SE468250B - Lymfocytstimulerande faktor fraan trypanosoma brucei - Google Patents

Description

46 10 15 20 25 30 35 250 2 tor härrör företrädesvis fràn haemoflagellaten Trzpanosoma brucei brucei.

Den lymfocytstimulerande faktor som tillhandahàlles genom föreliggande uppfinning utgöres av ett glykoprotein såsom bestämts genom proteolytisk och glykolytisk behand- ling som upphäver dess lymfocytstimulerande aktivitet.

Faktorn kan ha en molekylvikt av cirka 30 kD eller en mo- lekylvikt som är en heltalsmultipel av cirka 30 kD.

I enlighet med den utföringsform av lymfocytstimule- rande faktorn enligt uppfinningen är molekylvikten cirka 180 kD 1 20 kD.

Den trypanosomahärledda lymfocytstimulerande faktorn definieras ytterligare av dess bindning och verkan på lymfocytmembranets ytmolekyl - CD8 -, såsom kan faststäl- las genom selektiv blockering av dess aktivitet med anti- -CD8-antikroppar eller löslig CD8.

Den lymfocytstimulerande faktorn enligt föreliggande uppfinning är lämplig för användning som ett vaccin mot afrikansk sömnsjuka.

Enligt en annan sida av uppfinningen kan den ovan de- finierade lymfocytstimulerande faktorn användas vid fram- ställning av ett antiserum användbart för att bekämpa af- rikansk sömnsjuka.

Föreliggande uppfinning innefattar även ett förfaran- de för behandling av afrikansk sömnsjuka, och detta förfa- rande innefattar administration pà ett däggdjur i behov av .sådan behandling av en effektiv mängd av en antikropp mot nämnda lymfocytstimulerande faktor, vilken antikropp in- teragerar med nämnda faktor som frigjorts från parasiten och medför nämnda sjukdom.

Slutligen avses enligt uppfinningen enligt en annan sida av densamma ett förfarande för vaccination av ett däggdjur mot afrikansk sömnsjuka, varvid vaccinationen in- nefattar administrering pà däggdjuret av en immunologiskt aktiv mängd av den lymfocytstimulerande faktorn enligt uppfinningen. 10 15 20 25 30 35 Ja.

CN CO hä LH CD 3 Det faktum att den lymfocytstimulerande faktorn i enlighet med föreliggande uppfinning är en specifik en- hetlig substans som utövar sin verkan har experimentellt visats genom användning av en antikropp riktad mot nämnda faktor. En monoklonal antikropp riktad mot faktorn enligt uppfinningen inhiberar sålunda induktion av IFN-3-sekre- tion förorsakad av levande trypanosomer eller av samtliga av de tre toppaktivitetsfraktioner som erhålles genom gel- filtrering av avdödade parasiter, och detta är en klar in- dikation på att sådan induktion av lymfocytproducerad IFN-X genom trypanosomer beror på inverkan av en enda mo- lekyl och ej en komplex interaktion in vitro mellan para- siterna och de mononukleära cellerna.

Enligt ännu en sida av uppfinningen åstadkommes följ- aktligen en monoklonal antikropp riktad mot en lymfocyt- stimulerande faktor såsom definierats ovan.

Den lymfocytstimulerande faktorn enligt föreliggande uppfinning kan sålunda användas vid behandlingen av afri- kansk sömnsjuka, endera som ett terapeutiskt medel eller som ett medel för vaccination mot nämnda störning. Effek- tiva kvantiteter av nämnda faktor kan administreras på en levande djurkropp innefattande människor på vilket som helst sätt, exempelvis oralt, såsom i kapslar eller ta- bletter, parenteralt i form av sterila lösningar, suspen- sioner eller genom pelletimplantation, och i vissa fall intravenöst i form av sterila lösningar. Andra administra- tionssätt är kutant, subkutant, buckalt, intramuskulärt och intraperitonealt.

Farmaceutiska beredningar framställes vanligen från en förutbestämd kvantitet av den lymfocytstimulerande fak- torn enligt uppfinningen, företrädesvis i fast form. Så- dana formuleringar kan ta formen av pulver, elixir, lös- ningar, piller, kapslar, pellets eller tabletter, med el- ler utan, men företrädesvis med någon av en mångfald far- maceutiskt acceptabla vehiklar eller bärare. I blandning med en farmaceutisk vehikel eller bärare utgör den aktiva beståndsdelen, den lymfocytstimulerande faktorn enligt 10 15 20 25 30 35 468 250 4 uppfinningen, vanligen från cirka 0,01 till cirka 75%, normalt från cirka 0,05 till cirka 15 viktprocent av kom- positionen. Bärare, såsom stärkelse, socker, talk, vanli- gen använda syntetiska och naturliga gummin, vatten och liknande kan användas vid sådana beredningar. Bindemedel, såsom gelatin, och smörjmedel, såsom natriumstearat, kan användas till bildning av tabletter. Desintegreringsmedel, såsom natriumvätekarbonat, kan även innefattas i tablet- terna.

Vid dess användning för vaccination tillhandahållas faktorn enligt uppfinningen lämpligen i form av en steril lösning avsedd för injektion, såsom intramuskulär injek- tion.

Med avseende på den mängd aktiv beståndsdel som ad- ministreras på patienten i behov av behandling är det en- dast nödvändigt att den aktiva beståndsdelen utgör en effektiv mängd, dvs. en sådan att lämplig effektiv dos er- hålles som är förenlig med den använda dosformen. Uppen- barligen kan flera enhetsdosformer administreras vid unge- fär samma tidrymd. Den exakta individuella dosen även som den dagliga dosen i ett speciellt fall bestämmes natur- ligtvis i enlighet med väl etablerade medicinska princi- per.

Uppfinningen kommer nu att ytterligare illustreras genom följande exempel, vilka emellertid ej får betraktas såsom inskränkande. Denna illustration genom exempel göres _i anslutning till bilagda ritningar, vari Fig. l visar ett diagram över antalet IFN-X-sekrete- rande celler detekterade som immunofläckar efter expone- ring av lymfnod- eller mjältmononukleära celler (MNC) för olika antal av trypanosomer; Fig. 2 visar antalet IFN-X-sekreterande celler de- tekterade som immunofläckar bland humana perifera blod-MNC efter exponering för trypanosomer; Fig. 3 är ett diagram som visar lymfnodceller eller splenocyt-MNC inducerade genom trypanosomer till IFN-X- -sekretion; 10 15 20 25 30 35 468 250 5 Fig. 4 visar ett diagram över antalet IFN-¶-sek- reterande celler efter exponering av splenocyt-MNC för fraktioner erhållna efter gelfiltrering av sönderdelade trypanosomer; Fig. 5 visar ett diagram över inhibiton av IFN-X- -sekretion; Fig. 6 visar inhibition av mjält-MNC-understödd tillväxt; Fig. 7 visar selektiv blockering av trypanosom-' inducerad IFN-X-produktion; och Fig. 8 visar en blockering av trypanosominducerad IFN-X-produktion.

EXEMPEL 1 Musmonoklonalen anti-rått-IFN-X (DB1) och en kanin- -anti-rått-IFN-X-beredning användes (Van der Meide, P.H., M. Dubbeld, K. Vijverberg, T. Kos and H. Schellekens. 1986. The purification of rat gamma interferon by use of two monoclonal antibodies. J.Gen.Virol. 67:l059). DB1 re- nades pà protein A Sepharose-kolonner från askitesfluid.

Anti-rått-CD8 (OX8) (Brideau, R.J., P.B. Carter, W.R.

McMaster, D.W. Mason and A.F. Williams. 1980. Two subsets of rat T lymphocytes defined with monoclonal antibodies.

Eur.J.Immunol. lO:609) renades pà liknande sätt (Holmdahl, R., T. Olsson, T. Moran och L. Klareskog. 1985. In vivo treatment of rats with monoclonal anti-T-cell antibodies.

Immunohistochemical and functional analysis in normal rats and experimental allergic neuritis. Scand.J.Immunol. 22:l57) från odlingssupernatanter av OX8-hybridom ur- sprungligen erhållna frán Dr. Alan Williams (Oxford, Stor- britannien). En musmonoklonal anti-human-IFN-X (7-B6-1) (Andersson, G., H.-P. Ekre, G. Alm and P. Perlmann. 1989.

Monoclonal antibody two-site ELISA for human IFN-3.

Adaption for determinations in human serum or plasma.

J.Immunol.Methods l25:89) utgjordes av en gåva fràn Gudrun Andersson (Research and Development Immunobiology, KABI, Biopharma, Stockholm, Sverige). Kaninpolyklonal anti-human .Lä Ü\ 10 15 20 25 30 35 CO [O (Il 2 6 IFN-X inköptes från Interferon Sciences (New Brunnswick, New York, US). Rekombinant rått-IFN-3 framställdes och titrerades såsom tidigare beskrivits (Van der Meide, P.H., M. Dubbeld, K. Vijverberg, T. Kos och H. Schellekens. 1986. The purification of rat gamma interferon by use of two monoclonal antibodies. J.Gen.Virol. 67:l059). Rekombi- nant human IFN-X inköptes frán Genzyme (Boston, M.A., US).

Biotinylerad anti-kanin-IgG, ràttserum-absorberad biotio- nylerad anti-mus IgG (Vector Lab., Burlingame, US) och avidin-biotin-peroxidaskomplex (Vectastain ABC-Elite Kit, Vector Lab.) användes.

Mononukleära cellsuspensioner ' Enkla cellsuspensioner fràn superficiella cervikala lymfnoder av normala Sprague-Dawley-råttor (150-200 g, ALAB, Sollentuna, Sverige) erhölls genom malning genom ett tràdnät. Mjältar maldes på samma sätt och erytrocyter eli- minerades genom osmotisk lys. Cellerna suspenderades i Iscove's modifikation av Dulbeccos's medium (Flow, Irvine, UK) supplementerad med 2 mM glutamin (Flow), 50 IU peni- cillin (Astra, Södertälje, Sverige), 60 pg/ml streptomycin (Flow), 1% (vol/vol) minimum essential medium (Flow) och 5% (vol/vol) fetalt kalvserum (FCS; Gibco, Paisley, UK).

Humana perifera blodmononukleära blodceller fràn fyra friska laboratorieanställda bereddes på Ficoll Hypaque (Lymphoprep, Nygaard, Oslo, Norge). Cellsuspensionerna _tvättades tre gånger i medium àtföljt av räkning av MNC i närvaro av trypanblått. Procenttalet celler exkluderande trypanblàtt översteg i allmänhet 90%. Koncentrationen av MNC i suspensionerna justerades sedan till 5 och 10 x 106/ml.

Framställningfav fraktionering av T.b. brucei En variabel typ An Tat l/1 härledd fràn stabilat EATRO 1125 av T.b. brucei (erhållen från Dr. Nestor van Meirvenne, Laboratory of Serology, Institute of Tropical Medicine Prins Leopold, Antwerp, Belgien) bringades pas- 10 15 20 25 30 35 468 250 7 sera en gäng i Sprague-Dawley-råttor före användning. Blod från infekterade djur uppsamlades genom hjärtpunktering och blandades med fosfatbuffert innehållande 1% blukos och EDTA. För att rena trypanosomerna från blodet användes den metod som beskrives av Lanham and Godfray (Lanham, S.M., and D.G. Godfrey. 1970. Isolation of salivarian trypanso- mes from man and other animals using DEAE-cellulose.

Exp.Parasitol, 285521), men kromatografi utfördes pá för- svälld DEAE-Sepharose Fast Flow jonbytare (Pharmacia, Upp- sala, Sverige). Detta resulterade i en ren population av mobila parasiter utan kontaminerande MNC. I vissa experi- ment användes parasiter som sönderdelats genom frysning och upptining.

För att erhålla en bas för framtida reningsförsök och för att i stort karakterisera komponenterna av T.b. brucei som inducerar MNC till IFN-X-sekretion utfördes fraktione- ringsexperiment. Vid fyra olika tillfällen utfördes dessa pá följande sätt: de renade parasiterna (45 x 106) soni- kerades på is i 1 minut (output 5; 40% duty cycle; cell- disruptor B15, Bronson-sonifikator). Parasitmembran pel- letiserades genom ultra-centrifugering i 3 timmar vid 105 000 g (under användning av en 50 Tirotor i en Beckman L8-55 ultra-centrifug (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, California, USA)). Pelleten upplöstes sedan i 50 mM PBS, pH 8,0. Pelleten upplöstes i fosfatbuffrad koksalt- lösning (PBS: 50 mM, pH 8,0), underkastades sedan gelfilt- rering på Sephacryl S-200 superfine (Pharmacia Fine Chemicals) på en 48 x 1,5 cm kolonn, bringades i jämvikt med 10 mM Tris-CHl, pH 7,5, vid en flödeshastighet av 5,64 ml/timme. 120 fraktioner om 1,13 ml vardera uppsamlades.

Molekylvikt bestämdes genom jämförelse med proteiner med fastställd molvikt (catalase, bovint serumalbumin, hemo- globin, ovalbumin, cytokrom c). Parasitfraktionerna lyo- filiserades sedan och hölls vid -70°C. Omedelbart före an- vändningen upplöstes det lyofiliserade pulvret i 50 pl sterilt vatten, varav 10 ul applicerades i varje mikro- titerplatta väl med MNC.

Jä. 10 15 20 25 30 35 C\ 03 BJ cm EXEMPEL 2 Assay med avseende pà interferon-3-sekreterande celler Principerna för immunospotuppräkning av enkla sek- retoriska celler under utnyttjande av nitrocellulosa- bottnade mikrotiterplattor med 96 brunnar (Millititre- -HAM, Millipore Co., Bedford, US) följdes (Czerkinsky, C., G. Andersson, H.-P. Ekre, L.-A. Nilsson, L. Klareskog och Ö. Ouchterlony. Reverse ELI-SPOT assay for clonal analysis of cytokine production. 1988. I. Enumeration of gamma- -interferonsecreting cells. J.Immunol.Methods 1l0:29; Kabilan L., G. Andersson, F. Lolli, H.-P. Ekre, T. Olsson och M. Troye-Blomberg. 1990). Detection of intracellular expression and secretion of interferon-X at the single- cell level after activation of human T cells with tetanus toxoid in vitro. Eur.J.Immunol. 20:lO85). För detektering av ràtt-IFN-Z-SC överdrogs brunnarna med 100 ul alikvoter av DB1 vid 15 pg/ml vid 4°C över natten och tvättades med PBS, pH 7,4. Mikrotiterplattorna tömdes sedan genom sug- ning i en Millititre vaccumfiltreringshàllare (Millipore) och 100 ul alikvota mängder om 1% bovint serum albumin (BSA) i PBS tillsattes i 2 timmar. Plattorna tvättades sedan 10 gånger med PBS genom sugning i filtreringshål- laren. Alikvota mängder (100 pl) av cellsuspensioner tillsattes i triplikat till brunnarna vid tvâ olika kon- centrationer, 5 och 10 x 106 MNC per ml. Parasiter eller andra komponenter tillsattes vid koncentrationer som anges i figurbeskrivningarna. Efter 24 timmar odling vid 37°C och 7% C02 i fuktig atmosfär tömdes plattorna och tvätta- des flera gånger med PBS. Alikvota mängder (100 ul) av den polyklonala kanin-anti-rått IFN-3-antikroppen utspädd 1/5 000 tillsattes i 2 timmar. Efter tvättning tillsattes biotinylerad anti-kanin-IgG utspädd 1/1 000 under ytter- ligare 2 timmar àtföljt av avidin-biotinperoxidaskomplexet utspätt till 1/200 i 1 timme. Efter peroxidasfärgning (Kaplow, L.S. 1974. Substitute for benzidine in myelo- peroxidase stains. Am.J.clin.Pathol. 63:45l), räknades 10 15 20 25 30 35 463 250 9 fläckar som motsvarade celler som sekreterat IFN-X i ett dissektionsmikroskop. I specificitetskontrollexperiment, där ifrågavarande antikropp ersatts med en irrelevant monoklonal musantikropp eller där den polyklonala kanin- antikroppen uteslutits uppträdde inga fläckar. För detek- tering av humant IFN-X-SC överdrogs plattorna med 7-B6-1, 6 ug/ml, och en polyklonal kanin-anti-human IFN-X utspädd 1/500 användes. Variationen i antal fläckar inom tripli- katen var alltid mindre än 10%. Medelvärdet av triplikaten beräknades och uttrycktes som antalet IFN-X-SC per 106 MNC.

Depletion av CD8+-lymfocyter För att erhålla rått-MNC fri från CD8+-celler inji- cerades råttor i.p. med 1 mg OX8. 24 timmar senare pre- parerades mjält- och lymfnod-MNC. Såsom tidigare beskri- vits ((Ho1mdah1, R., T. Olsson, T. Moran och L. Klareskog. 1985. In vivo treatment of rats with monoclonal anti-T- -cell antibodies. Immunohistochemical and functional analysis in normal rats and experimental allergic neuritis. Scand.J.Immunol. 22:l57) resulterar denna be- handling i total depletion av CD8+-celler inom 30 minuter varande i I4 dagar. I samtliga råttor behandlade på detta sätt kontrollerades CD8+-depletionen immunohistokemiskt i snitt från mjälten såsom tidigare beskrivits (Bakhiet, M., T. Olsson, P. Van der Meide och K. Kristensson, 1990.

Depletion of CD8+ cells suppresses growth of Trypanosoma brucei brucei and interferon-gamma (IFN-3) production in infected rats. Clin.exp.Immunol. 81:l95).

EXEMPEL 3 Effekt av trypanosomer på MNC-IFN-X-sekretion Omedelbart efter utstrykning av mjält- och lymfosyt- -MNC från CD8+-depleterade och icke depleterade råttor sattes renade levande 10 pl alikvota mängder av trypano- somer till triplikata brunnar för att uppnå slutantal om 10, 102 och 103 parasiter per brunn. Andra brunnar expone- JS. 10 15 20 25 30 35 O\ OD BD Uñ CD 10 rades för frysta och upptinade trypanosomer (104 per brunn) eller trypanosomfraktioner beredda sàsom beskrivits ovan. I varje experiment bestod negativa kontroller av triplikata brunnar icke mottagande parasiter, under det att positiva kontroller bestod av triplikater mottagande optimalt utspätt fytohemagglutinin (PHA, Difco, Detroit, Mi., US).

Effekt av trypanosomer på MNC-proliferation I dessa experiment odlades MNC från lymfnoder och mjältar vid en cellkoncentration av 2 x 106 per ml medium genom applicering av 200 pl alikvota delar i rundbottnade polystyrenmikrotiterplattor med 96 brunnar (Nunclon, Nunc, Danmark). Triplikat av brunnar erhöll 0, 10, 102, 103 och 104 parasiter. PHA inkluderades som positiv kontroll. 16 timmar före skörd mottog varje brunn 10 ul alikvota mäng- der innehållande 1 pCi av H3-märkt tymidin (Amersham, Little Shalfont, UK) i koksaltlösning. I vissa experiment tillsattes DB1 (20 pg/ml) till parallella brunnar för att inhibera IFN-X producerat in vitro. Totala odlingstider innefattade 24, 48 och 72 timmar i 37°C i fuktig atmosfär och 7% C02. ' Celler skördades i glasfiberfilterremsor (Skaltron AS., Lierbyen, Norge) med en flerkanals halvautomatiserad skördeanordning (Titertec Skaltron AS) åtföljt av upprepa- de tvättningar i destillerat vatten. Införlivad radioakti- _vitet räknades i en scintillationsräknare (Marck II, Searle, Analytic, Des Plaines, USA). Medelinpulser per minut (cpm) och standarddeviation av H3-tymidininförliv- ningar beräknades fràn triplikaten.

Effekt av MNC och IFN-X pà trypanosomtillväxt MNC odlades i rundbottnade mikrotiterplattor med 96 brunnar (Nunclon) vid en celldensitet av 5 x 106/ml od- lingsmedium. Både humana och perifera blod-MNC och rått- mjält- och lymfnod-MNC från CD8+-depleterade och odeple- terade djur användes. Renade parasiter tillsattes trip- 'n 10 15 20 25 30 .35 4653 250 ll likata brunnar för uppnående av en ursprunglig densitet om 10 x 106 trypanosomer/ml odlingsmedium. I vissa experiment eeftee nB-l (10 pg/mi), 7-36-1 (10 pg/ml) eller peiyklenel antirátt-IFN-X (slutlig utspädning 1/5 000) till brunnar- na. I andra experiment mottog brunnar innehållande endast trypanosomer olika mängder rått eller humant rekombinant IFN-3. I parallella brunnar odlades trypanosomer i enbart medium. Parasitbestämningarna vid olika provtagningsinter- valler utfördes på följande sätt: innehållet i varje brunn blandades noggrant 10 gånger med en 100 pl mikropipett. l0 pl av fluidet sattes till 90 ul av en Trypanblått-lösning åtföljt av noggrann blandning. Burker--kamrar användes för att räkna antalet mobila parasiter som exkluderade Trypan- blått vid en x200 förstoring. Densiteten av "levande" pa- rasiter per ml medium närvarande i brunnen beräknades.

För varje typ av in vitro-manipulation utfördes ex- perimenten vid 3 till 6 olika tillfällen bortsett ifrån att en typ med tillsats av humant IFN-X utfördes en gång.

Vid varje tillfälle användes tre brunnar för varje prov- tagningsintervall, dvs. 2, 4, 8, 12 och 24 timmar efter initiering av odlingen, för att räkna antalet parasiter.

Totalt innehåller sålunda varje provtagningsintervall data från 12 till 18 räkningar. Medel- och standardfel av medel (SEM) beräknades. Mann-Whitney's test användes för att beräkna signifikansnivån.

Effekter av MNC och trypanosomfrigjorda faktorer i ett tvàkammarsystem För att studera om eventuell signalering mellan trypanosomer och MNC innebär endera direkt kontakt eller diffunderbara molekyler användes ett tvàkammarsystem. Od- lingsplattor (24 brunnar; Transwell, Laboratorie Design_ AB, Lidingö, Sverige) användes, vari lymfnod- eller mjält- -MNC applicerades i den undre brunnen och trypanosomer i den övre brunnen. Porstorleken för det membran som begrän- sar utbytet mellan de två kamrarna var 0,4 pm. I studier av trypanosomeffekter på MNC applicerades 6 x 104 MNC- .få O\ OD 10 15 20 25 30 35 250 12 -parasiter i 100 ul medium i den övre brunnen. 6 x 106 MNC i 600 ul medium applicerades i den undre brunnen. Efter 24 timmars odling tvättades MNC en gånger i mediet, cellerna utspäddes ånyo och 100 pl alikvota mängder, vardera inne- hållande 106 MNC, applicerades i brunnar av nitrocellu- losabottnade mikrotiterplattor, odlades under ytterligare 24 timmarsperiod för detektering av IFN-X-SC såsom beskri- vits ovan. I separata experiment på effekten av MNC på trypanosomtillväxt applicerades 106 parasiter i 100 pl medium i den övre brunnen, under det att den undre mottog 6 x 106 MNC i 600 ul medium. Parasiterna räknades såsom beskrivits ovan i triplikat vid 2, 4, 8, 12 och 24 timmar efter initiering av odlingarna. Medeltal, SEM och stati- stik beräknades såsom beskrivits ovan.

EXEMPEL 4 Studium av IFN-X-upptagning av trypanosomer För att studera huruvida T.b. brucei redan i den infekterade värden tagit upp IFN-X underkastades renade parasiter a) histokemisk färgning för detektion av rått- -IFN-X, b) Western blot för att detektera ungefärlig mo- lekylvikt för färgat material. ' a) Renade trypanosomer lufttorkades på glasplattor åtföljt av fixering i 30 sekunder i 4% buffrat formalin och efter tvättning i PBS 30 sekunder i iskyld aceton.

Därefter tvättades glasplattorna i PBS, inkuberades med 2% normalt hästserum i 30 minuter. Plattorna inkuberades sedan med 5 pg/ml DB1 vid 4°C över natten. Efter tvättning applicerades i tur och ordning lämpliga utspädningar av biotinylerad häst-anti-mus-IgG (Vector lab.) utspädd i 2% normalt råttserum och ABC, åtföljt av peroxidasfärgning (Kaplow, L.S. 1974. Substitute for benzidine in myeloperoxidase stains. Am.J.clin.Pathol. 63:45l). Som ne- gativa kontroller användes en serie av irrelevant isotyp- matchade monoklonala musantikroppar.

G7 '15 10 15 20 25 30 35 -Yta C7\ OO PO (fl (D 13 b) Hela renade och i övrigt obehandlade trypanosomer separerades genom natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel- elektrofores (SDS PAGE) och transfererades genom elektro- blotting till nitrocellulosamembran (Laemmli, U.K. 1971.

Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriphage T4. Nature 227:680; Towbin, H., T.

Stachelin and J. Gordon. l979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and same applications.

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76:4350). Cirka 106 trypanosomer sattes till vardera tràget i gelen. Elektroblotting pà nitrocellulosamembran utfördes i transblotcellutrustning (BioRad, CA, USA) vid en konstant ström om 0,1 Amp i 16 timmar vid 4°C. Proceduren innebär att parasiterna lyse- ras, deras beståndsdelar separerats enligt molvikt och de blottas över på nitrocellulosa. Nitrocellulosamembranen var blockerade i mjölk med låg fetthalt för att undvika icke specifik bindning av antikroppar. Membranet inkube- rades sedan över natten vid rumstemperatur med DBl i en koncentration av 5 pg/ml för detektering av eventuellt se- parerat IFN-X. Efter flera tvättningar i buffert inkube- rades membranen i en 1/500 utspädning av ett högaffini- tetsrenat get-anti-mus-IgG och underkastades sedan ABC och peroxidasfärgning enligt Kaplow (Kaplow, L.S. 1974. Sub- stitute for benzidine in myeloperoxidase stains.

Am.J.clin.Pathol. 63:45l).

Beräkningar och statistik I varje experiment användes om ej annat anges triplikat. Samtliga experiment upprepades 3-8 gånger och Wilcoxon's rank sum test eller Mann Whitney's test an- vändes för att beräkna signifikansnivàn.

JE. 10 15 20 25 30 35 G\ OD FJ CF 14 EXEMPEL 5 Trypanosominducerad stimulering av CD8+-lymfocyt-IFN-X- -sekretion och proliferation in vitro Såsom framgår av Fig. 1 medförde samodling av lymf- nod- eller mjält-MNC med trypanosomer 24 timmar en uttalad förhöjning av antalet IFN-X-SC. Även trypanosomer avdödade genom frysning och upptining inducerade IFN-X-sekretion, ehuru mindre effektivt. Exempelvis 104 frusna trypanosomer inducerade svar av liknande storleksordning som 102 levan- de trypanosomer. Så få som 10 levande trypanosomer per brunn kunde pà ett överraskande sätt inducera ett signifi- kant svar. Trypanosominducerad IFN-X-produktion eliminera- des fullständigt när CD8+-depleterade MNC-suspensioner an- vändes. Maximala antalet detekterbara IFN-X-SC var cirka 200 per 106 MNC, dvs. 1 av 5000 MNC. Såsom förväntats re- sulterade PHA-stimulering av parallella brunnar i ett ungefär likadant antal IFN-X-SC. MNC från humant perifert blod aktiverades av trypanosomer till sekretion av IFN-X (Fig. 2).

Mätningar av proliferativa svar under användning av 3H-tymidininförlivning avslöjade såsom förväntat att PHA inducerade kraftig proliferation efter 24, 48 resp. 72 timmar. När trypanosomer inom intervallet 10 till 104 pa- rasiter/brunn tillsattes uppträdde ett svagt proliferativt svar vid 24 timmar jämfört med kontrollbrunnarna. Vid 48 timmar var svaret jämfört med kontrollerna lika stort. Vid _72 timmar inducerade emellertid 10 och 102 parasiter enty- digt MNC-proliferation, under det att 103 ter ej medförde inducering. och 104 parasi- Den IFN-X-inducerande faktorn frigöres från trypanosomer Användningen av tvàkammarsystemet som fysiskt sepa- rerade trypanosomerna från MNC visade att jämförbara antal av IFN-X-SC inducerades i denna situation såsom med trypa- nosomer direkt samodlade med MNC. Sàsom_illustreras i Fig. 3 användes ett tvåkammarsystem i detta fall fysiskt av- skiljande T.b. och MNC men tillåtande utbyte av lösliga 10 15 20 25 30 35 .få CH CO FO (TI CD 15 mediatorer. Bindningarna anger att den trypanosomhärledda lymfocytaktiverande faktorn frigöres och även verkar på avstånd. Detta rön visar att parasiterna frigör en löslig mediator som inducerar MNC till IFN-X-sekretion.

CD8+ MNC-sekretion av en löslig faktor medför artbegränsad trypanosomtillväxt Ett reciprokt förhållande mellan trypanosomer och värdhärledda celler var uppenbart när kinetiken analyse- rades genom räkning av antalet parasiter i tvåkammarsyste- met med och utan MNC i den undre kammaren. Sålunda förelåg en tidig ökning i antalet parasiter i den övre kammaren när den undre kammaren tillförts mjält-MNC, medan de lång- samt avtog i antal vid exponering för enbart medium (Tabell I). Det var intressant att notera att denna till- växtstimulering eliminerades när CD8+-depletade MNC an- vändes (Tabell II).

IFN-X härmar den MNC-härledda trypanosomtillväxtbefräm- jande faktorn Denna fråga bestämdes genom in vitro-experiment med antikroppstillväxtinhibering och genom direkt cytokin- applicering. Av Tabell II är det uppenbart, att DBl och polyklonalt kanin-anti-rått-IFN-X-antiserum fullständigt blockerar tillväxtbefrämjandet av rått-MNC, under det att det monoklonala mus-anti-human-IFN-X var ineffektivt (inga data visade). Applicering av rekombinant rått-IFN-X på kulturer med renade parasiter resulterade i en slående dos beroende tillväxtstimulering (Tabell II).

Ytterligare beträffande detaljer i Fig. 4 till 8 Såsom angivits tidigare visar Fig. 4 ett diagram över antalet IFN-X-sekreterande celler efter exponering av splenocyt-MNC för fraktioner erhållna efter gelfiltrering av sönderdelade trypanosomer. Vid diagrammet var dessa tre toppaktiviteter approximativa molekylvikter om 185, 70 och 30 kD, och dessa aktiviteter motsvarar fraktionerna 23, 46 4ss_2so 10 15 20 25 30 35 16 och 79 som återges i diagrammet i Fig. 5. Såsom även tidi- gare angivits visar Fig. 5 ett diagram över inhibitionen av IFN-X-sekretion inducerad genom nämnda fraktioner under användning av en monoklonal antikropp mot den lymfocyt- stimulerande faktorn, i följande Exempel 6 godtyckligt be- tecknad Moiz I.

Fig. 6 illustrerar inhibitionen av mjält-MNC-stödd tillväxt av T.b. brucei in vitro genom blockering av den trypanosomfrigjorda lymfocytstimulerande faktorn med Moiz I.

Vidare visar Fig. 7 selektiv blockering av trypano- sominducerad IFN-X-produktion under användning av en mono- klonal mus-anti-CD8-antikropp, betecknad OX8. Andra anti- kroppar är ineffektiva, och detta rön anger att CD8-mole- kylen är màlet för den trypanosomlymfocytaktiverande fak- torn.

Slutligen visar Fig. 8 blockering av trypanosom- inducerad IFN-X-produktion under användning av stigande doser av lösliga CD8-molekyler satta till kulturerna.

Detta rön som illustreras i Fig. 8 anger att den trypa- nosomfrigjorda molekylen binder till CD8 och att under dessa betingelser lymfocyter ej aktiveras.

EXEMPEL 6 Principiell beskrivning av anti-TLTF-antikroppen, Moiz I Fraktionen med TLTF-toppaktivitet (F23 i Fig. 5) an- _ vändes för immunisering av möss. Nio dagar senare användes regionala lymfnodceller för produktion av hybridom enligt standardteknik. Resulterande 40 hybridom testades med av- seende pà sin förmåga att inhibera trypanosominducerad produktion av mononukleära IFN-X-celler i ovan beskrivet assay-system. Av 40 hybridom uppvisade 4 av desamma sådan inhiberande aktivitet. Hybridomet med starkaste aktivi- teten selekterades och expanderades. Antikroppen kallades godtyckligt Moiz I. Isotypen av antikroppen befanns vara gamma 2B. Den har sedan renats på protein A och analyse- rats vidare. Antikroppen inhiberar TLTF in vitro vid en 'x 10 15 20 25 30 35 .Ia CR CD PO (11 CD 17 koncentration ned till 0,1 pg/ml. Den inhiberar ej induk- tion till IFN-X-produktion på annat sätt, såsom PHA-indu- cerad IFN-3-produktion. Antikroppen verkar sålunda vid låg koncentration och specifikt pà trypanosominducerad IFN-3- -induktion. Det visar vidare att IFN-X-induktion genom trypanosomer beror pà inverkan av en enkel molekyl och ej en komplex interaktion in vitro mellan parasiter och mono- nukleära celler.

Vid användning av Moiz I för immunohistokemisk färg- ning av parasiter färgas trypanosomer specifikt genom mo- lekylen men ej av en serie kontrollantikroppar.

TABELL I Tid efter initiering av odling (h) 2 4 12 24 Experimen- 0 m 11,3 5,5 3,3 0,4 tell proce- SEM 0,3 0,2 0,2 0,1 dur n 12 12 12 12 MNC m 18,6 15,5 6,5 2,6 SEM 2,1 0,5 0,4 0,6 n 12 12 12 12 p 0,001 0,09 0,001 0,005 JE 10 15 20 25 30 35 68 250 18 TABELL II Tid efter initiering av odling (h) Experimentell procedur 2 4 8 12 24 0 m 10,8 11,8 4,8 3,1 0,7 SEM 0,8 0,9 0,28 0,2 0,05 n 18 18 18 18 18 'MNc M 29,3 17 9,7 6,9 1,4 SEM 2 0,4 1,1 0,3 0,17 n 18 18 18 18 18 p 0,001 0,002 0,001 0,003 0,01 cna*- m 11,1 11,1 3,3 2,1 0,5 -deple- SEM 1,1 0,8 0,2 0,2 0,2 terad n 18 18 18 18 18 MNC p jämförd n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. med 0 p jämförd 0,001 0,002 0,003 0,002 0,002 med 106 MNC _DBl + m 5,6 6,4 5,6 2 0,2 MNC SEM 0,2 0,2 0,15 0,1 0,01 n 12 12 12 12 12 p jämförd n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. med 0 p jämförd 0,001 0,002 0,003 0,002 0,002 med 106 MNC forts. 10 15 20 25 30 35 468 250 19 forts.

Tid efter initiering av odling (h) Experimentell procedur 2 4 8 12 24 Kanin- m 8,8 7,2 8 1,6 -anti- SEM 0,3 0,2 0,2 0,1 _ -rått n 12 12 12 12 12 + MC p jämförd n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

IFN-X med 0 p jämförd 0,002 0,001 0,03 0,001 0,03 med 106 MNC Human m 3 2,3 2,9 1,2 1 MNC SEM 0,28 1,37 1,7 0,7 0,6 n 12 12 12 12 12 p 0,001 0,001 0,008 0,003 0,12 20000 U m 2,1 26 13 8 4,8 rått SEM _ 2,1 4,2 1,1 0,7 0,5 IFN-X n 12 12 12 12 12 p 0,001 0,001 0,001 0,001 0,2 2ooo U m 14 18 11,8 6,4 3 rått SEM 1,1 3,1 0,8 0,6 0,2 IFN-X n 12 12 12 12 12 p 0,08 0,001 0,003 0,001 0,008 200 U m 11,2 12 5 3,8 1,8 rått SEM 0,8 0,6 0,2 0,1 0,1 IFN-z' n 12 12 121 -12 12 1 p 0,06 0,001 0,01 0,08 0,13 forts. 468 250 10 15 20 25 30 35 ' brunn mottog 100 pl. I den undre brunnen tillsattes 6x10 20 forts.

Tid efter initiering av odling (h) Experimentell procedur 2 4 8 12 24 20000 U m 5,6 8 9,6 2,4 2,2 human SEM 0,1 0,1 0,2 0,1 0,07 IFN-X n 3 3 3 3 3 p n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2000 U m 5,6 8 7,2 3,2 1,2 human SEM 0,1 0,1 0,1 0,17 0,05 IFN-X n 3 3 3 3 3 p n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

FÖRKLARING TILL TABELLERNA Tabell I. applicerade i den övre brunnen av tvàkammarsystem under Tillväxtkarakteristika för renade trypanosomer separation av desamma från mononukleära råttceller appli- cerade i den undre brunnen. Parasiterna applicerades vid en ursprunglig densitet av l0xl06/ml medium och varje 6 rått-MNC i 600 pl medium (MNC), kontrollkulturer mottog enbart medium (0). Data avser antalet trypanosomer x 106/ml. m = medelvärden, SEM = standardfel i medelvär- de, n = antalet analyserade kulturer, p = signifikansnivà.

Tabell II. Tillväxtkarakteristika av renade trypanosomer underkastade olika experimentella procedurer. Parasiterna applicerades vid en ursprunglig densitet av l0x106/ml me- dium i 100 pl alikvota mängder. Data avser antalet parasi- ter x 106/ml. Procedurerna var följande: medium enbart x) f; 1D 10 15 20 25 30 35 468 259 21 (0), samodling med 106 rått-MNC (MNC), samodling med CD8+- -depleterad rått-MNC (CD8+-depleterad MNC), samodlad med lo6 ratt-Mnc aan zo pg/ml mal tillsatt (nan-Mus), samodlad med 106 ràtt-MNC och 20 ug/ml tillsatt nBl (DBl+MNc), sam- odling med rått-MNC och polyklonal kanin-anti-rått-IFN-X tillsatt (rabbit anti-rat IFN-3 + MNC), samodling med hu- man MNC (human MNC), olika kvantiteter rekombinant rått- medelvärden, SEM = standardfel i medelvärde, n = antalet analyserade kulturer, p = signifi- eller human-IFN-3. m = kansnivá i jämförelse med kulturer med enbart medium, om ej annat anges, n.s. = ej signifikant, n.d. = ej betämd.

Claims (7)

Jb. 10 15 20 25 30 35 O\ 03 I\'J (J'1 3 22 PATENTKRAV

1. Lymfocytstimulerande faktor, k ä n n e - t e c k n a d av ett protein härrörande från haemoflagellaten Trypanosoma brucei med förmåga att i en levande djurkropp stimulera CD8+-T-celler resulterande i frigöring av interferon-X (IFN-X), så att därigenom im- munosuppression uppstår i nämnda kropp.

2. Lymfocytstimulerande faktor enligt patentkravet 1 härrörande från haemoflagellaten Trypanosoma brucei brucei.

3. Lymfocytstimulerande faktor enligt patentkravet 1 eller 2 med en molekylvikt av cirka 30 kD eller en heltalsmultipel därav.

4. Lymfocytstimulerande faktor enligt patentkravet 3 med en molekylvikt av cirka 180 kD 1 20 kD.

5. Lymfocytstimulerande faktor enligt något av de föregående patentkraven för användning som ett vaccin mot afrikansk sömnsjuka.

6. Lymfocytstimulerande faktor enligt något av patentkraven l till 4 för användning vid framställning av ett antiserum användbart för att bekämpa afrikansk sömn- sjuka.

7. Monoklonal antikropp riktad mot den lymfocyt- stimulerande faktorn enligt något av patentkraven 1 till '40 f)