MX2009000696A

MX2009000696A - Wsx-1/p28 como un objetivo para respuestas anti-inflamatorias.

Info

Publication number: MX2009000696A
Application number: MX2009000696A
Authority: MX
Inventors: Christopher A Hunter; Jason Scott Stumhofer
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 2006-07-19
Filing date: 2007-07-18
Publication date: 2009-01-30
Also published as: AU2007275654A1; EP2046809B1; CA2657934C; JP2009543579A; WO2008011081A3; WO2008011081A2; DK2046809T3; US20080038223A1; CA2657934A1; EP2046809A4; ES2612383T3; US9683026B2; EP2046809A2

Abstract

Se proveen composiciones y métodos relacionados con WSX-1 y p28 (IL-30); en particular, se describen métodos de tratamiento de condiciones inflamatorias en sujetos mamíferos usando varios polipéptidos y complejos WSX-1, p28, EBI3, y gp130 o porciones que se unen a o que modulan la actividad de dichos complejos; también se describen complejos aislados o recombinantes incluyendo polipéptidos WSX-1 o gp130 solubles, proteínas de fusión WSX-1 aisladas o recombinantes, y proteínas de fusión p28 aisladas o recombinantes.

Description

WSX-1/P28 COMO UN OBJETIVO PARA RESPUESTAS ANTI- INFLAMATORIAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una solicitud de patente de utilidad no provisional que reclama prioridad al beneficio de las siguientes solicitudes de patente provisionales anteriores: USSN 60/832,213, presentada el 19 de julio de 2006, titulada "WSX-1/P28 AS A TARGET FOR ANTI-INFLAMMATORY RESPONSES" de Christopher A. Hunter, y USSN 60/837,450, presentada el 11 de agosto de 2006, titulada "WSX-1/P28 AS A TARGET FOR ANTI-INFLAMMATORY RESPONSES" de Christopher A. Hunter, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

DECLARACION EN CUANTO A LOS DERECHOS DE INVENCIONES HECHAS BAJO INVESTIGACION Y DESARROLLO AUSPICIADAS POR EL GOBIERNO FEDERAL Esta invención se hizo con apoyo gubernamental bajo las concesiones Nos. AI42334, AI4 158, y 1-T32-AI-055428 de National Institutes of Health (Institutos Nacionales de Salud). El gobierno puede tener ciertos derechos a esta invención.

CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a métodos de tratamiento de condiciones inflamatorias en sujetos mamíferos usando polipéptidos WSX-1 , p28, EBI3, y gp 30 y complejos o porciones que se unen a dichos complejos o modulan la actividad de éstos. La invención también se refiere a complejos aislados o recombinantes que incluyen polipéptidos WSX-1 o gp130 solubles, proteína de fusión WSX-1 aisladas o recombinantes o proteínas de fusión p28 aisladas o recombinantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Un número de citocinas recombinantes se usan en una variedad de establecimientos clínicos. Estas incluyen interleucina-2 (IL-2), GM-CSF, IL-1 1 , IL-12 e interferones de tipo I (IFNs). Estas proteínas principalmente se están usando como estimuladores de células inmunes y actúan como factores de crecimiento o para incrementar respuestas anticancerosas o virales. Algunas citocinas se han usado para inhibir el sistema inmune; por ejemplo, se ha intentado la inhibición con IL-10, que funciona indirectamente sobre funciones de células accesorias necesarias para las funciones de las células T y que se estaban desarrollando específicamente con enfermedad de Crohn y enfermedad intestinal inflamatoria como objetivos y TGF. El éxito con estas ha sido limitado.

Los antagonistas de IL-12 p40 se han probado en ensayos clínicos para pacientes con enfermedad de Crohn con algún éxito. Los antagonistas de IL-15 están en ensayos clínicos para artritis con base en la observación de que esta citosina estaba implicada en el desarrollo de esta enfermedad. El antagonista de receptor de IL-1 es un producto comercialmente disponible que se usa para tratar a pacientes con artritis reumatoide. Este es un producto que bloquea la interacción de la citocina IL-1 proinflamatoria con su receptor. Varias compañías han desarrollado anticuerpos/antagonistas específicos para la citosina FNT-a que se usan actualmente en el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide. Este enfoque se basa en la neutralización de citocina endógena para prevenir inflamación. Un enfoque similar se ha llevado a cabo con anticuerpos específicos para IL-1 e IL-6. Un problema de seguridad es que estos tratamientos están asociados con el desarrollo de infecciones oportunistas incluyendo TB y toxoplasmosis.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION WSX-1 es un receptor de citosina recientemente descrito que se une a la citosina heterodimérica IL-27. Los estudios de los inventores de la presente han sugerido que este par de citosina/receptor está implicado en la regulación negativa de respuesta inflamatoria mediada por células T. La identificación de un papel para WSX-1 en la supresión de hiperactividad de células T tiene implicaciones clínicas para trastornos inflamatorios mediados por células T y representa un objetivo novedoso para terapias de base ¡nmunológica. El trabajo de este laboratorio ha seguido enfocándose en los efectos inhibidores de IL-27 en diferentes respuestas de células T, y los inventores de la presente han hecho varias observaciones que han provisto nuevas perspectivas en la biología de este sistema de receptor de citocina y han sugerido nuevas formas para usar esta información para desarrollar terapias anti-inflamatorías. Está claro a partir de los estudios de los inventores de la presente que WSX-1 tiene un efecto negativo sobre las respuestas de las células T. IL-27 puede inhibir respuestas de Th1 y Th2 y la capacidad de esta célula para hacer un factor de crecimiento de células T IL-2. Además, IL-27 inhibe un nuevo subconjunto de células T - T17 (células T que producen IL-17) - que se piensa que es un subconjunto de células T patológico importante. Una proteína de fusión, WSX-1 Fe, es capaz de incrementar la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de células T de IL-2 y IFNy. Esto implica que una versión difundida de este receptor puede facilitar IL-27 o sus componentes individuales para señalizar células T. Esto en parte se basa en la biología del componente de cítocina/receptor relacionado para actividad de IL-6. Esta ¡dea es soportada por la observación de que p28 recombinante (suministrado por eBioscience, y también conocido como IL-30), aunque no es eficiente como IL-27, es capaz de antagonizar la producción de IL-2 e IL-17.

Estos datos implican que p28 solo, modificado o como parte de otra molécula o complejo que incluye WSX-1 , representa un enfoque terapéutico útil para modular células del sistema inmunológico. De manera similar, polipéptidos y complejos WSX-1 solubles también representan un enfoque terapéutico útil. Puesto que IL-27 puede señalizar a través de un complejo receptor incluyendo tanto WSX-1 como gp130, los polipéptidos y complejos gp130 solubles representan otro enfoque terapéutico útil. Por consiguiente, una clase general de modalidades provee una composición que comprende un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido WSX-1/EBI3 soluble aislado o recombinante, un complejo de WSX-1/IL-27 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble aislado o recombinante, un complejo de gp130/IL-27 soluble aislado o recombinante, o una variante de los mismos. En un aspecto, la composición es anti-inflamatoria. La composición opcionalmente incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, en modalidades en las cuales la composición se ha de administrar a un sujeto. En una modalidad, la composición suprime el desarrollo de células IL-17 de células T intactas inducido por IL-6 y transformando factor de crecimiento transformante beta. La composición puede incluir una o más células, por ejemplo, una o más células T, células B, células cebadas, neutrófilos, macrófagos, células dendriticas u otras células que expresan gp 30 o WSX-1 . El complejo puede afectar una función o actividad de la célula. En una modalidad, la composición incluye una célula T, y la composición altera una función o actividad de la célula T. Por ejemplo, la célula T puede desplegar expresión alterada de IL-2, IFN-gamma, FNT-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5, o CD25, proliferación alterada o supervivencia alterada. La composición opcionalmente incluye factor de crecimiento transformante beta. Otra clase general de modalidades provee una proteína de fusión WSX-1 recombinante y aislada. La proteína de fusión incluye un polipéptido WSX-1 , que puede estar, v.gr., en el N-terminal de la proteína de fusión, en el C-terminal de la proteína de fusión, o interno a la proteína de fusión. El polipéptido WSX-1 puede incluir el dominio extracelular o una subsecuencia del mismo, de un WSX-1 que ocurre naturalmente (v.gr., WSX-1 humano) o una variante del mismo. En una clase de modalidades, la proteína de fusión comprende uno o más dominios que reconocen un marcador específico de célula, por ejemplo, uno o más dominios de anticuerpo que reconocen el marcador. Marcadores ilustrativos incluyen CD4, CD8, CD1 1c, CD1 1 b, y NK1.1 . En una clase de modalidades, la proteína de fusión comprende uno o más dominios de polipéptido derivados de p28 o EBI3. Otra clase general de modalidades provee una proteina de fusión p28 recombinante o aislada. La proteína de fusión incluye un polipéptido p28, que puede estar, v.gr., en el N-terminal de la proteína de fusión, en el C-terminal de la proteína de fusión, o interno a la proteina de fusión. El polipéptido p28 se puede derivar de un p28 que ocurre naturalmente (v.gr., p28 humano) o una variante del mismo. La proteína de fusión opcionalmente comprende uno o más dominios de anticuerpo. Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir uno o más dominios de anticuerpo que reconoce un marcador especifico de célula, v.gr., CD4, CD8, CD11c, CD11b, o NK1.1. Polinucleótidos que codifican proteínas de fusión WSX-1 y p28 son otra característica de la invención. Por ejemplo, una clase de modalidades provee un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión WSX-1 recombinante o aislada, en donde la proteína de fusión comprende uno o más dominios que reconoce un marcador específico de célula o uno o más dominios de polipéptido derivado de p28 o EBI3. El ácido nucleico opcionalmente codifica uno o más dominios de polipéptido seleccionados de: un dominio de anticuerpo, una región Fe, un dominio p28, o un dominio EBI3, y también codifica un polipéptido WSX-1. Otra clase de modalidades provee un ácido nucleico que incluye una proteína de fusión p28 recombinante o aislada. Anticuerpos que se unen a polipéptidos y complejos de la invención también son una característica de la invención. Por lo tanto, una clase de modalidades provee un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido WSX-1 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble, o a un complejo de polipéptido WSX-1/IL-27 soluble. El anticuerpo opcionalmente potencia una actividad del polipéptido o complejo de polipéptido. Un aspecto de la invención provee métodos de tratamiento de una condición inflamatoria en un sujeto mamífero, v.gr., un sujeto humano. Condiciones inflamatorias ilustrativas que se han de tratar incluyen, pero no se limitan a un trastorno inmune (v.gr., una enfermedad autoinmune) una infección; cáncer, tal como mieloma múltiple y leucemia mielógena y otras leucemias, así como metástasis tumoral; una alergia; artritis; asma; enfermedad intestinal inflamatoria, tal como colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis múltiple; enfermedad infecciosa crónica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de transplante; sarcoidosis; hepatitis; inflamación del sistema nervioso central; síndrome de inmunodeficiencia adquirida; pancreatitis aguda; enfermedad de Addison; lesión hepática inducida por alcohol incluyendo cirrosis alcohólica; enfermedad de Alzheimer; amielolateroesclerosis; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoimmune; lesión hepática inducida por hepatitis autoimmune; cirrosis biliar; caquexia/anorexia, incluyendo caquexia inducida por SIDA; síndrome de fatiga crónica, enfermedad asociada con Clostridium incluyendo diarrea asociada por Clostridium; condiciones e indicaciones coronarias, incluyendo insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunción de miocardio e injerto de derivación de arteria coronaria; diabetes, incluyendo diabetes mellitus de tipo I de inicio juvenil, resistencia a la insulina; endometriosis, endometritis, y condiciones relacionadas; epididimitis; resistencia a eritropoyetina; fiebre, fibromialgia o analgesia; glomerulonefritis; enfermedad de injerto versus hospedero/rechazo de transplante; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barre; enfermedad de Hashimoto; anemia hemolítica; choque hemorrágica; hiperalgesia; condiciones inflamatorias de una articulación y enfermedades reumáticas incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, artritis juvenil, (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedades de Still, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis (v.gr., enfermedad de Kawasaki), vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos, síndrome de Sjogren, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y arteritis de células gigantes; enfermedad ocular inflamatoria, como puede estar asociada con, por ejemplo, transplante de córnea; enfermedad ocular inflamatoria, como puede estar asociada con, v.gr., transplante de córnea; enfermedad intestinal inflamatoria; isquemia incluyendo isquemia cerebral, enfermedad de Kawasaki; alteración del aprendizaje; enfermedades pulmonares; nefritis por lupus; esclerosis múltiple; miastenia grave; miopatías; enfermedades neuroinflamatorias; neurotoxicidad; enfermedades y condiciones oculares, incluyendo degeneración ocular y uveitis; osteoporosis; dolor incluyendo dolor relacionado con cáncer; enfermedad de Parkinson; pemfigo; enfermedad periodontal; pitiriasis rubra pilaris; trabajo de parto de pre-término; prostatitis y condiciones relacionadas; psoriasis y condiciones relacionadas; artritis psoriática; fibrosis pulmonar; lesión de reperfusión; fiebre reumática; artritis reumatoide; sarcoidosis; escleroderma; choque séptico; efectos colaterales de terapia de radiación; síndrome de Sjogren; perturbación del sueño; espondiloartropatías; lupus eritematoso sistémico; enfermedad de articulación mandibular temporal; tiroiditis; transplante de tejido o una condición inflamatoria que resulta de contractura, esguince, daño a cartílagos, trauma y cirugía ortopédica; vasculitis; o una condición inflamatoria que resulta de contractura, esguince, daño a cartílagos, trauma, cirugía ortopédica, infección u otros procesos de enfermedad. En una clase de modalidades, los métodos incluyen administrar al sujeto una porción aislada o recombinante seleccionada del grupo que consiste de polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido p28, un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/EBI3 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/IL-27 soluble, un complejo de gp130/IL-27 soluble, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble, un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble, un polipéptido p28 y un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido EBI3 y un polipéptido WSX-1 soluble, IL-27 y un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido gp 30 soluble y un polipéptido p28, un polipéptido gp130 soluble e IL-27, un polipéptido gp130 soluble y un polipéptido EBI3, y una variante de los mismos. En modalidades en las cuales una combinación de polipéptidos recombinantes o aislados se administra (v.gr., un polipéptido p28 y un polipéptido WSX-1 soluble), los polipéptidos pueden pero no necesitan formar un complejo y los polipéptidos pueden ser coadministrados o administrados por separado. Los métodos opcionalmente incluyen diagnosticar al paciente con la condición inflamatoria antes de la administración. La porción aislada o recombinante se administra opcionalmente al sujeto en combinación con un segundo compuesto, por ejemplo, factor de crecimiento transformante beta. En otra clase de modalidades, los métodos incluyen administrar al sujeto una porción que se une específicamente a o modula una actividad de un complejo de gp1307WSX-1/IL-27, o que modula la formación de complejo en una célula, tratando así al sujeto para la condición. La porción puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un antagonista, un agonista, y un modulador de actividad. En otro aspecto, la invención provee métodos de identificación de un compuesto que se une a o modula una actividad de un polipéptido WSX-1 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1 /IL-27 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1 /EBI3 soluble, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble, un complejo de polipéptido gp130/IL-27 soluble o un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble. En los métodos, una muestra biológica o bioquímica que comprende el polipéptido o complejo se pode en contacto con un compuesto. La unión de compuesto de prueba al polipéptido o complejo o la modulación de la actividad del polipéptido o complejo por el compuesto de prueba es detectado, identificando así el compuesto que se une al polipéptido o complejo o modula la actividad del mismo. El compuesto opcionalmente potencia la inhibición de una respuesta de células T por el polipéptido o complejo, potencia la actividad antagonista contra IL-2 o IL-17, o altera la proliferación de células T, supervivencia o expresión de IL-2, IFN-gamma, FNT-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5, o CD25.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1 B ilustran la expresión de IL-27 en el cerebro durante TE. La figura 1A presenta gráficas de barra de resultados de PCR en tiempo real cuantitativo sobre ARN celular total aislado de los cerebros de ratones WT C57BL/6 no infectados y crónicamente infectados (día 30 después de la infección) para detectar ARNm de ebi3 y 1127 (p28). La figura 1 B presenta gráficas de barras de resultados de PCR en tiempo real cuantitativo de ARNm de ebi3 y 1127 aislado de cultivo de astrocitos WT C57BL/6 primarios. 1 ? 106 astrocitos se colocaron en placas/pozo y se estimularon durante 18 horas, seguido por aislamiento de ARN. Los resultados de PCR en tiempo real se normalizaron contra ARNm para Actb (ß-actina). Los datos son representativos de dos experimentos independientes. ND, no detectado. Las figuras 2A-2H ilustran que IL-27 es requerido para resistencia a TE crónica. La figura 2A presenta una gráfica de línea que muestra la supervivencia de ratones H27ra-I- (n = 8) y WT C57BU6 (n = 10) infectados intraperitonealmente con 20 quistes de cepa Me49 de T. gondii y tratados con CTLA4-lg. Las flechas denotan días de tratamiento con CTLA4- Ig. La figura 2B presenta una gráfica de línea que muestra la supervivencia de ratones H27ra-/- (n = 10) o WT (n = 10) tratados con sulfadiazina que empieza el día 5 después de la infección (flecha). El tratamiento se detuvo después de dos semanas. La figura 2C presenta fotografías de análisis histopatológicos del hígado y pulmones el día 14 y 30 después de la infección de ratones H27ra-/- tratados con CTLA4-lg. La fórmula 2D presenta fotografías para análisis de patología en el cerebro de ratones WT y H27ra~/-crónicamente infectados en el día 30 después de la infección con marcador específico de astrocitos GFAP. La figura 2E presenta una gráfica de barras de ADN de parásito aislado de los cerebros de ratones WT y \\27ra-l-crónicamente infectados medido por PCR cuantitativo en tiempo real. Los resultados son representativos de dos experimentos con 4-5 ratones por grupo. Las figuras 2F-2H presentan gráficas de barras que muestran producción de NO (figura 2F), IFN-? (figura 2G), e IL-12 (figura 2H) de BMNC aislado de ratones WT o \\27ra-l- reestimulados in vitro en presencia de STAg; después de 48 hr los sobrenadantes se recolectaron y analizaron. Los resultados son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados con resultados similares y las barras de error designan la SEM. Las figuras 3A-3E ilustran que el agotamiento de células T T CD4+ rescata a ratones Il27ra-I- y reduce la inflamación en el cerebro. La figura 3A presenta una gráfica de barras de BMNC total cosechado de grupos de 4-5 ratones H27ra-/~ y WT crónicamente infectados. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. La figura 3B presenta una gráfica de barras de células T CD4+, células T CD8+, macrófagos y microglia. El porcentaje de células T CD4+, células T CD8+, macrófagos y microglia en cada preparación de BMNC, como se determina por citometría de flujo, se usaron para calcular el número total de células en cada población. Las barras son coloreadas como en la figura 3A. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con grupos de 4-5 ratones. La figura 3B presenta una gráfica de linea que muestra la supervivencia de ratones H27ra-I- infectados con 20 quistes Me49 en día 5 después de la infección, tratados con sulfadiazina durante 2 semanas para controlar la replicación de parásitos; a las cuatro semanas se inició el agotamiento de células T CD4+. Los datos que representan dos experimentos independientes con tres ratones por grupo. La figura 3D ilustra citometría de flujo en BMNC o esplenocitos aislados y teñidos para CD4 y CD8 para cuantificar el éxito de agotamiento de CD4 en el cerebro. La figura 3E presenta fotografías de secciones de cerebro, tomadas el día 35 después de la infección para histología. * denota valor P < 0.05. Las figuras 4A-4D ilustran que IL-27 inhibe la producción de IL-17 en el cerebro de ratones crónicamente infectados con T. gondii. La figura 4A presenta gráficas de barras de PCR en tiempo real cuantitativo para ARNm para IL-17, IL-6 y FNT en el cerebro de ratones Il27ra-I- y WT crónicamente infectados (día 30 después de la infección). Los datos son representativos de dos experimentos independientes. La figura 4B presenta gráficas de barras de prueba de ELISA en sobrenadantes de BMNC aislado de ratones WT o H27ra-I- reestimulados in vitro en presencia de STAg durante 48 hr y evaluado para IL-17, IL-6 y FNT. Los resultados son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados similares y las barras de error designando la SEM. La figura 4C presenta una gráfica de barras de prueba de ELISA en sobrenadantes de BMNC aislado de ratones WT y reestimulados con STAg en presencia o ausencia de IL-23, IL-27 o IL-23 y IL-27 durante 48 hr. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares y las barras de error representan SEM. La figura 4D ilustra citometría de flujo de BMNC de ratones WT y H27ra-I- estimulados durante 2 hr ex vivo con PMA y iononmicina en presencia de BFA y teñidos intracelularmente para IL-17. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares. ND, no detectado. Las figuras 5A-5C ilustran que IL-27 inhibe la producción de IL-17 por células TH-17 generadas in vitro. Las figuras 5A-5C ilustran citometría de flujo sobre células T CD4+ (figuras 5A y 5C) y CD8+ (figuras 5B y 5C) aisladas de ratones C57BL/6 y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones inductoras de TH- 7 en presencia o ausencia de IL-27 (figuras 5A, 5B, y 5C) o p28 (figura 5C). Las células T CD4+ y CD8+ cultivadas durante cuatro y tres días respectivamente fueron estimuladas con PMA y ionomicina en presencia de BFA durante 4 hr antes de teñir para IL-17 intracelular (figuras 5A, 5B, y 5C), FNT (figuras 5A y 5B) o IFN-? (figura 5C). Las gráficas son confinadas a células T CD4+ o CD8+ en donde se especifica; los números en los cuadrantes representan la frecuencia de células en cada uno. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Las figuras 6A-6F ilustran que la inhibición mediada por IL-27 de producción de IL-17 de células T es independiente de SOCS3. Las figuras 6A y 6B presentan gráficas de barras de prueba de ELISA en sobrenadantes de células T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 que crecen bajo condiciones inductoras de TH-17 con concentraciones cada vez mayores de IL-27 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-IL-6 para producción de IL-17. La figura 6C ilustra citometría de flujo sobre células T CD4+ purificadas de ratones gp130Y757F o control WT teñidas para P-STAT3 intracelular después de estimulación con IL-6 (5 min, 60 min o 24 hr). La figura 6D ilustra citometría de flujo sobre células T CD4+ aisladas de ratones gp130Y757F o controles WT y estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones inductoras de TH-17 en presencia o ausencia de IL-27 cuatro días antes de la tinción para IL-17 IFN-? ¡ntracelulares. La figura 6E presenta una gráfica de barras de prueba de ELISA en sobrenadantes de células T CD4+ de controles gp130Y757F o WT que crecen bajo las condiciones inductoras de TH-17 en presencia de cantidades cada vez mayores de IL-27 para la producción de IL-17. La figura 6F ilustra citometría de flujo de células T Socs3-/- CD4+ aisladas de ratones CreMMTVSocs3fl/fl activadas para inducir la producción de IL-17 en presencia o ausencia de IL-27 antes de la tinción para IL-17 intracelular. Las gráficas son confinadas a células T CD4+; los números en cuadrantes representan la frecuencia en cada una. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Las barras de error representan SEM.

Las figuras 7A-7B ilustran que la inhibición mediada por IL-27 de la producción de IL-17 por células T es dependiente de STAT1 pero no de T-bet. La figura 7A ilustra citometría de flujo sobre células T CD4+ aisladas de ratones CD57BL/6, Stat1-I-, o Tbx21-I- y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones inductoras de TH-17 en presencia o ausencia de IL-27 y después teñidas para IL-17 y FNT intracelulares. Los datos representan tres experimentos independientes. La figura 7B presenta una gráfica de barras de prueba de ELISA en sobrenadantes de esplenocitos aislados de ratones C57BL/6 (n = 3) o Statl-/- (n=3) siete días después de infección intraperitoneal con 20 quistes de cepa Me49 de T. gondii y reestimuladas durante 48 en presencia o ausencia de STAg para la producción de IL-17. Las gráficas son confinadas en células T CD4+; los números en cuadrantes representan la frecuencia en cada una. Las barras de error denotan SEM. La figura 8 presenta datos de citometría de flujo que ilustran que las células T aisladas de los cerebros de ratones H27ra-/- y WT crónicamente infectados despliegan un fenotipo activado. BMNC se aislaron de ratones H27ra-I- y WT crónicamente infectados. Las células T CD4+ y CD8+ se tiñeron para los marcadores de activación CD44 y CD62L. Las gráficas son confinadas en células T CD4+ o CD8+ en donde se indica. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. La figura 9 presenta datos de citometría de flujo que ilustran que IL-27 inhibe la producción de IL-17 por células T CD4+ sin estimulación con PMA y ionomicina. Las células T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 se activaron con a-CD3 y a-CD28 bajo condiciones no polarizantes (anti-IFN-?, anti-IL-4). TGF-ß solo o en combinación con IL-6 o IL-6, IL-1 -ß, FNT se usaron para generar células TH-17 en presencia o ausencia de IL-27. Las células se tiñeron para IL-17 y IFN-? intracelulares sin estimulación con PMA y ionomicina el día cuatro. Las gráficas se confinan en células T CD4+; los números en cuadrantes representan la frecuencia de células en cada una. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. La figura 10 presenta datos de citometría de flujo que ilustran que la inhibición de IL-27 de la producción de IL-17 por células T es independiente de SOCS3. Células T CD4+ de ratones gp130Y757F o controles WT se hicieron crecer bajo condiciones inductoras de TH-17 en presencia o ausencia de IL-27. Sin embargo, en este experimento las células T fueron estimuladas con PMA y ionomicina más BFA durante 4 hr el día 4 antes de la tinción para IL-17 y FNT intracelulares. Las gráficas se confinan en células T CD4+; los números en cuadrantes representan la frecuencia de células en cada una. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. La figura 1 1 presenta una gráfica de barras de niveles de IL-17 que muestran que la inhibición de IL-27 de IL-17 ocurre independientemente de su capacidad para inhibir la producción de IL-2. Células T CD4+ aisladas de ratones DO 1.10 transgénicos fueron activados con péptido de ovalbúmina bajo condiciones inductoras de TH-17 en presencia o ausencia de IL-27. Las células se cultivaron durante cuatro días en presencia o ausencia de IL-2 humana antes de analizar los sobrenadantes celulares para IL-17 por ELISA. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. La figura 12 presenta gráficas de línea de niveles de IL-2 y IFNy, que ilustran que la inhibición de la producción de IL-2 y IFNy por IL-27 es potenciada por un polipéptido WSX-1 soluble en células T CD4+ de ratones con deficiencia de WSX-1. Las figuras 13A-13C ilustran esquemáticamente estrategias para modular la respuesta inflamatoria modulando la señal a través del receptor de IL-27 o sus componentes WSX-1 y gp130. La figura 13A ilustra esquemáticamente la señalización a través del receptor IL-27 por IL-27 (un heterodímero de EBI3 y p28). La figura 13B ilustra esquemáticamente señalización a través de gp130 por un complejo de WSX-1/p28 soluble o un complejo de WSX-1/IL-27 soluble. La figura 13C ilustra esquemáticamente la señalización a través de WSX-1 por un complejo de gp130/p28 soluble o un complejo de gp 30/IL-27 soluble. Las figuras 14A-14C ilustran que IL-27 promueve la producción de IL-10 por células T CD4+ y CD8+. La figura 14A presenta una gráfica de barras que muestra resultados del bioensayo de RodentMAP™, que se expresan como el por ciento de cambio entre células cultivados bajo condiciones no polarizantes y aquellas estimuladas con IL-27 Las figuras 14B y 14C ilustran la producción de IL-10 por células T CD4+ (figura 14B) y células T CD8+ (figura 14C) como se mide por citometria de flujo y ELISA de sobrenadantes de cultivo durante 72 hr (barras de error, d.e.). Las células T se aislaron de bazo y nodos linfáticos de ratones C57BU6 y se activaron con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27. Células T CD4+ y CD8+ cultivadas durante 4 y 3 días, respectivamente, fueron estimuladas durante 4 hr con PMA y ionomicina en presencia de brefeldin A antes de teñir para IL-10 intracelular. Los números en las cajas indican el por ciento de células IL-10+. Los números en negritas representan la media de la intensidad fluorescente (MFI). Los resultados en las figuras 14B y 14C son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. Las figuras 15A-15C ilustran que la producción de IL-10 es reducida en ausencia de señalización de IL-27R. La figura 15A presenta una gráfica de barras de ELISA de IL-10 en los sobrenadantes de células T CD4+ aisladas de los ratones C57BL/6 (WT) o ll-27ra-/- de tipo silvestre; las células se hicieron crecer bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares (barras de error, d.e.). La figura 15B ilustra citometria de flujo de BMNCs y bazos de ratones WT y ll-27ra-/-crónicamente infectados con células T. gondii; las células fueron estimuladas 5 hr ex vivo con PMA y ionomicina en presencia de brefeldin A y teñidas intracelularmente para IL-10. Los números en las cajas indican el por ciento de células IL-10+. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. La figura 15C presenta una gráfica de líneas de ELISA de IL-10 en sobrenadantes de WT BMNCs (n = 4) reestimulados durante 48 hr in vitro con antigeno de toxoplasma soluble (STAg) en presencia o ausencia de IL-27. Barras de error, d.e. *, P = 0.0275. Las figuras 16A-16B ilustran que las células T CD4+ hacen IL-10 en respuesta a IL-27 bajo condiciones de TH1 y TH2 pero no de TH 7. La figura 16A muestra análisis de dilución de CFSE de células T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27 (tiempo, gráficas de arriba) antes de tinción para IL-10 intracelular. Las gráficas son confinadas sobre células T CD4+. La figura 16B ilustra citometría de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones polarizantes de TH1 , TH2 o TH en presencia o ausencia de IL-27 antes de tinción intracelular de IL-10. Los números en negritas representan MFI. Para las figuras 16A y 16B, los números en las cajas indican el por ciento de células IL-10+. Los datos son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. Las figuras 17A-17B ilustran que IL-27 induce la generación de células T de IFN-y+IL-10+ CD4+ bajo condiciones de TH1. La figura 17A ilustra citometría de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones polarizantes de TH1 , TH2 O Th17 en presencia o ausencia de IL-27 antes de tinción para IL-10 intracelular y citocinas IFN-?, IL-13 o IL-17 asociadas con TH de firma. La figura 17B ilustra citometría de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones IL-10-/- activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones inductoras de TH17 en presencia o ausencia de IL-27 antes de tinción para IL-10 y IL-17 intracelulares. Las gráficas se confinan en células T CD4+; los números en cuadrantes representan la frecuencia de células en cada una. Los datos son representativos de tres experimentos independientes (figura 17A) o dos experimentos independientes (figura 17B). Las figuras 18A-18C ilustran que TGF-ß aumenta la producción de IL-10 impulsada por IL-27 por células T CD4+. La producción de IL-10 por células T CD4+ como se mide por citometria de flujo (figura 18A) y ELISA (figura 18B) de sobrenadantes de cultivo de 72 hr. Células T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6 fueron activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27, TGF-ß o la combinación de ambas citocinas. Células T CD4+ cultivadas durante 4 días, fueron estimuladas durante 4 hr con PMA y ionomicina en presencia de de brefeldin A antes de tinción para IL-10 intracelular. Los números en las cajas indican el por ciento de células IL-10+; los números en negritas representan MFI. Los datos son la media ± d.e. de diez ratones. La figura 18C ilustra citometria de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones Foxp3GFP de reportero activados con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27, TGF-ß o la combinación de ambas citocinas. Células T CD4+ cultivadas durante 3 días, fueron estimuladas durante 4 hr con PMA y ionomicina en presencia de brefeldin A antes de tinción para IL-10 y GFP intracelulares. Las gráficas se confinan en células T CD4+; los números en cuadrantes representan la frecuencia de células en cada una. Los datos son representativos de tres experimentos independientes (figuras 18A, 18B) o dos experimentos independientes (figura 18C). Las figuras 19A-19D ilustran que IL-6 sinergiza con TGF-ß para promover la producción de IL-10. la producción de IL-10 por células T CD4+ como se mide por citometria de flujo (figura 19A) y ELISA (figura 19B) de sobrenadantes de cultivo de 72 hr. Las células T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6 fueron activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-6, TGF-ß o la combinación de ambas citocinas. Células T CD4+ cultivadas durante 4 días fueron estimuladas durante 4 hr con PMA y ionomicina en presencia de brefeldin A antes de tinción para IL-10 intracelular. Los números en las cajas indican el por ciento de células IL-10+; los números en negritas representan MFI. Los datos son la media ± d.e. de triplicados. Las figuras 19C y 19D ilustran citometria de flujo de células T CD4+ purificadas de ratones C57BL/6; las células se dejaron sin estimular o fueron estimuladas con IL-6 o IL-27 (tiempo, gráficas de arriba), después fueron teñidas para STAT1 (P-STAT1) fosforilado intracelular (figura 19C) o STAT3 (P-STAT3) (figura 19D). Los números en las cajas representan el por ciento de P-STAT1 + (figura 19C) o células T de P-STAT3+CD4+ (figura 19D). Los datos son representativos de tres experimentos independientes (figuras 19A y 19B) o dos experimentos independientes (figuras 19C y 19D). Las figuras 20A-20F ilustran la inducción de IL-10 dependiente de STAT. Citometria de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6, Statl-/- (figura 20A) Tbx21-/- (figura 20B) Stat3CD4-/- (figura 20C) o Stat4-/- (figura 20D) activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27 y después teñidas para IL-10 intracelular. Citometría de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6, Statl-/- (figura 20E) o Stat3CD4-/- (figura 20F) activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes con IL-6 en presencia o ausencia de TGF-ß y después teñidas para IL-10 intracelular. Los números en las cajas representan el por ciento células IL-10+. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. La figura 21 presenta datos de citometría de flujo ilustran que IL-6 induce la generación de IL-10+ células T CD4+ bajo condiciones de TH2. Citometría de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes de TH1 o TH2 en presencia o ausencia de IL-27 antes de tinción para IL-10 intracelular. Los números en las cajas representan el por ciento de células IL-10+; los números en negritas representan MFI. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. La figura 22 presenta datos de citometría de flujo ilustran que la producción de IL-10 bajo condiciones TH1 es dependiente en STAT4. Citometría de flujo de células T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6 y Stat4-/-activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones polarizantes TH1 en presencia o ausencia de IL-27 y después teñidas para IL-10 intracelular. Los números en las cajas representan el por ciento células IL-10+. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Definiciones A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual está dirigida la invención. Las siguientes definiciones complementan aquellas en la técnica y están dirigidas a la solicitud actual y no deben ser imputadas a algún caso relacionado o no relacionado, v.gr., a cualquier patente o solicitud de propiedad común. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí se pueden usar en la práctica para probar la presente invención, los materiales y método preferidos se describen aquí. Por consiguiente, la terminología usada aquí es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no pretende ser limitante. Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente determine otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una proteína" se refiere a una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células y similares. El término "aislado" se refiere a un material biológico tal como un ácido nucleico o un polipéptido, que es sustancialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el mismo en su ambiente natural. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su ambiente natural, v.gr., una célula. Por ejemplo, si el material está en su ambiente natural, tal como una célula, el material ha sido colocado en un lugar en la célula (v.gr., genoma o elemento genético) no nativo a un material encontrado en ese ambiente. Por ejemplo, un ácido nucleico que ocurre naturalmente (v.gr., una secuencia codificadora, un promotor, un mejorador, etc.) es aislado si es introducido por medios no naturales a un locus del genoma (v.gr., un vector, tal como un plásmido o vector de virus o amplicón) no nativo al ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos también se refieren como ácidos nucleicos "heterólogos". Un polipéptido aislado, por ejemplo, está en un ambiente (v.gr., un sistema de cultivo de células o purificado a partir de cultivo de células) distinto al ambiente nativo de polipéptido de tipo silvestre. Preferiblemente, el polipéptido aislado es sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro uso. El término "recombinante" indica que el material (v.gr., un ácido nucleico o un polipéptido) ha sido artificialmente o sintéticamente (no naturalmente) alterado por intervención humana. La alteración se puede realizar sobre el material dentro de, o removido de, su ambiente o estado natural. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es uno que se hace recombinando ácidos nucleicos, v.gr., durante la clonación, intercalado de ADN u otros procedimientos; un "polipéptido recombinante" o "proteína recombinante" es, v.gr., un polipéptido o proteina que es producido por expresión de un ácido nucleico recombinante. El término "ácido nucleico" abarca cualquier cadena física de unidades monoméricas que pueden corresponder a una cadena de nucleótidos, incluyendo un polímero de nucleótidos (v.gr., un polímero de ADN o ARN típico), PNAs, oligonucleótidos modificados (v.gr., oligonucleótidos que comprenden nucleótidos que no son típicos para ARN o ADN biológico, tales como oligonucleótidos 2'-0-metilados) y similares. Un ácido nucleico puede ser v.gr., de una sola cadena o de doble cadena. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular de esta invención abarca secuencias complementarias, además de la secuencia explícitamente indicada. Una "secuencia de polinucleótidos" o "secuencia de nucleótidos" es un polímero de nucleótidos (un oligonucleótidos, un ADN, un ácido nucleico, etc.) o una cadena de caracteres que representa un polímero de nucleótido, dependiendo del contexto. A partir de cualquier secuencia de polinucleótidos especificada, ya sea el ácido nucleico dado o la secuencia de polinucleótidos complementaria (v.gr., el ácido nucleico complementario) se puede determinar. "Expresión de un gen" o "expresión de un ácido nucleico" significa transcripción de ADN a ARN (opcionalmente incluyendo modificación del ARN, v.gr., empalme), traducción de ARN a polipéptido (posiblemente incluyendo modificación subsecuente del polipéptido, v.gr., modificación de post traducción), o tanto transcripción como traducción, como lo indica el contexto. El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica. Los genes típicamente incluyen secuencias codificadoras y/o secuencias reguladoras requeridas para la expresión de dichas secuencias codificadoras. El término "gen" se aplica a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o un ARNm codificado por esta secuencia genómica. Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen "promotores" y "mejoradores," a los cuales las proteínas reguladoras tales como factor de transcripción se unen, dando por resultado la transcripción de secuencias adyacentes o cercanas. Un "promotor o mejorador" específico de tejido" es uno que regula la transcripción en un tipo o tipos de tejido específico, o tipo o tipos de células específicos. Un "vector de expresión" es un vector, tal como un plásmido, que es capaz de promover la expresión así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Típicamente, el ácido nucleico que se ha de expresar es "operablemente enlazado" a un promotor y/o mejorador, y está sujeto a control de regulación de transcripción por el promotor y/o mejorados. Como se usa aquí, el término "codificación" se refiere a cualquier proceso por el cual la informaciónen una macromolécula polimérica o cadena de secuencias se usa para dirigir la producción de una segunda molécula o cadena de secuencias que es diferente de la primera molécula o cadena de secuencias. Como se usa aquí, el término se usa ampliamente y puede tener una variedad de aplicaciones. En un aspecto, el término codificación describe el proceso de replicación de ADN semiconservativa, en donde una molécula de ADN de una cadena o de doble cadena se usa como una plantilla para codificar una cadena hermana complementaria recién sintetizaa por una ADN polimerasa dependiente de ADN. En otro aspecto, la codificación se refiere a cualquier proceso por el cual la información en una molécula se usa para dirigir la producción de una segunda molécula que tiene una naturaleza química diferente de la primera molécula. Por ejemplo, una molécula de ADN puede modificar una molécula de ARN (v.gr., mediante el proceso de transcripción que incorpora una enzima de ARN polimerasa dependiente de ADN). También, una molécula de ARN puede codificar un polipéptido, como en el proceso de traducción. En otro aspecto, una molécula de ADN puede codificar un polipéptido, en donde se entiende que "codificación" como se usa en este caso incorpora tanto los procesos de transcripción como de traducción. Un "polipéptido" es un polímero que comprende dos o más residuos de aminoácidos (v.gr., un péptido o una proteína). El polímero puede comprender además elementos que no son aminoácido tales como marcadores, extintores, grupos bloqueadores o similares y puede comprender opcionalmente modificaciones tales como glicosilación o similares. Los residuos de aminoácido del polipéptido pueden ser naturales o no naturales y pueden ser no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados. Una "secuencia de aminoácidos" es un polímero de residuos de aminoácidos (una proteína, polipéptido, etc.) o una cadena de caracteres que representa un polímero de aminoácidos, dependiendo del contexto. "lnterleucina-27" o "IL-27" es una citocina heterodimérca que incluye ???3" y "p28." Otros nombres para p28 en la literatura incluyen interleucina 30 o IL30. p28 se describe, por ejemplo, en la entrada 608273 en Online Mendelian Inheritance in Man datábase, en la web en www (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/Omim. Véase también id de secuencia de proteina NP_663634 y NP_663611.1 , número de acceso a secuencia de nucleótidos NMJ45659 y NM_1 5636.1 , y ID de gen 246778 y 246779, disponible, v.gr., a través de los buscadores de proteína, nucleótido y genes del National Center for Biotechnology Information's Entrez en la web en www (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/entrez. EBI3 ("gen 3 inducido por virus de Epstein-Barr") se describe, por ejemplo, en la entrada 605816 en Online Mendelian Inheritance in Man datábase. Véase también id de secuencia de proteínas NP 005746 y NP 056581.1 , número de acceso a secuencia de nucleótidos NM_005755 y NM_015766, y I de genD 10148 y 50498. IL-27 señaliza a través de un complejo de receptor que incluye los receptores de citocina de clase I "WSX-1 " y "gp130." Otros nombres para WSX-1 en la literatura incluyen receptor de citocina de células T (TCCR), receptor alfa de interleucina 27 (IL27RA), y receptor de interleucina 27 (IL27R). WSX-1 se describe, por ejemplo, en la entrada 605350 en Online Mendelian Inheritance in Man datábase. Véase también id de secuencia de proteína NP_004834 y NP_057880.1 , número de acceso a secuencia de nucleótidos NM_004843 y NM_016671 , y ID de gen 9466 y 50931. Otros nombres para gp130 en la literatura incluyen transductor de señal de interleucina 6 (IL6ST). gp130 se describe, por ejemplo, en la entrada 600694 en Online Mendelian Inheritance in Man datábase. Véase también id de secuencia de proteína NP 002 75 y NP 034690, número de acceso a secuencia de nucleótidos NM_002184 y NM_010560, y ID de gen 3572 y 16195. Un "polipéptido WSX- " (o análogamente "polipéptido de gp130," "polipéptido p28," o "polipéptido EBI3") se refiere a un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de longitud completa de un WSX-1 que ocurre naturalmente (o gp130, p28, o EBI3) o una subsecuencia o fragmento de la misma, o una variante de la misma (es decir, una variante de la secuencia de longitud completa o la subsecuencia). Polipéptidos WSX-1 , gp130, p28, y EBI3 ilustrativos se presentan anteriormente; los polipéptidos WSX-1 , gp130, p28, y EBI3 también incluyen polipéptidos homólogos o sustancialmente idénticos a los mismos y subsecuencias o variantes de las mismas. Una "subsecuencia" o "fragmento" es cualquier porción de una secuencia entera, hasta e incluyendo la secuencia completa. Típicamente una subsecuencia o fragmento comprende menos de la secuencia de longitud completa. Opcionalmente y dependiendo de la longitud de la secuencia completa, una subsecuencia puede incluir, v.gr., por lo menos aproximadamente 25, por lo menos aproximadamente 50, por lo menos aproximadamente 75, por lo menos aproximadamente 100, por lo menos aproximadamente 200, por lo menos aproximadamente 300, o por lo menos aproximadamente 500 aminoácidos contiguos de la secuencia completa. El término "variante" (o "derivado") con respecto a un polipéptido indica que la variante tiene una secuencia de aminoácidos que es alterada por uno o más aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia (v.gr., una secuencia que ocurre naturalmente). La variante puede tener cambios "conservativos", en donde un aminoácido sustituido tiene estructura o propiedades químicas similares, v.gr., reemplazo de leucina por isoleucina. Alternativamente, una variante puede tener cambios "no conservativos", v.gr., reemplazos de una glicina por un triptofano. Variación menor análoga también puede incluir deleción o inserción de aminoácidos, o ambas. La guia para determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados o deletados sin eliminar la actividad biológica o inmunológica se pueden encontrar usando programas de computadora bien conocidos en la técnica, por ejemplo, software DNASTAR. Ejemplos de sustituciones conservativas también se describen más adelante. Las variantes también incluyen proteínas de fusión y polipéptidos de otra manera derivados del polipéptido. Opcionalmente, la variante es por lo menos aproximadamente 60% idéntica a la secuencia de referencia (v.gr., una secuencia que ocurre naturalmente, v.gr., un polipéptido WSX-1 , gp130, p28, o EBI3 humano o de ratón) o una subsecuencia del mismo. Frecuentemente, dichas secuencias son por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98%, por lo menos aproximadamente 99%, o por lo menos aproximadamente 99.5% idénticas a la secuencia de referencia, por ejemplo, sobre una subsecuencia de la secuencia de referencia incluyendo, v.gr., por lo menos aproximadamente 25, por lo menos aproximadamente 50, por lo menos aproximadamente 75, por lo menos aproximadamente 100, por lo menos aproximadamente 200, por lo menos aproximadamente 300, o por lo menos aproximadamente 500 aminoácidos contiguos de la secuencia de rferencia. El término "derivado de" se refiere a un componente que es aislado de o se hace usando una molécula especificada, o información de la molécula especificada. Por ejemplo, un polipéptido que es derivado de un segundo polipéptido puede incluir una secuencia o subsecuencia de aminoácidos que es idéntica o sustancialmente idéntica a la secuencia o subsecuencia de aminoácidos del segundo polipéptido. En el caso de polipéptidos, la especies derivadas se pueden obtener, por ejemplo, por mutagénesis que ocurre naturalmente, mutagénesis dirigida artificial, mutagénesis aleatoria artificial u otras técnicas para producir polipéptidos recombinantes. La mutagénesis de un polipéptido típicamente incluye manipulación del polinucleótido que codifica el polipéptido. El término "proteína de fusión" indica que la proteína incluye componentes de polipéptido derivados de más de una proteina o polipéptido progenitor. Típicamente, la proteína de fusión se expresa a partir de un gen de fusión en el cual una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptido de una proteína es anexado en marco con, y opcionalmente separada por un enlazador de, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptido de una proteína diferente. El gen de fusión puede ser expresado por una célula (o en un sistema de expresión in vitro) como una proteína de fusión recombinante individual. Como otro ejemplo, una proteína de fusión puede ser producida conectando covalentemente (v.gr., in vitro) los componentes de polipéptido después de que cada componente es producido por separado. Un "polipéptido WSX-1 soluble" o "WSX-1 soluble" comprende todo o parte del dominio extracelular de un polipéptido WSX-1 (v.gr., un WSX-1 que ocurre naturalmente o una variante del mismo) pero no el dominio de transmembrana o dominio intracelular. El polipéptido (o un complejo que incluye el polipéptido) es opcionalmente soluble en solución acuosa a una concentración de por lo menos aproximadamente 10 pg/ml, por lo menos aproximadamente 100 pg/ml, por lo menos aproximadamente 1 mg/ml, o por lo menos aproximadamente 10 mg/ml. Un "polipéptido gp130 soluble" o "gp130 soluble" comprende todo o parte del dominio extracelular de un polipéptido gp130 (v.gr., un gp130 que ocurre naturalmente o una variante del mismo) pero no el dominio de transmembrana o dominio intracelular. El polipéptido (o un complejo que incluye el polipéptido) es opcionalmente soluble en solución acuosa a una concentración de por lo menos aproximadamente 10 pg/ml, por lo menos aproximadamente 100 pg/ml, por lo menos aproximadamente 1 mg/ml, o por lo menos aproximadamente 10 mg/ml. Un "dominio" de una proteína es cualquier porción de la proteína entera, hasta e incluyendo la proteína completa pero comprendiendo típicamente menos que la proteína completa. Un domino puede, pero no necesita, doblar independientemente el resto de la cadena de proteína y/o estar correlacionado con una función biológica o lugar particular (v.gr., un dominio de unión a ligando, o un dominio citosólico, de transmembrana o extracelular). El término "condición inflamatoria" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno u otra condición en la cual está presente la inflamación. La inflamación puede ser, v.gr., aguda, crónica, localizada y/o sistémica y puede ser mediada por células de la respuesta inmune innata y/o adaptativa. Una composición "anti-inflamatoria" es una que alivia la inflamación. Por ejemplo, la composición puede causar resolución de o prevenir empeoramiento posterior de una condición inflamatoria. Un "sujeto" aquí es típicamente un humano, pero puede ser un mamífero no humano. Los mamíferos no humanos ilustrativos incluyen animales de laboratorio, domésticos, mascotas, animales para deporte y anímales de granja, v.gr., ratones, gatos, perros, caballos y vacas. En un aspecto, el sujeto es elegible para tratamiento de una condición inflamatoria. Para los propósitos en la presente, dicho sujeto elegible es uno que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de la condición inflamatoria. El diagnóstico de la condición (y determinación de elección para tratamiento) se puede realizar como se establece en la técnica. "Tratamiento" de un sujeto aquí se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Quienes necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen condición inflamatoria así como aquellos en los que se ha de prevenir la inflamación. Aquí, el sujeto puede haber sido diagnosticado como teniendo una condición inflamatoria o puede estar predispuesto o ser susceptible a una condición inflamatoria. El término "aliviar" o "alivio" como se usa aquí se refiere a disminución, reducción o eliminación de una condición, enfermedad o trastorno, o fenotipo, incluyendo una anormalidad o síntoma. Un "síntoma" de una condición, enfermedad o trastorno es cualquier fenómeno mórbido o separación de lo normal en estructura, función o sensación, experimentado por un sujeto y que indica la condición, enfermedad o trastorno. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva para prevenir, aliviar, o tratar una condición, enfermedad o trastorno. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un polipéptido o complejo se refiere a una cantidad del polipéptido o complejo que es efectiva para prevenir, aliviar o tratar la condición inflamatoria especificada. De manera similar, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una combinación de un polipéptido o complejo y un segundo compuesto (v.gr., un anticuerpo, otro polipéptido o complejo, o un fármaco) se refiere a una cantidad del polipéptido o complejo y una cantidad del segundo compuesto que, en combinación, son efectivos para prevenir, aliviar o tratar la condición especificada. Cabe entender que la terminología "una combinación de" dos compuestos no significa que los compuestos tengan que ser administrados en mezcla uno con otro. Por lo tanto, el tratamiento con o el uso de dicha combinación abarca una mezcla de los compuestos o administración separada de los compuestos, e incluye administración el mismo día o días diferentes. Por lo tanto, la terminología "combinación" significa que dos o más compuestos se usan para el tratamiento, ya sea individualmente o en mezcla uno con otro. Cuando un polipéptido o complejo y un segundo compuesto, por ejemplo, se administran en combinación a un sujeto, el polipéptido o complejo está presente en el sujeto en un tiempo cuando el segundo compuesto también está presente en el sujeto, ya sea que el polipéptido o complejo y segundo compuesto se administren individualmente o en mezcla al sujeto El término "anticuerpo" aquí se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, (v.gr., anticuerpos biespecífícos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancialmente o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, así como una miríada de genes de región vanable de inmunoglobulina. "Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente que comprende la región de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de fragmento de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesado y ligero asi como una región Fe. "Anticuerpos natívos"son usualmente usualmente glicoproteínas heterotetramérícas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera es enlazada a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro de intercadena regularmente separados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alienado con el dominio variable de la cadena pesada. Residuos de aminoácido particulares se cree que forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no es uniformemente distribuida en todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones de marco de trabajo (FRs). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro FRs, principalmente adoptando una configuración de lámina ß, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas juntas en estrecha proximidad por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 )). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo. La digestión de anticuerpos por papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyos nombres reflejan su capacidad para cristalizar fácilmente. El término "región Fe" se refiere a dicho fragmento de no unión a antigeno que resulta de la digestión del anticuerpo entero, ya sea en forma monomérica o multimérica. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y es capaz de entrelazar el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento a antígeno y unión a antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera en asociación apretada no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada domino variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie de dímero VH-V|_. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieten especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tienen la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión entero. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteinas de la región de gozne del anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en la cual el residuo(s) de cisteína de los dominios constantes contienen por lo menos un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteinas de gozne entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también son conocidos. Véase v.gr., Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo. Aunque varios fragmentos de anticuerpo se definen en términos de digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que dichos fragmentos pueden ser sintetizados nuevamente ya sea químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa aquí, incluye anticuerpos o fragmentos de los mismos ya sea producidos por la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados nuevamente usando metodologías de ADN recombinante. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (?) y lambda (?), con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden ser asignados a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y algunos de estos pueden ser divididos adicionalmente en subclases (isotipos), v.gr., lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, y lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de anticuerpos se llaman a (alfa), d (delta), e (épsilon), ? (gamma), y µ (mu), respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Fragmentos de anticuerpo de "Fv de una sola cademna" o "scFv" que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antigeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a parearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen en forma más completa, por ejemplo, en EP 404,097; WO 1993/11161 ; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). El término "anticuerpo monoclonal" como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epitope, excepto por posibles variantes que pueden producirse durante la producción del anticuerpo monoclonal, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades menores. A diferencia de preparaciones de anticuerpo policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes) cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que no son contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no es construido como se requiere producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usarse de conformidad con la presente invención se pueden hacer por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden hacer por métodos de ADN recombinante (véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de genotecas de anticuerpo de fago usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991 ) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de E.U.A. No. 4,816,567; Morríson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)). Anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (v.gr., monos di viejo mundo, tales como babuinos, monos resus o mono cinomolgus) y secuencias de región constante humanas (patente de E.U.A. No. 5,693,780). Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (v.gr., murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos de receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son colocados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo del donador) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región de marco de trabajo (FR) de la inmunoglobulina humana son remplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o por lo menos uno y típicamente dos dominios variables en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FRs son los de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por sustitución(es) de FR como se indicó anteriormente. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). El término "región hipervariable" cuando se usa aquí se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antigeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (véase, v.gr., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 )) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (véase, v.gr., Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Residuos de "marco de trabajo" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos a los residuos de región hipervariable como se define aquí. Los términos "receptor de Fe" y "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. FcRs son revisados en Ravetch y Kinet (1991 ) Annu. Rev. Immunol 9:457-92; Capel et al. (1994) Immunomethods 4:25-34; y de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-41. Otros FcRs, incluyendo aquellos que se han de identificar en el futuro, son abarcados por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117:587 y Kim et al. (1994) J. Immunol. 24:249). Un "modulador de actividad" modula (mejora o inhibe) una actividad de un polipéptido o complejo (v.gr., un receptor o ligando de receptor), ya sea parcialmente o completamente. Un modulador puede ser, v.gr., una molécula pequeña, un polipéptido, un ácido nucleico, etc. Un "agonista" es un compuesto (v.gr., una sustancia endógena o un fármaco) que se puede unir a y activar un receptor, iniciando así una respuesta (v.gr., una respuesta fisiológica o farmacológica) característica de ese receptor. Los antagonistas pueden ser, v.gr., agonistas completos o agonistas parciales. Un "antagonista" es un compuesto (v.gr., un fármaco) que se puede unir a un receptor y evitar que un agonista se una a y active ese receptor. Típicamente, la unión de un antagonista a un receptor forma un complejo que no da origen a ninguna respuesta, como si el receptor estuviera desocupado. Alternativamente, el antagonista puede ser un agonista parcial. Cabe notar que ciertos compuestos se pueden clasificar tanto como agonistas como antagonistas. Por ejemplo, un "agonista-antagonista mixto" (también llamado un "angonista parcial") es un compuesto que posee afinidad para un receptor, pero que, a diferencia de un agonista completo, -inducirá sólo un pequeño grado de la respuesta característica de ese receptor, aun cuando una alta proporción de receptores sean ocupados por el compuesto. Dicha ocupación de los receptores por el agonista parcial pueden evitar la unión de un agonista completo (v.gr., un agonista endógeno) al receptor. Una variedad de términos adicionales se definen o se caracterizan de otra manera aquí.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Existen numerosas condiciones inflamatorias en las cuales las células T son mediadores críticos de enfermedad, y se ha enfocado un gran esfuerzo en el desarrollo de estrategias para inhibir específicamente respuestas de células T. Por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, uveítis, psoriasis, artritis, asma, lupus y rechazo de trasplante son todas ellas condiciones que implican células T. La respuesta inmune también ha sido implicada en una variedad de otras condiciones idiopáticas, tales como espondilitis anquilosante y sarcoidosis. Para todas estas condiciones, existe una fuerte necesidad de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. El reconocimiento de que WSX-1 es importante en la inhibición de respuestas de células T significa que este receptor representa un objetivo viable para prevenir este tipo de respuestas inflamatorias. Alternativamente, el bloqueo de este receptor se podría usar para aumentar respuestas de células T, por ejemplo durante vacunación o terapia inmunomediada para cáncer. Además, ciertos tipos de tumores que expresan WSX-1 también pueden ser susceptibles a señalización inhibidora a través de este receptor. Otras células que expresan WSX-1 o su pareja gp130 (incluyendo células que expresan ambas) pueden ser dirigidas aun objetivo de manera similar. Las respuestas mediadas ya sea por células que expresan WSX-1 o por células que expresan gp130 pueden ser moduladas, por ejemplo, por un polipéptido o complejo de gp130 o un polipéptido o complejo de WSX-1 soluble, respectivamente, o por p28. Por lo tanto, las respuestas mediadas por células B, células cebadas, neutrófilos, macrófagos, células dendríticas y/o similares pueden ser moduladas por la activación o bloqueo del receptor(es) pertinente.

Usos y aplicaciones comerciales potenciales p28, solo o en combinación con una forma soluble de WSX-1 , se puede usar para suprimir muchas condiciones inflamatorias incluyendo, pero sin limitarse a, alergias, artritis, enfermedad intestinal inflamatoria, uveítis, ciertos cánceres, psoriasis, lupus, esclerosis múltiple y enfermedades infecciosas crónicas tales como tuberculosis y hepatitis. Enfoques similares están implicados como enfoques terapéuticos útiles a partir de estas observaciones. Por ejemplo, una proteina de fusión de WSX-1 (v.gr., con una inmunoglobulina) es útil ya que ¡nteractúa con una IL-27 endógena y promueve su interacción con gp 30 y promueve efectos negativos sobre los objetivos. También se pueden construir moléculas terapéuticas que tienen funciones dobles; por ejemplo, dicha molécula se puede basar en una estructura de anticuerpo en donde una cadena puede reconocer un marcador especifico de célula tal como, pero sin limitarse a CD4, CD8, CD11c, etc., y la otra cadena contiene una fusión de WSX-1 o p28. Esto permite la dirección hacia un objetivo de tipos de células muy específicos. Además, el reconocimiento de que la biología de receptor abarca elementos de señalización trans conduce a la idea de que formas solubles de gp130 en complejos con IL-27 o p28 (o incluso EBI3) también pueden actuar para promover señalización específica a través de WSX-1. Sin limitarse a algún mecanismo en particular, en el modelo actual de los inventores de la presente invención las cadenas de receptor diferentes del receptor IL-27 tienen funciones de señalización únicas y pueden afectar distintas funciones de células T. Este concepto conduce al diseño de moléculas que afectan la producción de células T de citocinas particulares de manera muy específica. Con base exclusivamente en el trabajo y datos de los inventores de la presente invención, estos sugieren que este enfoque se puede usar para dirigir a un objetivo, pro ejemplo, IL-2, IF-gamma, FNT-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17 e IL-25, así como IL-10, IL-5, y/o CD25. Todos estos representan objetivos de fármaco válidos para biotecnología y son importantes en muchas enfermedades inflamatorias mediadas por células T. Las figuras 13A-13C delinean algunas estrategias candidatas. Como se describe con mayor detalle y con ejemplos adicionales aquí, existen muchos enfoques adicionales que se pueden formular con base en esta información que permiten dirigir a un objetivo de manera racional funciones inmunológicas discretas.

Composiciones anti-inflamatorias Un aspecto de la invención provee composiciones que incluyen polipéptidos y complejos novedosos, incluyendo composiciones que tienen actividad anti-inflamatoria. Una clase general de modalidades provee una composición que comprende un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido WSX-1/EBI3 soluble aislado o recombinante, un complejo de WSX-1/IL-27 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble aislado o recombinante, un complejo de gp130/IL-27 soluble aislado o recombinante, o una variante de los mismos. A manera de ejemplo, un "complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble" comprende un polipéptido WSX-1 soluble en complejo con un polipéptido p28, y una variante del complejo incluye una variante de polipéptido WSX-1 soluble y/o una variante de polipéptido p28. En un aspecto, la composición es anti-inflamatoria. La composición opcionalmente reduce la inflamación cuando se administra a un sujeto, v.gr., un humano o animal que presenta inflamación antes de dicha administración. De manera similar, la composición opcionalmente altera (v.gr., reduce) una o más actividades celulares características de una respuesta inflamatoria, por ejemplo, la expresión de citocinas particulares, en células a las cuales se aplica la composición en relación con células no expuestas a la composición. La composición opcionalmente incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, en modalidades en las cuales la composición se ha de administrar a un sujeto. En una modalidad, la composición suprime el desarrollo de células productoras de IL-17 (también llamadas células T17) a partir de células T intactas inducidas por IL-6 y factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß). Por ejemplo, la composición puede suprimir el desarrollo de células auxiliares T CD4+ productoras de IL-17 (TH-17) a partir de células T intactas inducidas por IL-6 y factor de crecimiento transformante beta. De manera similar, la composición opcionalmente suprime una o más funciones de las células T17. En una modalidad, la composición incluye TGF-ß. La composición puede incluir una o más células, por ejemplo, una o más células T, células B, células cebadas, neutrófilos, macrófagos, células dendriticas u otras células que expresan gp130 (v.gr., célula endotelial) o WSX-1. El complejo puede afectar una función o actividad de la célula. En una modalidad, la composición incluye una célula T, y la composición altera una función o actividad de la célula T, en relación con una célula T correspondiente no tratada con la composición. Por ejemplo, la célula T puede desplegar expresión alterada de IL-2, IFN-gamma, FNT-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5 o CD25, proliferación alterada o supervivencia alterada. La expresión de varias citocinas puede ser detectada por cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas en el campo, v.gr., para detectar niveles de ARNm y/o proteina. La expresión de las citocinas (v.gr., IL-2 e IFN-gamma) es típicamente regulada descendentemente por el complejo, aunque la producción de citocina IL-10 inhibidora es típicamente incrementada. De manera típica, un complejo de WSX-1 se usa para modular la actividad de una célula que expresa gp130 (y opcionalmente también WSX-1 ), aunque un complejo de gp130 se usa para modular la actividad de una célula que expresa WSX-1 (y opcionalmente también gp130). Los polipéptídos de WSX-1 y gp130 solubles adecuados incluyen, por ejemplo el dominio extracelular de WSX-1 o gp130 o una porción (o subsecuencia) del mismo. El dominio extracelular es opcionalmente parte de una proteína de fusión, v.gr., una de aquellas descritas aquí o una fusión con una región Fe, v.gr., un dominio IgG Fe. Véase, por ejemplo, publicación de solicitud de Patente de E.U.A. 20040185049 de Hunter y Villarino titulada "Methods for modulating an inflammatory response" y Wirtz et al. "Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27" J. Exp. Med. 10.1084/jem.20060471 para una descripción de polipéptidos de WSX- solubles. Los polipéptidos de WSX-1 solubles adicionales se construyen fácilmente, y algunos están comercialmente disponibles. Por ejemplo, quimeras de TCCR/WSX-1/Fc humanas y de ratón están disponibles de R&D Systems (en la web en www (dot) rndsystems (dot) com). Los polipéptidos de gp 30 solubles se pueden producir análogamente; véase v.gr., Jostock et al. (2001) "Soluble gp130 is the natural inhíbitor of soluble interleukin-6 receptor transsignaling responses" Eur. J. Biochem. 268:160-167 y Lin et al. (2006) "The functional expression of a biologically active fragment of soluble gp130 as an ELP fusión protein in transgenic plants: purification via inverse-transition-cyeling" Biochem J. 23 de mayo doi:10.1042/BJ20060544. De manera similar, polipéptidos de p28 y EBI3 adecuados incluyen, v.gr., p28 o EBI3 o una subsecuencia de los mismos. Los componentes del complejo están opcionalmente asociados de manera no covalente en el complejo, o están opcionalmente conectados de manera covalente por un entrelazados químico o similar en el complejo. Las proteínas de fusión son otra característica de la invención. Por consiguiente, una clase general de modalidades provee una proteína de fusión WSX-1 recombinante o aislada. La proteína de fusión incluye un polipéptido WSX-1 , que puede estar, v.gr., en el N-terminal de la proteína de fusión, en el C-terminal de la proteína de fusión, o interno a la proteina de fusión. El polipéptido WSX-1 puede incluir el dominio extracelular, o una subsecuencia del mismo, de un WSX-1 que ocurre naturalmente (v.gr., WSX-1 humano) o una variante del mismo. En una clase de modalidades, la proteína de fusión comprende uno o más dominios que reconocen un marcador específico de célula, por ejemplo, uno o más dominios de anticuerpo (v.gr., dominios VH y VL) que reconocen el marcador. El marcador específico de célula puede ser esencialmente cualquier marcador específico de célula, por ejemplo, un marcador para una población de linfocitos, una célula T, una célula de respuesta inmune innata tal como neutrófilo, célula dendrítica o célula cebada o una célula cancerosa. Una variedad de dichos marcadores para varios tipos de células se conocen en la técnica y otros más se pueden determinar por técnicas bien conocidas en el campo. En una clase de modalidades, el marcador específico de célula se selecciona de CD4, CD8, CD1 1 c, CD1 1 b y NK1.1. En una clase de modalidades, la proteína de fusión comprende uno o más dominios de polipéptido derivados de p28 o EBI3. La proteina de fusión opcionalmente incluye dominios derivados tanto de p28 como EBI3. El polipéptido WSX-1 se puede unir al polipéptido p28 o EBI3 a través de un enlazador. Muchos enlazadores adecuados son conocidos en la técnica (v.gr., enlazadores que incluyen residuos 4-6 Gly y/o Ala), y enlazadores adicionales s on fácilmente diseñados (véase, v.gr., Crasto and Feng (2000) "LINKER: A program to genérate linker sequences for fusión proteins" Protein Engineering 13:309-312). La proteína de fusión puede ser nomonérica, dimérica (v.gr., homodimérica o heterodimérica) o multimérica. La proteína de fusión es preferiblemente soluble. Opcionalmente, la proteína de fusión forma un complejo con p28, EBI3 o IL27. Esencialmente todas las características señaladas para las modalidades anteriores se aplican a estas modalidades también, según sea pertinente. Por ejemplo, una composición que incluye la proteína de fusión opcionalmente incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable, una célula (v.gr., una célula T), y/o TGF-ß. Otra clase general de modalidades provee una proteína de fusión p28 recombinante o aislada. La proteína de fusión incluye un polipéptido p28, que puede estar, v.gr., en el N-terminal de la proteína de fusión, en el C-terminal de la proteína de fusión, o interno a la proteína de fusión. El polipéptido p28 se puede derivar de un p28 que ocurre naturalmente (v.gr., p28 humano) o una variante del mismo. La proteína de fusión opcionalmente comprende uno o más dominios de anticuerpo. Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir uno o más dominios de anticuerpo que reconoce un marcador específico de célula. Esencialmente todas las características señaladas para las modalidades anteriores se aplican a esas modalidades también, según sea pertinente, por ejemplo, con respecto a marcadores específicos de célula, solubilidad, estado monomérico, dimérico o multimérico, formación de complejo, inclusión en composiciones (v.gr., con un excipiente farmacéuticamente aceptable, una célula y/o TGF-ß), y/o similares. Será evidente que las proteínas de fusión gp130y EBI3 se construyan de manera análoga y formen otra característica de la invención.

Determinación selectiva para moduladores Los compuestos que modulan la actividad de WSX-1 , p28, EBI3 y/o gp130 pueden ser útiles, por ejemplo, para tratar inflamación u otra modulación de la respuesta inflamatoria. Por consiguiente, una clase general de modalidades provee métodos de identificación de un compuesto que se une a o modula una actividad de un polipéptido WSX-1 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1 /IL-27 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/EBI3 soluble, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble, un complejo de polipéptido gp 30/IL-27 soluble o un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble. En los métodos, una muestra biológica o bioquímica que comprende el polipéptido o complejo se pone en contacto con un compuesto de prueba. La unión del compuesto de prueba con el polipéptido o complejo o la modulación de la actividad del polipéptido o complejo por el compuesto de prueba es detectado, identificando asi el compuesto que se une a o modula la actividad del polipéptido o complejo. En una clase de modalidades, el compuesto potencia la inhibición de una respuesta de célula T por el polipéptido o complejo, potencia la actividad antagonista contra IL-2 o IL-17, o altera la proliferación de células T, supervivencia o expresión de IL-2, IFN-gamma, FNT-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5 o CD25 en relación con una célula T correspondiente no tratada con el compuesto. El compuesto opcionalmente se une al receptor de IL-27, bloquea la interacción entre WSX-1 y gp130, potencia la interacción entre WSX-1 y gp130, potencia la interacción de p28 con WSX-1 o el receptor de IL-27, o similares. Ejemplos ilustrativos incluyen anticuerpos (v.gr., anticuerpos contra polipéptidos WSX-1 , p28, EBI3 y/o gp130), agonistas, antagonistas y moduladores de actividad, por ejemplo, moléculas pequeñas. La muestra biológica o bioquímica puede incluir polipéptidos o complejos aislados o recombinantes, células (v.gr., células T), muestras de tejido y/o similares. Las respuestas de células T tales como proliferación, supervivencia y expresión de marcador pueden ser probadas por técnicas conocidas en el campo.

Anticuerpos Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido p28, un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido WSX-1 /EBI3 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido WSX-1 /IL-27 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/IL-27 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble aislado o recombinante o una variante de los mismos son una característica de la invención. Dicho anticuerpo opcionalmente modula, v.gr., potencia, una actividad del polipéptido o complejo de polipéptido. En una modalidad, el anticuerpo se une a o modula una actividad de un complejo de gp130/WSX-1/IL-27 o modula la formación del complejo en una célula. Por ejemplo, el anticuerpo puede incrementar la vida media del complejo. Dicho polipéptido puede incluir, pero no se limitan a, policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado, de una sola cadena, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. Dichos anticuerpos encuentran uso, por ejemplo, en el tratamiento de condiciones inflamatorias. Los métodos para generar dichos anticuerpos se describirán aquí. El antígeno que se ha de usar para la producción de, o determinación selectiva para, anticuerpo(s) puede ser v.gr., una forma soluble de WSX-1 , p28, gp130 o EBI3, o una porción o complejo del mismo, que contiene el epitope deseado. Alternativamente, o adicionalmente, las células que expresan WSX-1 o gp130 en su superficie celular se pueden usar para generar, o determinar selectivamente, anticuerpo(s). Otras formas de polipéptidos WSX-1 , p28, gp130 o EBI3 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica. Los anticuerpos que facilitan la acción de IL2 e IL6 se conocen en la técnica; la determinación selectiva para anticuerpos que facilitan la acción de WSX-1 , p28, gp130 y/o EBI3 se puede obtener a través de métodos similares. Véase, v.gr., Boyman et al. (2006) "Selective Stimulation of T Cell Subsets with Antibody-Cytokine Immune Complexes" Science 311 :1924-1927 y Suzuki et al. (1994) "Antibody against interleukin-6 reduces inflammation and numbers of cysts in brains of mice with toxoplasmic encephalitis" Infect Immun. 62: 2773-2778. Por ejemplo, anticuerpos producidos contra polipéptidos WSX-1 , p28, gp130 y/o EBI3 (incluyendo complejos) se pueden probar para unirse a los polipéptidos o complejos de los mismos o probar para determinar si modulan la actividad de los polipéptidos o complejos usando técnicas conocidas en el campo. Un anticuerpo que se une a un complejo es opcionalmente un anticuerpo que se une a un componente de polipéptido del complejo independientemente de si ese polipéptido es parte del complejo o no, o es opcionalmente un anticuerpo que se une específicamente al complejo y no a cualquier componente de polipéptido del complejo (v.gr., el anticuerpo se puede unir al complejo con una afinidad por lo menos 1000 veces mayor que su unión a un componente del complejo). Numerosos métodos para producir anticuerpos son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden adaptar para producir anticuerpos específicos para polipéptidos o complejos de la invención. Véanse las siguientes secciones, así como, v.gr., Coligan (1991 ) Current Protocols in Immunoloqy Wilev/Greene, NY¡ y Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4a. ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en las mismas; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; Fundamental Immunology, e.g., 4a Edición (o posterior),W.E. Paul (ed.), Raven Press, N.Y. (1998); y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Otras técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos incluyen la selección de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares. Véase, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281 ; y Ward, et al. ( 1989) Nature 341 : 544-546. Detalles adicionales sobre producción de anticuerpos y técnicas de ingeniería genética se pueden encontrar en USPN 5,482,856, Borrebaeck (ed) (1995) Antibody Engineering, 2a Edición Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL en Oxford Press, Oxford, Inglaterra (McCafferty), Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul), Ostberg et al. (1983) Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, USPN 4,634,664, y Engelman et al. USPN 4,634,666. Anticuerpos específicos (v.gr., anticuerpos monoclonales y policlonales específicos) y antisueros se unirán usualmente con un KD de por lo menos aproximadamente 0.1 µ?, preferiblemente por lo menos aproximadamente 0.01 µ? o mejor, y muy típicamente y preferiblemente, 0.001 µ? o mejor. Como se apreciará, las características de unión de dicho anticuerpo dependerán típicamente de la aplicación específica a la cual se ha de poner el anticuerpo, incluyendo características ambientales, v.gr., pH, concentración de sal y similares. En ciertos aspectos preferidos, las condiciones ambientales típicamente incluirán las de sistemas bioquímicos, v.gr., pH entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9 (v.gr., aproximadamente 7), y niveles de sal a concentración iónica bioquímica relevante, v.gr., entre aproximadamente 0 mM y 100 mM.

Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se producen preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente a una proteína que es inmunogénica en la especie que ha de ser inmunizada, v.gr., hemocianina de lapa, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino o inhibidor de tripsina de soya usando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteina), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCL2, o R'N=C=NR, en donde R y R' son grupos alquilo diferentes. Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, v.gr., 100 pg o 5 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad de péptido o conjugado con el adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días más tarde se obtiene sangre de los animales y el suero se prueba para título de anticuerpos. Los animales son reforzados hasta la meseta de titulo. Preferiblemente, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrelazamiento diferente. Los conjugados también se pueden hacer en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteína. También, los agentes de agregación tales como alumbre son usados adecuadamente para incrementar la respuesta inmune.

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítope excepto por posibles variantes que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como uno que no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer usando el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden hacer por métodos de ADN recombinante (Patente de E.U.A. No. 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describió anteriormente para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los linfocitos después son fusionados con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantinas, aminofterina y timidina (medio de HAT), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio de HAT. Entre éstas, las lineas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-1 1 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. E.U.A. y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Md. E.U.A. Las lineas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se hacen crecer se prueba para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por una prueba de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después de que se han identificado células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden ser subclonados limitando los procedimientos de dilución y haciendo crecer mediante métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Pres, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden hacer crecer in vivo como tumores de ascitos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son adecuadamente separados del medio de cultivo, fluido de ascitos o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, agarosa entrelazada a proteína A-Sepharose®, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (v.gr., usando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de murino). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que después son transfectados en células hospedero tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedero recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados en genotecas de fago de anticuerpo generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991 ) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 -597 (1991 ) describe el aislamiento de anticuerpos de murino y humanos, respetivamente, usando genotecas de fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango de nM) por combinación de cadena (Marks et al. , Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinadora y recombinación in vivo como una estrategia para construir genotecas de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. , 21 :2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación para dominios de constante de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias de murino homologas (Patente de E.U.A. No. 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984)) , o por unión covalente de la secuencia codificadora de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Opcionalmente, dichos polipéptidos que no son inmunoglobulina sustituyen a los dominios constantes de un anticuerpo, o sustituyen a los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente.

Anticuerpos humanizados En la técnica se han descrito métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuene que es no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), utilizando secuencias de región hipervariable en lugar de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U.A. No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos típicamente humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de dominios de variable humana, tanto ligeros como pesados, que han de ser usados para hacer los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir la antigenicidad. De conformidad con el denominado método "de mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es determinada selectivamente contra la genoteca entera de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la de un roedor es entonces aceptada como la región de marco de trabajo humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151 :2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método usa una región de marco de trabajo particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. El mismo marco de trabajo se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati., Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151 :2623 (1993)). Es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para logar esta meta, de conformidad con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias progenitoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar del receptor y secuencias de importación de modo que la característica de anticuerpo deseado, tal como afinidad incrementada para el antígeno(s) objetivo, se logra. En general, los residuos de región hipervariable están directamente y muy sustancialmente implicados en la influencia de la unión a antigeno.

Anticuerpos humanos Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (v.gr., ratones) que son capaces, bajo inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da por resultado la inhibición completa de la producción de antígeno endógeno. La transferencia de la disposición de gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará por resultado la producción de anticuerpos humanos bajo desafio de antígeno. Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y patente de E.U.A. Nos. 5,591 ,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, la tecnología de despliegue de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) se puede usar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, de repertorios de gen de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. De conformidad con esta técnica, los genes de dominio-V de anticuerpo son clonados en cuadro ya sea en un gen de proteina de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y desplegados como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola cadena del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan por resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta estas propiedades. Por lo tanto, el fago simula algunas de las propiedades de la célula B. El despliegue de fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión, véase, v.gr., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen-V se pueden usar para despliegue de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una genoteca combinacional aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de un ratón inmunizado. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados se puede construir y anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) se pueden aislar esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991 ), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse también, Patentes de E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Anticuerpos humanos también pueden ser generados por células de activado in vitro (véanse Patentes de E.U.A. Nos. 5,567,610 y 5,229,275).

Fragmentos de anticuerpo Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, v.gr., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-1 17 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente por células hospedero recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las genotecas de fago de anticuerpo descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser directamente recuperados de E. coli y químicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio Technology 10: 163-167 (1992)). De conformidad con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de cultivo de células hospedero recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el experto en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elecci8ón es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). Véanse WO 1993/16185 y patentes de E.U.A. Nos. 5,571 ,894 y 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", v.gr., como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,641 ,870. Dichos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecificos o biespecíficos.

Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para por lo menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecíficos ilustrativos pueden unirse a dos epítopes diferentes de antigeno WSX-1 , p28, gp130 o EBI3. Otros de dichos anticuerpos se pueden unir a uno de WSX-1 , p28, gp130 o EBI3 y además se unen a otro de WSX-1 , p28, gp130 o EBI3 o un marcador de superficie de célula T. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar fármacos o agente citotóxicos a una célula que comprende el antígeno; estos anticuerpos poseen un brazo de unión a WSX-1 , p28, gp130 o EBI3 y un brazo que se une al fármaco o agente citotóxico. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (v.gr., anticuerpos biespecíficos de F(ab')2). Métodos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se hace por pasos de cromatografía de afinidad, es más bien tediosa, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 1993/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). De conformidad con un enfoque diferente, los dominios de variable de anticuerpo con especificidades unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antigeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones de gozne CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera, esté presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y son cotransfectados en un organismo hospedero adecuado. Esto provee gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proveen los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales da por resultado rendimientos altos o cuando las relaciones no son de importancia particular. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que provee una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina sólo en una mitad de la molécula biespecífica provee una forma fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 1994/04690. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121 :210 (1986). De conformidad con otro enfoque descrito en la patente de E.U.A. No. 5,731 ,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser manipulada genéticamente para aumentar al máximo el porcentaje de heterodimeros que son recuperados del cultivo de célula recombinante. La interfaz preferida comprende por lo menos una parte del dominio de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más de las cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales más grandes (v.gr., tirosina o triptofano). "Cavidades" compensadoras de identidad o tamaño similar a la cadena(s) lateral grande son creadas sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas de aminoácidos grandes con unas más pequeñas (v.gr., alanina o treonina). Esto provee un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros. Anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos entrelazados o de "heteroconjugado". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos, por ejemplo, se ha propuesto que dirijan células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de E.U.A. No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección por VIH (WO 1991/00360, WO 1992/200373, y EP 03089). Los anticuerpos de heteroconjugado se pueden hacer usando cualesquiera métodos de entrelazamiento convenientes. Los agentes de entrelazamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de entrelazamiento. Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos se pueden preparar usando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son proteolíticamente digeridos para generar fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente formador de complejo de ditiol, arsenita de sodio, para estabilizar ditioles vicinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos de Fab' generados son entonces convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB es después reconvertido al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir de cultivo de células recombinante también se ha descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos se han producido usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de gozne para formar monómeros y después reoxidados para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrito por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha provisto un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de caena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv (sFv) de una sola cadena también se ha reportado. Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecificos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). Será evidente que ciertas proteínas de fusión, v.gr., ciertas proteínas de fusión WSX-1 o p28, se pueden preparar usando técnicas análogas a aquellas para la producción de anticuerpo biespecífico. Una proteína de fusión WSX-1 o p28 basada en un anticuerpo biespecífico puede poseer un brazo que se una a un marcador específico de células (v.gr., CD4, CD8, CD1 1 c, CD11 b y NK1.1 ) y un brazo en el cual los dominios de unión a antígeno son reemplazados con un polipéptido WSX-1 o p28.

Conjugados y otras modificaciones del anticuerpo El anticuerpo usado en los métodos o incluido en los artículos de fabricación aquí es opcionalmente conjugado a un fármaco, v.gr., como se describe en WO 2004/032828 y publicación de solicitud de Patente de E.U.A. 2006/0024295. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar con una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (v.gr., un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase WO 1981/01 145) a un fármaco anticanceroso activo u otro fármaco. Véase, por ejemplo, WO 1988/07378, Patente de E.U.A. No. 4,975,278 y publicación de solicitud de Patente de E.U.A. 2006/0024295. Otras modificaciones del anticuerpo se contemplan aquí. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser enlazado a una variedad de polímeros no proteinaceos, v.gr., polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Los anticuerpos descritos aquí también se pueden formular como liposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los que se describen en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); Patentes de E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 1997/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación incrementado se describen en la patente de E.U.A. No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación de fase inversa con la composición lipidica comprendiendo fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada por PEG (PEG-PE). Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab' de un anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al. J. National Cáncer Inst. 81(19)1484 (1989). Modificaciones de secuencia de aminoácidos de anticuerpos de proteína o péptido descritas aquí se contemplan. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótido apropiados en el ácido nucleico de anticuerpo, o por síntesis de péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace que llegue a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos de post-traducción del anticuerpo, tales como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son lugares preferidos para muagénesis se llaman "mutagénesis de escudriñamiento de alanina" como lo describe Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (v.gr., residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y reemplazados por aminoácidos neutros o negativamente cargados (muy preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antigeno. Esos lugares de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son entonces refinados al introducir variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación como tal no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, el escudriñamiento de alanina o mutagénesis aleatoria se conduce en el codón o región objetivo y las variantes de anticuerpo expresadas son determinadas selectivamente para la actividad deseada. Inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones de intrasecuencia de un solo residuo de aminoácidos o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo, con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al N- o C-terminal del anticuerpo de una enzima, o un polipéptido que incrementa la vida media en el suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional de anticuerpos incluyen las regiones hipervariables, pero alteraciones de FR también se contemplan. Dichas sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas. Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo también puede ser sustituido, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrelazamiento aberrante. Por el contrario, el enlace(s) de cisteína se puede añadir al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv). Un tipo de variante sustitucional implica la sustitución de uno o más residuos de reacción hipervariable de un anticuerpo progenitor. Generalmente, la variante(s) resultante seleccionada para desarrollo posterior tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo progenitor del cual se generaron. Una forma conveniente para generar dichas variantes sustitucionales es la maduración de afinidad usando despliegue de fagos. En breve, varios sitios de región hipervariable (v.gr., 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas son desplegadas de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto del gen III del M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas en fago son entonces determinadas selectivamente para su actividad biológica (v.gr., afinidad de unión) como se describe aquí. A fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, se puede realizar mutagénesis de escudriñamiento de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o además, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de conformidad con las técnicas elaboradas aquí. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes es sometido a determinación selectiva como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores en una o más pruebas pertinentes se pueden seleccionar para desarrollo posterior. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Dicha alteración incluye deletar una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el anticuerpo. La glicosilación de polipéptidos es típicamente ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias del tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalacosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, muy comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glicosilación N-enlazados). La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados). En donde el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido a la misma puede ser alterado o removido. Por ejemplo, en una variante de glicosilación aquí, una o más sustituciones de aminoácido son introducidas en una región Fe de un anticuerpo para eliminar uno o más sitios de glicosilación. Dicho anticuerpo aglicosilado puede tener función efectora reducida, v.gr., en comparación con una lgG1 humana, de tal manera que su capacidad para inducir activación de complemento y/o citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo es reducida, y el anticuerpo aglicosilado puede tener unión reducida (o no) al receptor de Fe. Para ciertos anticuerpos, v.gr., anticuerpos agotados, la modificación del anticuerpo para implementar ADCC y/o CDC del anticuerpo puede ser deseable. Por ejemplo, anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura que carece de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo se describe en U.S. 2003/0157108 (Presta, L). Véase también U.S. 2004/0093621 (Kyowa Hako Kogyo Co., Ltd.). Anticuerpos con una N-acetilglucosamina de bisección (GI cNAc) en el carbohidrato unido a una región Fe del anticuerpo son referenciados en WO 2003/01 878, Jean-Mairet et al. y Patente de E.U.A. No. 6,602,684. Umana et al. Anticuerpos con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo se reportan en WO 1997/30087, Patel et al. Véase también, WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.) referente a anticuerpos con carbohidrato alterado unido a la región Fe de los mismos. Por lo tanto, una variante de glicosilación opcionalmente comprende una región Fe, en donde una estructura de carbohidrato unida a la región Fe carece de fucosa. Dichas variantes tienen función de ADCC mejorada. Opcionalmente, la región Fe además comprende una o más sustituciones de aminoácido en la misma que mejora adicionalmente ADCC, por ejemplo, sustituciones en posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración de residuos de Eu). Ejemplos de publicaciones relacionadas con anticuerpos "desfucosilados" o "deficiente en fucosa" incluyen: U.S. 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; U.S. 2003/01 15614; U.S. 2002/0164328; U.S. 2004/0093621 ; U.S. 2004/0132140; U.S. 2004/01 10704; U.S. 2004/01 10282; U.S. 2004/0109865; WO 2003/085 19; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239- 1249 (2004); y Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Ejemplos de lineas de células que producen anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); U.S. 2003/0157108, Presta, L; y WO 2004/056312, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 1 ), y líneas de células knockout, tales como gen alfa-1 ,6-fucosiltransferasa, células CHO con deficiencia de FUT8 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)). La modificación del anticuerpo con respecto a la función efectora, v.gr., para incrementar ADCC y/o CDC del anticuerpo se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe de un anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el residuo(s) de cisteína se puede introducir en la región Fe, permitiendo así formación de enlace de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte de células mediada por complemento incrementada y ADCC. Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B.J. Immunol 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral incrementada también se pueden preparar usando entrelazadores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser manipulado genéticamente de manera que tenga regiones Fe dobles y por lo tanto puede tener capacidades de lisis de complemento y ADCC incrementadas. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). WO 2000/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con función de ADCC mejorada en presencia de células efectoras humanas, donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácidos en la región Fe de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo con ADCC mejorada comprende sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe. Preferiblemente, la región Fe alterada es una región Fe de lgG1 humana que comprende o consiste de sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Anticuerpos con unión a C1 q alterada y/o CDC se describen en WO 1999/51642 y Patentes de E.U.A. Nos. 6,194,551 , 6,242,195, 6,528,624 y 6,538,124 (Idusogie et al.). Los anticuerpos comprenden una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de la región Fe de los mismos. Para incrementar la vida media en el suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de unión a receptor de recuperación en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,739,277, por ejemplo. Como se usa aquí, el término epítope de unión a receptor de recuperación se refiere a un epítope de la región Fe de una molécula de IgG (v.gr., IgG-i , lgG2, lgG3 o lgG4) que es responsable para incrementar la vida media en el suero in vivo de la molécula de IgG. Anticuerpos con sustituciones en una región Fe de los mismos y vidas medias en el suero incrementadas también se describen en WO 2000/42072 (Presta, L).

Cualquiera de los anticuerpos no agotables (u otros) de la invención pueden comprender por lo menos una sustitución en la región Fe que mejora la unión a FcRn o vida media en el suero. Por ejemplo, la invención además provee un anticuerpo que comprende una región Fe de variante con afinidad de unión a receptor Fe neonatal alterada (FcRn). FcRn es estructuralmente similar a complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y consiste de una unión no covalente de cadena a a microglobulina ß2. Las funciones múltiples del receptor Fe neonatal FcRn son revisadas en Ghetie y Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18:39-766. FcRn juega un papel en el suministro pasivo de inmunoglobulina IgGs de madre a hijo y la regulación de los niveles de IgG en suero. FcRn actúa como un receptor de recuperación, uniendo y transportando IgGs pinocitosadas en forma intacta tanto dentro como a través de las células, y rescatándolas de una vía de degradación por omisión. Aunque los mecanismos responsables para la recuperación de IgGs son aún inciertos, se piensa que las IgGs no unidas están dirigidas hacia la proteólisis en lisosomas, en donde las IgGs unidas son recicladas a la superficie de las células y liberadas. Este control tiene lugar dentro de las células endoteliales localizadas en los tejidos adultos. FcRn se expresa por o menos en el hígado, glándulas mamarias e intestino de adultos. FcRn se une a IgG; la interacción de FcRn-lgG ha sido estudiada extensivamente y parece implicar residuos en la interfaz del dominio CH2, CH3 de la región Fe de IgG. Estos residuos interactúan con residuos principalmente localizados en el dominio 2 de FcRn.

En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo de variante no agotable puede desplegar unión incrementada a FcRn y comprender una modificación de aminoácido en cualquier o más de las posiciones de aminoácido 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 31 1 , 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ó 434 de la región Fe, en donde la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice de EL) como en Kabat. Véase, v.gr., Patente de E.U.A. 6,737,056; y Shíelds et al., J. Biol. Chem. 276: 6591 -6604 (2001 ). En una modalidad de la invención, un anticuerpo comprende una región Fe de IgG variante que comprende por lo menos una sustitución de aminoácido en Asn 434 a His (N434H). En una modalidad de la invención, un anticuerpo comprende una región Fe de IgG de vanante que comprende por lo menos una sustitución de aminoácido en Asn 434 a Ala (N434A). Típicamente, todas estas variantes comprenden una afinidad de unión más alta para FcRn de los polipéptidos que tienen región Fe de secuencia nativa/secuencia de tipo silvestre. Este polipéptido de variante de Fe y anticuerpos tienen la ventaja de ser recuperados y reciclados en vez de ser degradados. Esos anticuerpos no agotables se pueden usar en los métodos provistos aquí. Anticuerpos manipulados por ingeniería genética con tres o más (preferiblemente cuatro) sitios de unión a antigenos funcionales también se contemplan (US 2002/0004587 A1 , Miller et al.). Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que ocurren naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis de PCR y mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.

Tratamiento de inflamación Un aspecto de la invención provee métodos de tratamiento de una condición inflamatoria en un sujeto mamífero, v.gr., un sujeto humano. La condición inflamatoria que ha de ser tratada puede ser esencialmente cualquier condición inflamatoria. La condición es opcionalmente mediada por células T, por ejemplo, la condición puede ser mediada por células TH1 , células TH2, células T17, células TH-17, células T CD4+, células T CD8+, células T gamma/delta, células T asesinas naturales, y/o células T reguladoras. Condiciones inflamatorias ilustrativas que han de ser tratadas incluyen, pero no se limitan a, un trastorno inmune (v.gr., una enfermedad autoinmune) una infección; cáncer, tal como mieloma múltiple y leucemia mielógena y otras leucemias, así como metástasis tumoral; una alergia; artritis; asma; enfermedad intestinal inflamatoria, tal como colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis múltiple; enfermedad infecciosa crónica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de transplante; sarcoidosis; hepatitis; inflamación del sistema nervioso central; síndrome de inmunodeficiencia adquirida; pancreatitis aguda; enfermedad de Addison; lesión hepática inducida por alcohol incluyendo cirrosis alcohólica; enfermedad de Alzheimer; amielolateroesclerosis; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoimmune; lesión hepática inducida por hepatitis autoimmune; cirrosis biliar; caquexia/anorexia, incluyendo caquexia inducida por SIDA; síndrome de fatiga crónica; enfermedad asociada con Clostridium, incluyendo diarrea asociada por Clostrídium; condiciones e indicaciones coronarias, incluyendo insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunción de miocardio e injerto de derivación de arteria coronaria; diabetes, incluyendo diabetes mellitus de tipo I de inicio juvenil y resistencia a la insulina; endometriosis, endometritis, y condiciones relacionadas; epidídimitis; resistencia a eritropoyetina; fiebre; fibromialgia o analgesia; glomerulonefritis; enfermedad de injerto versus hospedero/rechazo de transplante; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barre; enfermedad de Hashimoto; anemia hemolítica; choque hemorrágica; hiperalgesia; condiciones inflamatorias de una articulación y enfermedades reumáticas incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedades de Still, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis (v.gr., enfermedad de Kawasaki), vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos, síndrome de Sjogren, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y arteritis de células gigantes; enfermedad ocular inflamatoria, como puede estar asociada con, por ejemplo, transplante de córnea; enfermedad ocular inflamatoria, como puede estar asociada con, v.gr., transplante de córnea; enfermedad intestinal inflamatoria; isquemia incluyendo isquemia cerebral; enfermedad de Kawasaki; alteración del aprendizaje; enfermedades pulmonares; nefritis por lupus; esclerosis múltiple; miastenia grave; miopatías; enfermedades neuroinflamatorias; neurotoxicidad; enfermedades y condiciones oculares, incluyendo degeneración ocular y uveitis; osteoporosis; dolor incluyendo dolor relacionado con cáncer; enfermedad de Parkinson; pemfigo; enfermedad periodontal; pitiriasis rubra pilaris; trabajo de parto de pre-término; prostatitis y condiciones relacionadas; psoriasis y condiciones relacionadas; artritis psoriática; fibrosis pulmonar; lesión de reperfusión; fiebre reumática; artritis reumatoide; sarcoidosis; escleroderma; choque séptico; efectos colaterales de terapia de radiación; síndrome de Sjogren; perturbación del sueño; espondiloartropatías; lupus eritematoso sistémico; enfermedad de articulación mandibular temporal; tiroiditis; transplante de tejido o una condición inflamatoria que resulta de contractura, esguince, daño a cartílagos, trauma y cirugía ortopédica; vasculitis; o una condición inflamatoria que resulta de contractura, esguince, daño a cartílagos, trauma, cirugía ortopédica, infección u otros procesos de enfermedad. En una clase de modalidades, los métodos incluyen administrar al sujeto una porción aislada o recombinante seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido p28, un polipéptido gp130 soluble, un polipéptido EBI3, un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/EBI3 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/IL-27 soluble, un complejo de gp130/IL-27 soluble, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble, un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble, un polipéptido p28 y un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido EBI3 y un polipéptido WSX-1 soluble, IL-27 y un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido gp130 sluble y un polipéptido p28, un polipéptido gp130 soluble e IL-27, un polipéptido gp130 soluble y un polipéptido EBI3, y una variante de los mismos. En modalidades en las cuales una combinación de polipéptido recombinante o aislado se administra (v.gr., un polipéptido p28 y un polipéptido WSX-1 soluble), los polipéptidos pueden pero no necesitan formar un complejo, y los polipéptidos pueden ser coadministrados o administrados por separado. En otra clase de modalidades, los métodos incluyen administrar al sujeto una porción que se une específicamente a o modula una actvidad de un complejo de gp1307WSX-1 /IL-27, o que modula la formación del complejo en una célula (v.gr., en la membrana plasmática), tratando así al sujeto para la condición. La porción puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un antagonista, un agonista y un modulador de actividad. Opcionalmente, la porción potencia la formación o actividad de un complejo de gp130/WSX-1 /IL-27. En cualquier clase de modalidades, los métodos opcionalmente incluyen diagnosticar al paciente con la condición inflamatoria antes de dicha administración. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la porción es típicamente administrada al sujeto. Opcionalmente, el sujeto es monitoreado para respuesta al tratamiento. En una clase de modalidades, después del inicio del tratamiento el sujeto despliega información disminuida, por ejemplo, números reducidos de células inflamatorias, una reducción en el número de células T de IL17+ en circulación o en el sitio de inflamación, y/o expresión disminuida de IL17. Será evidente que complejos pertinentes ose pueden formar in vivo. Por ejemplo, en modalidades en as cuales se administra un polipéptido, el polipéptido puede formar un complejo activo con proteína(s) endógena. Como un ejemplo, cuando un polipéptido WSX-1 soluble (v.gr., una proteína de fusión WSX-1 Fe) se administra al sujeto, el WSX-1 puede formar un complejo con el p28 y/o IL-27 endógeno, conduciendo a resultados terapéuticos. Un polipéptido que ha de ser administrado es opcionalmente una variante que tiene una afinidad mayor para los componentes de receptor, v.gr., que la proteina de tipo silvestre (v.gr., una variante p28 que tiene afinidad mayor para WSX-1 o complejo de receptor WSX-1/gp 30 que hace un p28 que ocurre naturalmente correspondiente del cual se deriva la variante, o una variante WSX-1 soluble que tiene afinidad incrementada para gp130). En un aspecto, los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de la porción y por lo menos un segundo compuesto. El segundo compuesto es típicamente uno que se usa para tratar la condición inflamatoria, por ejemplo, un estándar de cuidado o tratamiento experimental. Segundos compuestos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, moduladores inmunológicos que afectan IL-23, IL-12, IL-6 o TGF (v.gr., anticuerpos específicos para IL-12 p40, p35 o IL-23 p19); anticuerpos o reactivos que antagonizan las funciones de IL-1 (v.gr., anakinra (Kineret®), receptor de IL-1 soluble) y FNT (v.gr., anticuerpos anti-FNT, etanercept, infliximab, y leflunomide); un agente citotóxico; un agente inmunosupresor (v.gr., ciclofosfamida); un antagonista de marcador de superficie de células B; un anticuerpo para un marcador de superficie de células B; un anticuerpo CD20, v.gr., Rituximab, véase US 20060051345); un anticuerpo o agente bloqueador de CD5, CD28, o CD40; un corticosteroide (v.gr., prednisona). CTI_A4-lg, un anticuerpo o antagonista de alfa4-integrina tal como natalizumab (Tysabri®), micofenolato mofetil, una estatina, un anticuerpo o bloqueador de LFA-1 o CD-1 1 a (véase publicación de solicitud de patente de E.U.A. 20050281817 de Jardeu et al. titulada "Method for treating múltiple sclerosis"), un anticuerpo de interleucina-12, un interferón beta (v.gr., un interferón ß-l a tal como Avonex® o Rebif®, o un interferón tal como Betaseron®), acetato de glatiramer (Copaxone®), un anticuerpo de CD52 tal como alemtuzuman (CamPath®), un anticuerpo de receptor de interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, un anticuerpo para la subunidad alfa de receptor de interleucina-2), etc. En una clase de modalidades, el segundo compuesto es un factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß). En una modalidad, el sujeto nunca ha sido tratado con fármaco(s) para tratar la condición inflamatoria y/o nunca ha sido tratado previamente con una porción de la invención. En otra modalidad, el sujeto ha sido tratado con fármaco(s) para tratar la condición inflamatoria y/o ha sido tratado previamente con dicha porción. Típicamente, el sujeto es elegible para tratamiento para la condición inflamatoria, es decir, un sujeto elegible. Para los propósitos de la presente, dicho sujeto elegible es uno que está experimentando, ha experimentado, o es probable que experimente, uno o más signos, síntomas u otros indicadores de la condición inflamatoria; se le ha diagnosticado con la condición inflamatoria, ya sea, por ejemplo, recién diagnosticado, previamente diagnosticado con una nueva recurrencia o exacerbación, previamente diagnosticado y en remisión, etc.; y/o está en riesgo de desarrollar la condición inflamatoria.

Administración Como lo entenderán los expertos en la técnica, las dosis apropiadas de las porciones de la invención (v.gr., polipéptidos, complejos, anticuerpos, etc.) generalmente estarán alrededor de aquellos ya utilizados en terapias clínicas en donde porciones generales se administran solas o en combinación con otros agentes terapéuticos. La variación en dosis ocurrirá probablemente dependiendo de la condición que se esté tratando. El médico que administra el tratamiento podrá determinar la dosis apropiada para el sujeto individual. Los programas de preparación y dosis para segundos compuestos comercialmente disponibles administrados en combinación con las porciones se pueden usar de conformidad con las instrucciones del fabricante o determinar empíricamente por el experto en la técnica. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de la porción y cualquier segundo compuesto administrado en combinación con la porción dependerán del tipo de enfermedad que se ha de tratar, como se definió antes, la severidad y curso de la enfermedad, si la combinación o porción se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo o combinación, y la discreción del médico que atiende al paciente. La porción o combinación se administra adecuadamente al paciente en una vez o muy típicamente en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg kg a 50 mg/kg (v.gr., 0.1-20 mg/kg) de la porción es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre la supresión deseada de síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. Típicamente, el médico de clínica administrará una porción de la invención (sola o en combinación con un segundo compuesto) hasta que se alcanza una dosis que provee el efecto biológico requerido. El progreso de la terapia de la invención es fácilmente monitoreado por técnicas y pruebas convencionales. La porción se puede administrar por cualquier medio, incluyendo administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal y/o intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal también se contempla (véase v.gr., publicación de solicitud de patente de E.U.A. 2002/0009444 de Grillo-Lopez). Además, la porción se puede administrar adecuadamente mediante infusión de pulso v.gr., con dosis cada vez menores de la porción. Opcionalmente, la dosis se da por vía intravenosa o subcutánea y opcionalmente por infusión(s) intravenosa. Cada exposición se puede proveer usando el mismo medio o un medio de administración diferente. En una modalidad, cada exposición es por administración intravenosa. Como se señaló, la porción se puede administrar sola o en combinación con por lo menos un segundo compuesto. Los segundos compuestos generalmente se usan en las mismas dosis y con vías de administración como se usa hasta ahora, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosis utilizadas hasta ahora. Si dichos segundos compuestos se usan, opcionalmente se usan en cantidades menores que si la porción no estuviera presente, para eliminar o reducir efectos colaterales causados por la misma. La administración de la porción de la invención y cualquier segundo compuesto se puede hacer simultáneamente, v.gr., como una sola composición o como dos o más composiciones distintas usando las mismas o diferentes vías de administración. Alternativamente, o adicionalmente, la administración se puede hacer secuencialmente, en cualquier orden. En ciertas modalidades, intervalos que varían desde minutos hasta días, hasta semanas, hasta meses, pueden estar presentes entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, la porción se puede administrar primero seguida por el segundo compuesto de la invención. Sin embargo, la administración simultánea o la administración del segundo compuesto de la invención primero también se contempla. Un tercer, cuarto, etc., compuesto es administrado opcionalmente en combinación con la porción y el segundo compuesto. De manera similar, tratamientos para síntomas segundarios o relacionados con la condición inflamatoria (v.gr., espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga, etc.) se puede administrar al sujeto, v.gr., durante el tratamiento con la porción o combinación.

Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de las porciones de la invención (v.gr., polipéptidos, complejos, anticuerpos, etc.) usados de conformidad con la presente invención se preparan para almacenamiento mezclando una porción que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de comulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen reguladores de pH tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenílico, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, aspargina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelatadores tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (v.gr., complejos de Zn-proteína); y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como Tween®, Pluronics®, o PEG. Las formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,267,958 (Andya et al.). Dichas formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente adecuado a una concentración de proteína alta y la formulación reconstituida se puede administrar subcutáneamente al mamífero que se ha de tratar aquí. Las formas cristalizadas de la porción también se contemplan.

Véase, por ejemplo U.S. 2002/013679A1 (Shenoy et al.). La formulación de la presente puede contener por lo menos un segundo compuesto según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no afectan adversamente unas a otras. Por ejemplo, puede ser deseable proveer además factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß), un agente citotóxico (v.gr., metotrexato, ciclofosfamida, o azatioprina), agente quimioterapéutico, agente inmunosupresor, citocina, antagonista o anticuerpo de citocina, factor de crecimiento, hormona, integrina, antagonista o anticuerpo de integrina (v.gr., un anticuerpo LFA-1 , o un anticuerpo de alfa-4-integrina tal como natalizumab), fármaco de clase de interferón tal como IFN-beta-1 a o IFN-beta-1b,, un oligopéptido tal como acetato de glatiramer, inmunoglobulina intravenosa (gamma globulina), fármaco de agotamiento de linfocitos (v.gr., mitoxantrona, ciclofosfamida, anticuerpos de CamPath® o cladribine), fármaco inmunosupresor que no es de agotamiento de linfocitos (v.gr., MMF o ciclosporina), fármaco reductor de colesterol de la clase de "estatina", estradiol, fármaco que trata síntomas secundarios o relacionados con lupus o MS (v.gr., espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga), un inhibidor de FNT, un fármaco antirreumático modificador de enfermedad, fármaco anti-inflamatorio no esteroideo, corticosteroide (v.gr., metilprednisolona, prednisona, dexametasona o glucorticoide), levotiroxina, ciclosporina A, análogo de somatastatina, antimetabolito, un antagonista/anticuerpo de superficie de células T o células B, etc., u otros como se señaló antes en la formulación. El tipo y cantidades efectivas de estos y otros agentes, depende, por ejemplo, de la cantidad de porción presente en la formulación, el tipo de condición inflamatoria que se esté tratando, y parámetros clínicos de los sujetos. Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en micropartículas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o cápsulas de gelatina y microcápsulas de polimetacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen v.g., en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Se pueden hacer preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparación de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, dichas matrices están en forma de artículos configurados, v.gr., películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o alcohol poli(vinílico)) poliláctidos (patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctíco-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolimero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico. Las formulaciones que se han de usar para administración ¡n vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Descripción de tecnologías relacionadas Existen varias citocinas o antagonistas específicos de citocina que están actualmente en desarrollo o comercialmente disponibles. Un número de citocinas recombinantes se usan en una variedad de establecimientos clínicos. Estas incluyen IL-2, GM-CSF, IL-1 1 , IL-12 e IFNs de tipo I. Estas proteínas se usan fácilmente como estimuladores de células inmunes y actúan como factores de crecimiento o para mejorar las respuestas anticancerosas o virales. Pocas citocinas se han usado para inhibir el sistema inmunológico, por ejemplo, IL-10, que funciona indirectamente sobre funciones de células accesorias necesarias para las funciones de células T y que se estaba desarrollando específicamente con enfermedad de Crohn y enfermedades intestinales inflamatorias como objetivos, y TGF. El éxito con estas ha sido limitado. Antagonistas de IL-12 p40 se han probado en ensayos clínicos para pacientes con enfermedad de Crohn con cierto éxito. Antagonistas de IL-15 están en ensayos clínicos para artritis basada en la observación de que esta citocina estaba implicada en el desarrollo de esta enfermedad.

El antagonista de receptor IL-1 es un producto comercialmente disponible que se usa para tratar a pacientes con artritis reumatoide. Este es un producto que bloquea la interacción de la citocina IL-1 proinflamatoria con su receptor. Amgen, Schering Plough and Centrocor (entre otros) han desarrollado anticuerpos/antagonistas específicos para la citocina FNT- que se usan actualmente en el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide. Ese es un enfoque que se basa en la neutralización de citocina endógena para prevenir inflamación. Un enfoque similar se ha investigado con anticuerpos específicos para IL-1 e IL-6. Un aspecto seguro es que estos tratamientos están asociados con el desarrollo de infecciones oportunistas incluyendo TB y toxoplasmosis.

Diferencias/ventajas sobre otros productos Muchos de estos productos (en particular IL-10) no dirigen de manera directa la respuesta de células T durante la inflamación. Puesto que WSX-1 es expresado por células T, se prevé que las estrategias que dirigen este receptor tendrán un efecto mucho más específico que algunos otros enfoques que actualmente están siendo usados o desarrollados. Además, muchos de los objetivos actuales son moléculas individuales hacia el extremo final de la actividad de células T mientras que p28/WSX-1 (y otras proteínas de fusión y complejos descritos aquí) dirigen de manera directa mucho de estos factores (v.gr., IL-2, IFN-GAMMA, IL-4, IL-17, FNT, IL-6) y adicionalmente pueden incrementar la expresión de IL-10, amplificando así su efecto terapéutico. Además, aunque los efectos colaterales se indican con muchas citocinas (IL-2, IL-12, IFNs), los inventores de la presente no observaron ningún signo obvio de enfermedad clínica en ratones tratados con IL-27 recombinante.

Secuencias de ácido nucleico y polipéptido y variantes Las secuencias para una variedad de proteínas y ácidos nucleicos de WSX-1 , gp130, p28, y EBI3 que ocurren naturalmente están públicamente disponibles. Véase, por ejemplo, identificación de secuencia de proteína NP 663634 y número de acceso a secuencia de nucleótido N _145659 para p28 humano, identificación de secuencia de proteína NP_005746 y número de acceso a secuencia de nucleótidos NM_005755 para EBI3 humano, identificación de secuencia de proteína NP 004834 y número de acceso a secuencia de nucleótidos NM 004843 para WSX-1 humano, identificación de secuencia de proteina NP 002175 y número de acceso a secuencia de nucleótidos NM_002184 para gp130 humano, identificación de frecuencia de proteína NP_66361 1.1 y número de acceso a secuencia de nucleótidos NM 145636.1 para p28 de murino, identificación de secuencia de proteína NP_056581 .1 y número de acceso a secuencia de nucleótidos NM 015766 para EBI3 de ratón, identificación de secuencia de proteina NP 057880.1 y número de acceso a secuencia de nucleótidos NM_016671 para WSX-1 de ratón, y identificación de secuencia de proteina NP 034690 y número de acceso a secuencia de nucleótidos NM 010560 para gp1 30 de ratón. Secuencias homologas o sustancialmente idénticas a estas secuencias de nucleótidos o aminoácidos también son de interés en la presente invención. Como se señala aquí, varias variantes solubles y/o de fusión de dichas proteínas se han descrito (v.gr., publicación de solicitud de patente de E.U.A. 20040185049 y Wirtz et al., supra), y variedades recombinantes de p28 y EBI3 están comercialmente disponibles. Un número de polipéptidos novedosos adicionales se describen aquí, incluyendo proteínas de fusión WSX-1 y p28 novedosas. Dichas proteínas de fusión pueden incluir dominios de anticuerpo y, como se detalló anteriormente, se basan opcionalmente en anticuerpos bioespecíficos. En un aspecto, la invención provee una variedad de polinucleótidos que codifican los polipéptidos novedosos de esta invención. Por ejemplo, una modalidad provee un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión WSX-1 recombinante o aislada, en donde la proteína de fusión comprende uno o más dominios que reconocen un marcador especifico de células o uno o más dominios de polipéptido derivados de p28 o EBI3. El ácido nucleico opcionalmente codifica uno o más polipéptidos seleccionados de: un dominio de anticuerpo, una región Fe, un dominio de p28, o un dominio de EBI3, así como que codifica un polipéptido WSX-1. Otra modalidad ilustrativa provee un ácido nucleico que incluye una proteína de fusión p28 recombinante o aislada. Igual que con las modalidades anteriores, el ácido nucleico opcionalmente codifica uno o más de un dominio de anticuerpo, una región Fe y un dominio de EBI3, así como un polipéptido p28. Un experto en la técnica apreciará que la invención provee muchas secuencias relacionadas con las funciones descritas aquí, por ejemplo, polinucleótidos que codifican una proteína de fusión WSX- , una proteína de fusión p28, una proteína de fusión gp130, una proteína de fusión EBI3, un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido gp130 soluble, etc. Debido a la degeneración del código genético, muchos polinucleótidos equivalentemente codifican una secuencia de polipéptido dada. Las secuencias de polinucleótidos complementadas a las secuencias anteriormente descritas se incluyen entre los polinucleótidos de la invención. De manera similar, un ácido nucleico artificial o recombinante que híbrida a un polinucleótido indicado anteriormente bajo condiciones altamente astringentes sustancialmente sobre toda la longitud del ácido nucleico (y es otro distinto al polinucleótido que ocurre naturalmente) es un polinucleótido de la invención. En ciertas modalidades, un vector (v.gr., un plásmido, un cósmico, un fago, un virus, etc.) comprende un polinucleótido de la invención. En una modalidad, el vector es un vector de expresión. En otra modalidad, el vector de expresión incluye un promotor operablemente enlazado a uno o más de los polinucleótidos de la invención. En otra modalidad, una célula comprende un vector que incluye un polinucleótido de la invención. Un experto en la técnica también apreciará que muchas variantes de las secuencias descritas se incluyen en la invención. Por ejemplo, variaciones conservativas de las secuencias descritas que producen una secuencia funcionalmente similar se incluyen en la invención. Variantes de las secuencias de polinucleótidos de ácido nucleico, en donde las variantes hibridan a por lo menos una secuencia descrita, se considera que se incluyen en la invención. Subsecuencias únicas de las secuencias descritas aquí, como se determina mediante, v.gr., técnicas de comparación de secuencia estándares, también se incluyen en la invención.

Variantes conservativas Debido a la degeneración del código genético, "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones en una secuencia de ácido nucleico que no da por resultado en una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implicada de cada secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos. De manera similar, "sustituciones de aminoácidos conservativas" en donde uno o un número limitado de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos son sustituidos con diferentes aminoácidos con propiedades altamente similares, también son fácilmente identificados como siendo altamente similares a una construcción descrita. Dichas variaciones conservativas de cada secuencia descrita son una característica de la presente invención. "Variaciones conservativas" de una secuencia de ácido nucleico particular se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Un experto en la técnica reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o deletan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos de 5%, muy típicamente menos de 4%, 2% o 2%) en una secuencia codificada son "variaciones conservativamente modificadas" en donde las alteraciones dan por resultado la deleción de un aminoácido, adición de un aminoácido, o sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar, mientras que retienen la función pertinente. Por lo tanto, "variaciones conservativas" de una secuencia de polipéptido listada de la presente invención incluyen sustituciones de un pequeño porcentaje, típicamente menos de 5%, muy típicamente menos de 2% o 1%, de los aminoácidos de la secuencia de polipéptidos, con un aminoácido del mismo grupo de sustitución conservativa. Finalmente, la adición de secuencias no altera la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional o de etiqueta (intrones en el ácido nucleico, poli His o secuencias similares en el polipéptido codificado, etc.), es una variación conservativa del ácido nucleico básico o polipéptido. Cuadros de sustitución conservativas que proveen aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidos en la técnica, en donde un residuo de aminoácido sustituye a otro residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas similares (v.gr., cadenas laterales aromáticas o cadenas laterales positivamente cargadas), y por lo tanto no cambia sustancialmente las propiedades funcionales de la molécula de polipéptido. El cuadro 1 expone grupos de ejemplo que contienen aminoácidos naturales de propiedades químicas similares, en donde la sustitución dentro de un grupo es una "sustitución conservativa".

CUADRO 1 Sustituciones de aminoácidos conservativas Hibridación de ácido nucleico La hibridación comparativa se puede usar para identificar ácidos nucleicos de la invención, incluyendo variaciones conservativas de ácidos nucleicos de la invención. Además, los ácidos nucleicos objetivo que hibridan a un ácido nucleico de la invención bajo condiciones de astringencia alta, ultra alta, y ultra-ultra alta en donde los ácidos nucleicos son otros distintos a los ácidos nucleicos que ocurren naturalmente, son una característica de la invención. Ejemplos de dichos ácidos nucleicos incluyen aquellos con una o algunas sustituciones de ácido nucleico silenciosas o comparativas en comparación con una secuencia de ácido nucleico dada de la invención.

Se dice que un ácido nucleico de prueba híbrida específicamente a un ácido nucleico de sonda cuando híbrida por lo menos 50% igual para la sonda que para el objetivo complementario perfectamente acoplado, es decir, con una relación de señal a ruido por lo menos la mitad tan alta como la hibridación de la sonda al objetivo bajo condiciones en las cuales la sonda perfectamente acoplada se une al objetivo complementario perfectamente acoplado con una relación de señal a ruido que es por lo menos de aproximadamente 5x-10x tan alta como aquella observada para la hibridación a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivos no acoplados. Los ácidos nucleicos "hibridan" cuando se asocian, típicamente en solución. Los ácidos nucleicos hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como unión de hidrógeno, exclusión de solvente, apilamiento de base y similar. Una guía extensiva a la hibridación de los ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bioloqv-Hvbridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays," (Elsevier, New York), así como en Current Protocols in Molecular Bioloqy, Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa colectiva entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado hasta 2007) ("Ausubel"); Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Impreso en en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, (Hames y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Impreso en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 2) proveen detalles sobre la síntesis, mareaje, detección y cuantificación de ADN y ARN, incluyendo oligonucleótidos. Un ejemplo de condiciones de hibridación astringente para hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en un análisis de Southern o northern blot es 50% de formalina con 1 mg de heparina a 42°C, en donde la hibridación se lleva a cabo durante la marcha. Un ejemplo de condiciones de lavado astringentes es un lavado de 0.2x SSC a 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook et al., Molecular Cloninq - A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 ("Sambrook") para una descripción del regulador de pH SSC). A menudo en lavado de alta astringencia es precedido por un lavado de astringencia para remover señal de sonda de fondo. Un lavado de baja astringencia de ejemplo es 2x SSC a 40°C durante 15 minutos. En general, una relación de señal a ruido de 5x (o más alta) que la observada para una sonda no relacionada en la prueba de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. "Condiciones de lavado de hibridación astringentes" en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como hibridaciones Southern y northern son dependientes de secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una guia extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993), supra y en Hames y Higgins, 1 y 2. Las condiciones de hibridación y lavado astringentes pueden ser fácilmente determinadas de manera empírica para cualquier ácido nucleico de prueba. Por ejemplo, en la determinación de las condiciones de hibridación y lavado se incrementan gradualmente (v.gr., al incrementar la temperatura, reducir la concentración de sal, incrementar la concentración de detergente y/o incrementar la concentración de solventes orgánicos tales como formalina en la hibridación o lavado), hasta que se satisface un conjunto de criterio seleccionado. Por ejemplo, en condiciones de hibridación y lavado altamente astringentes, las condiciones de hibridación y lavado son gradualmente incrementadas hasta que una sonda se une a un objetivo complementario perfectamente acoplado con una relación de señal a ruido que es por lo menos 5x tan alta como la observada para la hibridación de la sonda a un objetivo no acoplado. Condiciones "muy astringentes" se seleccionan para que sea igual al punto de fusión térmica (Tm) para una sonda en particular. La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica y pH definidos) a la cual 50% de la secuencia de prueba híbrida a una sonda perfectamente acoplada. Para los efectos de la presente invención, generalmente, las condiciones de hibridación y lavado "altamente astringentes" se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C más bajas que la Tm para la secuencia específica a una concentración iónica y un pH definidos. Condiciones de hibridación y lavado "de astringencia ultra alta" son aquellas en las cuales la astringencia de las condiciones de hibridación y lavado se incrementan hasta que la relación de señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico objetivo complementario perfectamente acoplado es por lo menos 10x tan alta como la observada para la hibridación a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivo no acoplados. Un ácido nucleico objetivo que híbrida a una sonda bajo dicha condición, con una relación de señal a ruido de por lo menos 14 la del ácido nucleico objetivo complementario perfectamente acoplado se dice que se une a la sonda bajo condiciones de astringencia ultra alta. De manera similar, niveles de astringencia aún mayores pueden ser determinados al incrementar gradualmente las condiciones de hibridación y/o lavado de la prueba de hibridación pertinente. Por ejemplo, aquellas en las cuales la astringencia de condiciones de hibridación y lavado se incrementa hasta que la relación de señal a ruido para unión de la sonda al ácido nucleico objetivo complementario perfectamente acoplado es por lo menos 10x, 20X, 50X, 100X, o 500X o más tan alta a la observada para la hibridación a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivos no acoplados. Un ácido nucleico objetivo que híbrida a una sonda bajo dichas condiciones, con una relación de señal a ruido de por lo menos 14 del ácido nucleico objetivo complementario perfectamente acoplado se dice que se une a la sonda bajo condiciones de astringencia ultra-ultra altas. Los ácidos nucleicos que no híbridan unos a otros bajo condiciones astringentes son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre v.gr., cuando se crea una copia de ácido nucleico usando la degeneración del código máxima permitida por el código genético.

Comparación, identidad y homología de secuencias Los términos "idéntico" o "por ciento de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y se alinean para correspondencia máxima, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencia descritos más adelante (u otros algoritmos disponibles para los expertos en la técnica) o por inspección visual. La frase "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (v.gr., ADN que codifican un polipéptido WSX-1 , p28, EBI3, o gp130, o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido WSX-1 , P28, EBI3, o gp130) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen por lo menos aproximadamente 60%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de identidad de residuo de nucleótido aminoácido, cuando se compara y se alinea para correspondencia máxima, como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencia o por inspección visual. Dichas secuencias "sustancialmente idénticas" son típicamente consideradas como "homologas", sin referencia a un ancestro real. Preferiblemente, la "identidad sustancial" existe sobre una región de las secuencias que es por lo menos aproximadamente 50 de residuos de longitud, muy preferiblemente sobre una región de por lo menos aproximadamente 100 residuos, y muy preferiblemente, las secuencias son sustancialmente idénticas sobre por lo menos aproximadamente 150 residuos o sobre la longitud completa de las dos secuencias que han de ser comparadas. Proteínas y/o secuencias de proteína son "homologas" cuando se derivan, naturalmente o artificialmente, de una proteína o secuencia de proteína ancestral común. De manera similar, los ácidos nucleicos y/o secuencias de ácido nucleico son homólogos cuando se derivan naturalmente o artificialmente, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. La homología es generalmente inferida de similitud de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos). El porcentaje preciso de similitud entre secuencias que es útil para establecer homología varía con el ácido nucleico y proteina en cuestión, pero tampoco como 25% de similitud de secuencia sobre 50, 100, 150 o más residuos (nucleótidos o aminoácidos) se usa rutinariamente para establecer homología. Niveles más altos de similitud de secuencia, v.gr., 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% o más también se pueden usar para establecer homología. Los métodos para determinar porcentaje de similitud de secuencia (v.gr., BLASTP y BLASTIN usando parámetros por omisión) se describen aquí y están generalmente disponibles. Ortólogos" son genes en diferentes especies que evolucionaron a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos retienen las mismas o similares funciones en el curso de la evolución. Como se usa aquí "ortólogos" se incluyen en el término "homólogos". Para comparación de secuencia y determinación de homología, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia son introducidas en una computadora, las coordenadas se subsecuencia son designadas, si es necesario, y los parámetros de programa de algoritmo de secuencia son designados. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula el por ciento de identidad de secuencia para la secuencia(s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa designados. La alineación óptima de secuencias para comparación puede ser conducida, v.gr., por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:382 (1981 , por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda de un método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementación computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o por inspección visual (véase generalmente Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa colectiva entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., suplementada hasta 2007). Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar análisis de BLAST está públicamente disponible a través del Nacional Center for Biotechnology Information (centro nacional para información de biotecnología). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencia de alta calificación (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de preguntas, que ya sea se acoplan o satisfacen alguna puntuación umbral T de valor positivo alineada con una palabra de la misma longitud en una secuencia de bases. T se refiere como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estas puntuaciones de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Las puntuaciones de palabra son entonces extendidas en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde la puntuación de alineación acumulativa se puede incrementar. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos de acoplamiento; siempre > 0) y N (puntuación de sanción para residuos discordantes; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las puntuaciones de palabra en cada dirección son detenidas cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por la cantidad X del valor logrado máxima; la puntuación acumulativa llega a cero o más bajo, debido a la acumulación de una o más alineación de residuos de puntuación negativa; o el final de cualquier secuencia es alcanzado. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como omisiones una longitud de palabra (W) de 11 , una expectación E de 10, un corte de 100, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como omisiones longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). Además de calcular el por ciento de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, v.gr., Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medición de similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la probabilidad por la cual una concordancia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría al azar, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.1 , muy preferiblemente menor que aproximadamente 0.01 , y muy preferiblemente menor que aproximadamente 0.001.

Producción y aislamiento de polipéptidos recombinantes Generalmente, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención o para usarse en los métodos o composiciones de la invención se pueden hacer por clonación, recombinación, síntesis in vitro, amplificación in vitro y/u otros métodos disponibles. Esencialmente cualquier ácido nucleico puede ser ordenado en forma personalizada o estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como Operon Technologies Inc. (Alameda, CA). Además, una variedad de métodos recombinantes se pueden usar para expresar un vector de expresión que codifica un polipéptido de la invención. Los métodos recombinantes para hacer ácidos nucleicos, expresión y aislamiento de productos expresados son bien conocidos y se describen, v.gr., en Sambrook, Ausubel, e Innis et al. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academia Press Inc., San Diego, CA (1990). Una gran cantidad de equipos están comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos u otros ácidos nucleicos pertinentes a partir de células, (véase, v.gr., EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; y, QIAprep™ de Qiagen). Cualquier ácido nucleico y/o purificado puede ser manipulado para producir otros ácidos nucleicos usados para transfectar células, incorporados en vectores relacionados para infectar organismos para expresión, y/o similares. Vectores de clonación típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de inicio de transcripción y traducción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico objetivo particular. Los vectores opcionalmente comprenden cassettes de expresión genéricos que contienen por lo menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten replicación del cassette en eucariotes, o procariotes o ambos, (v.gr., vectores de lanzadera) y marcadores de selección tanto para sistema procariótico como eucariótico. Los vectores son adecuados para la replicación e integración en procariotes, eucariotes o ambos. Véase, Giliman y Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel supra, Sambrook supra, y Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA. Un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para clonación se provee, v.gr., en ATCC, v.gr., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophago (catálogo de bacterias y bacteriófagos) publicado anualmente por el ATCC. Procedimientos básicos adicionales para secuenciación, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas fundamentales también se encuentran en Watson et al. (1992) Recombinant DNA segunda edición, Scientific American Books, NY. Otras referencias útiles, v.gr., para el aislamiento y cultivo de células (v.gr., para aislamiento de ácido nucleico o polipéptido subsecuentes) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley- Liss, New York y las referencias citadas en la misma; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg y Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Atlas y Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Una variedad de métodos de aislamiento y detección de proteína son conocidos y se pueden usar para aislar polípéptidos, v.gr., a partir de cultivos recombinantes de células que expresan las proteínas de fusión recombinantes o solubles de la invención. Una variedad de métodos de aislamiento y detección de proteína son bien conocidos en la técnica, incluyendo, v.gr., aquellos expuestos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymoloqy Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2a Edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harrís y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL impreso en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL impreso en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a Edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principies, Hiqh Resolution Methods and Applications, Segunda Edición Wilev-VCH. NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias citadas en la misma. Detalles adicionales referentes a métodos de purificación y detección de proteína se pueden encontrar en Satínder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000). Polipéptidos WSX-1 y gp 30 solubles, polipéptidos p28 y polipéptidos EBI3 por lo tanto pueden ser expresados y purificados por un experto en la técnica. Alternativamente, un número de dichos polipéptidos están comercialmente disponibles. Por ejemplo, p28 y EBI3 recombinantes están disponibles de Abnova Corporation (222 (dot) abnova (dot) com (dot) tw). En donde se desean complejos de polipéptido, los dos (o más) componentes de polipéptido del complejo son opcionalmente coexpresados y purificados juntos como un complejo o los componentes pueden ser purificados por separado y después combinarse para formar el complejo. Los componentes están opcionalmente no covalentemente asociados en el complejo, o están opcionalmente covalentemente conectados mediante un entrelazador químico o similar en el complejo.

EJEMPLOS Cabe entender que los ejemplos y modalidades descritos aquí son para fines ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos a los expertos en la técnica y se han de incluir dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Por consiguiente, los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada.

EJEMPLO 1 Interleucina 27 regulan negativamente el desarrollo de células 17 auxiliares de productora de interleucina 17 durante inflamación crónica del sistema nervioso central Estudios recientes se han enfocado en los eventos que influyen en el desarrollo de células TH- asociadas con autoinmunidad, tales como encefalitis autoinmune experimental, pero se sabe relativamente poco de las citocinas que antagonizan respuestas de efector TH-17. Los experimentos de la presente muestran que ratones con deficiencia de (IL)-27R crónicamente infectados con Toxoplasma gondii desarrollaron neuroinflamación severa que fue dependiente de células T CD4+ y asociados con una respuesta de IL-17 prominente. In Vitro, el tratamiento con IL-27 de células T primarias intactas suprimió el desarrollo de células TH-17 inducido por IL-6 y TGF-ß, que fue dependiente de STATI pero independiente de inhibición mediada por SOCS3 de señalización de IL-6. Por lo tanto, IL-27, un inhibidor potente de desarrollo de células TH-17, puede ser un objetivo útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por estas células. De manera similar, las proteínas de fusión y complejos descritos anteriormente proveen enfoques útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por estas células. Aunque el paradigma de tipo 1 auxiliar T (TH1 )-TH2 ha dominado los estudios de la función de células T por casi 20 años 1, el trabajo reciente ha identificado un subconjunto novedoso de células T CD4+ que produce IL-17A, IL-17F, TNF e IL-6 en respuesta a IL-232'3. Estos linfocitos TH-17' han sido implicados como mediadores de la inflamación asociada con varias enfermedades autoinmunes, incluyendo encefalitis autoinmune experimental (EAE) y artritis inducida por colágeno3"7. Como consecuencia, ha habido un interés para definir la ontogenia de estas células T CD4+ patológicas y los factores que regulan sus actividades 8"10. Aunque los primeros estudios establecieron un papel para IL-23 en la promoción de la producción de células TH- 7, el trabajo posterior mostró que IL-23 no es un fuerte inductor de novo de células TH-1 . La observación de que las células T de ratones con deficiencia de IL-23 pueden secretar IL-17 cuando son estimulados por IL-233 indicó que otros factores promueven el desarrollo de células productoras de IL-178. Varios reportes recientes de hecho han identificado un papel crítico para TGF-ß e IL-6 para el desarrollo de novo de células TH-17 de murino11"13. Aunque el éxito para demostrar la importancia de IL-6 y TGF-ß en sus desarrollo ha sido relativamente rápido (por lo menos en ratones), considerablemente menos se ha conocido acerca de los antagonistas fisiológicos de células TH-17. IL-27, una citocina heterodimérica compuesta de gen 3 (EBI3) y p28 inducidos por virus de Epstein-Barr, señaliza a través de un complejo de receptor compuesto de IL-27R (WSX-1/TCCR) y gp13014 15. Aunque la expresión de IL-27R está confinada a células ¡nmunológicas15"18, su pareja gp130, un componente de receptor compartido de varias citocinas incluyendo IL-6, se expresa constitutivamente en células ¡nmunológicas y no inmunológicas19,20. Aunque pocos estudios han enfrentado directamente los eventos que conducen a la producción de IL-27, un modelo actual sostiene que el heterodímero IL-27 es producido por APCs activado21. Reportes iniciales enfocados en la capacidad de IL-27 para promover la proliferación y el desarrollo de células T de respuestas de TH118,22; estudios subsecuentes han indicado que también puede limitar las respuestas de TH1 y TH2 implicadas en resistencia a varias infecciones parasitarias. Por lo tanto, los ratones con deficiencia de IL-27R (Il27ra-/-) desarrollan respuestas de células auxiliares T exageradas durante las etapas agudas de toxoplasmosis, enfermedad de Chagas, leishmaniasis y siguiendo el desafío de helminto23"26. Recientemente, un fenotipo similar se ha enlazado a la inhibición de IL-27 de la producción de IL-227, pero no está claro que IL-27 tiene efectos supresores adicionales sobre otros subconjuntos o funciones de células T. Aunque hay una apreciación del papel de IL-27 en modelos agudos de inflamación8, ha habido un entendimiento limitado de su papel en enfermedad crónica y sus efectos específicos de tejido. La evidencia sugiere que IL-27 se produce durante la inflamación en el SNC28, pero una posible función para IL-27 durante la toxoplasmosis crónica no ha sido enfrentado; no ha sido claro si IL-27 tiene efectos pro inflamatorios o anti inflamatorios en el SNC "inmunoprivilegiados". Los resultados descritos aquí demuestran que ratones H27ra-/-infectados crónicamente con T. gondii controlan la replicación de parásitos en el cerebro pero desarrollan una patología mediada por células T CD4+ letal asociada con una respuesta de TH-17 exagerada. Estudios ex vivo adicionales mostraron que IL-27 - o incluso su componente p28 solo, a un menor grado -fueron capaces de antagonizar el desarrollo de células TH-17. La actividad supresora de IL-27 fue independiente de la inhibición dependiente de SOCS3-de señalización gp130 pero dependiente de STATI. Juntos, estos hallazgos identifican IL-27 como un antagonista de desarrollo de células TH- 7 y por lo tanto indican un posible objetivo terapéutico para tratar enfermedades inflamatorias asociadas con células TH-17.

Resultados Producción de IL-27 durante encefalitis toxoplásmica PCR de tiempo real se usó para cuantificar los niveles relativos de las transcripciones para IL-27 durante TE. Cantidades bajas o mínimas de ARNm para eb¡3 (gen para EBI3) y 1127 (gen para p28) se detectaron en cerebros no infectados. En tejidos de ratones crónicamente infectados, sin embargo, hubo un incremento de > 3 veces en la cantidad de ARNm de ebi3 en el cerebro y un incremento de > 500 veces en las cantidades de ARNm para 1127 (figura 1A). Dado que se piensa que las células dendríticas y macrófagos son fuentes de IL-27 en tejidos periféricos14, es posible que las transcripciones de ebi3 e 1127 elevadas detectadas durante TE se deben a la migración de estas células en el SNC. Alternativamente, las células cerebrales residentes que también son capaces de producir IL-27 incluyen microglia y monolitos residentes en el cerebro29. La activación de astrositos, un subconjunto de células residentes en el SNC, durante TE y su capacidad para producir citocinas en respuesta a infección30 sugieren que pueden representar una fuente de IL-27. Sin embargo, aunque los astrositos primarios de ratones WT expresaron niveles básales de ARNm de ebi3, no se observó incremento en respuesta a la estimulación con LPS más IFN-? (figura 1 B). Por el contrario, cantidades de ARNm de 1127 incrementaron casi 2000 veces después de la estimulación con LPS e IFN-?. Juntas estas observaciones sugieren que ambos componentes de IL-27 son producidos localmente durante TE y que los astrositos activados pueden expresar tanto EBI3 como p28.

El papel de IL-27 durante infección crónica con T. pondii El enfoque previo sobre IL-27 implicó un papel para la misma en la diferenciación de células T intactas en células TH1 efectoras14,31"34. Sin embargo, se encontró que ratones H27ra-/- generan respuestas de TH1 robustas cuando se desafían con T. gondii, aunque los ratones sucumbieron a una enfermedad inflamatoria dependiente de células T CD4+ letal aguda caracterizada por producción exagerada de IFN-? e IL-226,27 asociada con patología de hígado y pulmón severa26. Dada la susceptibilidad de los ratones de H27ra-/- a toxoplasmosis aguda, se contemplan varias estrategias que permitirían que se desarrollara infección crónica. La primera de estas fue tratar ratones infectados con CTLA4-lg, un antagonista de coestimulacíón de células T dependiente de CD2835, los días 7 y 10 después de la infección. Después del tratamiento con CTLA4-lg, los ratones H27ra-/- infectados sobrevivieron durante 14 días después de la infección y progresaron a la etapa crónica; sin embargo, el tratamiento no proveyó protección a largo plazo, ya que los ratones H27ra-/- que recibieron el CTLA4-lg murieron dentro de cinco semanas de la infección. La letalidad observada después del tratamiento con CTLA4-lg no pareció ser una consecuencia secundaria de la supresión inmunológica mediada por CTI_A4-lg ya que los ratones WT que recibieron el mismo tratamiento sobrevivieron (figura 2A). El análisis histológico de hígado y pulmón revelaron que aunque los ratones H27ra-/- tratados con CTl_A4-lg sobrevivieron a la fase aguda aún desarrollaron infiltración de células inmunes prominentes, necrosis e inflamación en estos órganos en el día 14 después de la infección (figura 2C). La patología no fue evidente en ratones WT infectados ya sea que hubieran sido no tratados con CTLA4-lg (no se muestran datos). A diferencia de lo que se observó en el hígado y pulmones en este punto de tiempo, no hubo signos histológicos de inflamación observados en el cerebro de ratones Il27ra-/- o WT (no se muestran datos). En ratones H27ra-/- que progresaron a la etapa crónica de infección (día 30), sin embargo, la patología presente en el hígado y los pulmones durante la infección aguda se había resuelto (figura 2C). Por el contrario, en el cerebro y SNC, los ratones Il27ra-I- desplegaron áreas de intensa inflamación, numerosos pliegues perivasculares en el parénquima y meningitis severa (figura 2D). Ratones WT, por otra parte, tuvieron TE mínima a ligera. Más aún, la activación deastrocitos, como se evalúa mediante tinción para proteína fibrilar glial (GFAP), reveló que aunque la infección condujo a una expresión incrementada de esta proteína estructural en animales WT, ésta fue marcadamente incrementada en los ratones H27ra-/- (Figura 2D). En un enfoque complementario para permitir que los ratones H27ra-I- progresen a la etapa crónica, el tratamiento con el fármaco anti-parasitario sulfadiazina que empieza el día 5 después de la infección, que inhibe la replicación de parásitos pero no erradica la infección, también previno la mortalidad en los ratones H27ra-I-. Después de cesar el tratamiento con fármaco, los ratones WT no manifestaron enfermedad clínica, pero los ratones H27ra-I-desarrollaron síntomas de enfermedad asociada con patología severa del SNC y murieron dentro de 2-3 semanas (Figura 2B). Los datos presentados en el resto de este ejemplo por lo tanto se deriva de ratones que se dejó que desarrollaran enfermedad crónica a través del tratamiento con CTLA4-lg o sulfadiazina y no hubo deferencias evidentes entre estos grupos y no hubo diferencias evidentes entre estos grupos experimentales diferentes. Dados los reportes de que IL-27 pueden aumentar la producción de IFN-?18·22,31"34, una citocina crítica para el control de T. gondii en el SNC36, la inflamación incrementada vista en el cerebro en ausencia de señalización de IL-27 podría ser una consecuencia de una falla para hacer IFN-? y una incapacidad para controlar la replicación de parásitos. Sin embargo, no se encontró diferencia medible en carga de parásitos en los cerebros de \\27ra-\-y WT crónicamente infectados (figura 2E). Más aún, células mononucleares aisladas de los cerebros (BMNC) de ratones WT y H27ra-I- no fueron deficientes en su capacidad para producir el óxido nítrico (NO) de molécula efectora anti-parasitario dependiente de IFN-? (figura 2F). Consistente con esta observación, BMNC de ratones WT y H27ra-I- estimulados con STAg (antígenos de Toxoplasma solubles) produjo niveles similares de IL-12 y IFN-? (figuras 2G y 2H). Esos hallazgos indicaron que la neuro-inflamación severa en ratones Il27ra-I- no fue el resultado de un defecto en producción de IFN-? o un incremento en carga de parásitos. Debido a que IL-27 inhibe la producción de IL-2 por células T CD4+27,37 fue posible que en ausencia de señalización de IL-27 la producción resaltada de este factor de crecimiento de células T en el cerebro podría contribuir a la inmunopatología observada. Sin embargo, consistente con reportes anteriores, no se encontraron cantidades detectables de ARNm de 112 (IL-2) o proteína en el cerebro de ratones WT crónicamente infectados y ésta no se alteró en ausencia de la IL-27R (no se muestran datos). De manera similar, no hubo transcripciones detectables para 114 (IL-4) o 1113 (IL-13), dos citocinas asociadas a TH2, en el cerebro de estos grupos experimentales. Por último, la examinación de otros subconjuntos de células T reveló la presencia de una población menor de Foxp3+ células T reguladoras (Treg) en el cerebro, pero no hubo diferencia en los números de células entre ratones WT o H27ra-I- crónicamente infectados (no se muestran datos).

Ausencia de IL-27R da por resultado la acumulación de células T CD4+ patogénicas Dada la inflamación del SNC por infección prominente en ausencia de la IL-27R, los experimentos se realizaran para identificar el fenotipo de las células infiltrantes. De conformidad con la histopatología, el análisis de BMNC aislado de ratones crónicamente infectados mostró un incremento marcado en el número de células recuperadas de cerebros de H27ra-/-(P = 0. 05; figura 3A) y un incremento significativo en el número y porcentaje de células T CD4+ (P < 0. 05) así como el número de células T CD8+ recuperadas (figura 3B). A pesar de diferencias en la composición de las poblaciones de células T, el análisis de las células T de los cerebros de ratones WT y Il27ra-/- desplegó un fenotipo activado de CD44hi y CD62Llow (figura 8). Más aún, monocitos de ambos conjuntos de ratones desplegaron un fenotipo activado caracterizado por la expresión resaltada de clase II de compolejo de histocompatibilidad mayor sobre su superficie (no se muestran datos). Sin embargo, aunque no hubo diferencias en el número de microglia residente (CD1 1 bint, CD45int) hubo un incremento significativo en el número de macrófagos infiltranes (CD1 1 bhi, CD45hi) en ausencia de the IL-27R (P < 0. 05; figura 3B). En los estudios mencionados antes, una de las características sobresalientes observadas en ratones H27ra-I- crónicamente infectados es el incremento significativo en el número de células T CD4+ presentes en el cerebro. Aunque se requieren linfocitos infiltrantes para el control de TE38; también pueden contribuir al desarrollo de patología del SNC durante esta infección39. Para determinar si las células T CD4+ estaban implicadas en la enfermedad letal vista en los ratones H27ra-J- crónicamente infectados, los ratones fueron tratados con un mAb agotable específico para CD4 a las cuatro semanas después de la infección y monitoreados para supervivencia. El análisis de los ratones que siguieron el tratamiento con el mAb anti-CD4 reveló una depleción > 95% de células T CD4+ en el bazo y una reducción de 50% en el cerebro (figura 3C). La supervivencia de los ratones H27ra-/~ tratados con mAb anti-CD4 fue más larga que 60 días después de la infección, mientras que la mayoría de los ratones no tratados desarrolló patología severa en el cerebro y murieron de enfermedad el día 50 (figura 3D). Posteriormente, el análisis histológico 7 días después de este tratamiento reveló inflamación disminuida en el parénquima y meninges (figura 3E). Juntos, estos datos establecieron que las células T CD4+ infiltrantes contribuyen a la patología letal en el cerebro observada durante TE en ausencia de IL-27.

IL-27 inhibe la producción de IL-17 por células T que experimentaron antigeno El reconocimiento de que la neuro-patología en ratones H27ra-I-crónicamente infectados no es una consecuencia de una respuesta de TH1 defectuosa pero en vez de ello es mediada por células T CD4+ condujo a la decisión para examinar el posible papel del subconjunto TH- 7 de células T CD4+ recientemente descrito en la patología letal. Debido a que las células TH-17 se han caracterizado por la producción de IL-17, IL-6 y FNT, implicada en el desarrollo de enfermedad en un modelo de inflamación del SNC3, la cantidad de transcripciones de ARNm para estas citocinas se evaluó por PCR en tiempo real usando ARN derivado del cerebro de ratones WT y H27ra-I-crónicamente infectados. Mientras que tant ratones WT como ratones Il27ra-I- expresaron cantidades comparables de 116 (IL-6) y Tnf (FNT), las transcripciones para 1117 (IL-17) sólo fueron detectadas en las muestras de ratones H27ra-I- (figura 4A). Aunque hay múltiples fuentes celulares (astrocitos, microglia, macrófagos, células T) para IL-6 y FNT en el cerebro durante TE, la producción de IL-17 está restringida en gran medida a células T. Por consiguiente, BMNC de ratones Il27ra-/- que fueron reestimuladas en presencia de STAg produjeron significativamente más IL-17, IL-6 y FNT que las células de ratones WT (figura 4B). Cantidades bajas de IL-17 también fueron producidas por WT BMNCs estimulados con STAg, que fue aumentada al añadir IL-23 y fue casi completamente bloqueada mediante la adición de IL-27 (figura 4C). Además, la tinción intracelular de poblaciones de células T CD4+ y CD8+ en preparaciones de BMNC de ratones WT y H27ra-I-crónicamente infectados reveló producción elevada de IL-17 por células en el cerebro de ratones \\27ra-l- (figura 4D). Juntos, esos resultados sugieren que IL-27 regula la inflamación en el SNC durante TE crónica limitando la actividad de TH-17.

IL-27 inhibe la producción de IL-17 células T CD4+ y CD8+ Reportes recientes sobre la diferenciación de células TH-17 in vitro han concluido que TGF-ß y IL-6 se requieren para la generación de estas células a partir de células T CD4+ intactas, mientras que el bloqueo de IFN-? y IL-4 suporta un ambiente favorable para el desarrollo de TH-17 3 1- 3'40'4 por lo tanto, células T CD4+ y CD8+ intactas aisladas de los bazos de ratones C57BL/6 se cultivaron bajo estas condiciones para evaluar directamente la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de células T de IL-17. Después de la estimulación con PMA y ionomicina casi todas las células T produjeron FNT y una población significativa co-expresó IL-17 y FNT. Consistente con los estudios presentados anteriormente, la adición de IL-27 eficientemente inhibió la producción de IL-17 por células T CD4+ y CD8+, pero no alteró la producción de FNT por estas células (figura 5A y 5B). En ausencia de estimulación con PMA y ionomicina el porcentaje y la media de intensidad fluorescente de células productoras de IL-17 fueron más bajos, pero IL-27 fue aún un antagonista potente de esta actividad (figura 9). La descripción original de p28 indicó que esta proteína podría ser secretada como tal pero, a diferencia de IL-27, no promovió proliferación de células T ni promovió la producción de IFN-?14. A la luz de los hallazgos de que IL-27 inhibe la producción de IL-17 y la expresión de p28 incrementa drásticamente en astrocitos activados, aunque la expresión de EBI3 fue inalterada (figura 1 B), se realizaron estudios para determinar si p28 como tal podría inhibir la producción de IL-17 por células T. células T CD4+ o CD8+ aisladas de ratones C57BL/6 estimuladas bajo IL-17 que inducen condiciones en presencia de p28. Aunque no tan eficiente como IL-27, el tratamiento con p28 solo podría inhibir la producción de IL-17 por células T CD4+ y CD8+ (figura 5C).

Citocinas asociadas a qp130 tienen distintos efectos sobre el desarrollo de TH-17 Trabajo reciente por múltiples grupos ha revelado un papel para IL-6 en el desarrollo de células TH-1711"13. Debido a que IL-6 y IL-27 señalizan a través de un componente de receptor compartido, gp130, fue posible que la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de IL-17 fue una consecuencia de competición con IL-6 para unión de gp130 y o señaliza. Para enfrentar este problema, se realizaron una serie de experimentos usando células T CD4+ aisladas de los bazos de ratones WT C57BL/6. Cuando estas células fueron activadas con anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 en presencia de IL-23 o TGF-ß bajo condiciones no polarizantes (anti-IFN-?, anti-IL-4) ocurrió secreción robusta de IL-17, y la adición de IL-27 podría inhibir la producción de IL-17 de una manera dependiente de la dosis (figuras 6A y 6B). La neutralización subsecuente de IL-6 en las condiciones de cultivo (usando un anticuerpo anti-IL-6) se produjo una disminución en la producción de IL-17, similar a los reportes previos11; sin embargo, incluso en esas condiciones la adición de IL-27 redujo aún más los niveles de IL-17 de una manera dependiente de la dosis (figuras 6A y 6B), indicando que IL-27 y IL-6, citocinas estrechamente relacionadas, tienen efectos contrastantes sobre células TH- 7. Una de las consecuencias directas de la señalización por muchas citocinas de tipo I es la activación hacia el extremo 3' de proteínas SOCS, que conduce a la supresión de respuestas de células T a través de un bucle de retroalimentación negativa42. Se ha reportado anteriormente que igual que IL-6, IL-27 induce expresión de SOCS3 en células T CD4+27,37 y se ha propuesto que esta actividad explica la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de IL-237. Para explorar el posible papel de esta vía sobre la capacidad de IL-27 para inhibir la actividad de TH-17, se usaron ratones gp130Y757F, que expresan una mutación hipermórfica en gp13043; es estos ratones transgénicos, gp130 de tipo silvestre ha sido reemplazado por una versión en la cual el residuo Tyr757 es reemplazado por fenilalanina. Estudios previos han asociado este residuo con la unión de SOCS3 y SHP2, y consistente con esta observación esta substitución produce hiperactivación mediada por IL-6 de STAT3 y activación alterada de la vía Ras-ERK44. Células T de los ratones gp130Y757F estimuladas con IL-6 dieron por resultado fosforilación de STAT3 exagerada y prolongada (figura 6C y no se muestran datos). El pico de fosforilación de STAT3 ocurrió a 1 hr y permaneció elevado en las células T de gp130Y757F después de 24 hr (figura 6C y no se muestran datos). Subsecuentemente, células T CD4+ se aislaron de ratones gp130Y757F y controles de carnada WT y se hicieron crecer bajo condiciones inductoras de TH-17 durante 4 días seguido por medición de intracelular IL-17. En estos experimentos, esta mutación en gp130 condujo a un incremento por un factor de 3 en la frecuencia de células IL-17+ sin reestimulación con PMA y ionomicina (figura 6D) aunque este efecto fue menos evidente cuando se usó PMA y ionomicina estimulación (figura 10). El análisis de sobrenadantes de cultivo reveló que células T de gp130Y757F de CD4+ secretaron cinco veces más IL-17 que células T CD4+ WT (figura 6E). Esos datos establecen que la producción mediada por IL-6 de SOCS3 limita la capacidad de IL-6 para promover IL-17 y concuerdan con el reporte reciente de un papel para SOCS3 como un regulador negativo de producción de IL-17 inducida por IL-2345. Sin embargo, la adición de IL-27 antagonizó la producción de IL-17 por las células gp130Y757F TH-17 con o sin reestimulación con PMA y ionomicina (figura 6D y figura 10) y IL-27 fue capaz de reducir los niveles de IL-17 secretada por mutante y células T CD4+ WT de una manera dependiente de la dosis (figura 6E). Finalmente, para examinar directamente el papel de SOCS3 en limitar la producción de IL-17 por IL-27 se usaron ratones CreMm Socsm con una deleción condicional de Socs3 en células T CD4+. Cuando se hicieron crecer células T CD4+ CreM Socsm bajo condiciones inductoras de TH-17 en presencia de IL-27, la producción de IL-17 fue inhibida aún más (figura 6F). Juntos, estos resultados indican que la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de IL-17 no puede ser atribuida a un amortiguamiento de señalización de gp130— IL-6 mediada por SOCS3.

IL-27 inhibe la producción de IL- 7 a través de STAT1 Aunque IL-6 y IL-27 son citocinas estrechamente relacionadas y comparten señalización mediada por gp130, los datos presentados hasta ahora demuestran que tienen efectos opuestos sobre la producción de IL-17. Esa conclusión implica que las señales inhibidoras de IL-27 son mediadas a través del componente específico de IL-27R, y aunque IL-6 activa STAT3 predominantemente, varios estudios han ligado la cadena de IL-27R única a la activación de STAT1 y subsecuente inducción del factor de transcripción T-bet32,33. Por lo tanto, para determinar si la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de IL-17 implicó estos factores de transcripción, células T CD4+ ya sea de ratones Statl-/- o Tbx21-I- (deficientes en T-bet) fueron estimuladas bajo condiciones inductoras de TH-1 en presencia o ausencia de IL-27. Como antes, la adición de IL-27 dio por resultado una inhibición marcada de producción de IL-17 por WT y células T CD4+ deficientes en T-bet, pero el efecto fue comprometido en ausencia de STAT1 (figura 7A). Esos datos identifican un papel dominante para STAT1 en la capacidad de IL-27 para antagonizar la función de TH-17. Para examinar el papel de STAT1 in vivo, ratones Stat1-I-fueron infectados agudamente con T. gondii y la producción de IL-17 se monitoreó. La reestimulación de esplenocitos con STAg el día 7 después de la infección mostró que los esplenocitos de Statl-/- secretan más IL-17 que sus contrapartes WT (figura 7B). Aunque consistente con los datos in vitro, los datos in vivo tienen que ser interpretados con precaución debido a que los ratones Stat1-I- son incapaces de controlar la replicación de parásitos46; sin embargo los resultados son similares a los estudios con EAE7 que previamente proveyeron evidencia in vivo para inhibición de actividad de TH-17 mediada por STAT1.

Discusión Recientemente, un subconjunto único de células T ligadas a la producción de IL-17, FNT y IL-6 han sido implicadas en el desarrollo de la patología observada en modelos de esclerosis múltiple, enfermedad intestinal inflamatoria y artritis reumatoide3"7. Aunque las respuestas de TH-17 aberrante están asociadas con autoinmunidad, también tienen un papel en resistencia aguda para el desafío con los patógenos Klebsiella y Toxoplasma47'49, pero en esas situaciones las respuestas de TH-1 no conducen a autoinmunidad. La implicación de esos resultados, similar a lo que se conoce para la mayoría de las respuestas de células T, es que existen mecanismos para regular apropiadamente la actividad de TH-17¡ no hay evidencia clara de que IFN-? y IL-4 son requeridos para que otras células auxiliaresT antagonicen células TH- -| y3, 13,40, 1 Los resultados aquí muestran que ratones Il27rá~'~ crónicamente infectados con T. gondii desarrollan neuropatología severa mediada por células T CD4+, asociadas con la producción anormal de células T de IL-17, IL-6 y FNT que indica un papel para IL-27 en la regulación de la actividad de TH-17. Los efectos supresores de IL-27 sobre células ??-17 fueron demostrados por experimentos en los cuales IL-27 inhibió la producción de IL-17 por BMNC de ratones crónicamente infectados estimulados con IL-23, así como células T CD4+ transgénicas de TCR y células T CD4+ y CD8+ derivadas del bazo. Esos resultados indican que IL-27 probablemente regula las células ??-17 en otros sitios de inflamación. Como se resaltó antes, IL-6 y IL-27 son citocinas estrechamente relacionadas que señalizan ambas a través de gp130 y sus efectos celulares son mediados a través de la activación de la vía de JAK-STAT8,52, pero también tienen efectos muy diferentes sobre la actividad de TH-17. Un reporte reciente ha ligado la activación de STAT3 inducida por IL-23 para promover la producción de IL-17 por células T CD4+ 53, un hallazgo consistente con la capacidad de IL-6, un activador mayor de STAT3, para promover la actividad de ??-17. De manera similar, la observación de que las células T de gp130Y757F producen cantidades elevar las cantidades de IL-17 concuerda con modelos actuales que indican que SOCS3 es parte de un bucle de retroalimentación negativas clásica que limita la señalización mediada por IL-6. Sin embargo, aunque IL-27 activa SOCS327,37 la capacidad de IL-27 para reducir la actividad de TH- 7 en ausencia de IL-6 y en las células T CD4+ deficientes en gp130Y757F o SOCS3 indica que tiene efectos inhibidores distintos de simplemente antagonizar señalización mediada por IL-6. Aunque reportes iniciales enfocados sobre las actividades pro-inflamatorias de IL-27, existe un creciente reconocimiento de que IL-27 antagoniza respuestas de células T patológicas. Estudios recientes que muestran IL-27 inhiben la producción de IL-2 por células auxiliares han provisto perspectivas sobre sus posibles actividades anti-inflamatorias27. Más aún, la capacidad de IL-27 para reducir la producción de IL-17 en presencia de IL-2 exógena indica que la actividad de TH-17 disminuida no es simplemente una consecuencia de los niveles reducidos de IL-2 (figura 11). De hecho, algunos datos sugieren que IL-2 preferencialmente promueve respuestas de IFNy y no de IL-1711. Los datos presentados aquí demuestran que IL-27 utiliza STAT1 para suprimir producción de IL-17 por células T CD4+ y CD8+, un efecto que es independiente de T-bet. Esa observación contrasta con un reporte previo de que la inhibición de IL-2 producción por IL-27 fue independiente de STAT127. Aunque la activación de STAT1 por IFN-? o IL-27 ha estado predominantemente asociada con el desarrollo de respuestas de TH1 , los presentes datos resaltan que esta vía de señalización también media actividades anti-inflamatorias. Esta conclusión es soportada por la observación de desarrollo incrementado de células TH-17 ¡n vivo en ratones Sfa t- - 7,5 y por el hecho de que la neutralización de IFN-? promueve la producción de IL-173,40,41. Más aún, la hipótesis de que IL-27 media la activación de STAT1 representa una vía inhibidora endógena de células T productoras de IL-17 en el SNC puede explicar el hallazgo de que los ratones Statr'~ desarrollan EAE más severa55. Aunque el último hallazgo ha sido atribuido a la falta de señalización de IFN-?8, parece probable que también puede ser una funcción de actividad de IL-27 reducida. En la actualidad, se desconoce la base molecular para los efectos inhibidores de STAT1 en diferentes sistemas experimentales, sin embargo la literatura que resalta el papel de varios STATs en la represión de las respuestas inmunes sigue creciendo56,57. La inhibición de la producción de IL-17 por p28 sola provoca varias preguntas acerca de la biología de cómo esta proteína se une a su receptor y transluce sus efectos inhibidores. Una posibilidad es que la secreción de p28 puede dimerizar con EBI3 constitutivamente disponible conduciendo a la formación de IL-27 o p28 puede señalizar in trans de una manera similar a IL-619. Aunque ninguna de las actividades inmuno-estimuladoras de IL-27 han sido previamente ascritas a p2814, un mejor entendimiento de la biología de esta proteína secretada puede proveer una perspectiva en las formas en que se puede usar terapéuticamente. Los hallazgos presentados aquí sugieren una relevancia de señalización de p28 como tal y la importancia de IL-27 como un antagonista fisiológico de actividad de TH-17. Aunque se ha descubierto una fuerte evidencia de que el bloqueo de la actividad de IL-17 alivia la enfermedad en una variedad de trastornos autoimmunes3'50'51'58, la neutralización de IL-17 específicamente dirige las cítocinas hacia el extremo 3' de la actividad de TH-17. Por el contrario, la estimulación por IL-27 y/o su subunidad p28 puede antagonizar directamente células TH-17 específicas de antígeno y provee una oportunidad para dirigir específicamente las fuentes celulares de IL-17, que pueden proveer un enfoque más eficiente para el tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunes.

Métodos Ratones y parásitos Ratones C57BL/6 se obtuvieron de Jackson laboratories y ratones WSX-1-/- (H27ra-/-) fueron provistos por Dr. Christiaan Saris (Amgen Inc.). Los ratones DO1 1.10 transgénicos con una TCR específica para el péptido de ovalbúmina de pollo (OVA(323-339)) en el contexto de l-Ad, los ratones Statl-I- y ratones Tbx21-/- fueron provistos por Dr Phillip Scott (Universidad de Pennsylvania, Philadelphia, PA). Los ratones gp130Y757F y CreMMTVSocs3fl/fl fueron descritos anteriormente43,45. Los ratones fueron alojados y criados en instalaciones libres de patógenos específicas en el Departamento de Patobiología en la Universidad de Pennsylvania de conformidad con los lineamientos institucionales. La cepa Me49 de T. gondii se preparó a partir de ratones CBA/ca crónicamente infectados y los animales experimentales fueron infectados ¡ntraperitonealmente con 20 quistes. A los ratones Il27ra-I- se administró 200 µg de CTLA4-lg (Bristol Meyers Squibb) ¡ntraperitonealmente los días 7 y 10 después de la infección o fueron tratados el día 5 después de la infección con 200 mg/L de sulfadiazina (Sigma) en su agua para beber durante dos semanas. El antígeno de Toxoplasma soluble (STAg) se preparó a partir de taquizoitos de la cepa RH como se describió antes59. Para exámenes histológicos, se recolectaron hígados, pulmones y cerebros de animales, se fijaron en 10% de formalina, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para determinar la activación de astrositos, secciones de cerebro se tiñeron para GFAP como se describió antes30. Para medir la carga de parásitos, el gen B1 de T. gondii 35 veces repetido se amplificó por PCR en tiempo real usando mezcla SYBR® Green PCR Master (Applied Biosystems) en una máquina de PCR en tiempo real rápida AB7500 (Applied Biosystems) usando condiciones previamente descritas30. Para normalizar los valores de Ct obtenidos de las muestras experimentales, el gen de ß-actina de ratón se amplificó bajo las mismas condiciones30.

Análisis de células mononucleares de cerebro (BMNC) El aislamiento de BMNC de ratones WT y H27ra-I- crónicamente infectados se llevó a cabo de conformidad con un protocolo previamente descrito30,60. Las células se procesaron para tinción de superficie ex vivo y tinción intracelular como se describió antes27. Las células se tiñeron en la superficie usando anticuerpos contra CD4, CD8, CD44, CD45, l-A/l-E (BD Pharmingen), CD62L y CD1 1 b (eBioscience). Células T se tiñeron intracelularmente usando anticuerpos contra IL-17 (BD Pharmingen), IFN-? y FNT (eBioscience). Se obtuvieron muestras en un citómetro de flujo FACScaliber (Becton Dickenson) y los resultados se analizaron usando software FloJo (TreeStar Inc.). BMNC se colocaron en placas a una densidad final de 2 x 105 células por pozo en un volumen final de 200 µ? en placas de fondo redondo de 96 pozos (Costar). Las células fueron estimuladas con o sin STAg (50 g/ml) en presencia o ausencia de mlL-27 recombinante (100 ng/ml; Amgen Inc.), IL-23 (10 ng/ml; DNAX) o ambos. Los sobrenadantes se recolectaron después de 48 hr y los niveles de IL-2, IFN-?, IL-12, IL-17, FNT y IL-6 se midieron por ELISA. Los niveles de óxido nítrico (NO) se midieron mediante el uso de una prueba de Greiss.

Análisis de PCR cuantitativo en tiempo real ARN celular total se aisló de cerebros perfundidos y homogeneizados de ratones WT y H27ra-/- crónicamente infectados así como ratones WT no infectados usando procedimientos estándares y convertidos a ADNc como se describe26. Además, ARN total se aisló de cultivos de astrocitos primarios de WT C57BL/6 y se usó para hacer ADNc. Astrocitos primarios fueron cosechadas de los cerebros de ratones de 1 -3 días de edad como se describió antes30, y la pureza de cultivos de astrositos como se juzga por tinción de proteínas ácidas fibrilares gliales (GFAP) (GFAP anti-ratón, BD Pharmingen) fue consistentemente mayor que 90%. La expresión de FNT, IL-6, IL-27p28 y EBI3 se determinó usando iniciadores obtenidos de Qiagen y llevados a cabo en una máquina de PCR en tiempo real rápida AB7500 usando reactivos Power Sybr green® (Applied Biosystems). La expresión de IL-17 se determinó usando iniciadores Taqman®, sonda y reactivos obtenidos de Applied Biosystems. El gen de mantenimiento de ß-actina se usó como un control de normalización en ambos casos.

Generación de células TH-17 Células T CD4+ y CD8+ productoras de IL-17 se produjeron como se describe en otra parte11,40 con cambios modificados. En breve, esplenocitos aislados de los ratones antes mencionados se agotaron de células CD8+ y NK1 .1 + para enriquecerse de células T CD4+ o se agotaron de células CD4+ y NK1.1 + para enriquecerse de células T CD8+ por separación de esferas magnéticas (Polysciences). Las células se colocaron en placas de 96 pozos (Costar) a una densidad de 5 ? 106 células/ml. Las células T CD4+ de Tg fueron estimuladas con 5 µg/ml de péptido OVA, mientras que las otras células T fueron estimuladas con anticuerpo anti-TCR (anti-CD3¡ 1 pg/ml; eBioscience) y anti-CD28 (1 µg/ml; eBioscience). Para la producción de células TH-17 los cultivos se complementaron ya sea con IL-23 de ratón recombinante (10 ng/ml; DNAX) o TGF-ß humano (1 ng/ml; R & D) solo o en combinación con IL-6 (10 ng/ml; eBioscience), FNT (10 ng/ml; eBioscience) y IL-? ß (10 ng/ml; BD Pharmingen). Además, IFN-? y IL-4 fueron neutralizados en los cultivos usando anti— IFN-? (10 µg/ml; clon XMG1.2) y anti-IL-4 (10 µg/ml; clon 1 1 B1 1 ). IL-27 recombinante (100 ng/ml; Amgen) se añadió en donde se establece. p28 recombinante fue provisto por eBioscience y se usó a una concentración de 100 ng/ml en donde se establece. Las células T CD8+ se cosecharon el día 3, mientras que células T CD4+ fueron complementadas con medio fresco y reactivos el día 3 y se cosecharon el día 4. Ambos tipos de células fueron subsecuentemente teñidas para IL-17, FNT y IFN-? intracelulares en presencia o ausencia de estimulación con PMA y ionomicina más Brefeldin A (Sigma).

Estadísticas Se usó una prueba de t de Student no pareada para determinar diferencias significativas y un valor de P <0. 05 se consideró significativo.

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EJEMPLO 2 WSX-1 soluble mejora la inhibición de la producción de IL-2 por IL-27 Esplenocitos totales se aislaron de dos ratones Il27ra-/- (WSX-1 KO1 y WSX-1 K02). Los esplenocitos se agotaron de células NK1.1 + y CD8+ para enriquecerse de células T CD4+. Las células T CD4+ se marcaron después con CFSE (éster carboxifluorosceinsuccinimidílico) y se estimularon con anticuerpo anti-CD3 y anticuerpo anti-CD28. IL-27 con o sin la proteína SIL-27R Fe (un polipéptido WSX-1 soluble, una proteína de fusión Fe incluyendo secuencia de dominio extracelular de WSX-1 , provista por Amgen Inc.) se añadió a pozos que contenían las células. La proteína slL-27R Fe se incubó durante 30 minutos con IL-27 antes de la adición a los pozos con células para facilitar la unión. Las células se incubaron durante 48 hr a 37°C. Los sobrenadantes se usaron en pruebas de ELISA para medir la producción de IL-2 y I FN-Y (figura 12). La adición de la proteína de fusión de WSX-1 soluble slL-27R Fe potenció la inhibición de producción de IL-2 y IFN-? por IL-27. Los resultados demuestran que el receptor soluble puede funcionar en ausencia de receptor endógeno e indicar que el receptor puede funcionar ¡n trans.

EJEMPLO 3 Un papel central para interleucina 27 y activación mediada por IL-6 de STAT3 en la producción de células T de IL-10 IL-10 tiene un papel prominente en la regulación del equilibrio entre respuestas de células T protectora y patológica. Consistente con esta actividad hay múltiples fuentes de esta citocina incluyendo células mieloides así como una variedad de subconjuntos de células T. Sin embargo, aunque hay muchas vías que regulan la producción innata de IL-10, los factores que gobiernan su producción por la respuesta adaptativa son poco entendidas. Los estudios presentados en este ejemplo revelan que IL-27 y IL-6 son capaces de inducir una a variedad de poblaciones de células T para producir IL-10. Este efecto es dependiente de los factores de transcripción STAT1 y STAT3 para IL-27, y STAT3 para IL-6. Juntos, estos estudios identifican una vía novedosa que permite al sistema inmune templar respuestas inflamatorias. IL-10 se describió inicialmente como una citosina asociada a TH2 que inhibió la producción de IFN-? por células TH11, 2. Posteriormente se reconoció que éste era un efecto indirecto y que su capacidad para templar la función de células TH1 se debió a se capacidad para antagonizar actividad de células accesorias. Por lo tanto, IL-10 redujo la capacidad de los macrófagos para producir citocinas pro-inflamatorias tales como IL-1 , FNT y IL- 2, y disminuyeron la expresión de moléculas co-estimuladoras y MHC requeridas para respuestas de células T3"9. Aunque IL-10 tiene una variedad de propiedades biológicas, uno de sus principales papeles in vivo es limitar respuestas inflamatorias, consistentes con sus efectos inhibidores sobre células que presentan antigeno. Esta función fue primero resaltada en los reportes iniciales que revelaron que ratones IL-10-/- espontáneamente desarrollan enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) 0. Estudios subsecuentes que usan modelos de ratón de sepsis, enfermedad infecciosa y autoinmunidad han extendido el entendimiento del papel de IL-10 en la regulación de respuestas innata y adaptativa asociadas con actividades de TH1 , TH2 y TH1711"13. En el contexto de enfermedad infecciosa, hay varios ejemplos de cómo la ausencia de IL-10 conduce a resistencia incrementada a patógenos, pero también da por resultado el desarrollo de una respuesta inflamatoria aberrante que puede matar al hospedero14"16. Juntos, estos estudios ilustran el papel central de IL-10 en el mantenimiento de un equilibrio entre inmunidad protectora y el desarrollo de patología. Dado el papel importante de IL-10 en limitar la inflamación quizás no es sorprendente que haya múltiples fuentes de este inmuno-modulador, incluyendo macrófagos y células dendríticas estimuladas con productos microbianos. Además, aunque IL-10 se caracterizó inicialmente como una citocina de TH21 , 2, ahora se reconoce que las células Tr1 17, CD25+ 18, 19 y CD25-células T reguladoras (Treg) 20, 2 y células TH122, 3 también secretan IL-10. La importancia relativa de estos subconjuntos diferentes como fuentes de IL-10 ha sido una pregunta desde hace mucho tiempo24, 25 , pero en años recientes el enlace entre células Treg y IL-10 ha dominado esta área de investigación. Sin embargo, existe una literatura establecida sobre la presencia de IFN-y+IL-10+ células auxiliares T en una variedad de casos de enfermedad26, 27 , y varios estudios recientes han resaltado la importancia de supresión inmune dependiente de IL-10 por CD4+CD25-Foxp3-células T que también producen IFN-? durante la infección con T. gondii y en un modelo no cicatrizante de Leishmania majo/28, 29. Sin embargo, a pesar de la evidencia extensiva para la importancia de IL-10 derivada de células T para limitar la inflamación, los eventos que inducen la producción de esta citocina por células T ha seguido siendo poco clara24, 25. IL-10 no es el único mediador anti-inflamatorio usado por el sistema inmunológico para controlar la inflamación, y la lista de vías (CTLA4, BTLA, PD1 ) implicada en este proceso continúa creciendo. Recientemente la citocina IL-27, una citosina heterodimérica compuesta de proteína 3 inducida por Epstein-Barr (EBI3) y p28 30, se ha descrito como un antagonista de varias funciones de células T. Esta citosina se identificó inicialmente como un factor que promueve el desarrollo de células TH131 , 32, pero reportes subsecuentes resaltan que IL-27 también pueden limitar respuestas de TH1 , TH2 y TH1 implicadas en varios modelos de infección y autoinmunidad32"40. De hecho, estudios en estos laboratorios revelaron que, igual que los ratones IL-10-/-, los ratones IL-27ra-/- infectados con T. gondii desarrollaron una respuesta mediada por células T CD4+ letal que se caracterizó por la producción excesiva de ctocinas pro-inflamatorias, áreas grandes de necrosis en el hígado y la presencia de infiltrados de células inmunes severos en múltiples órganos14, 33, 38, 41 , 42. Las similitudes de estos fenotipos no sólo resaltan el papel importante que estas citocinas anti-inflamatorias juegan en la regulación de la respuesta inmune en curso, también sugiere un enlace potencial entre estos dos inmunomoduladores. Para entender mejor el efecto de IL-27 sobre las células T, la producción de 67 mediadores inmunes solubles en presencia o ausencia de IL-27 se probaron. Este análisis reveló que aunque IL-27 inhibió múltiples citocinas asociadas con células TH1 , TH2 y TH17, sorprendentemente también promovió la producción de IL-10. Esta observación se reflejó in vivo a medida que las células T de ratones IL-27ra-/- crónicamente infectados con T. gondii tuvieron un defecto en su capacidad para hacer IL-10. Estudios in vitro revelaron que IL-27 pudo incrementar la producción de IL-10 por células T CD4+ y CD8+, pero la mayoría de las células T IL-10+ inducidas por IL-27 no expresaron Foxp3 lo que indica que IL-27 puede estimular la producción de IL-10 por múltiples poblaciones de células T. Además, la estimulación de células T con IL-27 más TGF-ß dio por resultado un efecto aditivo sobre IL-10, y IL-6 (que igual que IL-27 señaliza a través de gp130) cuando se combinó con TGF-ß también fue un potente inductor de IL-10. La capacidad de IL-27 para estimular la producción de IL-10 fue independiente de la molécula de señalización intracelular STAT4 y el factor de transcripción T-bet, pero fue dependiente de la activación de STAT1 y STAT3, mientras que IL-6 sólo requiere STAT3. Colectivamente, estos datos proveen una perspectiva novedosa en el ambiente de la citocina que promueve la producción de IL-10 por células T y los eventos moleculares que sustentan esta vía reguladora.

Resultados IL-27 induce la producción de células T de IL-10 Aunque estudios recientes han resaltado la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de células T de múltiples citocinas pro-inflamatorias38 43, sería interesante una determinación selectiva que podría identificar objetivos adicionales para IL-27. Por lo tanto, células T intactas de CD4+ de ratones C57BL/6 fueron activadas con anticuerpos anti-TCR (a-CD3) y a-CD28 en presencia de células accesorias bajo condiciones no polarizantes (a-IFN-? y -IL-4) en presencia o ausencia de IL-27. Después de que las células se cultivaron durante tres días los sobrenadantes se probaron para un panel de 67 productos inmunes secretados usando un perfil de multianalito de roedores (RodentMAP™). Consistente con reportes anteriores, la adición de IL-27 a estos cultivos no polarizados conducen a disminuciones en múltiples citocinas asociadas con respuestas de TH1 (IFN-?), TH2 (IL-5) y TH17 (IL- 7) pero también se incluyen GM-CSF, IL- ß, IL-3, MIP-1a y -ß y linfotactina (figura 14A). Además, algunas otras citocinas incluyendo IL- 8, IL-6, IL-7 y quimiocinas incluyendo MCP-1 , MCP-3, M-CSF, MMP-9 fueron inalterados por este tratamiento (cuadro 2). Sin embargo, el resultado más sobresaliente fue la observación de que IL-27 condujo a un incremento de 1000 veces en los niveles de IL-10 en estos sobrenadantes del cultivo (figura 14A y cuadro 2).

CUADRO 2 Resultados de MAP en roedores Los valores <BAJO> reflejan muestras no medibles en la curva estándar * ulU/ml El análisis usando tinción intracelular reveló que cuando estimulado bajo condiciones similares seguido por reestimulación con 1 acetato de forbol 12-miristato (PMA) y ¡onomicina hay un pequeño porcentaje de células T CD4+ y CD8+ de IL-10+, pero la adición de IL-27 conduce a un incremento marcado en este porcentaje (figuras 14B y 14C). Aunque estos resultados indican que un número similar de células T CD4+ y CD8+ hacen IL-10 en respuesta a IL-27, la cantidad de IL-10 en el sobrenadante de los enriquecidos para células T CD4+ fue más alto que los observados para los cultivos que contienen las células T CD8+, consistentes con diferencias en la media de la intensidad fluorescente (MFI) (figuras 14B y 14C). Consecuentemente, la mayoría de los estudios presentado en este ejemplo enfocado en células T CD4+ como una fuente de IL-10. La IL-27R se requiere para producción óptima de células T de IL- 0 in vi tro y in vivo Los estudios descritos anteriormente indicaron que IL-27 podría incrementar la producción de células T de IL-10. Para evaluar el papel de la IL-27R en estos eventos, esplenocitos de ratones WT o ll-27ra-/- fueron activados bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27, y IL-10 se probó. Mientras que las células de ratones WT secretaron niveles incrementados de IL-10 en respuesta a IL-27, esto no se observó en los cultivos de los ratones ll-27ra-/- (figura 15A). De hecho, incluso niveles básales de IL-10 en estos sobrenadantes fueron reducidos en comparación con controles de WT. Para evaluar si IL-27/IL-27R estaba implicado en la regulación de respuestas inflamatorias in vivo, se usó un sistema experimental en el cual los ratones WT y ll-27ra-/- fueron crónicamente infectados con T. gondii38. En estos estudios, la reestimulación de preparaciones de células mononucleares de cerebro (BMNC) y esplenocitos de ratones WT crónicamente infectados directamente ex vivo reveló la presencia de células T CD4+ que producen IL-10. Por el contrario, cuando se usaron células de los cerebros y bazos de ratones ll-27ra-/- crónicamente infectados hubo un defecto marcado en IL-10 (figura 15B). Por el contrario, la reestimulación de e BMNC de tipo silvestre con STAg en presencia de IL-27 dio por resultado un aumento significativo de IL-10 (figura 15C). Estose resultados colectivamente sugieren un papel prominente para IL-27 y la IL-27R en promover la producción de células T de IL-10 in vitro y en el establecimiento de inflamación inducida por infección crónica asociada con T. gondii.

IL-27 induce la producción de IL-10 bajo condiciones de T H1 v Aunque los estudios descritos anteriormente se realizaron bajo condiciones neutras, los datos de ratones infectados con T. gondii implican un papel para IL-27 en el desarrollo de productores de IL-10 durante una respuesta dominada de TH1 . Por lo tanto, estudios in vitro adicionales se realizaron para determinar en qué punto después de la activación de células T se produjo IL-10 y para evaluar la capacidad de IL-27 para promover IL-10 bajo condiciones que favorecen el desarrollo de células TH1 , TH2 o TH17. El análisis de producción de IL-10 por células T CD4+ durante un período de cuatro días en respuesta a IL-27 reveló que las células empiezan haciendo IL- 10 48 horas después de la activación y que los números de células IL-10+ alcanzaron un pico a las 72 horas y se mantuvieron durante 96 horas (figura 16A). Además, las células fueron CFSE marcadas para determinar si las células T productoras de IL-10 generadas por IL-27 fueron activamente proliferantes o parte de una población no replicante de células T. Como se muestra por dilución de CFSE sólo las células tenues de CFSE hicieron IL-10 en respuesta a IL-27. Este hallazgo es consistente con modelos en los cuales la proliferación es requerida para que las células T adquieran producción de citocina44. También, el patrón de producción de IL-10 en estos experimentos se correlaciona con el perfil de expresión de la IL-27R en células T recién activadas T45. Consistente con reportes previos23, bajo condiciones de TH1 (IL-12 plus alL-4) hubo números bajos de células T CD4+ que hicieron IL-10, pero la adición de IL-27 dio por resultado un incremento en el porcentaje de células que tiñeron positivamente para IL-10 (figura 16B). Bajo condiciones de TH2 (IL-4 más a-IFN-?) hubo un número considerable de células T CD4+ de IL-10+, similar a reportes previos, y la adición de IL-27 dio por resultado un incremento marcado en el porcentaje y MFI para tinción de IL-10. Sorprendentemente, la polarización de células T CD4+ bajo condiciones de TH17 (TGF-ß más IL-6) dio por resultado la presencia de la población de células T más grande que produjo IL-10 cuando de comparó con todas las demás condiciones. Sin embargo, cuando se añadió IL-27 ya no hubo incremento en IL-10 (figura 16B). Juntos, estos datos indican que la capacidad de IL-27 para promover la producción de IL-10 es más prominente bajo condiciones de TH1 y TR2 pero no TH17.

Efectos de IL-27 sobre productores de citocina dobles Aunque IL-27 puede promover la producción de IL-10 bajo condiciones TH1 y TH2, y hubo una proporción significativa de células T CD4+ de IL-10+ después de la polarización de TH17, no estuvo claro si estas células de IL-10+ también producen citocinas de firma asociadas con estos subconjuntos de TH. Por lo tanto, las células T CD4+ fueron estimuladas bajo condiciones de TH1 , TH2 y TH17 y la tinción intracelular para IL-10 se combinó con IFN-?, IL-13 o IL-17 respectivamente. Cuando se estimulan bajo condiciones de TH1 , la mayoría de las células T productoras de IL-10 también se tiñeron positivas para IFN-?, pero esta población de doubles productores fue aún una minoría en comparación con las células que producen apenas IFN-? (figura 17A). La adición de IL-27 no redujo el número de células IFN-y+ en lugar de ello dio por resultado un incremento en el porcentaje de células IFN-Y+IL-10+T CD4+. Bajo condiciones de TH2 aproximadamente 50% de las células IL-10+ también estaban haciendo IL-13 (figura 17A). La adición de IL-27 incrementó el porcentaje de células IL-10+ y causó una reducción concurrente en el número de células IL-13+IL-10+ y los productores individuales de IL-13. Inesperadamente, el análisis de células T cultivadas con IL-6 más TGF-ß (TH17) para la producción de IL-17 y IL-10 reveló la presencia de tres poblaciones distintas de células T: productores individuales de IL-17 o IL-10, y una población de células IL-17+IL-10+ (figura 17A). De manera similar a los reportes anteriores38 la adición de IL-27 inhibió la expresión de IL-17, pero no incrementó el porcentaje de células que expresan IL-10. Más bien, hubo un incremento en la expansión de las células IL-10+IL-17-T. Dada la presencia de células accesorias en estos cultivos fue posible que la capacidad de IL-27 para inhibir la producción de IL-17 sea el resultado de su capacidad para inducir secreción de IL- 0. Sin embargo, cuando se usaron células T CD4+ de ratones IL-10-/-, IL-27 aún pudo inhibir la producción de IL-17 (figura 17B).

TGF-ß incrementa la capacidad de IL-27 para impulsar una población de células IL-10+ T CD4+ El hallazgo de que las célulasTH17 produjeron niveles significativos de IL-10 combinado con la incapacidad de IL-27 para incrementar IL-10 bajo estas condiciones sugirió que TGF-ß o IL-6 también pueden estar implicados en la regulación de estos eventos. El examen de los efectos de TGF-ß sobre células T CD4+ reveló que a diferencia de IL-27, TGF-ß sola dio por resultado un incremento moderado en IL-10, pero cuando se combinó con IL-27 tuvo un efecto aditivo que condujo a un incremento en el porcentaje de células IL-10+ asi como un incremento en el MFI (figuras 18A y 18B). Además, aunque TGF-ß exógeno incrementó la producción de IL-10, la neutralización de TGF-ß endógeno no eliminó la capacidad de IL-27 para promover la producción de IL-10, pero condujo a una reducción moderada en el porcentaje de células IL-10+ (no se muestran datos). Puesto que TGF-ß puede convertir las células CD4+CD25- T a CD4+CD25+ indujo células Treg que expresan Foxp3 46, 47, fue posible que la inclusión de TGF-ß favorecería la expansión de Treg y que IL-27 promueve la secreción de IL-10 por Treg. Por lo tanto, células T CD4+ de ratones quiméricos Foxp3GFP48 fueron activadas con a-CD3 y a-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia de TGF-ß, IL-27 o la combinación de ambas citocinas. Después de 72 horas de incubación bajo condiciones no polarizantes, pocas células Foxp3GFP+ estuvieron presentes en los cultivos sin TGF-ß; sin embargo, la adición de TGF-ß dio por resultado la generación de una población grande de células Foxp3GFP+ T CD4+ con menos de 10% haciendo IL-10 (figura 18C). Cuando se cultivaron células T CD4+ en presencia de IL-27 no hubo expansión de células Foxp3GFP+, pero 50% de las células Foxp3GFP+ estaban haciendo IL-10. Sin embargo, la mayoría de las células T productoras de IL-10 que se generaron en respuesta a IL-27 fueron Foxp3GFP- (20% versus 1.4%). Por último, cuando TGF-ß se combinó con IL-27 hubo casi 70% de disminución en el número de células Foxp3GFP+ comparado con los cultivos que contienen TGF-ß solo. Como se ve con IL-27 solo, cerca de 50% de las células Foxp3GFP+ hicieron IL-10, pero la mayoría de las células T CD4+ productoras de IL-10 permaneció Foxp3GFP-, indicando que los efectos de IL-27 sobre la producción de IL-10 no son específicos para Foxp3+ T regs. Juntos, estos datos indican que TGF-ß tiene un efecto sinergístico sobre la producción de IL-10 por células T CD4+ cuando se combina con IL-27, y este resultado no se debe a números incrementados de células Foxp3+ Treg en estos cultivos.

Un papel para IL-6 en promover la producción de IL-10 Aunque TGF-ß pudo incrementar la capacidad de IL-27 para estimular la producción de IL-10 sola, no pudo explicar el alto porcentaje de células IL-10+ T presentes bajo condiciones de TH1 . Por lo tanto, para determinar si IL-6, una citosina de tipo I que comparte homología estructural y una subunidad de receptor con IL-27, también puede promover la producción de IL-10, las células T CD4+ se incubaron con IL-6 bajo condiciones no polarizantes. En estos experimentos, como se ve con TGF-ß, la adición de IL-6 dio por resultado sólo un incremento moderado en IL-10 (figuras 19A y 19B). Sin embargo, cuando se combinó con TGF-ß IL-6 sinergizado para promover la emergencia de una gran población de células IL-10+ T CD4+. Puesto que la capacidad de IL-27 para regular positivamente IL-10 fue el más evidente bajo condiciones polarizantes de TH1 , el efecto de IL-6 sobre la producción de IL-10 bajo condiciones de ??1 y TH2 se examinó. A diferencia de IL-27, IL-6 no pudo incrementar IL-10 bajo la polarización de TH1 (figura 21). Por el contrario, bajo condiciones de diferenciación de TH2 la adición de IL-6 tuvo un efecto aditivo sobre el nivel de IL-10 que se hizo (figura 21).

Un papel para Stat y Stat3 para la generación de células T CD4+ productoras de IL- 0 La activación de proteína específicas de STAT en células T CD4+ es uno de los factores contribuyentes asociados con la diferenciación de células T en distintos linajes de células TH, y se ha mostrado que IL-27 activa un número d proteínas STAT incluyendo STAT1 (y como una consecuencia T-bet), STAT3 y a un menor grado STAT4 49, 50 mientras que IL-6 principalmente activa STAT3 y a un menor grado STAT1 51 · 52. A fin de determinar la cinética con la cual IL-27 y IL-6 activa STAT1 y STAT3, células T CD4+ purificadas fueron estimuladas con cada citosina durante un período de tres horas y la fosforilación de estos factores de transcripción se monitoreó. Estos estudios revelaron que las células T CD4+ fueron capaces de fosforilar STAT1 y STAT3 en respuesta a IL-6 y IL-27, sin embargo IL-6 fue capaz de hacer esto a una velocidad más rápida que IL-27 (figuras 19C y 19D). Aunque el número más alto de células P-STAT1 + no se vio sino hasta 30 minutos después de la estimulación con IL-27, no hubo diferencia en el porcentaje de células P-STAT1 + entre el pico de la respuesta de IL-6 y IL-27. Por otra parte, IL-6 fue un inductor tan fuerte de fosforilación de STAT3 que después de 5 minutos de estimulación aproximadamente 90% de las células T fueron P-STAT3+, y un nivel alto de P-STAT3 se mantuvo durante un período de 3 horas. Por el contrario, un porcentaje mucho menor de células T CD4+ teñidas positivas para P-STAT3 en respuesta a IL-27 y esta población de células P-STAT3+ no se mantuvo a 3 horas después de la estimulación.

Para investigar adicionalmente el papel de la vía de señalización de JAK-STAT en la inducción de IL-10 por IL-27, se usaron ratones deficientes para proteínas STAT individuales. La capacidad de IL-27 para inhibir IL-17 ha sido atribuida anteriormente a su capacidad para activar STAT1 38, aunque un papel para señalización de IL-27R en la promoción de diferenciación de TH1 se ha atribuido en gran medida a la activación de T-bet a través de mecanismos ependientes así como independientes de STAT153. Por lo tanto, para determinar si la capacidad de IL-27 para promover IL-10 implicó estas proteínas, las células T CD4+ obtenidas de ratones Stat - y Tbx21-/- (T-bet-deficiente) fueron estimuladas bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27. Células T CD4+ de ratones STAT1-/- fueron incapaces de producir IL-10 en respuesta a IL-27 (figura 20A), mientras que la ausencia de T-bet no afectó la capacidad de IL-27 para promover IL-10 (figura 20B). Para evaluar el papel de STAT3, células T CD4+ derivadas de ratones con un alelo de STAT3 flanqueado que también expresa un transgén CD4-Cre {Stat3CD4-/-†4 fueron estimuladas como antes en presencia o ausencia de IL-27. La remoción del alelo STAT3 de las células T CD4+ redujo su capacidad para hacer IL-10 en respuesta a IL-27 en compasión con sus controles de carnada Stat3fl/fl CD4-Cre-negativo de tipo silvestre (figura 20C). Estos datos indican que STAT1 y STAT3 están implicados en la capacidad de IL-27 para promover la producción de IL-10. Además, aunque IL-27 también había sido enlazada a STAT4, cuando las células T CD4+ derivadas de ratones Stat4-/- se cultivaron bajo condiciones no polarizantes en presencia de IL-27 la ausencia de STAT4 no impidió la capacidad de IL-27 para promover IL-10 (figura 20D), indicando que este es un evento independiente de STAT4. Sin embargo, es importante notar que cuando células STAT4-/- T se cultivaron bajo condiciones de TH1 produjeron menos IL-10 en comparación con células de tipo silvestre en respuesta a IL-12 aun cuando se añadió IL-27 (figura 22). Por último, células T CD4+ de ratones Statl-/- y Stat3CD4-/- se evaluaron para su capacidad para producir IL-10 cuando se estimularon con IL-6 solo o en combinación con TGF-ß. Las células T CD4+ de ratones Statl-/-y Stat3CD4-/- desplegaron una capacidad reducida para hacer IL-10 en respuesta a IL-6 (figuras 20E y 20F). Por el contrario, células T CD4+ de los ratones Statl-/- hicieron cantidades equivalentes de IL-10 cuando se incubaron con IL-6 más TGF-ß en comparación con los controles de tipo silvestre mientras que las células T de los ratones Stat3CD4-/- fueron deficientes en su capacidad para producir IL-10 bajo estas mismas condiciones. Estos hallazgos indican que la señalización de STAT3, pero no STAT1 , es requerida por IL-6 para iniciar la producción de IL-10 bajo condiciones de TH1 .

Discusión Puesto que la descripción original de IL-10's como una citocina asociada Con células TH2, ahora se reconoce que hay múltiples fuentes innatas y adaptativas de IL-10 que a su vez actúan como un inhibidor global de muchas clases (TH1 , TH2, TH17) de respuestas inmunes. Sin embargo, a pesar de la apreciación anterior de que las células T eran las fuentes principales de IL-10, persisten muchas preguntas acerca de los factores que gobiernan su expresión en estos linfocitos. El trabajo inicial de Trinchieri y colaboradores implicó IL-12 en impulsar el desarrollo de productores dobles de IFN-y/IL-1023' 26 ', observaciones recapituladas aquí por datos que muestran que bajo condiciones de TH1 , STAT4 está implicado en estos eventos. Más aún, la estimulación crónica de células T humanas y de ratón en presencia de IL-10 condujo a la emergencia de una población de células auxiliares T (Tr1) que secretaron altos niveles de IL-10 y que podrían aliviar colitis17. De manera similar, se ha mostrado que la estimulación repetida de células T CD4+ humanas y de murino intactas in vitro con dexametasona más vitamina D3 promueve la producción de IL-10 por una población de células Treg55. Por el contrario, los estudios presentados aquí revelaron que, incluso después de estimulación a corto plazo, IL-27 y IL-6 fueron capaces de inducir la producción de células T de IL-10 bajo una variedad de condiciones polarizantes. Esta observación identifica una nueva vía que promueve la producción de IL-10 y refuerza la relación de complejo entre las propiedades pro- y anti-ínflamatorias de los miembros de la familia de IL-6/IL-12. Aunque IL-27 se describió primero con base en su capacidad para promover respuestas de TH1 , ahora se reconoce que esta citosina de tipo I tiene un papel como regulador negativo de la intensidad y duración de las respuestas de células T32'34. Los efectos anti-ínflamatorios más amplios de IL- 27 se han atribuido a se capacidad para antagonizar funciones de células auxiliares T a través de la inhibición de la producción de IFN-?, IL-2, IL-4 y IL-1750, 56. Sin embargo, en un número de situaciones experimentales el fenotipo de ratones ll-27ra-/- ha sido remarcablemente similar al de ratones IL-10-/-33, 38, 39. Por ejemplo, ambos ratones IL-10-/- y ll-27ra-/- infectados con T. gondii desarrollaron una inflamación mediada por T CD4+ letal que está asociada con respuestas de TH1 desreguladas agudamente14, 15, 33, pero alteraron las respuestas de TH 7 en enfermedad crónica38, 42. En relación con estos últimos reportes, Sher y colaboradores establecieron que se requieren células CD4+CD25-Foxp3-IL-10+T para prevenir patología inducida por toxoplasma29. Los datos presentados aquí, junto con estos hallazgos, sugieren un modelo en el cual una de las funciones de IL-27 sea promover la producción de células T de IL-10 que ayude a limitar la patología mediada por células T durante la infección. Supuestamente, esta vía reguladora no sería restringida a toxoplasmosis sino que la inflamación incrementada observada en ratones //-27ra-/- en una variedad de situaciones infecciosas e inflamatorias50, 56 puede, por lo menos en parte, ser atribuida a respuestas de IL-10 defectuosas. Aunque hay múltiples fuentes celulares de IL-10, hay un número limitado de estudios que han definido los requerimientos específicos de linaje para transcripción de IL-10. En macrófagos, los productos microbianos y complejos inmunes pueden inducir IL-10 y MAPK, NF-KB y Sp1 están implicados en la regulación transcripcional de este gen57"59. En células T, mucho menos se sabe acerca de los eventos moleculares que controlan la síntesis de IL-10 aunque en células TH2 las proteínas JUN han sido implicadas en estos eventos y GATA3 está asociada con remodelación y estabilidad del locus de IL-10 requerido para la transcripción de este gen60. Puesto que IL-27 antagoniza la expresión de GATA361, parece poco probable que este factor de transcripción particular explique la capacidad de IL-27 y IL-6 para promover la transcripción de IL-10 bajo condiciones polarizantes de TH1 y TH1 . Más bien, los datos presentados aquí enlazan a STAT3 predominantemente, así como STAT1 y STAT4, con la inducción de IL-10 mediada por citocina. Esta observación es consistente con la presencia de sitios de unión a STAT en el promotor de IL-10 y un reporte previos de que IFN-a puede inducir el reclutamiento de STAT1 y STAT3 para trans-activar un reportero de IL-1062. Cabe notar que aunque IL-6 y IL-27 señalizan ambas a través de gp130, activan STAT1 y STAT3 y pueden promover IL-10, sólo IL-27 puede regular descendentemente IL-2 y IL-17 mientras que IL-6 promueve la actividad de TH17. Estas observaciones son parte de una literatura que ha resaltado algunos de los efectos aparentemente contradictorios de las moléculas de STAT en la diferenciación y función de células TH. Desde mediados de la década de 1990, STAT4 y STAT6 fueron reconocidos como factores de transcripción clave que promueven el desarrollo de TH1 y TH263, 6 mientras que estudios más recientes han ligado STAT3 a células TH1765"67. Ahora se ha vuelto evidente que proteínas STAT median los efectos de IL-27 en células T. Por lo tanto, la capacidad de IL-27 para inducir STAT1 puede antagonizar el desarrollo de TH17, mientras que STAT1 y STAT3 se requieren para que IL-27 induzca IL-10. Por el contrario, la capacidad de IL-6 para promover la actividad de TH17 y IL-10 es dependiente de STAT3. Una probable explicación de estos efectos distintos es que aunque los receptores para IL-6 y IL-27 contienen ambos gp130 hay cadenas de IL-6Ra y IL-27Ra únicas. El que esto indique que un heterodímero de STAT1/STAT3 media los efectos de IL-27 mientras que IL-6 (cuando se combina con TGF) sólo requiere que los homodímeros de STAT3 sigan siendo probados formalmente. Alternativamente, la diferencia en la magnitud de fosforilación de STAT3 entre IL-6 y IL-27 sugiere que los altos niveles de STAT3 activamente inducidos por IL-6 pueden ser suficientes para promover IL-10 mientras que IL-27 requiere la combinación de STAT1 y STAT3. Aunque el enfoque de este trabajo descrito en este ejemplo ha sido la capacidad de IL-6 y IL-27 para promover IL-10, quizás igual de importante es la observación de que TGF-ß también influye en esta vía. Con base, en parte, en presencia de inflamación de células T en los ratones TGF-ß-/-68, y la capacidad de TGF-ß para inhibir directamente la producción innata y adaptativa de IFN-?1 , 69, 70 se supuso que TGF-ß era una citocina antiinflamatoria. Con la realización de que TGF-ß tiene un papel prominente en el desarrollo de células Treg y TH17 y ahora la producción de IL-10 por células non-Treg, sigue siendo poco claro si dirige la diferenciación de células T o es un regulador central compartido de actividad de células T que es modulada por citocinas (IL-12, IL-6, IL-27) presentes en el ambiente que determinan el destino de las células. Aunque los estudios presentados aquí identifican IL-27 y IL-6 como factores que promueven la producción de células T de IL-10, uno de los problemas más grandes se relaciona con si esta observación indica el desarrollo de distintos subconjuntos de células T. Cuando Mossman y Coffman primero describieron células TH1 y TH2, se preguntaron cuál sería la diversidad total de fenotipos de células T y si otros tipos de células T existen in vivo7 Sin limitación a algún mecanismo particular, una posible interpretación de los datos presentados aquí es que los subconjuntos de células auxiliares T se pueden definir por su capacidad para producir IFN-?, IL-4 y IL-17 solas o en combinación con IL-10. Hasta la fecha, intentos iniciales que usan IL-27 para generar poblaciones estables de células T que producen IL-10 in vitro no han tenido éxito. Aunque hay varias formas de interpretar estos datos preliminares, una posibilidad es que la capacidad para secretar IL-10 no es un sello de distinción de distintos subconjuntos de células T sino más bien que las citocinas como IL-27 y IL-6 representan modificadores para los subconjuntos de células T principales que les permiten hacer IL-10 en el contexto de inflamación crónica. Nuevamente, sin limitación, este puede ser un mecanismo que permite el establecimiento de un subconjunto de células auxiliares T apropiado requerido para tratar con diferentes clases de patógenos, pero provee a cada uno de los distintos subconjuntos efectores con un mecanismo para vigilar sus propias actividades inflamatorias. Independientemente, con la identificación de IL-10 como una citocina anti- inflamatoria potente hubo la esperanza de que se pudiera usar para tratar una variedad de condiciones autoinmunes. Sin embargo, por razones que están poco claras, los ensayos clínicos con IL-10 han sido decepcionantes. El uso de citocinas como IL-27 que pueden inhibir las funciones efectoras de células T combinada con su capacidad para promover la producción de IL-10 se espera que pruebe ser más útil para el manejo de condiciones inflamatorias. En el contexto de la presente invención, los experimentos descritos en este ejemplo identifican la inducción de expresión de IL-10 como otra vía (además de dirigir la acción sobre las células T) por la cual los complejos y proteínas de fusión descritos anteriormente pueden suprimir la respuesta inflamatoria. Además, los resultados descritos en este ejemplo indican que la coadministración de factor de crecimiento transformante beta puede potenciar los efectos de los complejos y proteínas de fusión.

Métodos Ratones y parásitos Los ratones C57BL/6, Balb/c, Stat4-/- y Tbx21-/- se obtuvieron de Jackson laboratories. Los ratones WSX-1-/- (Il27ra-I-) fueron provistos por Dr. Christiaan Saris (Amgen Inc.). Los ratones Statl-/- fueron provistos por Dr Phillip Scott (University de Pennsylvania, Philadelphia, PA). Los ratones con un reportero de GFP con deficiencia en el sitio de traducción para Foxp3 se han descrito anteriormente72, y fueron provistos por Dr. Laurence Turka (University de Pennsylvania). Los ratones fueron alojados y criados en instalaciones libres de patógenos específicas en el Departmento de Patobiología en la Universidad de Pennsylvania de conformidad con los lineamientos institucionales. La cepa ME49 de T. gondii fue preparada a partir de ratones CBA/ca crónicamente infectados y animales experimentales fueron infectados intraperitonealmente con 20 quistes. Los ratones H27ra-I- y C57BL/6 de control de tipo silvestre fueron tratados el día 5 después de la infección con 200 mg/L de sulfadiazina (Sigma) en su agua para beber durante dos semanas para permitir que ll-27ra-/- progresara a una etapa crónica de infección. El antigeno de Toxoplasma soluble (STAg) se preparó a partir de taquizoitos de la cepa RH como se describió antes73. BMNCs de ratones crónicamente infectados se aislaron de conformidad con un protocolo publicado42 74.

Generación de células T productoras de IL-10 Células T CD4+ y CD8+ se aislaron de esplenocitos y nodos linfáticos que fueron agotados de células CD8+ y NK1.1 + para enriqucerse de células T CD4+ o fueron agotadas de células CD4+ y NK1.1 + para enriqucerse de células T CD8+ por separación de esferas magnéticas (Polysciences). Las células se se colocaron en placas de fondo redondo de 96 pozos (Costar) a una densidad de 5 ? 106 células/ml. Las células fueron estimuladas con anticuerpo anti-TCR (a-CD3; 1 pg/ml; eBioscience) y anticuerpo anti-CD28 (1 µ9/???; eBioscience). Para la producción de IL-10, cultivos de células T fueron complementados ya sea con IL-27 de ratón recombinante (100 ng/ml; Amgen) o TGF-ß humano (1 ng/ml; R & D) solo o en combinación con IL-27. Además, IFN-? y IL-4 fueron neutralizados en cultivos no polarizantes usando anti-IFN-? (10 µg/ml; clon XMG1.2) y anti-IL-4 (10 µg m|¦1 clon 11 B11). En algunos casos, las células T se cultivaron bajo condiciones de TH1 (10 ng/ml de IL-12 recombinante; eBioscience más 10 µg/ml de a-IL-4), TH2 (8 ng/ml de IL-4 recombinante; eBioscience más 10 µg/ml de a- IFN-?) o TH 7 (1 ng/ml de TGF-ß; R & D, 10 ng/ml de IL-6; eBioscience, más 10 µ?/G?? a-IFN-? y a-IL-4). Las células T CD8+ fueron cosechadas el día 3, mientras que las células T CD4+ fueron complementadas con medio fresco y reactivos el día 3 y cosechadas el día 4. Las células T después fueron reestimuladas con PMA y ionomicina más brefeldin A (Sigma). El análisis citométrico de flujo se realizó en un instrumento FACSCaliber (BD Biosciences) o BDFACS Cantoll (BD Biosciences) y se analizó usando software FlowJo (Tree Star Inc.). Todos los anticuerpos se compraron de BD Pharmingen o eBioscience. Para tinción intracelular de células GFP primero se tiñeron con un anticuerpo anti-GFP de ratón (eBioscience) seguido por una segunda tinción con un anticuerpo FITC anti-ratón de conejo (Jackson Immunoresearch).

Tinción intracelular para P-STAT1 y P-STAT3 Las células T CD4+ fueron purificadas de ratones C57BL/6 usando un equipo de aislamiento de CD4+ (Milltenyi). 1 ? 106 células T CD4+ purificadas fueron incubadas con IL-6 o IL-27 para 5, 30, 60 ó 180 minutos. Las células se fijaron después durante 10 minutos con 2% de paraformaldehído a 37°C. Después de la fijación las células se permeabilizaron con 90% de metanol durante 30 minutos sobre hielo seguido por tinción para CD4, P-STAT1 y P-STAT3. Los anticuerpos contra residuos de tirosina fosforilados de STAT1 y STAT3 se compraron de BD Pharmingen.

Estadística Se usó una prueba de t de Student no pareada para determinar diferencias significativas y un valor de P <0. 05 se consideró significativo.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una composición que comprende: un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido WSX-1/EBI3 soluble aislado o recombinante, un complejo de WSX-1/IL-27 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble aislado o recombinante, un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble aislado o recombinante, un complejo de gp130/IL-27 soluble aislado o recombinante, o una variante de los mismos. 2 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición es anti-inflamatoria. 3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 4. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición suprime el desarrollo de células IL-17 a partir de células T intactas inducidas por IL-6 y factor de crecimiento transformante beta. 5. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende además una o más células T. 6.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque las células T despliegan expresión alterada de IL-2, IFN-gamma, FNT-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5, o CD25, proliferación alterada o supervivencia alterada. 7 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende además una o más células B, células cebadas, neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células que expresan gp 30, o células que expresan WSX-1. 8. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende factor de crecimiento transformante beta. 9. - Una proteína de fusión WSX-1 recombinante o aislada, en donde la proteína de fusión comprende uno o más dominios que reconocen un marcador específico de célula, o en donde la proteína de fusión comprende uno o más dominios de polipéptido derivados de p28 o EBI3. 10. - La proteína de fusión recombinante o aislada de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque uno o más dominios que reconocen un marcador específico de célula comprende uno o más dominios de anticuerpo que reconocen un marcador específico de célula. 11.- La proteína de fusión recombinante o aislada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el marcador específico de célula se selecciona de CD4, CD8, CD11c, CD11b, y NK1.1. 12. - Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión recombinante o aislada de la reivindicación 9. 13. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el ácido nucleico codifica uno o más dominios de polipéptido seleccionados de: un dominio de anticuerpo, una región Fe, un dominio p28, o un dominio EBI3. 14. - Una proteína de fusión p28 recombinante o aislada. 15. - La proteína de fusión recombinante o aislada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la proteína de fusión comprende uno o más dominios de anticuerpo. 16. - La proteína de fusión recombinante o aislada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque por lo menos uno del dominio de anticuerpo reconoce un marcador específico de célula. 17.- La proteína de fusión recombinante o aislada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el marcador específico de célula se selecciona de CD4, CD8, CD11c, CD11b, y NK1.1. 18. - Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión recombinante o aislada de la reivindicación 14. 19. - Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de WSX-1 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/p28 soluble, o un complejo de polipéptido WSX-1/IL-27 soluble. 20.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el anticuerpo potencia una actividad del polipéptido o complejo de polipéptido. 21 - El uso de una porción aislada o recombinante seleccionada del grupo que consiste de: un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido p28, un complejo de polipéptido WSX- /p28 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/EBI3 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1/IL-27 soluble, un complejo de gp130/IL-27 soluble, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble, un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble, un polipéptido p28 y un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido EBI3 y un polipéptido WSX-1 soluble, IL-27 y un polipéptido WSX-1 soluble, un polipéptido gp130 soluble y un polipéptido p28, un polipéptido gp130 soluble y IL-27, un polipéptido gp130 soluble y un polipéptido EBI3, y una variante de los mismos, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una condición inflamatoria en un sujeto mamífero. 22. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde el sujeto es un humano. 23. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde la condición inflamatoria se selecciona de: un trastorno inmune, una infección, cáncer, una alergia, artritis, asma, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, uveitis, psoriasis, lupus, esclerosis múltiple, una enfermedad infecciosa crónica, tuberculosis, espondilitis anquilosante, rechazo de transplante, sarcoidosis y hepatitis. 24.- El uso de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la porción aislada o recombinante es adaptada para ser administrable al sujeto en combinación con factor de crecimiento transformante beta. 25.- El uso de una porción que se une específicamente a o modula una actividad de un complejo de gp130/WSX-1/IL-27, o que modula la formación del complejo en una célula, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una condición inflamatoria en un sujeto mamífero. 26. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde la porción se selecciona de: un anticuerpo, un antagonista, un agonista, y un modulador de actividad. 27. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde la condición inflamatoria se selecciona de: un trastorno inmune, una infección, cáncer, una alergia, artritis, asma, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, uveitis, psoriasis, lupus, esclerosis múltiple, una enfermedad infecciosa crónica, tuberculosis, espondilitis anquilosante, rechazo de transplante, sarcoidosis y hepatitis. 28. - Un método de identificación de un compuesto que se une a o modula una actividad de un polipéptido WSX-1 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1 /p28 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1 /IL-27 soluble, un complejo de polipéptido WSX-1 /EBI3 soluble, un complejo de polipéptido gp130/p28 soluble, un complejo de polipéptido gp130/IL-27 soluble, o un complejo de polipéptido gp130/EBI3 soluble, el método comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica o bioquímica que comprende el polipéptido o complejo con un compuesto de prueba; y (b) detectar la unión del compuesto de prueba al polipéptido o complejo, o modulación de la actividad del polipéptido o complejo por el compuesto de prueba, identificando así el compuesto que se une a o modula la actividad del polipéptido o complejo. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto potencia la inhibición de una respuesta de células T por el polipéptido o complejo, potencia la actividad antagonista contra IL-2 o IL-17, o altera la proliferación, supervivencia o expresión de IL-2, IFN-gamma, FNT-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5, o CD25 de células T.