KR20030074693A - 전항체 및 이의 단편의 결정과 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

전항체 및 이의 단편의 결정과 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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고바르단챈드리카피
양마크엑스
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Abstract

본 발명은 약학적 성분 또는 부형제를 사용하고 필요에 따라서는 중합체 담체중 결정 또는 결정 제제를 캡슐화시켜 조성물을 제조하고, 치료 단백질 및 백신의 전달을 비롯한 생물의학적 용도의 단백질 결정을 사용하여 전항체 결정 또는 항체 단편 결정의 안정화된 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

전항체 및 이의 단편의 결정과 이의 제조 및 사용 방법{CRYSTALS OF WHOLE ANTIBODIES AND FRAGMENTS THEREOF AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM}
항체는, 특정 항원을 내인성 세포, 박테리아, 바이러스 또는 독소에 특이적으로 표적화하는 뛰어난 능력을 매개로 하여 부작용이 최소화된 강력한 치료제를 구성한다. 지난 수 년간 시판되고 있는 일부 항체는 각종 질병, 예컨대 암 및 염증, 심혈관, 호흡기 및 감염성 질병을 치료하는 데 놀랄만한 성공을 거두었다. 현재 전세계적으로 약 480건의 항체 프로그램이 착수 및 개발 중에 있으며, 이중 83%는 미국에서 실시되고 있다. 미국 약학 연구 협회의 보고에 따르면, 현재 임상 시험에서 평가되고 있는 모든 생물약제 중 20% 이상이 항체이다. 미국 항체 시장은 향후 10년간 약 10배 증가하여 2010년에는 $101억에 이를 것으로 추산되고 있다[The Genesis Report: 25+ Business Development & Innovation Opportunities in Monoclonal Antibodies-Emerging Opportunities in 2010, The Genesis Group, Montclair, NJ]. 항체 개발에 있어서 이러한 노력과는 대조적으로, 항체의 정제,안정화 또는 차후의 전달 기술은 종종 제한된다.
개개의 항체 분자가 고유의 기능을 수행하는 데 필요한 시기가 될 때까지 항체의 3차원 이상의 고 차수 구조 또는 3차 구조를 보존하는 것이 중요하다. 지금까지, 특히 치료법에서 항체의 사용을 제한하는 인자는 전달 과정에서 직면하게 되는 화학적 및 물리적 변성에 대한 항체 구조의 감수성이다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 각종 방법이 사용되어 왔다. 그러나, 이들 방법은 종종 단백질 활성의 손실을 일으키거나 또는 단백질 안정화 담체 또는 제제의 추가 비용을 초래한다.
소분자의 결정질 약물의 안정성은, 이들 약물이 제조 과정에서 극단의 힘을 견딜 수 있도록 한다(예컨대 미국 특허 5,510,118호 참조). 이러한 힘은 비교적 불용성인 약물의 결정질 물질의 나노입자를 분쇄하는 것과 관련되어 있으며, 이러한 힘의 예로는 전단 응력, 난류, 고충격 충돌, 캐비테이션(cavitation) 및 분쇄 등이 있다. 소분자의 결정질 화합물은 상응하는 비결정질 고체보다 화학적 분해에 대해 더욱 안정한 것으로 인식되고 있다[Pical, M. J., Lukes, A. L., Lang, J. E. and Gaines, J. Pharm. Sci. 67: 767 (1978)].
지금까지, 당업자들은 소분자에 대해 관찰되는 결정질 상태의 상당히 증가된 안정성은 전항체와 같은 생물학적 고분자는 보유하지 못하는 것으로 인식하였다[Pical, M. J. and Rigsbee, D. R., Pharm. Res. 14: 1379 (1997)]. 예를 들어, 결정질 인슐린의 수성 현탁액은 상응하는 비결정질 상의 현탁액보다 약간만 더 (2배 정도로) 안정하다[Brange, J., Langkjaer, L., Havelund, S. and Volund, A., Pharm. Res. 9: 715 (1992)]. 고체 상태에서, 동결건조된 비결정질 인슐린은 지금까지 조사된 모든 조건 하에서 동결건조된 결정질 인슐린보다 더욱 안정하다[Pical, M. J. and Rigsbee, D. R., Pharm. Res. 14: 1379 (1997)]. 그러나, Shenoy 등은, 2가지 모델의 단백질, 글루코스, 옥시다제 및 리파제를 사용하여 무수 결정질 제제가 대응하는 비결정질 제제보다 상당히 더 안정할 수 있다는 것을 입증하였다[Shenoy, B. et al., Biotechnol Bioeng. 73 (5): 358-69 (2001)]. 놀랍게도, 본 발명은 가용성 항체 또는 항체 단편 대응부보다 더욱 안정한 전항체의 결정과 1본쇄 Fv(scFv) 항체 단편 또는 Fab("ab"는 "항원 결합"을 나타낸다) 항체 단편의 결정을 제공한다.
최근에 단백질 기술이 대체적으로 진보되었음에도 불구하고, 산업 및 의약 부문에서 생물학적 고분자 사용을 제한하는 2가지 문제가 지속되고 있다. 첫번째 문제는 제조 및 저장 과정에서 일어나는 화학적 및 물리적 변성에 대한 3차 이상의 고차 구조물의 분자 안정성 및 감수성과 관련된 것이다. 두번 째 문제는, 치료 단백질의 생물학적 전달 분야에서는 특정 환자의 요구와 질병 진행에 부합하는 속도로 천연 단백질(예, 전항체)을 방출하는 비히클이 제공되어야 한다는 것이다.
전항체의 결정화가 지난 30년간 중요한 관심의 대상이었음에도 불구하고, 구조 연구 하에서라도 전항체가 결정화된 것은 거의 없었다[Harris L. J., Skaletsky, E., and McPherson, A., J. Mol. Biol. 275: 861-72 (1998); Harris L. J., Larson, S. B., Skaletsky, E., and McPherson, A., Immunological Reviews 163: 35-43 (1998)]. 이들 모든 결정은 구조 분석을 위해 소량의 결정만을 산출하는 증기 확산 기법으로 얻었다. 이러한 방법으로 인한 수율은 약학용, 진단용 또는기타 상업용으로 필요한 수율에 휠씬 못 미친다. 또한, 이렇게 수율이 낮은 원인은 주로 항체의 크기가 비교적 크고, 그 표면에 올리고당이 존재하며, 고도의 분절 가요성(segmental flexibility)이 있어 항체 결정화가 어렵기 때문이다.
Fab 항체 단편은 결정화되었지만, X-선 결정 구조 연구에만 사용되어 왔다[예컨대, Ito et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57: 1700-02 (2001); Covaceuszach et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57: 1307-09 (2001); Saul et al., Bioorg. Khim. 25: 247-52 (1999); Pichla et al., J. Struct. Biol. 119: 6-16 (1997); Maninder et al., J. Mol. Biol. 242: 706-08 (1994) 참고].
다음 표는 X-선 결정 구조 연구용 결정화와 본 발명에 따른 대규모 결정화를 일반적으로 비교한 것이다.
매개변수 X-선 결정 연구 대규모 결정화
결정 크기(최장 치수) > 500 ㎛ 0.1∼100 ㎛
결정 품질 매우 중요함 덜 중요함
성장 속도 중요하지 않음 중요함
수율 중요하지 않음 매우 중요함
침전물 일반적으로 존재함 거의 존재하지 않음
치료 항체를 전달하는 대체 경로를 생성 가능하게 하는 공정인 전항체 또는 이의 단편의 대규모 결정화 공정에 관하여는 이전에는 연구된 바가 없었다.
항체와 이의 단편은 약학, 진단 및 조사 분야에서 그 사용이 증가되고 있다. 신속하고 저렴한 대안적인 안정화 방법이 상당히 필요한 실정이다. 또한, 전항체의 기능을 저해할 수 있는 부형제의 과도한 사용을 포함하지 않는 안정화 방법이 필요하다.
본 발명은 대규모로 전항체 및 이의 단편을 결정화하는 방법을 제공하여 치료 및 기타 생물의학 용도로 항체를 널리 사용하는 데에 대한 장애를 극복하고자 하는 것이다.
본 출원은 그 전문을 참고로 인용한, 2000년 12월 28일에 출원된 미국 가명세서 출원 제60/258,704호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 전항체(whole antibody) 및 이의 단편의 결정과, 이러한 결정을 포함하는 제제 및 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 대규모 회분식으로 전항체 및 이의 단편을 고 농도로 결정화시키는 방법과, 단독으로 사용하거나 또는 무수형 또는 슬러리형 제제나 조성물로 사용하기 위한 안정화된 전항체 결정을 제조하는 방법이 제공된다. 또한 본 발명은 생물학적으로 활성인 전항체 결정의 안정화, 저장 및 전달 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전항체 결정, 항체 단편 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 조성물 또는 제제를 인간과 동물에게 생물학적으로 전달하는 것을 비롯하여 생물의학 용도로 사용하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 고도로 농축된 전항체 또는 항체 단편 결정 제제 또는 조성물은 다량의 항체를, 필요한 시기 및 장소에, 그 용적을 작게 하여 개체에게 전달하는 데 유용하다. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, 전항체 결정 또는 항체 단편 결정은, 필요한 장소와 시기에 따라,개체에서 활성 전항체 또는 이의 단편을 서서히 방출할 수 있는 무담체(carrier-free) 전달 시스템으로서 사용된다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 전항체 결정 또는 항체 단편 결정, 또는 이의 결정 제제는 조성물을 형성하기 위해 중합체 담체를 포함하는 매트릭스 내에서 캡슐화된다.
또한, 약학 성분 또는 부형제를 사용하여 전항체 결정 또는 항체 단편 결정의 안정화된 제제를 제조하고, 필요에 따라 조성물을 형성하기 위해서 중합체 담체 중에서 결정 또는 결정 제제를 캡슐화하는 방법과, 치료용 단백질 및 백신의 투여를 비롯하여 생물의학 용도로 이러한 결정을 사용하는 방법이 제공된다.
도 1은 실시예 6에 개시된 바와 같이 제조된 리턱시맵(Rituximab)(RituxanTM) 결정의 형태를 도시한다. 리턱시맵 결정은 침상 클러스터로 형성된다.
도 2는 실시예 34에 개시된 바와 같이 제조된 인플릭시맵(Infliximab)(RemicadeTM) 결정의 형태를 도시한다. 인플릭시맵 결정은 막대형 클러스터로 형성된다.
도 3은 실시예 28에 개시된 바와 같이 제조된 리턱시맵(RituxanTM) 결정의 형태를 도시한다. 리턱시맵은 입방체형 결정으로 형성된다.
도 4는 실시예 26에 개시된 바와 같이 제조된 리턱시맵(RituxanTM) 결정의 형태를 도시한다. 리턱시맵은 작은 침상형 결정으로 형성된다.
도 5는 실시예 31에 개시된 바와 같이 제조된 트라스투즈맵(Trastuzumab)(HerceptinTM) 결정의 형태를 도시한다. 트라스투즈맵은 단(短) 침상 결정으로 형성된다.
도 6은 실시예 32에 개시된 바와 같이 제조된 트라스투즈맵(HerceptinTM) 결정의 형태를 도시한다. 트라스투즈맵은 장(長) 침상 결정으로 형성된다.
도 7은 실시예 37에 개시된 바와 같이 제조된 인플릭시맵(RemicadeTM) 결정의 형태를 도시한다. 트라스투즈맵은 성상형 결정으로 형성된다.
도 8은 결정화된 리턱시맵이 RAJI 림프종 세포주에 대한 직접적인 세포독성 반응을 유도할 수 있음을 도시한다. 실시예 55 참조.
도 9는 결정화된 리턱시맵이 RAJI 림프종 세포에 대한 보체 의존성 세포독성 반응을 유도할 수 있음을 도시한다. 실시예 56 참조.
도 10은 PEG, 에탄올 또는 PEG와 에탄올의 혼합물의 존재 하에 결정질 리턱시맵의 안정성을 분석한 결과를 도시하는 플롯이다. 실시예 68 참조.
도 11은 PEG, 에탄올 또는 PEG와 에탄올의 혼합물의 존재 하에 결정질 트라스투즈맵(HerceptinTM)의 안정성을 분석한 결과를 도시하는 플롯이다. 실시예 69 참조.
도 12는 용해 전에 1 개월간 실온에서 저장한 리턱시맵 결정(실시예 1에서 제조)을 용해시켜 얻은 리턱시맵 전항체에 대한 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 실시예 64 참조.
도 13은 결정질 트라스투즈맵(HerceptinTM)을 아세톤으로 3시간 처리한 결과를 도시하는 크로마토그램이다. 트라스투즈맵은 전항체였으며 그 구조를 유지하였다. 실시예 65 참조.
도 14는 천연(가용성) 트라스투즈맵(HerceptinTM)을 아세톤으로 20분 처리한 결과를 도시하는 크로마토그램이다. 아세톤 처리 후에 천연/가용성 트라스투즈맵이 침전되었으며, 이는 천연 트라스투즈맵의 구조적 완전성(structural integrity)이 상실되었음을 의미한다. 실시예 65 참조.
도 15는 트라스투즈맵을 정맥내 투여했을 때(i.v.) 결정질 트라스투즈맵의 혈중 생체이용율을, 트라스투즈맵을 피하(s.c.) 주사한 경우 혈중 생체이용율과 비교한 플롯이다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 더욱 완전하게 이해하기 위해서, 하기에 상세한 설명을 개시한다. 설명 중에 다음과 같은 용어가 사용된다.
전항체 또는 항체 단편
본 발명에 따른 전항체 또는 항체 단편, 예컨대 1본쇄 Fv 단편 또는 Fab 항체 단편은 작용성 항체 또는 항체 단편이다. 즉, 시험관내 또는 생체내에서 특이적 항원을 인식하여 결합할 수 있고 항체 결합과 관련된 임의의 후속 작용, 예컨대 직접 세포독성, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 개시할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 말한다.
비결정질 고체
때로는 "비결정질 침전물"이라고도 불리우는 단백질의 비결정질 고체 형태로서, 결정질 고체 상태의 분자 격자 구조 특성을 갖지 않는 고체 형태이다.
항체
척추동물 면역계의 체액성 부분이 체내에서의 외래 분자의 존재에 대해 반응하여 생성하는 MW 약 150 kD의 당단백질을 말한다. 항체는 미생물, 예컨대 기생체, 박테리아 및 바이러스에 의한 감염을 예방 및 제거하는 데 필수적이다. 항체는, 항원(또는 에피토프)이라 불리우는 단백질(또는 때로는 다당류, 당단백질, 지질 또는 핵산을 비롯한 다른 유기 분자) 구조, 예컨대 침입성 미생물 및 이의 생성물 상에 있는 것을 고도의 특이적인 방식으로 인식하여 결합함으로써 이러한 기능을 수행한다. 항체는, 항체 상의 항원 결합 부위라고 불리우는 초가변 영역과 이의 에피토프 사이의 고도의 특이적 상호작용을 통해 표적 항원에 결합한다. 항체가 항원에 결합하면, 감염성 미생물 또는 기타 항원을 함유하는 실체, 예컨대 암세포를 무력화, 파괴 및 제거하는 면역계의 여러 효과기 시스템 중 1 이상을 활성화시킨다.
또한 항체는 질병 상태와 연루된 세포성 표적에의 특이적 결합과 그 후의 무력화에 의해 암, 염증, 심혈관 질병 및 이식 거부반응을 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 모노클로날 항체인 인플릭시맵은 종양 괴사 인자에 결합하여 세포 표면 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 염증과 연루된 이의 역할을 무력화하는 반면, 리턱시맵은 세포 표면 CD20 항원에 결합하여 악성 B 림프구를 표적화한다.
단일 항체 분자는 서로 공유 결합된 2개의 동일한 중쇄(각각은 MW 약 50 kD)와 각각이 하나의 중쇄에 공유 결합된 2개의 동일한 경쇄(각각은 MW 약 25 kD)로 구성된 구조를 갖는다. 4개의 쇄는 고전적인 "Y" 모티프로 배열된다. "Y"의 하부 "다리(leg)"를 Fc 영역("c"는 "결정화가능함(crystallizable)" 또는 "보체결합(complement-binding)"을 의미함)이라고 하고, 세포막 내에 항체를 고정하는 데 사용되며, 또한 대식세포를 결합시키고 보체를 활성화시키는 데 사용된다. "Y"의 상부의 "팔"은 Fab 영역("ab"는 "항원 결합"을 의미함)이라 부른다. 각 Fab 영역은 (Fab와 Fc 영역의 이음부에서) 불변 영역과 ("Y"의 선단으로 연장되는) 가변 영역을 포함한다. 각각의 가변 영역은 "Y"의 각 선단에서 ("초가변" 영역으로 불리우는 가변 영역 내의 영역에서) 동일한 항원 결합 부위들을 포함한다. 따라서, 각 Fab 영역은 1개의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 완전한 항체 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다(즉, "2가"임). 자연 발생 항체 상의 2개의 항원 결합 부위는 서로 동일하므로, 항체는 1개의 항원에 대해 특이적이다(즉, "1가"임). 지금까지 항체 분자의 분자 단편이 많이 분리되어 왔다. 이들은 자연적으로 생기지 않지만, 1 이상의 완전 항체 분자로부터 조작된다. 이들 단편은 Fab 단편(효소 파페인으로 분해하여 완전한 항체로부터 분리된 단일 Fab)과 F(ab')2단편(효소 펩신으로 항체를 분해하여 생성된 서로 공유 결합된 2개의 Fab)을 포함한다. Fab 단편은 단일특이성을 나타내는 반면, F(ab')2단편은 이중특이성을 나타낸다. 최근에, 다수의 조작된 항체 단편이 도입되었다. 이들의 예로는 2본쇄 Fv(dsFv) 단편과 1본쇄 Fv(scFv) 단편 등이 있다(각각의 경우에 "v"는 "가변성"을 의미한다). dsFv 단편은 Fab 단편에서 불변 영역을 제외한 것으로서, 다시 말하면 서로 공유 결합된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역만으로 구성된 것이다. scFv 단편은 펩티드 링커를 통하여 경쇄의 가변 영역에 결합된 중쇄의 가변 영역로 구성된 1본쇄 폴리펩티드이다.고전적으로, dsFv 및 scFv 단편은 1가이다(따라서 단일 특이적(monospecific)이다). 그러나, 2개의 dsFv 단편 또는 2개의 scFv 단편은 그 자체가 결합되어 이중특이적 단편(불변 영역을 포함하지 않고 F(ab')2단편과 유사함)을 형성할 수 있다. 또한, 상이한 항원 결합 부위(즉, 상이한 특이성)를 갖는 2개의 dsFv 단편 또는 scFv 단편을 연결시켜 이중 특이적(bispecific) 단편을 형성할 수 있다. 이러한 단편은 조사 도구로서 또는 치료 또는 진단 시약으로서 사용될 수 있다.
인간의 (면역글로불린이라고도 불리우는) 항체는 5개의 클래스, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE가 있으며, 각각은 고유의 특성과 기능을 갖는다. IgG, IgD, 및 IgE는 모두 1개의 항체 분자로 구성되지만, IgA는 1, 2 또는 3개의 분자로 구성될 수 있으며, IgM은 5개의 분자로 구성된다. 또한, 인간에게는 IgG의 4가지 하위클래스(IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)와 IgM 및 IgA의 각각에 대해 2개의 서브클래스(각각 1 및 2)가 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체인 리턱시맵(RituxanTM)은 IgG1 항체이다.
자연 발생적 항체가 단일 종에서 유래된 것일지라도, 조작된 항체 및 항체 단편은 1 이상의 동물 종으로부터 유래된 것, 즉 키메라일 수 있다. 현재까지, 마우스(쥐)/인간 키메라 항체가 제조되었지만, 기타 종의 조합도 가능하다. 키메라 항체는 2가지 아형, 즉 키메라 항체와 인간화된 항체로 추가 분류된다. 키메라 쥐/인간 항체는 각각 대략적으로 75%의 인간 및 25%의 마우스 아미노산 서열을 포함한다. 인간 서열은 항체의 불변 영역을 제공하고 마우스 서열은 항체의 가변 영역(따라서 항원 결합 부위를 포함함)를 제공한다. 이러한 키메라를 사용하는 이유는 마우스 항체의 항원 특이성을 보유하지만 마우스 항체의 면역원성(쥐 항체는 마우스 이외의 종에서 항체에 대한 면역 반응을 유발함)을 감소시켜 인간 치료법에 키메라를 사용할 수 있기 때문이다. 키메라 항체로는 상이한 인간 항체로부터 유래한 CDR 영역을 포함하는 것 등이 있다. 초가변 영역라고도 불리우는 CDR 영역은 항원 결합 부위를 형성하는 항체 분자의 가변 영역 내의 서열이다. CDR 영역이라는 이름은, 그 결합 부위가 항원 상에서 인식되는 에피토프에 대해 형상 및 전하 분포가 상보적이기 때문에 붙여진 것이다.
대안적으로, 키메라 항체는 1개의 항체로부터 유래한 프레임워크 영역과 또 다른 항체로부터 유래한 CDR 영역을 포함한다. 키메라 항체로는, 또한 2 이상의 상이한 인간 항체로부터 유래한 CDR 영역을 포함하는 것들이 있다. 인간화된 항체는 약 90%(또는 그 이상)의 인간 아미노산 서열을 포함한다. 제공되는 유일한 쥐 서열은 초가변 영역(가변 영역 내에 포함되는 실제 항원 결합 부위)에 대한 서열이다. 인간화된 항체는 키메라 항체와 비교하여 최소한의 마우스 면역원성을 갖는다.
특이성으로 구별할 수 있는 항체에는 일반적으로 2가지 유형, 즉 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 있다. 폴리클로날 항체는 혈액 중 면역글로불린 분획으로서 발견되는 것이며, 실질적으로 개체가 노출된 상이한 항원에 대해 특이적인 여러가지 상이한 종류의 항체의 폴리클론 혼합물이다(즉, 폴리클로날 항체는 항체를 생산하는 세포인 B 림프구(또는 B 세포)의 여러가지 상이한 클론에서 유래한다).
모노클로날 항체는 단일 특이성을 갖는 항체이다. 즉 B 림프구(B 세포)의 단일 클론에서 유래된다. 이들 항체는 표적 항원에 대해 탁월한 특이성을 가지며, 다량(즉, 고 역가)으로 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 특정 항원(예, 암 항원)에 대한 마커로서, 진단제(예컨대 HIV-1과 같은 바이러스 검출 분석에서의 진단제)로서, 그리고 치료제로서 유용하다. 모노클론 전항체는 2개의 완전 중쇄와 2개의 완전 경쇄를 포함하는 고전적인 분자 구조를 갖는 것들이다. 이것은 Fab, F(ab')2, Fc 단편, dsFv 단편, 및 scFv 단편과 같은 항체 단편과 구별된다.
전통적으로, 불사의 하이브리도마 세포와 항체 생산 B 세포를 융합시켜 세포 배양물 중에 모노클로날 항체를 연속 생산하는 B 세포 하이브리도마를 형성함으로써 모노클로날 항체를 생성한다. 모노클로날 항체를 형성하기 위해서 전통적으로 이용되는 또 다른 방법은 파지 디스플레이 기법을 이용하여 박테리아 세포 배양물 중에서 모노클로날 항체를 발현하는 것을 포함한다. 그러나, 현재 모노클로날 항체는 유전자 변형 동물, 예컨대 소 및 염소(겐자임 트랜스제닉스), 돼지 및 토끼(메다렉스, PPL 테라퓨틱스)와, 닭(트랜제노겐), 그리고 식물, 예컨대 담배 및 옥수수(에피사이트, 인테그레이티드 프로테인 테크놀로지, 메리스템 크롭테크 등)에서 다량으로 생체내에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형 염소(겐자임 트랜스제닉)의 젖에서 다량의 모노클로날 항체가 발견될 수 있다. 모든 공급원으로부터 얻은 항체를 본 발명에 따라 결정화할 수 있다. 또한, 유전자이식으로 마우스가 (인간 항체를 암호화하는) 완전한 인간 B 세포 게놈을 포함하여 발현하도록 마우스를 변형시켰다. 따라서, 이러한 트랜스게닉 마우스(아브게닉스)는 본 발명에 따른 결정화용 인간 항체의 공급원이다. 글리코실화는 항체를 생산하는 동물에 특이적인 것임을 알아야 한다. 예를 들어, 인간 이외의 공급원으로부터 얻은 인간 항체는 글리코실화 프로필에 미묘한 차이를 나타낼 것이다. 따라서, 본 발명의 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편은 변형된 글리코실화를 나타내거나 또는 탈글리코실화될 수 있다. 본 발명에 따라 결정화될 수 있는 항체는 유도체화된 항체를 포함한다. 이러한 항체로는 폴리에틸렌 글리콜 또는 1 이상의 탄수화물 부분 또는 1 이상의 메틸 또는 에틸기로 유도체화된 것 등이 있다. 임상적 관련 항체는, 이들 항체가 사용되는 치료 분야에 따라서 분류될 수도 있다. 이러한 항체로는, 예컨대 암(예, 췌장암), 염증 질병(예, 자가면역 질병, 관절염), 심혈관 질병(예, 발작), 감염성 질병(예, HIV/AIDS), 호흡계 질병(예, 천식), 조직 이식 거부반응 및 기관 이식 거부반응 치료용 항체 등이 있다. 이러한 항체는 방사성면역요법용 항체도 포함한다. 본 발명에 따라 결정화될 수 있는 항체의 예로는 앱사익시맵(Abciximab), 팔리비즈맵(Palivizumab), 뮤루모냅(Muromonab)-CD3, 겜트즈맵(Gemtuzumab), 트라스투즈맵, 바실릭시맵(Basiliximab), 다클리즈맵(Daclizumab), 에타네르셉트(Etanercept) 및 이브리투모맵 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan) 등이 있다.
항체 활성 방출 속도
단위 시간당 용해되는 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 양을 의미한다.
항원
항체가 특이적으로 인식하여 결합하는 임의의 실체 또는 물질을 의미한다. 항원은 통상적으로 세포 또는 침입성 미생물의 표면 상에서 발견되는 작은 조각의 단백질(펩티드)이다. 항체는 4 아미노산 길이의 작은 항원을 특이적으로 인식하는 것으로 생각되며, 아미노산 1개만 치환되어도 특이적인 특정 항원을 항체가 인식하지 못하게 될 수 있다.
항원성
항체가 특이적으로 인식하여 결합하고자 하는 항원의 능력을 의미한다. 항원에 특이적인 항체가 항원을 특이적으로 인식하여 결합할 때 그 항원 구조의 항원을 말한다. 항원성은, 항원에 특이적인 항체 생산을 유발하는 항원의 능력을 나타내는 면역원성과는 다르다.
항-이디오타입 항체
다른 항체 분자의 항원 결합 부위에 특이적인 항체를 의미한다. 항-이디오타입 항체는 다음과 같은 방법으로 제조된다: 항원이 이에 대해 특이적인 항체(Ab-1 또는 이디오타입)의 생성을 유발한다. 그 다음 이들 항체(이디오타입)를 면역원으로서 사용하여 Ab-1에 대해 특이적인 항체의 2차 생성을 유발한다. 이들 2차 생성 항체(Ab-2)를 항-이디오타입 항체(또는 항-이디오타입)라고 부르며, 이는 Ab-1을 생성하는 데 사용된 초기 항원의 모의체이거나 또는 이와 밀접하게 관련되어 있다. 이러한 반응은 항원 자극에 반응하여 항체-항체 상호작용에 의해 생체내에서 자연적으로 일어나며, 면역계는 본질적으로 그 자체와 상호작용할 수 있다. 이러한 능력을 이용하여, 특정 감염을 예방하고 몇몇 종류의 암과 각종 면역 및 자가면역 질병을 치료하는 데 항-이디오타입 항체를 사용할 수 있을 것으로 간주되고 있다.
항체 반감기
생체내에서, 소정량의 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편이 초기 농도의 50%로 감소되는 데 필요한 시간을 의미한다. IgG는 통상적으로 반감기가 약 21일이고(IgG3의 반감기는 7일에 불과함), IgM, A, D, 및 E의 통상적인 반감기는 각각 10일, 6일, 3일 및 2일이다.
항체 적재량
무수 제제의 중량을 기준으로 하여 항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 중량%로 계산시 제제 또는 조성물 중의 항체 함량을 의미한다. 통상적인 항체 적재량 범위는 1∼80%이다.
항체 방출
하기 (1) 내지 (5)의 인자 중 어느 하나에 의해 조절될 때, 중합체 담체로부터의 활성 단백질의 방출: (1) 중합체 매트릭스의 분해; (2) 중합체 매트릭스 내의 결정 용해 속도; (3) 중합체 매트릭스를 통한 용해된 단백질의 확산; (4) 단백질 적재량; 및 (5) 항체 결정/중합체 매트릭스 내로의 생물학적 매질의 확산.
수성-유기 용매 혼합물
n% 유기 용매[이 때 n은 1∼99임]와 m% 수성 용매[이 때 m은 100-n임]를 포함하는 혼합물.
생체이용율
물질, 예컨대 활성 항체 또는 항체 단편이 표적화되는 조직에서 생체내 투여된 상기 물질이 이용되는 정도를 의미한다. 본 발명에 따르면, 생체이용율은 또한 생체 내에서 결정 또는 이의 조성물 또는 제제로서 투여되는 전항체 또는 이의 단편이 혈액에서 이용가능하게 되는 정도를 의미한다. 본 발명에 따르면, 생체이용율은 또한 물질(예, 활성 항체 또는 항체 단편)이 전달된 표적 조직에서 상기 물질이 기능(예, 직접 세포독성)을 수행하는 능력을 의미한다. 생체이용율은 각종 방법, 예컨대 혈류 중 시간의 함수로서 측정되는 물질(예, 활성 항체 또는 항체 단편)의 농도로서 측정될 수 있다.
생체적합성 중합체
비항원성(보조제로서 사용되지 않는 경우), 비발암성, 비독성이고, 다른 경우에는 생유기체와 고유의 비적합성을 나타내지 않는 중합체이다. 그 예로는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩티드), 폴리(에스테르), 예컨대 폴리(락트산), 즉 PLA, 폴리(락트산-코-글리콜산), 즉 PLGA, 폴리(β-히드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤) 및 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리((히드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루론산 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로즈 및 셀룰로즈 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고당류, 글리카미노글리칸, 황산화된 다당류, 이의 배합물 또는 공중합체.
생분해성 중합체
가수분해 또는 가용화에 의해 분해되는 중합체. 분해는 입자 표면에서 주로 발생하는 불균질성이거나 또는 중합체 매트릭스를 통해 고르게 분해되는 균질성일 수 있다.
생물학적 고분자
단백질, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)과 같은 생물학적 중합체. 본 출원에서, 생물학적 거대 분자를 고분자로서 언급하기도 한다.
조성물
전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이의 제제로서, 중합체 담체 내로 캡슐화되어 코팅된 입자를 형성한다.
제어형 용해
전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정의 표면적; 상기 결정의 크기; 상기 결정의 형상; 제제 또는 조성물 중 부형제 성분의 농도; 제제 또는 조성물 중 부형제 성분의 수와 특성; 제제 또는 조성물 중 부형제 성분의 분자량; 중합체 담체의 특성, 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 인자에 의해 제어되는, 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정들을 포함하는 제제 또는 조성물의 용해나, 또는 상기 결정 또는 제제 또는 조성물의 결정질 구성성분의 방출.
공중합체
1 이상의 단량체 종으로 구성된 중합체
결정
결정이란 물질의 고체 상태의 한 형태로서, 비조직형의 불균질한 고체로서 주로 존재하는 제2의 형태(비결정질 고체 상태)와 구별된다. 결정은 원자, 이온, 분자(예, 항체와 같은 단백질) 또는 분자 조합체(예, 항원/항체 복합체)의 규칙적인 입체 배열이다. 결정은, 명확히 구분되는 대칭축을 따라 3차원으로 반복되는 단위 셀로 배열되는 (결정화하고자 하는 물질로 구성된) 비대칭 단위라고 불리우는 빌딩 블록의 격자 배열이다. Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ed., pp. 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999) 참조.
결정의 용해
항체 또는 항체 단편을 가용성 항체 또는 항체 단편으로 회복시키기 위해서 전항체 또는 이의 단편의 결정을 용해시키는 것을 말한다.
전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정 건조
N2, 공기 또는 불활성 기체를 이용한 건조, 진공 오븐 건조, 동결건조, 휘발성 유기 용매를 이용한 세척 후 용매의 증발, 가스 후드에서의 증발, 트레이 건조, 유체상 건조, 분무 건조, 진공 건조 또는 롤러 건조 등의 수단으로 물, 유기 용매 또는 액상 중합체를 제거하는 것. 통상적으로, 결정이 자유 유동하는 분말이 되면 건조가 달성된다. 기체 스트림을 젖은 결정 위로 통과시켜 건조시킬 수 있다. 질소, 아르곤, 헬륨, 이산화탄소, 공기 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 기체를 선택할 수 있다.
유효량
본 발명의 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 결정 제제 또는 조성물이 일정 시간 동안 투여되는 검체 또는 부위를 치료, 면역화, 추가 자극, 보호, 수복 또는 해독하는 데 효과적인 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 본 발명의 결정 제제 또는 조성물의 양.
유화제
중합체 코팅된 결정과 용액 간의 계면 장력을 낮추는 표면 활성제.
제제
당 및 생체적합성 중합체를 비롯한 1 이상의 성분 또는 부형제와, 전항체의 결정과의 조합물, 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정과의 조합물. 부형제의 예는 미국 약학 협회와 영국 약학회가 공동 출판한 Handbook of Pharmaceutical Excipients에 개시되어 있다. 본 출원에서, "제제"은 "결정 제제"을 포함한다. 또한, "제제"은 "전항체 결정 제제"과 "1본쇄 Fv 항체 단편 결정 제제" 및 "Fab 항체 결정 제제"을 포함한다.
당단백질
탄수화물에 공유 결합된 단백질 또는 펩티드. 탄수화물은 단량체이거나, 또는 올리고당류로 구성될 수 있다.
단독중합체
단일의 단량체 종으로 만들어진 중합체.
면역치료제
항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편이 종양 세포, 바이러스 또는 박테리아에 대한 보호성 면역을 유도하거나 또는 종양 세포, 바이러스 또는 박테리아를 감소 또는 제거하는 면역계를 자극하는 활성을 갖는 경우, 이를 면역치료제라고 한다.
성분
약학 성분 또는 부형제를 비롯한 임의의 부형제(들).
부형제의 예로는 다음과 같은 것들이 있다:
산성화제
아세트산, 빙초산, 시트르산, 푸마르산, 염산, 묽은 염산, 말산, 질산, 인산, 묽은 인산, 황산, 타르타르산
에어로졸 압축 불활성 가스(Aeroosol propellants)
부탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이소부탄, 프로판, 트리클로로모노플루오로메탄
공기 대용물
이산화탄소, 질소
알코올 변성제
데나토늄 벤조에이트, 메틸 이소부틸 케톤, 수크로즈 옥트아세테이트
알칼리화제
진한 암모니아 용액, 탄산암모늄, 디에탄올아민, 디이소프로판올아민, 수산화칼륨, 중탄산나트륨, 붕산나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 트롤라민
균열방지제
(활주제(glidant) 부분 참조)
소포제
디메티콘, 시메티콘
항균성 보존제
염화벤즈알코늄, 염화벤즈알코늄 용액, 염화벤젤토늄, 벤조산, 벤질 알코올, 부틸파라벤, 염화세틸피리디늄, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 크레졸, 데히드로아세트산, 에틸파라벤, 메틸파라벤, 메틸파라벤 나트륨, 페놀, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐르산 아세테이트, 페닐머큐르산 니트레이트, 벤조산칼륨, 소르브산칼륨, 프로필파라벤, 프로필파라벤 나트륨, 벤조산나트륨, 데히드로아세트산나트륨, 프로피온산나트륨, 소르브산, 티메로살, 티몰
산화방지제
아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 포름알데히드 설폭실레이트, 나트륨 메타비설피트, 나트륨 티오설페이트, 이산화황, 토코페롤, 토코페롤 부형제
완충제
아세트산, 탄산암모늄, 인산암모늄, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산, 시트르산칼륨, 메타인산칼륨, 1가염기성 인산칼륨, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 락트산나트륨 용액, 이가염기성 인산나트륨, 1가염기성 인산나트륨, 히스티딘
캡슐 윤활제
(정제 및 캡슐 윤활제 부분 참조)
킬레이트화제
에데테이트산 2나트륨, 에틸렌디아민테트라아세트산 및 염, 에데트산
코팅제
나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 에틸셀룰로즈, 젤라틴, 약학적 글레이즈, 히드록시프로필 셀룰로즈, 히드록시프로필 메틸셀룰로즈, 히드록시프로필 메틸셀룰로즈 프탈레이트, 메타크릴산 공중합체, 메틸셀룰로즈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 쉘락, 수크로즈, 이산화티탄, 카나우바 왁스, 미정질 왁스, 제인
착색제
카라멜, 적색, 황색, 흑색 또는 배합물, 산화제2철
착화제
에틸렌디아민테트라아세트산 및 염(EDTA), 에데트산, 젠티스산 에탄올아미드, 옥시퀴놀린 설페이트
건조제
염화칼슘, 황산칼슘, 이산화규소
유화제 및/또는 용해제
아카시아, 콜레스테롤, 디에탄올아민(보조약), 글리세릴 모노스테아레이트,라놀린 알코올, 레시틴, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 모노에탄올아민(보조약), 올레산(보조약), 올레일 알코올(안정화제), 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥실 35 피마자유, 폴리옥실 40 경화 피마자유, 폴리옥실 10 올레일 에테르, 폴리옥실 20 세토스테아릴 에테르, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 프로필렌 글리콜 디아세테이트, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 스테아르산, 트롤아민, 유화 왁스
여과 조제
분말형 셀룰로즈, 정제형 규조토.
풍미제 및 향료
아네톨, 벤즈알데히드, 에틸 바닐린, 멘톨, 메틸 살리실레이트, 글루탐산1나트륨, 오렌지 플라워 오일, 페퍼민트, 페퍼민트 오일, 페퍼민트 에센스(spirit), 장미유, 농축 장미수, 티몰, 톨루 발삼 팅크제, 바닐라, 바닐라 팅크제, 바닐린
활주제 및/또는 균열방지제
규산칼슘, 규산마그네슘, 콜로이드 이산화규소, 탈크
습윤제
글리세린, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 소르비톨
연고 기제
라놀린, 무수 라놀린, 친수성 연고, 백색 연고, 황색 연고, 폴리에틸렌 글리콜 연고, 바셀린, 친수성 바셀린, 백색 바셀린, 장미수 연고, 스쿠알렌
가소제
피마자유, 라놀린, 광유, 바셀린, 벤질 벤질 포르메이트, 클로로부탄올, 디에틸 프탈레이트, 소르비톨, 디아세틸화된 모노글리세라이드, 디에틸 프탈레이트, 글리세린, 글리세롤, 모노- 및 디-아세틸화된 모노글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리아세틴, 트리에틸 시트레이트, 에탄올
중합체 막
셀룰로즈 아세테이트
용매
아세톤, 알코올, 희석 알코올, 아밀렌 수화물, 벤질 벤조에이트, 부틸 알코올, 4염화탄소, 클로로포름, 옥수수유, 면실유, 에틸 아세테이트, 글리세린, 헥실렌 글리콜, 이소프로필 알코올, 메틸 알코올, 메틸렌 클로라이드, 메틸 이소부틸 케톤, 광유, 피넛유, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 카보네이트, 프로필렌 글리콜, 참기름, 주사용 물, 주사용 멸균수, 관주용 멸균수, 정제수
흡착제
분말형 셀룰로즈, 활성탄, 정제된 규조토
이산화탄소 흡착제
수산화바륨 석회, 소다 석회
강화제
경화 피마자유, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 세틸 에스테르 왁스, 경질 지방, 파라핀, 폴리에틸렌 부형제, 스테아릴 알코올, 유화 왁스, 백색 왁스, 황색 왁스
보충 기제
코코아 버터, 경질 지방, 폴리에틸렌 글리콜
현탁제 및/또는 점도 증진제
아카시아, 아가, 알긴산, 알루미늄 모노스테아레이트, 벤토나이트, 정제 벤토나이트, 마그마 벤토나이트, 카르보머 934p, 카르복시메틸셀룰로즈 칼슘, 카르복시메틸셀룰로즈 나트륨, 카르복시메틸셀룰로즈 나트륨 12, 카라기난, 미세결정질 및 카르복시메틸셀룰로즈 나트륨 셀룰로즈, 덱스트린, 젤라틴, 구아검, 히드록시에틸 셀룰로즈, 히드록시프로필 셀룰로즈, 히드록시프로필 메틸셀룰로즈, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 메틸셀룰로즈, 펙틴, 산화폴리에틸렌, 폴리비닐 알코올, 포비돈, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 이산화실리콘, 콜로이드성 이산화실리콘, 나트륨 알기네이트, 트라가칸트, 잔탄 검.
감미제
아스파탐, 덱스트레이트, 덱스트로즈, 덱스트로즈 첨가제, 푸라노즈, 만니톨, 사카린, 칼슘 사카린, 나트륨 사카린, 소르비톨, 소르비톨 용액, 수크로즈, 압착 설탕, 제과용 설탕, 시럽.
정제 결합제
아카시아, 알긴산, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 미세결정질 셀룰로즈, 덱스트린, 에틸셀룰로즈, 젤라틴, 액상 글루코즈, 구아 검, 히드록시프로필 메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 산화폴리에틸렌, 포비돈, 예비 겔화 전분, 시럽.
정제 및/또는 캡슐 희석제
탄산칼슘, 이염기성 칼슘 포스페이트, 삼염기성 칼슘 포스페이트, 황산 칼슘, 미세결정질 셀룰로즈, 분말형 셀룰로즈, 덱스트레이트, 덱스트린, 덱스트로즈 첨가제, 프럭토즈, 카올린, 락토즈, 만니톨, 소르비톨, 전분, 예비 겔화된 전분, 수크로즈, 압착 설탕, 제과용 설탕.
정제 붕괴제
알긴산, 미세결정질 셀룰로즈, 크로스카멜로즈 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 전분, 예비 겔화된 전분.
정제 및/또는 캡슐 윤활제
칼슘 스테아레이트, 글리세릴 베헤네이트, 마그네슘 스테아레이트, 경질 미네랄 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 스테아르산, 정제 스테아르산, 활석, 경화 식물성 오일, 아연 스테아레이트.
강장제(Tonicity agent)
덱스트로즈, 글리세린, 만니톨, 염화칼륨, 염화나트륨.
비히클 : 풍미 비히클 및/또는 감미 비히클
방향성 엘릭시르, 화합 벤즈알데히드 엘릭시르, 이소-알코올 엘릭시르, 페퍼민트 수, 소르비톨 용액, 시럽, 톨루 발삼 시럽.
비히클 : 유질 비히클
아몬드 오일, 옥수수유, 면실유, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 광유, 경질 광유, 미리스틸 알코올, 옥틸도데칸올, 올리브유, 피넛유, 감유, 참기름, 대두유, 스쿠알렌.
비히클 : 고형 담체
구형 설탕.
비히클 : 살균 비히클
주사용 정균수, 주사용 정균 염화나트륨.
점성-증진제
상기 현탁제 참조.
발수제
시클로메티콘, 디메티콘, 시메티콘.
습윤제 및/또는 용해제
염화벤즈알코늄, 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 도큐세이트 나트륨, 노녹시놀 9, 노녹시놀 10, 옥톡시놀 9, 폴록사머, 폴리옥실 35, 피마자유, 폴리옥실 40, 경화 피마자유, 폴리옥실 50 스테아레이트, 폴리옥실 10 올레일 에테르, 폴리옥실 20, 세토스테아릴 에테르, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 나트륨 라우릴 설페이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 틸록사폴.
바람직한 성분 또는 첨가제로서는 다음의 것들을 포함한다 :
1) 아미노산 예컨대, 글리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아스파라긴, 글루타민, 프롤린, 히스티딘의 염 ;
2) 탄수화물 예를 들어, 단당류 예컨대, 글루코즈, 프럭토즈, 갈락토즈, 만노즈, 아라비노즈, 자일로즈, 리보즈 ;
3) 이당류 예컨대, 락토즈, 트레할로즈, 말토즈, 수크로즈 ;
4) 다당류 예컨대, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분, 글리코겐 ;
5) 알디톨 예컨대, 만니톨, 자일리톨, 락티톨, 소르비톨 ;
6) 글루쿠론산, 갈락투론산 ;
7) 시클로덱스트린 예컨대, 메틸 시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 등 ;
8) 무기염 예컨대, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 나트륨 및 칼륨의 포스페이트, 붕산 암모늄 카르보네이트 및 암모늄 포스페이트 ;
9) 유기염 예컨대, 아세테이트, 시트레이트, 아스코르베이트, 락테이트 ;
10) 유화제 또는 용해제 예컨대, 아카시아, 디에탄올아민, 글리세릴 모노스테아레이트, 레시틴, 모노에탄올아민, 올레산, 올레일 알코올, 폴록사머, 폴리소르베이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 스테아르산, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노스테아레이트 및 기타 소르비탄 유도체, 폴리옥실 유도체, 왁스, 폴리옥시에틸렌 유도체, 소르비탄 유도체 ; 및
11) 점도 증진 시약 예컨대, 아가, 알긴산 및 이의 염, 구아 검, 펙틴, 폴리비닐 알코올, 산화폴리에틸렌, 셀룰로즈 및 이의 유도체, 프로필렌 카르보네이트,폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜 및 틸록사폴.
첨가제 또는 성분의 추가의 바람직한 군은 수크로즈, 트레할로즈, 락토즈, 소르비톨, 락티톨, 이노시톨, 나트륨 및 칼륨의 염 예컨대, 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 보레이트, 글리신, 아르기닌, 산화폴리에틸렌, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린을 포함한다.
불용성 및 안정한 형태: 수성 용매, 유기 용매 또는 수성-유기 용매 혼합물중에 불용성이고, 대응부(counterpart) 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 가용성 형태보다 안정성이 더 큰, 전항체(whole antibody)의 결정형 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 결정형 또는 Fab 항체 단편 결정형. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, "불용성 및 안정한 형태"란 어구는 무수 제제중에서는 불용성이지만 함수 제제중에서는 가용성인 결정형을 의미할 수 있다. 임의의 구체예에서, 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정은 불용성 형태일때 활성이 있다. 또한 하나의 구체예에서, 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정은 불용성 형태일때 활성일 수 있으므로, 일단 이의 활성이 소실되면 용해되거나, 제거 또는 분해된다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 전항체 또는 이의 단편의 결정은 안정성을 증진시키기 위하여 가교될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 금속 이온 예컨대, Ca++은 전항체 또는 이의 단편의 결정에 첨가되어, 이 결정을 더욱 불용성이고 더욱 안정하게 만들수 있다.
표지: 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정에의 표지의 혼입. 표지는 방사능 표지, 효소 표지, 독소, 자성 제제(magnetic agent) 또는 약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
액상 중합체: 수성 또는 유기 용매의 부재하에서의 순수한 액상 합성 중합체 예컨대, 폴리-에틸렌 글리콜(PEG).
저장 안정성의 손실: 상응하는 조건하에 항온처리 하였을때, 시간이 경과함에 따른 가용성(즉, 비결정화된, 천연의) 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편 대응부에 대한 결정질 전항체 또는 결정질 단일쇄 항체 Fv 단편 또는 결정질 Fab 항체 단편의 2차 구조에 있어서 특이 활성의 손실 및/또는 변화.
안정성의 손실: 상응하는 조건하에 용액의 형태로 존재할때, 시간이 경과함에 따른 가용성(즉, 비결정화된) 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편 대응부에 비하여 결정질 전항체 또는 결정질 단일쇄 항체 Fv 단편 또는 결정질 Fab 항체 단편의 2차 구조에 있어서 특이 활성의 손실 및/또는 변화.
고분자: 단백질, 당단백질, 펩티드, 치료 단백질, DNA 또는 RNA 분자, 다당류, 리포 단백질, 리포 다당류.
투여 방법: 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 결정 또는 Fab 항체 단편 결정, 또는 결정 제제 또는 이의 조성물은 다양한 투여 방식에 적합할 수 있다. 이러한 투여 방식으로서는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 비경구 투여의 예로서는 피하, 정맥내, 경피, 근내, 폐흡입, 병소내, 국소 투여, 바늘을 사용한 주사, 무수 분말 흡입, 피부 전기천공, 에어로졸 전달 및 바늘을 사용하지 않는(needle-free) 주사 기법 예컨대, 바늘을 사용하지 않는 피하 투여를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
미소구: 직경 약 1㎚ ∼ 약 1 ㎜인, 구형이거나 또는 거의 구형인 캡슐화된 결정질의 물질.
미립자: 직경 약 1㎚ ∼ 약 1 ㎜이되 무정형인 캡슐화된 결정질의 물질.
모액: 고분자 예컨대, 단백질, 핵산의 결정화에 사용되는 완충액.
바늘을 사용하지 않는 약물 전달 장치 및 분사 주입: 주사에 예리한 바늘을 사용하지 않는 물질 전달 방법으로서, 포유 동물 또는 다른 적당한 수용체의 체내에 전달하는 장치. 이 장치는 압력 매개 방식으로 물질을 전달하는 것으로서, 바늘을 사용하지 않는 장치일 수 있다. 본 발명에 의한 전항체 또는 항체 단편의 결정 또는 결정 제제 또는 조성물을 투여하는데에 사용될 수 있으며 바늘을 사용하지 않는 주입 장치 또는 시스템의 예로서는 인트라젯(상표명)(Weston Medical, Ltd.), 바이오젝터 2000(등록상표명)(Bioject, Inc.), 마다젯(상표명)(MADA Medical Products, Inc.) 및 J-팁(등록상표명)(National Medical Products, Inc.), 렉트라젯(상표명)(DCI, Inc.), 메소플래쉬(등록상표명)(이소젯(상표명)이라고도 칭함)(Prolitec), VACCI JET 일렉트리크(상표명)(ENDOS Pharma) 및 2상 유체 약물 분사 주입기(Avant Drug Delivery Systems, Inc.)를 포함하며, 이들은 현재 시판중에 있다.
유기 용매: 액상 중합체 및 이의 혼합물을 포함하는, 비수성 공급원으로부터 유래된 임의의 용매. 본 발명에 적합한 유기 용매로서는 다음의 것들을 포함한다. 아세톤, 메틸 알코올, 메틸 이소부틸 케톤, 클로로포름, 1-프로판올, 이소프로판올, 2-프로판올, 아세토니트릴, 1-부탄올, 2-부탄올, 에틸 알코올, 시클로헥산, N-메틸피롤리디논(NMP), 디옥산, 에틸 아세테이트, 디메틸포름아미드, 디클로로에탄, 헥산, 이소옥탄, 염화메틸렌, tert-부틸 알코올, 톨루엔, 사염화탄소 또는 이들의 조합.
약학적 유효량: 일정 시간 동안 생유기체의 증상을 치료하는데에 효과적인, 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편 결정, 또는 이들의 제제 또는 조성물의 양.
가소화: 전항체 결정 또는 항체 단편 결정을 용액의 형태로 포함하는 제제를 제조하기 위하여 가소제 예를 들어, 라놀린, 에탄올을 사용하면 피하 주사후 점성을 띠게 되어 매트릭스를 형성한다. 생성된 고점도 매트릭스는 접착성이고, 생분해성이며 생체적합성이다. 항체 또는 항체 단편은 이후 매트릭스로부터 제어 가능한 방식으로 방출된다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 크기: 본 발명에 사용된 PEG 부분(예, PEG 200, PEG 400, PEG 10,000, PEG 80,000)의 크기란, 사슬의 길이 즉, PEG 사슬중 에틸렌 글리콜 잔기의 수를 의미한다. 예를 들어, PEG 200은 PEG 중합체중 200개의 에틸렌 글리콜 잔기를 보유하는 것이고, PEG 80,000은 PEG 중합체중 80,000개의 에틸렌 글리콜 잔기를 보유하는 것이다.
중합체: 작고 간단한 화학 단위의 반복으로 이루어진 거대 분자. 이러한 반복 단위는 선형이거나 분자형으로서, 상호 연결된 그물망 구조를 형성할 수 있다.이러한 반복 단위는 일반적으로 단량체와 동등한 것이거나 또는 거의 동등한 것이다.
중합체 담체: 전항체 또는 항체 단편의 전달(생물학적 전달 포함)을 위하여 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 단편의 결정을 캡슐화시키는데에 사용되는 중합체. 이러한 중합체는 생체적합성 및 생분해성 중합체를 포함한다. 중합체 담체는 단일의 중합체 유형이거나 또는 여러 유형의 중합체의 혼합물일 수 있다. 중합체 담체로서 유용한 중합체는 예를 들어, 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩티드), 폴리(에스테르) 예컨대, 폴리(락트산) 또는 PLA, 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-히드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤) 및 폴리(디옥사논) ; 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(히드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리(오르가노)포스파젠, 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에스테르의 공중합체, 플루론계 폴리올, 알부민, 천연 및 합성 폴리펩티드, 알기네이트, 셀룰로즈 및 셀룰로즈 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고당, 글리카미노글리칸, 황산 다당류, 개질 전분 예컨대, 아밀로즈 전분, 아밀로펙틴 전분, 히드록시에틸 전분, 메타크릴레이트 전분 및 기타 전분, 및 단백질 결정으로 캡슐화될 임의의 통상적인 재료를 포함한다.
예방학적 유효량: 일정시간 동안 생유기체내에게 투여되어 이의 증상의 발병을 막는데에 효과적인, 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 결정 또는 Fab 항체 단편 결정, 또는 이들의 결정 제제 또는 조성물의 양.
단백질: 탄소, 수소, 산소, 질소와 보통 황을 함유하며, 펩티드 결합에 의하여 연결된 아미노산 사슬을 이루는 복합 중합체. 단백질의 분자량 범위는 1000 달톤의 펩티드에서 600∼1000 킬로달톤의 당단백질을 포함한다.
단백질 전달 시스템: 1 이상의 단백질 예컨대, 항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편 결정, Fab 항체 단편 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물을 생물학적 개체에 투여하는 방법 또는 수단.
방사능 표지: 단백질 예컨대, 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편 결정으로의 방사능 표지의 혼입. 예컨대,131I 또는90Y와 같이 방사능 표지의 반감기가 짧은 경우, 방사능 표지는 또한 예를 들어, 암의 방사능 면역 치료법에 사용될 때 치료 효능이 있을 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질의 다양한 표지 방법은 당 업계에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 표지의 예로서는3H,14C,15N,35S,90Y,99Tc,111In,125I 및131I와 같은 방사능 동위원소 또는 방사능 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
재구성: 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물의 적당한 완충액 또는 약학적 제제중에서의 용해.
실온: 본 발명에 있어서, 당 업자는 실온은 약 20∼약 26℃ 사이의 임의의 온도일 수 있음을 이해할 것이다.
안정화: 중합체 담체를 포함하는 첨가제 또는 성분을 사용하여 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편 결정의 제제 또는 조성물을 제조함으로써, 가용성 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 대응부 또는 Fab 항체 단편 대응부에 비하여, 결정질 전항체 또는 결정질 단일쇄 항체 Fv 단편 또는 결정질 Fab 항체 단편의 2차 구조에 있어서의 특이적 활성의 손실 및/또는 변화를 억제하는 방법.
치료적 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편: 본 발명에 따른 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이의 결정 조성물 또는 제제로서, 생유기체에 투여되어 이 유기체의 특정 질병 또는 증상을 치료한다.
백신 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편: (1) 천연 항원 예컨대, 바이러스, 기생체, 박테리아 또는 종양 세포와 같은 병원체상에서 발견되거나, 또는 종양에서 발견되는 항원, 또는 (2) 알레르기 항원에 의하여 생성되는, 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편. 이러한 백신 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 단백질 활성은 병원체, 종양 또는 알레르기원 또는 기타 항원에 특이적인 보호성 면역 반응을 유도하는 것이다.
전항체 및 이의 단편의 결정성 및 이들의 이점
고분자 예컨대, 전항체 또는 이의 단편의 결정성은 이들의 생체내 저장 및 전달에 있어서 상당히 중요하다. 그러나, 모액의 외부에서 안정한 이러한 결정질 고분자를 다량으로 제조하는 기법은 얼마 존재하지 않는다. 단백질 예컨대, 전항체 및 이의 단편의 결정은 매우 파괴되기 쉽고 용매를 다량 함유하기 때문에 상당히 조심스럽게 취급되어야 한다. X 선 결정분석법을 통하여 고분자 결정으로부터 얻어진 회절 패턴은 공기중에서 탈수됨에 따라서 급속하게 분해된다는 것은 널리 공지된 사실이다. 보통, 결정은 그 모액으로부터 조심스럽게 분리되어 모세관으로 삽입된다. 탈수 상태를 유지하기 위하여 내부에 소량의 모액을 함유하는 관은 치과용 왁스 또는 실리콘 그리즈를 사용하여 공기로부터 차단된다[McPherson, A.,Preparation and Analysis of Protein Crystals, Robert E. Krieger Publishing, Malabar, p. 214(1989)]. 다른 기법으로는 냉동 온도에서의 고분자 결정으로부터 얻은 데이터를 수집하는 기법이 있다. 결정은 생성된 후 급속히 냉각되어 수성 매질중 얼음 격자가 형성되는 것이 억제된다. 얼음 대신에, 결정이 최소한으로 손상되도록 감싸는 견고한 유리 형태를 이용할 수도 있다. 이후 결정은 100°K로 유지되어 결정이 붕괴되는 것을 억제할 수 있다[Rodgers, D.W., Methods in Enzymology(Carter, C.W. 및 Sweet, R.M. 편저), Academic Press, v.276, p.183(1997)]. 이 기법은 모액의 외부에서 결정 상태를 유지시킬 수 있으나, 100°K 이상의 온도에서 사용될 수는 없다.
원칙적으로, 건조된 결정은 동결건조법에 의하여 제조될 수 있다. 그러나, 이 기법은 물질을 신속히 냉각시키는 것을 포함하고, 안정한 생성물을 동결시키기 위해서만 사용될 수 있다. 결정질 전항체 또는 결정질 단일쇄 항체 Fv 단편 또는 결정질 Fab 항체 단편을 함유하는 수용액은 맨처음 -40∼-50℃ 사이의 온도로 동결된다. 이후 진공상태하에서 얼음을 제거한다. 얼음이 형성되면 일반적으로 단백질 결정 격자에 유해하므로, 결정 및 비결정 침전물의 혼합물이 생성된다.
상온의 저장 조건하에서 순수하고 안정한 결정질 상태의 전항체를 제조하는것이 바람직하다. 이러한 결정은 치료제 및 백신의 투여용 제제의 제조에 특히 유리한 형태를 구성한다. 본 발명은 유리하게는 전항체의 제제 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 고체 입자형 또는 비수성 용매중에 분산된 형태인 전항체 결정의 저장용 제제 및 조성물을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 단일 유형의 생물학적 활성 전항체 또는, 각각 상호 작용하지 않는 상이한 유형의 전항체의 혼합물의 저장에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 항체의 1본쇄 Fv(scFv) 단편을 결정화시키는 방법 및 이러한 결정의 다양한 생물 의학적 분야에서의 용도를 제공한다. 이러한 scFv 단편은 링커 펩티드를 사용하여 항체 중쇄의 가변 영역을 항체 경쇄의 가변 영역에 결합시킴으로써 구성된다. 이들의 크기는 작기 때문에, scFv 단편은 조직으로의 침투가 전항체보다는 더욱 용이하며, 따라서 특정 증상에 대해서 효과적인 치료적 용도를 보유할 수 있다. 결정, scFv 단편을 함유하는 결정 제제 또는 결정 조성물은 제조되어 본 발명의 다양한 구체예에서 전항체의 결정이 사용될 수 있는 것과 동일한 방식으로 이용될 수 있다는 사실을 이해해야 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편을 결정화하는 방법 및 이러한 결정의 다양한 생물 의학적 분야에서의 용도를 제공한다. 전술한 바와 같이, 이러한 Fab 단편은 효소 파페인으로 완전한 항체를 분해하여, 하나의 항원 결합 부위를 보유하는 항체 단편 분자를 생성함으로써 제조된다. 또는 Fab 단편은 유전 공학 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 단편의 크기는 작기 때문에, Fab 단편은 전항체의 경우보다 조직으로의 침투가 용이하며, 이로써 이 단편은 특정 증상에 대해서 효과적인 치료적 용도를 보유할 수 있다. 결정, Fab 단편을 함유하는 결정 제제 또는 결정 조성물은 제조되어 본 발명의 다양한 구체예에서 전항체의 결정이 사용될 수 있는 것과 동일한 방식으로 이용될 수 있다는 사실을 이해해야 한다.
본 발명은 모든 면역글로불린 클래스 및 하위클래스로부터 유래된, 모든 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 및 혈청 IgA(sIgA), 그리고 이의 하위 클래스인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgM1 및 IgM2, IgA1 및 IgA2, 그리고 scFv 단편 및 Fab 항체 단편의 결정화, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 모액과 비수성 용매를 교체하는 것을 포함하는, 현탁액으로서 저장하는 것에 적합한 전항체의 생물학적으로 활성인 결정을 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 결정질 슬러리는 제1 용매를 스핀시키고, 물을 제거하기 위하여 제2 용매를 사용하여 잔류하는 결정질 고체를 세척한후, 비수성 용매를 증발시킴으로써, 고체로 제조될 수 있다.
결정질 전항체 또는 scFv 단편 또는 Fab 단편의 비수성 슬러리는 피하 전달, 근육내 전달에 특히 유용한 반면, 고체 제제는 폐 투여에 가장 적합하다. 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이, 폐 전달 방법은 다른 투여 경로에 의하여는 전달이 어려운 생물학적 고분자에 특히 유용하다.
본 발명에 의한 전항체의 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 및 Fab 항체 단편의 결정은 진단 방법 및 키트에 유용하다. 예를 들어, 이러한 결정은 환자 또는 다른 표본으로부터 얻은 샘플내 표적 항원이 존재하는지 여부를 진단하기 위한 키트에 사용될 수 있다. 이러한 키트는 용기를 포함할 수 있으며, 선택적으로는 이의사용 지침을 포함할 수도 있다. 이 키트중 결정은 검출 가능한 표지로 표지될 수 있다. 샘플 예컨대, 혈액, 종양, 세포 또는 조직 샘플중 표적 항원을 검출하는 방법은, 샘플을 본 발명에 의한 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정과 혼합하고, 이 샘플이 상기 항체 또는 단편과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 방법에 사용된 결정은 검출 가능한 표지로 표지될 수 있다.
이와는 달리, 본 발명에 의한 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 및 Fab 항체 단편의 결정은 크로마토그래피 및 정제 방법 예컨대, 친화성 크로마토그래피에 유용하다. 예를 들어, 단백질의 친화성 매트릭스 정제 방법은 다음의 단계에 의하여 수행될 수 있다 :
(a) 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 및 Fab 항체 단편의 결정을 결합 완충액과 혼합하는 단계로서, 상기 항체 또는 항체 단편은 정제될 단백질과의 친화성을 보유하는 것인 단계 ;
(b) 정제될 단백질을 함유하는 단백질 용액을 결정/완충액 혼합물에 첨가하는 단계 ;
(c) 단백질이 항체 또는 항체 단편에 결합할 수 있는데에 충분한 시간 및 온도에서 전체 혼합물을 항온처리하는 단계 ;
(d) 상기 혼합물을 세척 완충액으로 세척하는 단계 ; 및
(e) 상기 단백질을 용리 완충액으로 용리시키는 단계.
전항체의 캡슐화된 결정의 안정성
당업자들은 단백질 안정성이 단백질 방출을 조절하는 중합체 미립자 전달 시스템을 성공적으로 제조하는데에 가장 심각한 장애물중의 하나라는 사실을 이해할 것이다. 중합체 담체에 캡슐화된 결정질 단백질 예컨대, 전항체의 결정, 또는 항체 단편의 결정의 안정성은 3개의 개별 단계 즉, 1) 항체 결정 조성물의 제조 단계, 2) 생성된 조성물로부터의 항체 방출 단계, 및 3) 항체 방출 이후의 생체내 저장 단계에서 요청될 수 있다. 가용성 또는 비결정질 단백질을 함유하는 미립자 또는 미소구의 제조시, 유기 용매의 사용 및 동결 건조 수행은 단백질 안정성에 특히 유해하다. 결과적으로, 방출된 단백질들은 수분-유도성 응집에 영향받기 쉬워서, 영구적인 불활성화를 초래할 수 있다.
본 발명에 의한 전항체 결정, 항체 단편의 결정, 또는 제제 및 조성물의 제조시 단백질의 안정성을 높이기 위해서, 각각의 전항체 분자의 이동성을 제한할 필요가 있으며, 이는 결정질의 고체 상태일 경우 최선으로 이루어진다. 본원의 목적에 있어서, 고체 상태는 비결정질 및 결정질의 2 가지 범주로 나누어질 수 있다. 보통 결정질 물질로 존재하는 3차원 길이 범위는 비결정질 상태에는 존재하지 않는다. 뿐만 아니라, 서로에 대한 분자의 위치는 매우 질서정연한 결정질 상태에 비하여, 비결정질 또는 액체 상태에서 더욱 무작위적이다. 그러므로, 항체를 포함하는 비결정질 단백질은 이의 결정질 대응부보다 덜 안정적일 수 있다.
결절성의 유지
본 발명에 의한 항체 제제 및 조성물 제조용 항체 공급원으로서 항체 결정 또는 항체 단편의 결정을 사용하기 위하여, 결정화 용액(모액) 외부에서 단백질 결정이 용해되는 문제점은 극복되어야 한다. 본 발명에 의한 단백질의 결정성, 그리고 이로 인한 전항체의 결정, 또는 항체 단편의 결정, 및 제제 및 조성물의 제조에 있어서의 안정성을 유지하기 위하여, 다음과 같은 몇가지 요소가 적용될 수 있다.
1. 중합체 담체에 의하여 캡슐화된 항체 결정의 제조시 결정은 모액중에서 유지된다. 단백질 결정화에 사용된 다수의 화합물 예컨대, 염, PEG 및 유기 용매는 중합체 가공 조건과 부합된다.
2. 용해의 동력학. 모액 외부에서의 결정 용해 속도는 조건 예컨대 pH, 온도, 금속 예컨대 Zn, Cu 및 Ca의 이온의 존재 및 침전물의 농도에 따라서 달라진다. 이러한 조건을 변화시켜 결정의 용해를 몇시간 늦출수 있다. 이와 동시에 미립자 형성 과정은 매우 신속하게 진행되어 완결하는데에 보통 수 초에서 수 분이 소요된다.
3. 건조된 항체 결정. 모액은 여과에 의하여 제거될 수 있고, 잔류하는 결정질 페이스트는 진공하에서 수혼화성 유기 용매를 사용한 세척 및/또는 동결건조 또는 분무 건조에 의하여, 공기에 의해 건조될 수 있다.
4. 결정 크기 및 모양은 결정화시 조작되어 조절될 수 있다. 그러므로, 다양한 결정 형태(각 형태는 용해 동력학이 상이하므로, 비결정질 단백질에 비하여 상이한 지속 방출 프로필을 보유함)를 얻을 수 있다.
5. 모액을 약학적 허용 용매 또는 용액으로 대체하여 생체내 조절 전달용 피하 비히클을 형성함으로 인한 결정 제제의 제조 방법 : 모액은 원심분리에 의하여 제거될 수 있으며, 잔류하는 결정질 물질은 피하 주입을 위하여 약학적 허용 용매(예, 에탄올)중에 현탁될 수 있다. 결정질 물질은 또한 N-메틸피롤리디논(NMP)중 수크로즈 아세테이트 이소부티레이트(SAIB) 또는 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)중에 현탁될 수 있으며, 이는 수성 체액과 일단 접촉하게 되면 피하에서 겔을 형성하게 된다. 이후 상기 겔은 항체 또는 이의 단편의 조절 방출을 촉진한다.
투여 및 생물학적 전달
현재, 치료적 단백질 예컨대, 항체는 경구 생체적합성이 상당히 떨어지고 혈장내 수명이 짧기때문에 일반적으로 잦은 주사 또는 주입에 의하여 투여된다. 본 발명에 의한 전항체 결정 또는 항체 단편의 결정, 그리고 이를 함유하는 결정 제제 및 조성물(전항체용 미립자계 지속 방출형 시스템 포함)은 환자의 적응성 및 투여 편리성을 개선시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 결정질 상태의 단백질의 생체적합성 및 안정성이 증가하였기 때문에, 투여된 항체 또는 항체 단편의 혈중 농도는 더욱 낮은 투여량에 대하여 잠재적으로 더욱 안정하게 유지될 수 있다. 또한 본 발명에 의하여 얻어지는 느리고 일정한 방출능은 활성 항체의 전달 효율이 더욱 높아짐으로 인하여 항체의 투여량을 유리하게 감소시킬 수 있다. 본원에 기술된 결정화된 항체 및 항체 제제 및 조성물을 사용하여 비용을 상당히 절감할 수 있다.
본 발명의 항체 결정, 결정 제제 및 조성물은 전항체의 천연의 생물학적 활성인 3차 구조의 보존성을 강화시키고 전항체 또는 이의 단편을 이것을 필요로하는 개체에 서서히 방출시킬 수 있는 저장체를 제조할 수 있다. 생물학적으로 활성인 전항체 또는 이의 단편은 특정 캡슐화 기법, 중합체 구성, 결정 형태, 결정 크기, 결정 용해성 및 사용된 임의의 첨가제의 존재 및 성질에 의하여 측정되는 바와 같이, 일정 시간에 걸쳐서 조절된 방식으로 추후 방출된다. 생물학적 활성인 전항체 또는 항체 단편을 비경구 투여하기 위하여 본 발명의 결정, 결정 제제 및 조성물을 희석제로 재구성시킬 수 있다.
본 발명에 의한 중합체 전달 담체중에 전항체 또는 이의 단편의 결정을 포함하는 제제 및 조성물은 또한 백신, 약제, 신체 보호용(personal care) 제제 및 조성물, 수의학적 제제, 또는 경구 효소 보충제제에 사용되는 임의의 통상적인 담체 또는 보조제를 포함할 수도 있다. 이러한 담체 및 보조제는 예를 들어, 프룬트 보조제, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 완충 물질 예컨대, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질 예컨대, 황산칼륨, 이나트륨 수소 포스페이트, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘, 트리실리케이트, 셀룰로즈계 물질 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 국소 투여용 또는 겔계 형태 형성용 보조제로서는 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 나무 왁스 알코올을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에 의하면, 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정은 약학적 조절 방출 투여를 포함하는 조절 방출 투여에 사용할 수 있는 임의의 통상적인 물질과 배합될 수 있다. 이러한 물질로서는 예를 들어, 코팅, 외피 및 필름 예컨대, 장용 외피 및 중합체 코팅 및 필름을 포함한다.
전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정을 포함하는 제제 또는 조성물은 인간, 동물, 또는 식물의 본 발명에 의한 전달에 바람직한 위치에 전달될 수 있다. 이러한 전달에는 장치 예컨대, 임플란트 가능 장치를 사용하는 것을 포함할 수 있거나, 또는 다른 미립자 단백질 전달 시스템을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정은 약 0.01∼약 500 ㎛ 사이에서 가장 긴 치수를 가질 수 있거나, 또는 약 0.1∼약 200 ㎛ 사이에서 가장 긴 치수를 가질 수 있다. 가장 바람직한 구체예는 전항체 결정 또는 항체 단편의 결정의 가장 긴 치수가 약 1∼약 100 ㎛ 사이인 경우이다. 이러한 결정은 침상형, 침 다발형, 디스크형, 입방체형, 막대형, 유사 결정형, 구형, 플레이트형 예컨대, 육각형 및 정사각형, 장사방형, 이중피라미드형 및 프리즘형 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 형태를 보유할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 각각 약 0.1㎎/㎖ 이상이다. 이와는 달리, 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 각각 약 1㎎/㎖ 이상이다. 이와는 달리, 본 발명의 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 약 10㎎/㎖ 이상이다. 이와는 달리, 본 발명의 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 각각 약 20㎎/㎖ 이상이다. 이와는 달리, 본 발명의 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 각각 약 50㎎/㎖ 이상이다. 이와는 달리, 본 발명의 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 각각 약 100㎎/㎖ 이상이다. 이와는 달리, 본 발명의 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 각각 약 120㎎/㎖ 이상이다. 이와는 달리, 본 발명의 제제 또는 조성물은 전항체 농도 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 농도, 또는 Fab 항체 단편 농도가 각각 약 200㎎/㎖ 이상이다.
본 발명에 의하면, 인간, 동물 및 식물을 포함하는 임의의 개체는 약학적 유효량의 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물을 사용하여, 일정 시간 경과함에 따라서 이것이 투여된 개체의 증상을 치료하는데에 충분한 시간 동안 약학적 허용 방식으로 치료될 수 있다. 이와는 달리, 개체는 일정 시간 경과함에 따라서 이것이 투여된 개체의 증상을 억제하는데에 유효한 본 발명의 전항체 결정 또는 Fv 항체 단편 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물을 예방힉적 유효량으로 수용할 수 있다.
전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물은 보조제를 포함하거나 또는 포함하지 않는, 약학적 제제, 신체 보호용 또는 수의학적 제제의 일부로서, 또는 예방학적 제제의 일부로서 단독으로 투여될 수 있다. 이는 비경구 또는 경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 경구, 폐내, 코, 귀, 항문, 피부, 안구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 복막내, 점막내, 설하, 피하, 경피, 국소 또는 두개골내, 또는 구강내 투여될 수 있다. 또 다른 약학적 제제, 신체 보호용 또는 수의학적 제제의 경우, 전항체 또는 이의 단편의 결정, 또는 결정 제제 또는 이의 조성물은 임의의 상피 표면에 국소 투여될 수 있다. 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 결정 제제 또는 이의 조성물을 투여함으로써 치료, 보호, 수복 또는 해독될 수 있는, 이러한 상피 표면의 예로서는 구강, 안구, 귀, 항문 및 코의 상피 표면을 포함한다.
본 발명에 의한 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 결정 제제 또는 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 수의학적 또는 예방학적 제제는 또한 정제, 리포좀, 입자, 구, 미립자, 미소구 및 캡슐로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다.
본 발명에 의한 이러한 용도 및 다른 용도에 있어서, 전항체 결정, 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물은 정제의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 정제는 용이하게 취급되고 허용 가능한 수준의 활성 또는 효능을 보유하는 전항체 결정, 항체 단편의 결정 또는 결정 제제 또는 조성물의 저장용인 액체 제거형, 분말 제거형을 구성한다.
이와는 달리, 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물은, 반응성 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편을 이것의 투여가 필요한 부위에 제공하기 위한 투여에 사용되는 다양한 통상적 형태일 수 있다. 이에는 예를 들어 고체,반고체 및 액체 투여형 예컨대, 용액 또는 현탁액, 슬러리, 겔, 크림, 향유, 유액, 로션, 분말, 스프레이, 소포, 페이스트, 연고, 고약, 향유 소적을 포함한다.
본 발명에 의한 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물은 또한 약제, 신체 보호용 제제 또는 수의학적 제제에 사용되는 임의의 통상적인 담체 또는 보조제를 포함할 수도 있다. 이러한 담체 및 보조제로서는 예를 들어, 프룬트 보조제, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 완충 물질 예컨대, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질 예컨대, 황산프로타민, 이나트륨 수소 포스페이트, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘, 트리실리케이트, 셀룰로즈계 물질 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 국소 제형 또는 겔계 제형에 사용되는 보조제로서는 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 나무 왁스 알코올을 포함할 수 있다.
본 발명의 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물의 가장 효과적인 투여 방식 및 투여 형태는 원하는 효과, 이전의 치료법(행하여진 경우), 개체의 건강 상태, 증상의 상태, 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 결정 또는 Fab 항체 단편 결정, 또는 이의 결정 제제 또는 조성물, 및 치료의 또는 임상의의 판단에 따라서 달라질 것이다. 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편 결정, Fab 항체 단편 결정 또는결정 제제 또는 이의 조성물은 약학 제제, 면역치료제, 또는 수의학적 제제에 허용 가능한 임의의 투여형으로 한번에 또는 연속적 치료 기간에 걸쳐서 투여될 수 있다.
단일 투여를 제공하는 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물의 양은 특정 투여 방식, 특이적 결정 제제, 제제 또는 조성물, 투여 농도 및 투여 횟수에 따라서 달라질 것이다. 통상적인 제제는 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이의 제제 또는 조성물을 약 0.01∼약 99%(w/w), 바람직하게는 약 1∼약 50%(w/w)로 함유할 것이다. 이와는 달리, 제제는 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이의 제제 또는 조성물을 약 0.01∼약 80%(w/w), 바람직하게는 약 1∼약 50%(w/w)로 함유할 것이다.
필요에 따라서, 개체의 증상의 개선 정도에 따라서, 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물의 유지량이 투여될 수 있다. 결과적으로, 투여량 또는 투여 횟수, 또는 이 모두는 징후의 작용에 따라서 증상이 개선되는 수준으로 감소될 수 있다. 이러한 증상이 원하는 수준으로 감경되었을때, 치료는 중단되어야 한다. 그러나, 개체는 증상 또는 이의 징후가 재발할때 장기간에 걸친 간혈성 치료를 받을 필요가 있을 수 있다.
본 발명에 의한 결정화된 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 및 Fab 항체 단편, 및이의 조성물 및 제제는 항체 단독으로 또는 다른 약물과 함께, 또는 다른 화학 물질 예컨대, 독소 또는 방사성 뉴클레오티드와의 복합체 또는 접합체의 형태로 임의의 인간 질병을 비롯한, 다양한 인간 및 기타 동물의 질병, 감염 및 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 의한, 결정화 전항체, scFv 항체 단편 및 Fab 항체 단편, 및 이의 조성물 및 제제를 사용하여 치료 또는 진단될 수 있는 질병, 감염 및 질환으로는 AIDS/HIV 감염 또는 관련 증상 ; 자가면역 질환 예컨대, 류마티스성 관절염, 전신성 루프스 홍반증, 특발성 혈소판 감소성 자반병 ; 혈액 관련 질환 예컨대, 혈소판 응집 ; 결장암, 폐암 및 전립선암을 비롯한 암 ; 소화기 질환 예컨대, 결장 병, 크롬씨 병 및 염증성 장 질병 ; 눈 관련 증상 예컨대, 포도막염, 백내장 ; 심장병 예컨대, 급성 심근 혈전증, 심혈관 혈전증 ; 감염성 질환 예컨대, 폐혈증, 골수염 ; 신경성 질환 예컨대, 다발성 경화증, 졸중 ; 호흡기 질환 예컨대, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염 ; 피부 질환 예컨대, 건선 ; 조직 이식 문제 예컨대, 조직-대-숙주간 질환, 기관 이식 거부 ; 알레르기 항원 예컨대, 땅콩에 대한 감작성 감소증, 및 외상으로 인한 손상 등을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명에 의한 결정화 전항체, scFv 항체 단편 및 Fab 항체 단편, 및 이의 조성물 및 제제는 골수염, 살모넬라증, 쉬겔라증 및 암 예컨대, 비호지킨 림프종 및 백혈병으로 진행될 부위 및 병의 진행 정도를 비롯한, 질병 또는 감염을 진단하기 위하여 단독으로, 또는 시험 키트중에서 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 의한 결정화된 전항체, scFv 항체 단편 및 Fab 항체 단편, 그리고 이의 조성물 및 제제는 질병 예컨대,. 심혈관 혈전증의 검출용인 생체내 이미지 형성제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 의하여 결정화되어 사용될 수 있는 항체로서는 항시토킨 항체, 항CD 항원 항체(항CD3, 항CD20(예, 리턱시맵), 항CD25, 항CD52, 항CD33, 항CD11a), 항TNF-α(예, 인플릭시맵), 항방울뱀 독, 항ICAM(예, 항ICAM-1, 항ICAM-3), 항성장 인자 항체(예, 항VEGF), 항성장인자 수용체 항체(예, 항HER2/neu(예, 트라스츠즈맵), 항EGFR), 항면역글로불린 항체(예, 항IgE), 항폴리클로날 Ab 항체, 항바이러스 항체(예, 항CMV, 항HIV(예, 항gp120), 항HBV, 항RSV(예, 항F 단백질) 등), 항보체 항체(예, 항C5), 항응고인자 항체(예, 항gpⅡb/Ⅲa, 항인자 Ⅶ), 항인터루킨 항체(예, 항IL-5, 항IL-4, 항IL-8), 주요 조직적합성 복합체에 표적화된 항체(예, 항HLA), 항이디오타입 항체, 항인테그린 항체(예, 항β-2 인테그린), 항-17-ⅠA 세포 표면 항원, 항-α4β7, 항-VLA-4 및 항CBL을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
당업자는 전술한 전항체의 Fv 및 Fab 항체 단편을 포함하는 항체 단편들이 본 발명에 의하여 결정화되어 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물의 제조
본 발명의 하나의 구체예에 따르면, 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물은 다음의 방법에 의하여 제조된다.
첫째, 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편을 결정화시킨다.다음에는, 당, 당 알코올, 점도 증진제, 습윤제 또는 용해제, 완충염, 유화제, 항미생물제, 항산화제 및 코팅제로부터 선택된 첨가제 또는 기타 성분을 모액에 직접 첨가한다. 이와는 달리, 최소 1 시간에서 최대 24 시간 동안 결정을 첨가제 용액중에 현탁시킨 후에 상기 모액을 제거한다. 상기 첨가제의 농도는 통상적으로 약 0.01∼약 10%(w/w)이다. 성분의 농도는 약 0.01∼약 90%(w/w)이다. 결정의 농도는 약 0.01∼약 99%(w/w)이다.
이후 모액을 결정 슬러리로부터 여과 또는 원심분리에 의하여 제거한다. 이후, 결정을 약 50∼약 100%(w/w)의 1 이상의 유기 용매 예컨대, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 또는 에틸 아세테이트의 용액으로, 실온 또는 -20∼25℃의 온도에서 선택적으로 세척한다.
그 다음 결정에 질소, 공기 또는 비활성 기체 스트림을 통과시켜 상기 결정을 건조시킨다.
대안으로, 결정은 공기 건조, 분무 건조, 동결 건조 또는 진공 건조시킴으로써 건조시킨다. 최종 산물의 습기 함량이 약 10 중량% 미만, 가장 바람직하게는 5 중량% 미만이 될 때까지, 세척 후 최소 1 시간 내지 최대 72 시간 동안 건조시킨다. 마지막으로, 필요에 따라 결정의 미세화(크기를 감소시킴)를 수행할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따라, 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물을 제조하는 경우, 계면활성제와 같은 증강제는 결정화 동안 첨가되지 않는다. 부형제 또는 성분을 결정화 후 모액에 약 1 내지 약 10%(w/w)의 농도, 대안으로는 약 0.1내지 약 25%(w/w)의 농도, 대안으로는 약 0.1 내지 약 50%(w/w)의 농도로 첨가한다. 부형제 또는 성분은 약 0.1 내지 약 3 시간 동안 모액 중의 결정으로 항온처리하고, 대안으로는 약 0.1 내지 약 12 시간 동안 항온 처리를 수행하며, 대안으로는 약 0.1 내지 약 24 시간 동안 항온처리를 수행한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 성분 또는 부형제를 모액 이외의 용액에 용해시키고, 결정을 모액으로부터 제거하며, 부형제 또는 성분 용액에 현탁시킨다. 성분 또는 부형제 농도와 항온 처리 시간은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 기타 서방형 방법, 예컨대 전항체의 캡슐화된 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이들을 포함하는 제제 또는 조성물로 예비 로딩되는 실리콘계 고리 또는 로드(rod)를 사용할 수 있으므로, 전달용 이식물로서 작용할 수 있다. 이러한 방법은 수주 또는 수개월에 걸쳐 항체 또는 항체 단편의 일정 수치를 혈류에 제공한다. 이러한 이식물은 피내 삽입할 수 있고, 안전하게 대체할 수 있으며, 필요한 경우 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 제제 및 조성물은 전항체의 결정, 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정을 포함하는 백신 제제 및 조성물, 및 보조제 및/또는 캡슐화 중합체(들)를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 전체 항유전자형 항체는 그 자체로 면역원이다. 이 구체예에서, 전항체 결정 및 결정 제제 또는 조성물은 항유전자형이 의태하거나 또는 이에 매우 관련이 있는 항원에 대한 반응을 유도해 낸다. 따라서, 항유전자형 항체는 암 및 자가 면역 질환, 예컨대 알레르기뿐 아니라, 바이러스, 예컨대 간염 B 바이러스에 대한 백신 또는 치료제의 형태로서 작용할 수 있다.
이러한 백신 제제 또는 조성물의 한 구체예는 결정형 전항체, 또는 이의 scFv 단편 또는 이의 Fab 단편을 포함하는 미소구를 함유하는 단일 백신 주사를 수반한다. 예를 들면, 이러한 미소구는 세가지 이상의 상이한 방출 프로필에 의해 특징화될 것이다. 이러한 방식으로, 항원과 유사하게 작용하는 전항체 또는 이의 단편의 결정은 지속 면역을 발생시키기에 충분한 지속된 기간에 걸쳐서 방출할 수 있다. 이러한 제제 또는 조성물에 의해, 다항원 추가면역은 단일 단위 형태로 이용 가능하게 수행될 수 있다. 이러한 시스템의 한 이점은 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물을 사용함으로써 항체 또는 항체 단편의 천연 3차원 구조를 유지시키고, 이들의 천연 형태의 면역 시스템에 제공함으로써, 천연 항체에 의해 나타나는 면역 반응을 유도한다는 것이다.
면역 시스템을 프라이밍하는 경우, 보조제 효과에 대한 필요성이 적을 수 있다. 따라서, 보다 느린 분해 접종에서, 보다 적은 면역 보조제를 포함할 수 있고, 가능하게는 제제 및 조성물의 가장 낮은 분해 미소구에서 보조제가 전혀 필요하지 않을 수 있다. 이러한 방식으로, 원거리 지역에서의 환자 집단은 감염 질환에 대한 보호를 제공하기 위하여 여러번 처리되어야 하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 이점은 중합체 담체 내에서 캡슐화되어 미소구를 포함하는 조성물을 형성하는 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정 또는 이의 제제는 동결 건조함으로써 건조시킬 수 있다. 동결 건조 또는 냉동 건조시켜서 물을 조성물로부터 분리한다. 항체 결정 조성물을 먼저 냉각시킨 후, 고 진공에 둔다. 진공에서, 결정형 H2O를 승화시켜 전항체 결정 또는 항체 단편 결정 조성물이 단지 밀접하게 결합된 물만을 함유한 채로 남아 있게 한다. 이러한 가공은 조성물을 추가로 안정화시키고, 통상적으로 계수한 상온에서 보다 쉽게 저장 및 이송할 수 있게 한다.
분무 건조는 결정 제제로부터 물을 분리하게 한다. 이 분무 건조는 용액, 에멀션 및 펌핑 가능한 현탁액과 같은 액상 공급 원료로부터의 분말, 과립 또는 집괴의 형태에서 건조 고형물의 연속 제조에 매우 적합한다. 분무 건조는 액상 공급 원료를 액적 분무로 분무시키는 것과, 액적을 건조 챔버 내의 더운 공기와 접촉시키는 것을 수반한다. 이 분무는 회전(선회) 또는 노즐 분무기에 의해 생성된다. 제어된 온도 및 기류 조건 하에서 액적으로부터의 습기를 제거하고, 건조 입자를 형성시킨다. 분무 건조 조작에서 비교적 고온이 필요하다. 그러나, 임계 건조 기간 동안 증발 냉동 효과로 인해, 그 다음, 건조 물질을 고온에 노출시키는 시간이 매우 짧음으로 인해 일반적으로 산물에 대한 열 손상은 단지 작아진다. 분말은 건조 챔버로부터 연속 방출시킨다. 조작 조건 및 건조기 설계는 산물의 건조 특성과 분말 명세 내용에 따라 선택한다. 분무 건조는 말단 산물이 입도 분포, 잔여 습기 함량, 벌크 밀도 및 입자 모양에 관한 정확한 성질 표준에 부합해야하는 이상적인 공정이다.
이 양태는 단일 투여량 멸균 용기("앰플") 또는 대안으로는 제제 또는 조성물에서 슬러리와 같은 임의의 바람직한 증가분의 단일 투여량으로 분산될 수 있는 치료 항체 및 항유전자형 백신에 특히 바람직하다. 그 다음, 분산된 슬러리, 제제 또는 조성물을 함유하는 앰플을 멸균 조건 하에서 캡핑, 회분식 냉각 및 동결 건조할 수 있다. 이러한 멸균 용기는 전세계적으로 수송되어, 실온에 저장될 수 있다. 이러한 시스템은 멸균 백신 및 치료 항체를 세계의 원거리 및 미개발된 지역에 제공하는 데 유용하다. 사용 시점에서, 앰플은 선택한 멸균 용매 또는 완충액을 사용하여 재수화되고 분산된다. 이러한 제제의 경우, 냉장이 전혀 필요하지 않거나, 약간 필요하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 전항체의 결정, 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정, 또는 Fab 항체 단편의 결정은 추가의 안정성을 위해 가교될 수 있다. 이것은 극한 pH의 부위, 예컨대 인간 및 동물의 위장관에서 이러한 결정, 결정 제제 및 조성물의 용도에 대해 유익하다. 예를 들면, 항체 결정, 예컨대 모노클로날 항체 결정은 다수의 가교제 중 하나를 사용하여 가교될 수 있으며, 이 가교제로는 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트ㆍHCl(DTBP), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트(DSP), 비스말레이미도-헥산(BMH), 비스[술포숙신이미딜]수베레이트(BS), 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(DFDNB), 디메틸수베르이미데이트ㆍ2HCl(DMS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), 디술포숙신이미딜 타르타레이트(술포-DST), 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염(EDC), 에틸렌 글리콜비스[술포숙신이미딜숙시네이트](술포-EGS), N-[g-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS), N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(술포-HSAB), 술포숙신이미딜-6-[a-메틸-a-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(술포-LC-SMPT), 비스[b-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술피드(BASED) 및 글루타르알데히드(GA)가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 전항체 또는 항체의 scFv 단편 또는 항체의 Fab 단편의 결정은 항체 방사선 치료에 사용하기 위하여 방사선 표지할 수 있다. 이러한 치료에서, 예를 들면, 방사선 표지된 항암 항체 결정 또는 scFv 단편 결정 또는 Fab 항체 단편 결정, 또는 이러한 결정을 포함하는 제제 또는 조성물은 본 발명에 따라 암 부위로 전달할 수 있다. 전달 후, 방출되는 항체 또는 scFv 단편 또는 Fab 항체 단편은 표적된 암 항원에 결합하고, 방사선 동위 원소를 직접 암세포 또는 종양에 수송한다. 항체의 방출은 본 발명에 따라 시간 조절할 수 있다. 대안으로, 방사선 치료에서 가교된 결정을 사용하는 경우, 가교제 그 자체는 방사선 표지될 수 있다. 이 구체예에서, 가교된 결정에 있는 전항체, Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편은 방사선 동위 원소를 암세포 또는 종양에 표적 및 전달 역할을 수행한다. 방사선 동위 원소 그 자체는 가교제에 의해 이송 및 방출된다. 이론적으로, 유용한 방사선 표지로는 다음의 방사선 동위 원소 또는 방사선뉴클레오티드:3H,14C,15N,35S,90Y,99Tc,111In,125I,131I가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 특히 방사선 치료에서의 생체내 용도는 방사선 표지를131I,90Y 또는 짧은 반감기로 정의되는 임의의 다른 방사선 표지로 한정할 것이다. 예를 들면, 모노클로날 항체 리턱시맵(실시예 1 참조)는 비-호지킨 림프종의 환자에서 방사선 면역 치료에 사용하기 위하여90이트륨(90Y)으로 표지되어 왔다. 이 화합물은 이브리투모마브 티욱세탄(ZevalinTM; IDEC 파마슈티칼즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)으로서 시중 구입 가능하다.
전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정의 회분 결정화
단백질 결정은 수용액, 또는 유기 용매를 함유하는 수용액으로부터 제어된 단백질의 결정화에 의해 성장한다. 조절될 수 있는 용액 조건의 예로는, 용매의 증발율, 유기 용매, 적절한 공용질 및 완충액의 존재, pH 및 온도가 있다. 단백질의 결정화에 영향을 미치는 각종 인자의 포괄적인 개관은 문헌(McPherson, A., Methods Enzymol. 114:112-20(1985))에 의해 제시되어 왔다.
통상적으로, 대형 회분(공업 규모) 결정화는 고전적인 "현가 액적(hanging drop)" 방법에 의한 투여량 결정화 보다 매우 더 큰 범위의 조건을 수반한다. 초기 단백질 농도는 약 1 내지 약 200 mg/㎖(또는 가능하게는 그 이상), 보다 바람직하게는 약 0.01 mg/㎖ 내지 약 500 mg/㎖ 범위인 반면, 대형 회분 결정화의 경우, 현가 액적 방법에 대한 단백질의 농도는 약 4 내지 약 10 mg/㎖(드문 경우, 약 25 mg/㎖ 이하)로 한정된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 0.01 mg/㎖ 내지 3.9 mg/㎖ 이하 범위 내에 있는 단백질 농도를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 4 mg/㎖ 내지10 mg/㎖ 이하 범위 내에 있는 단백질 농도를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 10.1 mg/㎖ 내지 25 mg/㎖ 이하 범위 내에 있는 단백질 농도를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 25.1 mg/㎖ 내지 200 mg/㎖ 이하 범위 내에 있는 단백질 농도를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 200.1 mg/㎖ 내지 500 mg/㎖ 범위 내에 있는 단백질 농도를 사용하여 결정화된다.
대형 회분 결정화에 사용되는 결정화 완충액은 pH 범위가 약 3 내지 약 10이고, 보다 바람직하게는 pH 범위가 약 pH 1.9 내지 약 pH 11.1이지만, 현가 액적 방법은 (보통, 이것이 pH 7.0 또는 이 주위에서 달성될지라도) 약 5.0 내지 약 9.0 pH 범위로 수행된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편이며, 상기 결정은 약 pH 1.9 초과 약 pH 2.9 이하인 pH 범위에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 pH 2.9 초과 약 pH 3.9 이하인 pH 범위에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 pH 3.9 초과 약 pH 4.9 이하인 pH 범위에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 pH 4.9 초과 약 pH 5.9 이하인 pH 범위에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 pH 5.9 초과 약 pH 7.9 이하인 pH 범위에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 pH 7.9 초과 약 pH 8.9 이하인 pH 범위에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 pH 8.9 초과 약 pH 9.9 이하인 pH 범위에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 pH 9.9 초과 약 pH 11.1 이하인 pH 범위에서 결정화된다.
대형 회분 결정화는 약 4℃ 내지 약 37℃ 범위 온도, 보다 바람직하게는 약 -21℃ 내지 약 61℃ 온도 범위에서 달성되지만, 대부분의 현가 액적 결정화는 약 4℃ 내지 실온(약 22℃)의 온도에서 수행된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 -21℃ 내지 약 4℃ 미만의 온도 범위 내에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 4℃ 내지 실온(약 22℃) 이하의 온도 범위 내에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 실온(약 22℃) 내지 약 37℃ 미만의 온도 범위 내에서 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 37℃ 내지 약 61℃의 온도 범위 내에서 결정화된다.
PEG 농도가 약 5% 내지 약 40%, 보다 바람직하게는 약 2% 내지 약 80%이고 PEG 크기(쇄 길이, 즉 PEG 쇄 내의 에틸렌 글리콜 잔류물의 수)가 약 200 내지 약20,000, 보다 바람직하게는 약 200 내지 약 40,000, 보다 바람직하게는 약 200 내지 약 8,000인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 대형 회분 결정화를 위한 결정화 완충액에 사용할 수 있다. 이론적으로, 또한 현가 액적 방법은 이러한 크기 및 농도의 PEG를 사용할 수 있지만, 일반적으로 약 5% 내지 약 20%의 PEG 400(크기(쇄 길이)) 내지 PEG 10,000(크기(쇄 길이)) 범위 외로 진행되지 않을 것이다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 2% 내지 약 4.9% 이하의 범위의 PEG 농도를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 5% 내지 약 20% 이하의 범위의 PEG 농도를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 20.1% 내지 약 80% 이하의 범위의 PEG 농도를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 200 내지 약 400 범위의 PEG 크기를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 400 내지 약 10,000 이하의 범위의 PEG 크기(쇄 길이)를 사용하여 결정화된다. 본 발명의 추가의 구체예는 전항체, 또는 이의 Fab 또는 scFv 항체 단편의 결정이며, 상기 결정은 약 10,000 내지 약 80,000 범위의 PEG 크기(쇄 길이)를 사용하여 결정화된다.
대형 회분 결정화는 0 mM(완충액 없음) 내지 약 4 M 범위의 완충 농도에서 달성될 수 있지만, 대부분의 현가 액적 결정화는 약 2 mM 내지 약 1 M의 완충액 농도에서 수행된다.
대형 회분 결정화는 약 0 mM(완충액 없음) 내지 약 4 M 범위의 금속 또는 비금속 이온 농도에서 달성될 수 있다. 그 중에서도 특히, 금속 및 비금속 이온의 예로는 칼슘, 마그네슘, 망간, 구리, 아연, 리튬, 암모늄, 철, 코발트, 세슘, 카드뮴, 니켈, 나트륨 및 칼륨이 있다.
대형 회분 결정화는 약 0 mM(완충액 없음) 내지 약 4 M 범위의 염 농도에서 달성될 수 있다. 그 중에서도 특히, 적합한 염의 예로는 염화물, 아세트산염, 황산염, 인산염, 질산염, 시트르산염, 트리스, HEPES, 카코딜레이트, 이미다졸, CHES, CAPS, MES, MOPS, 타르타르산염, 붕산염, 탄산염/중탄산염, 불화물, 요오드화물, 티오시안산염, 포름산염, 말론산염, 숙신산, 비신 및 EDTA가 있다.
한정하는 것은 아니지만 하기에 것들을 비롯하여 광범위한 결정화 조건 하에서 광범위한 시약을 사용하여 본 발명에 따른 결정화 방법을 달성할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다:
각종 2가 또는 1가 이온의 존재 하에서의 결정화; 약 5 mM 내지 약 500 mM 범위의 농도의 2가 금속이온의 존재 하에서의 결정화; 아세트산염, 붕산염, 탄산염, 숙신산염, 이미다졸, 트리스, HEPES, MOP, 인산염, CHES 및 시그마 카탈로그에서 언급한 기타 생물학적 완충액을 포함하지만, 이제 한정되는 것은 아닌 각종 완충 염을 사용하는 결정화; 그 중에서도 특히 PEG 모노메틸 에테르, MPD, 에톡시에탄올, 프로판디올, 유기 용매, 나트륨염 또는 칼륨염 형 아황산염(다른 나트륨염을 포함함), 암모늄염, 리튬염, PEG 유도체, 또는 임의의 다른 유기 화합물을 비롯한시약을 사용하는 결정화; 고정되거나 텀블링(tumbling) 또는 혼합을 수반하는 결정화 방법; 세제 또는 킬레이트화제의 존재 또는 부재 하에서의 결정화.
결정은 대형 회분 결정화에서 약 3 시간 내지 최대 약 72 시간, 보다 바람직하게는 약 5 분 내지 약 48 시간 내에서 얻어지지만, 현가 액적 방법은 결정을 얻는데 수일, 수주 또는 수개월이 걸릴 수 있다. 또한, 대형 회분 결정화는 현가 액적 프로토콜과 같지 않은 교반 단계를 사용한다.
대형 회분 결정화는 하기와 같이 수행된다; 결정화하고자 하는 적합한 부피의 항체 또는 scFv 단편 또는 Fab 항체 단편(이의 저장 완충액 내)을 동일한 부피의 결정화 용액 또는 결정화 완충액(전술한 pH에서)과 혼합시킨다. 혼합물은 이전에 얻은 분쇄된 결정(다른 실험을 통함)으로 시딩(seeding)하거나 시딩없이 사용할 수 있다. 그 다음, 혼합물을, 예컨대 혈액학/화학 혼합기에서 약 3 내지 약 48 시간 동안 소정 온도(통상적으로 약 실온)에서 텀블링한다.
대형 회분 결정화는 "시드(seed)" 결정, 즉 결정화 조건을 측정하기 위한 소규모의 결정화 스크린 동안 얻은 결정의 사용을 수반할 수도, 수반하지 않을 수도 있다. 통상적으로, 시드 결정은 시중 구입할 수 있는 결정화 스크리닝 키트(예컨대, Wizard I 및 Wizard II와 Cryo I 및 cryo II 키트(에머랄드 바이오스트럭쳐스 인코포레이티드; 미국 원싱톤주 베인브리지 아일랜드에 소재), 또는 Crystal Screen 및 Crystal Screen II 키트(햄튼 리서치; 미국 캘리포니아주 라구나 니구엘에 소재)를 사용하여 현가 액적 방법으로부터 얻을 수 있다. 대안으로, 전항체 또는 scFv 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정들은 실제로 전술한 대형 회분 결정화 방법의 축소형인 소량 회분(microbatch) 스크리닝으로 불리는 스크리닝 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
전항체의 결정화가 대략 최근 25년 동안 중요 관심의 대상이었을지라도, 결정화된 것들은 거의 없다[Harris L. J., Skaletsky, E., and McPherson, A., J. Mol. Biol. 275:861-72 (1998); Harris L. J., Larson, S.B., Skaletsky, E., and McPherson, A., Immunoloqical Reviews 163:35-43 (1998)]. 이러한 과거의 노력은 오직 현가 액적 또는 시드 액적 프로토콜을 이용하였다. 두 방법은 결정의 극히 저수율을 특징으로 하기 때문에, 항체 결정의 대규모 제조에는 적합하지 않았다. 이처럼 항체의 큰 크기, 표면 올리고당의 존재 및 이들의 고도의 분절 가요성으로 인한 항체 결정화에 문제점이 있었다. 전항체를 대규모로 결정화하는 치료 항체의 전달의 대안 루트를 제공하는 가공은 이전에 개발된 적이 없었다.
중합체 담체에서의 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 결정의 캡슐화
본 발명의 한 구체예에 따라, 조성물은 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정 또는 이러한 결정들을 포함하는 제제가 1 이상의 중합체 담체에서 캡슐화되어 중합체 담체의 매트릭스 내에서의 캡슐화에 의해 미소구를 형성하여 이들의 천연 및 생물학적으로 활성인 3차 구조를 보존하는 경우에 생성된다. 결정은 상이한 생물학적 환경으로의 전달하거나 특이적인 기능을 초래하는 데 적합한 독특한 특성을 갖는 다양한 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체를 사용하여 캡슐화할 수 있다. 용해율 및 이에 따른 활성 항체 또는 이의 단편의전달율은 특정 캡슐화 기법, 중합체 제조, 중합체 가교, 중합체 두께, 중합체 용해도 및 항체 결정 기하 구조에 의해서 측정한다.
캡슐화하고자 하는 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정 또는 이러한 결정들의 제제를 유기 용매 중에 용해된 중합체 담체에 현탁시킨다. 중합체 용액은 이들을 용액에 첨가하고 난 후, 항체 결정 또는 제제를 완전 코팅하기에 충분하도록 농축하여야 한다. 이러한 양은 약 0.02 내지 약 20, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 2의 항체 결정 대 중합체의 중량비를 제공하는 양이다. 항체 결정을 약 0.5 분 내지 약 30 분, 바람직하게는 약 1 분 내지 약 3 분의 시간 동안 용액 중의 중합체와 접촉시킨다. 결정은 현탁되고 이들이 중합체와 접촉함으로써 코팅될 때 응집하지 않게 유지되어야 한다.
이 접촉 후, 결정은 코팅되고, 이는 발생기의 미소구로서 언급한다.
발생기의 미소구는 코팅 처리 동안 크기가 증가한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 중합체 담체 및 유기 용매와 함께 현탁된 코팅 결정 또는 발생기의 미소구는 유화제로 알려진 계면활성제를 함유하는 큰 부피의 수용액으로 수송된다. 이 수용액에서, 현탁된 발생기의 미소구는 수상에 침지되고, 여기서 유기 용매는 중합체로부터 증발하거나 확산한다. 결국, 중합체가 더이상 용해되지 않고 항체 결정, 항체 단편 결정 또는 제제를 캡슐화하는 침전상을 형성하여 조성물을 형성하는 점에 도달한다. 공정의 이 양태는 중합체 담체 또는 중합체의 경화 공정으로서 언급한다. 유화제는 상을 경화하는 공정 동안 시스템 내에서 문제의 다양한 상들 사이의 계면 장력을 감소시키는 것을 돕는다. 대안으로, 코팅 중합체가 몇몇 고유의 표면 활성을 가지는 경우, 분리 계면활성제를 첨가할 필요는 없을 수 있다.
본 발명의 따른 캡슐화된 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정을 제조하는 데 유용한 유화제로는 본 명세서에서 예시한 바와 같은 폴리(비닐 알콜), 예컨대 계면활성제 및, 중합체 코팅 전항체 결정 또는 중합체 코팅된 결정 제제와 용액 사이의 표면 장력을 감소시킬 수 있는 기타의 계면활성제가 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정의 결정도는 캡슐화 공정 동안 유지된다. 결정도는 결정이 용해되지 않는 유기 용매를 사용함으로써 코팅 공정 동안 유지된다. 이 후에, 코팅 결정이 수성 용매로 이송된다면, 이전 단계에서의 중합체 담체의 빠른 경화와 결정의 충분한 코팅은 용해로부터 결정형 물질을 보호한다.
전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정을 코팅하기 위해 중합체 담체로서 사용되는 중합체는 단일중합체 또는 공중합체일 수 있다. 미소구의 가수분해율은 개별 중합체 종의 가수분해율에 의해 대량으로 측정된다. 일반적으로, 가수분해율은 다음과 같이 감소한다: 폴리카르보네이트 > 폴리에스테르 > 폴리우레탄 > 폴리오르토에스테르 > 폴리아미드. 생분해성 및 생체적합성 중합체를 개관하려면, 문헌[W.R Gombotz and D.K. Pettit, "Biodegradable polymers for protein and peptide drug delivery", Bioconjugate Chemistry, vol. 6, pp. 332-351(1995)]을 참조하라.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 중합체 담체는 단일 중합체 유형, 예컨대PLGA를 포함한다. 그 다음의 바람직한 구체예에서, 중합체 담체는 50% PLGA 및 50% 알부민과 같은 중합체의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따른 캡슐화된 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정을 제조하기 위해 중합체 담체로서 유용한 기타의 중합체로는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩티드), 폴리(에스테르), 예컨대 폴리(락트산) 또는 PLA, 폴리(b-히드록시부티레에이트), 폴리(카프롤락톤) 및 폴리(디옥산온); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(히드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 무수 말레산-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉(pluronic) 폴리올, 알부민, 알긴산염, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분 및 이의 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고당, 글리카미노글리칸, 황산화 다당류, 배합물 및 이의 공중합체로 구성된 군 중에서 선택되는 생체적합성/생분해성 중합체가 있다. 다른 유용한 중합체는 문헌(J. Heller and R.W. Balar, "Theory and Practice of Controlled Drug Delivery from Biodegradable Polymers, "Academic Press, New York, NY(1980); K.O.R. Lehman and D.K. Dreher, Pharmaceutical Technology, vol. 3(1979); E.M. Ramadan, A. El-Helw and Y. El-Said, Journal of Microencapsulation, vol. 4, pp. 125-132(1987); O. Phillai and R. Panchagnula, Current Opinion in Chemical Biology, vol. 5, pp 447-451(2001))에 기재되어 있다. 바람직한 중합체는 사용되는 특정 항체 결정 또는 항체 단편 결정과 캡슐화된 결정 또는 결정 제제의 의도된사용에 따라 좌우될 것이다. 대안으로, 용매 증발 기법은 전항체 결정 또는 항체 단편 결정을 캡슐화하기 위해 사용할 수 있다(D. Babay, A. Hoffmann and S. Benita, Biomaterials vol. 9, pp. 482-488(1988) 참조).
본 발명의 바람직한 구체예에서, 전항체의 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정은 본 명세서에서 예시한 바와 같이, 중합체, 예컨대 폴리락트산과 글리콜리산의 공중합체를 사용하여 이중 유액 방법을 사용하여 1 이상의 중합체 담체에서 캡슐화된다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 중합체는 폴리락트산과 글리콜리산의 공중합체("PLGA")이다. PLGA는 락트산("L") 및 글리콜산("G")과의 축중합 반응에 의해 제조된 공중합체이다. L 및 G의 다양한 비를 사용하여 PLGA 중합체의 결정도 및 소수성을 조절할 수 있다. 중합체의 고 결정도는 보다 느린 용해를 초래한다. 20 내지 70% G 함량을 갖는 PLGA 중합체는 비정질 고체인 경향이 있지만, G 또는 L의 고수치는 우수한 중합체 결정도를 초래한다. 문헌[D.K. Gilding and A.M. Reed, "Biodegradable polymers for use in surgery-poly(glycolic)/poly(lactic acid) homo and copolymers: 1., Polymer vol. 20, pp. 1459-1464(1981)]을 참조하라. PLGA는 에스테르 결합 가교의 가수분해에 의해 물에 노출된 후 분해되어 락트산 및 글리콜산의 비독성 단량체를 생성한다.
본 발명의 다른 구체예로는 이중벽 중합체 코팅된 미소구가 있다. 이중벽 중합체 코팅된 미소구는 염화메틸렌 또는 중합체를 용해시킬 수 있는 다른 용매 중에 2가지 분리 중합체 용액을 제조함으로써 생성시킬 수 있다. 전항체 결정 또는 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정은 용액들 중 하나에 첨가되고,분산된다. 여기서, 결정은 제1 중합체로 코팅된다. 그 다음, 제1 중합체 코팅 결정을 함유하는 용액을 제2 중합체 용액과 합한다[Pekarek, K.J.; Jacob, J.S. and Mathiowitz, E. Double-walled polymer microspheres for controlled drug release, Nature, 367, 258-260 참조]. 그 결과, 제2 중합체는 결정을 캡슐화하는 제1 중합체를 캡슐화한다. 이상적으로, 그 다음 이 용액은 계면활성제 또는 유화제를 함유하는 큰 부피의 수용액에 점적한다. 이 수용액에서, 용매는 2가지 중합체 용액으로부터 증발하고, 중합체들이 침전된다.
본 발명의 결정, 제제 또는 조성물을 용해함으로써 회수된 전항체 및 1본쇄 Fv 항체 단편 및 Fab 항체 단편은 2차 구조를 특징으로 할 수 있다. 또한, 이러한 전항체 결정 또는 단소 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정은 약 0.8 내지 약 1.0 인 푸리에 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼에 의해 측정된 가용성 항체 또는 항체 단편 대응물의 스펙트럼을 비교하는 상관 관계 스펙트럼에 의해 표시되는 바와 같이 β-시트 구조 함량을 특징으로 할 수 있다. 약 0.8 미만의 상관 관계 공계계수는 분자간 β-시트 2차 구조 함량이 증가하는 크기로 중수소화되어 단백질 응집 및 침전을 초래하는 단백질 샘플을 나타낸다.
본 발명을 더 잘 이해하기 위해서, 다음의 실시예를 제시한다. 이러한 실시예들은 단지 예시의 목적이고, 임의의 방법으로 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 해석하여서는 안된다.
발명의 개요
본 발명은 가장 안정한 형태, 즉 결정형의 활성 전항체 또는 이의 단편을 사용하여 전술한 장애를 극복한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 전항체 또는 이의 단편의 결정은 각종 생물의학용으로서 그 자체로 이용되거나 또는 제제나 조성물로서 이용된다. 본 발명의 또 다른 구체예들에 따르면, 전항체 또는 이의 단편의 결정이나, 또는 이들을 포함하는 제제 또는 조성물은 (1) 성분 또는 부형제를 결정에 첨가하여 안정화되거나, 또는 (2) 개체에게 전달하고 차후에 활성의 전항체를 방출시키기 위하여 각 결정을 포함하는 조성물을 생성하기 위해서 중합체 담체 내에서 캡슐화될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라서 임의의 전항체 또는 이의 단편을 이러한 방식으로 결정화 및/또는 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 각종 측면은 특히 유리하다.
첫째, 치료제 및 백신을 제조하기 위한 공정과 같은 임상적인 제조 공정에서 정제 단계 및/또는 농축 단계로서 대규모 결정화 단계를 도입할 수 있기 때문에, 저장된 물질의 결정도가 매우 중요하다. 또한, 대규모 결정화 단계는 제조 공정 중 일부 정제 단계들을 대체할 수 있다. 예를 들어, 전항체 결정화는 항체 제제 및 조성물을 능률적으로 제조할 수 있어서, 절차를 더욱 효율적이고 실시가능하게 한다.
둘째, 결정질 상태에서는 모든 반응 속도가 상당히 감소되기 때문에, 용액 중에서 발생하는 고분자 상호작용이 억제되거나 또는 상당히 감소된다. 따라서, 결정질 상태는 전항체 또는 이의 단편의 혼합물을 보관하는 데 매우 적합하다.
세째, 고체 결정질 제제는 쉽게 재구성되어 항체를 고농도로 포함하는 즉시 사용가능한(ready-to-use) 비경구 제제를 형성할 수 있다. 통상적으로, 피하 투여의 경우 1.5 ㎖ 이하의 주사 부피가 관용된다. 따라서, 주 단위로 1 ㎎/kg으로 투여되는 단백질의 경우, 50 ㎎/㎖ 이상의 단백질 농도가 필요하며 100∼200 ㎎/㎖가 바람직하다. 액상 샘플에서는 응집 및 점도와 관련된 문제가 있어서, 액상 제제에서 이러한 농도를 얻는 것은 어렵다. 대조적으로, 본 발명에 따른 결정질 제제, 또는 이의 제제 또는 조성물 중에서는 이러한 농도를 얻을 수 있다.
네째, 전항체 결정 또는 항체 단편의 결정은 약학 제형을 위한 특히 유리한 형태를 구성한다. 결정은 생체내 서방을 위한 기제로서 사용될 수 있다. 당업자는, 결정의 용해 및 활성의 방출에 결정 크기가 중요하다는 것을 알 것이다. 또한 당업자라면, 결정의 입자 크기가 실질적으로 균일하고 비결정질 침전물을 함유하지 않는 경우 항체 방출 속도가 한층 예측 가능해질 것임을 알 것이다. 따라서, 전항체 결정 또는 항체 단편 결정은, PCT 특허 출원 WO96/40049호에 개시된 것과 같은 이식가능한 장치에 사용되는 것이 유리할 수 있다. 이식 저장소는 일반적으로 25∼250 ㎕ 용적 범위내에 있다. 이렇게 용적에 제한이 있기 때문에, 현탁액 비히클의 양을 최소로 한 고농도(10% 이상) 제제가 바람직하다. 본 발명에 따른 전항체결정 또는 항체 단편의 결정은 고 농도에서는 비수성 현탁액으로 쉽게 제형화될 수 있다.
다섯째, 목적하는 위치에 항체를 전달한 후에 이를 서서히 방출시키기 위해 전항체 결정 또는 항체 단편의 결정, 및 이를 포함하는 제제 및 조성물을 사용하면 생체내에서 전항체 또는 항체 단편의 유효 생물학적 반감기(effective biological half-life)를 증가시킬 수 있어 유리하다.
여섯째, 전항체 결정 또는 항체 단편 결정의 또 다른 장점은, 일부 변수를 조작하여 경시적으로 고분자의 방출을 조정할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 용해시키기 위한 결정 크기, 형상 및 부형제와의 제형화와, 중합체 매트릭스로의 캡슐화를 모두 조작하여 항체용 전달 비히클을 생산할 수 있다.
전항체의 결정화 공정은 강력한 단백질 정제 또는 안정화 도구로서 작용할 뿐 아니라 가능한 가장 농축된 단백질 형태를 제공한다. 이러한 효과는 고 용량의 전항체 또는 이의 단편을 목적하는 전달 부위로 전달하는 데 상당히 유효하다. 또한, 개체에게 전달하기 위해서 전항체 또는 항체 단편의 결정 또는 결정 제제 또는 조성물을 사용하여 특정 개체의 필요에 부합하거나 또는 질병 진행에 따른 속도로 전항체 또는 이의 단편의 조절된 방출을 실시할 수 있다. 결정 용해 속도는 결정 형태, 결정 크기 및 부형제의 존재와 사용된 특정 캡슐화 기술 또는 중합체 제제에 따라 좌우되기 때문에, 결정질 전항체 또는 이의 단편은 무담체의 서방형 제형으로서 사용될 수 있다.
상온 또는 고온에서 용액으로 유지되는 경우 안정하지 않은 전항체 또는 이의 단편도, 본 발명의 방법에 따라 결정화된 경우 무수 결정질 형태로 상기 온도에서 장기간 성공적으로 저장할 수 있다.
다음의 실시예에서, 사용된 결정 스크리닝 키트(현가 액적으로부터 시딩하는경우)는 다음의 것 중 1 이상이다: Wizard I 및 Wizard II와 Cryo I 및 cryo II 키트(에머랄드 바이오스트럭쳐스 인코포레이티드; 미국 워싱톤주 베인브리지 아일랜드에 소재), 또는 Crystal Screen and Crystal Screen II 키트(햄튼 리서치; 미국 캘리포니아주 라구나 니구엘 소재). 전항체의 회분 결정화 또는 소량 회분 스크리닝은 적절한 결정화 완충액과 항체를 혼합한 후, 텀블링 또는 항온 처리(적시한 바와 같이 진탕하거나 하지 않음)함으로써 수행하였다. 예비 스크리닝에서 증발 확산 현가 액적 또는 소량 회분 스크리닝으로부터 얻은 항체 결정을 대부분의 경우에 사용하여 결정화 과정을 촉진하였다. 항체 결정은 이들의 복굴절을 측정함으로써 확인하였다.
실시예 1
리턱시맵
리턱시맵은 RituxanTM(제네테크 인코포레이티드; 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재)으로서 시중 구입 가능한 키메라 쥐과/인간 모노클로날 항체이다. 이 모노클로날 항체는 비 호지킨 림프종을 처리하는 데 넓게 사용되어 왔다. 리턱시맵은 정상 및 악성 B-림프구의 표면 상에서 CD20 항원에 결합하는 키메라 IgG1 카파 면역 글로불린이다. 이것은 쥐과 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 및 인간 일정 영역 서열로 구성된다. 리턱시맵 항체는 분자량(MW)이 약 145 kD이다.
리턱시맵 결정화, 회분 1:
물질:
A - 리턱시맵 항체(9.0 mg/㎖ 염화나트륨, 7.35 mg/㎖ 무수 시트르산나트륨, 0.7 mg/㎖ 폴리소르베이트 80 및 멸균수, pH 6.5 중에서 10 mg/㎖로 4℃에서 사용할 때까지 저장됨)
B - Wizard I 결정 스크리닝 키트(에머랄드 바이오스트럭쳐스 인코포레이티드; 미국 워싱톤주 베인브리지 아일랜드에 소재)
C - 폴리에틸렌 글리콜-1000(PEG-1000)
D - 이미다졸
E - 아세트산칼슘 완충액 pH 8.0
절차
리턱시맵 시드 결정은 Wizard I 스크리닝 키트를 사용하여 예비 스크리닝에서 증발 확산 액적으로부터 얻었다. 소량 회분 결정화는 20%(w/v) PEG-1000, 100 mM 이미다졸 및 200 mM 아세트산 칼슘, pH 8.0을 함유하는 결정화 완충액 500 ㎕를 사용하여 수행하였다. 현가 액적으로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽, 미국 팬실베이니아주 피츠버그 소재)에서 50 rpm으로 실온에서 밤새도록 텀블링하였다. 이 단계로부터 얻은 항체 결정은 본질적으로 규모 확대 소량 회분 절차인 대형 회분 결정화를 위한 시드로서 사용하였다. 대형 회분 결정화는 리턱시맵 용액 8 ㎖를 20%(w/v) PEG-1000, 100 mM 이미다졸 및 200 mM 아세트산 칼슘, pH 8.0을 함유하는 결정화 완충액 8 ㎖와 혼합함으로써 개시하였다. 용액 중의 리턱시맵의 최종 농도는 5 mg/㎖였다. 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩 한 후, 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 밤새도록 텀블링한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 주입한 리턱시맵 중 85%가 이 예에서 결정화되었다.
실시예 2
리턱시맵 결정화, 회분 2:
리턱시맵 결정은 결정화가 리턱시맵(10 mg/㎖) 500 ㎕를 20%(w/v) PEG-1000, 100 mM 이미다졸 및 200 mM 아세트산칼슘을 함유하는 동일한 부피의 결정화 완충액과 혼합함으로써 개시한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 얻었다. 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 밤새도록 텀블링한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 이 프로토콜을 pH 4.0, 5.0, 6.0 및 8.0에서 반복하였으며, 동일한 결과를 얻었다.
실시예 3
리턱시맵의 소량 회분 결정화 스크리닝:
리턱시맵 결정은 결정화가 리턱시맵(10 mg/㎖) 60 ㎕를 20%(w/v) PEG-600, 100 mM 아세트산칼슘 및 50 mM 2-[N-시클로헥실아미노]에탄술폰산(CHES), pH 9.5를 함유하는 동일한 부피의 결정화 완충액과 혼합함으로써 개시한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 얻었다. 용액 중의 리턱시맵의 최종 농도는 5 mg/㎖였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 벤치탑(benchtop) 진탕기/항온 처리기(뉴 런즈윅 사이언티픽, 모델 C25)에서 25℃에서 650 rpm으로 항온 처리하였다. 밤새도록 항온 처리한 후, 침상 클러스터(도 1)의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 주입한 리턱시맵 중 80%는 이 실시예에서 결정화되었다.
실시예 4
리턱시맵의 소량 회분 결정화 스크리닝:
리턱시맵 결정은 결정화가 리턱시맵(10 mg/㎖) 50 ㎕를 20%(w/v) PEG-1000 및 100 mM 아세트산칼슘을 함유하는 동일한 부피의 결정화 용액과 혼합함으로써 개시한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 얻었다. 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 두었다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리관에서 실온으로 연속 항온처리하였다. 밤새도록 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 아세트산 칼슘 농도는 10, 20, 40, 60, 80, 200 또는 400 mM으로 조절하면서 이 스크린을 반복하였으며, 결정은 테스트한 모든 조건 하에서 얻어졌다.
실시예 5
리턱시맵의 소량 회분 결정화 스크리닝:
리턱시맵 결정은 결정화가 리턱시맵(10 mg/㎖) 50 ㎕를 20%(w/v) PEG-1000 및 100 mM 아세트산칼슘을 함유하는 동일한 부피의 결정화 용액과 혼합함으로써 개시한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 얻었다. 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 두었다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 원심분리관에서 실온으로 연속 항온처리하였다. 밤새도록 항온 처리한 후, 침상클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. PEG-1000 농도를 5, 10, 15, 20 또는 40%(w/v)로 조절하면서 이 스크린을 반복하였으며, 테스트한 모든 조건 하에서 결정이 얻어졌다.
실시예 6
리턱시맵의 소량 회분 결정화 스크리닝:
리턱시맵 결정은 결정화가 리턱시맵(10 mg/㎖) 50 ㎕를 20%(w/v) PEG-6000, 100 mM 아세트산칼슘 및 100 mM 트리스, pH 8.0을 함유하는 동일한 부피의 결정화 완충액과 혼합함으로써 개시한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 얻었다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 벤치탑 진탕기/항온 처리기(뉴 런즈윅 사이언티픽, 모델 C25)에서 25℃에서 225 rpm으로 항온 처리하였다. 밤새도록 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. PEG-6000(PEG 농도를 20%를 유지함)을 PEG-2000, PEG-4000 또는 PEG-8000으로 대체하여 이 실시예를 반복하였으며, 테스트한 모든 조건 하에서 결정이 얻어졌다. 도 1을 참고하라.
실시예 7
리턱시맵의 소량 회분 결정화 스크리닝:
리턱시맵 결정은 결정화가 리턱시맵(10 mg/㎖) 60 ㎕를 20%(w/v) PEG-6000, 100 mM 아세트산칼슘 및 100 mM 트리스, pH 8.0을 함유하는 동일한 부피의 결정화 완충액과 혼합함으로써 개시한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 얻었다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 벤치탑진탕기/항온 처리기(뉴 런즈윅 사이언티픽, 모델 C25)에서 25℃에서 650 rpm으로 항온 처리하였다. 밤새도록 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. PEG-6000(PEG 농도를 20%를 유지함)을 PEG-200, PEG-300 또는 PEG-20000으로 대체하여 이 스크린을 반복하였다. 140 mM(100 mM 대신) 트리스는 PEG-200을 사용하는 스크린을 위해 사용하였다. 테스트한 모든 조건 하에서 결정이 얻어졌다.
실시예 8
리턱시맵의 소량 회분 결정화 스크리닝:
리턱시맵 결정은 결정화가 리턱시맵(10 mg/㎖) 50 ㎕를 20%(w/v) PEG-1000 및 200 mM CuSO4, 및 100 mM 이미다졸, pH 8.0을 함유하는 동일한 부피의 결정화 완충액과 혼합함으로써 개시한 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 얻었다. 혼합물을 실온에서 14 시간 동안 두고, 혼합물을 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 실온에서 항온처리하였다. 밤새도록 항온 처리한 후, 막대형의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 이어서, 200 mM CuSO4을 다른 2가 양이온, 예컨대 200 mM CaCl2, MnCl2또는 ZnCl2로 대체하여 이 스크린을 반복하였으며 침상 클러스터, 디스크 및 반 결정의 형태의 결정을 얻었다.
실시예 9
투석된 리턱시맵을 사용하는 리턱시맵 결정화
리턱시맵(10 mg/㎖) 4 ㎖ 분액을 4℃에서 밤새도록 탈이온수를 2회 교체하면서 탈이온수 2 ℓ에 대해 투석하고, 원심 분리 필터 장치(밀리포어, 30 kD 컷-오프)로 1 ㎖로 농축시켰다. 결정화는 유기 커버 슬라이드 상에서 진한 리턱시맵 6 ㎕를 20%(w/v) PEG-1000 및 100 mM 이미다졸, 200 mM 아세트산칼슘, pH 8.0을 함유하는 결정화 완충액 2 ㎕와 혼합시킴으로써 현가 액적으로 수행하였다. 커버 슬라이드는 웰 상에 플립(flip)하고, 두었으며, 이 웰은 24-웰 플레이트에서 동일한 완충액 450 ㎕를 함유하였다. 약 1 주 동안 실온에서 플레이트를 항온 처리 한 후, 입방체의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 10
투석된 리턱시맵을 사용하는 리턱시맵 결정화
리턱시맵(10 mg/㎖) 5 ㎖ 분액을 4℃에서 밤새도록 10 mM Hepes 완충액 2 ℓ에 대해 투석하고, 원심 분리 필터 장치(밀리포어, 10 kD 컷-오프)로 54 mg/㎖로 농축시켰다. 회분 결정화는 진한 리턱시맵 20 ㎕를 완충액 및 첨가제와 혼합함으로써 수행하였는데, 최종 혼합물은 36 mg/㎖ 항체, 133 mM Hepes, pH 7.50, 66 mM CaCl2및 13% 2-메틸-2,4-펜탄디올을 함유하였다. 혼합물은 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 48 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 이 실시예에서, 주입한 리턱시맵 중 84%가 결정화되었다.
실시예 11
투석된 리턱시맵을 사용하는 리턱시맵 결정화
리턱시맵(10 mg/㎖) 5 ㎖ 분액을 4℃에서 밤새도록 10 mM Hepes 완충액, pH 7.0, 2 ℓ에 대해 투석하고, 원심 분리 필터 장치(밀리포어, 10 kD 컷-오프)로 54 mg/㎖로 농축시켰다. 회분 결정화는 진한 리턱시맵 20 ㎕를 완충액 및 첨가제와 혼합함으로써 수행하였는데, 최종 혼합물은 18 mg/㎖ 항체, 200 mM Hepes, pH 7.50, 200 mM CaCl2및 33% PEG-400을 함유하였다. 혼합물은 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 48 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 12
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 80 ㎕를 0.02 M CaCl2, 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.6, 30% 2-메틸-2,4-펜탄디올과 혼합하고, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링함으로써 결정화하였다. 실온에서 48 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 13
세제의 존재 하에서 리턱시맵 결정화:
리턱시맵은 리턱시맵 450 ㎕를, 20%(w/v) PEG-1000, 100 mM 이미다졸, 200 mM 아세트산칼슘, pH 8.0 및 0.1% Tween(등록 상표) 80(세제; 시그마-알드리치)를 함유하는 동일한 부피의 결정화 완충액과 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 밤새도록 텀블링한 후, 침상 클러스터의 형태의 결정이 형성되었다. 또한, 리턱시맵은 50 ㎕ 내지 1.0 ㎖ 범위의 출발 부피를 사용하여 결정화시켰다. 동일한 유형의 결정이 형성되었다.
실시예 14
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 50 ㎕를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.6, 30% PEG 400의 50 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 15
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 50 ㎕를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M 이미다졸, pH 8.0, 10% PEG 8000의 50 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 16
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 50 ㎕를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M 트리스, pH 7.0, 20% PEG 3000의 50 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 17
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 50 ㎕를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M MES, pH 6.0, 20% PEG 8000의 50 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 18
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 50 ㎕를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M 이미다졸, pH 8.0, 35% 2-에톡시에탄올의 50 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 19
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 50 ㎕를 0.5 M 아세트산칼슘, 0.1 M 아세테이트, pH 4.5, 40% 1,2-프로판디올의 50 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 20
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 50 ㎕를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M HEPES, pH 7.5, 40% PEG 400의 50 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 21
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 4 ㎖를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M 트리스, pH7.0, 20% PEG 6000 및 0.1% Tween(등록 상표) 80(시그마-알드리치)을 함유하는 시약 4 ㎖와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 이 방법에 의한 수율은 93%였다.
실시예 22
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 1 ㎖를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M MES, pH 6.0, 20% PEG 6000 및 0.1% Tween(등록 상표) 80(시그마-알드리치)을 함유하는 시약 1 ㎖와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 이 방법에 의한 수율은 80%였다.
실시예 23
리턱시맵 결정화:
리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 10 ㎕를 0.2 M 아세트산칼슘, 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.6, 30% 2-프로판올의 10 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 24
리턱시맵 결정화:
투석된 리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 10 ㎕를 0.02 M CaCl2, 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.6, 30% 2-메틸-2,4-펜탄디올의 20 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 25
리턱시맵 결정화:
투석된 리턱시맵(10 mg/㎖)는 항체 10 ㎕를 0.2 M CaCl2, 0.1 M HEPES, pH 7.5, 28% PEG-400의 20 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 26
리턱시맵 결정화 - 상이한 결정 형태:
리턱시맵(20 mg/㎖)는 항체 10 ㎕를 15% PEG 400, 0.51 M 황산나트륨, 0.1 M EDTA를 함유하는 용액 10 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 현가 액적으로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다. 이 실시예에서, 주입한 리턱시맵 중 85%가 결정화되었다. 도 4를 참고하라.
실시예 27
리턱시맵 결정화 - 상이한 결정 형태:
리턱시맵(20 mg/㎖)는 항체 10 ㎕를 12% PEG 400, 1.36 M 황산나트륨 및 0.1 M 트리스, pH 7.5를 함유하는 용액 10 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이전에 얻은 소량 회분로부터 리턱시맵 시드 결정으로 시딩한 후, 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 225 rpm으로 텀블링하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 침상 클러스터의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다.
실시예 28
리턱시맵 결정화 - 상이한 결정 형태:
투석된 리턱시맵(66 mg/㎖)는 항체 10 ㎕를 0.2 M CaCl2, 0.1 M HEPES, pH 7.5, 28% PEG 400을 함유하는 용액 20 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 20 일 후,PEG 400(100% PEG 400 30 ㎕) 및 1 M 황산리튬 10 ㎕를 더 첨가하였다. 실온에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 입방체의 형태의 리턱시맵 결정이 형성되었다(도 3).
실시예 29
결정 #1의 형태학
리턱시맵의 상이한 형태는 상이한 결정화 조건을 사용함으로써 얻었다. 예를 들면, 도 1 및 도 3으로부터의 리턱시맵 결정을 참고하라.
실시예 30
결정 #2의 형태학
결정화:
완충액: 100 mM Hepes, pH 7.7, 12% PEG 400, 1.17 M 황산나트륨.
방법:1 부피 리턱시맵을 2 부피 결정화 완충액과 혼합하였다. 이 혼합물을 결정이 형성될 때까지 실온에서 교반없이 유지하였다.
결과: 소형(길이≤10 ㎛) 침상 등의 결정이 형성되었다(도 4).
실시예 31
트라스투즈맵
트라스투즈맵은 HerceptinTM(제네테크 인코포레이티드; 미국 사우스 샌프란시스코에 소재)로서 시중 구입할 수 있는 재조합 DNA-유도 인간 모노클로날 항체이다. 이 모노 클로날 항체는 상피 성장 인자 수용체 2 단백질, HER2의 세포외 영역을 과발현시키는 유방암을 치료하는 데 광범위하게 사용되어왔다. 트라스투즈맵은 HER2에 결합하는 쥐과 항체(4D5)의 상보성 결정 영역을 갖는 인간 골격 영역을 포함하는 IgG1 카파이다.
트라스투즈맵 소량 회분 결정화,
회분 1:
트라스투즈맵 항체를 멸균 동결 건조된 분말로서 초기 440 mg 바이알 내에 저장한 후, 멸균수 20 ㎖ 중에 용해시켰다. 용해된 트라스투즈맵 용액은 22 mg/㎖ 트라스투즈맵, L-히스티딘 HCl 9.9 mg, 6.4 mg L-히스티딘, α,α-트레할로스 이수화물 400 mg 및 폴리소르베이트 20 1.8 mg, USP를 포함하였다.
0.495 mg/㎖ L-히스티딘 HCl, 0.32 mg/㎖ L-히스티딘, 20 mg/㎖ α,α-트레할로스 이수화물 및 0.09 mg/㎖ 폴리소르베이트 20, USP를 함유하는 완충액 중의 트라스투즈맵(22 mg/㎖)의 분액 210 ㎕를 25% PEG 400, 5% PEG 8000, 100 mM 트리스, pH 8.5, 10% 프로필렌 글리콜 및 0.1% Tween(등록상표) 80(시그마-알드리치)을 함유하는 결정화 완충액 210 ㎕와 혼합하고, 실온에서 밤새도록 항온 처리하였다. 용액 중의 트라스투즈맵의 최종 농도는 11 mg/㎖였다. 그 다음, 이 혼합물을 현가 액적으로부터 얻은 트라스투즈맵 결정으로 시딩하고, 프로필렌 글리콜 20 ㎕를 보충한 후, 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 트라스투즈맵 결정은 다음날에 얻었다(도 5). 주입한 트라스투즈맵 중 85%가 이 방법에 의해 결정화되었다.
실시예 32
트라스투즈맵 소량 회분 결정화, 회분 2:
0.495 mg/㎖ L-히스티딘 HCl, 0.32 mg/㎖ L-히스티딘, 20 mg/㎖ α,α-트레할로스 이수화물 및 0.09 mg/㎖ 폴리소르베이트 20, USP를 함유하는 완충 용액 중의 트라스투즈맵(22 mg/㎖)의 분액 50 ㎕를 25% PEG 300, 10% 글리세롤, 0.1 M 트리스, pH 7, 10% PEG 8000을 함유하는 결정화 완충액 50 ㎕와 혼합하고, 소량 회분로부터 얻은 틀스투주마브 결정으로 시딩한 후 실온에서 밤새도록 항온 처리하였다. 크기가 50 내지 120 ㎛ 범위인 트라스투즈맵 결정을 다음날 얻었다(도 6).
실시예 33
트라스투즈맵 소량 회분 결정화, 회분 3
0.495 mg/㎖ L-히스티딘 HCl, 0.32 mg/㎖ L-히스티딘, 20 mg/㎖ α,α-트레할로스 이수화물 및 0.09 mg/㎖ 폴리소르베이트 20, USP를 함유하는 완충액 중의 트라스투즈맵(22 mg/㎖)의 분액 50 ㎕를 25% PEG 300, 10% 글리세롤, 0.1 M 트리스, pH 7, 10% PEG 8000을 함유하는 결정화 완충액 50 ㎕와 혼합하고, 소량 회분로부터 얻은 트라스투즈맵 결정으로 시딩한 후 실온에서 밤새도록 항온 처리하였다. 크기가 약 20 ㎛인 트라스투즈맵 결정을 다음날 얻었다.
실시예 34
인플릭시맵
인플릭시맵은 RemicadeTM(센토코르; 네덜란드 레이덴에 소재)으로서 시중 구입할 수 있는 키메라 쥐과/인간 모노클로날 항체이다. 이 모노클로날 항체는 류마티즘성 관절염 및 콘 질환(Crohn's disease)을 처리하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 이플릭시마브는 TNF-α 항원에 결합하는 키메라 IgG1 카파 면역 글로불린이다. 이것은 쥐과 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열과 인간 일정 영역 서열로 구성된다. 인플릭시맵 항체는 분자량(MW)이 약 149 kD이다.
인플릭시맵 소량 회분 결정화, 회분 1
인플릭시맵 항체는 멸균 동결 건조 분말로서 초기 100 mg 바이알에 저장한 후, 멸균수 2 ㎖ 중에 용해시켰다. 인플릭시맵 100 mg, 수크로스 500 mg, 폴리소르베이트 80 0.5 mg, 일염기 인산나트륨 2.2 mg 및 이염기 인산나트륨 6.1 mg을 함유하는 용해된 용액을 결정화를 위해 사용하였다.
인플릭시맵은 항체(50 mg/㎖) 50 ㎕를 35% 에톡시에탄올, 0.2 M 황산리튬, 0.1 M 트리스, pH 8.6의 100 ㎕와 혼합함으로써 결정화하였다. 이 혼합물을 혈액학/화학 혼합기(모델 346, 피셔 사이언티픽)에서 실온에서 50 rpm으로 텀블링하였다. 밤새도록 항온 처리한 후, 막대형 클러스터의 형태의 인플릭시맵 결정이 형성되었다(도 2).
실시예 35
인플릭시맵 소량 회분 결정화, 회분 2:
또한, 실시예 34의 것과 유사한 막대형 결정은 인플릭시맵을 동일한 조건 하에서 40%(w/v) PEG-400, 0.1 M 트리스 완충액, 200 mM 황산리튬, pH 8.5로 항온 처리(교반 없음)하는 때 얻었다.
실시예 36
인플릭시맵 소량 회분 결정화 회분 3:
인플릭시맵(0.1 M 트리스 HCl 완충액, pH 7.0 중의 50 mg/㎖)의 분액 25 ㎕를 1 M 염화칼슘 3 ㎕ 및 100% 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 550(PEG MME 550) 5 ㎕과 혼합하고, 실온에서 밤새도록 항온 처리(교반 없음)하였다. 인플릭시맵의 입방형 결정이 밤새도록 형성되었다.
실시예 37
인플릭시맵 소량 회분 결정화
인플릭시맵(물 중의 20 mg/㎖)의 분액 25 ㎕를 20% PEG 300, 0.1 M 트리스, pH 8.5, 5% PEG 8000 및 10% 글리세롤을 함유하는 결정화 완충액 50 ㎕로 혼합하였다. 용액 중의 인플릭시맵의 최종 농도는 6.7 mg/㎖였다. 그 다음, 이 혼합물을 실온에서 밤새도록 항온 처리(교반 없음)하였다. 인플릭시맵의 별모양 결정이 일주일 후에 형성되었다(도 7).
실시예 38
상기 예시한 결정화 조건은 임의의 바람직한 임상적으로 적절한 항체의 결정화를 위해 유용하다. 임상적으로 적절한 항체는 이들을 사용하는 치료 분야에 따라 분류될 수 있다. 이러한 항체로는 다음에 것을 비롯한(이에 한정되는 것은 아님) 시중 구입 가능한 항체가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
(1) 앱사익시맵(ReoProTM) (항-GPIIB/IIIa 수용체; 심혈관 질환의 치료용) (센토코르; 네덜란드 라이덴 소재);
(2) 팔리비즈맵(SynagisTM) (RSV 상의 항-F 단백질; 호흡기 질환) (MedImmune 제조; 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재);
(3) 뮤로모냅-CD3(OrthocloneTM) (항-CD3 항체; 조직 이식 거부용) (오르토바이오테크; 미국 뉴저지주 라리탄 소재);
(4) 겜트즈맵 오조가마이신(MylotargTM)(암(항-CD33 항체)) (예쓰 랩스; 미국 팬실베이니아주 필라델피아 소재);
(5) 트라스투즈맵(HerceptinTM)(암(항-HER2 항체)) (제네테크, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재);
(6) 바실릭시맵(SimulectTM) (항-CD25 항체; 조직 이식 거부용) (노바티스, 스위스 바젤 소재);
(7) 다클리즈맵(ZenapaxTM) (항-CD25 항체; 조직 이식 거부용) (프로틴 디자인 랩스, 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재);
(8) 에타네르셉트(ENBRELTM) (염증성 질환) (이뮤넥스, 미국 워싱톤주 시애틀 소재);
(9) 이브리투모맵 티욱세탄(ZevalinTM) (암에 대한 방사선 면역 치료) (IDEC 파마슈티칼즈, 미국 캘리포이나주 샌디에고 소재).
실시예 39
상기 예시한 결정화 조건은 항체의 1본쇄 Fv (scFv) 단편의 결정화 또는 항체의 Fab 단편의 결정화에 유용하다.
실시예 40
면역글로불린의 기타 클래스
본 발명의 모든 구체예는 모든 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 및 혈청 IgA(sIgA)뿐만 아니라 하위클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgM1 및 IgM2, 그리고 IgA1 및 IgA2의 결정화 및 결정의 사용에 유용하다.
실시예 41
모노클론 항체 정제에 대한 도구로서의 결정화
그 중에서도 특히 리턱시맵, 인플릭시맵 및 트라스투즈맵을 포함하는 모노클로날 항체는 포유류 세포 배양으로부터 얻을 수 있다. 이러한 모노클로날 항체의 결정화는 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 직접 또는 부분 또는 완전 정제 후에 수행할 수 있다. 결정화는 이러한 단계 중의 정제 방법으로서 사용할 수 있다.
유사한 양태에서, 모노클로날 항체는 그 중에서도 특히 다음의 것을 비롯한 다른 공급원으로부터 결정화를 사용하여 정제할 수 있다: 곤충 세포 배양물; 박테리아 세포 배양물; 그 중에서도 특히 트랜스게닉 옥수수(maize), 담배, 감자 및 옥수수(corn)를 비롯한 트랜스게닉 식물 부분, 그 중에서도 특히 종자, 꽃, 잎 및 뿌리/괴경을 비롯한 식물 부분; 및 그 중에서도 특히 트랜스게닉 소, 말, 돼지, 닭, 염소 및 양을 비롯한 트랜스게닉 동물의 우유, 혈청, 혈장, 난 및 기타 부위.
항체의 결정화는 정제 전에 세포 추출물로부터 직접 또는 부분 또는 완전 정제 후에, 즉 우유로부터 직접 또는 공정의 임의 단계에서 관심 대상의 단백질의 정화 또는 부분 정제 후에 수행할 수 있다.
방법:
예컨대 트라스투즈맵(22 mg/㎖) 1 ℓ를 비이커에서 25% PEG400, 5% PEG8000, 100 mM 트리스, pH 8.5, 10% 프로필렌 글리콜 및 0.1% Tween(등록 상표) 80(시그마-알드리치)을 함유하는 결정화 완충액 1 ℓ와 혼합하였다. 그 다음, 혼합물을 실온에서 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하면서 밤새도록 항온처리하였다. 그 다음, 용액을 현가 액적 또는 소량 회분로부터 얻은 트라스투즈맵 결정으로 시딩하였다. 프로필렌 글리콜 100 ㎖를 가하고, 결정이 형성될 때까지(대략 24 시간 동안) 혼합물을 교반하였다.
실시예 42
우유로부터의 결정화에 의한 항체의 정제
우유를 37℃에서 해동하고, 7000 x g로 15 분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 탈지하였다. 그 다음, 크림색 층을 예리한 피펫 끝을 사용하여 천공하고, 탈지 우유를 개구를 통하여 깨끗한 튜브로 경사분리하였다. 그 다음, 탈지 우유를 동일 부피의 250 mM EDTA로 희석하였다. 유백색 외관을 처리하였는데, 이는 미셀 구조 및 응집물의 분해를 가리키는 것이다. EDTA 정화 탈지 우유를 PBS에 대하여 투석하여 EDTA를 제거하였다. 그 다음, 정화된 우유를 대략 5 내지 10 mg/㎖의 최종 농도로 모노클로날 항체 용액에 첨가하였다. 그 다음, 첨가된 우유로부터의 모노클로날 항체를 폴리에틸렌 글리콜 단독 또는 염, 예컨대 황산암모늄과의 조합을 사용하여,또는 다양한 염, 완충제, 유기 용매 등을 사용하는 전술한 임의의 결정화 조건을 사용하여 결정화하였다.
실시예 43
트랜스게닉 동물, 트랜스게닉 동물 산물 및 트랜스게닉 식물로부터의 모노클로날 항체의 결정화
당업자라면, 실시예 41 및 42에 나타낸 방법을 사용하여 트랜스게닉 동물(세포, 조직 추출물 등으로부터), 트랜스게닉 동물 산물(예컨대, 난 등) 및 트랜스게닉 식물(식물 세포 및 조직 추출물 등)로부터 결정화에 의하여 모노클로날 항체를 정제할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 44 및 45에서, 결정화된 리턱시맵의 순도 및 구조는 환원 및 비환원 조건 하에서 HPLC 및 SDS-PAGE 상의 용해된 리턱시맵을 분석함으로써 평가하였다.
실시예 44
실시예 1에서 얻은 결정으로부터 용해된 리턱시맵을 β-메르캅토에탄올의 존재없이, 4-20% 구배 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. 겔 전기영동으로부터 β-메르캅토에탄올의 누락은 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 중쇄 및 경쇄의 해리를 방지하기 위한 것이었다. 천연 리턱시맵을 대조군과 동일한 조건 하에서 분석하였다.
결과:
천연 및 용해된 리턱시맵 둘 다는 비환원 조건 하에서 단일 단백질 밴드를 나타내었으며, 분자량은 전체 리턱시맵 모노클로날 항체에 대한 정확한 크기인 대략 150 kD와 동일하였다.
이 프로토콜은 환원 조건을 사용하여(β-메르캅토에탄올을 사용함) 반복하였다. 천연 리턱시맵을 대조군과 동일한 조건 하에서 분석하였다.
결과:
환원 조건 하에서 천연 및 용해된 리턱시맵 둘 다에 대하여, 겔은 각기 모노클로날 항체 중쇄 및 경쇄에 대한 정확한 크기인 약 60 kD 및 약 25kD에서 두 개의 밴드를 나타내었다.
실시예 45
HPLC에 의한 리턱시맵 결정의 순도 및 크기 분석
실시예 1로부터 얻은 결정으로부터 천연 리턱시맵 및 용해된 리턱시맵의 순도 및 크기는 HPLC(시마즈, LC-10AD) 시스템 상의 크기 배제 칼럼(BIOSEP-SEC S3000, 페노메넥스, 미국 캘리포니아주 토렌스 소재)으로 실행 완충액으로서 100 mM 인산칼륨, pH 7.5 및 일정 유속 0.5 ㎖/분으로 분석하였다. 천연 및 용해된 리턱시맵 둘 다를 단일 단백질 피크로서 칼럼으로부터 용출시켰는데, 이는 결정화 과정이 리턱시맵 항체의 구조적 일체성을 변경시키지 않았음을 가리킨다.
실시예 46
천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵의 동력학적 광 산란 특성화
실시예 21에서와 같이 제조된 리턱시맵 결정으로부터 가용성 리턱시맵 및 용해된 리턱시맵을 25 mM 트리스, pH 7.0, 150 mM 염화나트륨 및 0.1% Tween(등록 상표) 80(시그마-알드리치)(최종 단백질 농도는 대략 1 mg/㎖과 같음)에 용해시키고, Precision/Acquire 및 Precision/Analyze가 장착된 PD2000 동력학적 광 산란 검출기(프리시젼 디텍터즈, 미국 매사추세츠주 프랭클린 소재) 상에서 분석하였다. 천연(가용성) 리턱시맵(10 mg/㎖)를 비교를 위해 탈이온수로 20 배 희석시켰다.
결과:
가용성 및 용해된 리턱시맵에 대한 유체역학적 반경이 동일하였으며, 이는 결정화 과정이 리턱시맵 항체의 이러한 특징을 변경하지 않았음을 가리킨다. 또한, 이 실시예는 유체역학적 반경의 측정으로부터 판단한 바와 같이, 단백질 응집이 결정화 중에 일어나지 않은 것으로 나타났다.
실시예 47
천연(가용성) 및 용해된 트라스투즈맵의 동력학적 광 산란 특성화
실시예 31에서와 같이 제조한 트라스투즈맵 결정은 25 mM Tris, pH 7.0, 150 mM 염화나트륨 및 0.1% Tween(등록 상표) 80(시그마-알드리치)에 용해시켰다. 최종 단백질 농도를 대략 1 mg/㎖로 조정하였다. 그 다음, 용해된 트라스투즈맵 결정을 Precision/Acquire 및 Precision/Analyze가 장착된 PD2000 동력학적 광 산란 검출기(프리시젼 디텍터즈, 미국 매사추세츠주 프랭클린 소재) 상에서 분석하였다. 천연(가용성) 트라스투즈맵(22 mg/㎖)를 비교를 위해 탈이온수로 20 배 희석시켰다.
결과:
가용성 및 용해된 트라스투즈맵에 대한 유체역학적 반경 및 분자량이 동일하였으며, 이는 결정화 과정이 리턱시맵 항체의 이러한 특징을 변경하지 않았음을 가리킨다. 또한, 이 실시예는 유체역학적 반경의 측정으로부터 판단한 바와 같이, 단백질 응집이 결정화 중에 일어나지 않은 것으로 나타났다.
실시예 48
실시예 1에서 20%(w/v), PEG-1000, 100 mM 이미다졸 및 200 mM 아세트산칼슘, pH 7.0으로 결정화시킨 침상 클러스터 리턱시맵 결정은 Coulter LS 입도 분석기로 특성화한 바, 중선이 72 ㎛이고, 크기 범위가 50 내지 150 ㎛인 것으로 측정되었다.
실시예 49
천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵의 펩티드 맵핑 비교
25 mM Tris, pH 7.0 및 Tween(등록 상표) 80(시그마-알드리치) 중의 리턱시맵(가용성 또는 실시예 1로부터의 결정) 10 mg/㎖의 500 ㎕ 분액을 트립신 167 ㎍과 혼합하고, 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 각각의 분해된 샘플을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켜 여과하고, 200 ㎕ 분액을 Shimazu LC10AD 시스템 상에서 0.1% 트리플루오로아세트산으로 수분 보충하여 평형화시킨 C-8 역상(Vydac, 미국 캘리포니아주 헤스페리아 소재) HPLC 칼럼에 로딩하였다. 결합된 펩티드를 0-70% 아세토니트릴 구배로 70 분에 걸쳐서 0.9 ㎖/분으로 용출시켰다.
결과:
유사한 프로필이 가용성 및 재용해된 리턱시맵에 대하여 얻어졌는데, 이는 결정화 과정으로 인한 리턱시맵의 형태, 구조 또는 크기 변화가 없음을 가리킨다.
실시예 50
천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵 및 트라스투즈맵의 N-말단 서열 결정
항체, 예컨대 리턱시맵 및 트라스투즈맵이 결정 상태에서 말단 분해를 받지않는다는 것을 설명하기 위하여, 각기 실시예 21 및 31에 따라 제조된 리턱시맵 및 트라스투즈맵 결정 및 이들의 가용성 대응부에 대하여 다음을 수행하였다.
N-말단 서열화는 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드(ABI) 447A 자동 단백질 서열 결정기를 사용하여 수행하였다. 각각의 샘플을 서열 결정기에 놓여 있는 유리 섬유 디스크에 로딩하고, 1회 예비 순환시켰다. 예비 순환 단계 후, 다수의 에드만 분해 사이클을, ABI로부터의 표준 단백질 서열 결정 프로그램을 사용하여 수행하였다. 결과는 각각의 사이클에 대하여 검출된 주 페닐티오히단토닌(PTH)-아미노산으로서 기록하였다(20 개의 통상 발생하는 아미노산에 대한 표준 1 문자 기호를 사용하여 생성된 서열을 기록하였다. 이들은 다음과 같다: A = 알라닌; C = 시스테인; D = 아스파르트산; E = 글루탐산; F = 페닐알라닌; G = 글리신; H = 히스티딘; I = 이소루신; K = 리신; L = 루신; M = 메티오닌; N = 아스파라긴; P = 프롤린; Q = 글루타민; R = 아르기닌; S = 세린; T = 트레오닌; V = 발린; W = 트립토판; Y = 티로신).
결과:
트라스투즈맵:
트라스투즈맵 형태 항체 사슬 N-말단 서열
결정 중쇄 E-V-Q-L-V-G-S
결정 경쇄 D-I-Q-M-T-Q-S
가용성 중쇄 E-V-Q-L-V-G-S
가용성 경쇄 D-I-Q-M-T-Q-S
리턱시맵:
리턱시맵 형태 항체 사슬 N-말단 서열
결정 중쇄 차단됨
결정 경쇄 Q-I-V-L-S-Q-S
가용성 중쇄 차단됨
가용성 경쇄 Q-I-V-L-S-Q-S
결과는 결정화 과정이 트라스투즈맵 또는 리턱시맵 항체의 N-말단 아미노산 분해를 초래하는 것으로 나타났다.
실시예 51
천연(가용성) 및 용해된 트라스투즈맵의 PAS(과요오드산 - 쉬프 시약) 총 탄수화물 염색
방법:
실시예 31에 따라 제조된 결정화 트라스투즈맵뿐만 아니라, 그 가용성 대응부(제조자에 의해 공급됨)의 투석 샘플 2 ㎍(둘 다 10% β-메르캅토에탄올로 환원시킨 것 및 환원시키지 않은 것)을 SDS-PAGE 겔 상에서 실행하였다. 겔을 웨스턴 블롯에 의하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 바이오라드 면역-블롯 염색 키트를 사용하여, 항체(및 환원된 샘플의 경우 항체의 중쇄)에 부착된 탄수화물 부분을 염색하고, 시각화하였다. 구체적으로, 겔을 40% 메탄올, 7% 아세트산으로 30 분 동안 고정하고, 이 용액으로 4회 세척한 다음, 새로운 용액에 밤새도록 방치하였다. 다음 날, 겔을 1% 과요오드산, 3% 아세트산으로 산화시키고, 이어서 이중 증류(dd) H2O로 각기 10 분 동안 10 회 세척하여 과요오드산을 제거하였다. 겔을 암소에서 쉬프 시약으로 약 1 시간 동안 항온처리하여 염색을 현상한 다음, 스캐닝하였다.
결과:
가용성 및 결정 트라스투즈맵 둘 다는 결정 항체의 비환원 샘플 내 경쇄 고분자량 밴드를 제외하고는 겔 상에서 거의 동일한 것으로 나타났다. 환원된 샘플에서, 탄수화물은 예상한대로 항체의 중쇄와 관련있었다.
실시예 52
천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵의 PAS(과요오드산 - 쉬프 시약) 총 탄수화물 염색
방법:
이 방법은 실시예 51에서와 같이 수행하였다.
결과:
리턱시맵의 가용성 및 결정화 샘플은 겔 슬래브 상에서 동일한 것으로 나타났으며, 탄수화물은 환원된 샘플 내 항체의 중쇄와 관련있었다.
실시예 53
천연(가용성) 및 용해된 트라스투즈맵 및 리턱시맵의 N-결합 올리고당 프로필링(Profiling)
N-결합된 올리고당 프로필링은 바이오라드 N-결합된 올리고당 프로필링 키트(카탈로그 # 170-6501)를 사용하여 달성하였다. 트라스투즈맵 및 리턱시맵의결정화 샘플(각기 실시예 31 및 21로부터)을 세척하고, 용해시켰으며, ddH2O에 대하여 투석하고, 가용성 트라스투즈맵 및 리턱시맵의 샘플(제조자에 의해 공급됨)을 ddH2O에 대하여 투석하였다. 각각의 샘플의 200 ㎍ 분액을 동일 부피의 방출 완충액과 혼합하고, 5% 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 1 ㎕, 10% β-ME 1.5 ㎕ 및 NP-40(Tergitol) 4 ㎕를 사용하여 실온에서 변성시켰다. 이어서, PNGase(아스파라긴 결합 올리고당을 개열하는 효소) 2 ㎕를 각각의 샘플에 가하고, 샘플을 37℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 그 다음, 단백질을 3 부피의 냉각 에탄올로 침전시키고, 샘플을 스피닝하였으며, 상청액(올리고당을 함유함)를 회수하고, 동결 건조시켰다. 샘플을 재구성하고, 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리술폰산으로 37℃에서 밤새도록 형광 표지하였다. 샘플을 다시 동결 건조시키고, H2O 및 2X 샘플 완충액으로 재구성하였다. 올리고당은 N-결합 올리고당 프로필링 겔과 바이오라드로부터의 완충액을 사용하여 겔 전기 영동으로 실행하고, 겔은 장파장 UV 투시기를 사용하여 시각화하였다.
N-결합 올리고당
N-결합 올리고당을 항체로부터 개열하고, 바이오라드 N-결합 올리고당 프로필링 키트를 사용하여 형광 염색하였다. 샘플의 좌측에 대한 글루코스 래더 표준 실행으로 올리고당의 상대 위치를 밝혀내었다.
결과:
결정 및 가용성 리턱시맵 및 트라스투즈맵에 대한 밴드는 동일한 것으로 나타났는데, 이는 결정화가 출발 물질과 관련된 올리고당기 변화를 유발하지 않았다는 것을 시사한다.
실시예 54
천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵 및 트라스투즈맵의 단당류 구성성분
천연(가용성) 리턱시맵 및 트라스투즈맵의 단당류 구성성분을 Bio-Rad 단당류 조성 분석 키트(카탈로그 # 170-6811)를 사용하여 각기 실시예 1 및 31에서 제조한 바와 같은 재구성된 리턱시맵 및 트라스투즈맵 결정의 것과 비교하였다. 트라스투즈맵 및 리턱시맵 결정을 모액으로 3회 세척하고, ddH2O에 대하여 밤새도록 투석하였다. 재구성된 천연(가용성) 트라스투즈맵 및 리턱시맵을 ddH2O에 대하여 투석하고, 비교에 사용하였다.
그 다음, 천연 및 용해된 항체의 샘플을 그 당 함량에 대하여 분석하였다. 각각의 천연 및 용해된 항체를, 항체 40 ㎍을 함유하는 3 개의 50 ㎕ 분액으로 분할하였으며, 한 분액은 각기 3회의 가수분해 반응을 위한 것이다. 중성 당 분석을 위하여, 100℃에서 5 시간에 걸쳐서 2 N 트리플루오로아세트산(TFA) 중에서 반응시켰다. 아민 당의 경우, 100℃에서 3 시간에 걸쳐서 4 N HCl 중에서 가수분해시키고, 80℃에서 1 시간 동안 0.1 N TFA를 사용하여 시알산 가수분해를 수행하였다. 가수분해 후, 모든 샘플을 동결 건조시키고, 아민 당을 무수아세트산과 완충액으로 재아세틸화시켰으며, 다시 동결 건조시켰다. 그 다음, 샘플을 재구성하고, 2-아미노아크리딘(AMAC)으로 형광 표지한 다음, 45℃에서 3.5 시간 동안 항온 처리하였다. 샘플을 다시 동결 건조시키고, 희석하였으며, 전기 영동을 위해 2X 샘플 완충액과 혼합하였다. 샘플의 전기 영동은 Bio-Rad 단당류 조성물 겔 및 완충액을 사용하여 달성하였으며, 결과는 장파장 UV 투시기를 사용하여 시각화하였다.
결과:
리턱시맵: 천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵은 동일한 단당류 구성성분을 가졌다. 겔 상에 나타나는 중성 단당류는 만노스, 작은 밴드의 푸코스, 작은 밴드의 글루코스(블랭크에서 나타나는 바와 같이, 단지 오염물일 수 있다) 및 작은 밴드의 갈락토스였다. N-글루코사민은 아민 가수분해 후 나타나는 유일한 밴드가었다. 시알산 가수분해로 밴드를 얻지 못하였다.
트라스투즈맵: 천연(가용성) 및 용해된 트라스투즈맵은 동일한 단당류 구성성분을 가졌다. 겔 상에 나타나는 중성 단당류는 만노스, 작은 밴드의 푸코스 및 작은 밴드의 글루코스(블랭크에서 나타나는 바와 같이, 단지 오염물일 수 있다) 였다. N-글루코사민은 아민 가수분해 후 나타나는 유일한 밴드가었다. 시알산 가수분해로 밴드를 얻지 못하였다.
리턱시맵와 트라스투즈맵에 대한 결과는 결정화 과정이 항체의 단당류 함량을 변화시키지 않았음을 설명한다.
실시예 55 및 56
항체의 생체분석
그 중에서도 특히 본 명세서에서 언급된 것들을 비롯한 종양 관련 항원을 인식하는 다양한 모노클로날 항체는 암 치료에 광범위하게 사용되고 있다. 항원을 가진 표적 세포에 대한 항체의 세포독성은 세 가지 분석, 예컨대 직접 세포독성, 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포독성(ADCC) 중 어느 하나에 의해 특성 규명할 수 있다. 리턱시맵에 대한 표적 세포는 Raji, Daudi, JOK1 및 WT100을 포함하는, 그 표면 상에 CD-20 항원을 과발현하는 세포이다. 트라스투즈맵에 대해 특이적인 항원은 HER2(사람 상피 성장 인자 수용체 2 단백질)이고, 이는 SK-BR-3, BT474 및 MCF/HER2를 비롯한 사람 유방 선암 세포주에서 과발현된다.
1. 직접 세포독성:
그 명칭이 의미하는 바와 같이, 직접 세포독성은 상이한 농도의 항체로 표적 세포를 동시 항온 처리함으로써 표적 세포에 대한 항체의 고유 독성 효과를 측정한다. 세포 생존률은 항체와의 동시 항온 처리 후에 계수한다.
2. 보체 의존성 세포독성(CDC)
항체가 그 세포 표면 항원에 결합할 때, 이것은 보체 시스템(세포를 용해시키고, 국소 염증성 반응을 유발하는 일련의 상호작용 단백질)을 활성화시킴으로써 표적 세포 파괴를 유발한다. 이 분석은 희석된 사람 혈청(보체 시스템의 공급원으로서)과 항체로 고정수의 표적 세포를 동시 항온 처리함으로써 수행한다. 세포 생존률은 항온 처리의 말미에 결정한다. 대조 플레이트(표적 세포 + 항체 단독)와 비교하여, 보체(사람 혈청)을 함유하는 플레이트 내 세포 사멸이 유의적으로 상승하였다.
3. 항체 의존성 세포독성(ADCC):
CDC와 유사하게, ADCC는 모노클로날 항체의 세포독성에 원인이 되는 주요 기전 중 하나이다. CDC와는 대조적으로, ADCC에 의해 야기되는 표적 세포 파괴는 항체가 표적 세포 상에 특이적인 항원에 결합한 후에 특이적으로 종양 세포를 공격하는 면역 세포를 모집함으로써 개시하였다. ADCC 분석은 항체와 효과기 면역 세포로 동시 항온 처리하기 전에, 고정량의 표적 세포로 웰/플레이트를 먼저 시딩함으로써 수행하였다(통상적으로, 분리된 말초 혈액 단핵 세포를 사용한다). 세포 생존률은 동시 항온처리의 말미에 결정하였다. 세포 사멸은 대조군(표적 세포 + 항체 단독)과 비교하였을 때, 효과기 면역 세포의 존재로 유의적으로 증가되었다.
실시예 55
리턱시맵 결정은 RAJI 림프종 세포주에 대한 직접 세포독성을 유발한다
RAJI 림프종 세포(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재, ATCC # CCL 86)를 배양 배지에서 배양하고, 0.5 x 105세포/㎖로 희석하였다. 그 배양물의 100 ㎕ 분액을 96 웰 플레이트 중 한 웰로 옮기고, 천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵(실시예 21에 따라 제조된 결정으로부터)의 존재 하에 3 일 동안 배양하였다. 3 일 항온 처리 후 잔존하는 생존 세포의 수는 CellTiter 96(등록 상표) 수성 일 용액 세포 증식 분석(프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 결정하였다(도 8).
결과:
용해된 리턱시맵은 동일 조건 하에서 천연 리턱시맵만큼 유능하게 직접 세포독성을 유발하였다.
실시예 56
리턱시맵 결정의 RAJI 림프종 세포에 대한 보체 의존성 세포독성의 유도
RAJI 림프종 세포(ATCC; 미국 버지니아주 마나사스 소재)를 성장 배지 중에서 배양하고 0.5×105세포/㎖로 희석하였다. 상기 배양액 중 100 ㎕ 분취량을 96웰 평판의 한 웰로 옮기고 천연 또는 용해시킨 리턱시맵(실시예 21에 따라 제조된 결정으로부터의 것) 25 ㎍/㎖와 각종 농도의 인간 혈청의 존재 하에 3일간 배양하였다. 배양 3일 후에 남아 있는 생존 세포의 수를 CellTiter 96(등록상표) 수성 일용액 세포 증식 분석(Promega Corp.; 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 이용하여 결정하였다. 도 9 참조.
결과:
용해된 리턱시맵은 동일한 조건하에서 천연 리턱시맵와 유사한 보체 의존성 세포독성을 유도하였다.
실시예 57
천연(가용성) 리턱시맵 및 결정질 리턱시맵을 비교하는 누적 분석
하기 표는 실시예 44-46, 49, 50, 54, 53, 55 및 56을 각각 요약하고, 천연(가용성) 리턱시맵 및 결정질 리턱시맵의 특성을 비교한다.
분석방법 가용성 결정질 결과
SDS-PAGE비환원 조건 전항체MW = ∼150 kD 전항체MW = ∼150 kD 리턱시맵의 가용성 및 결정형임.
환원 조건 H쇄 MW = ∼50 kDL쇄 MW = ∼25 kD H쇄 MW = ∼50 kDL쇄 MW = ∼25 kD 동일.결정화는 리턱시맵의 구조적 완전성(structural integrity)을 변화시키지 않았음.
HPLC 겔 여과 단일 피크 단일 피크 결정화는 리턱시맵의 구조적 완전성을 변화시키지 않았음.
동적 광산란 MW = ∼150 kD MW = ∼150 kD 결정화는 리턱시맵의 구조적 완전성을 변화시키지 않거나 유체역학적 반경을 변화시켰음.
펩티드 맵핑 트립신 분해 트립신 분해 가용성 및 재용해된 리턱시맵와 유사한 프로파일이 얻어졌는데, 이것은 리턱시맵 분자의 배열, 구조 또는 크기에 변화가 없음을 나타냄.
항체 경쇄(L쇄)의 N-말단 서열화 Gln-Ile-Val-Leu-Ser-Gln-Ser Gln-Ile-Val-Leu-Ser-Gln-Ser 천연(가용성) 및 용해된 리턱시맵은 N-말단 서열과 동일하였는데, 이것은 N-말단측에서 아미노산의 가수분해가 없었음을 나타냄.
모노사카라이드 구성 푸코스, 만노스, N-아세틸 글루코사민, 갈락토스 푸코스, 만노스, N-아세틸 글루코사민, 갈락토스 천연(가용성) 및 용해된 결정질 리턱시맵은 모노사카라이드 성분과 동일하였는데, 이것은 결정화 중에 모노클로날 항체로부터 모노사카라이드가 분해되지 않았음을 나타냄.
올리고사카라이드 프로파일링 8-, 9- 및 10-잔기 당에 해당하는 G8, G9 및 G10에 해당하는 3개의 밴드 8-, 9- 및 10-잔기 당에 해당하는 G8, G9 및 G10에 해당하는 3개의 밴드 천연(가용성) 및 용해된 결정질 리턱시맵은 올리고사카라이드 프로파일과 동일하였는데, 이것은 결정화가 항체의 올리고사카라이드 구성을 변화시키지 않았음을 나타냄.
생분석직접 세포독성 예 예 천연 및 용해된 리턱시맵 모두 각 기능을 유도하였음.
유도 보체 의존성 세포독성 예 예 결정화는 면역 기능에 변화를 유발하지 않았음.
실시예 58
FTIR에 의한 2차 구조 특성 규명
푸리에(Fourier) 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼을 동(Dong) 등의 문헌[Dong, A., Caughey, B., Caughey, W.S., Bhat, K.S. 및 Coe, J.E.Biochemistry, 1992;31:9364-9370; Dong, A. Prestrelski, S.J., Allison, S.D. 및 Carpenter, J.F.J. Pharm. Sci., 1995; 84: 415-424]에 개시된 니콜릿(Nicolet) 모델 550 Magna 시리즈 분광계로 수집하였다.
고체 샘플의 경우, 항체 또는 항체 단편 1 내지 2 ㎎을 KBr 분말 350 ㎎을 사용하여 약간 분쇄하고 확산 반사율 부속품용으로 사용된 작은 컵에 채웠다. 스펙트럼을 수집한 다음, 제2 유도체를 사용하는 2차 구조의 개별 성분들의 상대 면적을 결정하기 위한 Grams 32(Galactic Software)와 아미드 I 영역(1600∼1700 ㎝-1) 하에 커브-핏팅 프로그램을 사용하여 처리하였다.
사전 저장된 기준 스펙트럼과 시험 단백질 스펙트럼과의 상관계수를 용이하게 결정할 수 있는 니콜릿(Nicolet)으로부터의 단백질 분석 소프트웨어를 사용하여 상관계수를 계산하였다(Garland, B,FT-IR Studies of Protein Secondary Structure in Aqueous and Dried States.Nicolet application note # AN 9479). 천연의 수성 단백질의 제2 유도체 스펙트럼을 기준 스펙트럼으로서 사용하고 건조된 결정 및 동결건조된 고체 단백질은 샘플로서 사용할 수 있다. 상관계수가 단일성에 접근할수록 단백질은 더 유사한 2차 배열 구조를 가질 것이다.
결과:
슬러리 형태 또는 건조된 결정형의 주어진 결정질 모노클로날 항체의 상관계수는, 가용성 형태(기준 스펙트럼이 1과 동일)와 비교할 때, 0.8 이상이지만 1 또는 그보다 작다.
실시예 59
가용성 전항체 샘플
제조
실시예 1에서 제조한 리턱시맵 항체 결정과 비교하기 위해서, 전항체 결정을 pH 7.0 및 37℃의 0.1% 트윈(등록상표) 80(시그마-알드리치), 150 mM 염화나트륨 및 25 mM Tris-HCl에 20 ㎎/㎖로 용해(재현탁)시켜서 가용성 전항체 샘플을 제조하였다. 이 방법을 이용하여 실시예 44, 45, 46, 49, 50, 52, 53, 54, 55 및 56의 리턱시맵 결정을 용해시켰다. 역시 이 방법을 이용하여 실시예 47, 50, 51, 53 및 54의 리턱시맵 결정을 용해시켰다. 또 이 방법을 이용하여 실시예 63의 인플릭시맵 결정을 용해시켰다.
실시예 60
결정질
정량적 현미경 관찰에 의해 본 발명의 결정 및 그 결정의 제제 및 조성물의 결정 완전성을 측정하였다. 결정이 건조 후 그 형태를 보존하는지 여부를 육안관찰하기 위해서, DXC-970MD 3CCD 칼라 비디오 카메라, 카메라 어댑터(CMA D2) 및 Image ProPlus 소프트웨어가 장착된 올림푸스 BX60 현미경 하에서 건조된 결정을 검사할 수 있다. 건조된 결정 샘플을 유리 커버슬립으로 덮고, 탑재한 다음 올림푸스 UPLAN F1 대물 렌즈 10X/0.30 PH1(상 콘트라스트)를 구비한 올림푸스 현미경으로 10X 배율로 검사하였다.
실시예 61
트라스투즈맵 동물 모델
트라스투즈맵은 유방암 치료에 사용할 수 있다[Pietras R.J., Poen J.C., Gallardo, D., Wongvopat P.N., Lee H.J. 및 Slamon D.J., Cancer Res, 59권, pp. 1347-55(1999); Baselga, J., Norton L., Albanell J., Kim Y.M., Mendelsohn J., Cancer Research, 58권, pp. 2825-31(1998)].
누드 마우스에서의 종양 형성 절차
인간 유방암 SK-BR3 또는 BT-474 세포(ATCC; 미국 버지니아주 마나사스 소재)를 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM 글루타민 및 1% 페니실린 G/스트렙토마이신/펀지존 용액이 보충된 BRMI 1640 배지 중에서 배양하였다. 수회 계대배양한 후에, 인간 유방암 세포를 흉선이 제거된 3월령의 암컷 마우스의 뒤 넓적다리에 피하(s.c.; 5×107세포/동물) 접종시켰다.
접종 전에, 마우스를 10 내지 14일간 생분해성 담체-결합제 중의 17β-에스트라디올(펠릿당 에스트라디올 1.7 ㎎)을 투여하여 전처리함으로써 에스트로겐 의존성 유방암 세포의 성장을 촉진시켰다. 그 크기(㎜ 단위)를 측정하여 종양 결절을 검사하였다. 각 처리군은 5 내지 6마리의 동물로 구성시켰다. 각 처리 초기에 있어서 동물은 동물의 체중 및 종양 결절의 크기 면에서 무작위로 선택하였다. 종양의 크기가 일개의 동물군에서 50 ㎣ 이상으로 또는 2개의 동물군에서 350 ㎣ 이상으로 성장했을 때 항체 처리를 개시하였다. 모노클로날 항체 및 대조 용액을 복강내(i.p.) 주사로 투여하였다. 재조합 인간(rhu) Mab HER-2 항체(트라스투즈맵)는 4일 간격으로 3회(12일에 걸쳐) 동물 체중(㎏) 당 5 또는 10 ㎎ 용량으로 투여하였다. 대조용 주사는 동일한 투여 프로토콜을 이용하여 인간 IgG1(5 또는 10 ㎎/㎏)을 복강내 주사하였다. 이어서 병리검사를 위해 마우스를 죽였다.
결정질 및 가용성 트라스투즈맵은 BT 474 세포를 마우스에 주사하여 형성시킨 대부분 또는 모든 종양을 근절시켰고, 염수(세포 전달 매질로서 사용되었던 것) 또는 비특이성 IgG로 구성되는 대조군과 비교할 때, 결정질 트라스투즈맵은 유방암의 마우스 동물 모델에서 효과적인 것으로 명확히 드러났다.
마우스에서의 트라스투즈맵의 약물동력학(PK) 연구
트라스투즈맵의 PK 연구를 위해, 트라스투즈맵을 Balb/C 마우스에 피하 또는 정맥 주사로 접종하였다. 체중이 각각 20 내지 25 g인 동성의 Balb/C 마우스 25 내지 30 마리를 연구에 사용하였다. 1일째에, 마우스를 평량한 다음, 트라스투즈맵을 1회 피하 또는 정맥 주사하였다(마우스 체중 ㎏당 트라스투즈맵 30 ㎎). 트라스투즈맵 용액/현탁액의 농도를, 전술한 용량이 마우스 체중 ㎏당 5 ㎖의 부피로 투여되도록 조절하였다. 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24 및 48 시간째에, 마우스 3마리로부터 혈액을 채취하였다. 각 시점에서 마우스 세 마리를 마취시키고 심장에서 가능한 한 많은 혈액을 빼낸 다음(말단 출혈), Microtainer 혈청 분리기 튜브로 옮겼다. 각 마우스에서 약 300 ㎕의 혈액을 채취하였다. 수집된 혈액을 응고시키고 튜브를 원심분리하였다. 혈액 세포를 제거하고, 상청액(혈청)을 저온 용기로 경사 분리해 넣은 다음, -70℃에서 동결시켰다. 이어서, ELISA(프로토콜은 하기 참조)에 의해 트라스투즈맵의 농도를 결정하고, 그 결과를 혈청 ㎖당 트라스투즈맵의 ㎍수를 접종 후 경과시간에 대해 플롯팅하였다.
트라스투즈맵 ELISA 프로토콜
시그마(Costar 브랜드)에서 입수한 96웰 고결합 폴리스티렌 평판의 웰을 4℃에서 하룻밤동안 Pierce에서 입수한 항인간 항체 10 ㎍/㎖로 피복하였다(50 ㎕/웰). 항인간 항체를 제거하고 50 mM Tris, pH 8.0, 0.138 M 염화나트륨, 0.0027 M 염화칼륨 및 0.05% 트윈(등록상표) 20(시그마-알드리치)를 함유하는 완충액(TBST)으로 상기 평판을 3회 세정하였다. 이어서 각 웰을 실온에서 2 시간동안 TBST 중의 3% 탈지 건조유(시그마) 200 ㎕로 차단 처리하였다. 평판을 비우고 TBST로 3회 세정하였다. 트라스투즈맵을 함유하는 혈청 샘플을 TBST 중의 탈지 건조유에 희석하였다. 100 ㎕ 분취량을 적당한 각 웰에 첨가하였다. 대조 샘플(염수 또는 IgG) 100 ㎕ 분취량을 적당한 웰에 첨가하고 평판을 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 평판을 비우고 TBST로 3회 세정하였다. 항인간 항체(TBST 중의 탈지 건조유 중에 함유)에 접합된 양고추냉이 퍼옥시다제(시그마)(1/25,000 희석액)의 100 ㎕ 분취량을 각 웰에 첨가하고 평판을 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 이어서, 평판을 비우고 TBST로 3회 세정하였다. 각 웰에 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TBM) 기질(시그마) 100 ㎕를 첨가하고 평판을 암실에서 실온 하에 30분간 배양하여 색 반응을 진행시켰다. 각 웰에 1N 황산 100 ㎕를 첨가하여 색 반응을 중지시켰다. 자동 마이크로평판 판독기로 파장 450 nm에서 흡광도(OD450)를 판독하였다. 이어서, 시험 혈액 샘플 중의 트라스투즈맵의 양에 해당하는 OD450값을 플롯팅하였다. 플롯팅결과는 도 15에 도시한다.
결과:
결정질 트라스투즈맵을 혈류에 직접 정맥 투여하였고(제1 시점, 즉 30분째에 대략 최대 혈청 농도에 도달함), 그 혈청 농도는 약 480분간 유지된 다음 혈청 농도가 떨어지기 시작하였다. 도 15 참조. 피하 주사된 결정질 트라스투즈맵은 정맥 주사된 트라스투즈맵보다 혈류에 유입되는 데 더 오래 걸렸다(약 480분 내에 대략 최대 혈청 농도에 도달함). 그러나, 피하 투여된 트라스투즈맵의 대략 최대 혈청 농도는 적어도 최종 시점, 즉 48 시간까지 유지되었는데, 이것은 피하 투여된 트라스투즈맵 결정은 연장된 시간 주기에 걸쳐 항체의 높은 혈청 농도를 유리하게 유지하고 제어할 수 있음을 나타내는 것이다. 도 15 참조.
실시예 62
리턱시맵 동물 모델
리턱시맵은 비호지킨 림프종의 치료에 사용할 수 있다[Bertolini, F., Fusetti, L., Mancuso, P., Gobbi, A., Corsini, C., Ferruccu, P.F., Blood, 96권, pp. 282-87(2000)].
누드 마우스에서의 종양의 형성 절차
6주령 내지 8주령의 NOD/SCID 마우스에 10×106Raji 세포(ATCC)를 복강내 주사하여 높은 수준의 인간 등급 비호지킨 림프종 모델을 발생시켰다. 매일 마우스의 종양 성장을 평가하였다. 캘리퍼스로 종양 부피를 측정하고,식(폭×길이×0.52)을 적용하여 구형 종양의 부피를 개략적으로 산출하였다. 실시예 21에서 제조된 것과 같은 결정형의 키메라성 항-CD20 모노클로날 항체 리턱시맵을 25 내지 75 ㎎/㎖ 범위의 농도로 3, 5 및 7일째에 마우스에 복강내(i.p.) 투여하였다. 대조 마우스에는 인산염 완충 염수(PBS)를 복강내 또는 피하 주사하였다. 종양을 보유하는 마우스를 이산화탄소로 질식시켜 죽이고, 조직학, 면역조직화학(IHC) 및 유세포측정학(FC) 연구에 의해 종양 생착을 확인하였다.
실시예 63
인플릭시맵 동물 모델
인플릭시맵은 관절염의 치료에 사용할 수 있다[Kim, S. H., Evans, C.H., Kim, S., Oligino, T., Ghivizzani, S.C. 및 Robbins, P.D., Arthritis Res., 2권, pp. 293-302(2000); Yoshino, S., The Journal of Immunology, vol. 160, pp. 3067-71(1998); Malfait, A.M., Williams, R.O., Malik, A.S., Maini, R.N. 및 Feldmann, M., Arthritis Rheum., 44권, pp. 1215-24(2001)].
누드 마우스에서의 종양의 형성 절차
7-8주령의 숫컷 DBA/1 lacJ(H-2q) 마우스를 잭슨 레보러토리(Jackson Laboratory; 미국 메인주 바 하버 소재)에서 구입하였다. 꼬리 기부에 소 II형 콜라겐 100 ㎍을 경피(i.d.) 투여하여 마우스를 면역시켰다. 면역 후 21일째에, 프로인드 불완전 보조제 중의 II형 콜라겐 100 ㎍을 마우스에 일시 주사(i.d.)하였다. 관절염을 동시 발병시키기 위해, 28일째에 리포폴리사카라이드(시그마; 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 40 ㎍을 복강내 주사하였다.
임상적 관절염의 발병 시, 마우스를 4주간 항종양 괴사인자(anti-TNF; 인플릭시맵)로 처치하였다. 실시예 37에서 제조한 것과 같은 인플릭시맵 2 ㎎을 PBS 0.5 ㎖에 용해시키고 매일 복강내 주사하였다. 대조군 처치의 경우에는, PBS만 0.5 ㎖와, 그리고 비특이성 IgG 2 ㎎을 함유하는 PBS 0.5 ㎖를 마우스에 투여하였다. 처치 4주 후, 마우스를 죽이고 뒷다리의 관절 손상을 조직학적으로 평가하였다.
실시예 64
결정형 리턱시맵의 안정성
분석 1
실시예 21에서 제조한 바와 같은 리턱시맵(10 mg/ml) 결정 슬러리의 분취물(0.35 ml)은 실온에서 모액 내에 저장하였다. 분취물 5 ㎕는 1 개월의 기간에 걸쳐 상이한 시점에서 제거하였다. 이어서, 상기 항체의 완전성은 비환원 4-20% 트리스-글리신 구배 겔 상에서 분석하였다. 단일 단백질 밴드는 쿠마시 블루 염색후에 상기 겔 상에서 관찰되었다.
분석 2
실시예 21에서 제조한 바와 같은 리턱시맵 결정 슬러리의 분취물 100 mg/ml는 결정 슬러리 1.1 ml를 원심분리하여 제조하였으며, 펠릿은 150 mM 염화나트륨, 25 mM 시트르산 나트륨, 0.09% 트윈(등록상표) 80(시그마-알드리치, pH 6.5)을 함유하는 완충액 50 ㎕ 내에 재현탁시켰다. 이어서, 현탁된 슬러리는 실온에서 1개월 동안 저장하고, 비환원 4-20% 트리스-글리신 구배 겔 상에서 분석하였다. 상기 겔 상에서 단일 단백질 밴드가 관찰되었다(도 12).
실시예 65
유기 용매 존재 하에서 결정성 및 천연(가용성) 트라스투즈맵의 안정성
결정질 트라스투즈맵
트라스투즈맵은 실시예 31에 기술된 바와 같이 결정화하였다. 트라스투즈맵 결정(단백질 농도 22 mg/ml로)의 슬러리 분취물 50 ㎕를 원심분리하여 모액을 제거하였다. 상청액(모액)은 폐기하였다. 트라스투즈맵 결정은 아세톤 200 ㎕ 내에 재현탁시켰다. 결정/아세톤 혼합물은 4℃에서 3 시간 동안 항온처리하였다. 아세톤은 원심분리로 제거하고, 트라스투즈맵 결정은 50 mM 트리스(pH 7.0), 100 mM 염화나트륨을 함유하는 용액 100 ㎕에 용해시켰다. 이어서, 용해된 (가용성) 트라스투즈맵은 HPLC 상에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석하였다. SEC-HPLC 수행시, Phenomenex 2000 SEC 컬럼 및 50 mM 트리스(pH 7.0) 및 100 mM 염화나트륨을 포함하는 완충액을 이용하였으며, 유속은 0.5 ml/분으로 하였다.
천연 트라스투즈맵
가용성 트라스투즈맵(제조사에 의해 제공됨, 22 mg/ml)의 분취물 50 ㎕를 아세톤 200 ㎕에 첨가하였다. 결정/아세톤 혼합물은 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 아세톤은 원심분리로 제거하고, 가용성 트라스투즈맵은 SEC-HPLC로 분석하였으며, SEC-HPLC 수행시, Phenomenex 2000 SEC 컬럼 및 50 mM 트리스(pH 7.0) 및 100 mM 염화나트륨을 포함하는 완충액을 이용하였으며, 유속은 0.5 ml/분으로 하였다.
결과:
용해된 트라스투즈맵은 전부 잔류하고 그의 천연 구조를 유지한 반면(도13), 천연/가용성 트라스투즈맵은 아세톤 처리후에 침전되었는데(도 14), 이는 천연 트라스투즈맵의 구조적 완전성이 상실되었음을 입증하는 것이다.
본 실시예는 천연 트라스투즈맵의 안정성과 비교하여 본 발명에 따른 결정 상태의 트라스투즈맵의 안정성이 증가되었음을 입증한다.
입증된 바와 같이, 모노클로날 항체, 특히 트라스투즈맵을 포함하는 모노클로날 항체의 결정화는 항체의 안정성을 증가시키며, 항체의 구조적 완정성을 보존한다. 유기 용매 내에서의 안정성은, 폴리락트산과 글리콜산의 공중합체("PLGA")-캡슐화된 미소구를 생성하기 위한 다양한 중합체, 예를 들어 PLGA를 이용하여 용해를 조절하는 경우, 매우 유용하다. 이러한 방법은, 캡슐화하려는 항체 또는 항체 단편이 유기 용매 내에서 변성되는 경우, 사용할 수 없다.
트라스투즈맵을 다른 유기 용매, 예를 들어 아세토니트릴, 에탄올, 이소프로필 알콜(IPA) 및 2-메틸-2,4-펜탄디올("MPD")에 노출시키는 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 66
제형화된 결정성 및 천연(가용성) 트라스투즈맵의 안정성
결정성 트라스투즈맵:
트라스투즈맵 결정은 실시예 31의 절차에 따라 제조하였다.
트라스투즈맵(22 mg/ml)의 결정을 함유하는 슬러리 50 ㎕를 원심분리하고, 상청액은 폐기하였다. 상기 트라스투즈맵 결정은 제1 완충액(5% PEG 3350, 25% 에탄올, 0.1% 트윈(등록상표) 80(시그마-알드리치), 50 mM 트레할로즈, 50 mM 나트륨포스페이트, pH 7.6) 또는 제2 완충액(25% PEG 3350, 5% 알콜(에탄올 또는 이소프로판올), 0.1% 트윈(등록상표) 80(시그마-알드리치), 50 mM 트레할로즈, 100 mM 트리스, pH 8.0)에 재현탁시켰다. 결정/완충액 혼합물은 4℃에서 16 시간 동안 항온처리하고, 그후 완충 상청액은 원심분리로 제거하고, 결정은 50 mM 트리스, pH 7.0, 100 mM 염화나트륨 100 ㎕ 내에 용해시켰다. 이어서, 트라스투즈맵은 SEC-HPLC로 분석하였다(Phenomenex 2000 SEC 컬럼 및 50 mM 트리스(pH 7.0) 및 100 mM 염화나트륨을 포함하는 완충액을 이용하였으며, 유속은 0.5 ml/분으로 함).
천연 트라스투즈맵:
가용성 트라스투즈맵(제조사에 의해 제공됨, 22 mg/ml) 50 ㎕를 제1 완충액 또는 제2 완충액에 첨가하였다. 결정/완충액 혼합물은 4℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 완충 상청액은 침전으로부터 분리하고, 침전은 SEC-HPLC(상기한 조건과 동일한 조건을 이용함)로 분석하여 천연 트라스투즈맵의 존재 여부를 확인하였다.
결과:
제1 완충액 또는 제2 완충액과 함께 항온처리한 후, 용해된 결정성 트라스투즈맵은 전부 잔류하고 그의 천연 구조는 유지된 반면, 천연/가용성 트라스투즈맵은 제1 완충액 또는 제2 완충액과의 항온처리 후 침전되었는데, 이는 천연 (가용성) 트라스투즈맵의 구조적 완전성이 상실되었음을 입증하는 것이다.
실시예 67
수크로즈 아세테이트 이소부티레이트(SAIB)를 이용하는 제형화
수크로즈 아세테이트 이소부티레이트(SAIB)를 이용하는 제형화는 비경구 액상 비중합체성 약물 전달 시스템에 관한 것이다. 이 시스템은 수크로즈 아세테이트 이소부티레이트(SAIB) 및 "가소화" 용매, 예를 들어 라놀린, 광유, 에탄올 내에 현탁된 항체 결정 또는 항체 단편 결정을 포함한다. 즉, 액체로 주입된다[참조: S.A. Sullivan, R.M. Gilley, J.W. Gibson and A.J. Tipton, Pharmaceutical Research, vol. 14, p. 291 (1997)]. 주입후, 상기 용액의 점도는 증가한다. 생성된 고점도 매트릭스는 점착성이며, 생분해가능하며, 생체적합성이다. 상기 항체는 상기 매트릭스로부터 조절된 방식으로 방출된다.
수크로즈 아세테이트 이소부티레이트(SAIB)를 이용하는 트라스투즈맵 제형화
개략적으로 상기한 SAIB 제형화 시스템은 트라스투즈맵을 이용하여 수행하였다.
방법:
모액은 트라스투즈맵 결정을 함유하는 결정 슬러리 분취물 100 ㎕로부터 제거하였다. 이어서, 결정은 에탄올 중의 90% SAIB 용액으로 세척하였다(본 실시예에서 에탄올은 가소제로서 작용한다). 시간 경과에 따라 여러 시점에서, SAIB/에탄올 용액으로부터 분취물 10 ㎕를 50 mM 트리스(pH 7.0) 및 100 mM 염화나트륨 100 ㎕ 내에 현탁시켰다. 실온에서 10분 동안 항온처리한 후, 결정을 용해하고, 생성된 물질을 SEC-HPLC로 분석하여 트라스투즈맵의 구조적 완전성을 측정하였다.
결과:
상기 모노클로날 항체는 상기 조건 하에서 안정한 상태로 잔류하였다. 따라서, SAIB 제제는 트라스투즈맵을 피하 전달하기 위한 비히클로서 사용하기에 적합한 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 SAIB 제제는 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편의 임의 결정 또는 결정 제제 또는 조성물을 위한 조절된 전달 시스템으로서 사용할 수 있음을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예 68
결정성 리턱시맵의 안정성
결정화를 위해, 염화나트륨 9 mg/ml, 시트르산 나트륨 2수화물 7.35 mg/ml, 폴리소르베이트 80(pH 6.5) 0.7 mg/ml 내의 리턱시맵 100 ㎕와 0.1 M Hepes(pH 7.7), 12% PEG 400, 1.17 M 황산 나트륨을 함유하는 결정화 완충액 200 ㎕를 혼합하였다. 이어서, 튜브는 소량 회분에서 얻은 리툭시 모노크로날 항체 결정으로 시딩하고, 1.5 M 황산 나트륨 10 ㎕로 보충한 후, 실온에서 하룻밤 항온처리하였다. 에탄올 또는 PEG, 또는 이들의 배합물 내에서 결정의 안정성은 상기 결정 슬러리 20 ㎕를 취하고, 원심분리에 의해 결정을 분리한 후에 측정하였다. 이어서, 결정은 25 mM 트리스(pH 7.0) 200 ㎕ 내에 현탁시켰는데, 현탁은 37℃에서 10% 에탄올 및 10% PEG 3350의 존재 또는 부재하에 수행하였다. 샘플은 상청액 내에 용해된 단백질의 존재를 위해 24 시간까지 취했다. 단백질은 바이오라드 프로테인 어세이 키트 I(바이오라드 래보러토리즈, 카탈로그 번호 500-0001)로 측정하였다.
결과:
결과는 결정이 25 mM 트리스(pH 7.0) 및 10% 에탄올에서 쉽게 용해되는 것으로 나타났다. 10% PEG만을 함유하는 용액은 결정성을 유지시키지 않고 단백질을 침전시켰다. 그러나, 에탄올과 PEG를 병용하면, 결정성이 유지되었으며, 1500 분의 기간 동안에도 결정은 용해되지 않았다(도 10). 리턱시맵 결정을 위해 에탄올 및 PEG 제제의 병용이 가능한데, 그 이유는 이들 모두 약학적으로 허용가능한 시약이기 때문이다.
실시예 69
결정성 트라스투즈맵의 안정성
트라스투즈맵은 다음과 같이 결정화하였다. 개략적으로, 트라스투즈맵(제조사에 의해 제공된 바와 같이 원 제제내 22 mg/ml) 200 ml는 25% PEG 400, 5% PEG 8000, 10% 프로피렌 글리콜, 100 mM 트리스(pH 8.0), 0.1% 트윈(등록상표) 80(시그마 알드리치)를 함유하는 동일한 부피의 결정화 완충액과 함께 실온에서 하룻밤 항온처리하였다. 상기 튜브에 시딩하고, 프로필렌 글리콜 20 ㎕로 보충하였다. 에탄올 또는 PEG, 또는 에탄올과 PEG의 배합물 내에서 결정의 안정성은 상기 결정 슬러리 80 ㎕를 취하고 원심분리로 결정을 분리한 후 측정하였다. 이어서, 결정은 25 mM 트리스(pH 7.0) 400 ㎕ 내에 현탁시켰는데, 현탁은 37℃에서 10% 에탄올 및 10% PEG 3350의 존재 또는 부재하에 수행하였다. 샘플은 상청액 내에 용해된 단백질의 존재를 위해 140 시간까지 취했다. 단백질은 바이오라드 프로테인 어세이 키트 I(바이오라드 래보러토리즈, 카탈로그 번호 500-0001)으로 측정하였다.
결과:
결과는 결정이 25 mM 트리스(pH 7.0) 및 10% 에탄올에서 쉽게 용해되는 것으로 나타났다. 10% PEG만을 함유하는 용액은 결정성을 유지시키지 않고 단백질을 침전시켰다. 그러나, 에탄올과 PEG를 병용하면, 결정성이 유지되었으며, 8400 분의 기간 동안에도 결정은 용해되지 않았다(도 11). 트라스투즈맵 결정을 위해 에탄올 및 PEG 제제의 병용이 가능한데, 그 이유는 이들 모두 약학적으로 허용가능한 시약이기 때문이다.
실시예 70
부형제로서 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 이용하는 완전 항체 결정의 제조
건조 및 저장 중에 본 발명에 따라 제조한 완전 항체 결정의 안정성을 증가시키기 위해, 결정은 부형제와 함께 제형화할 수 있다. 본 발명에 따른 완전 항체 결정은 수중 0.1% 폴리에틸렌 옥사이드를 이용하여 다음과 같이 제형화할 수 있다: 결정은 스윙 버킷 로터가 장착된 베크만 GS-6R 벤치 탑 원심분리기에서 1000 rpm으로 원심분리하여 모액으로부터 분리하였다. 이어서, 결정은 0.1% 폴리에틸렌 옥사이드(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴퍼니) 내에서 3 시간 동안 현탁시키고, 이어서 원심분리로 분리하였다.
실시예 71
부형제로서 수크로즈를 이용하는 완전 항체 결정의 제조
본 발명에 따른 완전 항체 결정은 건조 전에 모액의 존재 하에서 슬러리 형태로 제형화할 수 있다. 수크로즈(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴퍼니)는 모액 내의 완전 항체 결정에 부형제로서 첨가하였다. 충분한 수크로즈를 완전 항체 결정에 첨가하여 최종 수크로즈 농도를 10%(w/v)로 만들었다. 생성된 현탁액은 실온에서 3시간 동안 텀블링하였다. 수크로즈로 처리한 후 결정은 실시예 70에 기술된 바와 같이 원심분리에 의해 액체로부터 분리하였다.
실시예 72
부형제로서 트레할로즈를 이용하는 완전 항체 결정의 제형화
본 발명에 따른 완전 항체 결정은 실시예 71에 기술된 바와 같이 제형화할 수 있는데, 수크로즈 대신에 트레할로즈(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴퍼니)를 첨가하였고, 모액내 최종 농도를 10%(w/v)로 하였다. 이어서, 생성된 현탁액은 실온에서 3 시간 동안 텀블링하고, 결정은 실시예 70에 기술한 바와 같이 원심분리에 의해 액체로부터 분리하였다.
실시예 73
부형제로서 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MOPEG)를 이용하는 완전 항체 결정의 제형화
완전 항체 결정은 실시예 71에 기술된 바와 같이 제형화하였으나, 수크로즈 대신에 메톡시폴리에틸렌 글리콜(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴퍼니)을 첨가하여 모액내 최종 농도를 10%(w/v)로 하였으며, 3 시간후 실시예 70에 기술된 바와 같이 원심분리에 의해 분리하였다.
실시예 74
결정 제제의 건조 방법
방법 1. 실온에서 N 2 가스 건조
스윙 버킷 로터가 장착된 베크만 GS-6R 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 원심분리하여 부형제를 함유하는 모액으로부터 실시예 1 내지 3중 어느 한 실시예에서 제조한 바와 같은 결정을 분리하였다. 원심분리시에는 50 ml 들이 1회용 (폴리프로필렌) 원심분리 튜브(피셔)를 사용하였다. 이어서, 상기 튜브내로 압력이 약 10 psi인 질소류를 하룻밤 동안 통과시킴으로써 상기 결정을 건조하였다.
방법 2. 진공 오븐 건조
먼저, 스윙 버킷 로터가 장착된 베크만 GS-6R 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 원심분리하여 모액/부형제 용액으로부터 실시예 1 내지 3중 어느 한 실시예에서 제조한 바와 같은 결정을 분리하였다. 원심분리시에는 50 ml 들이 1회용 폴리프로필렌 원심분리 튜브(피셔)를 사용하였다. 이어서, 습윤 결정은 수은 25(VWR 사이언티픽 프로덕츠) 및 실온에서 진공 오븐에 위치시키고, 12 시간 이상 동안 건조하였다.
방법 3. 동결건조
먼저, 스윙 버킷 로터가 장착된 베크만 GS-6R 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 원심분리하여 모액/부형제 용액으로부터 실시예 1 내지 3중 어느 한 실시예에서 제조한 바와 같은 결정을 분리하였다. 원심분리시에는 50 ml 들이 1회용 폴리프로필렌 원심분리 튜브(피셔)를 사용하였다. 이어서, 습윤 결정은 세미-스톱퍼 바이얼 내에서 비티스 동결건조기 모델 24를 이용하여 동결건조하였다. 냉동 단계 중에는 저장 온도를 -40℃까지 서서히 감온하였다. 이후, 이 온도는 16시간 동안 유지하였다. 이어서, 추가로 8시간 동안 2차 건조를 수행하였다.
방법 4. 유기 용매 및 공기 건조
스윙 버킷 로터가 장착된 베크만 GS-6R 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 원심분리하여 모액/부형제 용액으로부터 실시예 1 내지 3중 어느 한 실시예에서 제조한 바와 같은 결정을 분리하였다. 원심분리시에는 50 ml 들이 1회용 폴리프로필렌 원심분리 튜브(피셔)를 사용하였다. 이어서, 결정은 에탄올 또는 이소프로판올 또는 에틸 아세테이트 또는 기타 적합한 용매와 같은 유기 용매 내에 현탁시키고, 원심분리하였다. 이어서, 상청액은 경사분리하고, 실온의 흄 후드에서 2일 동안 건조하였다.
방법 5. 실온에서 공기 건조
스윙 버킷 로터가 장착된 베크만 GS-6R 벤치 탑 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 원심분리하여 부형제를 함유하는 모액으로부터 실시예 1 내지 3중 어느 한 실시예에서 제조한 바와 같은 결정을 분리하였다. 원심분리시에는 50 ml 들이 1회용 (폴리프로필렌) 튜브(피셔)를 사용하였다. 이어서, 결정은 흄 후드 내에서 2일 동안 공기 건조하였다.
방법 6. 분무 건조
실시예 1 내지 3중 어느 한 실시예에서 제조한 바와 같은 결정은 부치 미니 분무 건조기 모델 B-191를 이용하여 분무 건조하였다. 분무 건조를 위해서는 농도가 30 내지 50 mg/ml인 결정의 슬러리를 사용하였다.
실시예 75
항체 또는 항체 단편 결정의 가교 및 이의 제형화 또는 조성물
가교제의 활성이 매우 높아지고, 항체의 결정 특성이 보존되는 pH에서 결정을 항온처리함으로써 완전 항체의 결정 또는 항체 단편의 결정을 가교시켰다. 가교는 텀블링 또는 교반하면서 상온 또는 4℃에서 수행하였다. 24 시간후, 슬러리는 3000 rpm에서 원심분리하고, 상청액은 폐기하였다. 과량(또는 미반응)의 가교제는 트리스나 글리신과 같은 적합한 완충염으로 불활성화시켰다. 이어서, 펠릿은 모액 또는 약학적으로 허용가능한 적합한 완충액으로 세척하여 과량(또는 미반응)의 가교제를 제거하였다. 가교 조건은 사용된 가교제의 유형에 따라 변경할 수 있지만, 궁극적인 목적은 사용된 조건 하에서 상기 항체의 결정 상태를 유지하는 것이다.
항체 또는 항체 단편 결정은 임의의 적합한 가교제를 이용하여 가교될 수 있는데, 이러한 가교제로는 특히 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트.HCl(DTBP), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 비스말레이미도-헥산(BMH), 비스[술포숙신이미딜]수베레이트(BS), 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(DFDNB), 디메틸수베르이미데이트.2HCl(DMS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), 디술포숙신이미딜 타르타레이트(술포-DST), 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC), 에틸렌 글리콜비스[술포숙신이미딜숙시네이트](술포-EGS), N-[g-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS), N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(술포-HSAB), 술포숙신이미딜-6-[a-메틸-a-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(술포-LC-SMPT), 비스-[b-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술파이드(BASED) 및 글루타르알데히드(GA)를 들 수 있다.
실시예 76
이황화 결합을 함유하는 가교된 모노클로날 항체 결정의 용해
10 mM 염화 칼슘 및 20% MPD를 함유하는 10 mM 트리스 HCl 완충액(pH 7)내에 시스테인 242 mg을 용해시켜 200 mM 시스테인 용액을 제조하였다. 본 발명에 따라 제조한 가교된 모노클로날 항체 결정의 슬러리 분취물 200 ml를 취하고, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액은 폐기하였다. 펠릿은 시스테인을 함유하는 트리스 완충액 200 ml내에 현탁시켰다. 다시한번 모노클로날 항체 결정 200 ml를 취하고, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액은 폐기하였다. 이어서, 펠릿은 시스테인을 전혀 함유하지 않는 트리스 완충액 200 ml 내에 현탁시켰다. 모든 샘플은 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고, 32 mM NaOH 내의 용해에 대해 모니터링하였다(직접적인 육안 관찰 및 현미경을 이용한 관찰).
37℃에서 1 시간 동안 항온처리한 후, DTBP 샘플은 시스테인의 존재 하에서는 완전히 가용성이었으며, 시스테인의 부재 하에서는 불용성이었다. DSP 샘플은 시스테인의 존재 하에서 거의 용해되지 않았으며, 시스테인의 부재 하에서는 불용성이었다.
실시예 77
가교된 완전 항체 결정의 37℃에서의 pH 용해도의 특성화
본 발명에 따라 제조되고, 디메틸3,3'-디티오비스프로피온이미데이트.HCl(DTBP), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 비스말레이미도-헥산(BMH), 비스[술포숙신이미딜]수베레이트(BS), 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(DFDNB), 디메틸수베르이미데이트.2HCl(DMS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), 디술포숙신이미딜 타르타레이트(술포-DST), 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC), 에틸렌 글리콜비스[술포숙신이미딜숙시네이트](술포-EGS), N-[g-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS), N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(술포-HSAB), 술포숙신이미딜-6-[a-메틸-a-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(술포-LC-SMPT), 비스-[b-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술파이드(BASED) 및 글루타르알데히드(GA)를 이용하여 가교된 여러가지 모노클로날 항체 결정의 용해도를 분석하였다.
1.5 ml 들이 에펜도르프 튜브내의 효소 2.8 mg과 동량의 미가교된 모노클로날 항체 결정 및 가교된 모노클로날 항체 결정 슬러리 샘플은 상청액이 제거될 때까지 5분 동안 3000 rpm으로 원심분리하였다. 2개의 pH, 즉 1) pH 7.4 및 2) pH 2.0를 테스트하였다.
pH 7.4에서, PBS 완충액(0.01 M 포스페이트, 0.0027 M 염화 칼륨, 0.137 M 염화나트륨 pH 7.4) 의 분취물 200 ml를 각각의 샘플에 첨가하고, 모노클로날 항체의 농도를 14 mg/ml로 만들었다. 이어서, 상기 샘플은 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다.
pH 2.0에서, 글리신/HCl 완충액(pH 2.0)의 분취물 200 ml를 각각의 샘플에첨가하여, 모노클로날 항체 농도를 14 mg/ml로 만들었다. 샘플은 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하였다. 초기에, 샘플은 10 mM 염화 칼슘 및 20% MPD를 함유하는 10 mM 글리신/HCl 완충액(pH 2.0)으로 25℃에서 하룻밤 동안 텀블링하면서 처리하고, 이어서 글리신/HCl 완충액 만으로 처리하였다.
5 시간 및 24 시간후, 샘플은 14,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 용해에 대해 조사할 수 있었다. 원심분리후, 상청액은 0.22 mm 필터를 통해 통과시켰다. 이어서, 상청액의 단백질(항체) 함량은 상기 분취물 2 ㎕를 제거하고, 그것을 탈이온수 798 ml내에 위치시킴으로써 산정하였다. 바이오라드 단백질 분석 시약의 분취물 200 ㎕를 상기 샘플에 첨가하고, 상온에서 5 분 동안 항온처리하고, 595 nm 파장에서 측정하였다(브래드포드법에 의한 바이오라드 마이크로 단백질 분석). 표준물로는 0-20 ㎍ 소 IgG(시그마)를 사용하였다.
지금까지 본 발명의 다수의 구체예를 기술하였지만, 기술한 기본적인 실시예들은 본 발명의 생성물 및 방법을 이용하는 다른 구체예를 제공하기 위해 변형 실시할 수 있음은 명백하다. 따라서, 본 발명의 범위는 예로서 제시한 특정 구체예에 의해서라기 보다는 첨부한 특허청구의 범위에 의해 정해진다.

Claims (78)

  1. 전항체(whole antibody)의 결정.
  2. 항체의 1본쇄 Fv 단편의 결정.
  3. 항체의 Fab 단편의 결정.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전항체 또는 1본쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편은 FTIR에 의하여 상관성 스펙트럼(correlation spectra)이 약 0.8∼약 1.0 사이인 것으로 측정되는, 상기 항체 또는 항체 단편의 가용성 대응부(soluble counterpart)에 비교한 상관성 스펙트럼에 의하여 나타내어지는 항체 또는 단편의 β-병풍 구조의 함량을 특징으로 하는 것인 결정.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전항체 또는 1본쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편은 치료적 항체 또는 항체 단편인 것인 결정.
  6. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전항체 또는 1본쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편은 폴리클로날 항체 또는 이의 단편이거나, 모노클로날 항체 또는 이의 단편인 것인 결정.
  7. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정은 담체가 존재하지 않는(carrier-free) 약학적으로 조절 가능하도록 방출되는 결정인 것인 결정.
  8. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 비글리코실화된 항체, 이중 특이적(bispecific) 항체, 인간 항체 및 마우스 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결정.
  9. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 및 혈청 IgA 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결정.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgM1 및 IgM2, 및 IgA1 및 IgA2 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결정.
  11. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편은 생체내 반감기가 상기 항체 또는 항체 단편의 가용성 대응부의 반감기보다 더욱 긴 것인 결정.
  12. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 항이디오타입 항체인 것인 결정.
  13. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 리턱시맵(Rituximab), 인플릭시맵(Infliximab) 및 트라스투즈맵(Trastuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결정.
  14. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 앱사익시맵(Abciximab), 팔리비즈맵(Palivizumab), 뮤루모냅-CD3(Murumonab-CD3), 겜트즈맵(Gemtuzumab), 트라스투즈맵(Trastuzumab), 바실릭시맵(Basiliximab), 다클리즈맵(Daclizumab), 에타네르셉트(Etanercept) 및 이브리투모맵 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결정.
  15. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 항TNF 항체, 항CD3 항체, 항CD20 항체, 항CD25 항체, 항CD33 항체, 항CD40 항체, 항HER2 항체, 항HBV 항체, 항HAV 항체, 항HCV 항체, 항GPIIb/IIIa 수용체 항체, 항RSV 항체, 항HIV 항체, 항HSV 항체 및 항EBV 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결정.
  16. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 심혈관 질환 치료용 항체, 호흡기 질환 치료용 항체, 조직 이식 거부 치료용 항체, 기관 이식 거부 치료용 항체, 암 치료용 항체, 염증성 질환 치료용 항체 및 방사능 면역요법에사용되는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결정.
  17. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정은 표지되는 것인 결정.
  18. 제17항에 있어서, 상기 결정은 방사성 표지, 효소 표지, 독소, 자성제 또는 약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지로 표지되는 것인 결정.
  19. 전항체의 건조된 결정.
  20. 항체의 1본쇄 Fv 단편 또는 항체의 Fab 단편의 건조된 결정.
  21. (a) 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편 결정 또는 Fab 항체 단편 결정 및
    (b) 1 이상의 중합체 담체
    를 포함하는 것인, 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 방출을 위한 조성물.
  22. (a) 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편 결정, 또는 Fab 항체 단편 결정 및
    (b) 1 이상의 성분을 포함하는 제제.
  23. (a) 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편 결정, 또는 Fab 항체 단편 결정, 및 성분을 포함하는 제제 ; 및
    (b) 1 이상의 중합체 담체
    를 포함하는 것인, 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편, 또는 Fab 항체 단편의 방출을 위한 조성물.
  24. 제1항 내지 제3항, 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정 또는 조성물 또는 제제는 항체 또는 항체 단편 결정을 약 1 ㎎/㎖ 이상의 농도로 보유하는 것인 결정, 조성물, 또는 제제.
  25. 제1항 내지 제3항, 제21항 내지 제23항 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정 또는 조성물 또는 제제는 항체 또는 항체 단편 결정을 약 10.1 ㎎/㎖ 이상의 농도로 보유하는 것인 결정, 조성물, 또는 제제.
  26. 제1항 내지 제3항, 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정 또는 조성물 또는 제제는 항체 또는 항체 단편 결정을 약 20 ㎎/㎖ 이상의 농도로 보유하는 것인 결정, 조성물, 또는 제제.
  27. 제1항 내지 제3항, 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정 또는 조성물 또는 제제는 항체 또는 항체 단편 결정을 약 50 ㎎/㎖ 이상의 농도로 보유하는 것인 결정, 조성물, 또는 제제.
  28. 제1항 내지 제3항, 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정 또는 조성물 또는 제제는 항체 또는 항체 단편 결정을 약 100 ㎎/㎖ 이상의 농도로 보유하는 것인 결정, 조성물, 또는 제제.
  29. 제1항 내지 제3항, 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정 또는 조성물 또는 제제는 항체 또는 항체 단편 결정을 약 120 ㎎/㎖ 이상의 농도로 보유하는 것인 결정, 조성물, 또는 제제.
  30. 제1항 내지 제3항, 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결정 또는 조성물 또는 제제는 항체 또는 항체 단편 결정을 약 200 ㎎/㎖ 이상의 농도로 보유하는 것인 결정, 조성물, 또는 제제.
  31. 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 치료적 항체 또는 항체 단편인 것인 조성물 또는 제제.
  32. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 중합체 담체는 생분해성 중합체인 것인 조성물.
  33. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 중합체 담체는 생체적합성 중합체인 것인 조성물.
  34. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 중합체 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩티드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-히드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(히드록시프로필) 메티크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루론산 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로즈 및 셀룰로즈 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고당, 글리카미노글리칸, 황산화 다당류, 이들의 배합물 및 공중합체로 이루어진 군중 하나 이상으로부터 선택된 중합체인 것인 조성물.
  35. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 중합체 담체는 폴리(락트산-코-글리콜산)인 것인 조성물.
  36. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 중합체 담체는 폴리(비닐 알코올)로 유화되는 것인 조성물.
  37. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 중합체 담체는 공중합체인 것인 조성물.
  38. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 성분은 알부민인 것인 제제 또는 조성물.
  39. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 성분은 수크로즈, 트레할로즈, 락티톨, 젤라틴, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제 또는 조성물.
  40. 포유 동물에 유효량의 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편 결정 또는 Fab 항체 단편 결정을 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물의 치료 방법.
  41. 제21항 또는 제23항에 의한 조성물, 또는 제22항에 의한 제제의 유효량을 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물의 치료 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제는 비경구 경로, 경구 경로 또는 바늘을 사용하지 않는 주사에 의하여 투여되는 것인 방법.
  43. (a) 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 용액과 결정화 용액 또는 결정화 완충액을 혼합하는 단계 ; 및
    (b) 상기 항체 또는 상기 항체 단편의 결정이 형성될 때까지 약 -21∼약 61℃의 온도에서 약 3∼약 48 시간 동안 상기 혼합물을 교반하는 단계
    를 포함하는 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편을 결정화시키는 대규모 회분식(large-batch) 결정화 방법.
  44. 제43항에 있어서, 공기 건조법, 분무 건조법, 동결 건조법, 진공 오븐 건조법 및 질소 기체 건조법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 상기 결정을 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 온도는 약 4∼약 37℃ 사이인 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 온도는 약 -20∼약 4℃ 사이인 것인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 온도는 약 22∼약 61℃ 사이인 것인 방법.
  48. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액의 pH는 약 1.9∼약 11.1의 범위내인 것인 방법.
  49. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액의 pH는 약 1.9∼약 4.0의 범위내인 것인 방법.
  50. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액의 pH는 약 3∼약 10의 범위내인 것인 방법.
  51. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액의 pH는 약 9.0∼약 11.1의 범위내인 것인 방법.
  52. 제43항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 농도(w/v)는 약 5∼약 40% 인 것인 방법.
  53. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 약 1.9∼약 80%(w/v)의 농도로 함유하는 것인 방법.
  54. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 약 1.9∼약 5%(w/v)의 농도로 함유하는 것인 방법.
  55. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 약 20∼약 81%(w/v)의 농도로 함유하는 것인 방법.
  56. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 크기 범위가 약 200∼약 20,000인폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 것인 방법.
  57. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 크기 범위가 약 200∼약 80,000인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 것인 방법.
  58. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 크기 범위가 약 200∼약 400인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 것인 방법.
  59. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 크기 범위가 약 400∼약 80,000인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 것인 방법.
  60. 제43항에 있어서, 결정화될 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 상기 용액중 농도는 약 0.01∼약 500 ㎎/㎖인 것인 방법.
  61. 제43항에 있어서, 결정화될 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 농도는 약 0.01∼약 4 ㎎/㎖인 것인 방법.
  62. 제43항에 있어서, 결정화될 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 농도는 약 10∼약 25 ㎎/㎖인 것인 방법.
  63. 제43항에 있어서, 결정화될 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 농도는 약 3∼약 200 ㎎/㎖인 것인 방법.
  64. 제43항에 있어서, 결정화될 항체 또는 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 농도는 약 25∼약 500 ㎎/㎖인 것인 방법.
  65. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 염을 약 10∼약 400 mM의 함량으로 보유하는 것인 방법.
  66. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 농도가 약 0 mM∼약 4 M인 것인 방법.
  67. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 농도가 약 0∼약 2 mM인 것인 방법.
  68. 제43항에 있어서, 상기 결정화 완충액은 농도가 약 1∼약 4 M인 것인 방법.
  69. (a) 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정을 결합 완충액과 혼합하는 단계로서, 상기 항체 또는 항체 단편은 정제될 단백질과의 친화성을 보유하는 것인 단계 ;
    (b) 정제될 단백질을 함유하는 단백질 용액을 결정/완충액 혼합물에 첨가하는 단계 ;
    (c) 단백질이 항체 또는 항체 단편에 결합할 수 있는데에 충분한 시간 및 온도에서 단백질/결정/완충액 혼합물을 항온처리하는 단계 ;
    (d) 상기 혼합물을 세척 완충액으로 세척하는 단계 ; 및
    (e) 용리 완충액을 사용하여 상기 단백질을 상기 혼합물로부터 용리시키는 단계
    를 포함하는, 친화성 매트릭스 정제에 의하여 단백질을 정제하는 방법.
  70. (a) 항체 단편은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정 ; 및
    (b) 상기 항체 결정 또는 항체 단편 결정의 샘플중 임의의 항원과의 결합을 검출하기 위한 1 이상의 시약
    을 포함하는, 샘플중 항원의 시험관내 검출을 위한 진단 키트.
  71. 제70항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 항원인 것인 진단 키트.
  72. (a) 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편의 결정 또는 Fab 항체 단편의 결정과 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 항체 또는 항체 단편은 항체 결정 또는 항체 단편 결정이 샘플중 임의의 항원과 결합할 수 있는 조건하에 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 것인 단계 ; 및
    (b) 상기 항체 결정 또는 항체 단편이 샘플중 임의의 항원과 결합하였는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플중 항원의 존재를 검출하기 위한 시험관내 진단 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 항원인 것인 진단 방법.
  74. (a) 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편의 용액과 결정화 용액 또는 결정화 완충액을 혼합하는 단계 ; 및
    (b) 상기 항체 또는 상기 항체 단편의 결정이 형성될 때까지 약 -21∼약 61℃의 온도에서 약 5분∼약 72 시간 동안 상기 혼합물을 교반하는 단계
    를 포함하는 전항체, 1본쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편을 결정화시키는 대규모 회분식 결정화 방법.
  75. 제43항에 있어서, 결정화될 항체의 용액은
    (a) 전항체를 포함하는 트랜스게닉 우유를 원심분리시켜 유지방을 제거하고 트랜스게닉 탈지 우유를 제조하는 단계 ; 및
    (b) 단계 (a)애서 얻어진 트랜스게닉 탈지 우유를 약 250 mM의 EDTA로 희석시켜 상기 항체를 포함하는 정제된 트랜스게닉 탈지 우유의 용액을 제조하는 단계
    를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것인 방법.
  76. 제21항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전항체 결정, 1본쇄 Fv 항체 단편 결정, 또는 Fab 항체 단편 결정은 가교되는 것인 조성물 또는 제제.
  77. 포유 동물에 제76항에 의한 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물의 치료 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 경로, 경구 경로 또는 바늘을 사용하지 않는 주사에 의하여 투여되는 것인 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101320707B1 (ko) * 2004-07-23 2013-10-22 제넨테크, 인크. 항체 또는 그의 단편의 결정화 방법
KR20170120155A (ko) * 2015-02-27 2017-10-30 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-인간 pd-1 단일클론 항체의 결정

Families Citing this family (252)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7883704B2 (en) 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
KR20120011898A (ko) * 2000-02-10 2012-02-08 아보트 러보러터리즈 사람 인터류킨-１８에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
DK1255558T3 (da) * 2000-02-16 2006-10-23 Genentech Inc Anti-april antistoffer og hybridomaceller
US8703126B2 (en) 2000-10-12 2014-04-22 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
CA2423227C (en) 2000-10-12 2011-11-29 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
AU2002231736A1 (en) 2000-12-22 2002-07-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators
IL156618A0 (en) * 2000-12-28 2004-01-04 Altus Biologics Inc Crystals of whole antibodies and fragments thereof, methods for the preparation thereof and diagnostic kits utilizing the same
CA2451185A1 (en) * 2001-06-21 2003-01-03 Altus Biologics, Inc. Spherical protein particles and methods of making and using them
KR20040019105A (ko) * 2001-08-03 2004-03-04 제넨테크, 인크. ＴＡＣＩｓ 및 ＢＲ3 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2003041637A2 (en) * 2001-11-09 2003-05-22 Centocor, Inc. Lyophilized monoclonal antibody compositions
KR20140058649A (ko) 2002-07-19 2014-05-14 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 ＴＮＦα 관련 질환의 치료
MXPA05000940A (es) * 2002-07-25 2005-05-16 Genentech Inc Anticuerpos taci y su uso.
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US9415102B2 (en) * 2002-09-06 2016-08-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. High concentration formulations of anti-C5 antibodies
EP1545611B1 (en) * 2002-09-06 2016-11-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of treatment of asthma using antibodies to complement component c5
US20050271660A1 (en) * 2002-09-06 2005-12-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nebulization of monoclonal antibodies for treating pulmonary diseases
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
BRPI0316779B8 (pt) * 2002-12-16 2023-02-28 Genentech Inc Anticorpo anti-cd20 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, composição, artigo manufaturado e formulação líquida
US20050053666A1 (en) * 2002-12-31 2005-03-10 Stelios Tzannis Antibody-containing particles and compositions
EP2460530A3 (en) 2002-12-31 2012-08-29 Althea Technologies, Inc. Human growth hormone crystals and methods for preparing them
ZA200505306B (en) * 2002-12-31 2006-09-27 Altus Pharmaceuticals Inc Complexes of protein crystals and ionic polymers
AU2004204817C1 (en) 2003-01-13 2011-01-20 Macrogenics, Inc. Soluble FcyR fusion proteins and methods of use thereof
EP1594541A4 (en) * 2003-02-21 2007-03-28 Rikshospitalet Radiumhospitale METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING MECONIUM ASPIRATION SYNDROME
CN1750844B (zh) 2003-02-21 2010-09-08 健泰科生物技术公司 凝集素途径特异性补体抑制剂在制备用于预防或抑制组织损伤的药物中的用途
KR101208291B1 (ko) 2003-04-04 2012-12-05 노파르티스 아게 고농도 항체 및 단백질 제형
CA2524534C (en) 2003-05-15 2012-12-11 Sek Chung Fung Methods and compositions for the prevention and treatment of sepsis
WO2005005462A2 (en) * 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
WO2005012353A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Amgen Inc. Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptides
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
DE10355251A1 (de) * 2003-11-26 2005-06-23 Merck Patent Gmbh Pharmazeutische Zubereitung enthaltend einen Antikörper gegen den EGF-Rezeptor
DE10355904A1 (de) 2003-11-29 2005-06-30 Merck Patent Gmbh Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern
US20050186175A1 (en) * 2004-02-20 2005-08-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical compositions based on benzilic acid esters and soluble TNF receptor fusion proteins
TWI439284B (zh) 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
BRPI0510224A (pt) * 2004-05-05 2007-10-23 Genentech Inc métodos de prevenção de doença autoimunológica e artigo industrializado
CA2566075A1 (en) * 2004-05-12 2005-12-01 Baxter Healthcare S.A. Microspheres comprising protein and showing injectability at high concentrations of said agent
ATE409025T1 (de) 2004-05-12 2008-10-15 Baxter Int Nukleinsäure-mikrokügelchen, ihre herstellung und abgabe
US8728525B2 (en) 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
MXPA06012989A (es) * 2004-05-12 2007-06-12 Baxter Int Microesferas de acidos nucleicos, produccion y suministro de las mismas.
RU2384345C2 (ru) 2004-06-04 2010-03-20 Дженентек, Инк. Способ лечения рассеянного склероза
DOP2005000108A (es) * 2004-06-04 2007-06-15 Genentech Inc Method for treating lupus
US20070048785A1 (en) * 2004-06-09 2007-03-01 Lin Laura L Anti-IL-13 antibodies and complexes
US7501121B2 (en) * 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
US20090098142A1 (en) * 2004-06-09 2009-04-16 Kasaian Marion T Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders
AR049390A1 (es) * 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
GB0414054D0 (en) 2004-06-23 2004-07-28 Owen Mumford Ltd Improvements relating to automatic injection devices
CN101087807A (zh) * 2004-10-05 2007-12-12 健泰科生物技术公司 治疗血管炎的方法
MX2007004437A (es) 2004-10-22 2007-06-20 Amgen Inc Metodos para el repliegue de anticuerpos recombinantes.
JP2008519757A (ja) * 2004-11-12 2008-06-12 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 抗ｅｇｆｒ抗体の固形物
ZA200705459B (en) * 2005-01-13 2008-09-25 Genentech Inc Treatment method
DOP2006000029A (es) * 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
SI1850874T1 (sl) 2005-02-23 2014-01-31 Genentech, Inc. Podaljšanje časa za napredovanje bolezni ali za preživetje pri pacientkah z rakom na jajčnikih ob uporabi pertuzumaba
US20090136505A1 (en) * 2005-02-23 2009-05-28 Johanna Bentz Intranasal Administration of Active Agents to the Central Nervous System
TW200714289A (en) * 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
AR053579A1 (es) * 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
CA2903138A1 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Abbvie Biotechnology Ltd. Use of tnfa inhibitor for treatment of erosive polyarthritis
EP1902320B1 (en) * 2005-05-20 2010-03-10 Genentech, Inc. Pretreatment of a biological sample from an autoimmune disease subject
EP1907421A4 (en) 2005-06-30 2012-03-28 Abbott Lab IL-12 / P40 BINDING PROTEINS
WO2007014073A2 (en) * 2005-07-22 2007-02-01 Amgen Inc. Concentrated protein lyophilates, methods, and uses
EP2500355A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP2012228248A (ja) * 2005-08-19 2012-11-22 Abbott Lab 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
US20070041905A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
SG2014010029A (en) 2005-08-19 2014-08-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2862540C (en) 2005-09-21 2018-07-31 The Regents Of The University Of California Systems, compositions, and methods for local imaging and treatment of pain
US8906864B2 (en) 2005-09-30 2014-12-09 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use
AU2006337105B2 (en) 2005-11-01 2013-05-02 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for diagnosing ankylosing spondylitis using biomarkers
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
ES2618543T3 (es) * 2005-11-23 2017-06-21 Genentech, Inc. Métodos y composiciones relacionados con ensayos de linfocitos B
WO2007102946A2 (en) 2006-01-23 2007-09-13 Amgen Inc. Crystalline polypeptides
KR20150006085A (ko) 2006-04-05 2015-01-15 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 항체 정제
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
CA2564435A1 (en) 2006-04-10 2007-10-10 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for monitoring and treating intestinal disorders
EP2703010A3 (en) 2006-04-10 2014-08-06 AbbVie Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
EP2666472A3 (en) 2006-04-10 2014-04-02 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
CA2651992A1 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Abbott Biotechnology Ltd. Automatic injection device
EP2046809B1 (en) 2006-07-19 2016-12-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Wsx-1/il-27 as a target for anti-inflammatory responses
EP2647712A3 (en) 2006-08-04 2013-11-20 Baxter International Inc Microsphere-based composition for preventing and/or reversing new-onset autoimmune diabetes
MY188368A (en) 2006-09-08 2021-12-06 Abbott Lab Interleukin-13 binding proteins
JP5298021B2 (ja) * 2006-10-12 2013-09-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド リンホトキシン−αに対する抗体
CN101616932A (zh) 2006-10-27 2009-12-30 艾博特生物技术有限公司 结晶型抗-hTNFα抗体
US9675696B2 (en) * 2006-11-14 2017-06-13 Warsaw Orthopedic, Inc. Method and use for increasing efficacy of anti-adhesive compositions in controlling inflammation and pain
KR20150038227A (ko) 2007-01-16 2015-04-08 애브비 인코포레이티드 건선의 치료방법
CN103432580A (zh) 2007-03-02 2013-12-11 健泰科生物技术公司 基于低her3表达预测对her二聚化抑制剂的响应
CN101679507A (zh) * 2007-03-29 2010-03-24 艾博特公司 结晶抗人类il-12抗体
KR101540823B1 (ko) * 2007-03-30 2015-07-30 메디뮨 엘엘씨 항체 제제
AU2008242842B2 (en) * 2007-04-17 2014-06-05 Baxter Healthcare Sa Nucleic acid microparticles for pulmonary delivery
AR066240A1 (es) * 2007-04-23 2009-08-05 Wyeth Corp Metodos y composiciones para tratar y monitorear el tratamiento de trastornos asociados con il-13
US8999337B2 (en) 2007-06-11 2015-04-07 Abbvie Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis by inhibition of TNFα
US8753839B2 (en) 2007-08-08 2014-06-17 Abbvie Inc. Compositions and methods for crystallizing antibodies
US20100310548A1 (en) * 2007-10-15 2010-12-09 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Manufacturing a Biologic Using a Stable Storage Intermediate
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
CN101945890A (zh) * 2007-12-21 2011-01-12 健泰科生物技术公司 抗cd20抗体的结晶
EP2077281A1 (en) 2008-01-02 2009-07-08 Bergen Teknologioverforing AS Anti-CD20 antibodies or fragments thereof for the treatment of chronic fatigue syndrome
US7914785B2 (en) 2008-01-02 2011-03-29 Bergen Teknologieverforing As B-cell depleting agents, like anti-CD20 antibodies or fragments thereof for the treatment of chronic fatigue syndrome
WO2009099545A1 (en) * 2008-01-30 2009-08-13 Abbott Laboratories Compositions and methods for crystallizing antibody fragments
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
BRPI0908715A2 (pt) 2008-03-18 2016-05-03 Abbott Lab métodos para tratamento da psoríase
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
ES2579554T3 (es) 2008-05-09 2016-08-12 Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg Anticuerpos para el receptor de productos terminales de glicación avanzada (RAGE) y usos de los mismos
CA2725666A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153580A (ru) 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
JP5674654B2 (ja) 2008-07-08 2015-02-25 アッヴィ・インコーポレイテッド プロスタグランジンｅ２二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
CN104829718A (zh) 2008-07-08 2015-08-12 艾伯维公司 前列腺素e2结合蛋白及其用途
US20100021460A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-28 Genentech, Inc. Methods of Treating Autoimmune Diseases Using CD4 Antibodies
TW201014605A (en) 2008-09-16 2010-04-16 Genentech Inc Methods for treating progressive multiple sclerosis
CN102271703B (zh) * 2008-11-10 2015-09-16 阿雷克森制药公司 用于治疗补体相关障碍的方法和组合物
MX2011005953A (es) * 2008-12-04 2011-08-17 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable dual y usos de las mismas.
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
US20110142836A1 (en) * 2009-01-02 2011-06-16 Olav Mella B-cell depleting agents for the treatment of chronic fatigue syndrome
US8030026B2 (en) 2009-02-24 2011-10-04 Abbott Laboratories Antibodies to troponin I and methods of use thereof
US8835610B2 (en) * 2009-03-05 2014-09-16 Abbvie Inc. IL-17 binding proteins
PE20120359A1 (es) 2009-03-06 2012-04-13 Genentech Inc Formulacion con anticuerpo
US8283162B2 (en) 2009-03-10 2012-10-09 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKAII and uses thereof
BRPI1012162A2 (pt) 2009-04-29 2016-01-12 Abbott Biotech Ltd dispositivo de injeção automática
WO2010138809A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for a membrane protein crystallization screening kit
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US20120104413A1 (en) 2009-06-29 2012-05-03 Bougrov Vladislav E Light emitting semiconductor device and method for manufacturing
WO2011004028A2 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Innate Pharma Tlr3 binding agents
US8682440B2 (en) 2009-08-03 2014-03-25 Incube Labs, Llc Swallowable capsule and method for stimulating incretin production within the intestinal tract
BR112012003077A2 (pt) 2009-08-14 2019-09-24 Genentech Inc mercadorias biologicas para monitorar resposta em paciente para antagonistas de vegf
PE20121647A1 (es) 2009-08-29 2012-12-31 Abbvie Inc Proteinas terapeuticas de union a dll4
TW201119673A (en) 2009-09-01 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20110064670A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Genentech, Inc. Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
JP5491119B2 (ja) 2009-10-02 2014-05-14 日東電工株式会社 薬物含有微粒子を含む医薬組成物およびその製造方法
TW201119676A (en) 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011053707A1 (en) 2009-10-31 2011-05-05 Abbott Laboratories Antibodies to receptor for advanced glycation end products (rage) and uses thereof
CA2780069C (en) 2009-12-08 2018-07-17 Abbott Gmbh & Co. Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
WO2011075578A1 (en) 2009-12-16 2011-06-23 Philip Bosch Methods of treating interstitial cystitis
US8562589B2 (en) 2009-12-24 2013-10-22 Rani Therapeutics, Llc Swallowable drug delivery device and method of delivery
CA2789168A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Abbott Biotechnology Ltd. Methods and compositions for predicting responsiveness to treatment with tnf-.alpha. inhibitor
CA2789629A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Immunogen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
SG10201501562VA (en) 2010-03-02 2015-04-29 Abbvie Inc Therapeutic dll4 binding proteins
BR112012025568A2 (pt) * 2010-04-07 2017-03-28 Abbvie Inc proteínas de ligação ao tnf-<244>.
MX336196B (es) 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
KR101850687B1 (ko) 2010-04-21 2018-04-20 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 치료제의 제어된 전달을 위한 착용형 자동 주사 디바이스
HUE033063T2 (hu) 2010-05-14 2017-11-28 Abbvie Inc IL-1 kötõ fehérjék
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
EP2575884B1 (en) 2010-06-03 2018-07-18 AbbVie Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of hidradenitis suppurativa (hs)
US20120009196A1 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2596361A1 (en) 2010-07-19 2013-05-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
JP2013538338A (ja) 2010-07-19 2013-10-10 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法
US9120862B2 (en) 2010-07-26 2015-09-01 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKA-II and uses thereof
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012024187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
US9505829B2 (en) 2010-08-19 2016-11-29 Zoetis Belgium S.A. Anti-NGF antibodies and their use
JP5952816B2 (ja) * 2010-08-19 2016-07-13 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの結晶構造
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2627171C2 (ru) 2010-12-21 2017-08-03 Эббви Инк. Il-1 альфа и бета биспецифические иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
US20120275996A1 (en) 2010-12-21 2012-11-01 Abbott Laboratories IL-1 Binding Proteins
US9149617B2 (en) 2010-12-23 2015-10-06 Rani Therapeutics, Llc Device, system and methods for the oral delivery of therapeutic compounds
US10639272B2 (en) 2010-12-23 2020-05-05 Rani Therapeutics, Llc Methods for delivering etanercept preparations into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8734429B2 (en) 2010-12-23 2014-05-27 Rani Therapeutics, Llc Device, system and methods for the oral delivery of therapeutic compounds
US9415004B2 (en) 2010-12-23 2016-08-16 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8809271B2 (en) 2010-12-23 2014-08-19 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations comprising liraglutide for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US9861683B2 (en) 2010-12-23 2018-01-09 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8969293B2 (en) 2010-12-23 2015-03-03 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations comprising exenatide for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US9402807B2 (en) * 2010-12-23 2016-08-02 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US9629799B2 (en) 2010-12-23 2017-04-25 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US9284367B2 (en) 2010-12-23 2016-03-15 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US9283179B2 (en) 2010-12-23 2016-03-15 Rani Therapeutics, Llc GnRH preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8846040B2 (en) 2010-12-23 2014-09-30 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations comprising etanercept for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US9259386B2 (en) 2010-12-23 2016-02-16 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic preparation comprising somatostatin or somatostatin analogoue for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US9402806B2 (en) 2010-12-23 2016-08-02 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8809269B2 (en) 2010-12-23 2014-08-19 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations comprising insulin for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8980822B2 (en) 2010-12-23 2015-03-17 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations comprising pramlintide for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8764733B2 (en) 2010-12-23 2014-07-01 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US20140065154A1 (en) 2011-01-12 2014-03-06 Innate Pharma Tlr3 binding agents
EP3187216B1 (en) 2011-01-24 2019-08-21 AbbVie Biotechnology Ltd. Automatic injection devices having overmolded gripping surfaces
AU2015230852B2 (en) * 2011-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. High concentration antibody formulations
EA029956B1 (ru) 2011-03-25 2018-06-29 Эмджен Инк. Кристаллы антител против склеростина и составы на их основе
MX2014000531A (es) 2011-07-13 2014-12-05 Abbvie Inc Metodos y composiciones para el tratamiento del asma usando anticuerpos anti-il-13.
CA2844435A1 (en) * 2011-08-10 2013-02-14 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Highly galactosylated antibodies
IL309917A (en) 2011-10-14 2024-03-01 Genentech Inc Pertuzumab and Trastuzumab for use in treatment
WO2013063114A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Immunobinders directed against tnf
AR088513A1 (es) 2011-10-24 2014-06-18 Abbvie Inc Inmunoenlazantes dirigidos contra esclerostina
WO2013096812A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Articles of manufacture and methods for co-administration of antibodies
WO2013101771A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Genentech, Inc. Compositions and method for treating autoimmune diseases
BR112014015851A2 (pt) 2011-12-30 2019-09-24 Abbvie Inc proteínas de ligação específicas duplas direcionadas contra il-13 e/ou il-17
BR112014017320A2 (pt) 2012-01-13 2018-05-29 Genentech Inc método para determinar se um paciente é propenso a responder ao tratamento com um antagonista de vegf, método para otimizar a eficácia terapêutica de um antagonista de vegf, método para selecionar uma terapia, método para identificar um biomarcador e método para diagnosticar um distúrbio angiogênico
ES2676725T3 (es) 2012-01-27 2018-07-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composición y método para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades asociadas con la degeneración de las neuritas
US20130259867A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
MX2014011582A (es) 2012-03-30 2014-11-21 Genentech Inc Metodos y composiciones de diagnostico para el tratamiento de cancer.
SG11201406664SA (en) * 2012-05-11 2014-11-27 Novartis Ag Crystallization methods for purification of monoclonal antibodies
CA2874918A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Innate Pharma Tlr3 binding agents
JP6629069B2 (ja) 2012-06-06 2020-01-15 ゾエティス・エルエルシー イヌ化抗ｎｇｆ抗体およびその方法
US9777068B2 (en) 2012-06-18 2017-10-03 Apeiron Biologics Ag Method for treating a GD2 positive cancer
WO2013189516A1 (en) * 2012-06-18 2013-12-27 Apeiron Biologics Ag Method for treating a gd2 positive cancer
EP2866833B1 (en) 2012-06-27 2019-05-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Crystalline anti-human il-23 antibodies
US9670276B2 (en) 2012-07-12 2017-06-06 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
WO2014063205A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The University Of Queensland Use of endocytosis inhibitors and antibodies for cancer therapy
SG11201503412RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201506041A (zh) 2013-02-13 2015-02-16 Lab Francais Du Fractionnement 高度半乳糖基化的抗腫瘤壞死因子阿爾法抗體及其用途
CN105263319A (zh) 2013-02-13 2016-01-20 法国化学与生物科技实验室 具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法
BR112015023239A8 (pt) 2013-03-14 2018-04-17 Abbott Lab ensaio de combinação de anticorpo-antígeno de hcv e métodos e composições para uso do mesmo
JP6739329B2 (ja) 2013-03-14 2020-08-12 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈｃｖコア脂質結合ドメインモノクローナル抗体
MX2015012824A (es) 2013-03-14 2016-06-24 Abbott Lab Antigenos recombinantes ns3 del vhc y mutantes de los mismos para la deteccion mejorada de anticuerpos.
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
RU2737727C2 (ru) 2013-04-16 2020-12-02 Дженентек, Инк. Варианты пертузумаба и их аналитическая характеристика
EP2805730A1 (en) 2013-05-21 2014-11-26 Bergen Teknologioverforing AS Nitric oxide donor for the treatment of chronic fatigue syndrome
KR101834469B1 (ko) 2013-08-07 2018-03-06 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 비정형적 용혈성 요독증후군 (ahus) 바이오마커 단백질
US10093978B2 (en) 2013-08-12 2018-10-09 Genentech, Inc. Compositions for detecting complement factor H (CFH) and complement factor I (CFI) polymorphisms
US10456470B2 (en) 2013-08-30 2019-10-29 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
US10617755B2 (en) 2013-08-30 2020-04-14 Genentech, Inc. Combination therapy for the treatment of glioblastoma
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
EP3062780A1 (en) 2013-11-01 2016-09-07 Bergen Teknologioverføring AS Activators or stimulators of soluble guanylate cyclase for use in treating chronic fatigue syndrome
JP6993083B2 (ja) * 2013-11-15 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 環境適合性洗浄剤を使用するウイルス不活性化方法
NZ720273A (en) 2013-11-21 2022-02-25 Apeiron Biologics Ag Preparations and methods for treating a gd2 positive cancer
US9840566B2 (en) 2013-11-21 2017-12-12 Apeiron Biologics Ag Preparations and methods for treating a GD2 positive cancer
US10179821B2 (en) 2014-05-01 2019-01-15 Genentech, Inc. Anti-factor D antibodies
EP3145951A1 (en) 2014-06-24 2017-03-29 InSight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of purifying antibodies
EP3929218A1 (en) 2014-07-14 2021-12-29 Amgen, Inc Crystalline antibody formulations
MX2017000527A (es) * 2014-07-14 2017-08-10 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos cristalinos.
EP3169801A1 (en) 2014-07-14 2017-05-24 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
EP3212665A2 (en) 2014-10-31 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-il-17a and il-17f cross reactive antibody variants and compositions comprising and methods of making and using same
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
CN107223163A (zh) 2014-12-24 2017-09-29 豪夫迈·罗氏有限公司 用于膀胱癌症的治疗，诊断和预后方法
EP3078675A1 (en) 2015-04-10 2016-10-12 Ares Trading S.A. Induction dosing regimen for the treatment of tnf alpha mediated disorders
WO2016196381A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Genentech, Inc. Pd-l1 promoter methylation in cancer
PE20180193A1 (es) 2015-05-29 2018-01-26 Abbvie Inc Anticuerpos anti-cd40 y sus usos
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
HRP20220304T1 (hr) 2015-06-24 2022-05-13 F. Hoffmann - La Roche Ag Anti-transferinska receptorska protutijela s prilagođenim afinitetom
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
EP3356406A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
EP3359572A2 (en) 2015-10-06 2018-08-15 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for treating multiple sclerosis
JP2018536650A (ja) 2015-10-30 2018-12-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｄ因子抗体変異体コンジュゲート及びその使用
TW201730211A (zh) 2015-10-30 2017-09-01 建南德克公司 抗因子d抗體及結合物
WO2017136820A2 (en) 2016-02-06 2017-08-10 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
CN109803682A (zh) 2016-08-16 2019-05-24 岸迈生物科技有限公司 单价不对称串联Fab双特异性抗体
EP3544628A4 (en) 2016-11-23 2020-11-18 Immunoah Therapeutics, Inc. 4-1BB BINDING PROTEINS AND THEIR USES
AU2017387909A1 (en) 2016-12-28 2019-06-27 Genentech, Inc. Treatment of advanced HER2 expressing cancer
MA47313B1 (fr) 2017-01-17 2020-12-31 Hoffmann La Roche Formulations sous-cutanées d'anticorps her2
MX2019008600A (es) 2017-01-24 2019-09-10 Nestle Sa Composiciones que comprenden anticuerpos anti-fel d1 y metodos para reducir al menos un sintoma de la alergia humana a los gatos.
US11077189B2 (en) 2017-03-02 2021-08-03 Genentech Inc. Adjuvant treatment of HER2-positive breast cancer
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
EP3618871A4 (en) 2017-05-02 2021-01-06 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-LAG3 ANTIBODIES ETCO-FORMULATIONS ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND ANTI-PD-1 ANTIBODIES
US20210031012A1 (en) 2018-01-26 2021-02-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a pde4 inhibitor
WO2019177690A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Zoetis Services Llc Anti-ngf antibodies and methods thereof
EP3810094A1 (en) 2018-06-20 2021-04-28 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a jak or other kinase inhibitor
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
EP3810085A1 (en) 2018-06-20 2021-04-28 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
WO2019246313A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor
EP3810268A1 (en) 2018-06-20 2021-04-28 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor
US20220339174A1 (en) 2019-08-30 2022-10-27 Vestlandets Innovasjonsselskap As Method for the treatment of chronic fatigue syndrome using an inhibitory or cytotoxic agent against plasma cells
MX2023001678A (es) 2020-08-14 2023-02-22 Hoffmann La Roche Metodos para tratar esclerosis multiple con ocrelizumab.
IT202100004496A1 (it) 2021-02-25 2022-08-25 Univ Della Calabria Recupero di farmaci biologici o loro frammenti da soluzioni impure mediante cristallizzazione o precipitazione con membrane

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2799622A (en) * 1953-11-14 1957-07-16 Novo Terapeutisk Labor As Process of producing insulin crystals of substantially uniform size and compositions thereof
US4334024A (en) * 1980-11-03 1982-06-08 Sarjit Johal Preparation and crystallization of fraction I protein from plant sources
DE3327709A1 (de) * 1983-07-29 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Insulin-derivat-kristallsuspensionen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
DE3419782C1 (de) 1984-05-26 1985-11-14 Gödecke AG, 1000 Berlin Sphaerische Proteinpartikel mit immunadsorbierenden Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung
US6727278B1 (en) 1986-08-27 2004-04-27 Dms Pharmaceutical Inc. Pharmaceutically active agents that impede amyloid formation in vivo
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
ATE96167T1 (de) * 1989-12-21 1993-11-15 Novo Nordisk As Verfahren zur kristallisation von enzymen.
US5780599A (en) * 1990-07-13 1998-07-14 Novo Nordisk A/S Growth hormone crystals and a process for production of growth hormone crystals
US5618710A (en) 1990-08-03 1997-04-08 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Crosslinked enzyme crystals
US6063910A (en) 1991-11-14 2000-05-16 The Trustees Of Princeton University Preparation of protein microparticles by supercritical fluid precipitation
US5751453A (en) 1991-12-06 1998-05-12 Ncr Corporation Liquid crystal display with pen-input capability
WO1994010980A1 (en) 1992-11-16 1994-05-26 Corporation Of Mercer University Compositions using microencapsulated neutralizing antibodies
US6794357B1 (en) 1993-06-24 2004-09-21 Astrazeneca Ab Compositions for inhalation
US5510118A (en) * 1995-02-14 1996-04-23 Nanosystems Llc Process for preparing therapeutic compositions containing nanoparticles
US5904935A (en) 1995-06-07 1999-05-18 Alza Corporation Peptide/protein suspending formulations
US6143211A (en) 1995-07-21 2000-11-07 Brown University Foundation Process for preparing microparticles through phase inversion phenomena
AU6960696A (en) 1995-08-30 1997-03-19 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Crystalline zap family proteins
US5972331A (en) 1995-12-22 1999-10-26 Schering Corporation Crystalline interferon alpha for pulmonary delivery and method for producing the same
US6652837B1 (en) 1996-05-24 2003-11-25 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of novel particles for inhalation
US5932212A (en) * 1996-05-24 1999-08-03 Altus Biologics, Inc. Crosslinked protein crystal formulations and their use as catalysts in organic solvents
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6310038B1 (en) * 1997-03-20 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Pulmonary insulin crystals
US6140475A (en) 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
EP2311436A1 (en) * 1998-04-27 2011-04-20 Altus Pharmaceuticals Inc. Stabilized protein crystals, formulations containing them and methods of making them
US6956021B1 (en) 1998-08-25 2005-10-18 Advanced Inhalation Research, Inc. Stable spray-dried protein formulations
DE60027877T2 (de) * 1999-03-05 2006-12-28 Genencor International, Inc., Palo Alto Verfahren zur schnellen herstellung von crystallen mit wünschenswerter morphologie
EP1185248B1 (en) 1999-06-09 2012-05-02 Robert E. Sievers Supercritical fluid-assisted nebulization and bubble drying
DE20023081U1 (de) 1999-06-10 2003-01-16 Max Planck Gesellschaft Eingekapselte Kristalle mit Mehrlagenbeschichtung
GB9915975D0 (en) 1999-07-07 1999-09-08 Bradford Particle Design Ltd Method for the formation of particles
US6458387B1 (en) 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
FR2802445B1 (fr) 1999-12-15 2002-02-15 Separex Sa Procede et dispositif de captage de fines particules par piegeage au sein d'un melange solide de type neige carbonique
JP2004526949A (ja) * 2000-10-19 2004-09-02 ストラクチュラル ジェノミックス，インコーポレーテッド その場ｘ線回折による結晶識別のための装置および方法
US6562952B1 (en) 2000-10-31 2003-05-13 The University Of Kansas Precipitation of proteins from organic solutions
US6756062B2 (en) 2000-11-03 2004-06-29 Board Of Regents University Of Texas System Preparation of drug particles using evaporation precipitation into aqueous solutions
IL156618A0 (en) 2000-12-28 2004-01-04 Altus Biologics Inc Crystals of whole antibodies and fragments thereof, methods for the preparation thereof and diagnostic kits utilizing the same
US6955717B2 (en) * 2001-05-01 2005-10-18 Medimmune Inc. Crystals and structure of Synagis Fab
WO2002094264A1 (en) * 2001-05-23 2002-11-28 Tularik Inc. Ccr4 antagonists
CA2451185A1 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Altus Biologics, Inc. Spherical protein particles and methods of making and using them
US20060003012A9 (en) 2001-09-26 2006-01-05 Sean Brynjelsen Preparation of submicron solid particle suspensions by sonication of multiphase systems
CN101679507A (zh) * 2007-03-29 2010-03-24 艾博特公司 结晶抗人类il-12抗体

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101320707B1 (ko) * 2004-07-23 2013-10-22 제넨테크, 인크. 항체 또는 그의 단편의 결정화 방법
KR20170120155A (ko) * 2015-02-27 2017-10-30 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-인간 pd-1 단일클론 항체의 결정

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002256971B2 (en) 2008-04-03
EP2325205A3 (en) 2011-10-12
KR20080043858A (ko) 2008-05-19
US20020136719A1 (en) 2002-09-26
US9310379B2 (en) 2016-04-12
ZA200305035B (en) 2005-11-30
US20090093617A1 (en) 2009-04-09
JP2005502589A (ja) 2005-01-27
EP1345968A2 (en) 2003-09-24
EP2325205A2 (en) 2011-05-25
CA2433353C (en) 2017-03-21
WO2002072636A8 (en) 2004-02-26
NZ526720A (en) 2007-11-30
KR20100031769A (ko) 2010-03-24
CA2433353A1 (en) 2002-09-19
WO2002072636A3 (en) 2003-04-17
US7833525B2 (en) 2010-11-16
JP4731793B2 (ja) 2011-07-27
WO2002072636A2 (en) 2002-09-19
IL156618A0 (en) 2004-01-04
KR100923514B1 (ko) 2009-10-27

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