al 10 %, ácido acético al 10 %, 80 % de agua) . 13.2. Resultados. Aislamiento de proteínas de enlace a Cpn 10 por cromatografía de afinidad y electroforesis con SDS-PAGE . Los inventores efectuaron estudios preliminares usando la metodología que se describió y se identificaron varias proteínas de enlace a Cpn 10 usando análisis por espectrometría de masa, como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Identificación de moléculas de enlace a Cpn 10 usando espectrometria de masa Nombre de la proteína No. de Acceso Precursor de la proteína regulada GRP78_MESAU con glucosa de 78 kDa (GRP 78) Precursor de albúmina de suero ALBU_BOVIN Factor de alargamiento Tu-B EFTU2_PSEPK Annexina A2 ANXA2_HUMAN Triosafosfato isomerasa TPIS_PANTR Profilina-1 PR0F1_HUMAN Proteína mitocóndrica con choque CH10_HUMAN térmico de 10 kDa Región C de cadena Ig gamma 1 IGHG1_HUMAN Región C de cadena Ig alfa 2 IGHA2_HUMAN Precursor de alfa-1-antitripsina A1AT_HUMAN Peptidil-propil-cis-trans-isomerasa PPIA_MACMU A (proteína de enlace a ciclosporina A) A fin de verificar estos resultados así como también determinar las identidades de las proteínas que no fueron identificadas, los inventores repitieron el aislamiento de la proteína de enlace a Cpn 10 por cromatografía de afinidad y se analizaron las moléculas eluidas por SDS-PAGE (Figura 32) así como también por electroforesis sobre gel de 2D (Figura 33) .

Experimentos control en los cuales se corrieron lisados celulares sobre columna de afinidad a la cual ninguna proteína ha sido conjugada no demostraron bandas de proteína sobre SDS-PAGE (datos no mostrados) . 13.3. Discusión y conclusiones Estos datos de espectrometría de masa han facilitado la identificación de varias proteínas, que pudieran ser potencialmente importantes para el enlace y el tráfico de Cpn 10 a células huéspedes. En particular, porfilina, una pequeña proteína de enlace a actina, que regula las dinámicas de polimerización de actina, parece ser una proteína de enlace a Cpn 10. Otra molécula que pudiera ser importante en regular las respuestas de Cpn 10 es GRP78. GRP18 es una chaperona que pudiera estar involucrada en el tráfico de Cpn 10. Ejemplo 14 - La influencia de Cpn 10 sobre la respuesta antiviral del Virus de Ross River por células estimuladas con polil :C Xn Vitro Los inventores se interesaron en probar si Cpn 10 influye la resistencia anti-viral inducida por polil :C usando un virus conocido por ser muy sensible a los efectos anti-virales de IFN-a/ß. 14.1. Materiales y métodos Cpn 10. Se disolvió Cpn 10 en regulador con solución salina-Tris a pH de 7.6 y se con gel sobre hielo en alícuotas y se almacenó a -20 °C. las alícuotas fueron descongeladas antes de uso. PoliI: C. Para los datos mostrados en las Figuras 34A-B, PoliI:C (suministrado por Invivogen) se disolvió en solución salina estéril a 5 mg/ml se almacenó congelado a - 20 °C. Los frasquitos fueron descongelados y diluidos en medio. Para controles con regulador, el mismo volumen y solución salina estéril fueron añadidos a los pocilios de cultivo celular. Para los datos mostrados en las Figuras 35A-B, se disolvió PoliI:C en solución salina estéril a 5 mg/ml, luego se alicuotaron a 25 µl/500 µl y se añadieron 62.5 µl de etanol al 100 % (2.5 volúmenes) para precipitar los dsARN. Los tubos fueron almacenados a - 70 °C. En el día del ensayo, se centrifugaron las alícuotas a máxima velocidad (13,000 rpm) por 30 minutos a 40 °C. El compactado fue lavado una vez en agua destilada tratada con DEPC en etanol al 70 %, se compactó, se retiró el sobrenadante y se secó el compactado en la campana (aproximadamente 15 min) y se resuspendió en 100 µl de RPMI 1640. Se determinó la recuperación de dsARN, fue de aproximadamente 50 % como se determinó usando la cuantificación de ARN característica del BioPhotometer (Ependorf) . Todas las concentraciones de dsARN dadas en las figuras suponen un 50 % de recuperación.

Ensayo anti-viral . Células RAW264.7 fueron desarrolladas como cultivos adherentes en matraces y se rasparon ( es decir no se triptinizaron) antes de sembrar en placas de 96 pocilios. Se triptinizaron células HeLa de la manera estándar antes de sembrar. Las células fueron sembradas por duplicado en placas de 96 pocilios (5 x 103 para células RAW264.7 y 104 para células HeLa en 50 µl de medio por pocilio) . Después de 4 horas, se añadió Cpn 10 (en 50 µl diluido en medio) y después de 30 minutos adicionales , se añadió polil :C ( en 50 µl diluido en medio) . Las células fueron entonces incubadas toda la noche en las placas de 96 pocilios y luego se añadió RRV (MOI=l para células RAW264.7, y MOI=10 para células HeLa en 50 µl) . Después de 3 días, las células fueron fijadas, teñidas con cristal violeta, se lavaron, secaron y se extrajo el colorante con metanol al 100 % y se leyeron a A595 nm como se describió (Antalis y colaboradores, J. Exp. Med. 1998, 187 (11) : 1799) . 14.2.Resultados El efecto de Polil : C sobre células RAW264. 7. Inicialmente se tituló polil :C en células RAW264.7 en el intervalo de 0 - 100 µg/ml) . Concentraciones de polil :C > 5 - 10 µg/ml dieron como resultado células que mostraron señales claras de toxicidad con células redondas y que desarrollaron pobremente durante el período de ensayo de tres días. No se observó dicha toxicidad para células HeLa (Figura 34B) . Cpn 10 y PoliI: C. Se establecieron titulaciones para determinar la dosis requerida para la inducción de resistencia anti-viral para células RAW264.7 y células HeLa. Luego, usando intervalos de concentraciones apropiados de polil :C, se probó la hipótesis para saber si Cpn 10 incrementó la actividad anti-viral de dsARN. Como se muestra en la Figura 35B, ni células RAW264.7 ni células HeLa mostraron cualquier diferencia en su resistencia anti-viral en la presencia o ausencia de Cpn 10 a las concentraciones de polil :C y Cpn 10 probadas durante estos ensayos de tres días que midieron la viabilidad celular. 14.3. Discusión y conclusiones En este estudio, Cpn 10 no influyó la resistencia anti-viral inducida por dsARN sintético contra CPE inducido por alfa-virus. Los datos presentados en la presente no apoyan el hecho de que Cpn 10 puede influir la señalización por dsARN. dsARN puede señalar vía TLR3, PKR, RIG-l/mda-5 y/o ATF-2/c-Jun, aunque se cree que TLR3 es el principal sensor de dsARN extracelular, con las otras trayectorias de señalización activadas por dsARN citoplásmico.

EJEMPLO 15 - Cpn 10 recombinante interactúa en la superficie celular con APC Los inventores consideraron los medios por los cuales Cpn 10 extracelular puede modular una respuesta inmune. Para identificar cual subpoblación de células leucocíticas enlazan Cpn 10, los inventores marcaron con fluoróforo a Cpn 10 en un residuo cisteína C-terminal y demostraron que retuvo a la chaperona equivalente y a la actividad inmunomoduladora en Cpn 10 de tipo salvaje in vitro (datos no mostrados) . A partir de incubación de Cpn 10 marcado con PBMC a 4 °C, junto con un panel de anticuerpos para identificar subpoblaciones de leucocitos separadas, se demostró que Cpn 10 interactúa más fuertemente con APCs, específicamente DC mieloide (CD3~ CD4inferiorCD14"CDllc+) , DC o las macitoides (CD3~ CD4inferiorCD14_CDllcinferior) y monocitos (CD4inferiorCD14+) , con afinidad más baja hacia células T (Figura 36A) . Cuando PBMC fue estimulado con LTA, hubo un incremento aproximado de 1.6 veces en el nivel de enlace de Cpn 10 fluorescente a la superficie de células CD14+ por 4 horas, en comparación con células CD14+ sin estimular (Figura 36B) . Estos datos sugieren que Cpn 10 extracelular ejerce su actividad biológica sobre APCs, células reguladoras claves del sistema inmune innato.

Los inventores también siguieron la trayectoria de captación de Cpn 10 fluorescente en células inmunes por microscopía homofocal. Cuando pDC humano o macrófagos de ratón fueron incubados con Cpn 10 fluorescente, junto con reactivos para identificar compartimentos intracelulares, se demostró que Cpn 10 fue captada y transportada a las vesículas intracelulares acidificadas sin entrar al citosolo o mitocondria (Figura 36C) . Estos datos mostraron que la proteína de Cpn 10 se asocia con células competentes inmunes y es concentrada en áreas que señalan la presencia de motivos activadores de TLR. Ejemplo 16 - Composiciones para tratamiento De conformidad con el mejor modo de efectuar la invención proporcionada en la presente, se indican a continuación las composiciones específicas preferidas. Los siguientes se construyeron como ejemplos meramente ilustrativos de composiciones y no como una limitación del alcance de la presente invención en manera alguna. Ejemplo 16 (a) - Composición para administración parenteral Una composición para inyección intramuscular pudiera ser preparada que contenga 1 ml de agua regulada estéril, y 1 mg de un compuesto adecuado.

De manera similar, una composición para infusión intravenosa puede comprender 250 ml de solución de Ringer estéril, y 5 mg de un compuesto adecuado. Ejemplo 16 (b) - Composición parenteral inyectable Una composición adecuada para administración por inyección puede ser preparada por mezcla de 1 % en peso de un compuesto adecuado en 10 % en volumen de propilen glicol y agua. La solución es esterilizada por filtración. Ejemplo 16 (c) - Composición en cápsula Una composición de un compuesto adecuado en la forma de una cápsula puede ser preparada llenando una cápsula de gelatina dura de dos piezas estándar con 50 mg del agente o compuesto, en forma pulverizada, 100 mg de lactosa, 35 mg de talco y 10 mg de estearato de magnesio. Ejemplo 16 (d) . Composición en gotas para los ojos Una composición típica para liberar como unas gotas para los ojos se indica a continuación: Compuesto adecuado 0.3 g Hidroxibenzoato de metilo 0.005 g Hidroxibenzoato de propilo 0.06 g Agua purificada c.b.p. 100.00 ml Los hidroxibenzoatos de metilo y de propilo se disolvieron en 70 ml de agua purificada a 75 °C, y la solución resultante se dejó enfriar. Se añadió entonces el compuesto adecuado, y la solución se esterilizó por filtración a través de un filtro de membrana (tamaño de poro de 0.22 µm) , y se empacó asépticamente en contenedores estériles. Ejemplo 16 (e) - Composición para administración por inhalación Para un contenedor de aerosol con una capacidad de 20 - 30 ml: se dispersó una mezcla de 10 mg de un compuesto adecuado con 0.5 - 0.8 % en peso de un agente lubricante, tal como polisorbato 85 o ácido oleico, en un propelente, tal como freón, y se puso en un contenedor para aerosol apropiado para su administración por inhalación oral o intranasal. Ejemplo 16 (f) - Composición para ungüento Una composición típica para liberación como un ungüento incluye 1.0 g de un compuesto adecuado con parafina blanda blanca c.b.p. 100 g dispersa para producir un producto homogéneo, uniforme.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un método para modular la señalización del receptor similar al de Toll en un sujeto, o en al menos una célula, tejido u órgano de éste, caracterizado porque dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la señalización del receptor similar al de Toll involucra la asociación de la chaperonina 10 con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación.

2.- Un método para modular la señalización del receptor similar al de Toll en un sujeto, o en al menos una célula, tejido u órgano de éste, caracterizado porque dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde la señalización del receptor similar al de Toll involucra la asociación de la chaperonina 10 con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por el aglomerado de activación.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, un receptor similar al de Toll, y opcionalmente, al menos otra molécula.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la al menos otra molécula comprende un agonista del receptor similar al de Toll.

5.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR2 y ácido lipoteicoico (LTA) .

6.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR3 y ARN de doble hebra.

7. - El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR4 y LPS.

8.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR7 y ARN de una sola hebra.

9.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el aglomerado de activación comprende chaperonina 10, TLR9 y ADN que comprende un motivo CpG.

10.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la chaperonina 10 comprende la secuencia de polipéptido expuesta en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3.

11.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1 o 3 a 9, caracterizado porque la chaperonina 10 es administrada en la forma de un polinucleótido que codifica a chaperonina 10.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polinucleótido comprende la secuencia que se expone en la SEC ID NO: 4.

13.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende adicionalmente la administración de al menos un agente adicional.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el al menos un agente adicional es un inmunomodulador seleccionado del grupo que comprende IFNa o IFNß.

15.- Un método para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un sujeto, caracterizado porque dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el inicio, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición.

16.- Un método para el tratamiento o prevención de un trastorno o condición en el sujeto, en donde dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por medio del aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de acivación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 15, o la reivindicación 16, caracterizado porque la enfermedad o condición es seleccionada del grupo que comprende infecciones virales o bacterianas, enfermedades inflamatorias agudas o crónicas que incluyen choque séptico, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, psoriasis, enfermedad cardíaca, arterioesclerosis, enfermedad pulmonar crónica, caquexia, esclerosis múltiple, GVHD y cáncer.

18.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la chaperonina 10 regula la señalización de TLR2 inducida por LTA.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la chaperonina 10 modula la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR2.

20.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la chaperonina 10 regula la señalización de TLR3 inducida por ARN de doble hebra.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la chaperonina 10 modula la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR3.

22.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la chaperonina 10 regula la señalización de TLR4 inducida por LPS.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la chaperonina 10 modula la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR4.

24.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la chaperonina 10 regula la señalización de TLR7 inducida por ARN viral de una sola hebra.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la chaperonina 10 modula la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR7.

26.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la chaperonina 10 regula la señalización de TLR9 inducida por el motivo CpG.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la chaperonina 10 modula la producción y/o la secreción del inmunomodulador inducida por TLR9.

28.- El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado adicionalmente porque comprende la administración de al menos un agente adicional.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el al menos un agente adicional es un inmunomodulador seleccionado del grupo que comprende IFNa o IFNß.

30.- Una composición cuando se usa para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición, la composición está caracterizada porque comprende chaperonina 10 junto con al menos un portador, diluyente o adyuvante aceptables farmacéuticamente, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociado con el inicio, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición.

31.- La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque comprende al menos un agonista de un receptor similar al de Toll y al menos un inmunomodulador.

32.- Una composición cuando se usa para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición, la composición está caracterizada porque comprende al menos un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por medio del aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o el progreso de la enfermedad o condición.

33.- Un uso de chaperonina 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención d una enfermedad o condición, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación de el aglomerado de activación está asociada con el inicio, mejoramiento y/o mantenimiento de una respuesta inmune a la enfermedad o condición.

34.- Un uso de un antagonista de chaperonina 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o condición, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por medio del aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con el establecimiento y/o progreso de la enfermedad o condición.

35.- Un método de modular la producción y/o la secreción de uno o más inmunomoduladores en un sujeto, o al menos una células, tejido u órgano del mismo, en donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de chaperonina 10, en donde la chaperonina 10 se asocia con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la modulación de la producción y/o secreción del uno o más inmunomoduladores.

36.- Un método para modular la producción y/o secreción de uno o más inmunomoduladores en un sujeto, o al menos una célula, tejido u órgano de éste, en donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de chaperonina 10, en donde el antagonista previene que la chaperonina 10 se asocie con un receptor similar al de Toll en un aglomerado de activación, y/o previene la señalización por medio del aglomerado de activación, y en donde la formación del aglomerado de activación está asociada con la modulación de la producción y/o secreción del uno o más inmunomoduladores .

37.- El método de conformidad con la reivindicación 35 o la reivindicación 36, caracterizado porque el inmunomodulador es seleccionado del grupo que consiste de TNF-a, IL-lß, IL-6, IL-10, IL-12, o un interferón de tipo I.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el interferón de tipo I es IFNa o IFNß.