SE468250B - Lymfocytstimulerande faktor fraan trypanosoma brucei - Google Patents
Lymfocytstimulerande faktor fraan trypanosoma bruceiInfo
- Publication number
- SE468250B SE468250B SE9101086A SE9101086A SE468250B SE 468250 B SE468250 B SE 468250B SE 9101086 A SE9101086 A SE 9101086A SE 9101086 A SE9101086 A SE 9101086A SE 468250 B SE468250 B SE 468250B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- ifn
- mnc
- stimulating factor
- lymphocyte
- trypanosomes
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
46
10
15
20
25
30
35
250
2
tor härrör företrädesvis fràn haemoflagellaten Trzpanosoma
brucei brucei.
Den lymfocytstimulerande faktor som tillhandahàlles
genom föreliggande uppfinning utgöres av ett glykoprotein
såsom bestämts genom proteolytisk och glykolytisk behand-
ling som upphäver dess lymfocytstimulerande aktivitet.
Faktorn kan ha en molekylvikt av cirka 30 kD eller en mo-
lekylvikt som är en heltalsmultipel av cirka 30 kD.
I enlighet med den utföringsform av lymfocytstimule-
rande faktorn enligt uppfinningen är molekylvikten cirka
180 kD 1 20 kD.
Den trypanosomahärledda lymfocytstimulerande faktorn
definieras ytterligare av dess bindning och verkan på
lymfocytmembranets ytmolekyl - CD8 -, såsom kan faststäl-
las genom selektiv blockering av dess aktivitet med anti-
-CD8-antikroppar eller löslig CD8.
Den lymfocytstimulerande faktorn enligt föreliggande
uppfinning är lämplig för användning som ett vaccin mot
afrikansk sömnsjuka.
Enligt en annan sida av uppfinningen kan den ovan de-
finierade lymfocytstimulerande faktorn användas vid fram-
ställning av ett antiserum användbart för att bekämpa af-
rikansk sömnsjuka.
Föreliggande uppfinning innefattar även ett förfaran-
de för behandling av afrikansk sömnsjuka, och detta förfa-
rande innefattar administration pà ett däggdjur i behov av
.sådan behandling av en effektiv mängd av en antikropp mot
nämnda lymfocytstimulerande faktor, vilken antikropp in-
teragerar med nämnda faktor som frigjorts från parasiten
och medför nämnda sjukdom.
Slutligen avses enligt uppfinningen enligt en annan
sida av densamma ett förfarande för vaccination av ett
däggdjur mot afrikansk sömnsjuka, varvid vaccinationen in-
nefattar administrering pà däggdjuret av en immunologiskt
aktiv mängd av den lymfocytstimulerande faktorn enligt
uppfinningen.
10
15
20
25
30
35
Ja.
CN
CO
hä
LH
CD
3
Det faktum att den lymfocytstimulerande faktorn i
enlighet med föreliggande uppfinning är en specifik en-
hetlig substans som utövar sin verkan har experimentellt
visats genom användning av en antikropp riktad mot nämnda
faktor. En monoklonal antikropp riktad mot faktorn enligt
uppfinningen inhiberar sålunda induktion av IFN-3-sekre-
tion förorsakad av levande trypanosomer eller av samtliga
av de tre toppaktivitetsfraktioner som erhålles genom gel-
filtrering av avdödade parasiter, och detta är en klar in-
dikation på att sådan induktion av lymfocytproducerad
IFN-X genom trypanosomer beror på inverkan av en enda mo-
lekyl och ej en komplex interaktion in vitro mellan para-
siterna och de mononukleära cellerna.
Enligt ännu en sida av uppfinningen åstadkommes följ-
aktligen en monoklonal antikropp riktad mot en lymfocyt-
stimulerande faktor såsom definierats ovan.
Den lymfocytstimulerande faktorn enligt föreliggande
uppfinning kan sålunda användas vid behandlingen av afri-
kansk sömnsjuka, endera som ett terapeutiskt medel eller
som ett medel för vaccination mot nämnda störning. Effek-
tiva kvantiteter av nämnda faktor kan administreras på en
levande djurkropp innefattande människor på vilket som
helst sätt, exempelvis oralt, såsom i kapslar eller ta-
bletter, parenteralt i form av sterila lösningar, suspen-
sioner eller genom pelletimplantation, och i vissa fall
intravenöst i form av sterila lösningar. Andra administra-
tionssätt är kutant, subkutant, buckalt, intramuskulärt
och intraperitonealt.
Farmaceutiska beredningar framställes vanligen från
en förutbestämd kvantitet av den lymfocytstimulerande fak-
torn enligt uppfinningen, företrädesvis i fast form. Så-
dana formuleringar kan ta formen av pulver, elixir, lös-
ningar, piller, kapslar, pellets eller tabletter, med el-
ler utan, men företrädesvis med någon av en mångfald far-
maceutiskt acceptabla vehiklar eller bärare. I blandning
med en farmaceutisk vehikel eller bärare utgör den aktiva
beståndsdelen, den lymfocytstimulerande faktorn enligt
10
15
20
25
30
35
468 250
4
uppfinningen, vanligen från cirka 0,01 till cirka 75%,
normalt från cirka 0,05 till cirka 15 viktprocent av kom-
positionen. Bärare, såsom stärkelse, socker, talk, vanli-
gen använda syntetiska och naturliga gummin, vatten och
liknande kan användas vid sådana beredningar. Bindemedel,
såsom gelatin, och smörjmedel, såsom natriumstearat, kan
användas till bildning av tabletter. Desintegreringsmedel,
såsom natriumvätekarbonat, kan även innefattas i tablet-
terna.
Vid dess användning för vaccination tillhandahållas
faktorn enligt uppfinningen lämpligen i form av en steril
lösning avsedd för injektion, såsom intramuskulär injek-
tion.
Med avseende på den mängd aktiv beståndsdel som ad-
ministreras på patienten i behov av behandling är det en-
dast nödvändigt att den aktiva beståndsdelen utgör en
effektiv mängd, dvs. en sådan att lämplig effektiv dos er-
hålles som är förenlig med den använda dosformen. Uppen-
barligen kan flera enhetsdosformer administreras vid unge-
fär samma tidrymd. Den exakta individuella dosen även som
den dagliga dosen i ett speciellt fall bestämmes natur-
ligtvis i enlighet med väl etablerade medicinska princi-
per.
Uppfinningen kommer nu att ytterligare illustreras
genom följande exempel, vilka emellertid ej får betraktas
såsom inskränkande. Denna illustration genom exempel göres
_i anslutning till bilagda ritningar, vari
Fig. l visar ett diagram över antalet IFN-X-sekrete-
rande celler detekterade som immunofläckar efter expone-
ring av lymfnod- eller mjältmononukleära celler (MNC) för
olika antal av trypanosomer;
Fig. 2 visar antalet IFN-X-sekreterande celler de-
tekterade som immunofläckar bland humana perifera blod-MNC
efter exponering för trypanosomer;
Fig. 3 är ett diagram som visar lymfnodceller eller
splenocyt-MNC inducerade genom trypanosomer till IFN-X-
-sekretion;
10
15
20
25
30
35
468 250
5
Fig. 4 visar ett diagram över antalet IFN-¶-sek-
reterande celler efter exponering av splenocyt-MNC för
fraktioner erhållna efter gelfiltrering av sönderdelade
trypanosomer;
Fig. 5 visar ett diagram över inhibiton av IFN-X-
-sekretion;
Fig. 6 visar inhibition av mjält-MNC-understödd
tillväxt;
Fig. 7 visar selektiv blockering av trypanosom-'
inducerad IFN-X-produktion; och
Fig. 8 visar en blockering av trypanosominducerad
IFN-X-produktion.
EXEMPEL 1
Musmonoklonalen anti-rått-IFN-X (DB1) och en kanin-
-anti-rått-IFN-X-beredning användes (Van der Meide, P.H.,
M. Dubbeld, K. Vijverberg, T. Kos and H. Schellekens.
1986. The purification of rat gamma interferon by use of
two monoclonal antibodies. J.Gen.Virol. 67:l059). DB1 re-
nades pà protein A Sepharose-kolonner från askitesfluid.
Anti-rått-CD8 (OX8) (Brideau, R.J., P.B. Carter, W.R.
McMaster, D.W. Mason and A.F. Williams. 1980. Two subsets
of rat T lymphocytes defined with monoclonal antibodies.
Eur.J.Immunol. lO:609) renades pà liknande sätt (Holmdahl,
R., T. Olsson, T. Moran och L. Klareskog. 1985. In vivo
treatment of rats with monoclonal anti-T-cell antibodies.
Immunohistochemical and functional analysis in normal rats
and experimental allergic neuritis. Scand.J.Immunol.
22:l57) från odlingssupernatanter av OX8-hybridom ur-
sprungligen erhållna frán Dr. Alan Williams (Oxford, Stor-
britannien). En musmonoklonal anti-human-IFN-X (7-B6-1)
(Andersson, G., H.-P. Ekre, G. Alm and P. Perlmann. 1989.
Monoclonal antibody two-site ELISA for human IFN-3.
Adaption for determinations in human serum or plasma.
J.Immunol.Methods l25:89) utgjordes av en gåva fràn Gudrun
Andersson (Research and Development Immunobiology, KABI,
Biopharma, Stockholm, Sverige). Kaninpolyklonal anti-human
.Lä
Ü\
10
15
20
25
30
35
CO
[O
(Il
2
6
IFN-X inköptes från Interferon Sciences (New Brunnswick,
New York, US). Rekombinant rått-IFN-3 framställdes och
titrerades såsom tidigare beskrivits (Van der Meide, P.H.,
M. Dubbeld, K. Vijverberg, T. Kos och H. Schellekens.
1986. The purification of rat gamma interferon by use of
two monoclonal antibodies. J.Gen.Virol. 67:l059). Rekombi-
nant human IFN-X inköptes frán Genzyme (Boston, M.A., US).
Biotinylerad anti-kanin-IgG, ràttserum-absorberad biotio-
nylerad anti-mus IgG (Vector Lab., Burlingame, US) och
avidin-biotin-peroxidaskomplex (Vectastain ABC-Elite Kit,
Vector Lab.) användes.
Mononukleära cellsuspensioner
' Enkla cellsuspensioner fràn superficiella cervikala
lymfnoder av normala Sprague-Dawley-råttor (150-200 g,
ALAB, Sollentuna, Sverige) erhölls genom malning genom ett
tràdnät. Mjältar maldes på samma sätt och erytrocyter eli-
minerades genom osmotisk lys. Cellerna suspenderades i
Iscove's modifikation av Dulbeccos's medium (Flow, Irvine,
UK) supplementerad med 2 mM glutamin (Flow), 50 IU peni-
cillin (Astra, Södertälje, Sverige), 60 pg/ml streptomycin
(Flow), 1% (vol/vol) minimum essential medium (Flow) och
5% (vol/vol) fetalt kalvserum (FCS; Gibco, Paisley, UK).
Humana perifera blodmononukleära blodceller fràn fyra
friska laboratorieanställda bereddes på Ficoll Hypaque
(Lymphoprep, Nygaard, Oslo, Norge). Cellsuspensionerna
_tvättades tre gånger i medium àtföljt av räkning av MNC i
närvaro av trypanblått. Procenttalet celler exkluderande
trypanblàtt översteg i allmänhet 90%. Koncentrationen av
MNC i suspensionerna justerades sedan till 5 och 10 x
106/ml.
Framställningfav fraktionering av T.b. brucei
En variabel typ An Tat l/1 härledd fràn stabilat
EATRO 1125 av T.b. brucei (erhållen från Dr. Nestor van
Meirvenne, Laboratory of Serology, Institute of Tropical
Medicine Prins Leopold, Antwerp, Belgien) bringades pas-
10
15
20
25
30
35
468 250
7
sera en gäng i Sprague-Dawley-råttor före användning. Blod
från infekterade djur uppsamlades genom hjärtpunktering
och blandades med fosfatbuffert innehållande 1% blukos och
EDTA. För att rena trypanosomerna från blodet användes den
metod som beskrives av Lanham and Godfray (Lanham, S.M.,
and D.G. Godfrey. 1970. Isolation of salivarian trypanso-
mes from man and other animals using DEAE-cellulose.
Exp.Parasitol, 285521), men kromatografi utfördes pá för-
svälld DEAE-Sepharose Fast Flow jonbytare (Pharmacia, Upp-
sala, Sverige). Detta resulterade i en ren population av
mobila parasiter utan kontaminerande MNC. I vissa experi-
ment användes parasiter som sönderdelats genom frysning
och upptining.
För att erhålla en bas för framtida reningsförsök och
för att i stort karakterisera komponenterna av T.b. brucei
som inducerar MNC till IFN-X-sekretion utfördes fraktione-
ringsexperiment. Vid fyra olika tillfällen utfördes dessa
pá följande sätt: de renade parasiterna (45 x 106) soni-
kerades på is i 1 minut (output 5; 40% duty cycle; cell-
disruptor B15, Bronson-sonifikator). Parasitmembran pel-
letiserades genom ultra-centrifugering i 3 timmar vid
105 000 g (under användning av en 50 Tirotor i en Beckman
L8-55 ultra-centrifug (Beckman Instruments Inc., Palo
Alto, California, USA)). Pelleten upplöstes sedan i 50 mM
PBS, pH 8,0. Pelleten upplöstes i fosfatbuffrad koksalt-
lösning (PBS: 50 mM, pH 8,0), underkastades sedan gelfilt-
rering på Sephacryl S-200 superfine (Pharmacia Fine
Chemicals) på en 48 x 1,5 cm kolonn, bringades i jämvikt
med 10 mM Tris-CHl, pH 7,5, vid en flödeshastighet av 5,64
ml/timme. 120 fraktioner om 1,13 ml vardera uppsamlades.
Molekylvikt bestämdes genom jämförelse med proteiner med
fastställd molvikt (catalase, bovint serumalbumin, hemo-
globin, ovalbumin, cytokrom c). Parasitfraktionerna lyo-
filiserades sedan och hölls vid -70°C. Omedelbart före an-
vändningen upplöstes det lyofiliserade pulvret i 50 pl
sterilt vatten, varav 10 ul applicerades i varje mikro-
titerplatta väl med MNC.
Jä.
10
15
20
25
30
35
C\
03
BJ
cm
EXEMPEL 2
Assay med avseende pà interferon-3-sekreterande celler
Principerna för immunospotuppräkning av enkla sek-
retoriska celler under utnyttjande av nitrocellulosa-
bottnade mikrotiterplattor med 96 brunnar (Millititre-
-HAM, Millipore Co., Bedford, US) följdes (Czerkinsky, C.,
G. Andersson, H.-P. Ekre, L.-A. Nilsson, L. Klareskog och
Ö. Ouchterlony. Reverse ELI-SPOT assay for clonal analysis
of cytokine production. 1988. I. Enumeration of gamma-
-interferonsecreting cells. J.Immunol.Methods 1l0:29;
Kabilan L., G. Andersson, F. Lolli, H.-P. Ekre, T. Olsson
och M. Troye-Blomberg. 1990). Detection of intracellular
expression and secretion of interferon-X at the single-
cell level after activation of human T cells with tetanus
toxoid in vitro. Eur.J.Immunol. 20:lO85). För detektering
av ràtt-IFN-Z-SC överdrogs brunnarna med 100 ul alikvoter
av DB1 vid 15 pg/ml vid 4°C över natten och tvättades med
PBS, pH 7,4. Mikrotiterplattorna tömdes sedan genom sug-
ning i en Millititre vaccumfiltreringshàllare (Millipore)
och 100 ul alikvota mängder om 1% bovint serum albumin
(BSA) i PBS tillsattes i 2 timmar. Plattorna tvättades
sedan 10 gånger med PBS genom sugning i filtreringshål-
laren. Alikvota mängder (100 pl) av cellsuspensioner
tillsattes i triplikat till brunnarna vid tvâ olika kon-
centrationer, 5 och 10 x 106 MNC per ml. Parasiter eller
andra komponenter tillsattes vid koncentrationer som anges
i figurbeskrivningarna. Efter 24 timmar odling vid 37°C
och 7% C02 i fuktig atmosfär tömdes plattorna och tvätta-
des flera gånger med PBS. Alikvota mängder (100 ul) av den
polyklonala kanin-anti-rått IFN-3-antikroppen utspädd
1/5 000 tillsattes i 2 timmar. Efter tvättning tillsattes
biotinylerad anti-kanin-IgG utspädd 1/1 000 under ytter-
ligare 2 timmar àtföljt av avidin-biotinperoxidaskomplexet
utspätt till 1/200 i 1 timme. Efter peroxidasfärgning
(Kaplow, L.S. 1974. Substitute for benzidine in myelo-
peroxidase stains. Am.J.clin.Pathol. 63:45l), räknades
10
15
20
25
30
35
463 250
9
fläckar som motsvarade celler som sekreterat IFN-X i ett
dissektionsmikroskop. I specificitetskontrollexperiment,
där ifrågavarande antikropp ersatts med en irrelevant
monoklonal musantikropp eller där den polyklonala kanin-
antikroppen uteslutits uppträdde inga fläckar. För detek-
tering av humant IFN-X-SC överdrogs plattorna med 7-B6-1,
6 ug/ml, och en polyklonal kanin-anti-human IFN-X utspädd
1/500 användes. Variationen i antal fläckar inom tripli-
katen var alltid mindre än 10%. Medelvärdet av triplikaten
beräknades och uttrycktes som antalet IFN-X-SC per 106
MNC.
Depletion av CD8+-lymfocyter
För att erhålla rått-MNC fri från CD8+-celler inji-
cerades råttor i.p. med 1 mg OX8. 24 timmar senare pre-
parerades mjält- och lymfnod-MNC. Såsom tidigare beskri-
vits ((Ho1mdah1, R., T. Olsson, T. Moran och L. Klareskog.
1985. In vivo treatment of rats with monoclonal anti-T-
-cell antibodies. Immunohistochemical and functional
analysis in normal rats and experimental allergic
neuritis. Scand.J.Immunol. 22:l57) resulterar denna be-
handling i total depletion av CD8+-celler inom 30 minuter
varande i I4 dagar. I samtliga råttor behandlade på detta
sätt kontrollerades CD8+-depletionen immunohistokemiskt i
snitt från mjälten såsom tidigare beskrivits (Bakhiet, M.,
T. Olsson, P. Van der Meide och K. Kristensson, 1990.
Depletion of CD8+ cells suppresses growth of Trypanosoma
brucei brucei and interferon-gamma (IFN-3) production in
infected rats. Clin.exp.Immunol. 81:l95).
EXEMPEL 3
Effekt av trypanosomer på MNC-IFN-X-sekretion
Omedelbart efter utstrykning av mjält- och lymfosyt-
-MNC från CD8+-depleterade och icke depleterade råttor
sattes renade levande 10 pl alikvota mängder av trypano-
somer till triplikata brunnar för att uppnå slutantal om
10, 102 och 103 parasiter per brunn. Andra brunnar expone-
JS.
10
15
20
25
30
35
O\
OD
BD
Uñ
CD
10
rades för frysta och upptinade trypanosomer (104 per
brunn) eller trypanosomfraktioner beredda sàsom beskrivits
ovan. I varje experiment bestod negativa kontroller av
triplikata brunnar icke mottagande parasiter, under det
att positiva kontroller bestod av triplikater mottagande
optimalt utspätt fytohemagglutinin (PHA, Difco, Detroit,
Mi., US).
Effekt av trypanosomer på MNC-proliferation
I dessa experiment odlades MNC från lymfnoder och
mjältar vid en cellkoncentration av 2 x 106 per ml medium
genom applicering av 200 pl alikvota delar i rundbottnade
polystyrenmikrotiterplattor med 96 brunnar (Nunclon, Nunc,
Danmark). Triplikat av brunnar erhöll 0, 10, 102, 103 och
104 parasiter. PHA inkluderades som positiv kontroll. 16
timmar före skörd mottog varje brunn 10 ul alikvota mäng-
der innehållande 1 pCi av H3-märkt tymidin (Amersham,
Little Shalfont, UK) i koksaltlösning. I vissa experiment
tillsattes DB1 (20 pg/ml) till parallella brunnar för att
inhibera IFN-X producerat in vitro. Totala odlingstider
innefattade 24, 48 och 72 timmar i 37°C i fuktig atmosfär
och 7% C02. '
Celler skördades i glasfiberfilterremsor (Skaltron
AS., Lierbyen, Norge) med en flerkanals halvautomatiserad
skördeanordning (Titertec Skaltron AS) åtföljt av upprepa-
de tvättningar i destillerat vatten. Införlivad radioakti-
_vitet räknades i en scintillationsräknare (Marck II,
Searle, Analytic, Des Plaines, USA). Medelinpulser per
minut (cpm) och standarddeviation av H3-tymidininförliv-
ningar beräknades fràn triplikaten.
Effekt av MNC och IFN-X pà trypanosomtillväxt
MNC odlades i rundbottnade mikrotiterplattor med 96
brunnar (Nunclon) vid en celldensitet av 5 x 106/ml od-
lingsmedium. Både humana och perifera blod-MNC och rått-
mjält- och lymfnod-MNC från CD8+-depleterade och odeple-
terade djur användes. Renade parasiter tillsattes trip-
'n
10
15
20
25
30
.35
4653 250
ll
likata brunnar för uppnående av en ursprunglig densitet om
10 x 106 trypanosomer/ml odlingsmedium. I vissa experiment
eeftee nB-l (10 pg/mi), 7-36-1 (10 pg/ml) eller peiyklenel
antirátt-IFN-X (slutlig utspädning 1/5 000) till brunnar-
na. I andra experiment mottog brunnar innehållande endast
trypanosomer olika mängder rått eller humant rekombinant
IFN-3. I parallella brunnar odlades trypanosomer i enbart
medium. Parasitbestämningarna vid olika provtagningsinter-
valler utfördes på följande sätt: innehållet i varje brunn
blandades noggrant 10 gånger med en 100 pl mikropipett. l0
pl av fluidet sattes till 90 ul av en Trypanblått-lösning
åtföljt av noggrann blandning. Burker--kamrar användes för
att räkna antalet mobila parasiter som exkluderade Trypan-
blått vid en x200 förstoring. Densiteten av "levande" pa-
rasiter per ml medium närvarande i brunnen beräknades.
För varje typ av in vitro-manipulation utfördes ex-
perimenten vid 3 till 6 olika tillfällen bortsett ifrån
att en typ med tillsats av humant IFN-X utfördes en gång.
Vid varje tillfälle användes tre brunnar för varje prov-
tagningsintervall, dvs. 2, 4, 8, 12 och 24 timmar efter
initiering av odlingen, för att räkna antalet parasiter.
Totalt innehåller sålunda varje provtagningsintervall data
från 12 till 18 räkningar. Medel- och standardfel av medel
(SEM) beräknades. Mann-Whitney's test användes för att
beräkna signifikansnivån.
Effekter av MNC och trypanosomfrigjorda faktorer i ett
tvàkammarsystem
För att studera om eventuell signalering mellan
trypanosomer och MNC innebär endera direkt kontakt eller
diffunderbara molekyler användes ett tvàkammarsystem. Od-
lingsplattor (24 brunnar; Transwell, Laboratorie Design_
AB, Lidingö, Sverige) användes, vari lymfnod- eller mjält-
-MNC applicerades i den undre brunnen och trypanosomer i
den övre brunnen. Porstorleken för det membran som begrän-
sar utbytet mellan de två kamrarna var 0,4 pm. I studier
av trypanosomeffekter på MNC applicerades 6 x 104 MNC-
.få
O\
OD
10
15
20
25
30
35
250
12
-parasiter i 100 ul medium i den övre brunnen. 6 x 106
MNC
i 600 ul medium applicerades i den undre brunnen. Efter 24
timmars odling tvättades MNC en gånger i mediet, cellerna
utspäddes ånyo och 100 pl alikvota mängder, vardera inne-
hållande 106 MNC, applicerades i brunnar av nitrocellu-
losabottnade mikrotiterplattor, odlades under ytterligare
24 timmarsperiod för detektering av IFN-X-SC såsom beskri-
vits ovan. I separata experiment på effekten av MNC på
trypanosomtillväxt applicerades 106 parasiter i 100 pl
medium i den övre brunnen, under det att den undre mottog
6 x 106 MNC i 600 ul medium. Parasiterna räknades såsom
beskrivits ovan i triplikat vid 2, 4, 8, 12 och 24 timmar
efter initiering av odlingarna. Medeltal, SEM och stati-
stik beräknades såsom beskrivits ovan.
EXEMPEL 4
Studium av IFN-X-upptagning av trypanosomer
För att studera huruvida T.b. brucei redan i den
infekterade värden tagit upp IFN-X underkastades renade
parasiter a) histokemisk färgning för detektion av rått-
-IFN-X, b) Western blot för att detektera ungefärlig mo-
lekylvikt för färgat material. '
a) Renade trypanosomer lufttorkades på glasplattor
åtföljt av fixering i 30 sekunder i 4% buffrat formalin
och efter tvättning i PBS 30 sekunder i iskyld aceton.
Därefter tvättades glasplattorna i PBS, inkuberades med 2%
normalt hästserum i 30 minuter. Plattorna inkuberades
sedan med 5 pg/ml DB1 vid 4°C över natten. Efter tvättning
applicerades i tur och ordning lämpliga utspädningar av
biotinylerad häst-anti-mus-IgG (Vector lab.) utspädd i 2%
normalt råttserum och ABC, åtföljt av peroxidasfärgning
(Kaplow, L.S. 1974. Substitute for benzidine in
myeloperoxidase stains. Am.J.clin.Pathol. 63:45l). Som ne-
gativa kontroller användes en serie av irrelevant isotyp-
matchade monoklonala musantikroppar.
G7
'15
10
15
20
25
30
35
-Yta
C7\
OO
PO
(fl
(D
13
b) Hela renade och i övrigt obehandlade trypanosomer
separerades genom natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel-
elektrofores (SDS PAGE) och transfererades genom elektro-
blotting till nitrocellulosamembran (Laemmli, U.K. 1971.
Cleavage of structural proteins during assembly of the
head of bacteriphage T4. Nature 227:680; Towbin, H., T.
Stachelin and J. Gordon. l979. Electrophoretic transfer of
proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose
sheets: procedure and same applications.
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76:4350). Cirka 106 trypanosomer
sattes till vardera tràget i gelen. Elektroblotting pà
nitrocellulosamembran utfördes i transblotcellutrustning
(BioRad, CA, USA) vid en konstant ström om 0,1 Amp i 16
timmar vid 4°C. Proceduren innebär att parasiterna lyse-
ras, deras beståndsdelar separerats enligt molvikt och de
blottas över på nitrocellulosa. Nitrocellulosamembranen
var blockerade i mjölk med låg fetthalt för att undvika
icke specifik bindning av antikroppar. Membranet inkube-
rades sedan över natten vid rumstemperatur med DBl i en
koncentration av 5 pg/ml för detektering av eventuellt se-
parerat IFN-X. Efter flera tvättningar i buffert inkube-
rades membranen i en 1/500 utspädning av ett högaffini-
tetsrenat get-anti-mus-IgG och underkastades sedan ABC och
peroxidasfärgning enligt Kaplow (Kaplow, L.S. 1974. Sub-
stitute for benzidine in myeloperoxidase stains.
Am.J.clin.Pathol. 63:45l).
Beräkningar och statistik
I varje experiment användes om ej annat anges
triplikat. Samtliga experiment upprepades 3-8 gånger och
Wilcoxon's rank sum test eller Mann Whitney's test an-
vändes för att beräkna signifikansnivàn.
JE.
10
15
20
25
30
35
G\
OD
FJ
CF
14
EXEMPEL 5
Trypanosominducerad stimulering av CD8+-lymfocyt-IFN-X-
-sekretion och proliferation in vitro
Såsom framgår av Fig. 1 medförde samodling av lymf-
nod- eller mjält-MNC med trypanosomer 24 timmar en uttalad
förhöjning av antalet IFN-X-SC. Även trypanosomer avdödade
genom frysning och upptining inducerade IFN-X-sekretion,
ehuru mindre effektivt. Exempelvis 104 frusna trypanosomer
inducerade svar av liknande storleksordning som 102 levan-
de trypanosomer. Så få som 10 levande trypanosomer per
brunn kunde pà ett överraskande sätt inducera ett signifi-
kant svar. Trypanosominducerad IFN-X-produktion eliminera-
des fullständigt när CD8+-depleterade MNC-suspensioner an-
vändes. Maximala antalet detekterbara IFN-X-SC var cirka
200 per 106 MNC, dvs. 1 av 5000 MNC. Såsom förväntats re-
sulterade PHA-stimulering av parallella brunnar i ett
ungefär likadant antal IFN-X-SC. MNC från humant perifert
blod aktiverades av trypanosomer till sekretion av IFN-X
(Fig. 2).
Mätningar av proliferativa svar under användning av
3H-tymidininförlivning avslöjade såsom förväntat att PHA
inducerade kraftig proliferation efter 24, 48 resp. 72
timmar. När trypanosomer inom intervallet 10 till 104 pa-
rasiter/brunn tillsattes uppträdde ett svagt proliferativt
svar vid 24 timmar jämfört med kontrollbrunnarna. Vid 48
timmar var svaret jämfört med kontrollerna lika stort. Vid
_72 timmar inducerade emellertid 10 och 102 parasiter enty-
digt MNC-proliferation, under det att 103
ter ej medförde inducering.
och 104 parasi-
Den IFN-X-inducerande faktorn frigöres från trypanosomer
Användningen av tvàkammarsystemet som fysiskt sepa-
rerade trypanosomerna från MNC visade att jämförbara antal
av IFN-X-SC inducerades i denna situation såsom med trypa-
nosomer direkt samodlade med MNC. Sàsom_illustreras i Fig.
3 användes ett tvåkammarsystem i detta fall fysiskt av-
skiljande T.b. och MNC men tillåtande utbyte av lösliga
10
15
20
25
30
35
.få
CH
CO
FO
(TI
CD
15
mediatorer. Bindningarna anger att den trypanosomhärledda
lymfocytaktiverande faktorn frigöres och även verkar på
avstånd. Detta rön visar att parasiterna frigör en löslig
mediator som inducerar MNC till IFN-X-sekretion.
CD8+ MNC-sekretion av en löslig faktor medför artbegränsad
trypanosomtillväxt
Ett reciprokt förhållande mellan trypanosomer och
värdhärledda celler var uppenbart när kinetiken analyse-
rades genom räkning av antalet parasiter i tvåkammarsyste-
met med och utan MNC i den undre kammaren. Sålunda förelåg
en tidig ökning i antalet parasiter i den övre kammaren
när den undre kammaren tillförts mjält-MNC, medan de lång-
samt avtog i antal vid exponering för enbart medium
(Tabell I). Det var intressant att notera att denna till-
växtstimulering eliminerades när CD8+-depletade MNC an-
vändes (Tabell II).
IFN-X härmar den MNC-härledda trypanosomtillväxtbefräm-
jande faktorn
Denna fråga bestämdes genom in vitro-experiment med
antikroppstillväxtinhibering och genom direkt cytokin-
applicering. Av Tabell II är det uppenbart, att DBl och
polyklonalt kanin-anti-rått-IFN-X-antiserum fullständigt
blockerar tillväxtbefrämjandet av rått-MNC, under det att
det monoklonala mus-anti-human-IFN-X var ineffektivt (inga
data visade). Applicering av rekombinant rått-IFN-X på
kulturer med renade parasiter resulterade i en slående dos
beroende tillväxtstimulering (Tabell II).
Ytterligare beträffande detaljer i Fig. 4 till 8
Såsom angivits tidigare visar Fig. 4 ett diagram över
antalet IFN-X-sekreterande celler efter exponering av
splenocyt-MNC för fraktioner erhållna efter gelfiltrering
av sönderdelade trypanosomer. Vid diagrammet var dessa tre
toppaktiviteter approximativa molekylvikter om 185, 70 och
30 kD, och dessa aktiviteter motsvarar fraktionerna 23, 46
4ss_2so
10
15
20
25
30
35
16
och 79 som återges i diagrammet i Fig. 5. Såsom även tidi-
gare angivits visar Fig. 5 ett diagram över inhibitionen
av IFN-X-sekretion inducerad genom nämnda fraktioner under
användning av en monoklonal antikropp mot den lymfocyt-
stimulerande faktorn, i följande Exempel 6 godtyckligt be-
tecknad Moiz I.
Fig. 6 illustrerar inhibitionen av mjält-MNC-stödd
tillväxt av T.b. brucei in vitro genom blockering av den
trypanosomfrigjorda lymfocytstimulerande faktorn med Moiz
I.
Vidare visar Fig. 7 selektiv blockering av trypano-
sominducerad IFN-X-produktion under användning av en mono-
klonal mus-anti-CD8-antikropp, betecknad OX8. Andra anti-
kroppar är ineffektiva, och detta rön anger att CD8-mole-
kylen är màlet för den trypanosomlymfocytaktiverande fak-
torn.
Slutligen visar Fig. 8 blockering av trypanosom-
inducerad IFN-X-produktion under användning av stigande
doser av lösliga CD8-molekyler satta till kulturerna.
Detta rön som illustreras i Fig. 8 anger att den trypa-
nosomfrigjorda molekylen binder till CD8 och att under
dessa betingelser lymfocyter ej aktiveras.
EXEMPEL 6
Principiell beskrivning av anti-TLTF-antikroppen, Moiz I
Fraktionen med TLTF-toppaktivitet (F23 i Fig. 5) an-
_ vändes för immunisering av möss. Nio dagar senare användes
regionala lymfnodceller för produktion av hybridom enligt
standardteknik. Resulterande 40 hybridom testades med av-
seende pà sin förmåga att inhibera trypanosominducerad
produktion av mononukleära IFN-X-celler i ovan beskrivet
assay-system. Av 40 hybridom uppvisade 4 av desamma sådan
inhiberande aktivitet. Hybridomet med starkaste aktivi-
teten selekterades och expanderades. Antikroppen kallades
godtyckligt Moiz I. Isotypen av antikroppen befanns vara
gamma 2B. Den har sedan renats på protein A och analyse-
rats vidare. Antikroppen inhiberar TLTF in vitro vid en
'x
10
15
20
25
30
35
.Ia
CR
CD
PO
(11
CD
17
koncentration ned till 0,1 pg/ml. Den inhiberar ej induk-
tion till IFN-X-produktion på annat sätt, såsom PHA-indu-
cerad IFN-3-produktion. Antikroppen verkar sålunda vid låg
koncentration och specifikt pà trypanosominducerad IFN-3-
-induktion. Det visar vidare att IFN-X-induktion genom
trypanosomer beror pà inverkan av en enkel molekyl och ej
en komplex interaktion in vitro mellan parasiter och mono-
nukleära celler.
Vid användning av Moiz I för immunohistokemisk färg-
ning av parasiter färgas trypanosomer specifikt genom mo-
lekylen men ej av en serie kontrollantikroppar.
TABELL I
Tid efter initiering av odling (h)
2 4 12 24
Experimen- 0 m 11,3 5,5 3,3 0,4
tell proce- SEM 0,3 0,2 0,2 0,1
dur n 12 12 12 12
MNC m 18,6 15,5 6,5 2,6
SEM 2,1 0,5 0,4 0,6
n 12 12 12 12
p 0,001 0,09 0,001 0,005
JE
10
15
20
25
30
35
68 250
18
TABELL II
Tid efter initiering av odling (h)
Experimentell
procedur 2 4 8 12 24
0 m 10,8 11,8 4,8 3,1 0,7
SEM 0,8 0,9 0,28 0,2 0,05
n 18 18 18 18 18
'MNc M 29,3 17 9,7 6,9 1,4
SEM 2 0,4 1,1 0,3 0,17
n 18 18 18 18 18
p 0,001 0,002 0,001 0,003 0,01
cna*- m 11,1 11,1 3,3 2,1 0,5
-deple- SEM 1,1 0,8 0,2 0,2 0,2
terad n 18 18 18 18 18
MNC p jämförd n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
med 0
p jämförd 0,001 0,002 0,003 0,002 0,002
med 106
MNC
_DBl + m 5,6 6,4 5,6 2 0,2
MNC SEM 0,2 0,2 0,15 0,1 0,01
n 12 12 12 12 12
p jämförd n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
med 0
p jämförd 0,001 0,002 0,003 0,002 0,002
med 106
MNC
forts.
10
15
20
25
30
35
468 250
19
forts.
Tid efter initiering av odling (h)
Experimentell
procedur 2 4 8 12 24
Kanin- m 8,8 7,2 8 1,6
-anti- SEM 0,3 0,2 0,2 0,1 _
-rått n 12 12 12 12 12
+ MC p jämförd n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
IFN-X med 0
p jämförd 0,002 0,001 0,03 0,001 0,03
med 106
MNC
Human m 3 2,3 2,9 1,2 1
MNC SEM 0,28 1,37 1,7 0,7 0,6
n 12 12 12 12 12
p 0,001 0,001 0,008 0,003 0,12
20000 U m 2,1 26 13 8 4,8
rått SEM _ 2,1 4,2 1,1 0,7 0,5
IFN-X n 12 12 12 12 12
p 0,001 0,001 0,001 0,001 0,2
2ooo U m 14 18 11,8 6,4 3
rått SEM 1,1 3,1 0,8 0,6 0,2
IFN-X n 12 12 12 12 12
p 0,08 0,001 0,003 0,001 0,008
200 U m 11,2 12 5 3,8 1,8
rått SEM 0,8 0,6 0,2 0,1 0,1
IFN-z' n 12 12 121 -12 12 1
p 0,06 0,001 0,01 0,08 0,13
forts.
468 250
10
15
20
25
30
35
' brunn mottog 100 pl. I den undre brunnen tillsattes 6x10
20
forts.
Tid efter initiering av odling (h)
Experimentell
procedur 2 4 8 12 24
20000 U m 5,6 8 9,6 2,4 2,2
human SEM 0,1 0,1 0,2 0,1 0,07
IFN-X n 3 3 3 3 3
p n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
2000 U m 5,6 8 7,2 3,2 1,2
human SEM 0,1 0,1 0,1 0,17 0,05
IFN-X n 3 3 3 3 3
p n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
FÖRKLARING TILL TABELLERNA
Tabell I.
applicerade i den övre brunnen av tvàkammarsystem under
Tillväxtkarakteristika för renade trypanosomer
separation av desamma från mononukleära råttceller appli-
cerade i den undre brunnen. Parasiterna applicerades vid
en ursprunglig densitet av l0xl06/ml medium och varje 6
rått-MNC i 600 pl medium (MNC), kontrollkulturer mottog
enbart medium (0). Data avser antalet trypanosomer
x 106/ml. m = medelvärden, SEM = standardfel i medelvär-
de, n = antalet analyserade kulturer, p = signifikansnivà.
Tabell II. Tillväxtkarakteristika av renade trypanosomer
underkastade olika experimentella procedurer. Parasiterna
applicerades vid en ursprunglig densitet av l0x106/ml me-
dium i 100 pl alikvota mängder. Data avser antalet parasi-
ter x 106/ml. Procedurerna var följande: medium enbart
x)
f;
1D
10
15
20
25
30
35
468 259
21
(0), samodling med 106 rått-MNC (MNC), samodling med CD8+-
-depleterad rått-MNC (CD8+-depleterad MNC), samodlad med
lo6 ratt-Mnc aan zo pg/ml mal tillsatt (nan-Mus), samodlad
med 106 ràtt-MNC och 20 ug/ml tillsatt nBl (DBl+MNc), sam-
odling med rått-MNC och polyklonal kanin-anti-rått-IFN-X
tillsatt (rabbit anti-rat IFN-3 + MNC), samodling med hu-
man MNC (human MNC), olika kvantiteter rekombinant rått-
medelvärden, SEM = standardfel i
medelvärde, n = antalet analyserade kulturer, p = signifi-
eller human-IFN-3. m =
kansnivá i jämförelse med kulturer med enbart medium, om
ej annat anges, n.s. = ej signifikant, n.d. = ej betämd.
Claims (7)
1. Lymfocytstimulerande faktor, k ä n n e - t e c k n a d av ett protein härrörande från haemoflagellaten Trypanosoma brucei med förmåga att i en levande djurkropp stimulera CD8+-T-celler resulterande i frigöring av interferon-X (IFN-X), så att därigenom im- munosuppression uppstår i nämnda kropp.
2. Lymfocytstimulerande faktor enligt patentkravet 1 härrörande från haemoflagellaten Trypanosoma brucei brucei.
3. Lymfocytstimulerande faktor enligt patentkravet 1 eller 2 med en molekylvikt av cirka 30 kD eller en heltalsmultipel därav.
4. Lymfocytstimulerande faktor enligt patentkravet 3 med en molekylvikt av cirka 180 kD 1 20 kD.
5. Lymfocytstimulerande faktor enligt något av de föregående patentkraven för användning som ett vaccin mot afrikansk sömnsjuka.
6. Lymfocytstimulerande faktor enligt något av patentkraven l till 4 för användning vid framställning av ett antiserum användbart för att bekämpa afrikansk sömn- sjuka.
7. Monoklonal antikropp riktad mot den lymfocyt- stimulerande faktorn enligt något av patentkraven 1 till '40 f)
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9101086A SE468250B (sv) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Lymfocytstimulerande faktor fraan trypanosoma brucei |
AU14599/92A AU1459992A (en) | 1991-04-11 | 1992-03-25 | A lymphocyte stimulating factor originating from the haemoflagellate trypanosoma |
PCT/SE1992/000191 WO1992018538A1 (en) | 1991-04-11 | 1992-03-25 | A lymphocyte stimulating factor originating from the haemoflagellate trypanosoma |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9101086A SE468250B (sv) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Lymfocytstimulerande faktor fraan trypanosoma brucei |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE9101086D0 SE9101086D0 (sv) | 1991-04-11 |
SE9101086L SE9101086L (sv) | 1992-10-12 |
SE468250B true SE468250B (sv) | 1992-11-30 |
Family
ID=20382432
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE9101086A SE468250B (sv) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Lymfocytstimulerande faktor fraan trypanosoma brucei |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
AU (1) | AU1459992A (sv) |
SE (1) | SE468250B (sv) |
WO (1) | WO1992018538A1 (sv) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5891439A (en) * | 1996-07-26 | 1999-04-06 | Sbl Vaccin Ab, Stockholm, Se | Lymphocyte stimulating factor |
JP5054546B2 (ja) * | 2006-02-07 | 2012-10-24 | エヌエーアイ株式会社 | 新規ワクチン担体 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GR74132B (sv) * | 1980-05-22 | 1984-06-06 | Deutsches Krebsforsch |
-
1991
- 1991-04-11 SE SE9101086A patent/SE468250B/sv not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-03-25 AU AU14599/92A patent/AU1459992A/en not_active Abandoned
- 1992-03-25 WO PCT/SE1992/000191 patent/WO1992018538A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE9101086D0 (sv) | 1991-04-11 |
AU1459992A (en) | 1992-11-17 |
WO1992018538A1 (en) | 1992-10-29 |
SE9101086L (sv) | 1992-10-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gurney et al. | Neuroleukin: a lymphokine product of lectin-stimulated T cells | |
Germann et al. | Interleukin‐12/T cell stimulating factor, a cytokine with multiple effects on T helper type 1 (Th1) but not on Th2 cells | |
Yuan et al. | Neutralization of IL-17 inhibits the production of anti-ANT autoantibodies in CVB3-induced acute viral myocarditis | |
Black et al. | Regulation of parasitaemia in mice infected with Trypanosoma brucei | |
US20020077276A1 (en) | Compositions and methods for treating hemorrhagic virus infections and other disorders | |
Bakhiet et al. | A Trypanosoma brucei brucei‐Derived Factor that Triggers CD8+ Lymphocytes to Interferon‐γ Secretion: Purification, Characterization and Protective Effects In Vivo by Treatment with a Monoclonal Antibody against the Factor | |
Callard et al. | Loss of immune competence with age may be due to a qualitative abnormality in lymphocyte membranes | |
Lane et al. | LPS promotes CB3-induced myocarditis in resistant B10. A mice | |
Abdou et al. | CELLS INVOLVED IN THE IMMUNE RESPONSE: VI. The Immune Response to Red Blood Cells in Irradiated Rabbits after Administration of Normal, Primed, or Immune Allogeneic Rabbit Bone Marrow Cells | |
MX2008000596A (es) | Inmunomodulacion inducida por la chaperonina 10. | |
EP1171163A1 (en) | Compositions containing tetracyclines for treating hemorrhagic virus infections and other disorders | |
Feng et al. | Isolation and potential immunological characterization of TPSGLVY, a novel bursal septpeptide isolated from the bursa of Fabricius | |
DK172578B1 (da) | IgE-bindingsfaktorer fra kolostrum fremgangsmåder til fremstilling deraf, anvendelse af disse faktorer samt farmaceutisk pr | |
Rosenkranz et al. | 10. Immunobiology and Hematology of Zinc | |
Valbuena et al. | Effect of blocking the CXCL9/10-CXCR3 chemokine system in the outcome of endothelial-target rickettsial infections | |
Ringdén | Activation of Human Lymphocyte Subpopulations by Rabbit Anti‐Human β2‐Microglobulin and by Lipopolysaccharide | |
SE468250B (sv) | Lymfocytstimulerande faktor fraan trypanosoma brucei | |
Bonfanti et al. | Increased Levels of Antibodies to IFN‐γ in Human and Experimental African Trypanosomiasis | |
EP1367393A1 (en) | Methods for using the CD 163 pathway for modulating an immune response | |
Aaskov et al. | Specific and non‐specific immunological changes in epidemic polyarthritis patients | |
Magrone et al. | A broad variety of antigens contribute to the pathogenesis of atherosclerosis: how to neutralize noxious reactions in the host | |
KR20040030948A (ko) | 과민성 질환에 효과적인 il-18 저해물질 | |
Zbar et al. | Tumor rejection mediated by an amphotropic murine leukemia virus | |
Maisch et al. | Humoral and cell-mediated immunity: pathogenetic mechanisms in dilated cardiomyopathy | |
McOmish | A monthly roundup of key articles in other journals. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NAL | Patent in force |
Ref document number: 9101086-8 Format of ref document f/p: F |
|
NUG | Patent has lapsed |