DE60027877T2

DE60027877T2 - Verfahren zur schnellen herstellung von crystallen mit wünschenswerter morphologie

Info

Publication number: DE60027877T2
Application number: DE60027877T
Authority: DE
Inventors: Hong Meng Belmont HENG
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2020-03-04
Also published as: JP2002537804A; DK1159410T3; AU3393800A; EP1159410A1; CN1342198A; MXPA01008715A; ATE325868T1; US20020177206A1; DE60027877D1; CA2361507A1; US6593118B2; CA2361507C; EP1159410B1; US6403350B1; NZ513163A; WO2000052150A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Kristallisation und insbesondere ein Verfahren zum Erhalt von Kristallen von Mutanten-Subtilisin mit einer gewünschten Morphologie.
Hintergrund der Erfindung
Es sind intensive Forschungsbemühungen auf die Fällung und Kristallisation von Enzymen als Mittel zur Reinigung und Herstellung von Enzym-Produkten gerichtet worden. Zum Beispiel ist im U.S. Patent Nr. 4,659,667 ein Verfahren zur Gewinnung eines Enzyms aus Lösung offenbart, indem man die Enzym-haltige Lösung man bis zur Übersättigung bei einem pH nahe des isoelektrischen Punktes des Enzyms konzentriert, die Kristallisation induziert und das kristallisierte Endprodukt gewinnt. Die Induktion der Kristallisation wird durch spontanes Kristallisierenlassen der Enzyme beim Konzentrieren oder auch durch Impfen, Schall, Rühren oder Kratzen der Innenoberfläche des Behälters erzielt. Als Beispiel wird die Kristallisation von alpha-Amylase angeführt.
In der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/08703 ist ein Verfahren zur Kristallisation von Subtilisin durch Zugabe eines Halogenidsalzes, wie von Natriumchlorid oder Calciumchlorid, zu einer konzentrierten Subtilisin-Lösung mit mindestens etwa 40 Gramm pro Liter beschrieben.
In der EP 506 866 ist ein Verfahren zur Kristallisation von Enzymen offenbart, das dadurch gekennzeichnet ist, dass als Ausgangsmaterial eine wässrige Lösung verwendet wird, die Flüssigkeit mit einer relativ hohen Enzymreinheit und einer Enzym-Konzentration von mindestens etwa 5 Gramm pro Liter enthält, und als Kristallisationsmittel ein leicht lösliches Salz vom Nicht-Halogenid-Typ auf eine Konzentration zugesetzt wird, die beträchtlich geringer ist als die erforderliche Menge, um die Enzyme in amorpher Form zu fällen. Die Kristallisation von gewissen Subtilisin-Enzymen bei Temperaturen bis zu 30°C ist beispielhaft angeführt. Natriumsulfat wird verwendet, um zur Reinigung des Protease-Produkts beizutragen, aber nicht zur Kristallisation.
Trotz dieser Fortschritte auf dem Gebiet der Enzym-Kristallisation ist in der Industrie eine preiswerte und effiziente Kristallisation von Proteasen, die für die Produktion im großen Maßstab geeignet ist, problematisch geblieben. Die Fähigkeit, rasch Kristalle mit einer gewünschten Morphologie im industriellen Maßstab zu erzeugen, würde für große Kosteneinsparungen sorgen und von großer Bedeutung für die Industrie sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Kristallisationsverfahren zum raschen Erhalt von Kristallen mit einer gewünschten Morphologie (z.B. quadratischen Platten, hexagonalen oder rechteckigen Kristallen usw.) bereit. Typisch ist die gewünschte Morphologie eine solche, in der die Kristalle eine erhöhte Festigkeit im Vergleich zu anderen möglichen Kristallmorphologien zeigen (z.B. quadratische oder rechteckige Platten oder Würfel, im Gegensatz zu länglichen Nadeln oder Stäben). In einer Ausführungsform wird eine Ausgangstemperatur derart gewählt, dass Kristalle in Form von quadratischen Platten erhalten werden. Die Ausgangstemperatur kann zum Beispiel eine Temperatur unterhalb von Raumtemperatur (z.B. weniger als 20 Grad C) sein. Eine Temperaturverschiebung oder -erhöhung wird dann bewirkt, bevorzugt auf solche Weise, dass eine weitere Keimbildung minimiert oder vermieden wird, so dass die Kristalle weiter auf den quadratischen Platten wachsen, aber mit einer verschiedenen Kinetik, z.B. einer höheren Kristallisationsgeschwindigkeit. Die Temperaturverschiebung kann zum Beispiel auf mindestens Raumtemperatur (z.B. zwischen etwa 20 und 60 Grad C) sein. Als Ergebnis ergibt das Verfahren ein kristallines Produkt mit der gewünschten Morphologie bei einer höheren Kristallisationsgeschwindigkeit.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere für den schnellen Erhalt von Kristallen von Mutanten-Subtilisinenzym mit einer gewünschten Morphologie nützlich. In einer Ausführungsform wird das Verfahren verwendet, um eine mindestens etwa 90 %-ige Kristallisation in weniger als 25 Stunden aus einer Enzym-haltigen Lösung zu verwirklichen, wobei die Enzymkristalle eine vorherrschende Morphologie von quadratischen Platten aufweisen.
Andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen und beigefügten Ansprüchen ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Mikrographie, die Protease-Kristalle zeigt, welche erhalten werden, wenn sie aus einer Lösung kristallisiert werden, die über etwa 19,5 Stunden bei etwa Raumtemperatur (22 Grad C) gehalten wird.
2 ist eine Mikrographie, die Protease-Kristalle zeigt, welche erhalten werden, wenn sie aus einer Lösung kristallisiert werden, die über etwa 19,5 Stunden bei etwa 30 Grad C gehalten wird.
3 ist eine Mikrographie, die Protease-Kristalle zeigt, welche erhalten werden, wenn sie aus einer Lösung kristallisiert werden, die über etwa 19,5 Stunden bei etwa 15 Grad C gehalten wird.
4 ist eine Mikrographie, die Protease-Kristalle zeigt, welche gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, wobei man die Kristallisation über etwa 4 Stunden bei 15 Grad C beginnen ließ und dann zusätzliche 18 Stunden fortsetzte, nachdem die Temperatur auf etwa 22 Grad C erhöht wurde. Man beachtet die beträchtliche Zahl an Kristallen in Form von quadratischen Platten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Kristallisationsverfahren bereit, in dem eine Ausgangstemperatur, z.B. unterhalb von Raumtemperatur, so gewählt wird, dass eine wünschenswerte Kristallmorphologie (z.B. quadratische Platten) erhalten wird. Dann wird eine Temperaturverschiebung, z.B. auf Raumtemperatur oder darüber, eingeführt, bei der die Kristalle auf die gewünschte Weise, aber mit unterschiedlicher Kinetik, z.B. einer höheren Kristallisationsgeschwindigkeit, weiter wachsen. Als Ergebnis ergibt das Verfahren ein kristallines Produkt mit gewünschter Morphologie bei einer höheren Kristallisationsgeschwindigkeit.
Wenn die Kristalle, welche die gewünschte Morphologie zeigen, bei der Ausgangstemperatur begonnen haben, sich zu bilden, kann eine geeignete Temperaturverschiebung gewählt werden, welche die weitere Keimbildung minimiert oder ausschaltet, um dadurch die Bildung von Kristallen mit einer anderen Morphologie als der erwünschten zu behindern. Zum Beispiel kann die Temperatur in diskreten Schritten über eine Zeitspanne erhöht werden (z.B. in Inkrementen von etwa 4 Grad C alle 5 Minuten über eine Zeitspanne von etwa 25 Minuten). Oder es kann ein kontinuierliches Temperaturanstiegsprofil bestimmt werden, welches eine weitere Keimbildung minimiert. Ein derartiges Temperaturanstiegsprofil kann eine gleichmäßige Zunahme, z.B. 2 Grad C/Minute über eine Verschiebungszeitspanne von etwa 10 Minuten darstellen, oder die Geschwindigkeit kann über die Verschiebungszeitspanne variieren, z.B. 1 Grad C/Minute über 10 Minuten, dann Abänderung auf 2 Grad C/Minute über 5 Minuten.
Bei der Gewinnung von Proteinen unter Verwendung von Kristallisation gibt es eine Anzahl von Faktoren, die ins Gleichgewicht gebracht werden müssen, um Kristalle mit gewünschter Morphologie zu erlangen, einschließlich Temperatur, pH, verwendeten Salzes, Zeitspanne für die Kristallisation, Morphologie der Kristalle.
Proteine, die im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen, umfassen genetisch modifizierte Mutanten-Subtilisinenzyme, die von einer DNA-Sequenz abstammen, in der eine oder mehrere der Aminosäuren der Protease deletiert, ersetzt oder andere Weise manipuliert worden sind. Derartige modifizierte Subtilisine sind zum Beispiel im U.S. Patent 4,760,025, im EP-Patent 130 756 B1, in der EP-Patentanmeldung WO 91/06637, in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/10615 und im U.S. Patent 5,185,258 beschrieben.
Bevorzugt behalten Enzyme, die unter Verwendung des vorliegenden Kristallisationsverfahrens gewonnen werden, mindestens 80 %, bevorzugter mindestens 90 % und am bevorzugtesten mindestens 95 % ihrer ursprünglichen Aktivität bei.
Die Fermentationsverfahren zum Kultivieren von Zellen und zur Produktion von Protein sind als solche in der Technik bekannt. Zum Beispiel kann Protein entweder durch feste oder durch Submers-Kultur, einschließlich Batch-, Fed-batch- und kontinuierlicher Durchflussverfahren, erzeugt werden. Die Sammlung und Reinigung des Proteins aus der Fermentationsbrühe kann ebenfalls mittels Verfahren bewirkt werden, die als solche in der Technik bekannt sind.
Die wässrige Lösung, die als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren dient, stammt von der Fermentationsbrühe ab, die durch die Fermentation eines geeigneten Mikroorganismus erzeugt wird. Die Fermentationsbrühe enthält im Allgemeinen Zelltrümmer, die Zellen, verschiedene suspendierte Feststoffe und andere Biomassen-Verunreinigungen einschließen, sowie das gewünschte Protease-Produkt, welche bevorzugt durch in der Technik bekannte Mittel aus der Fermentationsbrühe entfernt werden. Geeignete Verfahren zur Entfernung umfassen herkömmliche Feststoff-Flüssigkeits-Abtrenntechniken, wie z.B. Zentrifugation, Filtration, Dialyse, Mikrofiltration, Rotationsvakuumfiltration oder andere bekannte Verfahren, um zellfreie Filtrate zu erzeugen. Obwohl es als innerhalb des Bereichs der Erfindung angesehen wird, das Protease-Enzym entweder direkt aus der Fermentationsbrühe oder aus dem zellfreien Filtrat zu kristallisieren, ist es vorzuziehen, die Fermentationsbrühe oder das zellfreie Filtrat vor der Kristallisation unter Verwendung von Techniken wie Ultrafiltration, Verdampfung oder Fällung weiter zu konzentrieren.
Im Fall von Enzymen ist es in der Technik seit langem bekannt, dass gewisse Bestandteile, wenn sie in ein Kulturmedium eingeschlossen werden, Schwierigkeiten bei der Kristallisation der Enzym-Komponenten zur Folge haben. Aus diesem Grund ist es häufig vorteilhaft, die filtrierte Fermentationsbrühe weiter zu reinigen, um Verunreinigungen zu entfernen, welche die Kristallisation stören können, zum Beispiel indem man die filtrierte Brühe einer Säulenreinigung unterzieht. Zusätzlich ist es möglich, die Menge derartiger Verunreinigungen durch Steuern des Kulturmediums zu beschränken, in welchem der Mikroorganismus gezüchtet wird. Zum Beispiel sind, wie es in Northrup et al. (1948), Crystalline Enzymes, Columbia University Press, S. 254, beschrieben ist, Mucin-ähnliche Substanzen, z.B. Polysaccharide, häufig für Kristallisationsverfahren schädlich. Demgemäß ist es durch Eliminierung derartiger Polysaccharid-Komponenten aus dem Vorfermentations-Kulturmedium oder durch Reinigung derartiger Komponenten aus einer Fermentationsbrühe möglich, den Erfolg der anschließenden Kristallisation zu verbessern. Alternativ können diese Substanzen durch Behandeln des Filtrats mit einer starken Säure, Kupferhydroxid, Alkohol oder Aceton entfernt werden. Vorzugsweise wird Aluminiumsulfat bei der Reinigung von Protease-haltigen Fermentationsbrühen verwendet, um die Kristallisation zu erleichtern.
Eine Anzahl von verschiedenen Proteinen zeigt verschiedene Morphologien bei verschiedenen Temperaturen, welche Enzyme, wie gewisse Proteasen und Glucose-Isomerasen, einschließen. Im Allgemeinen wird die Kristallmorphologie bevorzugt, die bei niedrigerer Temperatur gefunden wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann dieser Faktor verwendet werden, um Kristalle mit bevorzugten Kristallmorphologien mit einer höheren Kristallisationsgeschwindigkeit zu erzeugen.
Bevorzugte Kristallmorphologien sind jene, die nicht leicht zerbrechen, wenn die Kristalle gehandhabt werden. Stäbe tendieren dazu, leichter als quadratische, rechteckige oder hexagonale Kristalle zu zerbrechen.
Die folgenden Beispiele sind repräsentativ und sind nicht als Beschränkung gedacht.
Beispiele
Beispiel 1
Es wurde eine wässrige Lösung hergestellt, die ein Ultrafiltrat-Konzentrat einer Fermentationsbrühe von einer Mutanten-Protease umfasste, welche aus der Fermentation von Bacillus subtilis abstammte. Verfahren zur Herstellung von Mutanten-Protease, die für die vorliegenden Zwecke geeignet sind, sind im U.S. Patent 5,185,258 beschrieben. Es wurde eine Ultrafiltration mit einer Polysulfan-Membran mit einem 10 kD-Molekulargewichts-Rückhaltevermögen in einer wendelförmigen Ultrafiltrationseinheit durchgeführt. Die resultierende Proteaselösung lag bei einer Konzentration von etwa 52 g/l aktivem Enzym vor. Die Proteasekonzentration kann durch das Verfahren bestimmt werden, das in Estell et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 6518–6521 beschrieben ist. Diese Brühe wurde für alle folgenden Kristallisationsexperimente verwendet.
Kristallisation von Mutanten-Protease aus Bacillus unter Verwendung verschiedener Temperaturprofile
Wässrige Lösungen, welche das Ultrafiltrat-Konzentrat einer Fermentationsbrühe einer Mutanten-Protease umfassten, die von Bacillus subtilis abstammte, wie oben beschrieben, wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt, um Kristalle zu erzeugen:

1. Das Ultrafiltrat-Konzentrat wurde auf die gewünschte Ausgangstemperatur äquilibriert (siehe Tabelle 1).
2. 5 % NaCl wurde unter sanftem Mischen dazugegeben.
3. Bei allen Experimenten wird die Lösung bei der angegebenen Temperatur gehalten, außer bei Experiment 2, in dem eine Probe nach vier Stunden aus Experiment Nr. 1 entnommen wurde und unter sanftem Mischen bei 22°C inkubiert wurde.
4. Der Kristallhabitus wurde im Laufe der Zeit beobachtet, indem man die Probe unter einem Mikroskop überprüfte.
5. Die Aktivität, die im Laufe der Zeit im Überstand verblieb, wurde gemessen, und die prozentuale Kristallisation wurden berechnet.

Tabelle 1
Im Experiment 2 scheint es, ohne dass man durch eine Theorie gebunden sein will, dass die niedrige Temperatur zu Beginn zu Keimen mit quadratischer Form führte, aber als sie unter eine höhere Temperatur gesetzt wurden, wuchsen einige Kristalle gemäß einer Stäbchenform. Die Kombination davon hatte rechteckige Platten und einige Stäbchen zum Ergebnis.

Claims

Verfahren zur Kristallisation eines mutierten Subtilisins, das aus einer Fermentationsnährlösung stammt, die durch die Fermentation von Bacillus subtilis zur Produktion von Subtilisin-Kristallen produziert wird, umfassend: a) Herstellen einer wässrigen Lösung, die das Subtilisin enthält; b) Halten der wässrigen Lösung, welche das Subtilisin enthält, bei einer Temperatur zwischen etwa 4°C und 20°C für nicht mehr als etwa 5 Stunden, um den Beginn der Kristallbildung zu ermöglichen, um Subtilisin-Kristalle zu produzieren, die eine gewünschte Kristallmorphologie zeigen; und c) Erhöhen der Temperatur der Lösung auf zwischen etwa 22°C und 60°C für nicht mehr als etwa 20 Stunden, um eine fortgesetzte Kristallbildung zu ermöglichen, wobei etwa 90 % des Subtilisins in der Lösung innerhalb von 25 Stunden nach Beginn von Schritt (b) kristallisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend die Gewinnung von Subtilisin-Kristallen mit der gewünschten Kristallmorphologie aus der Lösung.
Verfahren nach Anspruch 2, in dem das Subtilisin der gewonnenen Subtilisin-Kristalle mindestens etwa 90 % seiner ursprünglichen Aktivität beibehalten hat.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Zelltrümmer, die in der Fermentationsnährlösung anwesend sind, daraus entfernt werden, um ein zellfreies Filtrat zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die wässrige Lösung vor der Kristallisation konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die wässrige Lösung ein Ultrafiltrat-Konzentrat der Fermentationsnährlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Kristallisation von Schritt (c) die Produktion von Kristallen mit einer gewünschten Morphologie zum Ergebnis hat, wobei die Morphologie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus quadratisch, rechteckig oder hexagonal.
Verfahren nach Anspruch 7, in dem mindestens ein Teil der Kristalle quadratische Platten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend die Zugabe eines Salzes zu der Subtilisin-Lösung in Schritt (a).
Verfahren nach Anspruch 9, in dem das Salz Natriumchlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Subtilisin der gewonnenen Kristalle mindestens etwa 80 % seiner ursprünglichen Aktivität beibehalten hat.