KR20040030948A

KR20040030948A - 과민성 질환에 효과적인 ｉｌ-18 저해물질

Info

Publication number: KR20040030948A
Application number: KR10-2004-7001962A
Authority: KR
Inventors: 올란드 차바체코; 마리에 코스코-빌보이스
Original assignee: 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2002-08-01
Publication date: 2004-04-09
Also published as: MXPA04001230A; CN100500210C; US20040247598A1; NO335688B1; JP2005501080A; AU2002331376B2; BRPI0211827B8; CA2456247A1; PL368231A1; CN1568193A; HRP20040071A2; IL160230A; HU230377B1; BR0211827A; AR035274A1; HUP0401323A3; HRP20040071B1; WO2003013577A2; RS52224B; PL227130B1

Abstract

본 발명은 과민성 질환, 특히 지연형 과민증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

Description

과민성 질환에 효과적인 ＩＬ-18 저해물질{USE OF IL-18 INHIBITORS IN HYPERSENSITIVITY DISORDERS}

알레르기 또는 과민증은 적응 면역이 부적절한 형태로 발생할 때 나타난다. 알레르기 또는 과민 반응은 외래 항원(일반적으로 환경적 거대분자)에 부적절하게 작용하는 정상 상태에서는 유익한 면역 반응에 의해 유발되며, 때때로 염증 반응과 조직 손상을 초래한다. 이런 경우에, 알레르기원이라고 하는 정상적으로 무해한 환경적 자극은 면역 반응을 유도하고, 이런 면역 반응은 재-노출직후 재-활성화되어 병리학적 손상을 유발한다.

과민 반응은 외인성 항원에 대한 면역 반응을 손상시킨다. 과민증은 다양하게 분류된다. 일부는 항원에 노출후 증상이나 피부 검사 반응이 나타나는데 필요한 시간(예를 들면 즉시형과 지연형 과민증), 항원의 종류(예, 약물 반응), 또는 관련된 장기의 특성에 기초한다. 일반적으로, 이런 분류법은 과도하게 단순화되고, 한가지이상 유형의 면역 반응이 발생하거나 또는 한가지이상 유형이 면역 손상을 유발하는데 필요할 수 있다는 사실을 고려하지 않는다. 가장 널리 이용되는 분류법은 다음과 같다:

I형이나 즉시형 과민증은 IgE-매개된다. 이는 일반 알레르기로 불린다. 즉시형 과민(I형) 반응은 비만 세포 또는 호염기구에서 항원과 IgE 간의 결합에 기인한다.

I형 과민반응 질환은 아토피 질환으로 불리는데, 여기에는 예로써 알레르기성 관절염, 알레르기성 결막염, 아토피성 피부염, 알레르기성 외부 천식, 두드러기, 전신 아나필락시스 등이 포함된다. 천식은 원인이 거의 알려지지 않고 있지만, 발병률이 급속하게 증가하고 있다. 최근에, 라텍스 제품(예, 특히 라텍스에 노출된 의료기간 종사원과 환자 및 이분척추와 선천적 비뇨생식기 결함을 갖고 있는 어린이에서 고무장갑, 덴탈 댐, 콘돔, 호흡 장치용 튜브, 카테터)에서 수용성 단백질 노출과 관련된 I형 반응이 현저하게 증가하였다.

일반적으로, 아토피 질환(아토피성 피부염 포함) 환자에는 아토피가 아닌 환자에서는 무해하게 흡입되고 소화되는 물질(알레르기원)에 대하여 IgE 항체-매개된 과민증이 발병할 유전적 소인이 존재한다. 아토피성 피부염을 제외하고, 주로 IgE 항체가 과민증을 매개한다.

Ⅱ형이나 세포독성 과민증은 항체, 보체 및/또는 세포 기전에 의해 매개되는 세포용해 작용을 수반한다. Ⅱ형 반응에서 표적은 세포 표면이고, 이의 결과는 세포 손상이나 사멸이다. 세포-결합된 항원(Ⅱ형)에 대한 항체는 보체를 활성화시키거나 또는 식세포작용을 촉진함으로써 세포 파괴를 유발한다. 항체가 세포의 항원성 구성요소와 반응하는 세포 손상의 예는 Coombs-파지티브 용혈성 빈혈, 항체-유도된 혈소판 감소성 자반증, 백혈구 감소증, 천포창, 유천포창, 구드패스츄어 증후군, 악성 빈혈이다. 이들 반응은 부적합한 수혈, 신생아의 용혈성 질환, 신생아 혈소판 감소증에서 발생하며, 다기관 과민성 질환(예, 전신 홍반성 낭창, SLE)에서도 부분적으로 역할한다.

손상 기전은 적혈구 세포에 대한 효과가 전형이다. 용혈성 빈혈에서, 적혈구 세포는 주로 비장내에서 혈관내 용혈 또는 대식세포 식세포작용에 의해 파괴된다. 시험관내 연구에서, 보체의 존재하에 일부 보체-결합 항체(예, 혈액군 항체 항-A와 항-B)가 급속한 용혈을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 다른 항체(예, 항-LE 항체)는 느린 세포 용해를 유도한다; 또 다른 항체는 세포를 직접적으로 손상시키지 않지만 이들 세포의 식세포 유착 및 파괴를 유도한다. 대조적으로, 적혈구 세포에서 Rh 항체는 보체를 활성화시키지 않고, 주로 혈관외 식세포작용으로 세포를 파괴한다. 항원이 조직의 구성요소가 되는 예는 혈관 내피에서 항체의 존재에 기인하는 이식된 신장의 조기 급성(아급성) 이식편 거부반응 및 항체의 사구체와 폐포 기저막 내피에 대한 반응에 기인하는 구드패스츄어 증후군이다. 실험적 구드패스츄어 증후군에서 보체는 손상의 중요한 매개물질이지만, 조기 급성 이식편 거부반응에서 보체의 역할은 아직 분명하지 않다.

세포 또는 조직과의 합텐 결합(haptenic coupling)에 기인하는 반응의 예에는 여러 약물 과민 반응(예, 페니실린-유도된 용혈성 빈혈)이 포함된다.

항-수용체 과민 반응은 막 수용체에 항원 결합의 결과로 세포 기능을 변화시킨다. 많은 질환(예, 중증근무력증, 그레이브스병, 인슐린-저항성 당뇨병)에서 세포막 수용체에 대한 항체가 보고되었다. 극도의 인슐린 저항을 보이는 일부 당뇨병 환자에서, 인슐린 수용체에 대한 항체가 상기 수용체에 인슐린의 결합을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 그레이브스병 환자에서, 갑상선-자극 호르몬(TSH) 수용체에 대한 항체가 상기 수용체에서 TSH의 효과를 촉진하여 갑상선기능항진증을 유발하는 것으로 확인되었다.

Ⅲ형 기전은 항원과 면역 복합체를 형성하는 대부분의 항체를 수반한다. 순환 복합체는 보체를 활성화시키고 적혈구에 유착하며(이후, 비장에서 식작용된다) 순환계를 이탈하고 조직 공간에서 염증(아르투스 반응)을 유발하거나, 또는 대식세포에 의해 식작용되고, 상기 대식세포는 항원을 제시하고 사이토킨을 방출하며 B와 T-세포를 활성화시킨다. IgE, IgA, IgG, IgM 모두 항원과 복합체를 형성한다. Ⅲ형 반응은 조직, 특히 피부, 관절, 신장에서 면역 복합체의 급격한 촉진에 기인한다. 만성 면역 복합체 신염은 사람에서 발생하는 사구체신염 사례의 대부분을 차지한다. 면역복합체(IC)가 일정하게 역할하는 질환은 혈청, 약물 또는 간염 바이러스 항원에 기인하는 혈청병; 전신 홍반성 낭창; 류머티스 관절염; 다발성 동맥염; 크리오글로불린혈증; 과민성 폐렴; 기관지폐 아스페르길루스증; 급성 사구체신염; 만성 막증식성 사구체신염; 연관된 신장 질환이다. 기관지폐 아스페르길루스증, 약물-이나 혈청-유도된 혈청병, 일부 신장 질환에서, IgE-매개된 반응은 Ⅲ형 반응을 선행하는 것으로 생각된다.

Ⅲ형 반응의 표준 동물 모델은 국소 아르투스 반응과 실험적 혈청병이다.아르투스 반응(전형적으로 국소 피부 반응)에서, 동물은 먼저 과다면역되어 다량의 순환 IgG 항체를 유도하고, 이후 피내에 소량의 항원이 제공된다. 항원은 과도한 IgG를 촉진하고 보체를 활성화시켜, 고도 염증성의 고통스런 부종형 국소 병소가 급속하게 나타나고(4 내지 6시간후) 다수의 다핵 세포를 보유하는 무균성 농양으로 진행되고, 이후 조직 괴사로 진행된다. 세동맥관이 폐색되는 괴사 혈관염이 현미경적으로 관찰된다. 항체가 이미 존재하기 때문에, 이런 반응에 앞선 지체 시간(lag time)은 필요하지 않다.

I형, Ⅱ형, Ⅲ형 반응은 항체에 의해 유발된다. Ⅳ형 반응은 T-림프구에 의해 유발된다.

일반적으로, 세포-매개된 반응을 수반하는 Ⅳ형 과민증은 발병하는데 12시간 이상의 시간이 소요되고 활성화된 면역세포 네트워크에 기반한다. 염증은 기본적인 조직 패턴이며, 이의 결과는 만성 염증성 질환이다. Ⅳ형 과민증은 지연형 과민증(Ⅳ형) 또는 DTH로 불린다. 반응은 T-림프구에 의해 방출된 인터루킨-2, 인터페론-γ, 다른 사이토킨에 의해 매개된다. DTH에서, T-림프구는 항원과 반응하고 인터루킨-9, 인터페론-γ, 다른 사이토킨을 방출한다. T-세포가 일차 노출에 의해 일단 감작화되면, 이차 공격에서 임상적으로 발생하는데 2-3일이 소요되는 국소 염증 반응인 지연형 과민 반응이 유도된다.

조직학적으로, 이들 반응은 침윤성 T-림프구, 대식세포, 일부 호산구로 구성된다. 실험적으로, DTH는 혈청이 아닌 T-림프구에 의해 전이될 수 있다, 다시 말하면 DTH에는 항체가 관여하지 않는다.

DTH는 바이러스, 진균, 특정 박테리아, 특히 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 나균(Mycobacterium leprae)의 감염에 대한 정상적인 세포-매개된 면역 반응에 기인한다. 대식세포는 섭취된 미생물을 파괴하지 못하면, 상피형 세포 또는 다핵 거대 세포로 분화된다. 이들 세포의 집합은 육아종을 형성하다. 국소적인 조직 손상은 이런 보호 면역 반응의 원치않는 부작용이다. 하지만, DTH 반응이 부재하거나 손상되면, T-림프구는 침입한 미생물의 위치를 확인할 수 없게 되고 환자에는 급성 결핵과 같은 침입성의 공격성 전신 질환이 발병한다.

작업이나 다른 항원에 대한 접촉 피부염 역시 IV형 반응이다. 일반적으로, 이를 유발하는 작용물질은 상대적으로 저분자량(<1kD)이고 자체적으로 비-면역원성이지만, 피부나 조직 단백질에 공유 결합하는 고활성 분자이다. 이런 감작화 화학물질은 합텐으로 알려져 있는데, 이는 담체인 호스트 단백질과 결합한다. 잠재적인 감작화 항원의 범위는 광범위하다. 2 단계의 병인이 인식되고 있다: 유도 단계와 전개 단계. 유도 단계에서, 랑게르한스 세포로 알려진 피부에서 항원-제시 세포는 합텐-담체 단백질 복합체와 결합하고 이를 MHC Ⅱ형 항원과 연관된 T-림프구에 제시한다. T-세포는 수개월에 걸친 소량 항원에 노출이후에 유도될 수 있다. 관련된 항원에 재-노출은 전개 단계를 유발하는데, 여기서 주효체 세포는 피부로 이동하여 표피에서 랑게르한스 세포에 의해 제시된 단백질 복합체와 만나고, 결과적으로 사이토킨 방출과 피부 염증을 유발한다. 원인 물질의 진단은 패치 검사로 실시한다. 의심되는 접촉 감작물질은 환자 등에 도포하고 48시간동안 덮어둔다. 반응 부위는 2시간과 24시간후 검사한다. 파지티브 반응으로 검사 부위에 염증과경화가 나타난다.

지연형 과민증은 이식된 검사 장기의 거부반응을 결정하는 핵심적인 기전이기도 하다.

Ⅳ형 반응이 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는 일부 임상적 질환은 접촉피부염, 과민성 폐렴, 동종이식편 거부반응, 세포내 미생물에 기인한 육아종, 일부 약물 민감증, 갑상선염, 광견병 백신접종후 뇌척수염이다. 마지막 2가지 질환의 증거는 실험적 모델 및 인간 질환에서 갑상선과 뇌의 염증성 삼출물에서 림프구의 출현에 기초한다.

피부염은 습진으로 불린다. 이는 조직학적으로 표피 부종, 임상적으로 수포, 불량한 연변 홍적, 부종, 삼출물, 가피, 각질, 소양증, 긁거나 문질러서 생긴 태선으로 특성화되는 표피 염증이다.

습진은 주로 수포형 피부염을 의미하지만, 때때로 만성 피부염을 의미하는 습진으로 국한된다. 또한, 피부염은 조직학적으로 해면증(피내 부종)을 특징으로 하기 때문에 해면성 피부염을 의미하기도 한다.

접촉 피부염은 피부에 접촉하여 독성(자극성)이나 알레르기 반응을 유발하는 물질에 의해 유발되는 비대칭이나 기묘한 형태의 급성이나 만성 염증이다.

과민 반응의 진단은 수반된 반응의 유형에 좌우된다.

Ⅳ형 반응은 염증 반응이 조직학적으로 혈관주위 림프구와 대식세포로 특성화될 때 의심해 볼 수 있다. 지연형 과민증 피부 검사와 패치 검사는 지연형 과민증을 검사하는데 가장 일반적으로 가용한 방법이다.

접촉 피부염의 악화를 예방하기 위하여, 접촉 피부염을 제거한 이후에 패치 검사를 실시한다. 의심 알레르기원(적절한 농도에서)은 비-흡수성 부착 패치로 피부에 도포하고 48시간동안 방치한다. 작열감(burning)이나 가려움(itching)이 조기에 발생하면, 패치는 제거한다. 파지티브 검사는 얼마간 경화된 홍반 및 일부 수포 형성으로 구성된다. 일부 반응은 패치가 제거될 때까지는 나타나지 않기 때문에, 도포 부위는 72시와 96시에 재검한다.

과민증은 약물에 대한 반응으로 발생할 수도 있다. 반응의 원인으로 특정 약물을 지목하기에 앞서, 위약 역시 다양한 증상 및 심지어 피부 발진과 같은 객관적인 증세를 유발할 수 있다는 점에 유의한다. 그럼에도 불구하고, 진정 약물 반응은 중요한 의료 문제이다.

약물 내성에서, 유해한 반응이 약물의 일차 사용에서 발생한다. 이는 좀더 높은 용량에서 초기에 예상되었던 것과 동일한 독성 반응이거나, 또는 일상적인 경미한 부작용(예, 항히스타민 진정효과)의 과장일 수 있다. 특이 체질은 약물의 일차 사용에서 약리학적으로 예상치 못한 유해한 반응이 발생하는 독특한 질환이다.

약물에 대한 알레르기 반응의 특징에는 환자가 약물에 1회 이상 의도적으로 노출된 이후에 발생하는 IgE-매개된 반응이 포함된다. 과민증이 발생하면, 이런 반응은 치료 함량, 일반적으로 특이 체질 반응을 유도하는 수준보다 훨씬 낮은 용량에 의해 유도될 수 있다. 임상적 특징은 증상에 국한되지 않는다. 피부 발진(특히 두드러기), 혈청병-유사 증상, 예상치 못한 열병, 아나필락시스, 약물 요법동안 나타나는 호산구 폐 침윤물은 일반적으로 과민증에 기인한다; 일부 사례의 빈혈, 혈소판 감소증 또는 무과립구증. 드물게, 약물(예, 설폰아마이드, 요오드, 페니실린)에 반복된 노출이후 혈관염이 발생하고, 특정 과민증의 발생과 일치하는 환경에서 간질성 신염(예, 메티실린)과 간 손상(예, 할로탄)이 보고되었다.

약물 과민증의 가장 심각한 예는 아나필락시스이다. 하지만, 가장 일반적인 약물 반응은 원인 미상의 홍역양 발진이다. 열병과 두드러기 반응 역시 약물 알레르기에 의해 상대적으로 빈번하게 발생한다. 동물 혈청을 치료에 사용하면, 혈청병이 합병증으로 발병하지만, 현재 동물 혈청은 거의 사용되지 않고 있다. 높은 수준의 순환 IgG 항체는 부재하지만 IgE 항체와 일반적으로 연관하는 병인 미상의 심각한 혈청병-유사 증상은 특히, 페닐실린과 같은 약물로 발병할 수 있다.

약물 과민 반응은 직접적인 면역 기전으로 특정 항체 생산을 촉진하는 단백질과 대형 폴리펩티드 약물의 능력에 기반한다. 잠재적인 항원성인 가장 적은 분자는 대략 3500의 분자량을 갖는 글루카곤이다. 대부분의 약물 분자는 훨씬 작기 때문에, 단독으로는 항원으로 기능할 수 없다. 하지만, 합텐은 단백질에 공유 결합하고, 생성된 공액체는 상기 약물에 특이적인 항체 생산을 촉진한다. 약물, 또는 이의 대사산물중 하나는 단백질과 화학적으로 반응한다. 많은 약물에 공통되는 혈청-단백질 결합은 훨씬 약하고 항원성에 대한 강도가 불충분하다.

특정 면역 반응은 벤질페니실린에서만 확인되었다. 이런 약물은 항원성 복합체를 형성할 만큼 견고하게 조직이나 혈청 단백질에 결합하지 않지만, 이의 주요 분해 산물인 벤질페니실린산은 조직 단백질과 결합하여 페니실린의 주요 항원 결정부위인 벤질페니실로일(BPO)을 형성할 수 있다. 여러 부차적 항원성 결정부위는아직 확인되지 않은 기전에 의해 상대적으로 소량으로 생성된다. 대부분의 과민 반응(I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ)에는 BOP 결정부위가 관여한다. 부차적 결정부위에 대한 IgE 항체는 일부 환자에서 아나필락시스와 두드러기의 원인이 된다. IgG 항체는 부차적 결정부위가 아닌 주요 결정부위에서 발견되었다. 이들은 BPO에 대한 "차단 항체"로 기능하거나, BPO에 대한 반응을 변화시키거나 또는 이를 심지어 예방하기도 하는데, 부차적 결정부위에 대한 차단 IgG 항체가 부재하면 이들 결정부위는 아나필락시스를 유도할 수 있게 된다.

모든 반-합성 페니실린(예, 아목시실린, 카르베니실린, 티카르실린)은 페니실린과 잠재적으로 반응하기 때문에, 페니실린-감수성 환자는 이들에도 빈번히 반응한다. 조금 덜하긴 하지만 세팔로스포린과도 교차-반응이 발생한다. 세팔로스포린 치료는 환자가 페니실린에 심각한 반응(예, 아나필락시스)의 병력이 있는 경우에는 매우 조심해야 한다.

혈액학적 항체-매개된(세포독성, Ⅱ형) 약물 반응은 3가지 기전중 하나에 의해 발생한다: 페니실린-유도된 빈혈에서, 항체는 적혈구 세포막에 견고하게 고정된 합텐과 반응하여 적혈구 세포의 응집 및 증가된 파괴를 유발한다. 스티보펜- 또는 퀴니딘-유도된 혈소판 감소증에서, 약물은 특정 항체와 가용성 복합체를 형성한다. 이후, 복합체는 주의의 혈소판("방관자"표적 세포)과 반응하고 보체를 활성화시키고, 이는 혈소판 막에 단독으로 잔류하여 세포용해를 유도한다. 다른 용혈성 빈혈에서, 약물(예, 메틸도파)은 적혈구 세포 표면을 화학적으로 변화시켜, 일반적으로 Rh 특이성의 자가 항체를 유도하고 이들 항체와 반응하는 항원을 노출시키는 것으로 보인다.

독성-특이체질 반응 및 아나필락시스 반응은 원인 약물이 쉽게 확인될 수 있을 만큼 종류 또는 시간 면에서 특이하다. 혈청병-유사 반응은 페니실린에 가장 일반적으로 기인하지만, 일부 경우에 설폰아마이드, 하이드랄라진, 설포닐우레아 또는 티아지드에 기인한다. 광감화(photosensitization)는 클로르프로마진, 비누에서 특정 방부제, 설폰아마이드, 프솔랄렌, 데메클로사이클린, 그리세오풀빈의 특징이다. 절대적으로 필요한 약물을 제외하고 모든 약물은 중단한다. 약열(drug fever)이 의심되면, 대부분의 유사 약물(예, 알로푸리놀, 페니실린, 이소니아지드, 설폰아마이드, 바르비투레이트, 퀴니딘)은 중단한다. 48시간이내에 열병이 감소하면, 이는 상기 약물이 원인임을 강하게 암시한다. 열병이 과립구감소증을 동반하면, 약물 독성은 알레르기보다 훨씬 심각할 수 있다.

약물에 대한 알레르기 폐 반응은 호산구증과 함께 일반적으로 침윤성이며, 특히 금염(gold salt), 페니실린, 설폰아마이드에 의해 유발된다. 급성 침윤성 폐 반응의 가장 일반적인 원인은 니트로푸란토인이다. 이는 알레르기원성이긴 하지만 일반적으로 호산구성은 아니다.

간 반응은 일차적으로 담즙정체성(페노티아진과 에리트로마이신 에스톨레이트가 가장 빈번하게 관여한다) 또는 간세포성(알로푸리놀, 히단토인, 금염, 이소니아지드, 설폰아마이드, 발프로산 등)이다. 통상적인 알레르기 신장 반응은 주로 메티실린에 기인하는 간질성 신염이다; 다른 항균제와 시메티딘 역시 관여한다.

전신 홍반성 낭창과 유사한 증상은 여러 약물, 특히 히드랄라진과 프로케인아마이드에 의해 유도된다. 이런 증상은 항핵 항체에 대한 파지티브 검사와 연관하고 상대적으로 양성이며 신장과 CNS에 영향을 주지 않는다. 페니실라민은 SLE 및 다른 자가면역 질환, 특히 중증근무력증(myasthenia gravis)을 유발할 수 있다.

1989년에, 생쥐의 비장세포로부터 수득된 인터루킨-γ(IFN-γ)을 유도하는 엔도톡신-유도된 혈청 활성이 보고되었다(Nakamura et al., 1989). 이런 혈청 활성은 IFN-γ의 직접적인 유도인자일 뿐만 아니라, IL-2 또는 세포분열물질과 함께 보조-자극인자로 작용한다. 엔도톡신-이후 생쥐 혈청으로부터 활성을 정제하려는 시도에서 상동한 50-55 kDa 단백질이 발견되었다. 다른 사이토킨이 IFN-γ 생산에 대한 보조-자극물질로 작용할 수 있기 때문에, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 또는 TNF에 대한 중화 항체가 혈청 활성을 중화시키지 못한다는 것은 이것이 별개의 인자라는 것을 의미한다. 1995년 이들 연자들은 여드름균(P.acnes)으로 선처리된 생쥐의 간 추출물에 IFN-γ 생산을 위한 엔도톡신-유도된 보조-자극물질이 존재함을 입증하였다(Okamura et al., 1995). 상기 모델에서 간 대식세포 개체군(Kupffer 세포)은 증폭되는데, 선처리되지 않은 생쥐에서는 치명적이지 않은 적은 용량의 세균성 리포폴리사카라이드(LPS)가 이들 생쥐에게는 치명적이다. 초기에 IFN-γ-유도 인자(IGIF)로 불렸고, 이후 인터루킨-18(IL-18)로 명명된 이 인자는 1,200g 여드름균(P. acnes)-처리된 생쥐 간으로부터 균질하게 정제되었다. 정제된 IL-18의 아미노산 서열에서 유도된 축중 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 뮤린 IL-18 cDNA을 클론하였다. IL-18은 157개 아미노산으로 구성된 18-19 kDa 단백질로, 데이터베이스상의 임의 펩티드와 명백한 유사성을 보이지 않는다. IL-18 및 인터루킨-12(IL-12)에 대한 메신저 RNA는 Kupffer 세포 및 활성화된 대식세포에서 쉽게 검출된다. 재조합 IL-18은 별도의 과정을 통하여, IL-12보다 더 강하게 IFN-감마를 유도한다(Micallef et al., 1996). 엔도톡신-유도된 혈청 활성과 유사하게, IL-18은 스스로 IFN-γ를 유도하지는 못하고 세포분열물질 또는 IL-2와 함께 보조-자극물질로 주로 작용한다. IL-18은 IL-2-의존성 경로를 통하여 T 세포 증식을 강화시키고, Th1 사이토킨in vitro생산을 강화시키고, 강화된 IFN-γ 생산의 측면에서 IL-12와 병용되면 시너지 효과를 나타낸다(Maliszewski et al, 1990).

뮤린형으로 클론된 IL-18에 대한 사람 cDNA 서열은 1996년에 보고되었다(Ushio et al., 1996).

피해를 입은 조직으로부터 IL-18을 클로닝하고 IL-18 유전자 발현을 조사하여, 이런 사이토킨과 자가면역 질환의 밀접한 연관성이 발견되었다. 비-비만 당뇨병 생쥐(NOD)는 자가면역 인슐린증과 당뇨병이 자발적으로 발병하는데, 이는 사이클로포스파미드를 1회 주사하여 가속화하고 동조시킬 수 있다. IL-18 mRNA는 인슐린증의 초기 단계동안 NOD 생쥐 췌장에서 역전사효소 PCR로 입증되었다. 사이클로포스파미드 처리후 IL-18 mRNA 수준은 급격하게 증가되고, 이후 IFN-γ mRNA 상승 및 당뇨로 진행된다. 흥미롭게도, 이들 동태는 IL-12-p40 mRNA의 동태를 모방하고, 따라서 개별적인 mRNA 수준간의 밀접한 상관관계를 유발한다. 췌장 RNA에서 IL-18 cDNA의 클로닝 및 후속적인 서열화에서, Kupffer 세포와in vivo선-활성화된 대식세포로부터 클론된 IL-18 서열과의 동일성이 확인되었다. NOD 생쥐 대식세포 역시 IL-18 유전자 발현으로 사이클로포스파미드에 반응하지만, 동일하게 처리된 Balb/c 생쥐의 대식세포는 이런 반응을 보이지 않았다. 따라서, 자가면역 NOD 생쥐에서 IL-18 발현은 비정상적으로 조절되고 당뇨병 발생과 밀접하게 연관한다(Rothe et al., 1992).

IL-18은 Th1 세포에서 Fas 리간드의 기능 활성을 증폭하여 면역조절이나 염증에서 잠재적인 역할을 수행한다(Conti et al., 1997). IL-18은 부신피질에서도 발현되고 신경-면역조절물질로 분비되어, 스트레스를 받은 면역계를 조정하는데 중요한 역할을 한다(Chater, 1986).

in vivo에서, IL-18은 프로-IL-18 절단으로 생성되고, 이의 내생적 활성은 여드름균(P. acnes)에서 IFN-γ 생산 및 LPS-매개된 치사를 설명하는 것으로 보인다. 성숙 IL-18은 IL-1β전환효소(IL-1베타-전환효소, ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 만들어진다.

IL-18 수용체는 리간드 결합에서 동시-작동하는 적어도 2개의 요소로 구성된다. 뮤린 IL-12 촉진된 T 세포에서 IL-18에 대한 고-친화성 결합 부위와 저-친화성 결합 부위가 발견되었는데(Yoshimoto et al., 1998), 이는 다중적인 체인 수용체 복합체를 암시한다. 지금까지 2개의 수용체 아단위가 동정되었는데, 이들 둘 모두 IL-1 수용체 계통에 속한다(Parnet et al., 1996). IL-18의 신호 전달에는 NF-κB의 활성화가 관여한다(DiDonato et al., 1997).

최근에, IL-18에 대하여 고친화성을 보이는 가용성 단백질이 사람 소변으로부터 분리되었고, 사람과 생쥐 cDNA가 보고되었다(Novick et al., 1999; WO 99/09063). 상기 단백질은 IL-18 결합단백질(IL-18BP)로 명명되었다.

IL-18BP는 공지된 IL-18 수용체중 한가지의 세포외 도메인이 아닌 분비된 천연 순환 단백질이다. 이는 신규한 분비단백질 군에 속한다. 상기 군에는 IL-18BP에 높은 상동성을 보이는 여러 폭스바이러스-인코드된 단백질이 포함된다(Novick et al., 1999). IL-18BP는 비장에서 구조적으로 발현되고 면역글로불린 대과에 속하며 IL-1 II형 수용체에 제한적인 상동성을 갖는다. 이의 유전자는 사람 크로모좀 11q13에 위치하고, 막통 도메인을 코딩하는 엑손은 8.3kb 게놈 서열에서 발견되지 않았다(Novick et al., 1999).

mRNA 절단접합으로 만들어지고 다양한 cDNA 라이브러리에서 발견되는 IL-18BP의 4가지 사람 동등형과 2가지 생쥐 동등형은 발현시키고 정제하고 결합 및 IL-18 생물활성의 중화를 평가하였다(Kim et al., 2000). 사람 IL-18BP 동등형 a(IL-18BPa)는 빠른 온-레이트(on-rate), 느린 오프-레이트(off-rate), 399 pM의 해리 상수(K(d))로 IL-18에 대하여 가장 높은 친화성을 보였다. IL-18BPc는 29개 C-말단 아미노산을 제외하고 IL-18BPa의 Ig 도메인을 공유한다; IL-18BPc의 K(d)는 10배나 낮다(2.94 nM). 그럼에도 불구하고, IL-18BPa와 IL-18BPc는 과몰량에서 IL-18을 >95% 중화시킨다. IL-18BPb와 IL-18BPd 동등형은 완전한 Ig 도메인이 결핍되고, IL-18과 결합하거나 이를 중화시키는 능력이 부족하다. 동일한 Ig 도메인을 보유하는 뮤린 IL-18BPc와 IL-18BPd 동등형 역시 과몰량에서 뮤린 IL-18을 >95% 중화시킨다. 하지만, 사람 IL-18BPa와 공통된 C-말단 모티프를 공유하는 뮤린 IL-18BPd 역시 사람 IL-18을 중화시킨다. 분자 모델링을 통하여, IL-18BP의 Ig 도메인에서 정전성과 소수성이 혼합된 상당히 큰 결합 위치가 확인되었는데, 이런 결합위치는 리간드에 대한 이의 높은 친화성 결합을 설명할 수 있다(Kim et al., 2000).

1998년에, 인터루킨-18(IL-18)의 발현이 뮤린 접촉 과민증의 병인에 관여하는 것으로 제안되었다(Xu et al., 1998). Xu 등은 옥사졸론을 접촉 알레르기원으로 하는 접촉 과민증의 뮤린 모델을 이용하여, 피부 병소에서 IL-18 발현의 유도를 입증하였다. 최대 상향조절은 알레르기원 공격으로부터 24시간후에 확인되었고, 이후 IL-18 발현이 점진적으로 감소하였다.

IL-18과는 독립적으로 DTH 반응을 유도하는 IL-18의 능력에 관한 추가 보고서가 Kitching et al., 2000에 의해 발표되었다. 하지만, IL-18의 역할은 여전히 불명확한데, 그 이유는 IL-18이 아토피성 피부염 환자에서 잠재적으로 효과적인 치료약물로 보고되었기 때문이다(Habu et al., 2001). 이런 보고는 여러 임상 시험에서 IFN-γ이 아토피성 피부염 증상을 개선한다는 제안과 일관한다(Reinhold et al., 1990; Hanifin et al., 1993).

본 발명의 요약

본 발명은 Ⅳ형 과민증 모델에서 IL-18 저해물질로 생쥐를 치료하면 대조 동물과 비교하여 상기 동물에서 과민 반응이 약화된다는 결과에 기초한다. 따라서, 본 발명은 과민성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. IL-18 저해물질과 인터페론, TNF 저해물질, 염증 저해물질 및/또는 항-알레르기 약물의 병용 역시 본 발명에서 계획한다. 다른 측면에서, 본 발명은 과민성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한다. 또한, 본 발명은 과민성 질환을 예방 및/또는 치료를 위한 IL-18 저해물질을 발현하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.

본 발명은 알레르기 분야에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 과민성 질환, 특히 인체의 지연형 과민 반응을 수반하는 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

도 1에서는 공격동안 IL-18BP 처리가 접촉 과민증(CHS)으로부터 보호를 제공한다는 것을 보여준다. 생쥐는 0일에 등(back)에 DNFB로 감작화시키고, 5일후 귀에 DNFB 공격하였다. 귀 종기는 매일 측정하고 DNFB 공격된 귀 vs. 부형약 처리된 대조 귀의 종기 증가로 표시하였다. 5일 내지 8일에 생쥐당 매일 250㎍ IL-18BP i.p. 처리는 귀 종기(A)를 현저하게 감소시킨 반면, 0일 내지 2일에 처리는 이런 실험 환경(B)(n=5 생쥐/군)에서 보호 효과를 나타내지 않았다. 사각형: IL-18BP 처리된 생쥐, 삼각형: 대조, 즉 염수 처리된 동물.

도 2에서는 19일부터 22일까지 250 ㎍/생쥐/day IL-18BP(열린 사각형) 또는 부형약(채워진 사각형)의 전신 투여되는 지연형 과민증 모델에서, 5일에 첫 번째 합텐 공격과 19일에 두 번째 공격이후 5일부터 30일까지 귀 종기의 정도를 보여준다.

도 3에서는 IL-18BP가 IL-18을 중화시킴으로써 CHS로부터 보호한다는 것을 보여준다. IL-18 결핍성(KO) 생쥐와 야생형 C57BL/6 생쥐는 CHS 반응으로부터 방어 능력을 비교하였다. IL-18 결핍된 생쥐는 야생형 생쥐보다 정도가 덜하긴 하지만 DNFB에 대하여 CHS가 발생하였다. 하지만, IL-18 결핍된 생쥐에서 IL-18BP 처리 효과는 전혀 관찰되지 않았는데, 이는 CHS에서 IL-18BP의 항-염증성 효과가 IL-18의 중화에 기인한다는 것을 시사한다. (n = 5 생쥐/군). 원: IL-18 KO 생쥐에서 염수; 다이아몬드: IL-18 KO 생쥐에서 IL-18BP; 사각형: 야생형(WT) 생쥐에서 IL-18BP; 삼각형: WT 생쥐에서 염수.

도 4에서는 IL-18BP가 CHS동안 혈관 누출을 감소시킨다는 것을 보여준다. CHS는 C57BL/6 생쥐에 유도하였다. CHS 반응에 의해 유발된 부종을 모니터하기 위하여, DNFB 공격으로부터 2시간 앞서 Evans Blue를 i.v. 주사하였다. 생쥐는 24시간후 죽이고, 귀는 가공 처리하여 혈관에서 누출되어 주변 조직에 축적되는 염료를 추출하였다. 혈관 누출은 혈청에서 Evans Blue 농도가 보정된 건조된 귀 조직 ㎎당 염료의 함량으로 평가하고 공격된 귀 vs. 대조 귀의 비율로 표시하였다. 4일과 5일에 IL-18BP 처리가 부형약 처리된 대조의 56%로 종기를 감소시키긴 하지만(좌측 패널, p<0.01), 이들 두 군간 혈관 누출에서 유의한 차이는 없었다. 양 군은 비-감작화된 대조군에 비하여 유의하게 증가된 부종을 보였다(p<0.05와 p<0.01). 추가 대조로서, 생쥐는 동물당 250㎍/day의 무관한 단백질 BSA로 처리하였다. 이들 생쥐는 부형약 처리된 대조 동물과 유사하게 CHS가 발생하였다(n = 10 생쥐/군).

도 5에서는 IL-18BP 처리가 DNFB 공격된 귀의 염증성 침윤을 감소시킨다는 것을 보여준다. CHS는 앞서 밝힌 바와 같이 C57BL/6 생쥐에 유도하였다. 이들 동물은 4일 내지 6일에 IL-18BP 또는 부형약 처리하였다. IL-18BP 처리는 7일에 부형약 대조의 58%로 종기를 감소시켰다. 생쥐는 7일에 죽이고, 공격된 귀는 수거하고 군별(n=8)로 모으며 효소 분해시켜 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포는 CD45 파지티브 생존 세포에서 후속의 FACS 분석 게이팅(analysis gating)으로 특성화시켰다. 귀 조직 표본에서 발견된 αβT 세포, NK 세포, 호중구, 단핵구/대식세포의수는 분석된 전체 세포의 비율로 표시하였다(위쪽 수치). 부형약 대조에 비하여 IL-18BP 처리후 이들 세포 유형의 감소는 아래쪽 도면에 제시한다.

도 6에서는 T 세포 활성화가 IL-18BP 처리 직후에 감소한다는 것을 보여준다. DNFB 공격된 귀로부터 얻은 세포는 플레이트 결합된 항-CD3 항체로 2 x 10⁵/웰로 재-자극하였다. 후속의 24시간 배양 기간동안 IL-18BP는 추가로 첨가하지 않았다. IFNγ생산은 ELISA로 삼중 측정하였다. IL-18BP 처리된 생쥐로부터 얻은 세포는 부형약 처리된 대조 동물로부터 얻은 세포의 배양액에서 발견되는 IFNγ의 45% 정도만을 유도하였다.

도 7에서는 IL-18BP 처리가 귀의 염증성 침윤물에서 IFNγ생산 세포의 수를 감소시킨다는 것을 보여준다. DNFB 공격된 쥐로부터 얻은 세포 조직 표본은 4시간동안 50 ng/㎖ PMA^*와 500 ng/㎖ 이노마이신으로 자극하였다. 사이토킨 분비는 배양의 마지막 2시간동안 2㎍/㎖ 브레펠딘 A를 첨가하여 차단하였다. 이후, 세포는 세포내 IFNγ과 표면 항원에 대한 다색 면역형광 염색을 실시하였다. IL-18BP 처리는 IFNγ 염색에 파지티브한 세포의 총수를 부형약 대조의 78%로 감소시켰다. IFNγ은 CD8 T 세포에 의해 생산되고 CD4 T 세포에 의해 일부 생산되었다. IFNγ은 NK 세포와 αβT 세포에서 탐지되지 않았다. (n.d. 탐지되지 않음;^*포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트).

도 8에서는 IL-18BP 처리가 랑게르한스 세포의 배수 림프절로의 동원을 감소시키지 않는다는 것을 보여준다. 생쥐는 각각 오른쪽과 왼쪽 옆구리에 합텐 FITC또는 부형약 아세톤/디부틸프탈레이트(1:1)를 도포하였다. 샅고랑 림프절(inguinal lymph nodes)은 도포 24시간후 수거하였다. 합텐 공액된 랑게르한스 세포는 FACS에 의해, FITC 도포된 옆구리를 배수하는 림프절에서 FITC+, CD11c+ 세포로 탐지되지만, 부형약 도포된 옆구리를 배수하는 반대측 림프절에서는 탐지되지 않았다. 배수 림프절에서 합텐-보유 랑게르한스 세포의 비율은 도포로부터 24시간과 1시간 앞서 IL-18BP로 처리된 동물에서, 전체 림프절 세포의 1.2%이었다. 이는 대조 처리된 동물에서 얻은 숫자와 별다른 차이가 없었다(n=5 배수 림프절/군).

본 발명은 IL-18 저해물질이 Ⅳ형 과민증의 뮤린 모델에서 합텐 공격으로부터 회복에 유익한 효과를 보인다는 조사결과에 기초한다.

따라서, 본 발명은 과민성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

본원에서, "과민성 질환"과 "알레르기 질환"은 동의어로 사용된다. 양 용어는 부적절한 적응 면역으로 유발되는 질환이나 반응에 관한다. 과민 반응은 염증 반응과 조직 손상을 유발하는 외래 항원, 예를 들면 환경적 거대 분자에 부적절하게 작용하는 정상 상태에서는 유익한 면역 반응에 기인한다. 과민성 질환에서 정상적으로 무해한 자극인 알레르기원이 면역 반응을 유발하고, 이는 재-노출직후 재-활성화되어 병리학적 손상을 초래한다.

과민성 질환 및 이들의 임상적 증상과 결과는 "배경기술"에서 상세하게 설명하였고, 본 발명에 따른 용도는 본원에 언급된 과민성 질환에 관하지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 과민성 질환은 I형 과민성 반응과 연관된 질환, Ⅱ형 과민성 반응과 연관된 질환, Ⅲ형 과민성 반응과 연관된 질환, Ⅳ형 과민성 반응과 연관된 질환에서 선택된다.

I형 과민성 반응과 연관된 질환은 즉시형 과민증 또는 일반 알레르기라고 한다. 과민증은 IgE-매개된다. 즉시형 과민(I형) 반응은 비만 세포 또는 호염기구에서 항원과 IgE 간의 결합에 기인한다. I형 과민반응 질환은 아토피 질환으로 불리는데, 여기에는 예로써 알레르기성 관절염, 알레르기성 결막염, 아토피성 피부염, 알레르기성 외부 천식, 두드러기, 전신 아나필락시스 등이 포함된다. 아나필락시스는 I형(즉시형) 과민증에 기인하는 매우 심각한 알레르기 반응이다.

Ⅱ형이나 세포독성 과민증은 항체, 보체 및/또는 세포 기전에 의해 매개되는 세포용해 작용을 수반한다. 세포-결합된 항원(Ⅱ형)에 대한 항체는 보체를 활성화시키거나 또는 식세포작용을 촉진함으로써 세포 파괴를 유발한다. 본 발명의 범주에 속하는 Ⅱ형 과민증 질환은 Coombs-파지티브 용혈성 빈혈, 항체-유도된 혈소판 감소성 자반증, 백혈구 감소증, 천포창, 유천포창, 구드패스츄어 증후군, 악성 빈혈 등이다. 이들 반응은 부적합한 수혈, 신생아의 용혈성 질환, 신생아 혈소판 감소증에서 발생하며, 다기관 과민성 질환(예, 전신 홍반성 낭창, SLE)에서도 부분적으로 역할한다.

Ⅲ형 과민성 질환은 항체가 항원과 면역 복합체를 형성하는 반응을 수반한다. 순환 복합체는 보체를 활성화시키고 적혈구에 유착하며, 이후 비장에서 식작용되고 순환계를 이탈하며 조직 공간에서 염증을 유발한다. 이런 반응은 아르투스 반응이라 한다. 대안으로, 복합체는 대식세포에 의해 식작용되고, 상기 대식세포는 항원을 제시하고 사이토킨을 방출하며 B와 T-세포를 활성화시킨다. IgE, IgA, IgG, IgM 모두 항원과 복합체를 형성한다. Ⅲ형 반응은 조직, 특히 피부, 관절, 신장에서 면역 복합체의 급격한 촉진에 기인한다. 만성 면역 복합체 신염은 사람에서 발생하는 사구체신염 사례의 대부분을 차지한다. 본 발명에서 Ⅲ형 과민성 질환은 혈청, 약물 또는 간염 바이러스 항원에 기인하는 혈청병; 전신 홍반성 낭창; 류머티스 관절염(RA); 다발성 동맥염; 크리오글로불린혈증; 과민성 폐렴; 기관지폐 아스페르길루스증; 급성 사구체신염; 만성 막증식성 사구체신염; 연관된 신장 질환이다.

Ⅳ형 과민성 질환은 세포-매개된 반응을 수반하고 발병하는데 12시간 이상의 시간이 소요된다. Ⅳ형 과민성 질환은 염증을 수반하며, 이의 결과는 만성 염증성 질환이다. Ⅳ형 과민증은 지연형 과민증(Ⅳ형) 또는 DTH로 불린다. T-세포가 일차 노출에 의해 일단 감작화되면, 이차 공격에서 지연형 과민 반응이 유도된다. 이런 반응은 임상적으로 발생하는데 2-3일이 소요되는 국소 염증 반응이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 과민성 질환은 지연형 과민증이다. 따라서, 본 발명은 Ⅳ형 반응이 중요한 역할을 하는 모든 임상적 질환, 예를 들면 지연형 과민증, 피부염, 접촉피부염, 과민성 폐렴, 동종이식편 거부반응, 세포내 미생물에 기인한 육아종, 일부 약물 민감증, 갑상선염, 광견병 백신접종후 뇌척수염에관한다.

DTH는 바이러스, 진균, 특정 박테리아, 특히 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 나균(Mycobacterium leprae)의 감염에 대한 정상적인 세포-매개된 면역 반응에 기인한다. DTH를 유도하는 다른 외부 물질은 식물, 동물, 곤충 또는 파충류 분비물; 화학적 항원; 또는 생화학적 항원일 수 있다. 이들은 합성이나 자연 출처로부터 유래될 수 있다. 수술용 장갑에 사용되는 라텍스와 같은 다양한 유형의 섬유, 직물 등이 특정 개체에서 T-세포 매개된 과민 반응을 유발할 수 있다. 외부 원인 물질은 예로써 주변 환경, 광산, 야금 공장, 화학물질 제조 공장에서 마주치는 수인성 물질, 예를 들면 분해된 염과 미네랄일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 과민성 질환은 접촉 피부염 또는 접촉 과민증이다. 일종의 Ⅳ 반응인 접촉 피부염은 작업이나 다른 항원에 대한 반응이다. 접촉 피부염을 유발하는 물질은 상대적으로 저분자량(<1kD)이고 자체적으로 비-면역원성이지만, 피부나 조직 단백질에 공유 결합하는 고활성 분자이다. 이런 감작화 화학물질은 합텐으로 알려져 있는데, 이는 담체인 호스트 단백질과 결합한다. 접촉 피부염을 유도하는 많은 합텐이 공지되어 있다. 임의의 감작물질에 대한 접촉 피부염이 개체에서 발병하는 지를 확인하기 위하여, 의심되는 접촉 감작물질은 환자 등에 도포하고 48시간동안 덮어둔다. 반응 부위는 2시간과 24시간후 검사한다. 파지티브 반응으로 검사 부위에 염증과 경화가 나타난다.

또한, 지연된 과민증은 이식된 검사 장기의 거부반응을 결정하는 핵심적인 기전이며, 따라서 본 발명은 이식편 거부반응의 예방을 위한 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

본 발명에서 "IL-18 저해물질"은 IL-18 생산 및/또는 작용을 약화시키거나, 감소시키거나, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방이나 차단하는 방식으로 IL-18 생산 및/또는 작용을 조절하는 임의의 분자를 의미한다. "IL-18 저해물질"에는 IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 작용의 저해물질이 포함된다.

생산 저해물질은 IL-18의 합성, 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자, 예를 들면 ICE 저해물질일 수 있다. 본 발명에 따른 저해물질은 예로써 인터루킨 IL-18 유전자의 발현 저해물질; IL-18 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 안티센스 mRNA 또는 상기 mRNA의 분해를 유도하는 리보자임; 정확한 접힘을 손상시키는 단백질; IL-18의 분비를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방하는 단백질; IL-18을 분해시키는 프로테아제 등일 수 있다.

IL-18 작용의 저해물질은 IL-18 길항물질, 예를 들면 IL-18BP일 수 있다. 길항물질은 리간드(예, 수용체)에 대한 IL-18 결합을 주도하는 IL-18 또는 IL-18 결합부위를 부분적으로 혹은 실질적으로 중화시킬 수 있을 정도로 충분한 친화성과 특이성으로 IL-18 분자와 결합하거나 이를 격리시킬 수 있다. 길항물질은 IL-18/수용체 결합 직후에 세포내에서 활성화되는 IL-18 신호전달 경로를 저해할 수도 있다.

IL-18 작용의 저해물질은 가용성 IL-18 수용체나 이를 모방하는 분자; IL-18 수용체를 차단하는 작용제; 다클론이나 단클론 항체와 같은 IL-18 항체; 또는 표적에 대한 IL-18의 결합을 예방하는 임의의 작용제나 분자일 수도 있는데, 이들은IL-18에 의해 매개되는 세포내 혹은 세포외 반응을 감소시키거나 또는 이의 유인을 예방한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 카스파제-1 저해물질(ICE), IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택된다.

본원에서 "IL-18 결합단백질"은 "IL-18BP 결합 단백질"또는 "IL18BP"와 동의어로 사용된다. 여기에는 Kim et al., 2000에 정의된 IL-18에 결합하는 IL-18 결합단백질의 절단접합 변이체 및/또는 동등형을 비롯하여 WO 99/09063 또는 Novick et al., 1999에 정의된 IL-18 결합단백질이 포함된다. 특히, 본 발명에서 IL-18BP의 사람 동등형 a와 c가 유용하다. 본 발명에 효과적인 단백질은 당화되거나 또는 당화되지 않을 수 있고, 천연 공급원(예, 소변)으로부터 유래되거나 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 재조합 발현은 원핵 발현계(예, 대장균(E. coli)) 또는 진핵, 특히 포유동물 발현계에서 실시할 수 있다.

본원에서 "뮤테인"은 IL-18BP의 유사체 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유사체를 말하는데, 여기서 고유 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 하나이상의 아미노산 잔기가 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 고유 서열에 부가되는데, 이때야생형 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP과 비교하여 생성된 산물의 능력에는 큰 변화가 없어야 한다. 이들 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 적합한 다른 공지된 기술을 활용하여 만들 수 있다.

본 발명에 따른 뮤테인에는 엄격한 조건하에 핵산, 예를 들면 본 발명에 따른 IL-18BP 또는 바이러스 IL-18BP를 인코드하는 DNA 혹은 RNA와 혼성화되는 DNA 혹은 RNA에 의해 인코드되는 단백질이 포함된다. "엄격한 조건"은 혼성화 및 후속 세척 조건을 의미한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., &&6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al., supra. 제한없이, 엄격한 조건의 예에는 조사중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 12-20℃ 낮은 세척 조건, 예를 들면 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분동안 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS가 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 이용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.).

동일성은 서열을 비교하여 확정된 2개이상 폴리펩티드 서열 또는 2개이상 폴리뉴클레오티드 서열간의 상관관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열 범위에서 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 각각 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다.

정확하게 일치하지 않는 서열에서, "동일성 %"를 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열은 정렬시켜 서열간의 최대 상관을 제공한다. 정렬의 정도를 향상시키기 위하여 한 서열이나 양 서열에 "틈새(gap)"를 삽입할 수 있다. 동일성 %는 비교되는 각 서열의 전체 범위(소위, 전역정렬)(동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 적합), 또는 좀더 짧고 한정된 범위(소위, 국부정렬)(동등하지 않은 길이의 서열에 적합)에서 측정할 수 있다.

2개이상 서열의 동일성과 상동성을 비교하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1(Devereux J et al., 1984)에서 가용한 프로그램, 예를 들면 BESTFIT와 GAP 프로그램을 이용하여 두 폴리뉴클레오티드 서열간 동일성 % 및 두 폴리펩티드 서열간 동일성 %와 상동성 %를 측정할 수 있다. BESTFIT에서는 Smith와 Waterman의"국부 상동성(local homology)" 알고리즘(1981)을 이용하여 두 서열간 가장 유사한 단일 영역을 찾는다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램은 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 BLAST 계통의 프로그램(Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, NCBI 홈페이지: www. ncbi.nlm.nih.gov에서 입수가능)과 FASTA(Pearson W R, 1990; Pearson 1988)이다.

임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-18BP와 실제로 유사한 활성을 가진다. IL-18BP의 한가지 활성은 IL-18에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 IL-18에 대하여 실제적인 결합 활성을 보유하는 경우에 이는 친화성 크로마토그래피와 같은 수단으로 IL-18의 정제에 사용될 수 있고, IL-18BP와 실제 동일한 활성을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 통상적인 실험 방법으로 임의의 뮤테인이 IL-18BP와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험 방법은 적절히 라벨된 IL-18과 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면 방사성면역분석 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다.

바람직한 구체예에서, 임의의 이런 뮤테인은 WO 99/09063에 정의된 바와 같이 IL-18BP 또는 바이러스-인코드된 IL-18BP 상동체의 서열과 적어도 40% 동일성이나 상동성을 보유한다. 적절하게는, 이는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성이나 상동성을 보유한다.

본 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드 혹은 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인, 또는 이들을 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 교시에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.

본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변화는"보존성"치환이다. IL-18BP 폴리펩티드나 단백질 또는 바이러스성 IL-18BP의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974). 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(예, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 목적에 포함된다.

바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.

표 1

바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산동질성 군

SerSer, Thr, Gly, Asn

ArgArg, Gln, Lys, Glu, His

LeuIle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

ProGly, Ala, Thr, Pro

ThrPro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

AlaGly, Thr, Pro, Ala

ValMet, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

GlyAla, Thr, Pro, Ser, Gly

IleMet, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

PheTrp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

TyrTrp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

CysSer, Thr, Cys

HisGlu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn Gln, Asp, Ser, Asn

LysGlu, Gln, His, Arg, Lys

AspGlu, Asn, Asp

GluAsp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

MetPhe, Ile, Val, Leu, Met

Trp Trp

표 2

좀더 바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산동질성 군

SerSer

ArgHis, Lys, Arg

LeuLeu, Ile, Phe, Met

ProAla, Pro

ThrThr

AlaPro, Ala

ValVal, Met, Ile

GlyGly

IleIle, Met, Phe, Val, Leu

PheMet, Tyr, Ile, Leu, Phe

TyrPhe, Tyr

CysCys, Ser

HisHis, Gln, Arg

GlnGlu, Gln, His

AsnAsp, Asn

LysLys, Arg

AspAsp, Asn

GluGlu, Gln

MetMet, Phe, Ile, Val, Leu

TrpTrp

표 3

가장 바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산동질성 군

SerSer

ArgArg

LeuLeu, Ile, Met

ProPro

ThrThr

AlaAla

ValVal

GlyGly

IleIle, Met, Leu

PhePhe

TyrTyr

CysCys, Ser

HisHis

GlnGln

AsnAsn

LysLys

AspAsp

GluGlu

MetMet, Ile, Leu

TrpMet

본 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드나 단백질의 뮤테인, 또는 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환체의 생산 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다.

"융합단백질"은 예로써 체액에서 연장된 체류 시간을 갖는 다른 단백질과 융합되는 IL-18BP, 바이러스성 IL-18BP 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-18BP 또는 바이러스성 IL-18BP는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린이나 이의 단편과 융합될 수 있다.

본원에서 "기능성 유도체"에는 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본 발명에 포함된다.

가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 감추고 체액에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르; 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드; 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.

본 발명에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질의 "활성 분획물"에는 단독으로 또는 관련된 분자나 여기에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체)와 결합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되지만, 이런 분획물은 IL-18BP와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.

본원에서 "염"은 IL-18 저해물질 분자 또는 이의 유사체의 카르복실기의 염과 아미노기의 산첨가염을 의미한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 방법으로 생성될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철, 아연 등과 같은 무기 염기로 형성된 염 및 아민, 예를 들면 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산 첨가염에는 예로써 무기산, 예를 들면 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 이들 염은 본 발명에 적합한 IL-18 저해물질의 생물학적 활성을 보유해야 한다, 예를 들면 DTH에 대한 유익한 효과를 보여야 한다.

본원의 다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 항체다. 항-IL-18 항체는 다클론이나 단클론, 키메라, 인화 또는 사람 항체이다. 재조합 항체와 이의 단편은 생체내에서 IL-18에 대한 높은 친화성 결합 및 낮은 독성으로 특성화된다. 본 발명에 사용될 수 있는 항체는 낮은 독성으로 병원성 질환이나 이와 관련된 여러 증상을 효과적으로 저하 또는 완화시킬 만큼 충분한 기간동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특성화된다.

중화 항체는 IL-18 면역주사로 토끼, 염소 또는 생쥐와 같은 동물에서 생성시킨다. 면역화 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특히 유용한데, 상기 하이브리도마는 배양하여 다량의 항-IL-18 단클론항체를 생산한다.

키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개이상의 분절 또는 일부분으로 특성화되는 면역글로불린 분자이다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 포유동물 항체, 예를 들면 뮤린 단클론항체로부터 유래되고, 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 가급적, 양 영역 및 이들의 조합은 낮은 면역원성을 갖는다(Elliott et al., 1994). 인화 항체는 유전공학 기술로 만들어진 면역글로불린 항체인데, 여기서 뮤린 불변 영역은 사람 불변 영역으로 대체되고 뮤린 항원 결합 영역은 계속 유지된다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 낮은 면역원성 및 향상된 약동학을 보유한다(Knight et al., 1993).

따라서, 다른 바람직한 구체예에서 IL-18 항체는 인화 IL-18 항체이다. 바람직한 항-IL-18 인화 항체의 예는 유럽 특허 출원 EP 0 974 600에서 기술한다.

다른 바람직한 구체예에서, IL-18 항체는 완전한 사람 항체다. 사람 항체를 생산하는 기술은 WO 00/76310, WO 99/53049, US 6,162,963 또는 AU5336100에서 자세히 기술한다. 바람직한 완전 사람 항체는 기능성 사람 Ig 좌위의 전체 또는 일부분을 포함하는 외래유전자도입 동물, 예를 들면 외래유전자도입 생쥐에서 만들어진 재조합 항체이다.

본 발명의 좀더 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18BP, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 이들의 원형 순열된 유도체이다. 이들 동등형, 뮤테인, 융합단백질 또는 기능성 유도체는 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 유지하고, IL-18BP와 적어도 유사한 활성을 보유한다. 이상적으로는, 이런 단백질은 변형되지 않은 IL-18BP와 비교하여 상승된 생물학적 활성을 갖는다. 적절한 활성 분획물은 IL-18BP의 활성보다 좀더 높은 활성을 보유하거나, 추가적인 장점, 예를 들면 좀더 높은 안정성 혹은 좀더 낮은 독성이나 면역원성을 보유하거나, 또는 좀더 용이하게 대량 생산되거나 정제된다.

IL-18BP 및 이의 절단접합변이체/동등형의 서열은 Kim et al., 2000 뿐만 아니라, WO 99/09063이나 (Novick et al., 1999)에서 얻을 수 있다.

IL-18BP의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질의 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에서 내약성, 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, IL-18BP는 예로써 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합시킨다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 밝힌 방법으로 실시할 수 있다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 기능성 유도체는 아미노산 잔기에서 하나이상의 측쇄로 나타나는 한가지이상 기능기(functional group)에 부착되는 적어도 일부분을 포함한다. 이런 부분이 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 구체예가 매우 바람직하다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 면역글로불린 융합을 포함한다, 다시 말하면 IL-18 결합단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 융합단백질이고, 이는 면역글로불린의 전체 또는 일부분과 융합된다. 면역글로불린 융합 단백질을 제조하는 방법은 당분야, 예를 들면 WO 01/03737에 공지되어 있다. 본 발명의 생성된 융합단백질은 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합을 계속 유지한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 좀더 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 예를 들면 IL-18BP 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly- Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 체류 시간(반감기) 연장, 특이적 활성 증가, 발현 수준 증가 또는 융합단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.

바람직한 구체예에서, IL-18BP는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 예로써 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. IL-18BP 및 면역글로불린의 일부분으로 구성되는 특이적 융합단백질의 생산은 WP 99/09063에서 기술한다. Ig 분자의 다른 동등형은 본 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면 동등형 IgG₂혹은 IgG₄, 또는 다른 Ig(IgM이나 IgA)의 생산에도 적합하다. 가령, 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 또는 동종-)일 수 있다.

인터페론은 바이러스 복제와 세포 증식에 대한 저해 효과로 잘 알려져 있다.가령, 인터페론-γ는 면역과 염증 반응을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 인터페론 β(IFN-β, I형 인터페론)는 항-염증 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명은 과민성 질환의 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질과 인터페론의 병용에 관한다.

인터페론은 또한, 중합체에 공액시켜 이런 단백질의 안정성을 향상시킬 수도 있다. 인터페론-β와 폴리올 폴리에틸렌글리콜(PEG)간의 공액체는 예로써 WO 99/55377에서 기술한다.

본원의 다른 바람직한 구체예에서, 인터페론은 인터페론-β(IFN-β), 바람직하게는 IFN-β1a이다.

IL-18 생산 및/또는 작용의 저해물질은 인터페론과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, IL-18 저해물질은 TNF 길항물질과 병용한다. TNF 길항물질은 여러 방식으로 활성을 나타낸다. 먼저, 길항물질은 TNF 수용체 결합을 담당하는 TNF 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 TNF 분자 자체와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, "격리 길항물질"). 격리 길항물질은 예로써 TNF에 대한 항체일 수 있다.

대안으로, TNF 길항물질은 TNF 결합이후에 세포표면 수용체에 의해 활성화되는 TNF 신호 경로를 저해할 수 있다(이후, "신호 길항물질"). 이들 길항물질은 과민성 질환의 치료에서 단독으로 사용하거나 또는 IL-18 저해물질과 병용한다.

TNF 길항물질은 시험관내에서 영향을 쉽게 받는 세포주, 예를 들면 TNF가 증식과 면역글로불린 분비를 유발하는 사람 B 세포에서 고유 TNF의 활성에 대한 효과를 일반적인 후보 스크리닝으로 확인하고 평가한다. 상기 분석에는 다양하게 희석된, 예를 들면 분석에 이용된 TNF 몰농도의 0.1 내지 100배 몰농도의 후보 길항물질의 TNF 제형 및 TNF가 없거나 길항물질만 있는 대조군이 포함된다(Tucci et al., 1992).

격리 길항물질은 본 발명에 사용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 격리 길항물질 중에서, 높은 친화성으로 TNF와 결합하고 낮은 면역원성을 보유하는 폴리펩티드가 바람직하다. 가용성 TNF 수용체 분자 및 TNF에 대한 중화 항체가 특히 바람직하다. 가령, 가용성 TNF-RI과 TNF-RII가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 또는 이들의 기능성 일부분을 포함하는 이들 수용체의 절두형은 본 발명에 특히 바람직한 길항물질이다. 절두된 가용성 TNF I형 수용체와 II형 수용체는 EP914431에 기술한다.

TNF 수용체의 절두형은 가용성이고 소변과 혈청에서 30kDa와 40kDa TNF 저해 결합단백질로 검출되는데, 이들은 각각 TBPI과 TBPII라고 한다(Engelmann et al., 1990). 본 발명에서 TNF 길항물질 및/또는 인터페론과 IL-18 저해물질의 동시, 순차적 또는 개별적 사용이 바람직하다.

본 발명에 따라, TBPI과 TBPⅡ는 IL-18 저해물질과 병용되는 바람직한 TNF 길항물질이다.

수용체의 분자의 유도체, 단편, 영역, 생물학적 활성 부분은 본 발명에 사용될 수 있는 수용체 분자와 기능적으로 유사하다. 수용체 분자의 이런 생물학적 활성 균등물이나 유도체는 폴리펩티드, 또는 수용체 분자를 인코드하는 서열의 일부분을 의미하는데, 이는 충분한 크기를 가지며 막-결합된 TNF 수용체와의 상호작용을 저해 혹은 차단하는 정도의 친화성으로 TNF와 결합할 수 있다.

다른 적절한 구체예에서, 사람 가용성 TNF-RI(TBPI)는 본원 발명에 따라 사용되는 TNF 길항물질이다. 고유와 재조합 가용성 TNF 수용체 분자 및 이들의 생산 방법은 유럽 특허 EP308 378; EP 398 327; EP 433 900에서 기술한다.

IL-18 저해물질은 TNF 저해물질과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.

본원의 다른 바람직한 구체예에서, 약제는 항-염증제, 예를 들면 NSAID(비-스테로이드성 항-염증 약물)을 추가로 함유한다. 바람직한 구체예에서, COX-저해물질, 좀더 바람직하게는 COX-2 저해물질은 IL-18 저해물질과 병용된다. COX-저해물질은 당분야에 공지되어 있다. 특이적인 COX-2 저해물질은 예로써 WO 01/00229에서 개시한다. 이들 활성 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.

과민성 반응은 항-알레르기 약물, 예를 들면 항히스타민제, 크로몰린, 글루코코르티코이드 또는 교감신경흥분자극제로 주로 치료된다. 따라서, 본 발명은 IL-18 저해물질과 항-알레르기 약물로 구성되는 복합 요법에 관한다. 본 발명에서 항히스타민제, 크로몰린, 글루코코르티코이드 및/또는 교감신경흥분자극제와 IL-18 저해물질의 동시, 순차적 또는 개별적 사용이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략0.0001 내지 1000 ㎎, 대략 0.001 내지 100 ㎎, 대략 0.01 내지 10 ㎎, 0.1 내지 5 ㎎, 또는 1 내지 3 ㎎ 함량으로 사용된다.

적절하게는, 본원 발명에 따른 IL-18 저해물질은 국소 투여된다. 가령, 접촉 피부염의 경우에, IL-18 저해물질은 피부의 병든 부위에 직접 투여된다.

본 발명의 다른 구체예에서, IL-18 저해물질은 전신, 바람직하게는 피하 또는 근육내 투여된다.

더 나아가, 본원 발명은 과민성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, IL-18 저해물질이 필요한 부위에 이를 전달하는데 유전자 치료 방식이 고려된다. 과민성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위하여, IL-18 저해물질의 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터는 병든 조직에 직접 주사하여, 유전자 치료 벡터의 전신 투여와 관련된 문제, 예를 들면 벡터의 희석, 표적 세포나 조직으로의 도달과 표적화, 부작용 등을 회피할 수 있다.

정상 상태에서는 IL-18 저해물질의 발현이 중단되는 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 못하는 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본 발명에 포함된다. 상기 벡터는 IL-18 저해물질을 발현하도록 소요의 세포에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서일 수 있다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입할 수 있는데, 여기서 이런 조절 서열은 발현을 유도 혹은 강화시켜야 하는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 "내생적 유전자활성화(EGA)"라 한다(WO 91/09955).

당업자가 인지하는 바와 같이, IL-18 저해물질을 사용하지 않고 동일 기술로 IL-18 발현을 직접적으로 차단하는 것도 가능하다. 이를 위하여, 네거티브 조절 요소(예, 억제 인자)를 IL-18의 유전자 좌위에 도입하여 IL-18 발현의 하향-조절 또는 예방을 결과할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, IL-18 발현의 이런 하향-조절 또는 억제는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 IL-18 저해물질의 사용과 동일한 효과를 갖는다.

또한, 본 발명은 과민성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.

또한, 본 발명은 과민성 질환의 예방 및/또는 치료에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관하는데, 이는 치료요법적 효과량의 IL-18 저해물질 및/또는 치료요법적 효과량의 인터페론 및/또는 제약학적 효과량의 TNF 저해물질 및/또는 제약학적 효과량의 함-알레르기제, 특히 항-히스타민제로 구성된다.

IL-18 저해물질로서 상기 조성물은 카스파제-1 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18 길항물질 및 IL-18 결합단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 동일 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체를 함유할 수 있다.

IL-18BP와 이의 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 원형 순열된 유도체는 이런 제약학적 조성물의 바람직한 활성 성분이다.

제약학적 조성물에 포함되는 인터페론은 IFN-β이다.

다른 바람직한 구체예에서, 제약학적 조성물은 TNF 알파의 치료요법적 효과량을 함유한다. 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 하나이상의 COX-저해물질을 추가로 함유할 수 있다.

"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형으로 만들 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반제와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여할 수 있다.

장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반제(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.

본 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).

치료요법적 효과량의 활성 단백질은 길항물질의 유형, IL-18에 대한 길항물질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔기의 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 IL-18 활성의 비-독성 수준 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.

"치료요법적 효과량"은 IL-18의 생물학적 활성을 저해하는 IL-18 저해물질 복용량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 IL-18 저해물질 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 개체에서 IL-18의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.

본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 100 ㎎, 대략 0.01 내지 10 ㎎, 대략 0.1 내지 5 ㎎, 1 내지 3 ㎎, 또는 2 ㎎ 함량으로 사용된다.

본 발명에서 바람직한 투여 루트는 피하 루트를 통한 투여이다. 본 발명에서 다른 바람직한 투여 경로는 근육내 투여이다. IL-18 저해물질을 작용 부위에 직접 투여하기 위하여, 이를 국소 투여하는 것도 바람직하다.

다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 매일 또는 격일로 투여된다.

일일 복용량은 분할 분량으로 또는 소요 결과를 달성하는데 효과적인 서방 형태로 제공된다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기량 또는 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 복용량으로 실시될 수 있다. 2차 또는 후속 투여는 발병 동안 또는 발병에 앞서 투여될 수 있다.

본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 예방이나 치료 목적으로 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약물(예, 다중 약물 요법), 특히 인터페론 및/또는 TNF 저해물질 및/또는 다른 항-염증제, 예를 들면 COX 저해물질 및/또는 항-알레르기 약물에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료제와 동시에 투여되는 활성 약물은 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질 및/또는 인터페론 및/또는 TNF 길항물질 및/또는 COX 저해물질의 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 혼합하는 단계로 구성된다.

또한, 본 발명은 과민성 질환을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질의 제약학적 효과량을 병든 환자에 투여하는 단계로 구성된다.

본원의 상세한 설명에 비추어, 본 발명은 과도한 실험없이 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 광범위한 등가의 파라미터, 농도, 조건에서 동일하게 실시할 수 있다.

본 발명을 특정 구체예와 연계하여 기술하였지만, 추가적인 개변이 가능하다. 본 출원에는 본 발명의 원칙을 전반적으로 따르고 본 발명이 속하는 분야의당업자가 용이하게 유추할 수 있는 본 발명의 임의 변용, 활용 또는 적용이 포함된다.

논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 특허 혹은 외국 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면 모든 데이터, 표, 도면 및 언급된 자료에 제시된 참고문헌은 여기에 순전히 참고로 한다.

공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 설시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다. 이에 덧붙여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체내용은 순전히 참고로 한다.

특정 구체예의 전술한 설명에서는 본 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이런 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 개시된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에서 사용된 용어는 본원을 설명하기 위한 것으로, 이를 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.

실시예 1 : IL-18BP 치료는 접촉 과민증을 감소시킨다.

방법

실험적으로 유도된 접촉 과민증(CHS)의 뮤린 모델이 아래의 모든 실시예에 이용되었다. CHS의 정도는 국소 도포된 감작물질에 대한 귀 종기 반응으로 측정한다.

도 1 내지 3에 제시된 데이터를 작성하는데 이용된 생쥐 귀-종기 검사는 기존 문헌에 상세하게 기술되었다(Garrigue et al., 1994). 간단히 말하면, 생쥐는 아세톤/올리브 오일(4:1)에 녹인 25㎕의 0.5% 2,4-디니트로플루오르벤젠(DNFB; Sigma Chemical Co.) 용액을 면도된 복부에 도포하여 국소적으로 감작화시켰다(0일). 5일후, 동일 부형약에 녹인 20㎕의 0.2% DNFB는 오른쪽 귀에 도포하고, 부형약 단독은 왼쪽 귀에 도포하였다.

생쥐는 5일부터 8일까지 250 ㎍/생쥐/day의 rhIL-18BP(재조합 사람 IL-18BP) 또는 대조군에서 염수를 매일 복강내(i.p.) 섭취하거나(도 1A), 또는 0일 내지 2일에 IL-18BP를 섭취하였다(도 1B).

귀 두께는 다이알 두께 게이지(Mitutoyo Corp., Kawasaki, Japan)로 측정하고, 귀 종기는 공격후 수치에서 공격전 수치를 감하고 부형약-공격된 반대측 귀에서 탐지된 귀 종기를 추가로 감하여 산정하였다.

각 종기는 0일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 12일, 14일, 16일에 측정하였다.

도 4 내지 6에 제시된 데이터를 작성하는 데에는 다른 모델이 이용되었다. 2,4-디니트로플루오르벤젠(DNFB)에 대하여 실험적으로 유도된 접촉 과민증(CHS)동안 IL-18을 중화시키는데 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)을 사용하였다. 실험 구성은 아래와 같다:

1. 0일: 감작화

면도된 등(back)에 25㎕ DNFB(아세톤/올리브 오일(4/1)에서 0.5%)

2. 5일: 공격

우측 귀의 등부와 복부에 각각 5㎕ DNFB(0.2%)

좌측 귀의 등부와 복부에 각각 5㎕ 부형약

3. 6일: 판독

염증의 척도로 귀 두께를 모니터한다.

공격된 귀 vs. 대조 귀의 종기[㎛]에서 증가로 스코어를 표시한다.

4. 6일 또는 7일: 분석을 위한 귀 가공 처리

상기 모델에서, 종기는 6일과 7일에 최고이다. IL-18은 0일, 1일, 2일에 감작화동안, 또는 4일, 5일, 6일에 공격동안 동물당 250㎍ IL-18BP(염수에서)의 매일 주사로 중화시킨다.

결과

접촉 과민 반응(CHS)은 T 세포에 의해 매개되는 합텐-특이적 피부 염증이다. 대부분의 합텐은 주로 CD8⁺주효체 T 세포로 구성되는 올리고클로날 T-세포 반응을 유도하는 반면, CD4⁺T 세포는 CHS 반응에서 하향조절을 역할한다(Bour, H., et al. 1995; Grabbe et al., 1998). CHS에서 IL-18의 역할을 검사하기 위하여, 생쥐는 DNFB로 피내단자 감작화시키고, 5일후 귀 피부에 합텐 도포하였다. 합텐 공격과 동시에, 생쥐는 250 ㎍/생쥐/day rhIL-18BP 또는 염수를 i.p. 주사하였다. IL-18BP, 또는 염수(대조)는 첫 번째 DNFB 감작화(0일)이후 5일부터 8일까지 3일동안 매일 투여하였다. 5일에 DNFB 공격은 양 군에서 귀 종기를 현저하게 증가시켰다(도 1A). 염수(삼각형)로 처리된 생쥐에서 종기의 정도는 IL-18BP(사각형)로 처리된 생쥐에서보다 훨씬 현저하였고, 9일에는 거의 정상 상태로 회복되었다.

0일 내지 2일에 IL-18BP 치료에서 관찰되는 귀 종기의 변화는 통계학적으로 유의하지 않았다(도 1B). IL-18BP 투여의 시기는 IL-18BP의 유익한 효과를 달성하는데 중요한 인자로 생각된다.

결론:

이와 같은 접촉 과민증/접촉 피부염의 확립된 뮤린 모델에서, IL-18 저해물질로 3일 치료는 합텐 처리로 유도된 종기/염증의 정도에 현저하게 유익한 효과를 보였다.

실시예 2 : IL-18BP 치료는 2차 공격후 접촉 과민증을 감소시킨다.

방법

C57BL/6 생쥐는 면도된 복부에 25㎕의 0.5% DNFB 용액의 피내단자 투여로 감작화시켰다(0일). 생쥐는 5일에 귀에 20㎕의 0.2% DNFB로 1차 공격을 받았다. 19일에, 생쥐는 DNFB로 2차 공격을 받았다. 귀 종기는 0일(합텐 감작화), 5일(1차 합텐 공격), 6일, 7일, 8일, 9일, 12일, 14일, 16일, 19일(2차 합텐 공격), 20일, 21일, 22일, 23일, 26일, 28일, 30일에 측정하였다. SD에서 각 군의 평균 수치는 도 2에 제시한다. 생쥐는 250㎍/생쥐/day IL-18BP i.p.(n = 5; 도 2, 열린 사각형) 또는 염수(n = 5; 도 2, 19일부터 23일까지 닫힌 사각형)로 매일 처리하였다.

결과

도 2에 도시된 바와 같이, IL-18BP-치료는 특히 합텐으로 2차 공격후 귀 종기를 현저하게 감소시켰다.

따라서, IL-18BP 요법은 환자가 동일한 항원으로부터 반복적인 공격을 받고 이런 공격에 의해 유발된 염증 반응을 극복하기 위한 치료를 필요로 하는 과민성 환자의 치료에 특히 적합하다.

실시예 3: IL-18BP는 IL-18를 중화시킴으로써 CHS로부터 보호한다.

IL-18BP 치료에서 관찰되는 종기로부터 보호가 IL-18의 중화에 기인하는 지를 검증하기 위하여, IL-18 결핍성(KO) 생쥐와 야생형 C57BL/6 생쥐는 CHS 반응으로부터 방어 능력을 비교하였다. IL-18 결핍된 생쥐는 야생형 생쥐보다 정도가 덜하긴 하지만 DNFB에 대하여 CHS가 발생하였다. 하지만, 도 3에 도시된 바와 같이 IL-18 결핍된 생쥐에서 IL-18BP 치료 효과는 전혀 관찰되지 않았는데, 이는 CHS에서 IL-18BP의 항-염증성 효과가 IL-18의 중화에 기인한다는 것을 시사한다(n = 5 생쥐/군).

실시예 4 : IL-18BP는 혈관 누출을 감소시키지 않는다.

CHS는 앞서 밝힌 바와 같이 C57BL/6 생쥐에 유도하였다. CHS 반응에 의해 유발된 부종을 모니터하기 위하여, DNFB 공격으로부터 2시간 앞서 Evans Blue를 i.v. 주사하였다. 생쥐는 24시간후 죽이고, 귀는 가공 처리하여 혈관에서 누출되어 주변 조직에 축적되는 염료를 추출하였다. 혈관 누출은 혈청에서 Evans Blue 농도가 보정된 건조된 귀 조직 ㎎당 염료의 함량으로 평가하고 공격된 귀 vs. 대조 귀의 비율로 표시하였다. 4일과 5일에 IL-18BP 처리가 부형약 처리된 대조의 56%로 종기를 감소시키긴 하지만(도 4, 좌측 패널, p<0.01), 이들 두 군간 혈관 누출에서 유의한 차이는 없었다(도 4, 우측 패널). 양 군은 비-감작화된 대조군에 비하여 유의하게 증가된 부종을 보였다(p<0.05와 p<0.01). 추가 대조로서, 생쥐는 동물당 250㎍/day의 무관한 단백질 BSA로 처리하였다. 이들 생쥐는 부형약 처리된 대조 동물과 유사하게 CHS가 발생하였다(n = 10 생쥐/군).

혈관 누출(Evans Blue)의 In vivo 분석

원리: Evans Blue의 주사(iv) 및 표적 조직(귀)으로부터 추출

평가를 요하는 데이터:

● Evans Blue의 표준 곡선(OD₆₂₀/ng)

● 혈액에서 Evans Blue 농도(OD₆₂₀/㎖ 또는 ㎍/ml, 각각)

● 귀의 건조된 조직 중량(편측과 반대측, mg)

● 귀에서 Evans blue 함량(편측과 반대측, OD₆₂₀/㎖ 또는 ㎍/ml, 각각)

DNFB 유도된 CHS에 적합하는 프로토콜:

● 5일에 생쥐를 DNFB로 공격하기 2시간전에, 실험적으로 유도된 CHS에 100㎕ Evans Blue[생리 NaCl에 녹인 7.5㎎/㎖ Evans Blue(Σ2129), 100㎕, iv]를 안와후에 iv 주사한다.

● 공격하기 1시간전에 IL-18BP를 i.p. 주사한다.

● 6일(DNFB로 귀 공격하고 24시간후)에 종기를 측정하고 동물을 죽인다.

● 혈액 시료를 채취하고 아래와 같이 가공 처리한다:

○ 30㎕ 혈청을 970㎕ 포름아마이드에 첨가한다(→1/33 희석).

○ 620 nm에서 OD를 측정한다(→1 OD₆₂₀은 33 OD₆₂₀/㎖에 상응한다).

● 편측과 반대측 귀를 수거하고 아래와 같이 가공 처리한다:

○ 80℃에서 24시간동안 건조시킨다.

○ 건량을 측정한다.

○ 잘게 자르고, 55℃에서 24시간동안 부드럽게 교반하면서 1㎖

포름아마이드로 염료를 추출한다.

○ 여과하여 파편[시료 표본 필터 Whatman 5㎛ PTFE 메쉬,

#6984.0350]을 제거하고, 쿠벳(cuvette)을 채우며, 실온에서 여러

시간동안 방치하여 지질이 상부로 떠오르게 한다.

○ 620 nm에서 OD를 측정한다.

계산되는 수치:

누출: → 건조 조직 중량당 Evans Blue 함량[ng/㎎]/혈청에서 Evans Blue 함량[ng/㎎]

상대적 누출: → 100*실험적 누출/부형약 누출

결과:

기본적으로, 2가지 과정이 CHS 반응동안 관찰되는 종기에 기여한다: 부종을 유발하는 혈관으로부터 주위 조직으로의 액체 누출 및 혈관으로부터 조직 손상 부위로 염증성 세포의 혈관외 유출(extravasation).

Evans Blue를 추적물질로 이용하여, 종기의 전반적인 감소에도 불구하고 IL-18BP 치료는 혈관 누출을 감소시키지 않는 것으로 확인되었다(도 4).

실시예 5 : IL-18BP 치료는 염증성 침윤 및 DNFB 공격된 귀의 IFNγ생산을 감소시킨다.

CHS는 앞서 밝힌 바와 같이 C57BL/6 생쥐에 유도하였다. 이들 동물은 4일 내지 6일에 IL-18BP 또는 부형약 처리하였다. IL-18BP 처리는 7일에 부형약 대조의 58%로 종기를 감소시켰다. 생쥐는 7일에 죽이고, 공격된 귀는 수거하고 군별(n=8)로 모으며 효소 분해시켜 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포는 CD45 파지티브 생존 세포에서 후속의 FACS 분석 게이팅(analysis gating)으로 특성화시켰다. 귀 조직 표본에서 발견된 αβT 세포, NK 세포, 호중구, 단핵구/대식세포의 수는 분석된 전체 세포의 비율로 표시하였다. 부형약 대조에 비하여 IL-18BP 처리후 이들 세포 유형의 감소 역시 계산하였다.

IFNγ생산의 측정을 위하여, DNFB 공격된 귀로부터 얻은 세포는 플레이트 결합된 항-CD3 항체로 2 x 10⁵/웰로 재-자극하였다. 후속의 24시간 배양 기간동안 IL-18BP는 추가로 첨가하지 않았다. IFNγ생산은 ELISA로 삼중 측정하였다.

DNFB 공격된 쥐로부터 얻은 세포 조직 표본은 4시간동안 50 ng/㎖ PMA^*와500 ng/㎖ 이노마이신으로 자극하였다. 사이토킨 분비는 배양의 마지막 2시간동안 2㎍/㎖ 브레펠딘 A를 첨가하여 차단하였다. 이후, 세포는 세포내 IFNγ과 표면 항원에 대한 다색 면역형광 염색을 실시하였다. IFNγ은 CD8 T 세포에 의해 생산되고 CD4 T 세포에 의해 일부 생산되었다. IFNγ은 NK 세포와 γαT 세포에서 탐지되지 않았다. (n.d. 탐지되지 않음;^*포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트).

단일 세포 현탁액의 조직 표본

단일 세포 현탁액을 얻기 위한 생쥐 귀의 효소 분해는 Schuler,G. and Steinman,R.M. (1985) 및 Stingl et al. (1983)의 프로토콜에 기초하였다.

1. 귀를 자르고, 조직 표본당 5개의 귀를 모은다.

2. 70% 에탄올로 씻는다.

3. 핀셋으로 찢는다.

4. 37℃에서 피부면을 7.5㎖ HBSS[Ca²⁺와 Mg²⁺를 함유하지 않는 Hanks 균형

염 용액)(GIBCO# 14170.070)]에 위치시킨다.

5. 5㎖의 2.5% 트립신(10x)[2.5% 트립신/EDTA(10x)(GIBCO# 35400-027)]을

첨가하여 1% 최종 농도를 얻는다.

6. 37℃에서 35분동안 배양한다.

7. 얼음위에서 10㎖ HBSS/80% FCS에 위치된 나일론 여과기(세포 여과기)로

귀 절반의 피부면을 옮기고 부드럽게 걸러 세포외 매트릭스로부터 세포를

제거한다.

8. 여과기로 큰 파편을 제거한다.

9. 차가운 HBSS/10%FCS로 2x 세척한다.

10. 세포를 계수한다.

FACS 분석

1. FACS 염색 완충액[인산염 완충액에 녹인 1% 소 혈청 알부민]에 세포를 재현탁시키고, 모든 후속 단계에는 얼음에 재현탁시킨다.

2. 염색당 10⁶개 세포를 사용한다.

3. 1㎍ FC-Block을 10분동안 첨가한다.

4. 관심있는 마커에 대한 항체와 함께 항-CD45 항체를 각각 1㎍씩 30분동안 첨가한다.

5. 2x 세척한다.

6. FACS로 0.5 x 10⁶개의 결과를 얻는다.

7. CD45+, 생존 세포에서 게이팅(gating)이후 특정 마커를 분석한다.

결과:

공격 부위에서 염증성 침윤물을 검사하기 위하여, 자연 상태의 귀와 공격된 귀에서 준비된 단일 세포 현탁액은 CD45+ 생존 세포에서 FACS, 게이팅으로 분석하였다(도 5). 자연 상태의 귀에 존재하는 CD45+ 세포는 주로 γαT 세포와 피부의 수상 돌기 세포인 것으로 밝혀졌다. 공격 24시간후 염증성 침윤물은 CD8과 CD4 T 세포, 호중구, 단핵구, NK 세포로 구성되고, 귀에서 CD45+ 세포의 총수가 2배 정도증가하였다. 종기 감소에 상응하여, IL-18BP 처리는 공격 부위를 침윤하는 전체 백혈구 세포를 감소시켰다. 이는 염증성 침윤물의 서로 다른 모든 세포형에 영향을 주었다. 이런 감소는 세포형에 따라 20% 내지 40%이었다.

IL-18BP 처리된 생쥐의 귀로부터 얻은 침윤물의 추가적인 특성화에서 항-CD3 재자극 직후에 감소된 IFNγ 생산이 확인되었다(도 6). FACS 분석에서 IFNγ은 CD8 T 세포에 의해 주로 생산되고 CD4 T 세포에 의해 일부 생산되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, NK 세포와 γαT 세포는 IFNγ 생산에 기여하지 않았다.

실시예 6 : IL-18BP는 랑게르한스 세포의 동원을 감소시키지 않는다

방법

생쥐는 각각 오른쪽과 왼쪽 옆구리에 합텐 FITC(50㎕의 4㎎/㎖ 용액) 또는 부형약 아세톤/디부틸프탈레이트(1:1)를 도포하였다. 샅고랑 림프절(inguinal lymph nodes)은 도포 24시간후 수거하였다. 합텐 공액된 랑게르한스 세포는 FACS에 의해, FITC 도포된 옆구리를 배수하는 림프절에서 FITC+, CD11c+ 세포로 탐지되지만, 부형약 도포된 옆구리를 배수하는 반대측 림프절에서는 탐지되지 않았다. (n=5 배수 림프절/군).

결과:

항원을 보유하는 랑게르한스 세포(LC)의 배수 림프절로의 이동은 친염증성 사이토킨 IL-1β와 TNFα에 의존하고 카스파제-1에 의해 조절된다(Antonopoulos et al., 2001; Kimber et al., 1992). 따라서, IL-18은 LC 소통(trafficking)에 기여할 것으로 생각된다(Cumberbatch et al., 2001). 따라서, IL-18BP 처리는 LC 동원을 감소시켜 공격 단계동안 DNFB에 대한 면역 반응을 감소시키게 된다. 이런 가설을 검증하기 위하여, 생쥐는 각각 오른쪽과 왼쪽 옆구리에 합텐 FITC 또는 부형약 을 도포하였다. 피부 배수 샅고랑 림프절(inguinal lymph nodes)은 도포 24시간후 수거하고 림프절당 FITC+ 세포수를 평가하였다. 도포로부터 24시간과 1시간 앞서 IL-18BP로 동물 처리는 도포 24시간후 배수 림프절에 존재하는 합텐-보유 LC 숫자를 변화시키지 않았다(도 8). 따라서, 상기 모델에서 IL-18은 LC 소통에 별다른 영향을 주지 않는다.

실시예 7: IL-18BP는 DHT의 다른 뮤린 모델에서 지연형 과민증의 정도를 감소시킨다.

방법

지연형 과민증

생쥐는10⁶BALB/c비장세포의 정맥내 주사로 감작화시키고, 5일에 오른쪽 푸트패드(footpad)에 13 x 10⁶BALB/c 비장세포(50 ㎕ PBS)로 공격하였다. 대조의 좌측 푸트패드에는 50 ㎕ PBS로 처리하였다. 오른쪽 푸트패드 종기는 서로 다른 일자에, 공격후 수치로부터 공격전 수치 및 왼쪽 푸트패드에서 측정된 종기를 감하여 계산한다.

적응 전달 실험을 위하여, BALB/c 비장세포-감작화된 동물 또는 무관한 대조 동물의 림프절로부터 얻은 세포 현탁액은 쥐 항-생쥐 B220-FITC와 CD8-FITC와 함께 배양하고, 이후 MACS 칼럼에서 상자성 항-FITC 마이크로비드(MiltenyiBiotech,Auburn, California, USA)로 분리하여 B220⁺과 CD8⁺세포를 고갈시킨다. 용리된 CD4⁺T 세포-풍부한 조직 표본은 수용자 생쥐의 꼬리 정맥에 주사한다(2 x 10⁷세포/생쥐). 16시간후, 생쥐는 13 x 10⁶BALB/c 비장세포(적혈구 없음)를 오른쪽 푸트패드에 주사하여 공격하고, 이후 종기를 매일 모니터한다.

결과

지연형 과민증(DHT)은 CD8⁺T 세포의 분명한 하향조절과 함께, CD4⁺T 세포에 의해 유발된다(Grabbe et al., 1998). IL-18BP로 처리된 생쥐로부터 얻은 CD4⁺T세포의 행동은 DTH 모델에서 조사한다. C57BL/6 동물은 10⁶동종 BALB/c 비장세포의 정맥내 주사로 감작화시킨다. 5일후, 13 x 10⁶BALB/c 비장세포는 10㎎/㎏ 재조합 사람 IL-18BP i.p. 또는 부형약과 함께, 오른쪽 푸트패드에 주사한다. 국소 염증은 24시에 푸트패드 종기를 확인하여 측정한다.

참고문헌

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997

2. Antonopoulos, C., M. Cumberbatch, R. J. Dearman, R. J. Daniel, I. Kimber, and R. W. Groves. 2001. Functional caspase-1 is required for Langerhans cell migration and optimal contact sensitization in mice. JImmunol 166:3672-3677.

3. Bour, H., et al. 1995. Major histocompatibility complex class I-restricted CD8 + T cells and class II-restricted CD4 + T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. Eur. J. Immunol. 25:3006-3010.

4. Chater, K. F. et al., in "Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology", Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54).

5. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272:2035-2037.

6. Cumberbatch, M., R. J. Dearman, C. Antonopoulos, R. W. Groves, and I. Kimber. 2001. Interleukin (IL)-18 induces Langerhans cell migration by a tumour necrosis factor-alpha- and IL-1beta-dependent mechanism. Immunology 102:323-330.

7. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

8. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Nature 388, 16514-16517.

9. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

10. Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:1531-1536.

11. Garrigue JL, Nicolas JF, Fraginals R, Benezra C, Bour H, Schmitt D. Contact Dermatitis 1994 Apr;30(4):231-7

12. Grabbe, S., and Schwarz, T. 1998. Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity. Immunol. Today.19:37-44

13. Habu et al., J. Immunol. 2001, 166: 5439-5347.

14. Hanifin et al. (1993). J. Am. Acad. Dermatol. 28: 189.

15. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:1190-1195.

16. Kimber, I. and M. Cumberbatch. 1992. Stimulation of Langerhans cell migration by tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha). J Invest Dermatol. 99:48S-50S.

17. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokinereceptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol. 144:3028-3033.

18. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-Immunol 26:1647-51 issn: 0014-2980.

19. Nakamura K, Okamura H, Wada M, Nagata K, Tamura T. Infect Immun 1989 Feb;57(2):590-5

20. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

21. Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tanimoto T, Nukata Y, Tanabe F, Akita K, Torigoe K, Okura T, Fukuda S, et al. Infect Immun 1995 Oct;63(10):3966-72

22. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.

23. Reinhold et al. (1990). Lancet 335: 1282.

24. Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, Kolb H. J Clin Invest 1997 Feb 1;99(3):469-74

25. Schuler,G. and Steinman,R.M. (1985). Murine epidermal Langerhans cells mature into potent immunostimulatory dendritic cells in vitro. J Exp. Med.161, 526-546.

26. Stingl,L.A., Sauder,D.N., Iijima,M., Wolff,K., Pehamberger,H., and Stingl,G. (1983). Mechanism of UV-B-induced impairment of the antigen-presenting capacity of murine epidermal cells. J Immunol130, 1586-1591.

27. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J.Immunol. 148, 2778-2784.

28. Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K, Micallef M, Fujii M, Torigoe K, Tanimoto T, Fukuda S, Ikeda M, Okamura H, Kurimoto M. J Immunol 1996 Jun 1;156(11):4274-9

29. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161, 3400-3407.

30. Xu et al.

Claims

과민성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도.
제 1 항에 있어서, 과민성 질환은 I형 과민성 반응과 연관된 질환, Ⅱ형 과민성 반응과 연관된 질환, Ⅲ형 과민성 반응과 연관된 질환, Ⅳ형 과민성 반응과 연관된 질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2 항에 있어서, 과민성 질환은 지연형 과민증인 것을 특징으로 하는 용도.
제 2 항 또는 3 항에 있어서, 과민성 질환은 접촉 과민증인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 4 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물, 원형 순열된 유도체 또는 이들의 염에서 선택되는 것을 특징으로하는 용도.
제 5 항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 6 항에 있어서, IL-18 항체는 인화된 IL-18 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 6 항에 있어서, IL-18 항체는 인간 IL-18 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 5 항에 있어서, IL-18의 저해물질은 IL-18 결합 단백질이나 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물, 원형 순열된 유도체 또는 이들의 염인 것을 특징으로 하는 용도.
제 9 항에 있어서, IL-18 저해물질은 면역글로불린 융합을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 융합 단백질은 IL-18에 결합하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 5 항 내지 10항중 어느 한 항에 있어서, 기능성 유도체는 아미노산 잔기에서 하나이상의 측쇄로 나타나는 한가지이상 기능기(functional group)에 부착되는 적어도 일부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 11 항에 있어서, 일부분은 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 인터페론을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 13 항에 있어서, 인터페론은 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 종양 괴사 인자(TNF)의 저해물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 15 항에 있어서, TNF 저해물질은 TBPI 또는 TBPⅡ인 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 항-염증제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 17 항에 있어서, 항-염증제는 COX-저해물질인 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 항-알레르기 약물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 0.001 내지 1000 ㎎, 0.01 내지 100 ㎎, 0.1 내지 10 ㎎, 또는 5 ㎎의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 근육내 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 국소 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
과민성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도.
과민성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도하거나 강화시키는 벡터의 용도.
과민성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도.
알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, IL-18 저해물질의 제약학적 효과량을 병든 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.