JP2009500430A

JP2009500430A - シャペロニン１０により誘導される免疫調整方法

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Publication number: JP2009500430A
Application number: JP2008520676A
Authority: JP
Inventors: バーバラジェインジョンソン; キャロリーヌアマンダドビン; ディーンジェイソンネイラー; リンダアリソンウォード; イングイー．エー．フレッシュ; クリストファーブルースハワード
Original assignee: シーバイオリミテッド
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2006-07-11
Publication date: 2009-01-08
Also published as: BRPI0613515A2; MX2008000596A; WO2007006095A3; US9457062B2; KR20080080079A; EP1906989A4; WO2007006095A2; EP1906989A2; CA2614480A1; US20090047240A1; NZ565731A

Abstract

本発明は、対象における、またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器におけるToll様受容体シグナル伝達を調整するための方法、対象における疾患または病状を治療または予防するための方法、対象またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器における1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整するための方法であって、シャペロニン10の投与を含み、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合する方法に関する。付随する組成物およびその使用法も同じく想定している。

Description

発明の分野
本発明は一般に、Toll様受容体シグナル伝達、特にTLR2、TLR3、TLR4、TLR7およびTLR9シグナル伝達の調整におけるシャペロニン10の使用、ならびに、そのようなシグナル伝達のシャペロニン10により誘導される調整を介した、ウイルス性および細菌性の感染症、炎症性疾患ならびに自己免疫疾患を非限定的に含む疾患の治療のための方法および組成物に関する。

発明の背景
侵入してくる細菌性、真菌性、酵母性およびウイルス性の病原体に対する宿主防御システムの中心的な構成要素は、病原体またはその構成要素が、免疫系の刺激および種々のサイトカインの産生をもたらすシグナル伝達カスケードを誘導する細胞受容体によって首尾よく認識されることを含む。この防衛線において重要な役割を果たす受容体の1つのファミリーが、Toll様受容体（TLR）ファミリーである。TLRは、単球、マクロファージ、樹状細胞、B細胞および顆粒球を含む免疫細胞、ならびに内皮および上皮を含むさまざまな他の細胞種の表面で発現される。病原体またはそれらに由来する分子によるTLRの活性化は、転写因子NF-κBの活性化（Beg, 2002, Trends lmmunol 23:509-12.（非特許文献1））およびサイトカイン産生の調整を主としてもたらす、細胞内シグナル伝達を誘導する。しかし、p38マイトジェン活性化キナーゼ、c-Jun-N末端キナーゼおよび細胞外シグナル関連キナーゼ経路を含む、一連の他の経路が誘発されることもある（Flohe et al., 2003, J Immunol 170:2340-2348（非特許文献2）；Triantafilou and Triantafilou, 2002, Trends Immunol 23:301-304（非特許文献3））。

I型インターフェロン、主にIFNαおよびIFNβは、細胞性およびウイルス性の感染症に対する免疫応答における主要な寄与因子である。そのような感染症の後に生じるI型インターフェロンの主な源は、末梢血単核細胞の特化した部分集団である、形質細胞様樹状細胞（PDC）である。PDCはToll様受容体であるTLR7およびTLR9を発現し、PDC活性化および大量のI型インターフェロンの産生の原因となるのはTLR7／TLR9刺激である。

ある範囲にわたる病原体由来因子は、種々のTLRを選択的に刺激することができる。これらの中で最も特徴が明らかにされているものの1つは、グラム陰性菌の外膜に由来する糖脂質であるリポ多糖（LPS）であり、これはTLR4のアゴニストである。TLR2はリポテイコ酸（LTA）、ペプチドグリカン（PGN）およびリポペプチドを認識し、TLR3は二本鎖RNA、典型的にはウイルス由来のものを認識する；TLR 7はウイルス性の一本鎖RNAを認識し、TLR9は非メチル化CpG二ヌクレオチド、典型的には細菌およびウイルスのDNAの内部にあるものを認識する。また、TLRはさまざまな合成アゴニスト、例えばTLR3の場合にはポリI：C（ポリイノシン酸-ポリシチジル酸）、TLR7の場合にはレシキモド（R848）およびイミキモドなどのイミダゾキノリン類、TLR9の場合にはCpGリッチオリゴヌクレオチドによっても刺激されうる。

TLRシグナル伝達の調整ならびにTLRにより刺激されるサイトカインおよびケモカイン産生の調整の機序の解明は、ウイルス性および細菌性の疾患を含むさまざまな疾患および病状の治療に対する治療的アプローチの開発のための手段を提供すると考えられる。

哺乳動物シャペロニン10（Cpn10）は、熱ショックタンパク質10（Hsp10）としても知られており、典型的には、シャペロニン60（Cpn60；Hsp60）とともにタンパク質フォールディングに関与するミトコンドリア性「分子シャペロン」タンパク質として特徴づけられる。Cpn10は細菌タンパク質GroESの相同体である。GroESおよびCpn10はオリゴマー化して7員環となり、これは14個のGroEL分子または7個のHsp60分子を含むバレル様構造に対して蓋（lid）として結合し、変性タンパク質をその複合体に係留させる。Cpn10はまた、細胞表面（Belles et al., , 1999, Infect Immun 67:4191-4200（非特許文献4））および細胞外液中（Shin et al., 2003, J Biol Chem 278:7607-7616（非特許文献5））にも高頻度で認められる。

しかし、Cpn10はまた、実験的自己免疫性脳脊髄炎、遅延型過敏症および同種移植片拒絶反応のモデルにおける免疫抑制活性を有することも示されている（Zhang et al., 2003, J Neurol Sci 212:37-46（非特許文献6）；Morton et al., 2000, lmmunol Cell Biol 78:603-607（非特許文献7））。

以前に、本発明者らもまた、TLR4アゴニストおよびTLR2アゴニスト（それぞれLPSおよびPAM₃CysSK₄）の存在下で、Cpn10がTLR4およびTLR2により刺激されるNF-κB活性化を低下させ、TNF-αおよびRANTESの分泌を低下させ、その一方でIL-10分泌を用量依存的な様式で増加させることを示している（Johnson et al., 2005, J Biol Chem 280:4037-4047（非特許文献8）；国際特許出願PCT／AU2005／000041（特許文献1）；国際公開公報第2005／067959号（特許文献2）。それらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）。

本発明者らは今回、驚いたことに、Cpn10がTLR3、TLR7およびTLR9によるシグナル伝達をも調整することを見いだした。本明細書では、Cpn10が、TLR3特異的リガンドの存在下でIFNαおよびIFNβの産生を用量反応的に増強すること、ならびにTLR7およびTLR9に対して特異的なリガンドの存在下でNF-κB活性化を低下させることが示される。さらに、本発明者らは驚いたことに、Cpn10は、細胞表面で活性化クラスター内のTLRと会合し、そのような活性化クラスターがTLRシグナル伝達を調整するが、Cpn60またはGroESはそうではないことも示している。

PCT／AU2005／000041 国際公開公報第2005／067959号 Beg, 2002, Trends lmmunol 23:509-12. Flohe et al., 2003, J Imniunol Immunol 170:2340-2348 Triantafilou and Triantafilou, 2002, Trends Immunol 23:301-304 Belles et al., , 1999, Infect Immun 67:4191-4200 Shin et al., 2003, J Biol Chem 278:7607-7616 Zhang et al., 2003, J Neurol Sci 212:37-46 Morton et al., 2000, lmmunol Cell Biol 78:603-607 Johnson et al., 2005, J Biol Chem 280:4037-4047

発明の概要
本発明の第1の局面によれば、対象における、またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器におけるToll様受容体シグナル伝達を調整するための方法であって、シャペロニン10の有効量を投与する段階を含む方法であり、Toll様受容体シグナル伝達がシャペロニン10と活性化クラスター内のToll様受容体との会合を含む方法が提供される。

本発明の第2の局面によれば、対象における、またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器におけるToll様受容体シグナル伝達を調整するための方法であって、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストの有効量を投与する段階を含む方法であり、Toll様受容体シグナル伝達がシャペロニン10と活性化クラスター内のToll様受容体との会合を含み、かつアンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げる、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げる方法が提供される。

活性化クラスターは細胞の表面に位置しうる。

活性化クラスターは、シャペロニン10、Toll様受容体、および任意で少なくとも1つの他の分子を含む。この少なくとも1つの他の分子には、Toll様受容体アゴニストが含まれうる。

1つの態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR2およびリポテイコ酸（LTA）を含む。

1つの追加的な態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR3および二本鎖RNAを含む。

もう1つの態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR4およびLPSを含む。

さらなる態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR7および一本鎖RNAを含む。

さらにさらなる態様において、活性化クラスターは、シャペロニン10と、TLR9と、CpGモチーフを含むDNAとを含む。

シャペロニン10は、天然由来の、組換え的に生産された、または合成的に生産されたシャペロニン10でもよい。シャペロニン10は真核生物起源のものであってもよい。シャペロニン10はヒトシャペロニン10であってもよい。

シャペロニン10は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：3に示されたポリペプチド配列を含みうる。シャペロニン10はアセチル化されていてもよく、アセチル化されていなくてもよい。

シャペロニン10を、シャペロニン10をコードするポリヌクレオチドの形態で投与してもよい。シャペロニン10をコードするポリヌクレオチドを、プロモーターと機能的に連結させて遺伝子構築物中に配置することができる。ポリヌクレオチドはSEQ ID NO：4に示された配列を含みうる。

本方法はさらに、少なくとも1つの追加的な作用物質の投与を含みうる。作用物質は免疫修飾物質でありうる。免疫修飾物質は、IFNαまたはIFNβなどのI型インターフェロンでありうる。

本発明の第3の局面によれば、対象における疾患または病状を治療または予防するための方法であって、シャペロニン10の有効量を対象に投与する段階を含む方法であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している方法が提供される。

本発明の第4の局面によれば、対象における障害の治療または予防のための方法であって、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストの有効量を対象に投与する段階を含む方法であり、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している方法が提供される。

疾患または病状は、敗血性ショック、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬、心疾患、アテローム性動脈硬化、慢性肺疾患、悪液質、多発性硬化症、GVHDおよび癌を含む、ウイルス性、真菌性、酵母性または細菌性の感染症、急性または慢性の炎症性疾患を含む群から選択することができる。

1つの態様において、シャペロニン10は、LTAにより誘導されるTLR2シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR2により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。

1つの追加的な態様において、シャペロニン10は、二本鎖RNAにより誘導されるTLR3シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR3により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。

もう1つの態様において、シャペロニン10は、LPSにより誘導されるTLR4シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR4により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。

さらなる態様において、シャペロニン10は、ウイルス性一本鎖RNAにより誘導されるTLR7シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR7により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。

さらにさらなる態様において、シャペロニン10は、CpGモチーフにより誘導されるTLR9シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR9により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。

シャペロニン10は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：3に示されたポリペプチド配列を含みうる。シャペロニン10は、アセチル化されていてもよく、アセチル化されていなくてもよい。

本発明の第5の局面によれば、疾患または病状の治療または予防のために用いられる場合の組成物であって、シャペロニン10を少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤または補助物質とともに含む組成物であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している組成物が提供される。

本組成物はさらに、Toll様受容体の少なくとも1つのアゴニストを含みうる。組成物はさらに、I型インターフェロンなどの少なくとも1つの免疫修飾物質を含んでもよい。

本発明の第6の局面によれば、疾患または病状の治療または予防のために用いられる場合の組成物であって、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストを含む組成物であり、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している組成物が提供される。

本発明の第7の局面によれば、疾患または病状の治療または予防のための医療薬剤の製造のためのシャペロニン10の使用法であって、シャペロニン10が活性化クラスターのToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している使用法が提供される。

本発明の第8の局面によれば、疾患または病状の治療または予防のための医療薬剤の製造のためのシャペロニン10のアンタゴニストの使用法であって、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している使用法が提供される。

本発明の第9の局面によれば、対象またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器における1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整するための方法であって、シャペロニン10の有効量を投与する段階を含む方法であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌と関連している方法が提供される。

本発明の第10の局面によれば、対象またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器における1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整するための方法であって、シャペロニン10のアンタゴニストの有効量を投与する段階を含む方法であり、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌の調整と関連している方法が提供される。

免疫修飾物質は、例えば、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12またはI型インターフェロンでありうる。I型インターフェロンはIFNαまたはIFNβでありうる。

以上の局面および態様は、野生型および改変型のシャペロニン10、ならびに完全長シャペロニン10ポリペプチド、および免疫調整活性を保っているその断片または誘導体の使用を想定している。

定義
本明細書の文脈において、「含む（comprising）」という用語は、「主として含む（including）が、必ずしも単独で含むというわけではない」ということを意味する。さらに、「含む（comprise）」または「含む（comprises）」といった「含む（comprising）」の変化形も、同様に多様な意味を有する。

本明細書で用いる場合、「治療（treatment）」、「治療すること（treating）」およびそれらの変化形は、疾病状態もしくは症状を治す、疾患の確立を予防する、または疾患もしくは種類のいかんを問わず他の望ましくない症状の進行を、他の様式で予防する、妨げる、遅らせる、改善するもしくは好転させる、任意およびすべての使用法のことを指す。

本明細書で用いる場合、「有効量」という用語は、その意味の範囲内に、非毒性量であるが所望の治療的または予防的な効果を与えるのに十分な作用物質または化合物の量を含む。必要とされる厳密な量は、治療される種、対象の年齢および一般的条件、治療される病状の重症度、投与される特定の作用物質、ならびに投与の様式などの要因に応じて、対象ごとに異なると考えられる。したがって、厳密な「有効量」を特定することは不可能である。しかし、所与の任意の場合に対して、適切な「有効量」は、当業者によって規定通りの実験のみを用いて決定されうる。

「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸から構成される重合体のことを意味する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられるが、本発明の目的においては「ポリペプチド」が完全長タンパク質の一部分を成してもよい。ポリペプチドにはまた、それらの断片、類似体、変異体および誘導体も非限定的に含まれる。そのようなそれらの断片、類似体、変異体および誘導体は、ポリペプチドとの特定の構造的および／または機能的類似性を有しうる。

本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド塩基、リボヌクレオチド塩基、または公知の類似体もしくは天然ヌクレオチド、またはそれらの混合物による一本鎖または二本鎖重合体のことを指す。「ポリヌクレオチド」とう用語の範囲には、ポリヌクレオチドの逆相補物、ならびにポリヌクレオチドの断片、類似体、変異体および誘導体、さらには、高ストリンジェンシー条件下でそのポリヌクレオチドとハイブリダイズする他のポリヌクレオチドが含まれる。

本明細書で用いる場合、「調整すること（modulating）」、「調整する（modulate）」という用語、およびそれらの変化形は、本発明の特定の調節性分子または作用物質の存在下における分子の活性、産生、分泌または機能のレベルが、調節性分子または作用物質の非存在下におけるその活性、産生、分泌または他の機能のレベルに比較して上昇または低下することを指す。これらの用語は、その上昇または低下の数量化のことは意味しない。調整は、所望の結果を生じさせるのに十分な任意の大きさのものであってよく、直接的でも間接的でもよい。

本明細書で用いる「免疫修飾物質」という用語には、1つまたは複数の細胞種によって分泌されて、免疫応答の開始、活性化、維持、増強、成熟、阻害、抑制または増強において役割を果たす分子メディエーターが非限定的に含まれる。

本明細書で用いる「活性化クラスター」という用語は、生物シグナルを生成するように機能する、分子の会合物のことを指す。典型的には、生物シグナルは免疫応答の調整を含み、特にこの調整過程の一部としてToll様受容体シグナル伝達の調整を伴うことがある。活性化クラスターは、例えば、細胞の表面またはエンドソーム内部で会合し、例えばシャペロニン10をToll様受容体アゴニストおよびToll様受容体とともに含みうる。他の分子が活性化クラスターの一部として会合することもあり、これにはCD14が非限定的に含まれる。

本発明をここで、添付の図面を参照しながら説明するが、これは非限定的な例に過ぎない。

野生型ヒトCpn10（GenBankアクセッション番号X75821）のアミノ酸配列はSEQ
ID NO：1に提示されている。N末端に追加的なアミノ酸残基を有する2つの改変型のCpn10のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2および3に提示されている。それをコードするヌクレオチド配列はSEQ ID NO：4に提示されている。本明細書に開示した実施例に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、SEQ ID NO：5〜10に提示されている。

発明を実施する最良の形態
Cpn10は、細胞培養物およびインビボの両方において、TNF-αおよびRANTESなどの炎症誘発性サイトカインの産生を低下させることが以前に示されている（例えば、Johnson et al., 2005, J Biol Chem 280:4037-4047および国際特許出願PCT／AU2005／000041、国際公開公報第2005／067959号を参照。これらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）。これらの知見は、例えば多発性硬化症、関節リウマチおよび移植片対宿主病を含む、種々の炎症性疾患の治療のための治療薬としてのCpn10の使用を裏付ける。

Toll様受容体シグナル伝達の調整および免疫修飾物質の産生のための方法
本明細書に開示したように、本発明者らはこれまでに、ヒトCpn10が、TLR3アゴニストであるポリI：Cとともに投与された場合にIFNβおよびIFNαの産生の顕著な相乗的上昇を引き起こすことを示している。さらに、Cpn10は、NF-κB活性化の低下によって測定されるように、TLR7およびTLR9を介したシグナル伝達を調整することが示されている。

その上、本発明者らは驚いたことに、Cpn10が、LPSによる刺激後に細胞表面で「活性化クラスター」の形態としてTLR4と会合するが、Cpn60またはGroESは会合しないことも示している。本発明者らはさらに、Cpn10がリポテイコ酸（LTA）による刺激後にTLR2と、ウイルス性一本鎖RNAおよび／またはイミキモドによる刺激後にTLR7と、ならびにCpG DNAによる刺激後にTLR9と会合することも示している。それぞれの場合に、このような会合は、Cpn10が、特定のTLRおよびそのアゴニストを含む「活性化クラスター」と相互作用する形態にある。

したがって、本発明は、対象における、またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器におけるToll様受容体シグナル伝達を調整するための方法であって、シャペロニン10の有効量を投与する段階を含む方法であり、Toll様受容体シグナル伝達がシャペロニン10と活性化クラスター内のToll様受容体との会合を含む方法を提供する。

また、Toll様受容体シグナル伝達が、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストの有効量を投与することによって調整されてもよく、この際、Toll様受容体シグナル伝達はシャペロニン10と活性化クラスター内のToll様受容体との会合を含み、アンタゴニストはシャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げる、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げる。

活性化クラスターは、細胞の表面に、またはエンドソームなどの細胞内小胞の表面に位置しうる。活性化クラスターは、シャペロニン10、Toll様受容体、および任意で少なくとも1つの他の分子を含みうる。この少なくとも1つの他の分子には、Toll様受容体アゴニストが含まれうる。

1つの態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR2およびリポテイコ酸（LTA）を含む。1つの追加的な態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR3および二本鎖RNAを含む。もう1つの態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR4およびLPSを含む。さらなる態様において、活性化クラスターはシャペロニン10、TLR7および一本鎖RNAを含む。さらにさらなる態様において、活性化クラスターは、シャペロニン10と、TLR9と、CpGモチーフを含むDNAとを含む。

シャペロニン10は、天然由来の、組換え的に生産された、または合成的に生産されたシャペロニン10のいずれでもよい。シャペロニン10が真核生物起源のものであってもよい。シャペロニン10がヒトシャペロニン10であってもよい。シャペロニン10は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：3に示されたポリペプチド配列を含みうる。シャペロニン10はアセチル化されていてもアセチル化されていなくてもよく、単一または複数のN末端伸長部を含んでもよい。シャペロニン10は、シャペロニン10をコードするポリヌクレオチドの形態で投与してもよい。シャペロニン10をコードするポリヌクレオチドを、プロモーターと機能的に連結させて遺伝子構築物中に配置することもできる。ポリヌクレオチドはSEQ ID NO：4に示された配列を含みうる。

本方法はさらに、少なくとも1つの追加的な作用物質の投与を含みうる。作用物質は免疫修飾物質でありうる。免疫修飾物質は、例えば、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12またはI型インターフェロンでありうる。I型インターフェロンはIFNαまたはIFNβでありうる。

典型的には、Cpn10の調整活性は、例えば、RAW264.7細胞を伴う免疫調整アッセイ法との関連で、本発明者らによって実証され本明細書に開示されているように、まずTLRをCpn10に曝露させ、続いて1つまたは複数のTLRアゴニストを添加することによって示される。アゴニストは、細菌性、真菌性、酵母性またはウイルス性の病原体、それに由来するもしくはそれによって産生される分子もしくは成分、または合成化合物であってよい。また、TLRアゴニストが、アゴニストとしてヒトDNAを有するTLR9によって例示されるように、自己免疫疾患に伴ってみられる損傷ヒト細胞による産物であってもよい。TLR3アゴニストの非限定的な例には、二本鎖RNAおよびポリI：Cが含まれる。TLR7アゴニストの非限定的な例には、一本鎖RNA、レシキモドおよびイミキモドなどのイミダゾキノリン類、ならびにイサトリビンなどの低分子アゴニストが含まれる。TLR9アゴニストの非限定的な例には、非メチル化CpGリッチモチーフを含むDNA、および合成CpG含有オリゴヌクレオチドが含まれる。しかし、当業者は、本発明がTLRアゴニストのアイデンティティによって限定されないことを容易に理解すると思われる。

本発明はまた、対象における、またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器における1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整するための方法であって、シャペロニン10の有効量を投与する段階を含む方法であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、活性化クラスターの形成が1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌の調整と関連している方法が提供される。

1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌の調整を、シャペロニン10のアンタゴニストの有効量を投与することによって実現することもでき、この際、アンタゴニストはシャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、活性化クラスターの形成は、1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌の調整と関連している。

疾患を治療または予防するための方法
本明細書に提示した本発明者らの知見は、急性および慢性のウイルス性および細菌性の疾患を含む、種々の疾患および病状の臨床的管理におけるCpn10の使用を裏付ける。したがって、本発明は、Cpn10の投与を含む、ウイルスまたは細菌の感染によって引き起こされるまたは他の様式で関連のあるウイルス性および細菌性の疾患および障害の治療または予防のための方法を提供する。

加えて、TLR3、TLR7および／またはTLR9の刺激は、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患および全身性炎症を含むさまざまな他の障害に対する天然の応答、ならびに／またはその治療的処置にも関係することが示されている。したがって、本発明はまた、Cpn10の投与を含む、そのような疾患および障害の治療または予防のための方法も想定している。

したがって、本発明は、対象における疾患または病状を治療または予防するための方法であって、シャペロニン10の有効量を対象に投与する段階を含む方法であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強または維持と関連している方法を提供する。

前記方法はまた、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストの有効量を対象に投与することも含んでもよく、この際、アンタゴニストはシャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、活性化クラスターの形成は疾患または病状の確立および／または進行と関連している。

疾患または病状へとは、敗血性ショック、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬、心疾患、アテローム性動脈硬化、慢性肺疾患、悪液質、多発性硬化症、GVHDおよび癌を含む、ウイルス性、真菌性、酵母性または細菌性の感染症、急性または慢性の炎症性疾患を含む群が、非限定的に含まれうる。その確立および／もしくは進行または開始、それに対する免疫応答の増強および／または維持にシャペロニン10と活性化クラスター内のToll様受容体との会合が関与する、任意の疾患または病状が、本発明の範囲に含まれるものと想定される。

1つの態様において、シャペロニン10は、LTAにより誘導されるTLR2シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR2により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。1つの追加的な態様において、シャペロニン10は、二本鎖RNAにより誘導されるTLR3シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR3により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。もう1つの態様において、シャペロニン10は、LPSにより誘導されるTLR4シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR4により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。さらなる態様において、シャペロニン10は、ウイルス性一本鎖RNAにより誘導されるTLR7シグナル伝達を調節する。シャペロニン10が、TLR7により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。さらにさらなる態様において、シャペロニン10は、CpGモチーフにより誘導されるTLR9シグナル伝達を調節する。シャペロニン10は、TLR9により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整してもよい。

組成物およびその使用法
本発明は、疾患または病状の治療または予防のために用いられる場合の組成物であって、シャペロニン10を少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤または補助物質とともに含む組成物であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している組成物が提供される。

本組成物はさらに、Toll様受容体の少なくとも1つのアゴニストを含みうる。組成物がさらに、I型インターフェロンなどの少なくとも1つの免疫修飾物質を含んでもよい。

他の組成物が疾患または病状の治療または予防のために用いられ、この組成物は、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストを含む組成物であり、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している組成物である。

疾患または病状の治療または予防のための医療薬剤の製造のためのシャペロニン10の使用法であって、シャペロニン10が活性化クラスターのToll様受容体と会合し、活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している使用法も想定される。

疾患または病状の治療または予防のための医療薬剤の製造のためのシャペロニン10のアンタゴニストの使用法であって、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している使用法も想定される。

一般に、本発明の方法に従って用いるのに適した組成物は、当業者に公知である方法および手順に従って調製することができ、したがって薬学的に許容される担体、希釈剤および／または補助物質を含みうる。

併用療法
当業者は、本発明の方法に従って、Cpn10を単独で、または1つまたは複数の追加的な作用物質とともに投与しうることを理解すると思われる。例えば、Cpn10を、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7およびTLR9のうち1つまたは複数を刺激しうる1つまたは複数のTLRアゴニストとともに投与することができる。加えて、本発明は、Cpn10を、疾患および障害の治療のための他の治療的アプローチとともに組み合せて用いる併用療法も想定している。例えば、Cpn10は、IFNβまたはIFNαなどのI型インターフェロンによる治療法に反応するウイルス性疾患の治療に有用な可能性がある。さらに、アゴニストにより誘導されるTLR7およびTLR9の活性化は、放射線療法に対する腫瘍の反応を強めることが以前に報告されているため、Cpn10を癌の治療のために放射線療法と組み合せて用いることも考えられる。

このような併用療法のためには、所望の効果を与えるために、併用療法の各成分を同時に、または任意の順序で逐次的に、または異なる時点で投与することができる。または、成分を配合物として単一投薬単位の中に一緒に配合することもできる。別々に投与する場合には、成分を同じ投与経路によって投与することが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。

Cpn10
本発明の局面および態様によれば、治療を必要とする対象にCpn10の有効量が投与される。特定の態様において、治療しようとする対象はヒトであり、したがって、Cpn10ポリペプチドはヒトのCpn10ポリペプチドである。当業者は、治療しようとする種に由来するようにCpn10を選択しうるように、本発明に従って用いられるCpn10の厳密なアイデンティティは、例えば、治療しようとする種などの数多くの要因に依存して変更しうることを理解すると思われる。

典型的には、Cpn10は組換えCpn10である。Morton et al., 2000（lmmunol Cell Biol 78:603-607）、Ryan et al., 1995（J Biol Chem 270:22037-22043）およびJohnson et al., 2005（J Biol Chem 280:4037-4047）に記載された方法は、組換えCpn10タンパク質の適した生産方法の例であるが、当業者は、本発明が用いられる精製または生産の方法によって限定されず、本発明の方法および組成物に従って用いる目的でCpn10を生産するために任意の他の方法を用いうることを理解すると思われる。

本発明に従って用いるためのCpn10ポリペプチドおよびペプチド断片は、標準的な組換え核酸手法を用いて入手することができ、または例えば従来の液相もしくは固相合成手法を用いて合成してもよい。Cpn10ペプチドを、endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-Cおよびブドウ球菌V8-プロテアーゼなどの1つまたは複数のプロテイナーゼによるポリペプチドの消化によって生産することもできる。消化されたペプチド断片は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法などによって精製することができる。

本発明の態様は、Cpn10をコードするポリヌクレオチドの投与も想定している。このような状況において、ポリヌクレオチドは典型的には、対象に対するポリヌクレオチドの投与後に適切なポリペプチド配列が産生されるように、プロモーターと機能的に連結される。ポリヌクレオチドは、ベクター中で対象に投与することができる。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または外来配列の挿入、真核細胞へのそれらの導入および導入された配列の発現のために適合化された任意の他の適した媒体であってよい。典型的には、ベクターは真核生物発現ベクターであり、これはプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列などの発現制御配列およびプロセシング配列を含みうる。投与しようとする核酸構築物は、裸のDNAを含んでもよく、または1つもしくは複数の薬学的に許容される担体と一緒になった組成物の形態にあってもよい。

Cpn10ポリペプチドは、SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列を有しうるが、それには限定されない。Cpn10をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：4に示された通りであってもよく、またはSEQ ID NO：4の配列とハイブリダイズする程度にそれに対して十分な配列同一性を示してもよい。代替的な態様において、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：4に示された配列に対して、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、96％、97％、98％または99％の同一性を有しうる。

本明細書で用いる「ポリペプチド」および「ポリヌクレオチド」という用語の範囲には、その断片および変異体が含まれる。これは一例に過ぎないものの、国際公開公報第95／15338号に記載されたCpn10のペプチド断片を、本発明の局面および態様に従って用いてもよい。

「断片」という用語は、完全長Cpn10タンパク質の構成要素をコードする、またはその構成要素である、核酸配列またはポリペプチド配列のことを指す。ポリペプチドに関して、断片は、完全長タンパク質と共通する質的な生物活性を有する。本発明に従って用いられるCpn10生物活性断片は、典型的には、対応する完全長タンパク質の免疫修飾物質活性の少なくとも約50％、より典型的にはそのような活性の少なくとも約60％、より典型的にはそのような活性の少なくとも約70％、より典型的にはそのような活性の少なくとも約80％、より典型的にはそのような活性の少なくとも約90％、およびより典型的にはそのような活性の少なくとも約95％を有しうる。

本明細書で用いる「変異体（variant）」という用語は、かなり類似した分子のことを指す。一般に、核酸配列変異体は、共通の質的な生物活性を有するポリペプチドをコードする。一般に、ポリペプチド配列変異体も、共通の質的な生物活性を有する。さらに、これらのポリペプチド配列変異体は、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有しうる。

さらに、変異体ポリペプチドは類似体を含んでもよく、この際、「類似体」という用語はCpn10の誘導体であるポリペプチドのことを意味し、その誘導体は、ポリペプチドが天然のCpn10と実質的に同じ機能を保つような1つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、置換を含む。ポリペプチドの活性を変化させることなく、ポリペプチド内部のいくつかのアミノ酸を変更しうることは、当技術分野で周知である（保存的置換）。「保存的アミノ酸置換」という用語は、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）の内部での、1つのアミノ酸による、類似した性質を有する別のアミノ酸の置換または置換えのことを指す。例えば、荷電アミノ酸であるグルタミン酸（Glu）による、同様に荷電したアミノ酸であるアスパラギン（Asp）の置換は、保存的アミノ酸置換であると考えられる。アミノ酸付加は、Cpn10ポリペプチドまたはその断片と、第2のポリペプチドまたはペプチド、例えばポリヒスチジンタグとの融合、マルトース結合タンパク質との融合、グルタチオンSトランスフェラーゼとの融合、緑色蛍光タンパク質との融合、またはFLAGもしくはc-mycなどのエピトープタグの付加に起因するものであってよい。例えば、野生型ヒトCpn10ポリペプチドが、付加的なGSMトリペプチド部分をN末端に（SEQ ID NO：2；例えば、国際公開公報第95／15338号を参照。その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）、または付加的なアラニン（A）側鎖をN末端に（SEQ ID NO：3；国際公開公報第2004／041300号を参照。その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）含んでもよい。その他の突然変異型のCpn10には、豪州特許仮出願（Australian provisional patent application）第2005904765号に開示されたものが含まれ、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。本発明はまた、そのような修飾型のCpn10をコードするポリヌクレオチドの使用も想定している。

Cpn10変異体は、当業者に周知である方法を用いるランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発などによる、Cpn10タンパク質の突然変異誘発、またはそれをコードする核酸の突然変異誘発によって作製することができる。このような方法は、例えば、Current Protocols In Molecular Biology（Chapter 9）, Ausubel et al., 1994, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。変異体および類似体にはまた、他の化学部分と複合体形成したポリペプチド、融合タンパク質または他の様式で移行後に修飾されたものも含まれる。適した修飾の例は、同時係属中の国際特許出願PCT／AU2005／000041；国際公開公報第2005／067959号に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。

さらに、Cpn10ポリペプチドまたはその断片が、例えばアセチル化、アミド化、カルバモイル化、還元的アルキル化および当業者に公知である他の修飾などの側鎖修飾を含む、他の翻訳後修飾を有してもよい。

Cpn10ポリヌクレオチドにはさらに、本明細書に定義したCpn10ポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする任意のポリヌクレオチドが含まれうるが、それには限定されない。本明細書で用いる「高ストリンジェンシー」という用語は、2つのポリヌクレオチドがハイブリダイズする可能性のある条件のことを指し、これには例えば、溶液中の塩および／または界面活性剤の濃度、2つのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に用いる溶液の温度、ならびにハイブリダイゼーションの時間が含まれうる。したがって、本明細書で用いる「高ストリンジェンシー」という用語は、2つのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、そのようなポリヌクレオチドが高度の相同性を有する場合にのみ導くような溶液中での条件のことを指す。相同性の程度には、約50％〜99％の範囲が非限定的に含まれうる。すなわち、「高ストリンジェンシー」条件は、0〜10％のドデシル硫酸ナトリウムおよび／もしくは0〜1×塩化ナトリウム-クエン酸ナトリウムを含み、温度が約60℃〜70℃である洗浄用緩衝液、またはハイブリダイゼーション用の「高ストリンジェンシー」溶液が得られると考えられる緩衝液、温度もしくは時間の任意の他の組み合わせの使用を非限定的に含みうる。

投与の経路
組成物は標準的な経路によって投与することができる。一般に、組成物は、非経口的（例えば、静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内）、経口的または局所的な経路によって投与することができる。投与は全身的、局部的または局所的であってよい。任意の所与の状況において用いられる特定の投与経路は、治療しようとする病状の性質、病状の重症度および程度、送達しようとする特定の化合物の必要投与量、ならびに化合物の潜在的な副作用を含む、数多くの要因に依存すると考えられる。

本発明の組成物は、注射による投与のために適した形態、経口摂取のために適した形態（例えば、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、エリキシル剤など）、局所投与のために適した軟膏、クリームまたはローションの形態、点眼剤としての送達のために適した形態、経鼻吸収または経口吸入などによる吸入による投与のために適したエアロゾル形態、非経口的投与、すなわち皮下、筋肉内または静脈内注射のために適した形態にあってよい。

注射用の溶液または懸濁液としての投与のための、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または担体には、リンゲル液、等張食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノールおよび1,2プロピレングリコールが含まれうる。

希釈剤、担体、補助物質および添加剤
一般に、適した組成物は、当業者に公知の方法によって調製することができ、これは薬学的に許容される希釈剤、補助物質および／または添加剤を含みうる。希釈剤、補助物質および添加剤は、組成物の他の成分と適合性があって、そのレシピエントに対して有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。

薬学的に許容される担体または希釈剤の例には、以下のものが非限定的に含まれる：脱塩水または蒸留水、食塩液、植物ベースの油、例えばピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油またはヤシ油など；シリコーン油、これにはメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリソルポキサン（methylphenyl polysolpoxane）などのポリシロキサン類が含まれる；揮発性シリコーン；鉱油、例えば流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクアランなど；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；低級アルカノール、例えばエタノールまたはイソプロパノールなど；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコールまたはグリセリンなど；脂肪酸エステル、例えばイソプロピルパルミテート、イソプロピルミリステートまたはオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドン；寒天；カラゲナン；トラガカントゴムまたはアラビアゴム、およびワセリン。典型的には、担体または担体は、組成物の重量比にして10％〜99.9％を占める。

経口用途のために適した担体、希釈剤、添加剤および補助物質のいくつかの例には、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが非限定的に含まれる。加えて、これらの経口製剤は、適した香味剤および着色剤を含んでもよい。カプセル形態で用いる場合には、カプセル剤を、崩壊を遅らせるモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの化合物でコーティングしてもよい。

補助物質には、典型的には、軟化剤、乳化剤、増粘剤、保存料、殺菌剤および緩衝剤が非限定的に含まれる。

経口投与用の固体形態は、ヒトおよび獣医学的な薬学実務において許容される結合剤、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、香味剤、コーティング剤、保存料、潤滑剤ならびに／または時間遅延剤を非限定的に含みうる。適した結合剤には、アラビアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが非限定的に含まれる。適した甘味剤には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが含まれる。適した崩壊剤には、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が非限定的に含まれる。適した希釈剤には、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたは第二リン酸カルシウムが非限定的に含まれる。適した香味剤には、ペパーミント油、冬緑油、チェリー、オレンジまたはラズベリーの香味剤が非限定的に含まれる。適したコーティング剤には、アクリル酸および／もしくはメタクリル酸および／もしくはそれらのエステルの重合体もしくは共重合体、蝋状物質、脂肪アルコール、ゼイン、セラックまたはグルテンが非限定的に含まれる。適した保存料には、安息香酸ナトリウム、ビタミンB、α-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは重亜硫酸ナトリウムが非限定的に含まれる。適した潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが非限定的に含まれる。適した時間遅延剤には、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルが含まれる。

経口投与用の液体形態は、上記の作用物質に加えて液体担体を含みうる。適した液体担体には、水、油、例えばオリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、落花生油、ヤシ油など、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドまたはそれらの混合物が非限定的に含まれる。

経口投与用の懸濁液は、分散剤および／または懸濁剤をさらに含みうる。適した懸濁剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが非限定的に含まれる。適した分散剤には、レシチン、ステアリン酸などの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトール-モノオレエートもしくはポリオキシエチレンソルビトール-ジオレエート、ポリオキシエチレンソルビトール-ステアレートまたはポリオキシエチレンソルビトール-ラウレート、ポリオキシエチレンソルビタン-モノオレエートもしくはジオレエート、ポリオキシエチレンソルビタン-ステアレートまたはポリオキシエチレンソルビタン-ラウレートなどが非限定的に含まれる。

経口投与用の乳濁液は、1つまたは複数の乳化剤をさらに含みうる。適した乳化剤には、以上に例示した分散剤、またはグアーガム、アラビアゴムもしくはトラガカントゴムなどの天然ゴムが非限定的に含まれる。

非経口的に投与しうる組成物を調製するための方法は当業者には明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton、Pa.にさらに詳細に記載されており、それは参照により本明細書に組入れられる。

本発明の局所用製剤は、有効成分を、1つまたは複数の許容される担体、および任意で、任意の他の治療用成分とともに含む。局所投与のために適した製剤には、治療が必要な部位に対する皮膚を通じての浸透のために適した液体または半流動体、例えばリニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤など、および眼、耳または鼻に対する投与のために適した滴剤が非限定的に含まれる。

本発明による滴剤は、無菌の水性または油性の溶液または懸濁液を含みうる。これらは、有効成分を、殺菌薬および／または殺真菌薬および／または任意の他の適した保存料の水溶液中に溶解させること、ならびに任意で界面活性剤を含めることによって調製しうる。その結果得られた溶液を、続いて、濾過によって透明化し、適した容器に移して滅菌することができる。滅菌は以下によって行うことができる：90℃〜100℃でのオートクレーブ処理もしくは維持を30分間行うこと、または濾過の後に無菌的手法によって容器に移すこと。滴剤中に含めるのに適した殺菌薬および殺真菌薬の例には、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（0.002％）、塩化ベンザルコニウム（0.01％）および酢酸クロルヘキシジン（0.01％）がある。油性溶液の調製のために適した溶媒には、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが非限定的に含まれる。

本発明によるローション剤には、皮膚または眼に対する適用のために適したものが含まれる。眼用ローション剤は、任意で殺菌薬を含む滅菌水溶液を含むことができ、滴剤の調製に関して上述したものに類似した方法によって調製することができる。皮膚に対する適用のためのローション剤またはリニメント剤も、乾燥を早め、皮膚を冷却するための作用物質、例えばアルコールもしくはアセトン、および／またはグリセロールなどの保湿剤、またはヒマシ油もしくは落花生油などの油を非限定的に含みうる。

本発明によるクリーム剤、軟膏剤またはペースト剤は、外用のための有効成分の半固形製剤である。それらは、微細または微粉状の形態にある有効成分を、単独で、または水性もしくは非水性の流動体中にある液体または懸濁液として、油脂性または非油脂性の基剤と混合することによって製造することができる。基剤には、炭化水素、例えば硬、軟もしくは流動パラフィン、またはグリセロール、蜜蝋、金属セッケン；ゴム糊；天然物由来の油、例えば扁桃油、コーン油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油；羊毛脂もしくはその誘導体、または脂肪酸、例えばステアリン酸またはオレイン酸が、プロピレングリコールまたはマクロゴールなどのアルコールとともに含まれうる。

組成物には、陰イオン性、陽イオン性または非イオン性の界面活性剤、例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの、任意の適した界面活性剤を組み入れることができる。天然ゴム、セルロース誘導体、または珪質シリカなどの無機材料、およびラノリンなどの他の成分を含めることもできる。

組成物をリポソームの形態で投与することもできる。リポソームは一般にリン脂質または他の脂質物質から得られ、水性媒体中に分散された単層または多層の水和液体結晶から形成される。リポソームを形成することのできる、任意の無毒性で生理的に許容され、かつ代謝されうる脂質を用いることができる。リポソーム形態にある組成物は、安定剤、保存料、添加剤などを含みうる。好ましい脂質は、天然性および合成性の両方の、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成するための方法は当技術分野で公知であり、この点に関する具体的な参照は以下のもの：Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y.(1976), p. 33 et seq.に対してなされ、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。

組成物を、ポリエチレングリコール（PEG）誘導体のアレイと結合させることもできる。タンパク質に対するPEGの付加（PEG化）は、タンパク質の血漿クリアランス速度を低下させ、それによってその有効性を高めるための十分に確立された方法である（Nucci et al., 1991, Adv. Drug Del. Rev. 6:133）。PEG化のそのほかの恩典には、タンパク質の安定性の増大、免疫原性の低下、溶解性の向上およびタンパク質分解に対する感受性の低下が含まれうる（Sheffield W. 2001, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 1:1-22）。PEG分子は、-(OCH₃CH₂)_n-OHという基本的な反復構造を含み、その分子量に従って複数の群に分類される。PEG誘導体は、流体力学的半径を増大させるためにタンパク質と結合され、一般に、それらの半減期の延長は結合したPEG鎖のサイズと直接的に関係する（Sheffield W. 2001, Gurr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 1:1-22）。

また、組成物を微粒子の形態で投与することもできる。ポリ乳酸（PLA）、ポリ乳酸グリコール酸（PLGA）およびイプシロン-カプロラクトン（ε-カプロラクトン）から形成された生分解性微粒子は、血漿中半減期を延長させ、それによって有効性を持続化させるために薬物担体として幅広く用いられている（R. Kumar, M., 2000, J Pharm Pharmaceut Sci. 3(2) 234-258）。微粒子は、ワクチン、抗生物質およびDNAを含む、ある範囲にわたる薬物候補の送達のために製剤化されている。その上、これらの製剤は、非経口的な皮下注射、静脈内注射および吸入を含む、さまざまな送達経路用に開発されている。

組成物には、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル（SAIB）および有機溶媒または複数の有機溶媒の混合物から構成される、制御放出用マトリックスを組み入れることができる。粘度をさらに高め、放出速度を低下させるための放出調節剤として媒体にポリマー性添加物を添加してもよい。SAIBはよく知られた食品添加物である。これは極めて疎水性が高く、イソ酪酸基6に対して酢酸基2という理論的比で完全にエステル化されたスクロース誘導体である。混合エステルとして、SAIBは結晶化しないが、透明な粘性液体として存在する。SAIBをエタノールまたはベンジルアルコールなどの薬学的に許容される有機溶媒と混合すると、混合物の粘度は注射が可能となるほどに十分に低下する。有効薬物成分をSAIB送達媒体に添加して、SAIB溶液または懸濁液の製剤を形成させることができる。製剤を皮下注射すると、溶媒が、SAIB-薬物またはSAIB-薬物-ポリマー混合物をインサイチューで形成するデポー剤として設置することを可能とするマトリックスから拡散する。

本発明の目的において、分子および作用物質は、対象に対して組成物として治療的または予防的に投与されうる。治療的な用途において、組成物は、疾患にすでに罹患している患者に対して、疾患およびその合併症を治癒させる、または少なくとも阻止するのに十分な量で投与される。組成物は、患者を有効に治療するのに十分な、分子または作用物質の量を提供すべきである。

投与量
任意の特定の患者に対する治療的に有効な用量レベルは、以下のものを含む、さまざまな要因に依存すると考えられる：治療しようとする障害、および障害の重症度；用いる分子または作用物質の活性；用いる組成物；患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別および食事内容；投与の時間；投与の経路；分子または作用物質の捕捉の速度；治療の持続時間；治療と組み合わせて、または同時に用いられる薬物、さらに医学において周知である他の関連した要因。

当業者は、規定通りの実験により、適用可能な疾患を治療するために必要と考えられる作用物質または化合物の有効な無毒性量を決定しうると考えられる。

一般に、有効投与量は、体重1kg当たり24時間につき約0.0001mg〜約1000mg；典型的には、体重1kg当たり24時間につき約0.001mg〜約750mg；体重1kg当たり24時間につき約0.01mg〜約500mg；体重1kg当たり24時間につき約0.1mg〜約500mg；体重1kg当たり24時間につき約0.1mg〜約250mg；体重1kg当たり24時間につき約1.0mg〜約250mgの範囲にあると予想される。より典型的には、有効用量の範囲は、体重1kg当たり24時間につき約1.0mg〜約200mg；体重1kg当たり24時間につき約1.0mg〜約100mg；体重1kg当たり24時間につき約1.0mg〜約50mg；体重1kg当たり24時間につき約1.0mg〜約25mg；体重1kg当たり24時間につき約5.0mg〜約50mg；体重1kg当たり24時間につき約5.0mg〜約20mg；体重1kg当たり24時間につき約5.0mg〜約15mgの範囲にあると予想される。

または、有効投与量が、最大で約500mg／m²であってもよい。一般に、有効投与量は、約25〜約500mg／m²、好ましくは約25〜約350mg／m²、より好ましくは約25〜約300mg／m²、さらにより好ましくは約25〜約250mg／m²、さらになお好ましくは約50〜約250mg／m²、さらになおより好ましくは約75〜約150mg／m²の範囲にあると予想される。

典型的には、治療的用途において、治療は疾病状態の持続時間にわたると考えられる。

さらに、当業者には、個々の投薬の最適な量および間隔が、治療しようとする疾病状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療される特定の個体の性質によって決まると考えられることは明らかであると思われる。また、そのような最適な条件を従来の手法によって決定することもできる。

また、最適な治療コース、例えば、規定された日数にわたって1日当たりに投与される組成物の投薬回数が、当業者によって従来の一連の治療判定検査を用いて確認されうることも当業者には明らかであると思われる。

Cpn10のアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、Cpn10のアゴニストおよびアンタゴニストの使用法、ならびにそのようなアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングおよび生産の方法も想定している。

Cpn10のアゴニストおよびアンタゴニストは、Toll様受容体シグナル伝達および免疫修飾物質の分泌に対する効果に従って、特別に設計またはスクリーニングすることができる。

抗体は、Cpn10またはその断片もしくは類似体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する可能性がある。適した抗体は、Cpn10ポリペプチドの分離した領域または断片、特にプロテアーゼ活性および／またはパートナーもしくは基質との結合性の付与に関与するものから調製されることが好ましい。抗原性Cpn10ポリペプチドは、少なくとも約5個、好ましくは少なくとも約10個のアミノ酸を含む。

適した抗体の作製のための方法は、当業者には容易に明らかであると考えられる。例えば、典型的にはFab部分を含む、抗Cpn10モノクローナル抗体を、Antibody-A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1988)に記載されたハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。

本質的には、Cpn10またはその断片もしくは類似体を標的とするモノクローナル抗体の調製には、培養下にある連続継代細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の手法を用いることができる。これらには、Kohler et al., 1975, Nature, 256:495-497によって最初に開発されたハイブリドーマ法、ならびにトリオーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72）およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc.,(1985)）が含まれる。不死性の抗体産生細胞株を、融合以外の手法により、例えば、発癌性DNAによるBリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン-バーウイルスによるトランスフェクションによって作出することもできる。例えば、M. Schreier et al., 「Hybridoma Techniques」 (1980)；Hammerling et al.,「Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas」 (1981)；Kennett et al.,「Monoclonal Antibodies」(1980)を参照のこと。

以上をまとめると、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する1つの手段では、骨髄腫または他の自己永続的な細胞株を、その認識因子結合部分、または認識因子、またはその起源特異的DNA結合部分による過剰免疫化を受けた哺乳動物の脾臓から入手したリンパ球と融合させる。本発明の実施において有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その認識因子と免疫反応する能力、および標的細胞における特定の転写活性を阻害する能力によって同定される。

本発明の実施において有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性を有する抗体分子を分泌するハイブリドーマを含む栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養物を惹起することによって産生させることができる。培養物を、ハイブリドーマが抗体分子を培地中に分泌するのに十分な条件下および時間にわたって維持する。続いて、抗体を含む培地を収集する。続いて、抗体分子を周知の手法によってさらに単離することができる。

同様に、ポリクローナル抗体の生産のために用いうる手順も当技術分野にはさまざまなものがある。抗Cpn10ポリクローナル抗体の生産のためには、ウマ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを非限定的に含む、さまざまな宿主動物に対して、Cpn10またはその断片もしくは類似体の注射による免疫処置を行うことができる。さらに、Cpn10ポリペプチドまたはその断片もしくは類似体を、免疫原性担体、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）と結合させることができる。また、免疫学的応答を高めるために、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの金属ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG（カルメット-ゲラン菌）およびコリネバクテリウム-パルブム（Corynebacterium parvum）などの有用と考えられるヒトアジュバントを非限定的に含む、種々のアジュバントを用いてもよい。

所望の抗体に関するスクリーニングを、当技術分野で公知のさまざまな手法によって行うこともできる。抗体の免疫特異的結合に関するアッセイ法には、例えば、ラジオイムノアッセイ法、ELISA（固相酵素免疫アッセイ法）、サンドイッチイムノアッセイ法、免疫放射定量アッセイ法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、インサイチューイムノアッセイ法、ウエスタンブロット法、沈殿反応、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、免疫蛍光アッセイ法、プロテインAアッセイ法および免疫電気泳動アッセイ法などが非限定的に含まれる（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照）。抗体結合は、一次抗体上の検出可能な標識によって検出することができる。または、抗体を、適切に標識された二次抗体または試薬とのその結合によって検出することもできる。イムノアッセイ法における結合を検出するための方法はさまざまなものが当技術分野で公知であり、それらは本発明の範囲に含まれる。

Cpn10またはその断片もしくは類似体に対して産生された抗体（またはその断片）は、Cpn10に対する結合親和性を有する。好ましくは、抗体（またはその断片）は、約10⁵M^-1を上回る結合親和性またはアビディティーを有し、それはより好ましくは約10⁶M^-1を上回り、より好ましくは約10⁷M^-1をさらに上回り、最も好ましくは約10⁸M^-1を上回る。

本発明による抗体の適した量を入手することに関して、無血清培地を用いるバッチ発酵を用いて抗体を製造することもできる。発酵の後に、クロマトグラフィーおよびウイルスの失活／除去の段階を組み入れた多段階手順によって抗体を精製することができる。例えば、抗体をまずプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって分離し、続いて脂質エンベロープを有するウイルスを失活させるために溶媒／界面活性剤で処理する。さらなる精製、典型的には陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィーによるものを、残留性のタンパク質、溶媒／界面活性剤および核酸を除去するために用いてもよい。精製された抗体を、ゲル濾過カラムを用いて、さらに精製して0.9％食塩水中に調合することもできる。調合されたバルク調製物は、続いて滅菌し、ウイルス濾過を行って、分配することができる。

抗体以外のアゴニストおよびアンタゴニストも想定している。アゴニストまたはアンタゴニストの候補は、Toll様受容体と、および任意でToll様受容体アゴニストと、分子複合体を形成する能力によって同定することができる。さらに、アンタゴニストの候補を、Cpn10とToll様受容体またはToll様受容体アゴニストとを含む分子複合体の形成を防止または妨害する能力によって同定することもできる。

コンビナトリアルライブラリーのような合成化学物質ライブラリーなどの分子ライブラリーのスクリーニング、構造データベースのコンピュータ支援スクリーニング、コンピュータ支援によるモデル化および／もしくは設計、または分子結合性相互作用を検出するより慣習的な生物物理学的手法を含め、アゴニストおよびアンタゴニストの同定および生産のための手法および手順は、当業者に周知である。

本発明をここで、以下の具体的な実施例を参照しながらさらに詳細に説明するが、それらは本発明の範囲を何らか限定するものとみなされるべきではない。

実施例
組換えヒトCpn10
以下の実施例1〜4に記載した実験では、組換えヒトCpn10（GenBankアクセッション番号X75821）を、Johnson et al., 2005（J Biol Chem 280:4037-4047）に記載された通りに、N末端アラニン残基を伴う形で大腸菌（E. coli）において産生させた。純度は、SDS-PAGEによって97％を上回ることが確かめられた。Cpn10の凍結アリコートを使用前に1回のみ解凍させた。すべてのCpn10バッチが、GroEL媒介性ロダネーゼリフォールディングアッセイ法において大腸菌GroESと同じモル活性を示した（非提示データ）。

実施例1‐ポリI：Cの存在下における抗ウイルス性サイトカインIFNβの産生
TLR3の選択的アゴニストであるポリI：C（ポリイノシン酸-ポリシチジル酸）と併用投与した場合の、Cpn10の、抗ウイルス性サイトカインであるインターフェロン-β（IFNβ）の産生に対する影響を明らかにするために実験を行った。

実験は、Johnson et al., 2005（J Biol Chem 280:4037-4047）に記載された通りに、マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7（ATCCアクセッション番号TIB71）において実施した。手短に述べると、RAW264.7細胞を2×10⁵個／ウェルで24ウェルプレートに播き、一晩培養した（37℃、5％CO₂）。組換えヒトCpn10（10μg／ml〜200μg／mlの濃度）または緩衝液を2組ずつの細胞に添加して2時間おいた後に、ポリI：C（tlrl-pic、InvivoGen, San Diego, CA）を最終濃度が100μg／mlとなるように添加した。24時間後に上清を収集し、特異的ELISAを製造元の指示に従って用いて（カタログ番号424001、R&D Systems Inc, Minneapolis, MN）、IFNβレベルに関して分析した。

図1に示されているように、刺激されていないRAW264.7細胞は、培養上清中に検出可能なIFNβを放出しなかった。Cpn10の非存在下において、100μg／mlのポリI：Cによる刺激は、RAW264.7培養上清中への292pg／mlのIFNβの放出を引き起こした。Cpn10の用量を10μg／mlから最高200μg／mlまで増やしながら添加すると、培養上清中のIFNβレベルの用量依存的な上昇が引き起こされ、150μg／mlのCpn10にてIFNβが900pg／mlという最高レベルに達した。

実施例2‐RAW264.7細胞上清の抗ウイルス活性
上の実施例1に記載した実験によって得られた細胞培養上清を凍結させて-20℃で保存し、その後、L細胞の細胞変性効果低下（CPER）アッセイ法で総抗ウイルス活性（総合的なI型インターフェロン放出）に関して分析した。

手短に述べると、3×10⁴個のL細胞を96ウェルプレートに播き、37℃で4時間放置して付着させた。IFN標準物質および被験上清を2組ずつ、log10が0.5刻みの系列希釈物（semi-log10 serial dilution）としてプレートに添加した。標準物質の希釈物は、1〜10⁴ IU／mlの範囲のIFN活性が得られるようなものとした。このプレートを15時間にわたって一晩インキュベートし、培地を除去して、セムリケ森林ウイルスを、組織培養ID₅₀のそれの100倍の力価でウェルに添加した。プレートを37℃で3日間インキュベートし、続いて細胞生存度をスコア化した。どのプレートにも、最大限の細胞死に関する対照として用いるためのIFNも被験上清も含まない細胞の2組ずつの列を含めた。IFNの力価は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）の標準物質Ga02901511に比して細胞の50％の防御を与えるIFNの濃度として決定した。図2に示されているように、ポリI：Cの存在下において、Cpn10の添加は、I型インターフェロンの放出の顕著な用量依存的な増加を引き起こした（100μg／mlのCpn10で最大）。

実施例1および2に提示したデータは、ウイルス核酸が放出される可能性のある場合、またはTLR3アゴニストとの同時投与が高いレベルでの抗ウイルス免疫の刺激を引き起こす場合の、ウイルス感染の状況におけるCpn10の投与を示している。

実施例3‐TLR7を発現するHEK293細胞におけるNF-κB活性化
ヒトCpn10がToll様受容体TLR7を介したシグナル伝達を調整する能力を、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293で調べた。TLR7およびTLR4の両方を発現するHEK293の安定細胞株を、Latz et al., 2002（J Biol Chem 277:47834-47843）に記載された通りに樹立し、96ウェルプレートに1ウェル当たり2×10⁴個の密度で播いた。一晩増殖させた後に、NF-κB活性化の判定が可能となるように、細胞に対して、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を作動させる5つのNF-κB部位の多量体と恒常的活性化型ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子から構成される人工的プロモーターを含む、NF-κB-ルシフェラーゼレポーター構築物（Latz et al., 2002, J Biol Chem 277:47834-47843の通り）を一過的にトランスフェクトした。

細胞を一晩培養した後に、細胞に対して組換えヒトCpn10を最終濃度50μg／mlとなるように単独で、または以下のうちの1つと同時に投与した：TLR7選択的アゴニストであるレシキモドR848、ホスホチオエートCpGオリゴヌクレオチド（MWG Biotech）（TLR9選択的アゴニスト）、TLR4選択的アゴニストであるリポ多糖（LPS）、または対照としてのプロテインキナーゼC活性化物質であるホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）。

続いて刺激5時間後に、Dual-Luciferase Assay Reporter System（Promega、Madison WI）を製造元の指示に従って用いてさらにプレートリーダー照度計（Perkin Elmer）を用いたルシフェラーゼ活性の測定により、NF-κB活性化の判定および定量を行った。

NF-κB活性化の倍数として表現された結果が図3に示されている。刺激の非存在下（培地のみ）では、NF-κB活性化は誘導されなかった。これに対して、TLR7選択的アゴニストであるR848は、0.32〜40μMの範囲の濃度で、5倍を上回る、TLR7を介したNF-κBの活性化を誘導した。しかし、50μg／mlのCpn10の存在下では、この活性化はほぼおよそ2分の1に低下した。

実施例4‐TLR9を発現するHEK293細胞におけるNF-κB活性化
ヒトCpn10がToll様受容体TLR9を介したシグナル伝達を調整する能力についてもHEK293細胞で調べた。アッセイ法は実施例3に記載した通りに行った。

アッセイ法は、TLR9を発現する、安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞の2つの独立したクローンに対して行った。結果は図4に示されている。刺激の非存在下（培地のみ）では、NF-κB活性化は誘導されなかった。しかし、0.08〜10μMの範囲の濃度のCpG DNAによるHEK-TLR9の活性化は、NF-κBの最大でおよそ33倍の活性化を誘導した。これは50μg／mlのCpn10の存在下では5分の1〜10分の1に低下した。

TLR9を発現するHEK293細胞のCpG DNAへの反応性に対するCpn10の効果をさらに調べるために、さまざまな濃度のCpn10‐12.5μg／ml、25μg／ml、50μg／mlおよび100μg／mlを用いて、上記のものと同様の実験を行った（図5参照）。これらの結果は、以上で観察されたCpn10により媒介される効果（図4）を裏づけるとともに、TLR9シグナル伝達に対するCpn10により媒介される効果の用量反応性を実証している。

実施例5‐ヒト末梢血単核細胞からのサイトカイン放出
Cpn10が初代ヒト細胞におけるサイトカイン放出を調整する能力を明らかにするために、健常志願者ドナーから単離したヒト末梢血単核細胞（PBMC）を用いた。Johnson et al., 2005（J Biol Chem 280:4037-4047）における記載の通りに、浮遊密度勾配遠心分離法によってヘパリン添加血液からPBMCを単離した。

単離したPBMCの半分は、Latz et al., 2004（Nature Immunol 5:190-198）における記載の通りに、抗BDCS-2-APCカラム（Miltenyi）を用いて細胞集団から形質細胞様樹状細胞（PDC）を除去するために処理した。PDCは、PBMC集団内でのI型インターフェロンIFNαの主な源である。PDCはTLR7およびTLR9を発現することが知られており、かつヒトにおける一本鎖核酸の認識のために非常に重要な細胞種である。

PDCを含むPBMC、およびPDCが除去されたPBMCの両方に関して、Johnson et al., 2005（J Biol Chem 280:4037-4047）における記載の通りに、細胞を96ウェルプレートに1ml当たり生細胞10⁶個の密度で200μlとして播いて培養した。手短に述べると、Cpn10を最終濃度が1μg／ml、10μg／mlまたは50μg／mlとなるように添加し、プレートを1時間インキュベートし、その後にLPS（再精製していないもの、または再精製したもの）を添加した。続いて細胞を37℃および5％CO₂の下でさらに20時間インキュベートした。上清を収集し、特異的ELISAを製造元の指示（R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN）に従って用いて、炎症誘発性サイトカインTNF-α（図6）および抗炎症性サイトカインIL-10（図7）の産生に関して分析した。

図6および7に示されているように、LPSの非存在下では、培地のみもCpn10もともに、TNF-αおよびIL-10のいずれの産生も誘導しなかった。

無傷のPBMC培養物に対する再精製LPS（0.01〜10ng／ml）の添加はTNF-αの産生を引き起こし、それは最大10μg／ml Cpn10の存在下で用量反応的に低下（最大32％）した（図6A）。しかし、PDCが除去されたPBMCでは、TNF-α産生に対するCpn10の影響は失われた（図6B）。すなわち、LPSにより誘導されるTNF-αの産生に対するCpn10の効果はPDCの存在を必要とし、その非存在下では打ち消される。この所見は、PDCがTLR4を発現せず、それ故にLPSによる刺激に反応しないことからみて幾分驚くべきことであり、すなわちこれはTLR4により導かれるシグナル伝達に対するCpn10の調整効果が間接的であることを示唆する。

IL-10の場合には（図7）、PBMCからの上清はCpn10の存在下でIL-10産生の増加を示したが、PDCが除去されたPBMCからの上清は、PDCを伴う無傷PBMCで観察されたもの（図7A）を上回る、用量反応的（最大10μg／mlのCpn10）なIL-10産生の増加（図7B）を示した。

実施例6‐TLR3活性化のCpn10による調整
この検討は、Cpn10がTLR3の連結に対する応答を他のTLRとは異なった様式で調節するか否かを明らかにするために着手したものであり、これは分子相互作用の標的を示す可能性がある。

特異的アゴニストによるTLRの刺激は、MyD88依存的または非依存的な、2つの下流シグナル伝達経路の活性化を誘発する。MyD88はTLR3を除くすべてのTLRに共通するアダプター分子である。この分子の機能は、IL-1R関連キナーゼ（IRAK）およびTNFR関連因子6（TRAF6）をともに動員してIκB（IKK）αβγキナーゼ複合体を活性化することであり、この複合体は続いてIκBαをリン酸化し、NF-κBの核移行およびDNA結合をもたらす。TLRのMyD88非依存的な活性化は、IFN-βを誘導するToll／IL-1Rドメイン含有アダプター（TRIF）の活性化を伴う。これは、NF-κB、ならびにIFN-βの産生およびIFN誘導遺伝子の発現をもたらすIFN調節因子3（IRF3）の遅延型活性化を引き起こす。TLR3の連結は主としてTRIF経路を活性化するが、一方、TLR4はMyD88依存的経路およびTRIF依存的経路の両方を活性化する。この検討の目的の1つは、Cpn10がTLR3の活性化に起因する反応の動態を調節しうるか否かを他のTLRと対比して明らかにし、それによってCpn10の標的および作用様式に関する何らかの情報を得ることであった。

6.1 一般的材料
Cpn10のバッチCH003およびGroESを、LPS（Sigma）およびポリ（I：C）（Invivogen）とともに、またはそれらを伴わずに用いた。用いた細胞株にはRAW264-pNifty2-LUCおよびRAW264.7が含まれる。

6.2 結果
6.2.1 Cpn10はTLR3を介したNF-κB活性化を阻害しない
マウスのマクロファージ様細胞株RAW264.7に対して、ELAM1プロモーターによって作動するプラスミド（RAW264-pNifty2-LUC）を安定的にトランスフェクトした。ELAM1プロモーターは5つのNF-κB部位の近位にあり、細胞におけるNF-κB転写因子の核移行および活性化に応じてルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を作動させる。図8に示されているように、広範囲にわたる濃度のCpn10の存在は、ポリ（I：C）により刺激されたRAW264-pNifty2-LUC細胞における、TLR3により誘導されるNF-κB活性化の動態を変化させなかった。ポリ（I：C）は、TLR3との相互作用を介してNF-κBを活性化するウイルス感染に伴ってみられる分子パターンである二本鎖RNAの合成類似体である。

6.2.2 Cpn10は、TLR3およびTLR4の連結に応じたI型IFNの産生を用量反応的に増加させる
RAW264.7細胞をCpn10とともに2時間プレインキュベートし、続いてLPSまたはポリ（I：C）によって24時間刺激した。この時点で細胞培養上清を収集し、以前の記載の通りに（Hamilton et al.,（1996）J Immunol 156(7):2553）、細胞変性効果低下バイオアッセイ法を用いてIFNα／β抗ウイルス活性に関して分析した。以下の図9に示されているように、Cpn10の存在下における、TLR4（LPS）またはTLR3［ポリ（I：C）］のいずれかを介した24時間にわたる刺激は、I型IFNのアップレギュレーションをもたらす。

続いて、RAW264.7細胞を2.5×10⁵個／mlで滅菌24ウェルプレートに播き、16〜20時間放置して付着させた。細胞を漸増量（titration）のCpn10の存在下でプレインキュベートし、続いてLPS（TLR2／4）またはポリ（I：C）によって4時間または6時間刺激した。細胞溶解物を収集し、-70℃で凍結させるか、またはDynabeadsを用いた直接的なmRNA単離のために直ちに処理した。mRNAは、RT-PCR用のオリゴ（dT）プライマーおよびSuperscript III First-Strand Synthesis Systemを用いて逆転写させた。その結果得られたcDNAを、マウスIFNβ特異的プライマーを用いるPCRで増幅させた。等量のテンプレートが各反応物に添加されたことを検証するため、および増幅の均一性を確かめるために、各試料に関して、GAPDH（グルセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）の転写および増幅を行った。PCR産物はアガロースゲルで分離し、図10に示されているように、臭化エチジウム染色によって描出した。

マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7からのデータに加えて、図11に示されているように、ポリ（I：C）によって刺激されたヒトPBMCが、Cpn10の存在下でI型IFN（IFN-α）の産生の増加を示すことも示された。

6.2.3 Cpn10の大腸菌相同体であるGroESは、ポリ（I：C）により誘導されるIFN-β産生を増強することができない
ポリ（I：C）により誘導されるIFN-β産生の、Cpn10により媒介される増加の特異性を明らかにするために、大腸菌のCpn10相同体であるGroESについて検討した。図12に示されているように、GroESは、TLR3を介してポリ（I：C）により誘導されるIFN-βの産生を調整しなかった。

6.2.4 Cpn10とのプレインキュベーション後の洗浄は、ポリ（I：C）により誘導されるlFNβ産生の用量反応的な増加を無効化する
LPS刺激アッセイ法では、LPSの添加の前に、Cpn10とのプレインキュベーションに続いてPBS洗浄を行っても、Cpn10がNF-κBの活性化を調整する能力に影響を及ぼさなかった。しかし、ポリ（I：C）アッセイ法では、図13に示されているように、RAW264細胞のCpn10とのプレインキュベーション後にPBS洗浄を行うと、ポリ（I：C）刺激によるIFN-β産生のCpn10用量反応的な増加が劇的に低下した。

6.2.5 ポリ（I：C）またはLPSにより誘導される反応の、Cpn10による調整は、I型インターフェロン経路の正のフィードバックを必要とする
1型IFN受容体のIFNAR1（インターフェロン関連受容体1）要素にヌル突然変異を有するマウスは、ウイルス感染に対する感受性の上昇に対応する抗ウイルス反応の完全な欠如、およびIFNα／βに対する抗増殖反応の損失を特徴とする（Hwang et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11284）。IFNAR1欠損マウス（IFNAR1/-）では、恒常的なIFN活性がみられず、マクロファージを含む造血細胞の比率および応答の点で異常がある。

IFN「プライミング」反応におけるCpn10の関与についてのエクスビボ評価を、野生型（wt）またはIFNAR1-/-マウスから単離した骨髄由来マクロファージ（BMM）を用いて行った。BMMを単離し、漸増量のCpn10の存在下において、一団のTLRアゴニスト（ポリ（I：C）‐TLR3またはLPS‐TLR4）により活性化させた。24時間後に上清を収集し、BD Mouse Inflammation CBAおよびマウスIFNβ ELISAキットを用いてサイトカインレベルを分析した。これらのアッセイ法による結果は、ポリ（I：C）により誘導されるIFNβ産生（図14）およびLPSにより誘導されるTNF-α産生のいずれの、Cpn10による調整のためにも、IFNAR1受容体を介した正のフィードバック反応が必要であることを示している（図15）。

IFNフィードバック経路をCpn10により媒介される活性と結びつけるこれらのデータは、マウスのエンドトキシン血症試験からのインビボ成績によってさらに実証された。この敗血症のマウスモデルにおいて、マウスに対して、10μg LPSの静脈内注射の前に、100μgのCpn10の静脈内投与による30分間の前処置を行った。血清を1.5時間後に収集し、BD Mouse Inflammation CBAおよびIFNβ ELISAを用いて炎症誘発性サイトカインの産生について分析した。図16に示されているように、Cpn10を同時投与されたマウスにおける血清TNFαレベルの有意な（p＜0.05）低下は、血清IFNβレベルの有意な（p＜0.01）低下と相関した。

6.3 考察および結論
Cpn10により媒介されるNF-κB調整パターンに関する少なくとも1つの例外には、TLR3リガンドであるポリ（I：C）による細胞の活性化が含まれる。このTLR3系では、Cpn10は、細胞のポリ（I：C）刺激に応じたNF-κB活性化に対して何ら効果を及ぼさないことが見いだされた。

加えて、Cpn10は、ポリ（I：C）に応じたI型インターフェロン産生の相乗的な増加を誘導することが見いだされた。この異例に見える事柄についての1つの説明は、Cpn10がプライミング反応またはフィードバックループ反応の調整に係るということである。例えば、I型インターフェロンは、LPSにより調節される反応に、直接的または間接的に（例えば、SOCS1を介して）重要な役割を果たすことが示されている。これは、Cpn10がI型IFNによる初期細胞プライミングを減衰させることによってTNFαなどの炎症誘発性サイトカインのダウンレギュレーションを誘発することを示唆しているため、Cpn10の作用機序を理解する上での大きな進展である。

実施例7‐マウスにおけるセムリケ森林ウイルス（SFV）感染のCpn10による調整
この一連の検討には、Cpn10の投与がマウスモデルにおけるセムリケ森林ウイルス（SFV）の致死性に影響を及ぼすか否か、およびCpn10がTLR活性化に応じたI型IFN産生を調整するか否かを明らかにするために着手した。

このインビボモデルには、I型IFNの抗ウイルス活性の調整の初期判定のためにセムリケ森林ウイルス（SFV）の全身感染を行わせた。モデルは脳を含むすべての臓器が感染した新生マウスとして実現することができ、これは用量に依存して4〜6日以内に致死性を生じるため、感染の感度および急性度が高いという利点がある。または、モデルを、I型IFN産生のためにウイルスに対する感受性がより低い成体マウスで試験することもできる。ウイルス感染後の最初の24〜48時間以内のIFN産生がウイルス力価を低下させることは知られている。このモデルは、血清分析および免疫応答を含む「慢性的」反応の分析に適用しうる。

インビトロ試験には、WTマウスおよびIFNAR欠損マウスから新たに単離した骨髄マクロファージの比較を含めて、TLR活性化に応じたサイトカイン産生のCpn10調整に対するマクロファージのプライミングの影響を調べるための一連のアッセイ法を含めた。

7.1 材料および方法
Cpn10のバッチCH003を、エンドトキシンが0.01 EU／ml未満である50mM Trisおよび150mM NaCl中にて5.0mg／mlで用いた。希釈用調合緩衝液は50mM Trisおよび150mM NaClで構成した。Pam3cysおよびポリI：CはInvivogen社から入手した。マウスはC57BL／6とした。

インビボ試験に関しては、ウイルスの適切なバッチおよび投与量を設定するために、マウスのおいてウイルス力価測定を伴う事前試験に着手した。すべての試験に関して、1群当たり10〜13匹のマウスを用い、ウイルスの用量別に3つのマウス群を用いた。処置した群は以下の通りである：（A）ウイルスのみ；（B）ウイルス＋濃度AのCpn10；（C）ウイルス＋濃度BのCpn10。約6〜9日齢の新生マウスにCpn10（または調合緩衝液）およびSFVを腹腔内注射し、母親とともに飼育した。加えて、6〜8週齡の成体マウス（wtおよびIFNAR欠損性）にもSFVを腹腔内注射し、それとともにCpn10をウイルス感染から最初の1週間にわたって12時間毎に、決定された用量で腹腔内投与した。

インビトロ試験に関しては、TLR活性化に応じたサイトカイン産生のCpn10による調整に対するマクロファージのプライミングの影響、ならびにWTマクロファージおよびIFNAR欠損マクロファージの比較について着手した。WTマウスおよびIFNAR欠損マウスを源とする骨髄由来マクロファージ（BMM）を、ある範囲にわたる用量のCpn10のもとで、TLRアゴニストであるpam3cys（TLR2）、ポリI：C（TLR3）およびLPS（TLR4）により処理した。

7.2 結果
インビボ新生仔ウイルス感染試験によるデータから、Cpn10を投与されたSFV感染マウスの生存率の有意な上昇が示された。試験を構成したのは、6〜9日齢の新生C57BL／6マウスの以下の群であった：A群：SFV（n＝13）；B群：SFV＋Cpn10 20μg（n＝13）；C群：SFV＋Cpn10 50μg（n＝13）。

B群およびC群には20μgおよび50μgのCpn10を腹腔内注射し、続いて（3時間後に）、3群すべてに50μlのSFV（TCID50の30倍）を注射した。マウスは母親と一緒に飼育し、実験全体を通じて注意深く取り扱った。仔は一定間隔（12／24時間）で、移動性、状態、行動などを含む健康状態の標準的な徴候に関して注意深くモニターした。

72時間の時点で、20μgおよび50μgのCpn10を投与したマウスの54％および69％が生存しており、これに対して非投与マウスの生存率は15％であった（図17）。また、高用量群のマウスは歩き回っていたが、他の2群は極めて病的であって横臥していた。84時間の時点までには、SFVのみを投与されたすべてのマウスがウイルスのために死亡したが、一方、B群およびC群はいずれも31％が生存していた。

7.3 考察および結論
Cpn10の投与は、72時間時点のデータによって見てとれるように、ウイルス感染後の生存期間を用量依存的な様式で延長させた。感染96時間後の時点では、Cpn10を注射されたマウスの18％が生存しており、一方、非投与マウスはすべて感染88時間後の時点で死亡していた。大量のウイルスが投与された場合、Cpn10を投与した2群における感染72時間後のマウスの生存率は50％および70％であったのに対して非投与群では18％であり、これは有意であった。また、この結果がCpn10の単回投与で得られたことも注目に値する。これらのデータは、Cpn10による抗ウイルス防御の誘導を示唆する。

実施例8‐Cpn10はCD14非依存的なLPS受容体クラスターと会合する
細胞の原形質膜は、側方不均質物、パッチおよびミクロドメインで構成される。これらの細胞膜ミクロドメインまたは脂質ラフトはスフィンゴ糖脂質およびコレステロールを豊富に含み、膜ソーティングおよびシグナル伝達などの細胞プロセスへの関与が指摘されている。本発明者らは、Cpn10が、TLR4またはクラスターの他の構成要素の1つと直接結合することによってLPSシグナルのクラスター化の際に脂質ラフトに局在し、シグナル伝達を妨げることを提唱している。

8.1 材料および方法
FRETのための細胞標識
MonoMac 6細胞（ヒト単球細胞株）を、ドナー結合抗体（Cy3）およびアクセプター結合抗体（Cy5）の混合物100μlによって標識した。Cpn10の標識には抗Cpn10ウサギポリクローナル抗体を用いた。細胞をPBS／0.02％BSAで2回すすぎ洗いし、その後に4％ホルムアルデヒドで15分間固定した。実験過程でのタンパク質の再編成を防ぐために細胞を固定した。

共焦点画像の撮影
細胞の画像は、1.4 NA 63倍Zeiss対物レンズを用いてCarl Zeiss, Inc.のLSM510共焦点顕微鏡（Axiovert 200蛍光顕微鏡とともに）で撮影した。画像はLSM 2.5画像解析ソフトウエア（Carl Zeiss, Inc.）を用いて解析した。Cy3およびCy5は適切なフィルターセットを用いて検出した。画像収集のための一般的な露出時間（5秒未満）を用いた場合、Cy5フィルターを用いるとCy3で標識した標本からは蛍光が観察されず、Cy3フィルターセットを用いるとCy5蛍光が検出されなかった。

FRET測定
FRETは、分子の近接性を決定するために用いられる非侵襲的な撮像法である。FRETは1〜10nmの距離にわたって起こりうるもので、光学顕微鏡の分解能を分子レベルへと効果的に高める。これは励起状態のドナー分子から適切なアクセプターへの無放射性エネルギー転移を伴う（Wu and Brand (1994) Anal. Biochem. 218:1-13）。エネルギー転移の速度はドナーとアクセプターとの間の距離の6乗に反比例する（Kenworthy and Edidin (1998) Journal of Cell Biology 142:69-84；Kenworthy and Edidin (1998) Gelb,M.H. (Ed.) Methods in molecular Biology. Humana Press Inc, Totowa, NJ pp 37-49）。エネルギー転移の効率（E）は、rおよびフェルスター距離R₀に関連して以下のように定義される。
E＝1／［1＋（r／R₀）⁶］［1］

本検討では、以前に記載された方法を用いてFRETを測定した（Kenworthy and Edidin (1998) Journal of Cell Biology 142:69-84；Kenworthy and Edidin (1998) Gelb,M.H. (Ed.) Methods in molecular Biology. Humana Press Inc, Totowa, NJ pp 37-49）。手短に述べると、試料をドナー結合抗体およびアクセプター結合抗体で標識し、アクセプター分子の完全な光退色後のドナー蛍光の増加（脱消光）としてエネルギー転移を検出した。Cy3が退色するために必要な最短時間を決定するために、26ic-Cy3プローブのみで標識した細胞を用いた。Cy3は、Cy3フィルターセットを用いたアーク灯による5分間にわたる連続励起によって退色させた。これらの条件下でCy5は退色しなかった。FRET画像は、以下により、アクセプター光退色後のドナー蛍光の増加から計算した。
E（％）×100＝10,000×［（Cy3退色後−Cy3退色前）／Cy3退色後］［2］

Eを12ビット画像の規模に拡張するために倍数10,000を用いた。

8.2 結果および考察
表1に示した第1のデータのセットでは、FRETを用いて、脂質ラフトにおいてLPSにより誘導される細胞活性化（MonoMac6細胞）に関与する受容体分子の濃度を決定した。FRET実験を行うことにより、Cpn10（バッチP003-04またはCH003）、Hsp60、大腸菌GroESおよび他の分子が脂質ラフトと共存するか否かを調べることが可能であった。FRETは、アクセプター蛍光団の完全な光退色後のドナー蛍光の脱消光に関して測定した。アクセプターの破壊後のドナー蛍光の増加により、アクセプターの存在下ではエネルギー転移のためにドナー蛍光が消光したことが示された。系におけるエネルギー転移効率を、陽性対照、すなわちmAbとGM1（ガングリオシド、ラフト随伴分子）分子上の種々のエピトープとの間の転移を用いて検査したところ、最大エネルギー転移効率（E％）は37±1.0であることが示された。FITC-GM1とローダミン-MHCとの間の陰性対照も用いたところ、大きなエネルギー転移は認められなかった（3±0.4）。このバックグラウンドFRET値は、どちらの種も高濃度で存在するために、ランダムFRETによって起こると考えられる。

（表１）ドナー-アクセプター対の間のエネルギー転移効率の値

さまざまな対の間のエネルギー転移を、アクセプターの光退色後のドナー蛍光の増加によって検出した。データは独立した実験の平均±標準偏差を表している。

表1に提示したデータは、CD14は脂質ラフト中に存在するが、TLR4はLPS刺激の前には脂質ラフトと会合しておらず、LPS刺激後にそこに動員されるように思われることを示している。

次のデータのセットは、TLR4クラスターに対するCpn10の近接性を、同じくFRETを用いて記載している。表2では陽性対照をTLR4とそれ自体のものとしており、最大のエネルギー転移効率（E％）は36±2.0であった。

（表２）ドナー-アクセプター対の間のエネルギー転移効率の値

表2に示されているように、Cpn10は、LPSの非存在下ではHsp70、Hsp90、CXCR4のいずれとも会合しなかったが、LPS刺激後にはLPS活性化クラスターのこれらのメンバーとの会合を示した。LPS刺激前にCpn10とTLR4との会合があるか否かを示すデータはここには示されていないが、LPS刺激後にはCpn10とTLR4との強い会合がみられる。

これらのデータはまた、Hsp60が細胞のLPS刺激の前にも後にもTLR4、CD14、脂質ラフトのいずれとも会合しないことを示している。重要なこととして、Cpn10の免疫応答モジュレーターとしての活性を試験する実験において陰性対照として慣例的に用いられる、Cpn10の大腸菌相同体であるGroESもまた、脂質ラフトとも、CD14非依存的なLPS活性化クラスターの他のメンバーとも会合しない。

実施例9‐Cpn10は脂質ラフト内部にてPBMCの表面でTLRクラスターと相互作用する
内因的に産生されたCpn10が、PBMCの表面で、TLR、TLR関連分子および脂質ミクロドメインの構成要素と相互作用するか否かを明らかにするために、本発明者らは、新たに単離したヒト付着単球のLPS刺激に対する反応に関して、蛍光団で標識した抗Cpn10抗体を用いるFRET分析を用いた。組換えCpn10を画像化の前に細胞培養物に添加していないため、細胞表面で認識されたCpn10は細胞内貯蔵物から輸出されたものと考えられる。

9.1 材料および方法
FRETのための細胞標識
Ficoll-Hypaqueによる密度勾配遠心分離法を用いてPBMCを健常ドナー血液から単離して、付着細胞を調製した。非付着細胞を除去するために細胞を洗浄した。残った付着細胞の単層（単球1〜2×10⁵個／ウェル）を、24ウェルプレート内で、0.01％ L-グルタミンおよび40μg／mlゲンタマイシンを加えた無血清培地（Gibco）中にて培養した。集積された単球調製物のアリコートを、フローサイトメトリーによって純度に関して規定通りに評価した（純度＞80％）。または、FRETアッセイ法の前に、集積された付着性末梢血単球からの単球由来DCを、発表されているプロトコール（Bender, A et al. 1996. J Immunol Methods 196:121-135）に従って、GM-CSFおよびIL-4（R&D Systems）とともに5日間培養した。

FRET分析のための細胞標識は、本質的には以前に発表されている通りに行った（Triantafllou, K 2001. Nat Immunol 2:338-345）。新たに単離したヒト単球または単球由来DCを、100ng／mlのLPS（サルモネラ-ミネソタ（S. minnesota.）由来のRe-LPS、List Labs，CA）、10ng／mlの黄色ブドウ球菌（S. aureus）LTA（Thomas Hartung, Konstanz, Germanyの寄贈による）、0.1μg／mlのポリ（I：C）、20ng／mlのイミキモド、1μMのCpG ODN（Invivogen）、25μg／mlのコクサッキーウイルスB3由来ssRNA精製物、または緩衝液対照によって10分間刺激し、洗浄した後に、ドナー結合抗体（Cy3）およびアクセプター結合抗体（Cy5）の1：1混合物により標識した。続いて、タンパク質の再編成を防ぐために細胞を固定した。

抗体
FRET分析に用いた抗体には以下が含まれる：Cpn10（Johnson, B. 2005. J Biol Chem 280:4037-4047）、Hsp70、CXCR4、TLR3、TLR7、TLR9（Santa Cruz）、TLR2（Genentech）、Hsp90（Bioquote）、CD14（26ic、ATCC、HB246ハイブリドーマ由来）、GM1（GM1-1、Calbiochem、GM1-2b、North Star Bioproducts, Liverpool, UK）、MHCクラスI（MCA115、Serotec）、TLR4（HTA125、HyCult）。抗体は、FluoroLink標識キット（AmershamPharmacia）を用いてCy3またはCy5のいずれかにより標識した。

FRET測定
Cy3は543nmを放出するヘリウム／ネオンレーザーによって、Cy5は633nmを放出するヘリウム／ネオンレーザーによって励起させた。細胞の画像は、1.4 NA 63倍Zeiss対物レンズを用いてCarl Zeiss, Inc.のLSM510 META共焦点顕微鏡（Axiovert 200蛍光顕微鏡とともに）で撮影した。画像はLSM 2.5画像解析ソフトウエア（Carl Zeiss, Inc.）を用いて解析した。Cy3およびCy5は適切なフィルターセットを用いて検出した。画像収集のための一般的な露出時間（5秒未満）を用いた場合、Cy3で標識した標本からは蛍光が観察されなかった。トラックは1つのみのレーザーを用いて逐次的にスキャニングし、各スキャン毎にそれぞれの検出器チャンネルを動作状態にした。FRETは、アクセプター蛍光団の完全な光退色後のドナー蛍光の脱消光に関して測定した。エネルギー転移の効率（E）は、rおよびフェルスター距離R₀に関連して以下のように定義される：E＝1／［1＋（r／R₀）⁶］（29）。このFRET測定の方法は以前に記載されている（30）。

9.2 結果
表3に示されているように、内因的に産生されたCpn10は、LPS刺激後に、TLR4およびTLR4シグナル複合体の他のメンバーと会合することが見いだされた。LPS刺激前にCpn10が脂質ラフト部分と相互作用することが同定されたことは、死細胞によるその放出、または精製時の細胞の物理的操作に起因するアップレギュレーションを示す可能性がある。内因性Cpn10が脂質ラフトドメイン内に認められたことは、その細胞表面への送達様式および細胞外分泌を示唆する。

（表３）FRETによる判定では、内因性Cpn10は脂質ラフトおよびPBMC上のTLR4シグナル伝達複合体のメンバーと会合する

データは、いくつかの独立した実験による平均±s.d.を表している。

本発明者らはまた、Cpn10が他のTLRと直接会合するか否かについても、FRET分析および新たに単離した細胞を用いて調べた。FRETは、アクセプター蛍光団の完全な光退色後のドナー蛍光の脱消光に関して測定した。表4に示されているように、Cpn10と、単球由来DC（MoDC）の細胞表面およびエンドソーム内部の双方に位置するほとんどのTLR（TLR3を除く）との間には、リガンドの存在下では大きな脱消光が観察されたが、非存在下では観察されなかった（MoDC上のTLR 7および9に関する陽性FRETシグナルは、細胞のMoDC集団内に少数のpDCが存在することを示す可能性が非常に高いことに注意されたい）。

（表４）FRETによる判定では、Cpn10はヒトMoDCの細胞表面およびエンドソーム内のTLRと、リガンドの存在下では会合するが非存在下では会合しない

さまざまな対の間のエネルギー転移（E±ΔE（％）を、アクセプターの光退色後のドナー蛍光の増加によって検出した。それぞれの対に関してドナー（Cy3）はCpn10としたが、対照実験では例外としてドナー（Cy3）をTLR4とし；アクセプター（Cy5）はTLRとした。FRETは、アクセプター光退色後のドナー蛍光の増加から以下によって算出した：E％×100＝10,000［ドナー退色後−ドナー退色前）／ドナー退色後］。データはいくつかの実験による平均±s.d.を表している。

実施例10‐Cpn10に対するTLR連結の影響
TLR連結とCpn10との間の関係を明らかにするために、特にCpn10が免疫系の内因性調節物質であるか否かを検証するために、本発明者らは、内因性Cpn10がTLR連結またはサイトカイン活性化の形態で細胞ストレスによって誘導されるか否かを検討した。本発明者らはまた、適切な刺激に曝された場合にCpn10が細胞から放出されるか否か、およびCpn10が他のTLRに対するリガンドによって誘導されるシグナルを制限しうるか否かについても検討した。

10.1 材料および方法
試薬
組換えヒトCpn10は、BresaGen Limited（Adelaide, Aus）により、本質的には以前に記載された通りに（Johnson, B. 2005. J. Biol Chem 280:4037-4047）、GMP規格に則って生産された。Cpn10の純度はSDS-PAGEにより99％を上回ることが確かめられ、GroEL媒介性ロダネーゼリフォールディングアッセイ法（Brinker, 2001. Cell 107:223-233）においてGroESと同じモル活性が示された（非提示データ）。FACS分析のために、Cpn10のC末端にシステイン残基を導入し、AlexFluor647（Invitrogen）により製造元の指示に従って標識した。Cpn10へのLPS混入は、Endosafeアッセイ法（Charles River Laboratories）によって、常に0.2EU／mgタンパク質未満であることが明らかになった。TLRリガンドおよびサイトカインには以下が含まれた：大腸菌LPS（055:B5株、Sigma）、大腸菌超高純度LPS（0111:B4 Sigma）、黄色ブドウ球菌LTA、枯草菌（B. subtilis）LTA、黄色ブドウ球菌PGN、枯草菌PGN、S.セレビシエ（S. cerevisae）由来のザイモサン細胞壁、ポリ（I：C）、イミキモドR837、CpG ODN 1826およびODN2216、GpC ODN1826対照（いずれもInvivogen, San Diego, CA）、組換えマウスIFNγ（Chemicon）、IL-1β（PeproTech）および組換えヒトTNF-α（Invivogen）。

抗体
Cpn10に対するウサギポリクローナル抗体の産生およびアフィニティー精製はCBioで行われた。ERK1/2（T202／Y204）、JNK1/2（T183／Y185）、p38／MAPキナーゼ（T180／Y182）、CD14およびFcBlock（CD16／CD32）を含むリン酸化シグナルタンパク質（ヒトおよびマウスの両方）を認識するCytometric Bead Array（CBA）Flex SetsはBDからのものであった。

トランスフェクション、細胞刺激およびプロモーター分析
pCAT／LUC-CPNプロモーター構築物は、M. RyanおよびN. Hoogenraad（La Trobe University, Melbourne）により提供された。RAW264.7細胞にGeneJuice（Novagen）を用いて一過的にトランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、トリパンブルー色素排除によって細胞生存度を評価した。細胞を24ウェルプレートに播いて、熱ショックを与え（43℃で15分間（軽度）、30分間（中等度）または60分間（高度））、その後に37℃で回復させるか18時間後に刺激した。細胞を洗浄し、Cell Culture Lysis Reagent（CCLR, Promega）中に収集して、ホタルルシフェラーゼシグナルを、Luciferase Assay System（Promega）およびWallac Victor 2 Multilabel Counter（Perkin-Elmer）を用いて測定した。

リアルタイムPCR
RAW264.7細胞を2.5×10⁵個／mlで滅菌24ウェルプレートに播き、刺激の前に16〜20時間かけて付着させた。各条件に関して反復試験試料をアッセイした。mRNAはDynabeads（Dynal）を用いて単離し、オリゴ（dT）プライマーおよびRT-PCR用のSuperscript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いて逆転写させた。その結果得られたcDNAを2組ずつ、それぞれが2.5μlの希釈（20％）cDNAテンプレート、6.25μlのPlatinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG（Invitrogen）ならびに0.25μlずつの10μMセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含む、10μlのqPCR反応物中にて増幅させた。反応条件は以下の通りとした：95℃ 2分間の後に、95℃ 10秒間、60℃ 15秒間および72℃ 20秒間を40サイクル、最後の融解段階を72〜95℃で50秒間。qPCR反応はRotor-Gene 3000装置（Corbett Research）にて行った。以前に記載された通りに、標的遺伝子の発現をハウスキーピング対照に対して正規化して分析した（Livak, K.J. and T.D. Schmittgen. 2001, Methods 25:402-408）。プライマーは以下の通り：18SセンスCGG CTA CCA CAT CCA AGG AA（SEQ ID NO：5）、18SアンチセンスGCT GGA ATT ACC GCG GCT（SEQ ID NO：6）；Cpn10センスGCC GAA ACT GTA ACC AAA GG（SEQ ID NO：7）、Cpn10アンチセンスCAG GCT CAA TCT CTC CAC TC（SEQ ID NO：8）；PbgdセンスCCT GGT TGT TCA CTC CCT GA（SEQ ID NO：9）、PbgdアンチセンスCAA CAG CAT CAC AAG GGT TTT（SEQ ID NO：10）。

細胞培養上清、細胞溶解物および患者血清における内因性Cpn10の定量
非トランスフェクトRAW264.7細胞を上記の通りに処理し、培養上清を濃縮した。細胞を生存度に関して評価し、条件毎にプールして（n＝4）、遠心分離処理によってペレット化した上で、CCLR中に再懸濁させた。細胞タンパク質の総含有量は、改変Bradfordアッセイ法（BioRad）によって定量した。細胞上清および抽出物（試料当たり25μg）中のCpn10のレベルは、ELISA（検出限界0.195ng／ml）によって分析した。臨床試験の被験者からの血清は、試験加入時に流血中Cpn10のレベルに関してELISAによって検査した。これらの試験はGCP指針に従って実施され、試料の検査の前に各被験者から書面によるインフォームドコンセントを得た。試験のプロトコールは各地のセンターのヒト倫理委員会によって承認された。

RAW264.7-HIV-LTR-LUCアッセイ法
RAW264.7-HIV-LTR-LUCアッセイ法は、本質的には以前の記載の通りに行った（Johnson, B. 2005. J. Biol Chem 280:4037-4047）。細胞をCpn10または対照緩衝液とともに2時間インキュベートし、その後にある範囲にわたる用量のTLRリガンドを添加した。各アッセイ法において、Cpn10を25〜100μg／mlの濃度範囲で試験し、リガンドは立ち上がりの急な用量反応曲線を誘発する濃度、すなわち大腸菌LPSは0.2〜5ng／ml、超高純度大腸菌LPSは5〜10ng／ml、LTAおよびPGNは10〜100μg／ml、ザイモサンは10〜100μg／ml、ポリ（I：C）は10〜100μg／ml、イミキモドは1〜10μg／ml、ならびにCpG ODNは3.25〜16.25μg／mlで用いた。各アゴニストに関するインキュベーション時間は、バックグラウンドに対して十分なシグナルが確実に得られるように最適化した。ヒトCpn10に関する陰性対照としては、GroESと命名されたCpn10の大腸菌相同体を慣例的に用いた（精製は本質的には以前の記載の通りに行った（Brinker, 2001. Cell 107:223-233））。Cpn10およびGroESの調製物ならびにTLRリガンド試薬におけるエンドトキシンの混入レベルは、この細胞株でこれらのアッセイ法に用いた濃度では、HIV-LTR活性化を誘導しないことが以前に示されているレベルを下回ることがわかっていることに留意されたい（Johnson, B. 2005. J. Biol Chem 280:4037-4047）。

ヒトPBMCサイトカインアッセイ法
PBMCは、健常志願者の血液から、Ficoll-Paque Plus（Amersharm Biosciences）による浮遊密度勾配遠心分離法によって単離した。PBMCをCpn10（または緩衝液対照）で1時間前処理し、続いてアゴニストにより37℃および5％CO₂の下で20時間にわたり刺激し、その後に培養上清を収集した。サイトカインレベルはCBA（BD）またはELISA（Bender MedSystems）を用いて分析した。

タンパク質リン酸化の検出
RAW264.7またはPBMCをCpn10とともに2時間インキュベートし、続いてLPSにより30分間刺激し、遠心分離した上で、ペレットを0.1％SDSを含むPBSで溶解させた。溶解物を5分間煮沸して冷却し、細胞片を遠心分離によってペレット化させて、上記の通りに上清をタンパク質濃度に関してアッセイした。リン酸化されたシグナルタンパク質は、p38、ERK1/2およびJNK1/2に対するBD CBA Flex Setを用いて検出した。または、RAW264.7をCytofix／Cytoperm（BD）で処理し、細胞内p38および細胞表面CD14に関して二重染色した。試料は、BD FACSArray BioanalyzerをFCAPアレイソフトウエアとともに用いて分析した。

統計学的分析
細胞刺激後のプロモーター活性の変化を、最適なアゴニスト濃度で非刺激条件を刺激条件と比較する、一元配置ANOVAおよびTukeyの多重比較検定を用いて評価した。対象の血清試料におけるCpn10を、一元配置ANOVAおよびTukeyの多重比較事後検定を用いて、群間の有意性に関して検定した。

10.2 結果
10.2.1．TLR連結はCpn10プロモーターを誘導する
RAW264.7細胞に対して、ルシフェラーゼの産生がCpn10プロモーターの制御下にあるレポーター構築物をトランスフェクトした。精製組換えIFNγ、TNF-αおよびIL-1βを非TLR性アゴニストとして試験した。中等度の熱ショック（43℃、30分間）で処理した細胞は回復6時間の時点でCpn10プロモーターの有意な誘導を示し、18時間までに基礎レベルに戻った（図18A）。さらに、TLRアゴニストが用量依存的にCpn10プロモーターを誘導し、最大の活性化が20時間後に観察されることが実証された（図18Aおよび19C）。続いて、アゴニスト濃度を、最大のプロモーター応答を誘導するように最適化した（図18B〜G）。

TLRアゴニストおよび非TLR性アゴニストに対する応答の比較により、Cpn10プロモーター活性の異なるプロファイルが示された（図18H）。TLR 2、7および9のリガンドに対する応答ではCpn10の有意なアップレギュレーションが観察され、MyD88依存的なTLRシグナル伝達経路との相関が示唆された。TRIF依存的なシグナル伝達経路を使用しうるTLRリガンド（TLR3および4）を用いた場合はCpn10プロモーターの有意なアップレギュレーションは観察されなかった。さらに、非TLR性アゴニストであるIFNγ、IL-1βおよびTNF-αはCpn10プロモーターの実質的なアップレギュレーションを誘導せず、このことはCpn10の転写制御におけるある程度の特異性を示している。

TLRにより誘導されるCpn10転写に関するもう1つの実証として、リアルタイムPCR分析を用いたところ、RAW264.7細胞のLTA刺激がCpn10 mRNAの濃度依存的な誘導を引き起こし、最大の誘導が18時間の時点でみられ、刺激24時間後までにベースラインレベル近くに戻ることが示された（図18I）。

10.2.2．Cpn10はTLR連結後に細胞から放出される
適切な刺激に曝された時に細胞からCpn10が放出されるか否かを検討するために、本発明者らはRAW274.7細胞をLTAで刺激し、内因性Cpn10、および細胞によって培地中に放出されるCpn10の存在をELISAによってモニターした。細胞溶解物の分析により、LTAで処理した細胞および対照細胞の細胞内Cpn10レベルにはほとんど変化がないことが判明した（図19A）。しかし、培養上清の分析からは、30時間後の可溶性Cpn10は、刺激されていない対照細胞の3倍であることが判明した（図19B）。加えて、刺激された細胞によって産生される細胞外Cpn10のレベルは、経時的に認められたCpn10プロモーター活性の増加と相関した（図19C）。これらのデータは、免疫誘発刺激条件下で産生される新規合成Cpn10のある比率は細胞によって放出されることを示している。軽度、中等度または高度の熱ショック（HS）に曝露された細胞（RAW264.7細胞またはpCAT／LUC-CPNがトランスフェクトされたRAW264.7細胞）からの培養上清は、LTAにより刺激された細胞からの上清と比較して、細胞外Cpn10の蓄積をほとんど示さなかった（図19D）。これらのデータは、Cpn10がHSによって誘導されてミトコンドリアタンパク質のミスフォールディングを助け、一方、特定の免疫誘発刺激がCpn10の細胞外蓄積を招くことを示唆する。

Cpn10が疾患において調節される可能性があるという証拠を得るために、本発明者らは、慢性炎症性疾患に罹患した患者におけるCpn10のベースライン血清レベルを検査し、これらを健常志願者のコホートと比較した。図19Eに示されているように、関節リウマチの患者におけるCpn10の流血中レベルは、多発性硬化症、乾癬の患者または健常対象よりも有意に高かった（それぞれ1.32ng／ml±1.41、n＝23、0.44ng／ml±0.46、n＝46；0.55ng／ml±0.52、n＝25；0.45ng／ml±0.32、n＝24）。このため、それぞれのCpn10の血清レベルは、個体および／または疾患のレベルで、進行中の炎症と相関する可能性がある。細胞溶解後の受動的放出、または炎症誘発刺激時の免疫細胞刺激後の誘発性放出のいずれに起因するかにかかわらず、Cpn10が細胞外環境に蓄積すること、およびその輸出がある種の細胞刺激によって増強されることは明らかである。

10.2.3．Cpn10はTLRシグナル伝達の動態を制限する
本発明者らは、組換えCpn10が、他のToll様受容体に対するリガンドによって誘導されるシグナルを制限しうるか否かについて検討した。このレポーター細胞株と最適濃度のCpn10との2時間にわたるプレインキュベーションの後に、グラム陽性菌ペプチドグリカン（PGN）およびリポテイコ酸（LTA）から合成RNAおよびDNAモチーフまでの範囲にわたる種々のTLRリガンドで刺激したところ、外因性Cpn10の非存在下で刺激した細胞と比較して、NF-κBにより誘導されるルシフェラーゼ活性の有意な低下が引き起こされた。合成TLR3リガンドであるポリイノシン酸-ポリシチジル酸（ポリ（I：C））を例外として、試験した他のすべてのTLRリガンドにより刺激された細胞培養物ではCpn10の存在がルシフェラーゼ活性の20〜80％の阻害を引き起こした（図20A）。これらの結果は、Cpn10が、ほとんどのTLRに対するリガンドによって生じる免疫応答のシグナルの強度を調整しうることを示している。

LPSによる細胞の刺激は、MyD88依存的および非依存的なシグナル伝達カスケードの両方を誘発する。MyD88依存的カスケードは、TLR3を例外としてすべてのTLRによって共有され、NF-κB、ならびにp38、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）およびc-Jun N末端キナーゼ（JNK）を含むマイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼ（MAPK）を含む。これらの経路はどちらも結果的には、免疫応答の開始および動態の調節をもたらす。細胞の刺激後のNF-κB活性化およびサイトカイン産生をCpn10が調節する事象を解明するために、本発明者らは、MAPキナーゼシグナル経路にかかわる重要なタンパク質のリン酸化のレベルを分析した。図20B〜Dに示されているように、Cpn10は、マウスマクロファージ細胞株（RAW264.7）および新たに単離したヒトPBMCの両方において、p38、ERK1/2およびJNK1/2のLPSにより誘導されるリン酸化のレベルを用量反応的に低下させた。MAPK経路の活性化は、サイトカイン産生の炎症性カスケードの誘導と密接につながっているため、これらのデータは、Cpn10により媒介される、リガンドにより誘導されるサイトカイン産生の変化が、TLRシグナルカスケードの変化に起因することを示している。

種々のTLRリガンドによって刺激された、新たに単離したヒト細胞によるサイトカインの産生に対するCpn10の活性を確かめるために、本発明者らは健常ドナーからのPBMCをCpn10の存在下または非存在下で1時間にわたり前処理し、続いて選択された範囲のTLRリガンドによって20時間刺激した。続いて、細胞培養上清におけるサイトカインレベルをELISAまたはサイトメトリックビーズアレイ（cytometric bead array）（CBA）を用いてアッセイした。図20Eに示されているように、TLR2、TLR2／6またはTLR4に対するアゴニスト（PGN、LTA、ザイモサン、LPS）によって誘導される、TNF-α、IL-1β、IL-6およびIL-10を含むサイトカインの産生は、Cpn10の存在下では阻害された。Cpn10がLPSにより誘導されるIL-10産生のわずかな誘導を媒介した一方で、データは、他のTLRリガンドに対する応答ではIL-10産生の低下を示している点に注目されたい。同様に、Cpn10の存在下における、TLR7または9に対するアゴニストであるイミキモドまたはCpG ODNによるPBMCの刺激は、Cpn10の非存在下での対照培養物と比較して、TNF-αの産生の低下およびIFNαの増加をもたらした。

10.3 考察
この検討により、免疫系の内因性調節物質としてのCpn10の、これまで特定されていなかった役割が明らかにされた。TNFα、IFNγまたはIL-1βの受容体ではなく、TLR系の受容体を介した細胞の刺激は、Cpn10プロモーター、および細胞外培地中で測定可能なCpn10タンパク質の産生を誘導する。組換えCpn10の添加は、マウス細胞株および新たに単離したヒトPBMCによるインビトロでのNF-κB活性化、MAPKリン酸化およびサイトカイン産生による評価では、TLRにより作動される細胞活性化を用量反応的に制限する。

免疫侵襲によるCpn10の誘導を示すこれらの結果は、Cpn10により媒介される炎症反応の規模の抑制を示すデータとともに、Cpn10が免疫応答ネットワークの中核をなす負のフィードバック経路の必須なメンバーであるという強力な証拠を提供する。

実施例11‐Cpn10により誘導される、LPS刺激に応じたTLR4発現の修飾
本発明者らは、Cpn10がLPS刺激に応じたTLR4の表面発現に影響を及ぼすか否かを検討する目的で、RAW264細胞におけるTLR4発現に対するCpn10の影響を明らかにしようとした。

11.1 材料および方法
LPSは大腸菌（Sigma）から調達し、抗マウスTLR4／MD-2-ビオチンおよびストレプトアビジン-フィコエリトリンはeBioscienceから調達し、抗マウスIFN-γはBDから調達した。

細胞を、100μg／mlのCpn10の存在下または非存在下で、指定された期間にわたって懸濁下で培養した。続いて細胞を10mlチューブに移して算定し、ペレット化した上で新たな培地中に再懸濁させた。100μlの細胞懸濁液をEppendorfチューブ（10⁶個／チューブ）に移した。15分毎に穏やかに混合しながらインキュベーター中に保ったEppendorfチューブ内で、4時間にわたるCpn10処理およびLPS刺激を行った。細胞をPBS／0.2％FBSで3回洗浄した。抗マウスTLR4-ビオチン（50μlのPBS／0.2％FBS中に1μl）または対照抗体（抗マウスIFN-γ-ビオチン）を細胞とともに氷上で1時間インキュベートした。細胞を1mlのPBS／0.2％FBS中で3回洗浄し、続いて50μlのPBS／10％FBSにより4℃で45分間ブロックした。続いてストレプトアビジン-PEを1／100希釈度で添加し、さらに氷上で1時間インキュベートした。3回の洗浄後に細胞を1％パラホルムアルデヒドを含むPBS中に固定し、FACS CaliberによりCell Questソフトウエアを用いて分析した。

11.2 結果
Cpn10とRAW264細胞の4時間のインキュベーションはTLR4発現を変化させなかった
TLR4は、抗マウスTLR4／MD-2-ビオチンに続いてストレプトアビジン-PEを用いるとRAW264細胞の表面に容易に検出された（図21）。対照抗体は明らかな染色を示すことができなかった（非提示データ）。4時間のCpn10処理も対照緩衝液処理もTLR4発現の変化を引き起こさなかった。

LPSによるTLR4のダウンレギュレーションおよびCpn10の影響
2ng／mlのLPSの添加は、LPS添加の2時間後にTLR4発現のわずかな低下を引き起こし（図22）、20ng／mlのLPSはほぼ完全な損失を引き起こした（図23）。4時間にわたるCpn10とのインキュベーションは、LPS添加後のTLR4の挙動を有意に変化させなかった。Cpn10処理を一晩に延長したところ、緩衝液で処理した細胞（図24および25）と比較して、TLR4発現はわずかに低下した（図24および25）。LPSにより媒介されるTLR4発現の低下は、細胞に2ng／mlのLPSを投与した場合、Cpn10で処理した細胞の方が幾分顕著であった（図24）。細胞を20ng／mlのLPSで処理した場合、すべての群においてTLR4発現は本質的に失われた（図25）。

11.3 考察および結論
4時間のCpn10処理によって媒介されるLUC活性は、LPSにより誘導されるNF-κB活性化の30〜50％の低下を引き起こした。このような処理はTLR4発現レベルをほとんど変化させないため、この作用が、TLR4発現のCpn10により媒介されるダウンレギュレーションに起因する可能性は低い。2ng／mlのLPSによって媒介されるダウンレギュレーションは、4時間のCpn10処理後にはおそらく極めてわずかに顕著であり、一晩のCpn10処理後には確実により顕著であった。これらの結果は、Cpn10がLPS添加後のTLR4発現の動態を変化させうることを示唆する。

実施例12‐Cpn10は広範囲にわたるTLRアゴニストに対する細胞応答を制限する
本発明者らは、Cpn10により媒介される、さまざまなTLRリガンドによって誘導されるNF-κB活性化の阻害の広さを記録することに着手した。

12.1 材料および方法
大腸菌LPS 055:B5はSigmaから調達し、大腸菌LPS 0111:B4超高純度（1×10⁶ EU／mg）、黄色ブドウ球菌リポテイコ酸（LTA）（12.5 EU／mg）、黄色ブドウ球菌ペプチドグリカン（PGN）（＜0.125 EU／mg）、枯草菌リポテイコ酸（LTA）（12.5 EU／mg）、枯草菌ペプチドグリカン（PGN）（0.25 EU／mg）、S.セレビシエのザイモサン（＜0.125 EU／ml）、イミキモドR837、CpG ODN1826（マウス）、CpG ODN2216（ヒト）およびGpC ODN1826（非刺激性対照）はすべてInvivogenから調達した。組換えマウスIL-1βはR & D Systemsから調達し、組換えマウスIFNγおよび組換えマウスTNFαはChemiconから調達した。サイトカインビーズアレイはBDから調達した。

RAW264-HIV-LTR-LUCのバイオアッセイ法
バイオアッセイ法は、本質的にはJohnson, B. et al. 2005. J Biol Chem 280:4037-4047に記載された通りに行った。各アッセイにおいて、Cpn10を25〜100μg／mlの濃度範囲で試験し、刺激薬は立ち上がりの急な用量反応曲線を誘発する濃度、すなわち大腸菌LPSは0.2〜5ng／ml、超高純度大腸菌LPSは5〜10ng／ml、黄色ブドウ球菌および枯草菌のLTAおよびPGNは10〜100μg／ml、S.セレビシエのザイモサンは10〜100μg／mlで用いた。Cpn10調製物ならびにTLRリガンドにおけるエンドトキシンの混入レベルは、この細胞株でこれらのアッセイ法に用いた濃度では、HIV-LTR活性化を誘導しないことが以前に示されているレベルを下回ることがわかっていることに留意されたい（Johnson, B. 2005. J. Biol Chem 280:4037-4047）。以下に提示したデータでは、HIV LTRがNF-κB活性化の大きな原因であることが知られており、このためこの転写因子の活性化の間接的指標であるという理解の下に、この細胞株の刺激の読取り値は、NF-κBの活性化として記載されていることに注意されたい。

ヒト末梢血単核細胞（PBMC）サイトカインアッセイ法
PBMCは、健常志願者のヘパリン添加血液から、Ficoll-Paque Plus（Amersharm Biosciences）による浮遊密度勾配遠心分離法によって単離した。PBMCは新たに単離した細胞として用いるか、または代替的には貯蔵液を凍結チューブに入れて液体窒素中で使用時まで保存した。PBMCを200μl／ウェルとして8×10⁵個／mlで96ウェル組織培養プレート（Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria）中に分注した。Cpn10を1時間にわたり添加し、続いて37℃および5％CO2の下でアゴニストにより20時間刺激し、その後に培養上清を収集した。サイトカインレベルは、市販のELISAキット（R&D Sciences）およびサイトメトリックビーズアレイ（BD）を用いて分析した。

シグナル分子のリン酸化レベルの検出
RAW264.7またはPBMCをCpn10とともに2時間インキュベートし、続いてLPSにより30分間刺激し、遠心分離した上で、ペレットを0.1％SDSを含むPBSで溶解させた。溶解物を5分間煮沸して冷却し、細胞片を遠心分離によってペレット化させて、上記の通りに上清をタンパク質濃度に関してアッセイした。リン酸化されたシグナルタンパク質は、p38、ERK1/2およびJNK1/2に対するBD CBA Flex Setを用いて検出した。または、RAW264.7をCytofix／Cytoperm（BD）で処理し、細胞内p38および細胞表面CD14に関して二重染色した。試料は、BD FACSArray BioanalyzerをFCAPアレイソフトウエアとともに用いて分析した。

12.2 結果
TLRアゴニストはHIV-LTRの活性化を誘導した
図26に表されたデータは、ある濃度範囲にわたるTLRリガンドにより刺激されたマウスマクロファージRAW264-HIV-LTR-LUC細胞におけるNF-κB活性化を、Cpn10が調節する能力を示している。本発明者らは、超高純度LPS（TLR4のみ）および非再精製LPS（TLR2およびTLR4の両方を刺激すると記載）の両方、2種類のグラム陰性菌である枯草菌および黄色ブドウ球菌からのLTA（TLR2）ならびに上記のグラム陰性菌の両方からのPGN（TLR2）を含む、TLRに対する広範囲にわたるリガンドをアッセイした。加えて、細胞を、酵母S.セレビシエの細胞壁から単離された調製物であるザイモサン（TLR2／TLR6）、およびTLR3と結合してそれを介して刺激する合成二本鎖RNAであるポリ（I：C）によっても刺激した。細胞をまた、Cpn10の存在下において、CpG DNA（TLR9）、またはTLR7 MyD88依存的経路を介して細胞を活性化する低分子量合成分子であるイミキモド（R837）による刺激の後にも調べた。検討したTLRのうち4種（TLR2、4、7、9）の連結後のNF-κB活性化の、Cpn10により誘導される調整を示すデータが提示されている。

図27は、種々のTLRリガンドによって刺激されたRAW264-HIV-LTR-LUC細胞におけるルシフェラーゼ活性の、Cpn10により誘導される最大阻害率を表している。応答パターンは検討したほとんどのリガンドで極めて類似しており、HIV-LTR活性化の平均阻害率は50％であるが、Cpn10はポリ（I：C）に応じてTLR3により誘導されるNFκB活性化は変化させないように思われる。さらに、Cpn10は、酵母細胞壁調製物であるザイモサンによって活性化された細胞ではおよそ20％という限定的なNF-κB阻害を引き起こした。

細胞内シグナルタンパク質のリン酸化に対するCpn10の影響
RAW264細胞のLPS刺激は、IκBキナーゼ（IKK）-NF-κB経路および3種のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路：細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）1および2、c-Jun N末端キナーゼ（JNK）ならびにp38を含む、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を活性化する。さらに下流で、これらのシグナル伝達経路はNF-κBおよびAP-1を含む数多くの転写因子を活性化し、それらは続いて炎症メディエーターをコードする遺伝子の誘導に協調的に働く。これらのシグナル系に対するCpn10の影響を評価するために、本発明者らは、Cpn10の存在下または非存在下における、LPSにより30分間刺激された細胞におけるリン酸化p38、JNK1/2およびERK1/2のレベルを測定した。本発明者らは、Cpn10が、シグナル伝達経路のこれらのメンバーのそれぞれの、LPSにより誘導されるリン酸化を用量反応的に制限することを示した（図28）。

種々のTLRリガンドによって刺激された、新たに単離したヒト細胞によるサイトカインの産生に対するCpn10の活性を確かめるために、本発明者らは健常ドナーからのPBMCをCpn10で1時間にわたって前処理し、続いて選択された範囲のTLRリガンドによって20時間刺激した。続いて細胞培養上清におけるサイトカインレベルをELISAまたはサイトメトリックビーズアレイを用いてアッセイした。図29A〜Dに示されているように、TLR2またはTLR4に対するアゴニスト（PGN、LTA、ザイモサン、LPS）によって誘導される、TNF-α、IL-1β、IL-6およびIL-10を含むサイトカインの産生は、Cpn10の存在下では低下した。同様に、Cpn10の存在下における、TLR7または9に対するアゴニストであるイミキモドまたはCpG（ODN2216）によるよるPBMCの刺激は、図29E中のデータによって示されているように、Cpn10の非存在下での対照培養物と比較してサイトカインの産生の低下をもたらした。

Cpn10とのプレインキュベーション後の洗浄は、LPSにより誘導されるNF-κBの活性化を制限するCpn10の能力に影響を及ぼさない
本発明者らは以前に、LPSによる刺激の前の、RAW264-HIV-LTR-LUC細胞とCpn10との2時間にわたるプレインキュベーションが、ルシフェラーゼ活性の用量反応的な低下を最適化することを明らかにしている。本発明者らは今回、LPS刺激の前にCpn10との2時間のプレインキュベーションに続いてPBS洗浄を行っても、図30に示されているように、NF-κB活性化の指標としてのルシフェラーゼ活性の、Cpn10により媒介される低下に変化がないことも示した。

非TLR性アゴニストはNF-κB活性化を誘導した
Cpn10の活性をさらに特徴づけるために、本発明者らはさまざまな非TLR性アゴニストのCpn10による調整について調べた。この非TLR性プログラムの一環として、Cpn10の存在下において、RAW264.7細胞を1〜10ng／mlの低エンドトキシン（2.24 EU／mg）組換えマウスIFN-γにより6時間刺激した（図31）。細胞上清を収集し、ELISAを用いてTNF-αに関して分析した。Cpn10はIFN-γにより誘導されるTNF-α産生を増強することが見いだされた。IFN-γ刺激の前に細胞をCpn10とともに2時間インキュベートした場合には、TNF-αの産生の顕著な相乗的増加の増強が起こった。Cpn10の存在下でIFN-γにより2時間または4時間刺激したRAW264-HIV-LTR-LUC細胞からの溶解物における、NF-κBにより誘導されるルシフェラーゼレベルも測定した。

12.3 考察および結論
本発明者らは、Cpn10がTLR2、4、7および9を含む種々のTLR特異的リガンドに対するマクロファージ応答の動態を調節する能力を示し、それ故に、NF-κB活性化およびサイトカイン産生の上流にあるシグナル伝達分子、すなわちERK、JNKおよびp38を含むMAPKファミリーのシグナル伝達タンパク質のメンバーのリン酸化に対するCpn10の影響を示した。本発明者らはまた、Cpn10が、LPSによって活性化された細胞における細胞内リン酸化MAPKのレベルを用量反応的に低下させることも示した。

この実施例に提示されたデータは、Cpn10が、ある範囲にわたるTLRリガンドによってインビトロで刺激されたマクロファージにおける先天性免疫応答の動態を用量反応的に調節することを示している。これらの分子によって誘発されるNF-κB活性化の、Cpn10により誘導される阻害の最大レベルは、TLR7アゴニスト（R837）によるRAW264-HIV-LTR-LUC細胞株の刺激後にはおよそ80％であった。その対極的な規模として、10〜100μg／mlの範囲の濃度で添加したCpn10は、酵母細胞壁調製物であるザイモサンによるTLR2／6関与の動態に対して、20％を上回る影響を及ぼさなかった。

Cpn10によるNF-κB活性化の低下のパターンに対する少なくとも1つの例外には、ポリイノシン酸-ポリシチジル酸（ポリ（I：C））による活性化が含まれる。ポリ（I：C）は、TLR3との相互作用を介してNF-κBを活性化するウイルス感染に伴ってみられる分子パターンである二本鎖RNAの合成類似体である。Cpn10は、NF-κB活性化シグナルを制限するのではなく、このアゴニストに応じたI型インターフェロンの産生を用量反応的に増加させる。

実施例13‐固体マトリックスに結合させたCpn10と結合する細胞表面受容体の同定
13.1 材料および方法
Cpn10と結合する宿主細胞上の受容体の単離
アフィニティーカラム（NHS活性化Hi-Trap）カラム（AmershamPharmacia）を、Cpn10（CBio Ltdにより供給、バッチCH003）を用いて調製した。Cpn10を重炭酸緩衝液pH 8.3中に透析させ、製造元の指示に従ってカラムに結合させた。

ヒト単球をNP-40溶解緩衝液（0.05％w／v）を用いて溶解させた。全細胞溶解物をCpn10アフィニティーカラムに通過させ、非結合分子をPBSで洗い流した。Cpn10結合性の受容体分子を、b-オクチル-グルコシド（b-OG）溶出緩衝液（15mMトリエタノールアミン、pH 11.5、140mM NaClおよび30mM b-OG）を用いて溶出させ、1Mの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸pH 5で中和した上で、PBSに対して透析した。対照として、タンパク質を結合させていないカラムに対しても細胞溶解物を通過させた。

溶出液をCentriprep YM-10（Millipore）を用いて濃縮し、1mlに濃縮した上で、SDS-PAGE（図32）または2Dゲル（図33）電気泳動によって分析した。2Dゲル電気泳動に関しては、濃縮した溶出液の緩衝液を、分析の前に再水和緩衝液（8M尿素、2％CHAPS、10mM DTT、0.2％Bio-Lyte）（Biorad）を用いて交換した。関心対象のバンドまたはスポットを切り出し、トリプシン消化した上でMALDI-TOF分析用に搬送した。

1Dゲル電気泳動によるタンパク質の分離
溶出した溶液を2×SDS-PAGE還元緩衝液（4mlの10％SDS、2.5mlの0.5M Tris-HCl PH：6.8、5gのグリセロール、1mlの14.3Mメルカプトエタノールおよび5mgのブロモフェノールブルー）で処理して、熱湯中に5分間おいた。試料を泳動させるために、Criterion Tris-HCl Precast 4〜20％勾配ゲル（Biorad）を用いた。十分な範囲のRAINBOW分子量マーカー（2μl）を第1のウェルにロードし、残りのウェルには40μlの試料をロードした。続いてゲルを電気泳動槽に入れ、泳動用緩衝液を添加した。泳動用緩衝液は0.025M Tris、0.2Mグリシン、0.1％SDSからなり、pH 8.3に調整された。電気泳動は200Vの定電圧下で50分間行った。電気泳動の後にゲルを取り出し、固定用緩衝液（40％エタノール、10％酢酸、50％H₂O）で一晩固定した上で、クーマシーブルー着色剤（50％クーマシーブルー（0.3w／v）、25％メタノール、5％酢酸、20％H₂O）で1.5時間染色した。最後にゲルを脱染剤（10％エタノール、10％酢酸、80％H₂O）による数回の洗浄によって脱染した。

2Dゲル電気泳動によるタンパク質の分離
非直線的に固定化されたpH勾配（3-10 ReadyStrip IPGストリップ11cm）を第1の次元として用いた。200μlの試料のアリコートをフォーカシングトレイにピペットで注ぎ、IPGストリップをその上に乗せて、ゲル面を下に向けて試料および緩衝液を含めた溶液に触れさせた。尿素の沈降を避けるためにIPGストリップの上を鉱油で覆った。ストリップを20℃の受動的条件下にて12時間かけて再水和させた。続いてストリップに対するフォーカシングを、ストリップ当たり一定の50μAにて6000〜7000ボルトでおよそ52,000v-hrを用いて行った。第2の次元に関してReadyStrip IPGストリップを調製するためには、それらをフォーカシングトレイから取り出し、50mM Tris HCl、pH 8.8、6M尿素、2％SDS、30％グリセロール、1％DTTを含む5mlの緩衝液によって平衡化させた。続いて第2の平衡化を、DTTの代わりに1.5％ヨードアセトアミドを含む容積5mlの同じ緩衝液中で行わせた。平衡化の後に、ReadyStrip IPGストリップをCriterionゲル（4〜20％勾配）の上に乗せ、微量のメルカプトエタノールを含む0.5％アガロースを重ねた。ゲルをCriterionセル内で200Vで60分間泳動させた。電気泳動の後にゲルを取り出し、固定用緩衝液（40％エタノール、10％酢酸、50％H₂O）で一晩固定した上で、クーマシーブルー着色剤（50％クーマシーブルー（0.3w／v）、25％メタノール、5％酢酸、20％H₂O）で1.5時間染色した。最後にゲルを脱染剤（10％エタノール、10％酢酸、80％H₂O）による数回の洗浄によって脱染した。

13.2 結果
アフィニティークロマトグラフィーおよびSDSPAGE電気泳動によるCpn10結合性タンパク質の単離
本発明者らは上記の方法を用いて予備的な検討を行い、表5に示されているように、質量分析を用いていくつかのCpn10結合性タンパク質を同定した。

（表５）質量分析を用いたCpn10結合性分子の同定

これらの結果を検証するため、ならびに同定されなかったタンパク質のアイデンティティを明らかにするために、本発明者らはアフィニティークロマトグラフィーによるCpn10結合性タンパク質の単離を繰り返して行い、溶出した分子をSDS-PAGE（図32）ならびに2次元ゲル電気泳動（図33）によって分析した。

タンパク質を結合させていないアフィニティーカラムに細胞溶解物を流した対照実験では、SDSPAGE上にタンパク質バンドは認められなかった（非提示データ）。

13.3 考察および結論
この質量分析データにより、Cpn10の宿主細胞に対する結合および細胞内輸送のために重要な可能性のあるいくつかのタンパク質の同定が可能となった。特に、アクチン重合の動態を調節する小型のアクチン結合性タンパク質であるプロフィリンは、Cpn10結合性タンパク質であるように思われた。Cpn10応答の調節に重要な可能性のあるもう1つの分子はGRP78である。GRP78は、Cpn10の輸送に関与している可能性のあるシャペロンである。

実施例14‐インビトロでポリI：Cにより刺激された細胞によるロスリバー熱ウイルス抗ウイルス応答に対するCpn10の影響
本発明者らは、IFNα／βの抗ウイルス効果に対する感受性が高いことが判明しているウイルスを用いて、Cpn10がポリI：Cにより誘導される抗ウイルス耐性に影響を及ぼすか否かを検討することに興味を抱いた。

14.1 材料および方法
Cpn10
Cpn10をTris-食塩水緩衝液pH7. 6に溶解させ、アリコートに分けてドライアイス上で凍結させた後に-20℃で保存した。アリコートは使用前に解凍させた。

ポリI：C
図34に示されたデータに関しては、ポリI：C（Invivogenにより供給）を滅菌食塩水に5mg／mlで溶解させて-20℃で凍結保存した。バイアルを解凍させ、培地で希釈した。緩衝液対照に関しては、同じ容積の滅菌食塩水を細胞培養ウェルに添加した。図35に示されたデータに関しては、ポリI：Cを滅菌食塩水に5mg／mlで溶解させた後に、25μl／500μlずつ分注し、dsRNAを沈殿させるために62.5μlの100％エタノール（2.5倍容積）を添加した。このチューブを-70℃で保存した。アッセイ当日に、アリコートを最高速度（13,000rpm）で30分間、40℃で遠心分離した。ペレットを70％エタノールDEPCで処理した蒸留水で1回洗浄し、ペレット化した上で上清を除去し、ペレットをフード内で乾燥させ（約15分間）、100μlのRPMI 1640中に再懸濁させた。BioPhotometerのRNA定量装置（Eppendorf）を用いた判定で、dsRNAの回収率は約50％であることが明らかになった。図中に示されたdsRNA濃度はすべて、50％の回収率であるとみなしている。

抗ウイルスアッセイ法
RAW264.7細胞をフラスコ内の付着培養物として増殖させ、剥離させた後に（すなわちトリプシン処理していない）、96ウェルプレートに播いた。HeLa細胞は播種の前に標準的なやり方でトリプシン処理した。細胞を2つずつの繰り返しで96ウェルプレートに播いた（各ウェルに50μl培地中にRAW264.7細胞については5×10³個、HeLa細胞については10⁴個）。4時間後に、Cpn10を添加し（培地中に50μlに希釈）、さらに30分後にポリI：Cを添加した（培地中に50μlに希釈）。続いて細胞を96ウェルプレート内で一晩インキュベートし、その後にRRV（50μl中にRAW264.7細胞についてはMOI＝1、HeLa細胞についてはMOI＝10）を添加した。記載されている通りに（Antalis et al, J Exp Med 1998, 187(11):1799）、3日後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色して洗浄し、乾燥させて、色素を100％メタノールで抽出した上で、A595nmで読み取りを行った。

14.2 結果
RAW264.7細胞に対するポリI：Cの影響
まず、ポリI：CをRAW264.7細胞に対して0〜100μg／mlの範囲で漸増的に添加した。5〜10μg／mlを上回るポリI：Cの濃度は、細胞の丸まりおよび3日間のアッセイ期間中の増殖の乏しさを伴う、明らかな毒性の徴候を示す細胞を生じさせた。HeLa細胞に関してはそのような毒性は観察されなかった（図34）。

Cpn10およびポリI：C
RAW264.7細胞およびHeLa細胞の抗ウイルス耐性の誘導のために必要な用量を決定するために力価測定を行った。続いて、適切な濃度範囲のポリI：Cを用いて、Cpn10がdsRNAの抗ウイルス活性を高めるか否かに関する仮説を検証した。図35に示されているように、RAW264.7細胞、HeLa細胞のいずれも、細胞生存度を測定するこの3日間のアッセイで検討したポリI：CおよびCpn10の濃度では、Cpn10の存在下においても非存在下においても抗ウイルス耐性の差を示さなかった。

14.3 考察および結論
この検討において、Cpn10は、アルファウイルスにより誘導されるCPEに対する、合成dsRNAにより誘導される抗ウイルス耐性に影響を及ぼさなかった。ここに提示したデータは、Cpn10がdsRNAによるシグナル伝達に影響を及ぼしうるという見方を裏付けていない。dsRNAはTLR3、PKR、RIG-l／mda-5および／またはATF2／c-Junを介してシグナルを伝達しうるが、TLR3が細胞外dsRNAの主要なセンサーであリ、他のシグナル伝達経路は細胞質dsRNAによって誘発されると考えられている。

実施例15‐組換えCpn10は細胞表面でAPCと相互作用する
本発明者らは、細胞外Cpn10が免疫応答を調整する可能性のある手段について考察した。白血球のその部分集団の細胞がCpn10と結合するかを同定するために、本発明者らはCpn10をC末端システイン残基の箇所で蛍光団によりタグ標識し、それが野生型Cpn10と等価なシャペロン活性および免疫修飾物質活性をインビトロで保っていることを示した（非提示データ）。標識Cpn10とPBMCとを4℃で、別々の白血球部分集団を同定するための一団の抗体とともにインキュベートしたところ、Cpn10は、APC、特に骨髄性DC（CD3^-CD4^lowCD14^-CD11c⁺）、形質細胞様DC（CD3^-CD4^lowCD14^-CD11c^low）および単球（CD4^lowCD14⁺）と最も強く相互作用し、T細胞に対する親和性はそれよりも低いことが示された（図36A）。PBMCをLTAで刺激した場合には、刺激されていないCD14⁺細胞と比較して、4時間ごとにCD14⁺細胞の表面に対する蛍光性Cpn10結合のレベルにおよそ1.6倍の上昇がみられた（図36B）。これらのデータは、細胞外Cpn10がその生物活性を、先天免疫系の重要な調節細胞であるAPCに対して発揮することを示唆する。

本発明者らはまた、蛍光性Cpn10の免疫細胞への取込み経路についても共焦点顕微鏡によって追跡した。ヒトpDCまたはマウスマクロファージと蛍光性Cpn10とを、細胞内区画を識別するための試薬とともにインキュベートしたところ、Cpn10は急速に取り込まれ、サイトゾルにもミトコンドリアにも入ることなく、酸性化された細胞内小胞へと輸送されることが示された（図36C）。これらのデータは、Cpn10タンパク質が、免疫担当細胞と会合し、TLR活性化モチーフの存在のシグナルを伝達する領域に濃縮されることを示している。

実施例16‐治療用の組成物
本明細書に提供した本発明を実施する最良の形態に従って、具体的な好ましい組成物を以下に概説する。以下は組成物の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものでは全くない。

実施例16（a）‐非経口的投与用の組成物
筋肉内注射用の組成物は、1mlの滅菌緩衝水および1mgの適した化合物を含むように調製しうると考えられる。

同様に、静脈内注入用の組成物は、250mlの滅菌リンゲル液および5mgの適した化合物を含みうる。

実施例16（b）‐注射用の非経口的組成物
注射による投与のために適した組成物は、重量比にして1％の適した化合物を、重量比にして10％のプロピレングリコールおよび水と混合することによって調製しうる。溶液は濾過によって滅菌される。

実施例16（c）‐カプセル組成物
カプセルの形態にある適した化合物の組成物は、標準的な2ピース型の硬ゼラチンカプセルに、粉末形態にある50mgの作用物質または化合物、100mgのラクトース、35mgのタルクおよび10mgのステアリン酸マグネシウムを充填することによって調製しうる。

実施例16（d）‐点眼用組成物
点眼剤としての送達のための典型的な組成物の概要は以下の通りである：
適した化合物 0.3g
ヒドロキシ安息香酸メチル 0.005g
ヒドロキシ安息香酸プロピル 0.06g
精製水を加えて約100.00mlに。

ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピルを75℃の70ml精製水に溶解させ、その結果得られた溶液を冷却させる。続いて適した化合物を添加し、溶液を膜フィルター（孔径0.22μm）に通す濾過によって滅菌し、滅菌容器に無菌的に詰める。

実施例16（e）‐吸入投与用の組成物
容量20〜30mlのエアロゾル容器に関しては：10mgの適した化合物と、重量比にして0.5〜0.8％のポリソルベート85またはオレイン酸などの潤滑剤との混合物をフレオンなどの噴射剤中に分散させ、鼻内または経口的な吸入投与のために適切なエアロゾル容器に入れる。

実施例16（f）‐軟膏組成物
軟膏としての送達用の典型な組成物は、1.0gの適した化合物を、全体が100.0gとなるようにした白色軟パラフィンとともに、滑らかで均質な生成物を生じるように分散されて含む。

刺激2時間前に添加した10〜200μg／mlの組換えヒトCpn10の存在下における、100μg／mlのポリI：Cによる23時間の刺激後のRAW264.7細胞の上清中へのIFNβ（pg／ml）の分泌。示されている結果は2回ずつの実験によるものである。刺激2時間前に添加した10〜100μg／mlの組換えヒトCpn10の存在下における、100ng／mlの再精製LPSまたは100μg／mlのポリI：Cのいずれかによる刺激後のRAW264.7細胞の上清中へのI型インターフェロン（IU／ml）の分泌。 50μg／mlの組換えヒトCpn10（アゴニストと同時に添加）の存在下（□）または非存在下（■）における、TLR7／TLR4発現構築物およびNF-κB-ルシフェラーゼレポーター構築物によるトランスフェクション後のHEK293細胞におけるNF-κB活性化（x倍）。細胞は、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA；プロテインキナーゼC活性化物質）、R848（R848；TLR7アゴニスト）、CpGオリゴヌクレオチド（CpG；TLR9アゴニスト）または再精製リポ多糖（LPS；TLR4アゴニスト）のいずれかによって刺激した。 50μg／mlの組換えヒトCpn10（アゴニストと同時に添加）の存在下（□）または非存在下（■）における、TLR9発現構築物およびNF-κB-ルシフェラーゼレポーター構築物によるトランスフェクション後のHEK293細胞におけるNF-κB活性化（x倍）。細胞は、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA；プロテインキナーゼC活性化物質）、R848（R848；TLR7アゴニスト）、CpGオリゴヌクレオチド（CpG；TLR9アゴニスト）または再精製リポ多糖（LPS；TLR4アゴニスト）のいずれかによって刺激した。2つの独立したクローンに関する結果が提示されている（AおよびB）。 CpG DNAの存在下における、TLR9発現構築物およびNF-κB-ルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトしたHEK293細胞におけるNF-κB活性化（A、ルシフェラーゼ単位、およびB、相対ルシフェラーゼ単位として提示）に対する組換えヒトCpn10濃度（12.5μg／ml、25μg／ml、50μg／mlおよび100μg／ml）の影響（Cpn10はアゴニストと同時に添加）。 A．種々の濃度の組換えヒトCpn10（1μg／ml、10μg／mlまたは50μg／ml）の存在下（アゴニストと同時に添加）またはCpn10の非存在下における、再精製リポ多糖（LPS）により刺激されたヒト末梢血単核細胞（PBMC）からのTNF-α放出（ng／ml）。B．PBMCから最初に形質細胞様樹状細胞（PDC）を除去した点を除き、Aと同じ。 A．種々の濃度の組換えヒトCpn10（1μg／ml、10μg／mlまたは50μg／ml）の存在下またはCpn10の非存在下における、再精製リポ多糖（LPS）により刺激されたヒト末梢血単核細胞（PBMC）からのIL-10放出（ng／ml）。B．PBMCから最初に形質細胞様樹状細胞（PDC）を除去した点を除き、Aと同じ。 Cpn10は、RAW264-pNifty2-LUC細胞株におけるポリ（I：C）によるNF-κB活性化を低下させない。 Cpn10は、LPS（主としてIFN-β）またはポリ（I：C）（主としてIFN-α）により24時間にわたって刺激されたRAW264.7細胞におけるI型IFNの産生を用量反応的に促進する。 Cpn10は、ポリ（I：C）により刺激されたRAW264.7細胞におけるIFNβの産生を転写レベルで用量反応的に促進する。LPSにより刺激されたRAW264.7細胞では、Cpn10の存在下におけるIFNβの増強も認められる。 50μg／mlのポリ（I：C）により刺激された2例の異なるドナーからのヒトPBMCでは、Cpn10の存在下でIFN-αの産生レベルが上昇する。 Cpn10は、ポリ（I：C）により誘導されるIFN-βの用量反応的な増加を誘導するが、GroESは誘導しない。 Cpn10とのプレインキュベーション後の洗浄により、ポリ（I：C）により誘導されるIFN-β産生のCpn10用量反応的な増加が低下する。 Cpn10は、IFNAR1-/-マウスからのBMMにおけるIFNβ応答を増強しない。 Cpn10によるTLR4応答の調整には、I型インターフェロン経路を介したマクロファージのプライミングが必要である（n＝2）。 LPSにより誘導される全身炎症を有するマウスにおける血清TNFαおよびIFNβレベル。 SFVに感染した6〜9日齢の新生C57BL／6マウスの生存率。6〜9日齢の新生C57BL／6マウスを以下の通りに用いた：A群：SFV（n＝13）；B群：SFV＋Cpn10を20μg（n＝13）；C群：SFV＋Cpn10を50μg（n＝13）。B群およびC群には20μgおよび50μgのCpn10を腹腔内注射し、続いて（3時間後に）、3群すべてに対して50μlのSFV（30×TCID50）の注射を行った。生存率は、示した説明に従ってプロットされている。 Cpn10プロモーターは、熱ショック（HS）刺激およびTLR刺激によって誘導される。代表的なアッセイ法は、6時間の回復期間を伴う熱ショックによってCpn10プロモーター活性が有意に上昇し、その後、HSから18時間後までに基礎レベルに戻ることを示している（n＝2の繰返しアッセイ）（A）。これに対して、LTA（TLR2アゴニスト）による刺激は、刺激から24時間までにプロモーターの2.7倍の誘導を招き、30時間の時点でもこれは一定に保たれた（A）。TLR2（B、C）、TLR7（D、E）またはTLR9（F、G）リガンドの滴下による細胞の刺激は、Cpn10プロモーターを用量依存的な様式で誘導した（n＝2〜6回の繰返し）。C、EおよびGに提示されたデータは、B、DおよびFにおけるものと同じデータを反映しているが、ベースラインに対する変化倍数として表されている。エラーバーは平均の1つのSDを反映している。TLRアゴニストおよびサイトカインは、Cpn10プロモーターをさまざまな最大レベルで誘導した（H）。Cpn10プロモーター活性は、各アゴニストに関して基礎レベルに対して正規化されたルシフェラーゼcpsとして表現されている。最適なアゴニスト濃度およびアッセイの反復数：TLR2：枯草菌（B. subtilis）LTA 100μg／ml、n＝12；TLR3：100μg／ml ポリ（I：C）、n＝6；TLR4：超高純度大腸菌（E. coli）LPS 10ng／ml、n＝12；TLR7：イミキモドR837 10μg／ml、n＝2；TLR9、CpG ODN 1mM、n＝2；IFNγ 1ng／ml、n＝3、IL-1β（1ng／ml）、n＝2、TNFα（100ng／ml）、n＝2（H）。（A）については（p＜0.02）、（F）については（p＜0.05）の有意性をANOVAで評価したが、これを^＊によって示している。cps＝1秒当たりカウント数。LTAで刺激した非トランスフェクトRAW264.7細胞では、Cpn10のmRNAレベルの一過性の濃度依存的上昇がリアルタイムPCR（I）によって測定された。遺伝子発現は対照用ハウスキーピング遺伝子（18SおよびPbgd）に対して正規化した。 TLRアゴニストおよび熱ショックはCpn10産生を誘導するが、Cpn10の細胞外放出を引き起こすのはTLRアゴニストのみである。LTAにより刺激されたRAW264.7全細胞溶解物のELISAによる定量分析では、処理細胞と対照細胞との間にCpn10レベルの差はほとんど認められなかった（A）が、培養上清の分析では、100μg／mlのLTAによる刺激の30時間後に細胞外Cpn10の3倍の増加が示された（B）。上清Cpn10はウェル当たりの細胞数に対して正規化した。経時的推移の分析により、TLR2連結に応じて30時間以上にわたる持続的なCpn10プロモーター活性化が示された。結果は試料タンパク質濃度に対して標準化した（C）。RAW264.7細胞に対する軽度、中等度または高度の熱ショックは、Cpn10の細胞外放出を誘導しなかった（D）。RA患者の流血中のCpn10レベルは、MSもしくは乾癬の患者または健常対照対象におけるよりも有意に高かった。有意性についてはTukeyの事後検定を伴う一元配置ANOVAによって分析し、^*（p＜0.01）または^**（P＜0.001）によって示している（E）。 Cpn10は、さまざまなTLRを通じてアゴニストにより誘導されるシグナル伝達を制限する。HIV-LTR-LUCプロモーター構築物が安定的にトランスフェクトされたRAW264.7細胞を、種々のTLRリガンドによる刺激の前にCpn10とともにインキュベートしたところ、これらの細胞においてNF-κB活性化の指標であるルシフェラーゼ活性の阻害が引き起こされた（A）。アゴニスト濃度およびインキュベーション時間は以下の通りであった：CpG ODN 16.25μg／ml、4時間；イミキモド10μg／ml、2時間；ポリ（I：C）100μg／ml、4時間；ザイモサン10μg／ml、2時間；PGN 10μg／ml、2時間；PGN 10μg／ml、2時間；超高純度LPS 10ng／ml、2時間；LPS 5ng／ml、2時間。RAW264.7細胞（B、C）またはヒトPBMC（D）のCpn10プレインキュベーション後のLPS刺激（RAW264.7細胞では10ng／ml、PBMCでは100ng／ml）は、リン酸化MAPKシグナルのレベルの用量反応的な低下をもたらす。Cpn10の存在下でのTLR 2、2／6、4、7、9に対するリガンドによるヒトPBMCの刺激は、TNF-α、IL-1β、IL-6およびIL-10のレベルの低下、ならびにイミキモドおよびCpG ODNにより誘導されるIFNα産生の増加を引き起こす（E）。用いたリガンドの濃度は以下の通りであった：10μg／ml PGN、10μg／ml LTA、10μg／mlザイモサン、0.12ng／ml LPS、6.5μg／ml CpG ODN、10μg／mlイミキモド。懸濁下で増殖させたRAW264細胞を、100μg／ml Cpn10または等容積の希釈緩衝液の存在下で4時間インキュベートし、続いてTLR4の存在に関して染色した。懸濁下で増殖させたRAW264細胞を、2ng／ml LPS（Cpn10処理の最後の2時間にわたり添加）とともに、またはそれを伴わずに、100μg／ml Cpn10または等容積の希釈緩衝液の存在下で4時間インキュベートし、続いてTLR4の存在に関して染色した。懸濁下で増殖させたRAW264細胞を、Cpn10処理の最後の2時間にわたり添加した20ng／ml LPSとともに、またはそれを伴わずに、100μg／ml Cpn10または等容積の希釈緩衝液の存在下で4時間インキュベートし、その後にTLR4に関して染色した。（平均蛍光強度：橙：4.39、黒：6.14、青：25）。懸濁下で増殖させたRAW264細胞を、Cpn10処理の最後の2時間にわたり添加した20ng／ml LPSとともに、またはそれを伴わずに、100ug／ml Cpn10または等容積の希釈緩衝液の存在下で一晩インキュベートし、続いてTLR4に関して染色した。平均蛍光強度青-25、赤-33、橙-11.7、黒-20。懸濁下で増殖させたRAW264細胞を、Cpn10処理の最後の2時間にわたり添加した20ng／ml LPSとともに、またはそれを伴わずに、100μg／ml Cpn10または等容積の希釈緩衝液の存在下で一晩インキュベートし、その後にTLR4に関して染色した。（平均蛍光強度：橙：橙：3.9、黒：7.9）。代表的なTLRリガンドおよびCpn10によるルシフェラーゼ活性の阻害。A、C、E、G、Iにおけるデータはルシフェラーゼ単位をCPSで表しており、一方、B、D、F、H、Jはこれらのデータを、LPSにより刺激したRAW264-HIV-LTR-LUC細胞におけるルシフェラーゼ活性の阻害率として表している。 NF-κB活性化の間接的な指標としての、広範囲にわたるTLRリガンドによって刺激されるHIV-LTR活性化のCpn10により誘導される最大阻害率。 Cpn10は、LPSにより30分間刺激された細胞における、リン酸化p38（A）、ERK1/2およびJNK1/2（B）のレベルを用量反応的に低下させる。マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7に関して示されているように、Cpn10は、新たに単離されたヒトPBMCにおける、p38、ERK1/2およびJNK1/2のLPSにより誘導されるリン酸化のレベルを用量反応的に低下させた（C）。MAPキナーゼ経路の活性化はサイトカイン産生の炎症性カスケードの誘導と密接につながっているため、これらのデータは、Cpn10により媒介される、リガンドにより誘導されるサイトカイン産生の変化が、TLRシグナルカスケードの変化に起因することを示している。 Cpn10の存在下で、TLR2（PGN、LTA）、TLR2、6（ザイモサン）、TLR4（LPS）、TLR7（イミキモド）またはTLR9（CpG 0DN2216）に対するリガンドにより刺激されたヒトPBMCは、サイトカイン産生の低下を引き起こす。 LPS添加の前の、Cpn10とのプレインキュベーション後の洗浄は、依然としてNF-κB活性化を用量反応的な様式で制限する。 Cpn10とのプレインキュベーション後の、6時間にわたるIFN-γ刺激は、RAW264.7細胞によるTNF-α産生の増加を引き起こす。 Cpn10結合性分子のSDS-PAGE分析。Cpn10アフィニティーカラムと結合させて溶出させた細胞溶解物タンパク質のSDS-PAGEゲル。 Cpn10結合性分子の2Dゲル電気泳動。CPn10アフィニティーカラムと結合させて溶出させた細胞溶解物タンパク質の2Dゲル。 RAW264（A）およびHeLa細胞（B）におけるポリI：Cの3日間にわたる毒性プロファイル。 RAW264（A）およびHeLa細胞（B）におけるポリI：Cに対するCpn10の3日間にわたる影響。 Cpn10はヒト抗原提示細胞と細胞表面で相互作用し、エンドソーム-リソソーム区画への内部取込みを受ける。精製PBMCを、蛍光団と結合させたCpn10とともに4℃で10分間インキュベートし、表面蛍光をフローサイトメトリーによって測定した（A）。Cpn10はmDCおよびpDCと最も強く会合し、単球は4時間にわたるLTA刺激後に蛍光性Cpn10の結合の増加を示した（B）。RAW264.7細胞および精製ヒトpDCを蛍光性Cpn10とともに37℃で30分間インキュベートし、その後に共焦点画像を撮影した。ミトコンドリアおよび酸性区画の蛍光マーカーとの同時インキュベーションにより、エンドソーム-リソソーム区画へのCpn10の内部取込みが判明した（C）。

Claims

対象における、またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器におけるToll様受容体シグナル伝達を調整するための方法であって、シャペロニン10の有効量を投与する段階を含む方法であり、Toll様受容体シグナル伝達がシャペロニン10と活性化クラスター内のToll様受容体との会合を含む方法。
対象における、またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器におけるToll様受容体シグナル伝達を調整するための方法であって、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストの有効量を投与する段階を含む方法であり、Toll様受容体シグナル伝達がシャペロニン10と活性化クラスター内のToll様受容体との会合を含み、かつアンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げる、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げる方法。
活性化クラスターが、シャペロニン10、Toll様受容体、および任意で少なくとも1つの他の分子を含む、請求項1または請求項2記載の方法。
少なくとも1つの他の分子がToll様受容体アゴニストを含む、請求項3記載の方法。
活性化クラスターがシャペロニン10、TLR2およびリポテイコ酸（LTA）を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
活性化クラスターがシャペロニン10、TLR3および二本鎖RNAを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
活性化クラスターがシャペロニン10、TLR4およびLPSを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
活性化クラスターがシャペロニン10、TLR7および一本鎖RNAを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
活性化クラスターが、シャペロニン10と、TLR9と、CpGモチーフを含むDNAとを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
シャペロニン10が、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：3に示されたポリペプチド配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
シャペロニン10が、シャペロニン10をコードするポリヌクレオチドの形態で投与される、請求項1または3〜9のいずれか一項記載の方法。
ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：4に示された配列を含む、請求項11記載の方法。
少なくとも1つの追加的な作用物質の投与をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
少なくとも1つの追加的な作用物質が、IFNαまたはIFNβを含む群から選択される免疫修飾物質である、請求項13記載の方法。
対象における疾患または病状を治療または予防するための方法であって、シャペロニン10の有効量を対象に投与する段階を含む方法であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している方法。
対象における障害の治療または予防のための方法であって、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストの有効量を対象に投与する段階を含む方法であり、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している方法。
疾患または病状が、敗血性ショック、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬、心疾患、アテローム性動脈硬化、慢性肺疾患、悪液質、多発性硬化症、GVHDおよび癌を含む、ウイルス性または細菌性の感染症、急性または慢性の炎症性疾患を含む群から選択される、請求項15または請求項16記載の方法。
シャペロニン10が、LTAにより誘導されるTLR2シグナル伝達を調節する、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
シャペロニン10が、TLR2により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整する、請求項18記載の方法。
シャペロニン10が、二本鎖RNAにより誘導されるTLR3シグナル伝達を調節する、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
シャペロニン10が、TLR3により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整する、請求項20記載の方法。
シャペロニン10が、LPSにより誘導されるTLR4シグナル伝達を調節する、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
シャペロニン10が、TLR4により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整する、請求項22記載の方法。
シャペロニン10が、ウイルス性一本鎖RNAにより誘導されるTLR7シグナル伝達を調節する、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
シャペロニン10が、TLR7により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整する、請求項24記載の方法。
シャペロニン10が、CpGモチーフにより誘導されるTLR9シグナル伝達を調節する、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
シャペロニン10が、TLR9により誘導される免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整する、請求項26記載の方法。
少なくとも1つの追加的な作用物質の投与をさらに含む、請求項15〜27のいずれか一項記載の方法。
少なくとも1つの追加的な作用物質が、IFNαまたはIFNβを含む群から選択される免疫修飾物質である、請求項28記載の方法。
疾患または病状の治療または予防のために用いられる場合の組成物であって、シャペロニン10を少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤または補助物質とともに含む組成物であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している組成物。
Toll様受容体の少なくとも1つのアゴニスト、および／または少なくとも1つの免疫修飾物質をさらに含む、請求項30記載の組成物。
疾患または病状の治療または予防のために用いられる場合の組成物であって、シャペロニン10の少なくとも1つのアンタゴニストを含む組成物であり、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している組成物。
疾患または病状の治療または予防のための医療薬剤の製造のためのシャペロニン10の使用法であって、シャペロニン10が活性化クラスターのToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状に対する免疫応答の開始、増強および／または維持と関連している使用法。
疾患または病状の治療または予防のための医療薬剤の製造のためのシャペロニン10のアンタゴニストの使用法であって、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が疾患または病状の確立および／または進行と関連している使用法。
対象またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器における1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整するための方法であって、シャペロニン10の有効量を投与する段階を含む方法であり、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合し、かつ活性化クラスターの形成が1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌の調整と関連している方法。
対象またはその少なくとも1つの細胞、組織もしくは臓器における1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌を調整するための方法であって、シャペロニン10のアンタゴニストの有効量を投与する段階を含む方法であり、アンタゴニストが、シャペロニン10が活性化クラスター内のToll様受容体と会合するのを妨げ、および／または活性化クラスターによるシグナル伝達を妨げ、かつ活性化クラスターの形成が1つまたは複数の免疫修飾物質の産生および／または分泌の調整と関連している方法。
免疫修飾物質が、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12またはI型インターフェロンを含む群から選択される、請求項35または請求項36記載の方法。
I型インターフェロンがIFNαまたはIFNβである、請求項37記載の方法。